BRPI0407071B1 - Peptídeo purificado, seu método de produção e composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios gastrointestinais - Google Patents

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Thea Norman
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Abstract

"métodos e composições para o tratamento de distúrbios gastrointestinais". a presente invenção refere-se a composições e métodos relacionados para o tratamento de ibs e outros distúrbios gastrointestinais e condições (por exemplo, distúrbio de motilidade gastrointestinais, distúrbios gastrointestinais funcionais, doença de refluxo gastroesofageano (gerd), doença de crohn, colite ulcerativa, doença de intestino inflamatório, azia funcional, dispepsia (incluindo dispepsia funcional ou dispepsia de não úlcera), gastroparesia, pseudo-obstrução intestinal crônica (ou pseudo-obstrução colônica), e distúrbios ou condições associados à constipação, por exemplo, constipação associada ao uso de matadores de dor com opiato, constipação pós-cirúrgica e constipação associada o distúrbios neuropáticos bem como outras condições e distúrbios usando-se peptídeos e outros agentes que ativam o receptor de guanilato ciclase c (gc-c).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PEPTÍDEO PURIFICADO, SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS GASTROINTESTINAIS.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a métodos e composições para o tratamento de vários distúrbios, incluindo distúrbios gastrointestinais, obesidade, falha cardíaca congestiva e hiperplasia prostática benigna. Antecedentes
Síndrome do intestino irritável (IBS) é um distúrbio crônico comum do intestino que afeta de 20 a 60 milhões de indivíduos só nos Estados Unidos (Lehman Brothers, Global Healthcare-lrritable bowel syndrome industry update, setembro de 1999). IBS é o distúrbio mais comum diagnosticado por gastroenterologistas (28% de pacientes examinados) e representa 12% de visitas a médicos de cuidado primário (Camilleri 2001, Gastroenterology 120:652-668). Nos Estados Unidos, o impacto econômico de IBS é estimado a $25 bilhões anualmente, através de custos diretos de uso de cuidado de saúde e custos indiretos de ausência permanente do trabalho (Talley 1995, Gastroenterology 109:17361741). Pacientes com IBS têm três vezes mais absentismo do trabalho e relatam uma qualidade de vida reduzida. Sofredores podem ser incapazes ou não querer atender eventos sociais, manter emprego, ou viagem mesmos em distâncias curtas (Drossman 1993, Dig Dis Sei 38:1569-1580). Há uma tremenda necessidade médica insatisfeita nesta população, uma vez que existem poucas opções de prescrições para tratar IBS.
Pacientes com IBS sofrem de dor abdominal e um padrão de intestino perturbado. Três subgrupos de pacientes com IBS foram definidos com base no hábito de intestino predominante: constipação-predominante (c-IBS), diarréia-predominante (d-IBS), ou alternante entre os dois (a-IBS). Estimativas de indivíduos, os quais sofrem de c-IBS, variam de 20-50% dos pacientes com IBS com 30% frequentemente citados. Em contraste com os outros dois subgrupos que têm uma taxa de sexo similar, c-IBS é mais comum em mulheres (razão de 3:1) (Talley e outros, 1995, Am J Epidemiol 142:76-83).
Petição 870180155135, de 26/11/2018, pág. 8/18
A definição e critérios de diagnósticos para IBS foram formalizados no Rome Criteria (Drossman e outros, 1999, Gut 45:Suppl. II: 1-81), que são bem aceitos na prática clínica. No entanto, a complexidade de sintomas não foi explicada por anormalidades anatômicas ou mudanças meta5 bólicas. Isto levou à classificação do IBS como um distúrbio de Gl funcional, que é diagnosticado com base nos critérios de Rome e avaliação limitada para excluir doença orgânica (Ringel e outros, 2001, Annu Rev Med 52:319338). IBS é considerado ser um distúrbio biofisicossocial resultante de uma combinação de três mecanismos que influenciam: motilidade de intestino alterada, uma sensibilidade aumentada do intestino ou cólon para estímulos de dor (sensibilidade visceral) e fatores psicossociais (Camilleri 2001, Gastroenterology 120:652-668). Recentemente, houve aumento de evidência para uma regra de inflamação em etiologia de IBS. Relatos indicam que subconjuntos de pacientes com IBS têm aumentos pequenos, mas significativos, em matócitos e células inflamatórias colônicas, óxido nitrico induzível aumentado (NO) e sintase (iNOS) e expressão alterada de citocinas inflamatórias (revistas por Talley 2000, Medscape Coverage de DDW week). Sumário
A presente invenção caracteriza composições e métodos rela20 cionados para o tratamento de IBS e outras condições e distúrbios gastrointestinais, por exemplo, distúrbios de motilidade gastrointestinais, distúrbios gastrointestinais funcionais, doença de refluxo gastroesofageano (GERD), doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória de intestino, azia funcional, dispepsia (incluindo dispepsia funcional ou dispepsia de não úlce25 ra), gastroparesia, pseudo-obstrução intestinal crônica (ou pseudo-obstrução colônica), e distúrbios e condições associadas à constipação, por exemplo, constipação associada a uso de opiatos cessadores de dor, constipação pós-cirúrgica e constipação associada a distúrbios neuropáticos, bem como outras condições e distúrbios. As composições caracterizam peptídeos que ativam o receptor de guanilato ciclase C (GC-C).
A presente invenção também caracteriza composições e métodos relacionados para o tratamento de obesidade, falha cardíaca congestiva e hiperplasia prostática benigna (BPH).
Sem estar ligado por qualquer teoria particular, no caso de 1BS e outros distúrbios gastrointestinais os peptídeos são úteis, uma vez que eles podem aumentar a motilidade gastrointestinal.
Sem estar ligado por qualquer teoria particular, no caso de IBS ou outros distúrbios gastrointestinais os peptídeos são úteis, em parte, uma vez que eles podem diminuir inflamação.
Sem estar ligado por qualquer teoria particular, no caso de IBS e outros distúrbios gastrointestinais os peptídeos são úteis, uma vez que eles 10 diminuem dor gastrointestinal ou dor visceral.
A invenção caracteriza composições farmacêuticas compreendendo certos peptídeos que são capazes de ativar o receptor de guanilato ciclase C (GC-C). Também dentro da invenção estão composições farmacêuticas compreendendo um peptídeo da invenção, bem como composições 15 de combinação compreendendo um peptídeo da invenção e um segundo agente terapêutico, por exemplo, um agente para tratamento de constipação (por exemplo, SPI-0211; Sucampo Pharmaceuticals, Inc.; Bethesda, MD) ou algum outro distúrbio gastrointestinal. Exemplos de um segundo agente terapêutico incluem: agentes de redução de ácido tais como inibidores de 20 bomba de próton e bloqueadores de receptor de H2, agentes pró-motilidade tais como agonistas de receptor de 5HT (por exemplo, Zeínorm®), agentes antiinflamatórios, antiespasmódicos, antidepressores, agentes analgésicos de ação central tais como agonistas de receptor de opióide, antagonistas de receptor de opióide, agentes para o tratamento de doença inflamatória de 25 intestino, doença de Crohn e colite ulcerativa, por exemplo, Traficet-EN® (ChemoCentryx, Inc.; San Carlos, CA), agentes que tratam dor gastrointestinal e visceral, e inibidores de cGMP fosfodiesterase (motapizona, zaprinast e suldinac sulfona). Assim, por exemplo, as composições farmacêuticas podem incluir um agente analgésico selecionado do grupo que consiste em: 30 bloqueadores de canais de Ca (por exemplo, ziconotídeo), antagonistas de receptor de 5HT (por exemplo, antagonistas de receptor de 5HT3, 5HT4 e 5HT1), agonistas de receptor de opióide (por exemplo, loperamida, fedotozi4 na e fentanila, naloxona, naltrexona, metil nalozona, nalmefeno, ciprimida, beta funaltrexamina, naloxonazina, naltrindol e nor-binaltrofimina, morfina, difeniloxilato, encefalina pentapeptídeo e trimebutina), antagonistas de receptor de NK1 (por exemplo, ezlopitant e SR-14033), agonistas de receptor 5 de CCK (por exemplo, loxiglumida), antagonistas de receptor de NK1, antagonistas de receptor de NK3 (por exemplo, talnetant, osanetant (SR142801)), inibidores de recaptação de norepinefrina-serotonina (NSRI; por exemplo, milnacipran), agonistas de receptor de vanilóide e canabanóide (por exemplo, arvanil), sialorfin, peptídeos relacionados com sialorfin com10 preendendo a sequência de amínoácidos QHNPR (SEQ. ID NO:111), por exemplo, vQHNPR (SEQ. ID NO:112); VRQHNPR (SEQ. ID NO:113); VRGQHNPR (SEQ. ID NO:114); VRGPQHNPR (SEQ. ID NO:115); VRGPRQHPNR (SEQ. ID NO:116); VRGPRRQHNPR (SEQ. ID NO:117); e RQHNPR (SEQ. ID NO: 118), compostos ou peptídeos que são inibidores de * 15 neprilisina, fracefamida (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2; WO 01/019849 A1), loperamida, Tyr-Arg (ciotorfina), agonistas de receptor de CCK (caerulein), peptídeo de conotoxin, análogos de peptídeo de timulina, loxiglumida, dexloxiglumida (o isômero R ou loxiglumida) (WO 88/05774) e outros compostos ou peptídeos analgésicos podem ser usados com ou ligados aos 20 peptídeos da invenção.
A invenção inclui métodos para o tratamento de vários distúrbios por administrção de um peptídeo que age como um agonista parcial ou completo do receptor de GC-C. O peptídeo inclui pelo menos seis cisteínas que formam três ligações de dissulfeto. Em certas concretizações, as 25 ligações de dissulfeto são substituídas por outras reticulações covalentes e, em alguns casos, as cisteínas estão substituídas por outros resíduos para prover reticulações covalentes alternativas. Os peptídeos podem também incluir pelo menos um sítio de divagem de tripsina ou de quimotripsina e/ou uma molécula pequena ou peptídeo analgésico carbóxi terminal, por 30 exemplo, AspPhe ou algum outro peptídeo analgésico. Quando presente dentro do peptídeo, a molécula pequena ou peptídeo analgésico pode ser precedida por um sítio de divagem de tripsina ou quimitripsina que permite liberação da molécula pequena ou peptídeo analgésico. Os peptídeos e os métodos da invenção são também úteis para o tratamento de dor e inflamação associados a vários distúrbios, incluindo distúrbios gastrointestinais. Certos peptídeos incluem sítio de divagem de tripsina ou quimitripsina localizado a fim de permitir inativação do peptídeo quando da divagem. Certos peptídeos tendo um sítio de divagem funcional sofrem divagem e inativação gradual no trato digestivo, e isto é desejável em algumas circunstâncias. Em certos peptídeos, um sítio de quimotripsina é alterado, aumentando a estabilidade do peptídeo in vivo.
A invenção inclui métodos para o tratamento de outros distúrbios, tais como falha cardíaca congestiva e hiperplasia prostátíca benigna, por administração de uma molécula pequena ou peptídeo (parenteralmente ou oralmente) que age como um agonista de receptor de GC-C. Tais agentes podem ser usados em combinação com peptídeos natriuréticos (por exemplo, peptídeo natriurético atrial, peptídeo nitriurético cerebral ou peptídeo natriurético de tipo C), um diurético, ou um inibidor de enzima conversora de angiotensina.
A invenção caracteriza métodos e composições para o aumento da motilidade intestinal. A motilidade intestinal envolve contrações e dissensões coordenadas espontâneas do estômago, intestinos, cólon e reto, para mover o alimento através do trato gastrointestinal durante o processo digestivo.
Em certas concretizações, os peptídeos incluem ou um ou dois ou mais aminoácidos negativamente carregados contíguos (por exemplo, Asp ou Glu), ou um ou dois ou mais resíduos positivamente carregados (por exemplo, Lys ou Arg), ou um ou dois ou mais aminoácidos positivamente ou negativamente carregados contíguos nos terminais carbóxi. Nestas concretizações, todos os aminoácidos de flanqueamento no terminal carbóxi ou são positivamente carregados ou negativamente carregados. Em outras concretizações, aminoácido carbóxi terminal são precedidos por um Leu. Por exemplo, as seguintes seqüências de aminoácidos podem ser adicionadas ao terminal carbóxi do peptídeo: Asp; Asp Lys; Lys Lys Lys Lys Lys Lys (SEQ
ID NO: 123); Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys (SEQ ID NO: 124); Leu Lys Lys; e Leu Asp. É também possível adicionar simplesmente Leu no terminal carbóxi.
Em um primeiro aspecto, a invenção caracteriza um peptídeo compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente na seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cys™ Cysn Xaa12 Xaai3 XaaM Cysi5 Xaai6 Xaa17 Cys18 Xaai9 Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121), ou está faltando, ou Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando. Em cer10 tas concretizações, Xaa8, Xaa9, Xaai2, Xaa-i3, Xaai4, Xaapv e Xaa19 pode ser qualquer aminoácido. Em certas concretizações, Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, ou Phe. Em outras concretizações, Xaa5 pode também ser Thr ou lie. Em outras concretizações, Xaa5 é Tyr, Asp ou Trp. Em algumas concretizações, Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro. Em outras concretizações, Xaa8 é 15 Glu; em algumas concretizações, Xaa9é Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe em algumas concretizações, Xaa9é Leu, lie, Vai, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe.
Em certas concretizações, um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido de ocorrência natural ou um análogo de aminoácido de 20 ocorrência não natural. Por exemplo, um aminoácido aromático pode ser substituído por 3,4-diidróxi-L-fenilalamina, 3-iodo-L-tirosina, triiodotironina, Ltiroxina, fenilglícina (Phg) ou nor-tirosina (norTyr). Phg e norTyr, e outros aminoácidos, incluindo Phe e Tyr, podem estar substituídos por, por exemplo, um halogênio, -CH3, -OH, -CH2NH3, -C(O)H, -CH2CH3, -CN, -CH2CH2CH3, 25 -SH, ou um outro grupo.
Em algumas concretizações, Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala. Em outras concretizações, Xaai2 é Asn. Em algumas concretizações, Xaai3 é Ala, Pro ou Gly, e em outras concretizações é Pro. Em algumas concretizações, Xaaué Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, lie, Leu, Lys, Arg, ou Asp, e 30 em outras concretizações é Ala ou Gly, e em ainda outras concretizações é Ala. Em algumas concretizações, Xaai6 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa-i7 é Gly, Pro ou Ala; Xaai9 é selecionado de Trp, Tyr, Phe, Asn e Leu ou Xaa^ é selecionado de Trp, Tyr, e Phe, ou Xaa-tgé selecionado de Leu, lie e Vai; ou Xaaig é His, ou Xaa-igé selecionado de Trp, Tyr, Phe, Asn, lie, Vai, His e Leu; e Xaa2o Χθθ2ΐ θ AspPhe ou está faltando, ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando, ou Xaa19Xaa20 Xaa2i está faltando. A invenção também revela métodos para o tratamento de um distúrbio gastrointestinal (por exemplo, um distúrbio de motilidade gastrointestinal, um distúrbio gastrointestinal funcional, distúrbio de refluxo gastroesofageano, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia de não úlcera, gastroparesia, pseudoobstrução intestinal crônica, pseudo-obstrução colônica), obesidade, falha 10 cardíaca congestiva ou hiperplasia prostática benigna, por administração de uma composição compreendendo um peptídeo acima mencionado.
Quando Xaa9 é Trp, Tyr ou Phe, ou quando Xaai6 é Trp, o peptídeo tem sítio de divagem de quimotripsina potencialmente funcional que está localizado em uma posição onde a divagem inativará a ligação de re15 ceptor de GC-C pelo peptídeo. Quando Xaa9 é Lys ou Arg, ou quando Xaa16 é Lys ou Arg, o peptídeo tem um sítio de divagem de tripsina potencialmente funcional que está localizado em uma posição onde a divagem inativará a ligação de receptor de GC-C pelo peptídeo.
Quando Xaaig é Trp, Tyr ou Phe, o peptídeo tem um sítio de cli20 vagem de quimotripsina que está localizado em uma posição onde a divagem liberará a porção do carbóxi terminai de peptídeo a Xaa-jg. Quando Xaa-igé Leu, lie ou Vai, o peptídeo pode ter um sítio de divagem de quimotripsina que está localizado em uma posição onde a divagem liberará a porção do amino terminal de peptídeo a Xaa-ig. Em pH relativamente alto o mesmo 25 efeito é visto quando Xaaig é His. Quando Xaa-ig é Lys ou Arg, o peptídeo tem um sítio de divagem de tripsina que está localizado em uma posição onde a divagem liberará a porção do peptídeo carbóxi terminal a Xaaig. Assim, se o peptídeo incluir um carbóxi terminal de peptídeo analgésico a Xaaw, o peptídeo será liberado no trato digestivo quando da exposição à pro30 tease apropriada. Entre os peptídeos analgésicos que podem estar incluídos no peptídeo estão: AspPhe (como Xaa20Xaa2i), endomorfina-1, endomorfina2, nocistatina, dalargina, lupron, e substância P e outros peptídeos analgési8 cos descritos aqui. Estes peptídeos podem, por exemplo, ser usados para substituir Xaa20Xaa21.
Quando Xaai ou o aminoácido amino terminal do peptídeo da invenção (por exemplo, Xaa2ou Xaa3) é Trp, Tyr ou Phe, o peptídeo tem um 5 sítio de divagem de quimotripsina que está localizado em uma posição onde a divagem liberará a porção do amino terminal de peptídeo a Xaai (ou Xaa2 ou Xaa3) juntamente com Xaa-ι, Xaa2ou Xaa3. Quando Xaai ou o aminoácido amino terminal do peptídeo da invenção (por exemplo, Xaa2 ou Xaa3) é Lys ou Arg, o peptídeo tem um sítio de divagem de tripsina que está localizado 10 em uma posição onde a divagem liberará porção do amino terminal de peptídeo a Xaai juntamente com Xaai, Xaa2 ou Xaa3. Quando Xaai ou o aminoácido amino terminal do peptídeo da invenção é Leu, lie ou Vai, o peptídeo pode ter um sítio de divagem de quimotripsina que está localizado em uma posição onde a divagem liberará a porção do amino terminal de peptídeo a 15 Xaai. Em pH relativamente alto o mesmo efeito é visto, quando Xaai é His.
Assim, por exemplo, se o peptídeo inclui um amino terminal de peptídeo anaigésico a Xaai, o peptídeo será liberado no trato digestivo quando da exposição à protease apropriada. Entre os peptídeos analgésicos que podem estar incluídos no peptídeo estão: AspPhe, endomorfina-1, endomorfina-2, 20 nocistatina, dalargin, lupron, e substância p, e outros peptídeos analgésicos descritos aqui.
Quando totalmente dobradas, as ligações de dissulfeto estão presentes entre: Cys6 e Cysn; Cys7e Cysi5; e Cys10 e Cysi8- Os peptídeos da invenção portam alguma similaridade em relação a seqüência a peptí25 deos de ST. No entanto, eles incluem mudanças e/ou adições de aminoácido que aperfeiçoam a funcionalidade. Estas mudanças podem, por exemplo, aumentar ou diminuir a atividade (por exemplo, aumentar ou diminuir a capacidade do peptídeo de estimular motilidade intestinal), alterar a capacidade do peptídeo de dobrar corretamente, a estabilidade do peptídeo, a capa30 cidade do peptídeo de ligar receptor de GC-C e/ou diminuir a toxicidade. Em alguns casos, os peptídeos podem funcionar mais desejavelmente do que peptídeo de ST do tipo selvagem. Por exemplo, eles podem limitar os efeitos colaterais indesejáveis, tais como diarréia e desidratação.
Em algumas concretizações, um ou ambos os membros de um ou mais pares de resíduos de Cys, que normalmente formam uma ligação de dissulfeto, pode ser substituída por homocisteína, 3-mercaptoprolina (Kolodziej e outros, 1996 Int J Pept Protein Res 48:274); beta,beta-dimetilcisteína (Hunt e outros, 1993 Int J Pept Protein Res 42:249) ou ácido diaminopropiônico (Smith e outros, 1978 J Med Chem 21:117) para formar reticulações internas alternativas nas posições das ligações de dissulfeto normais.
Além disso, uma ou mais ligações de dissulfeto podem ser substituídas por reticulações covalentes alternativas, por exemplo, uma ligação de amida, uma ligação de éster, uma ligação de alquila, uma ligação de tioéster, uma ponte de lactama, uma ligação de carbamoíla, uma ligação de uréia, uma ligação de tiouréia, uma ligação de éster de fosfonato, uma ligação de alquila e uma ligação de alquenila, um éter, uma ligação de tioéter, ou uma ligação de amina. Por exemplo, Ledu e outros (Proceedings Nat'1 Acad. Sei. 100:11263-78, 2003) descreveram métodos para a preparação de reticulações de amida e lactama. Schafmeister et al. (J. Ant Chem. Soc. 122:5891, 2000) descrevem todas as reticulações de carbono. Em alguns casos, a geração de tais reticulações alternativas exige substituição dos resíduos de Cys com outros resíduos, tais como Lys ou Glu ou aminoácidos de ocorrência não natural.
No caso de um peptídeo compreendendo a seqüência (l): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys8 Cys? Xaa8 Xaa9 Cys10 Cysn Xaai2 Xaai3 Xaa14 Cys15 Xaa-ie Xaai7 Cysw Xaai9Xaa20 Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3Xaa4 Xaag está faltando e/ou a seqüência Xaai9 Xaa20 Xaa2i está faltando, o peptídeo pode ainda conter aminoácidos carbóxi terminal ou amino terminal, ou ambos. Por exemplo, o peptídeo pode incluir uma seqüência amino terminal que facilita a produção recombinante do peptídeo e é clivado antes da administração do peptídeo a um paciente. O peptídeo pode também incluir outros aminoácidos amino-terminais ou carbóxi-terminais. Em alguns casos, os aminoácidos adicionais protegem o peptídeo, estabilizam o peptídeo ou alteram a atividade do peptídeo. Em alguns casos, alguns ou a totalidade dos aminoácidos adicionais são removidos antes da administração do peptídeo a um paciente. O peptídeo pode incluir 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100 ou mais aminoácidos em seu carbóxi terminal ou amino terminal, ou ambos. O número de aminoácidos de flanqueamento não necessitam ser iguais. Por exemplo, pode haver 10 aminoácidos adicionais no amino terminal do peptídeo e nenhum no carbóxi terminal.
Em uma concretização, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysw Cysn Xaai2 Xaau Xaau Cysi5 Xaai6 Xaav Cys18 Xaai9 Xaa2oXaa2i (SEQ ID NO:
119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa-|2 é Asn; Xaa-i3 é Pro; Xaai4 θ Ala; Xaa-ieé Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaav é Gly; Xaai9 é Tyr ou Leu; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou está faltando. Onde Xaa20Xaa2i e/ou Xaa-ι Xaa2Xaa3Xaa4 Xaa5 estão faltando, pode haver aminoácidos de flanqueamento adicionadais em algumas concretizações.
Em segundo aspecto, a invenção também caracteriza um método profilático ou terapêutico compreendendo administração de um peptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cys10 Cysn Xaa-|2 Xaai3 Xaai4 Cysi5 Xaaie Xaa-j7 Cysi8 Xaa19 Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121) ou está faltando, ou Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4está faltando e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, Ue, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9é Leu, He, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaav é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; XaaM é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, He, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaai6 é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaav é Gly, Pro ou Ala; Xaai9 é Trp, Tyr, Phe ou Leu; e Xaa20 Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaai9 Xaa2o Xaa2i está faltando.
Em certas concretizações dos métodos terapêuticos ou profiláticos: o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio CysnXaai2 Xaai3 Xaau Cysi5 Xaai6 Xaai7Cysis Xaa-|9 Xaa2oXaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3
Xaa4Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr, ou Phe; Xaa-i2é Asn; Xaa-i3 é Pro; Xaai4é Ala; Xaa^é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp ou Xaai6 é qualquer aminoácido ou Xaa-i6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp ou Xaa16 é qualquer aminoácido não aromático; Xaa17é Gly; Xaa-i9é Tyr ou Leu; e Xaa2oXaa2i θ AspPhe ou está faltando.
Em certas concretizações, a invenção caracteriza um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (II):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysw Cys«n Asn12 Proi3 Alai4 Cysi5 Xaaw Glyi7Cysi8 Xaa-|9 Xaa2oXaa2i (SEQ ID NO:
120) , em que
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO:
121) ou está faltando, ou Xaai Xaa2 Xaa3Xaa4está faltando e Xaa5é Asn;
Xaa8 é Glu ou Asp;
Xaa9 é Leu, lie, Vai, Trp, Tyr ou Phe;
Xaawé Thr, Ala, Trp;
Xaai9 é Trp, Tyr, Phe ou Leu ou está faltando; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe.
Em várias concretizações preferidas a invenção caracteriza um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (II): Xaaí Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 CysioCysn Asni2 Proi3 Alau Cysis Xaa-i6Gly17 Cys18 Xaai9 Xaa20Xaa2i (SEQ ID NO: 120), em que, Xaa9é Leu, lie ou Vai e Xaai8 é Trp, Tyr ou Phe; Xaa9 é Trp, Tyr ou Phe, e Xaai8 é Trp ou Ala; Xaa-ig é Trp, Tyr, Phe e Xaa2oXaa2i é AspPhe; e Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa5 é Asn; o peptídeo compreende menos do que 50, 40, 30 ou 25 aminoácidos; menos do que cinco aminoácidos precedem Cyse.
Os peptídeos podem ser co-administrados com ou ligados, por exemplo, covalentemente ligados, a qualquer uma de uma variedade de outros peptídeos, incluindo peptídeos analgésicos ou compostos analgésicos. Por exemplo, um peptídeo terapêutico da invenção podem estar ligado a um agente analgésico selecionado do grupo que consiste em: bloqueadores de canais de cálcio (por exemplo, ziconotídeo), antagonistas de receptor de 5HT totais ou parciais (por exemplo, antagonistas de receptor de 5HT3,
5ΗΤ4 e 5HT1), agonistas de receptor de 5HT totais ou parciais incluindo 5HT3, 5HT4 (por exemplo tegaserod, mosaprida e renzaprida) e agonistas de receptor de 5HT1, agonistas de receptor de CRF (NBI-34041), agonistas de receptor de beta-3 adreno, agonistas de receptor de opióide (por exemplo, loperamida, fedotozina, e fentanila, naloxona, naltrexona, metil nalozona, nalmefeno, cipridima, beta fimaltrexamina, naloxonazina, naltrindol, e nor-binaltorfimina, morfina, difeniloxilato, encefalina pentapeptídeo, asimadolina, e trimebutina), antagonistas de receptor de NK1 (por exemplo, ezlopitant e SR14033), agonistas de receptor de CCK (por exemplo, loxiglumida), antagonistas de receptor de NK1, antagonistas de receptor de NK3 (por exemplo, talnetant, osanetant (SR-142801)), inibidores de recaptação de norepinefrina-serotonina (NSRI; por exemplo, milnacipran), agonistas de receptor de vanilóide e canabanóide (por exemplo, arvanil), sialorfin, peptídeos relacionados com sialorfin compreendendo a seqüência de aminoácidos QHNPR (SEQ ID NO: 111) por exemplo, VQHNPR (SEQ ID NO: 112); VRQHNPR (SEQ ID NO: 113); VRGQHNPR (SEQ ID NO: 114); VRGPQHNPR (SEQ ID NO: 115); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO: 116); VRGPRRQHNPR (SEQ ID NO: 117); e RQHNPR (SEQ ID NO: 118), compostos ou peptídeos que são inibidores de neprilisina, fracefamida (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2 WO 01/019849 A1), loperamida, Tyr-Arg (ciotorfina), agonistas de receptor de CCK (caeruleina), peptídeos de conotoxina, análogos de peptídeo de timulina, loxiglumida, dextoxiglumida (o isômero R de loxiglumida) (WO 88/05774) e outros peptídeos analgésicos ou compostos podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Espaçadores de aminoácido, não aminoácido, peptídeo e não peptídeo podem ser interpostos entre um peptídeo que é um agonista de receptor de GC-C e um peptídeo que tem alguma outra função biológica, por exemplo, um peptídeo analgésico ou um peptídeo usado para tratar obesidade. O ligador pode ser um que é clivado a partir dos peptídeos de flanqueamento in vivo ou um que permanece ligado aos peptídeos de flanqueamento in vivo. Por exemplo, glicina, beta-alanina, glicilglicina, glicilbetaalanina, ácido gama-aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, L-fenilalanina, L13 triptofano e glicil-L-valil-L-fenilalanina podem ser usados como um espaçador (Chaltin e outros, 2003 Helvetica Chimica Acta 86:533-547; Caliceti e outros, 1993 FARMCO 48:919-32), como o podem polietileno glicóis (Butterworth e outros, 1987 J. Med. Chem 30:1295-302) e derivados de maleími5 da (King e outros, 2002 Tetrahedron Lett. 43:1987-1990). Vários outros ligadores são descritos na literatura (Nestler 1996 Molecular Diversity 2:35-42;
Finn e outros, 1984 Biochemistry 23 :2554-8; Cook e outros, 1994 Tetrahedron Lett. 35:6777-80; Brokx e outros, 2002 Journal of Controlled Release 78:115-123; Griffin e outros, 2003 J. Am. Chem. Soc. 125:6517-6531; Robin10 son e outros, 1998 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:5929-5934).
Os peptídeos podem incluir a seqüência de aminoácidos de um peptídeo que ocorre naturalmente em uma espécie de vertebrado (por exemplo, mamífero) ou em uma espécie bacteriana. Além disso, os peptídeos podem ser peptídeo parcialmente ou totalmente de ocorrência não natural.
Também dentro da invenção estão os peptidomiméticos, que correspondem aos peptídeos da invenção. Em várias concretizações, o paciente está sofrendo de um distúrbio gastrointesinal; o paciente está sofrendo de um distúrbio selecionado do grupo que consiste em: um distúrbio de motilidade gastrointestinal, síndrome do intestino irritável, constipação crônica, um dis20 túrbio gastrointestinal funcional, doença de refluxo gastroesofageano, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia de não úlcera, gastroparesia, pseudo-obstrução intestinal crônica, Doença de Crohn, colite ulcerativa, Síndrome do intestino irritável, pseudo-obstrução colônica, obesidade, falha cardíaca congestiva, ou hiperplasia prostática benigna; a composição é 25 administrada oralmente; o peptídeo compreende 30 ou menos aminoácidos, o peptídeo compreende 20 ou menos aminoácidos, e o peptídeo compreende não mais do que 5 aminoácidos antes de Cys6í o peptídeo compreende 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, ou 30 ou menos aminoácidos. Em outras concretizações, o peptídeo compreende 20 ou menos a30 minoácidos. Em outras concretizações o peptídeo compreende não mais do que 20, 15, 10, ou 5 peptídeos subseqüentes a Cysis. Em certas concretizações, Xaa-jg é um sítio de divagem de quimotripsina ou tripsina e um peptí14 deo analgésico está presente imediatamente após Xaaw.
Em um terceiro aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de um paciente que sofre de constipação. Critérios clinicamente aceitos que definem constipação variam da freqüência de movimentos intestinais, a consistência das fezes e a facilidade de movimento intestinal. Uma definição comum de constipação é menos do que três movimentos de intestino por semana. Outras definições incluem evacuações ou defecação duras, que exigem esforços violentos (Schiller 2001, Aliment Pharmacol Ther 15:749-763). Constipação pode ser idiopática (constipação funcional ou constipação de trânsito lento) ou secundária a outros casos, incluindo distúrbios neurológicos, metabólicos ou endócrinos. Estes distúrbios incluem diabetes mellitus, hipotiroidismo, hipertiroidismo, hipocalcemia, esclerose múltipla, Doença de Parkinson, lesões da coluna espinhal, Neurofibromatosis, neuropatia autônoma, Doença de Chagas, doença de Hirschsprung e fibrose cística. Constipação pode também ser o resultado de cirurgia (íleo pósoperativo) ou devido ao uso de drogas tais como analgésicos (tipo opióides), antiipertensivos, anticonvulsivantes, antidepressores, antiespasmódicos e anti psicóticos.
O método compreendendo a administração de uma composição compreendendo um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cys10 Cysn Xaai2 Xaai3 Xaa14 Cysw Xaaw Xaa-|7 Cysw Xaaw Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2Xaa3Xaa4Xaa5é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121) ou está faltando, ou Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, lie, Thr, ou Phe; Xaa8é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaag é Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaa13é Pro ou Gly; Xaa-14 é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, lie, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaaw é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa^ é Gly, Pro ou Ala; Xaaw θ Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaaw θ Lys ou Arg; Xaa20Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa20é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaaw Xaa20Xaa2i está faltando.
Em uma concretização do método, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys8 Cys7 Xaa8 Xaag Cysw Cysu Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysi5Xaai6 Xaav Cysw Xaaig Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa12 é Asn; Xaa-i3é Pro; Xaau é Ala; Xaa16 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa-|7 é Gly; Xaa-ig é Tyr ou Leu; Xaaig é Lys ou Arg; Xaa20Xaa21 é AspPhe ou está faltando.
Em várias concretizações preferidas, a constipação está associada ao uso de um agente terapêutico; a constipação está associada a um distúrbio neurológico; a constipação é constipação pós-cirúrgica (íleo pósoperativo); e a constipação associada a um distúrbio gastrointesinal; a constipação é idiopática (constipação funcional ou constipação de trânsito lento); a constipação está associada a um distúrbio neuropático, metabólico ou endócrino (por exemplo, diabetes mellitus, hipotiroidismo, hipertiroidismo, hipocalcemia, esclerose múltipla, Doença de Parkinson, lesões da coluna espinhal, neurofibromatose, neuropatia autônoma, Doença de Chagas, Doença de Hirschsprung ou fibrose cística). Constipação pode também ser o resultado de cirurgia (íleo pós-operativo) ou devido ao uso de drogas tais como analgésicos (por exemplo, opióides), antihipertensivos, anticonvulsivantes, antidepressores, antiespasmódicos e antipsicóticos.
Em um quarto aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de um paciente que sofre de um distúrbio gastrointestinal, o método compreendendo a administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaag Cysio Cysu Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cys-is Xaai6 Xaav Cysi8 Xaaw Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121) ou está faltando, ou Xaa-i Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa8 é Asn, Trp, Tyr, Asp, lie, Thr, ou Phe; Xaa8é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaag é Leu, ILe, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa-i2é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3é Pro ou Gly; Xaau é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, lie, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaaw θ Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaav é Gly, Pro ou Ala; Xaaig é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaa-ig é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou está fal16 tando ou Xaa20é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaa19Xaa20 Xaa2i está faltando.
Em uma concretização do método, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaa^i Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysw Cysu Xaai2 Xaai3 Xaau Cysis Xaai6 Xaai7 Cysi8 Xaai9 Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyrou Phe; Xaai2é Asn; Xaai3é Pro; Xaai4 é Ala; Xaai6 é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaav é Gly; Xaai9 é Tyr ou Leu; Xaai9é Lys ou Arg; Xaa20Xaa2i é AspPhe ou está faltando.
Em várias concretizações, o paciente está sofrendo de um distúrbio gastrointesinal; o paciente está sofrendo do distúrbio selecionado do grupo que consiste em: um distúrbio de motilidade gastrointestinal, síndrome do intestino irritável, constipação crônica, um distúrbio gastrointestinal funcional, distúrbio de refluxo gastroesofageano, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia de não úlcera, gastroparesia, pseudo-obstrução intestinal crônica, Doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória do intestino, pseudo-obstrução colônica, obesidade, falha cardíaca congestiva, ou hiperplasia prostática benigna.
Em várias concretizações preferidas, Xaa9 é Leu, lie ou Vai e Xaaw é Trp, Tyr ou Phe; Xaa9 é Trp, Tyr ou Phe e Xaa-|6 é Thr ou Ala; Xaai9 é Trp, Tyr, Phe; Xaai9é Lys ou Arg; Xaa20 Xaa2i é AspPhe; Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa5 é Asn.
Em um quinto aspecto, a invenção caracteriza um método para aumentar motilidade gastrointestinal em um paciente, o método compreendendo: administração ao paciente da composição compreendendo um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysw Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysi5 XaaieXaav Cysis Xaai9 Xaa20Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121) ou está faltando, ou Xaa-i Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa5é Asn, Trp, Tyr, Asp, lie, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9é Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa-|2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaa13 é Pro ou Gly; Xaai4 é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, He, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaa-i6é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly, Pro ou Ala; Xaaig é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaaig é Lys ou Arg; Xaa20Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaaig Xaa2oXaa2i está faltando.
Em uma concretização, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys8 Cys7Xaa8 Xaa9 Cys™ Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysi5 Xaa-ie Xaav Cysis Xaai9 Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa-|2 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaau é Ala; Xaai6é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaavé Gly; Xaai9 é Tyr ou Leu; Xaaig é Lys ou Arg; Xaa20Xaa2i é AspPhe ou está faltando.
Em um sexto aspecto, a invenção caracteriza um método para o aumento da atividade de um receptor de guanilato ciclase (GC-C) intestinal em um paciente, o método compreendendo: administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cys™ Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysi5 Xaa-ιθ Xaai7 Cysw Xaa-|9 Xaa2oXaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121) ou está faltando, ou Xaai Xaa2 Xaa3Xaa4 está faltando e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, He, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9é Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaai4 é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, lie, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaai6é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa17 é Gly, Pro ou Ala; Xaaig é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaa-i9 é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaai9Xaa20Xaa2i está faltando.
Em uma concretização o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaa-ι Xaa2 Xaa3Xaa4Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaa-12 Xaan Xaa14 Cys15 Xaa^ Xaai7 Cys18 Xaaig Xaa20Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa-|2 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaai4 é Ala; Xaaieé Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa-|7 é Gly; Xaa-i9é Tyr ou Leu; Xaa-|9 é Lys ou Arg; Xaa20 Xaa2i é AspPhe ou está faltando.
Em um sétimo aspecto, a invenção caracteriza uma molécula de ácido nucléico isolado compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos: (I): Xaai Xaa2Xaa3 Xaa4Xaa5 Cys6 Cys7Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaai2 Xaai3Xaai4 Cysi5 Xaa16 Xaa17 Cysi8 Xaa-ig Xaa20Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr ou está faltando, ou Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr Asp, lie, Thr, ou Phe; Xaa8é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaag é Leu, He, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa-|2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaau θ Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, lie, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaai6é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa17é Gly, Pro ou Ala; Xaa-ig é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaa19 é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa20 é Asn ou Glu e Xaa2i, está faltando ou XaaigXaa2o Xaa2i está faltando.
Em uma concretização, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (1): Xaai Xaa2 Xaa3Xaa4Xaa5 Cys8Cys7 Xaa8 Xaag Cysio Cysn Xaai2 Xaan Xaa-|4 Cysi5 Xaai6 Xaai7 Cysi8 Xaaig Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaag é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaa-|4 é Ala; Xaai6 é Thr Ala, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly; Xaaig é Tyr ou Leu; Xaa-ig é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2^ é AspPhe ou está faltando.
Em um oitavo aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de constipação, o método compreendendo a administração de um agonista do receptor de guanilato ciclase (GCC) intestinal. Em várias concretizações: o agonista é um peptídeo, o peptídeo inclui quatro Cys que formam duas ligações de dissulfeto, e o peptídeo inclui seis Cys que formam três ligações de dissulfeto.
Em um nono aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de um distúrbio gastrointesinal, um distúrbio de motilidade gastrointestinal, síndrome do intestino irritável, constipação crônica, um distúrbio gastrointestinal funcional, distúrbio de refluxo gastroesofageano azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia de não úlcera, gastroparesia, pseudo-obstrução intestinal crônica, pseudo-obstrução colônica, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória do intestino, obesidade, falha cardíaca congestiva, ou hiperplasia prostática benigna, o método compreendendo a administração de um agonista do receptor de guanilato ciclase (GCC) intestinal ou oralmente, por supositório retal, ou parenteralmente. Em várias concretizações: o agonista é um peptídeo, o peptídeo inclui quatro Cys que formam duas ligações de dissulfeto, e o peptídeo inclui seis Cys que formam três ligações de dissulfeto.
Em um décimo aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de um distúrbio gastrointesinal selecionado do grupo que consiste em: um distúrbio de motilidade gastrointestinal, síndrome do intestino irritável, constipação crônica, um distúrbio gastrointestinal funcional, doença de refluxo gastroesofageano, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia de não úlcera, gastroparesia, pseudo-obstrução intestinal crônica, pseudo-obstrução colônica, Doença de Crohn, colite ulcerativa, doença inflamatória do intestino, o método compreendendo a administração de um agonista do receptor de guanilato ciclase (GC-C) intestinal. Em várias concretizações, a composição é administrada oralmente; o peptídeo compreende 30 ou menos aminoácidos, o peptídeo compreende 20 ou menos aminoácidos, e o peptídeo compreende não mais do que 5 aminoácidos antes de Cys5.
Em várias concretizações: o agonista é um peptídeo, o peptídeo inclui quatro Cys que formam duas ligações de dissulfeto, e o peptídeo inclui seis Cys que formam três ligações de dissulfeto.
Em um décimo primeiro aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de obesidade, o método compreendendo a administração de um agonista do receptor de guanilato ciclase (GC-C) intestinal. Em várias concretizações: o agonista é um peptídeo, o peptídeo inclui quatro Cys que formam duas ligações de dissulfeto, e o peptídeo inclui seis Cys que formam três ligações de dissulfeto.
Em um décimo segundo aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de obesidade, o método compreendendo a adminis20 tração de um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos: (I):
Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysw Cysn Xaai2 Xaa-13 Xaai4 Cys^ Xaa-i6 Xaai7 Cysw Xaai9 Xaa20 Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr(SEQ ID NO: 121) ou está faltando, ou Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa5 é Asn, Trp, Tyr, Asp, lie, Thr, ou Phe; Xaa8é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9 é Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaa14 é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, lie, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaa-ie é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa17 é Gly, Pro ou Ala; Xaa19 é Trp, Tyr, Phe ou Leu; e Xaa20 Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa20 é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaai9Xaa20 Xaa2i está faltando. O peptídeo pode ser administrado sozinho ou em combinação com um outro agente para o tratamento de obesidade, por exemplo, agente de sibutramina ou um outro agente, por exemplo, um agente descrito aqui.
Em uma concretização o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3Xaa4Xaa5 Cys8 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cys10 Cysn Xaai2 Xaan Xaa^ Cysi5 Xaai6Xaai7 Cysw Xaai9 Xaa20 Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaa-ι Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa-|2 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaai4 é Ala; Xaaie é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaa-|7 é Gly; Xaai9 é Tyr ou Leu; e Xaa20 Xaa21 é AspPhe ou está faltando.
Em um décimo terceiro aspecto, a invenção caracteriza uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo descrito aqui.
Em um décimo quarto aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de falha cardíaca congestiva, o método compreendendo: administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (1): Xaa! Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cys10 Cysn Xaa-|2 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaa^ Xaa-i7 Cysi8 Xaai9Xaa20 Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121) ou está faltando, ou Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa5é Asn, Trp, Tyr, Asp, lie, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9é Leu, lle, Vai, Ala, Lys,
Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaai3 é Pro ou Gly; Xaai4 é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, He, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaa-i6é Thr, Ala, Asn, Lys, Arg, Trp; Xaa-|7, é Gly, Pro ou Ala; Xaa^é Trp, Tyr, Phe ou Leu; e Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa20 é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaa-i9 Xaa20 Xaa2i está faltando. O peptídeo pode ser administrado em combinação com um outro agente para o tratamento de falha cardíaca congestiva, por exemplo, um peptídeo natriurético tal como peptídeo natriurético atrial, peptídeo natriurético cerebral ou peptídeo natriurético de tipo C, um diurético, ou um inibidor de enzima conversora de angiotensina.
Em uma concretização, o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3Xaa4Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaag Cysio Cysn Xaa12 Xaa-13 Xaa14 Cysi5 Xaai6 Xaai7 Cysi8 Xaa-i9 Xaa20 Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaa-|2 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaau é Ala; Xaa^é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaai7é Gly; Xaai9é Tyr ou Leu; Xaa19é Lys ou Arg; Xaa2o Xaa2i é AspPhe ou está faltando.
Em um décimo quinto aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de hiperplasia prostática benigna, o método compreendendo: administração ao paciente de uma composição compreendendo um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (l): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaai2 Xaai3 Xaai4 Cysis Xaaie Xaa17 Cysi8 Xaai9 Xaa2oXaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaa! Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121) ou está faltando, ou Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 está faltando e Xaa5é Asn, Trp, Tyr, Asp, lie, Thr, ou Phe; Xaa8 é Glu, Asp, Gin, Gly ou Pro; Xaa9é Leu, lie, Vai, Ala, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn, Tyr, Asp ou Ala; Xaa-i3 é Pro ou Gly; Xaa-i4 é Ala, Leu, Ser, Gly, Vai, Glu, Gin, lie, Leu, Lys, Arg, e Asp; Xaa-i6 é Thr, Ala, Asn, Lys Arg, Trp; Xaai7é Gly, Pro ou Ala; Xaai9 é Trp, Tyr, Phe ou Leu; Xaa-i9 é Lys ou Arg; Xaa20 Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa2o é Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaai9 Xaa20 Xaa2i está faltando.
O peptídeo pode ser administrado em combinação com um outro agente para o tratamento de BPH, por exemplo, um inibidor de 5-alfa reduta22 se (por exemplo, finasterídeo), ou um inibidor alfa adrenérgico (por exemplo, doxazosina).
Em uma concretização o peptídeo compreende a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysio Cysn Xaa12 Xaan Xaa-14 Cysi5 Xaai6Xaai7 Cys18 Xaai9Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 está faltando; Xaa8 é Glu; Xaa9 é Leu, lie, Lys, Arg, Trp, Tyr ou Phe; Xaai2 é Asn; Xaai3 é Pro; Xaau é Ala; Xaaw é Thr, Ala, Lys, Arg, Trp; Xaai7 é Gly; Xaai9 é Tyr ou Leu; e Xaa2oXaa2i é AspPhe ou está faltando.
Em um décimo sexto aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento ou redução de dor, incluindo dor visceral, dor associada a um distúrbio gastrointesinal ou dor associada a alguma outro distúrbio, o método compreendendo: administração a um paciente de uma composição compreendendo um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cys™ Cysu Xaai2 Xaan Xaai4 Cysi5 Xaa^ Xaai7 Cysis Xaa-|9 Xaa2oXaa2i (SEQ ID NO: 119), por exemplo, um polipeptídeo purificado compreendendo uma seqüência de aminoácidos descrita aqui.
Em um décimo sétimo aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de inflamação, incluindo inflamação do trato gastrointestinal, por exemplo, inflamação associada a um distúrbio ou infecção gastrointesinal, ou algum outro distúrbio, o método compreendendo: administração a um paciente de uma composição compreendendo um polipeptídeo purificado compreendendo a seqüência de aminoácidos (I): Xaa! Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa8 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysw Cysn Xaai2 Xaan Xaa14 Cysw Xaaw Xaai7 Cysw Xaai9Xaa2oXaa21 (SEQ ID NO: 119), por exemplo, um polipeptídeo purificado compreendendo uma seqüência de aminoácidos descrita aqui.
Em certas concretizações, o peptídeo inclui um peptídeo compreendendo ou consistindo em uma seqüência de aminoácidos Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys Cys Glu Xaa9 Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Xaa2o Xaa2i (II) (SEQ ID NO: 66), em que Xaa9 é qualquer aminoácido, em que Xaagé qualquer aminoácido outro que não Leu, em que Xaagé selecionado de Phe, Trp e Tyr; em que Xaag é selecionado de qualquer outro aminoácido aromático natural ou não natural, em que Xaa9 é Tyr; em que Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é Asn Ser Ser Asn Tyr (SEQ ID NO: 121); em que Xaa-i, Xaa2, Xaa3, Xaa4, e Xaa5 estão faltando; em que Xaai, Xaa2, Xaa3 e Xaa4 estão faltando; em que Xaa-ι, Xaa2 e Xaa3 estão faltando; em que Xaai e Xaa2 estão faltando; em que Xaai está faltando; em que Xaa20 Xaa2i é AspPhe ou está faltando ou Xaa2o θ Asn ou Glu e Xaa2i está faltando ou Xaai9Xaa2o Xaa2i está faltando. No caso de um peptídeo compreendendo a seqüência (I): Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys6 Cys7 Xaa8 Xaa9 Cysw Cysn Xaai2 Xaa-i3 Xaai4 Cysw Xaa-w Xaai7 Cysw Xaaw Xaa2o Xaa2i (SEQ ID NO: 119), em que: Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa8 está faltando e/ou a seqüência Xaaw Xaa2o Xaa2i está faltando peptídeo pode ainda conter aminoácidos carbóxiterminais ou amino-terminais, ou ambos.
Entre os peptídeos úteis estão os peptídeos compreendendo, consistindo em, ou consistindo essencialmente na seqüência de aminoácidos Xaai Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Cys Cys Glu Xaa9 Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Xaa20 Xaa2i (II) (SEQ ID NO: 66) são os seguintes peptídeos: Gin Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 67)
Asn Thr Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr(SEQIDNO: 68)
Asn Leu Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr(SEQIDNO: 69)
Asn lie Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 70)
Asn Ser Ser Glu Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 71)
Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 72)
Gin Ser Ser Gln Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 73)
Ser Ser Gin Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 74).
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ala Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 75)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 76)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Asn Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr(SEQIDNO: 77)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Asp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 78)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Cys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 79)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Gin Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQIDNO: 80)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 81)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Gly Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 82)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu His Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQIDNO: 83)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu lie Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQIDNO: 84)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQIDNO: 85)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Met Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr(SEQIDNO: 86)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys
Tyr (SEQ ID NO: 87)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Pro Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 88)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Ser Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQIDNO: 89)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Thr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 90)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 91)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQIDNO: 92)
Cys Cys Glu Ala Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 93) Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 94) Cys Cys Glu Asn Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 95) Cys Cys Glu Asp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 96) Cys Cys Glu Cys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 97) Cys Cys Glu Gin Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 98) Cys Cys Glu Glu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 99) Cys Cys Glu Gly Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 100)
Cys Cys Glu His Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 101)
Cys Cys Glu lie Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 102) Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:
103)
Cys Cys Glu Met Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:
104)
Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:
105)
Cys Cys Glu Pro Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:
106)
Cys Cys Glu Ser Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:
107)
Cys Cys Glu Thr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:
108)
Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 109)
Cys Cys Glu Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 110).
Em um décimo oitavo aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de falha cardíaca congestiva, o método compreendendo a administração de um agonista completo ou parcial do receptor de guanilato ciclase (GC-C) intestinal. O agonista pode ser administrado em combinação com um outro agente para o tratamento de falha cardíaca congestiva, por exemplo, um peptídeo natriurético tal como peptídeo natriurético artrial, peptídeo natriurético cerebral ou peptídeo natriurético de tipo C, um diurético, ou um inibidor de enzima conversora de angiotensina.
Em décimo nono aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de BPH, o método compreendendo a administração de um agonista completo ou pacial do receptor de guanilato ciclase (GC-C) intestinal. O agonista pode ser administrado em combinação com um outro agente para o tratamento de BPH, por exemplo, um inibidor de 5-alfa redutase (por exemplo, finasterídeo), ou um inibidor alfa adrenérgico (por exemplo, doxazosina).
Em um vigésimo aspecto, a invenção caracteriza um método para o tratamento de obesidade, o método compreendendo a administração de um agonista completo ou pacial do receptor de guanilato ciclase (GC-C) intestinal. O agonista pode ser administrado em combinação com um outro agente para o tratamento de obesidade, por exemplo, peptídeo de fragmento de hormônio do intestino YY3-36 (PYY3-36) (N. Engl. J. Med. 349: 941, 2003; ikpeapge daspeenlnry yaslrhylnl vtrqry) glp-1 (peptídeo 1 de tipo glucagon), exendin-4 (um inibidor de glp-1), sibutramina, fentermina, fendimetrazina, cloridrato de benzfetamina (Didrex), orlistat (Xenical), cioridrato de dietilpropion (Tenuate), fluoxetina (Prozac), bupropion, efedra, cromo, garcínia cambogia, benzocaína, alga marinha (Fucus vesiculosus), quitosano, nomame herba, galega (Goat’s Rue, French Lilac), ácido linoléico conjugado, Lcarnitina, fibra (fibra de psílio, plantago, guar), cafeína, desidroepiandrosterona, germander (Teucrium chamaedrys), B-hidróxi-beta-metilbutirato e piruvato. Um peptídeo útil para 0 tratamento de obesidade pode ser administra27 do como uma co-terapia com um peptídeo da invenção, ou como uma molécula distinta, ou como parte de uma proteína de fusão com um peptídeo da invenção. Assim, por exemplo, PYY3-36 pode ser fundido ao terminal carbóxi ou amina de um peptídeo da invenção. Tal proteína de fusão pode incluir um sítio de divagem de quimotripsina ou tripsina, que pode permitir que a divagem separe os dois peptídeos.
Os peptídeos e agonista do receptor de guanilato ciclase (GC-C) intestinal pode ser usado para tratar constipação ou motilidade intestinal diminuída, digestão lenta ou esvaziamento de estômago lento. Os peptídeos podem ser usados para aliviar um ou mais sintomas de IBS (inchamento, dor, constipação), GERD (refluxo de ácido para dentro do esôfago), dispepsia funcional, gastroparesia (náusea, vômito, inchamento, esvaziamento gástrico retardado) e outros distúrbios descritos aqui.
Os detalhes de uma ou mais concretizações da invenção são indicados na descrição anexa. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente são aqui incorporados por referência.
Figuras
A figura 1 mostra os resultados de análise de EMCL de peptídeo MD-915 e de peptídeo MM-416776 recombinante.
Figuras Ib e c mostram os resultados de análise de EMCL de peptídeo MD-1100 sintético e o branco.
Figura 2 mostra os resultados do ensaio de atividade de receptor GC-C intestinal de peptídeo MM-416776, peptídeo MD-915 e dois diferentes peptídeo MD-1100 sintéticos.
Figura 3a mostra 0 efeito de peptídeo MM-416776 recombinante e Zelnorm® em um modelo de trânsito gastrointestinal de murino.
Figura 3b mostra o efeito de peptídeo MD-1100 sintético e Zelnorn® em um modelo de trânsito gastrointestinal agudo de murino.
Figura 3b mostra o efeito de peptídeo MD-1100 sintético e Zelnorm® em um modelo de trânsito gastrointestinal crônico de murino.
Figuras 4a e 4b mostram os efeitos de peptídeos MD-915, MD1100, e MM-416776 em um modelo de trânsito gastrointestinal agudo de murino.
Figura 4c mostra o efeito de peptídeo MD-1100 em um modelo de trânsito gastrointestinal crônico de murino.
Figura 5a mostra o efeito de peptídeo MM-416776 e Zelnorm® em um modelo de secreção intestinal de camundongo que mama.
Figura 5b mostra os efeitos de MD 1100 e Zelnorm® em um modelo de secreção intestinal de camundongo.
Figuras 6a e 6b mostram os efeitos de peptídeos MM 416776, MD-1100 e MD-915 em um modelo de secreção intestinal de camundongo.
Figura 7 mostra os resultados da experiência em que atividade de MD-1100 foi analisada no modelo de distenção colônica de TNBS.
Figuras 8a e 8b mostram os efeitos de doses diferentes de MD915 e MD-1100 no ensaio de contorção de PBQ.
Figura 9 mostra os resultados de análise de determinação de Kd usando-se MD-1100 em um ensaio de ligação de radioligante competitivo.
Figuras 10a e 10b mostram os dados de biodisponibilidade para IV e MID-1100 oralmente administrado como detectado por um ensaio ELISA e EMCL.
Descrição Detalhada
Os peptídeos da invenção se ligam ao receptor de guanilato ciclase (GC-C) intestinal, um regulador chave de equilíbrio de fluido e eletrólito no intestino. Quando estimulado, este receptor, que está localizado na membrana apical da superfície epitelial do intestino, causa um aumento no GMP cíclico epitelial no intestino (cGMP). Acredita-se que este aumento em cGMP cause uma diminuição na absorção de água e sódio e um aumento em secreção de íons de potássio e cloreto, levando a mudanças no transporte de eletrólito e fluido intestinal e motilidade intestinal aumentada. O receptor de GC-C intestinal possui uma região de ligação de ligante extracelular, uma região de transmembrana, uma região de tipo cinase de proteína intracelular e um domínio catalítico de ciclase. Funções propostas para o receptor de GC-C são hemoestase de eletrólito, a regulação de proliferação epitelial e indução de apoptose (Shalubhai 2002 Gun Opin Drug Dis Devei 5:261-268).
Além de ser expresso no intestino por células epiteliais gastrointestinais, GC-C é expresso nos tecidos extra-intestinais, incluindo rim, pulmão, pâncreas, pituitária, adrenal, desenvolvimento de fígado (revistos em Vaandrager 2002, Mol Cell Biochem 230:73-83) e tecidos reprodutivos de macho e fêmea (revistos em Vaandrager 2002 Moll Cell Biochein 230:73-83). Isto sugere que os agonistas de receptor de GC-C podem ser usados no tratamento de distúrbios do lado de fora do trato Gl, por exemplo, falha cardíaca congestiva e hiperplasia protática benigna.
Ghrelin, um hormônio de peptídeo secretado pelo estômago, é um regulador chave de apetite em seres humanos. Níveis de expressão de Ghrelin são regulados por jejum e por esvaziamento gástrico (Kim e outros, 2003, Neuroreprt 14:1317-20; Gualillo e outros, 2003, FEBS Letts 552: 1059). Assim, por aumento da motilidade gastrointestinal, agonistas de receptor de GC-C podem também ser usados para regular obesidade.
Em seres humanos, o receptor de GC-C é ativado por guanilina (Gn) (patente U.S. n° 5.96.097), uroguanilina (Ugn) (patente U.S. n° 5.140.102) e limfoguanilina (Forte e outros, 1999, Endocrinology 140:18001806). De modo interessante, estes agentes são de 10-100 vezes menos pontentes do que uma classe de peptídeo bacteriamente derivados, chamados ST (revistos em Gianella 1995 J Lab Clin Med 125:173-181). Peptídeos ST são considerados super agonistas de GC-C e são muito resistentes à degração proteolítica.
Peptídeo ST é capaz de estimular o sistema nervoso entérico (Rolfe e outros, 1994, J Physiolo 475: 531-537; Rolfe e outros, 1999, Gut 44: 615-619; Nzegwu e outros, 1996, Exp Physiol 81: 313-315). Também, cGMP foi relatado ter efeitos anitnociceptivos em múltiplos modelos de dor de animais (Lazaro Ibanez e outros, 2001, Eur J Pharmacol 426: 39-44; Soares e outros, 2001, British J Pharmacol 134: 127-131; Jam e outros, 2001, Brain Res 909:170-178; Amarante e outros, 2002, Eur J. Pharmacol 454:19-23). Assim, agonitas de GC-C potem ter tanto efeito analgésico, quanto antiinflamatório.
Em bactérias, peptídeos ST são derivados de uma pré-pró30 proteína que geralmente tem pelo menos 70 aminoácidos. As pré- e próregiões são clivadas como parte do processo de secreção, e a proteína madura resultante, que em geral inclui menos do que 20 aminoácidos, é biologicamente ativa.
Entre os peptídeos ST bacterianos conhecidos estão:
ST Ib de E. coli (Moseley e outros, (1983) lnfect Immun. 39:1167) tendo a seqüência de aminoácidos madura Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 1); ST Ia de E. coli (So e McCarthy (1980) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77:4011) tendo a seqüência de aminoácidos madura Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 2); ST I* de E. coli (Chan e Giannella (1981) J. Biol. Chem. 256:7744) tendo a seqüência de aminoácidos madura Asn Thr Phe Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Tyr Pro Ala Cys Ala Gly Cys Asn (SEQ ID NO: 3); peptídeo ST C. freundii (Guarino e outros, (1989) lnfect. Immun. 57:649) tendo a seqüência de aminoácidos madura Asn Thr The Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 4); peptídeos ST de Y. enterocolitica, Y-ST(Y-STa), YSTb, e Y-STc (revisto em Huang e outros, (1997) Microb. Pathog. 22:89) tendo as seguintes seqüências de aminoácidos de pró-forma: Gin Ala Cys Asp Pro Pro Ser Pro Pro Ala Glu Vai Ser Ser Asp Trp Asp Cys Cys Asp Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ID NO: 5); (bem como uma variante de Ser-7 a Leu-7 de Y-STa (SEQ ID NO: 122), (Takao e outros, (1985) Eur. J. Biochem. 152:199)); Lys Ala Cys Asp Thr Gin Thr Pro Ser Pro Ser Glu Glu Asn Asp Asp Trp Cys Cys Gin Vai Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ID NO: 6); Gin Glu Thr Ala Ser Gly Gin Val Gly Asp Val Ser Ser Ser Thr lie Ala Thr Glu Val Ser Glu Ala Glu Cys Gly Thr Gin Ser Ala Thr Thr Gin Gly Glu Asn Asp Trp Asp Trp Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys (SEQ ID NO: 7), respectivamente; peptídeo ST de Y kristensenii tendo a seqüência de aminoácidos madura Ser Asp Trp Cys Cys Glu Val Cys Cys Asn Pro Ala Cys Ala Gly Cys (SEQ ID NO: 8); peptídeo de não 01 ST de V. chlolerae (Takao e outros, (1985) FEBS lett. 193:250) tendo a seqüência de aminoácidos madura lie Asp Cys Cys Glu He Cys Cys Asn Pro
Ala Cys Phe Gly Cys Leu Asn (SEQ ID NO: 9); e peptídeo ST de V. mimicus (Arita (1991) e outros, FEMS Microbiot Lett, 79:105) tendo a seqüência de aminoácidos madura lie Asp Cys Cys Glu lie Cys Cys Asn Pro Ala Cys Phe Gly Cys Leu Asn (SEQ ID NO: 10). A tabela abaixo provê seqüências da totalidade ou de uma porção de numerosos peptídeo ST maduros. Acesso de Gl de Gen- Seqüência
GenBank® Bank®
QHECIB 69638
P01559 123711
AAA24653 147878
P01560 123707
AAA27561 295439
P04429 123712
S34671 421286
CAA52209 395161
A54534 628844
AAL02159 15592919
AAA18472 487395
S25659 282047
P74977 3913874
BAA23656 2662339
P31518 399947
NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO: 1) NTFYCCELCCNPACAGCY (SEQ ID NO: 2) NTFYCCELCCNPACAPCY (SEQ ID NO: 11) NTFYCCELCCYPACAGCN (SEQ ID NO: 3) IDCCEICCNPACFGCLN (SEQ ID NO: 9) IDCCEICCNPACFGCLN (SEQ ID NO: 10) IDCCEICCNPACF (SEQ ID NO: 12) IDCCEICCNPACFG (SEQ ID NO: 13) IDCCEICCNPACFGCLN (SEQ ID NO: 14) IDRCEICCNPACFGCLN (SEQ ID NO: 15) DWDCCDVCCNPACAGC (SEQ ID NO: 16) DWDCCDVCCNPACAGC (SEQ ID NO: 17) NDDWCCEVCCNPACAGC (SEQ ID NO: 18) WDWCCELCCNPACFGC (SEQ ID NO: 19) SDWCCEVCCNPACAGC (SEQ ID NO: 8)
A forma imatura (incluindo pré- e pró-regiões) de proteína ST1A(ST-P) de E. coli tem a seqüência; mkklmlaifisvlsfpsfsqstesldsskekitletkkcdvvknnsekksenmnntfyccelccnpacagcy (SEQ ID NO: 20); ver o número de acesso no GenBank® P01559 10 (gi:123711). A pré-seqüência se prolonga a partir de aa 1-19. A próseqüência se prolonga a partir de aa 20-54. A proteína madura se prolonga a partir de 55-72. A forma imatura (incluindo pré- e pró-regiões) de proteína
ST-IB(ST-H) de E. coli tem a seqüência:
mkksilfiflsvlsfspfaqdakpvesskekitleskkcniakksnksgpesmnssnyccelccnpactgcy 15 (SEQ ID NO 21); ver o número de acesso no GenBank® P07965 (gi:3915589). A forma imatura (incluindo pré- e pró-regiões) de proteína ST e Y. enterocolitica tem a seqüência:
mkkivfvlvlmlssfgafgqetvsgqfsdalstpitaevykqacdpplppaevssdwdccdvccnpacag c (SEQ ID NO: 22); ver o número de acesso no GenBank® S25659 (gi:282047).
Os peptídeos da invenção, como os peptídeos ST bacterianos, têm seis resíduos de Cys. Estes seis resíduos de Cys formam três ligações de dissulfeto na forma madura e ativa do peptídeo. Se os seis resíduos de Cys forem identificados desde o terminal-amino até o terminal-carbóxi do peptídeo, como A, B, C, D, E, e F, então as ligações de dissulfeto se formam como segue: A-D, B-E, e C-F. A formação destas ligações é acreditada ser importante para ligação de receptor de GC-C. Alguns dos peptídeos da invenção incluem um sítio de divagem potencialmente funcional, por exemplo, um Trp, Tyr ou Phe localizado entre Cys B e Cys D, ou entre Cys E e Cys F. Clivagem em qualquer sítio de divagem de quimotripsina reduz ou elimina a capacidade do peptídeo de se ligar ao receptor de GC-C.
No corpo humano, uma forma inativa de quimotripsina, quimotripsinogênio, é produzida no pâncreas. Quando esta enzima alcança o intestino delgado, ela é convertida em quimotripsina ativa pela extirpação de dois dipeptídeos. Quimotripsina ativa pode potencialmente clivar peptídeos na ligação de peptídeo sobre o lado carbóxi terminal de Trp, Tyr ou Phe. A presença de quimotripsina ativa no trato intestinal pode potencial mente levar a clivagem de certos dos peptídeos da invenção tendo um sítio de clivagem de quimotripsina funcional posicionado. É esperado que a clivagem de quimotripsina modere a ação de um peptídeo da invenção tendo um sítio de clivagem de quimotripsina apropriadamente posicionado quando o peptídeo passar através do trato intestinal.
Tripsinogeno, semelhante a quimotripsina, é uma protease de serina que é produzida no pâncreas e está presente no trato digestivo. A forma ativa, tripsina, clivará peptídeo tendo um Lys ou Arg. A presença de trípsina ativa no trato intestinal pode levar a clivagem de alguns dos peptídeos da invenção tendo um sítio de clivagem de tripsina funcional apropriadamente posicionado. É esperado que a clivagem de quimotripsina modere a ação de um peptídeo da invenção tendo um sítio de tripsina apropriada33 mente posicionado quando o peptídeo passar através do trato intestional.
Muitos distúrbios gastrointestinais, incluindo IBS, estão associados a dor abdominal ou visceral. Alguns dos peptídeos da invenção incluem etiquetas analgésicas ou antinociceptivas, tais como a seqüência carbóxi 5 terminal AspPhe imediatamente após um Trp, Tyr ou Phe, que cria um sítio de divagem de quimotripsina funcional, ou a seguir Lys ou Arg, que cria um sítio de tripsina funcional. Quimotripsina no trato intestinal pode potencialmente clivar tais peptídeos imediatamente carbóxi terminal ao resíduo de Trp, Phe ou Tyr, liberação do dipeptídeo, AspPhe. Este dipeptídeo demons10 trou ter atividade analgésica em modelos de animais (Abdikkahi e outros, 2001, Fundam Clin Pharmacol 15:117-23; Níkfar e outros, 1997, 29:583-6; Edmundson e outros, 1998, Clin Pharmacol Ther 63:580-93). Deste modo, tais peptídeos podem tratar tanto dor, quanto inflamação. Outros peptídeos analgésicos podem estar presentes no terminal carbóxi do peptídeo (a seguir 15 um sítio de divagem funcional) incluindo: endomorfina-1, endomorfina-2, nocistatina, dalargína, lupron, e substância P. Numerosos peptídeos úteis são baseados na seqüência de núcleo: Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 29). Para criar uma variante tendo um sítio de divagem de quimotripsina potencialmente funcional capaz de inativar 20 o peptídeo, ou o Leu (sublinhado) ou o Thr (sublinhado) pode ser substituído por Trp, Phe ou Tyr, ou tanto o Leu quanto o Thr podem ser substituídos por (independentemente) Trp, Phe ou Tyr. Para criar uma variante tendo um dipeptídeo analgésico, a seqüência de núcleo é seguida por Asp Phe. O carbóxi terminal Tyr na seqüência de núcleo pode permitir que o dipeptídeo Asp 25 Phe seja liberado por quimotripsina no trato digestivo. A seqüência de núcleo pode ser opcionalmente precedida por Asn Ser Ser Asn Tyr ou Asn.
Assim, variantes úteis baseados na seqüência de núcleo incluem:
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys 30 Tyr (SEQ ID NO:26; MM-416776)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 27)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 28; MD-915)
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:29; MM-416774)
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 30)
Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 31; MD-1100)
Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 32)
Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 33)
Asn Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 34)
Asn Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:
35)
Asn Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO:
36)
Asn Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 37)
Asn Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 38)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 39)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 40)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 41)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 42)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 43)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys
Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 44)
Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys
Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 45)
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 46)
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ
ID NO: 47)
Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ
ID NO: 48)
Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID
NO: 49)
Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID
NO: 50)
Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 51)
Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 52)
Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 53)
Asn Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Trp Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 54)
Asn Cys Cys Glu Phe Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 55)
Asn Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 56)
Asn Cys Cys Glu Trp Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 57)
Asn Cys Cys Glu Arg Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 58)
Asn Cys Cys Glu Lys Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr Asp Phe (SEQ ID NO: 59).
Em alguns casos, os peptídeos da invenção são produzidos co36 mo um pré- pró-proteína que inclui a seqüência líder amino terminal:
mkksílfiflsvlsfspfaqdakpvesskekitleskkcniakksnksgpesmn (SEQ ID NO: 23)
Onde o peptídeo é produzido por uma célula bacteriana, por e5 xemplo, E. coli, a seqüência líder exposta acima será clivada e o peptídeo maduro será eficientemente secretado a partir da célula bacteriana. A patente U.S. 5.395.490 descreve vetores, sistemas de expressão e métodos para a produção eficiente de peptídeos ST maduros. Os vetores, sistemas de expressão e métodos descritos na patente U.S. 5.395.490 podem ser usados 10 para produzir os peptídeos ST e os peptídeos ST variantes da presente invenção.
Peptídeos Variantes
A invenção inclui peptídeos variantes que podem incluir um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez substituições de ami15 noácidos (em algumas concretizações menos do que 5 ou menos do que 3 ou 2 ou menos) em comparação com SEQ. ID NOs: 25 a 59 e 66 a 110. A(s) substituição(ões) pode(m) ser conservador(as) ou não-conservador(as). Os aminoácidos de ocorrência natural podem ser substituídos por D-isômeros de qualquer aminoácido, aminoácidos não-naturais, e outros grupos. Uma 20 substituição de aminoácido conservadora resulta na alteração de um aminoácido para um aminoácido de ação similar, ou aminoácido de carga, polaridade ou hidrofobicidade semelhante. Em algumas posições, mesmo as seqüências de aminoácidos conservadoras podem reduzir a atividade do peptídeo. Entre as substituições de aminoácidos de ocorrência natural em geral 25 consideradas conservadoras estão:
Para aminoácido Código Substituir com qualquer de
Alanina Ala Gly, Cys, Ser
Arginina Arg Lys, His
Asparagina Asn Asp, Glu, Gin,
Ácido aspártico Asp Asn, Glu, Gin
Cisteína Cys Met, Thr, Ser
Glutamina Gin Asn, Glu, Asp
Ácido glutâmico Glu Asp, Asn, Gin
Para aminoácido Código Substituir com qualquer de
Glicina Gly Ala
Histidina His Lys, Arg
Isoleucina lie Vai, Leu, Met
Leucina Leu Vai, lie, Met
Lisina Lys Arg, His
Metionina Met lie, Leu, Vai
Fenilalanina Phe Tyr, His, Trp
Pro li na Pro
Serina Ser Thr, Cys, Ala
Treonina Thr Ser, Met, Vai
T riptofano Trp Phe, Tyr
Tirosina Tyr Phe, His
Valina Vai Leu, lle, Met
Em algumas circunstâncias, pode ser desejável tratar pacientes t com um peptídeo variante que se liga a e ativa o receptor de GC-C intestinal, mas é menos ativo do que a forma não-variante do peptídeo. Esta atividade reduzida pode resultar da afinidade reduzida para o receptor ou uma capaci5 d ade reduzida para ativar o receptor uma vez ligado, ou reduzir a estabilidade do peptídeo.
Em alguns pares de peptídeos de resíduos de Cys, que normalmente formam uma ligação de dissulfeto, um ou ambos os membros do par podem ser substituídos por homocisteína, 3-mercaptoprolina (Kolodziej e 10 outros, 1996 Int J Pept Protein Res 48:274); β,β-dimetilcisteína (Hunt e outros 1993 Int J Pept Protein Res 42: 249), ou ácido diaminopropiônico (Smith e outros 1978 J Med Chem 21: 117), para formar reticulações alternativas nas posições das ligações de dissulfeto normais.
Produção de peptídeos
Peptídeos úteis podem ser produzidos ou em bactérias, incluindo, sem limitação, E. coli, ou nos outros sistemas existentes para produção de peptídeo ou proteína (por exemplo, Bacillus subtilis, sistemas de expressão de baculovírus usando-se células de Drosophila Sf9, sistemas de expressão fúngico filamentoso ou levedura, sistemas de expressão de célula 20 de mamífero), ou eles podem ser quimicamente sintetizados.
Se o peptídeo ou peptídeo variante é para ser produzido em bactérias, por exemplo, E. coli, a molécula de ácido nucléico que codifica o peptídeo de preferência também codificará uma seqüência líder que permite a secreção do peptídeo maduro a partir da célula. Assim, a seqüência que codifica o peptídeo pode incluir a pré-seqüência e a pró-seqüência de, por exemplo, um peptídeo de ST bacteriano de ocorrência natural. O peptídeo, maduro, secretado, pode ser purificado a partir do meio de cultura.
A seqüência que codifica um peptídeo da invenção é de preferência inserida dentro de um vetor capaz de fornecer e manter a molécula de ácido nucléico em uma célula bacteriana. A molécula de DNA pode ser inserida dentro de um vetor autonomamente replicante (vetores adequados incluem, por exemplo, pGEM3Z e pcDNA3 e seus derivados). O ácido nucléico de vetor pode ser um DNA bacteriófago ou bacteriano, tal como bacteriófago lambda ou M13 e seus derivados. Construção de um vetor contendo um ácido nucléico descrito aqui pode ser seguida por transformação de uma célula hospedeira, tal como uma bactéria. Hospedeiros bacterianos adequados incluem, mas não limitados a, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Salmonella. O construto genético também inclui, além disso, a molécula de ácido nucléico de codificação, elementos que permitem expressão, tais como seqüências reguladoras e promotoras. Os vetores de expressão podem conter seqüências de controle transcritivo que controlam iniciação transcritiva, tais como seqüências promotoras, aumentadoras, operadoras e repressoras. Uma variedade de seqüências de controle transcritivas são bem-conhecidas por aqueles da técnica. O vetor de expressão pode também incluir uma seqüência reguladora de tradução (por exemplo, seqüência 5' não-traduzida, uma seqüência 3' não-traduzida, ou um sítio de entrada de ribossoma interno). O vetor pode ser capaz de replicação autônoma ou pode se integrar no DNA do hospedeiro para assegurar estabilidade durante a produção do peptídeo.
A seqüência de codificação de proteína que inclui um peptídeo da invenção também pode ser fundida a um ácido nucléico que codifica uma etiqueta de afinidade de polipeptídeo, por exemplo, S-transferase de glutationa (GST), proteína de ligação de maltose E, proteína A, etiqueta de FLAG, hexahistidina, etiqueta de myc ou a etiqueta de HA de influenza a fim de facilitar a purificação. A etiqueta de afinidade ou fusão de repórter une o quadro de leitura do peptídeo de interesse ao quadro de leitura do gene que codifica a etiqueta de afinidade, de modo que uma fusão transcritiva seja gerada. Expressão do gene de fusão resulta em tradução de um único polipeptídeo, que inclui tanto o peptídeo de interesse, quanto a etiqueta de afinidade. Em alguns casos onde etiquetas de afinidade são utilizadas, a seqüência de DNA que codifica um sítio de reconhecimento de protease será fundida entre os quadros de leitura para a etiqueta de afinidade e o peptídeo de interesse.
Métodos e construtos genéticos adequados para a produção de formas imaturas ou maduras dos peptídeos e variantes da invenção em sistemas de expressão de proteína outros que não bactérias, e bemconhecidos por aqueles versados na técnica, podem também ser usados para produzir peptídeos em um sistema biológico.
Peptídeos maduros e suas variantes podem ser sintetizados pelo método de fase sólida usando-se um sintetizador de peptídeo automatizado. Por exemplo, o peptídeo pode ser sintetizado sobre resina de Cyc(4-CH2 Bxl)-OCH2O-4-(oximetil)-fenilacetamidometila, usando-se um programa de acoplamento duplo. Grupos de proteção devem ser usados apropriadamente para criar o padrão de ligação de dissulfeto correto. Por exemplo, os seguintes grupos de proteção podem ser usados: t-butiloxicarbonila (grupos alfaamina); acetamidometila (grupos tiol de resíduos de Cys B e E); 4metilbenzila (grupos tiol de resíduos de Cys C e F); benzila (y-carboxila de ácido glutâmico e o grupo hidroxila de treonina, se presente); e bromobenzila (grupo fenólico de tirosina, se presente). A acoplagem é efetuada com anidrido simétrico de ácidos t-butoxilcarbonilamino ou éster de hídroxibenzotríazol (para resíduos de asparagina ou glutamina), e o peptídeo é desprotegido e é clivado a partir do suporte sólido em fluoreto de hidrogênio, sulfeto de dimetila, anisol, e p-tiocresol, usando-se a razão de 8/1/1/0,5 (v/v/v/w) a 0°C, por 60 minutos. Depois da remoção do fluoreto de hidrogênio e sulfeto de dimetila por pressão reduzida, e anisol e p-tiocresol por extração com éter de etila e acetato de etila seqüencialmente, peptídeos brutos são extraídos com uma mistura de tampão de fosfato de sódio 0,5 M, pH 8,0, e N,Ndimetilformamida, usando-se uma razão de 1/1, v/v. A ligação de dissulfeto para resíduos de Cys B e E é a formada usando-se sulfóxido de dimetila (Tam e outros (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6657-62). O peptídeo resultante é o purificado por cromatografia de fase reversa. A ligação de dissulfeto entre resíduos de Cys C e F é formada por, primeiramente, dissolução do peptídeo em 50% de ácido acético em água. Solução de iodo saturado em ácido acético glacial é adicionada (1 ml de solução de iodo por 100 ml de solução). Depois da incubação a temperatura ambiente por dois dias, em um recipiente de vidro fechado, a solução é diluída cinco vezes com água desionizada e é extraída com éter de etila quatro vezes para a remoção de iodo não-reagido. Depois da remoção da quantidade residual de éter de etila por evaporação rotativa, a solução de produto bruto é liofilizada e é purificada por cromatografia de fase reversa sucessiva.
Ensaio de ligação de receptor de GC-C intestinal
A capacidade de peptídeos e outros agentes para se ligarem ao receptor de GC-C intestinal pode ser testada como se segue. Células da linha de célula de carcinoma de ser humano de T84 (American Type Culture Collection (Bethesda, Md)) são desenvolvidas para confluência em placas de cultura de 24 cavidades com uma mistura de 1:1 de meio de F12 de Ham e meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementada com 5% de soro de bezerro fetal. Células usadas no ensaio estão tipicamente entre as passagens 54-60. Resumidamente, monocamadas de célula de T84 em placas de 24 cavidades são lavadas duas vezes com 1 ml de tampão de ligação (DMEM contendo 0,05% de albumina de soro bovino e HEPES a 25 nM, pH 7,2), em seguida são incubadas por 30 mins a 37°C, na presença de peptídeo ST de E. coli radioativamente marcado maduro, e o material de teste a várias concentrações. As células são então lavadas quatro vezes com 1 ml de DMEM e são solubilizadas com 0,5 ml/cavidade de NaOH a 1 N. O nível de radioatividade no material solubilizado é então determinado usando-se métodos padrão.
Exemplo 1: Preparação de peptídeos ST de variante e peptídeo ST de tipo selvagem
1a: Preparação de peptídeos ST de variante recombinantes e peptídeo ST de tipo selvagem
Um peptídeo ST variante, chamado de MD-915, foi reproduzido recombinante e foi testado em modelo de animal. MD-915 tem a seqüência: Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 28). Um peptídeo tendo a seqüência do peptídeo ST de tipo selvagem foi também criado (MM-416776).
Peptídeos MD-915 MM-416776 foram produzidos como pré-pró proteínas usando-se vetores produzidos como se segue. Uma seqüência que codifica uma pré-pró seqüência de enterotoxina estável a calor foi aplicada a partir de pGK51/pGSK51 (ATCC 67728) usando-se oligonucleotídeo MO3514 (5’ CACACCATATGAAGAAATCAATATTATTTATTTTTCTTTCTG 3’ (SEG ID NO: 60)) e oligonucleotídeo MO3515 (5’ CACACCTCGAGTTAGGTCTCCATGCTTTCAGGACCACTTTTATTAC3' (SEQ ID NO: 61)). O fragmento de produto de ampliação foi digerido com Ndel/Xhol e ligado ao vetor de expressão de T7, pET26b(+) (Novagen) digerido com Ndel/Xhol, desse modo criando plasmídio MB3976. A região que codifica a pré-pró proteína foi seqüênciada e demonstrou codificar a seqüência de aminoácidos: mkksilfiflsvlsfspfaqdakpagsskekitleskkcnivkksnksgpesm (SEQ ID NO: 24), que difere da seqüência de aminoácidos de precursores de a2 de enterotoxina estável a calor (sta2;
mkksilfiflsvlsfspfaqdakpagsskekitleskkcnivkknnesspesm (SEQ ID NO: 25)); n° de acesso do GenBank® Q47185, Gl: 3913876) nas três posições (indicadas pelo sublinhado e texto em negrito) próximo ao C-terminal. Para criar vetores de expressão com a pré-pró seqüência, oligos complementares que codificam cada variante de peptídeo ST ou peptídeo ST de tipo selvagem foram anelados e foram clonados no vetor de expressão de MB3976. Para criar MB3984 (que codifica de peptídeo ST de tipo selvagem de comprimento total de peptídeo MM-416776 como uma pré-pró proteína), contendo a seqüência de aminoácidos, NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO: 26) fundida a jusante da pré-pró seqüência, MB 3976 foi digerido com Bsal/Xhol e ligado aos oligos anelados MO3621 (5'
GCATGAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAATTGTGTTGTAATCCTGCTTGT AC CGGGTGCTATTAATAAC 3’ (SEQ (D NO: 62) e MO3622 (5’ TCGA GTT ATTAATAGCACCCGGTACAAGCAGGATTACAACACAATTCACAG CAGTAATTGCTACTATTC 3' (SEQ ID NO: 63). Para criar MB3985 (que codifica MD-915 como uma pré-pró proteína) contendo a seguinte seqüência de aminoácidos, NSSNYCCEYCCNPACTGCY (SEQ ID NO: 28) fundido a jusante da pré-pró seqüência, MB 3976 foi digerido com Bsal/Xhol e ligado a oligos anelados MO3529 (5’ GCATGAATAGTAGCAATTACTGCTGTGAATATTGTTGTAATCCTGCTTGTACC GGGTGCTATTAATAAC 3’ (SEQ ID: 64) e MO3530 (5' TCGAGTTATTAATAGCACCCGGTACAAGCAGGATTACAACAATATTCACAGCAGTAATTGCTACTATTC 3* (SEQ ID NO: 65).
O peptídeo MD-915 e o peptídeo MM-416776 foram produzidos como se segue. Os vetores de expressão foram transformados em hospedeiros bacterianos de E. coli BL21 λ DE3 (Invitrogen). Uma única colônia foi inoculada e foi desenvolvida agitando-se de um dia para o outro a 30°C, em caldo L + 25 mg/l canamicina. A cultura de um dia para o outro foi adicionada a 3,2 L de meio de batelada (Glicose de 25 g/l, ácidos Caseamino 5 g/l, Extrato de levedura 5 g/l, KH2PO4 de 13,3 g/l, (ΝΗ4)2ΗΡΟ4 de 4 g/l, MgSO47H2O de 1,2 g/l, Ácido cítrico de 1,7 g/l, EDTA de 8,4 mg/l, CoCI2-6H20 de 2,5 mg/l, MnCI2-4H20 de 15 mg/l, CuCI2-4H2O de 1,5 mg/l, H3BO3 de 3 mg/l, Na2MoO4-2H20 de 2,5 mg/l, acetato de Zn-2H20 de 13 mg/l, Citrato férrico 100 mg/l, Canamicina 25 mg/l, Antiespuma DF2O41 de 1 ml/l) e foi fermentada usando-se os seguintes parâmetros de processo: pH 6,7 - controle com base apenas (28% de NH4OH), 30°C, aeração : 5 litros por minuto. Depois do consumo inicial da batelada de glicose (com base na monitoração de níveis de oxigênio dissolvidos (DO), 1,5 L de meio de alimentação (Glicose de 700 g/l, ácidos Caseamino de 10 g/l, Extrato de levedura de 10 g/l, MgSO47H2O de 4 g/l, EDTA de 13 mg/l, CoCI2-6H20 de 4 mg/l, MnCI2-4H20 de 23,5 mg/l, CuCI2-4H20 de 2,5 mg/l, H3BO3 de 5 mg/l, Na2MoO4-2H20 de 4 mg/l, Acetato de Zn-2H20 de 16 mg/l, citrato férrico de 40 mg/l, antiespuma DF2O4 de 1 ml/í) foi adicionada a uma taxa de alimentação controlada para manter 20% de DO. IPTG foi adicionado a 0,2 mM, 2 horas pós início de alimentação. O tempo de experiência total era cerca de 40-45 horas (até exaustão de alimentação).
Células foram coletadas por centrifugação a 5.000 g por 10 minutos. O pélete de célula foi descartado e o sobrenadante foi passado através de uma unidade de ultrafiltração de 50 Kd. O filtrado de 50 Kd (0,6 litro) foi carregado sobre uma coluna de fluxo rápido Q-Sepharose de 110 ml (Amersham Pharmacia, equilibrado com Tris-HCI a 20 mM, pH 7,5) a uma taxa de fluxo de 400 ml/hora. A coluna foi lavada com seis volumes de Tris-HCI a 20 mM, pH 7,5 e as proteínas foram eluídas com ácido acético a 50 mM coletando 50 ml de frações. Frações contendo peptídeo de ST do tipo selvagem ou variante de peptídeo ST foram combinadas e o solvente foi removido por evaporação rotativa. As proteínas secas foram ressuspensas em 10 ml de ácido acético a 8%, 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) e foram carregadas sobre uma coluna Varian Polaris C18-A (250 X 21,2 mm 10 pm, equilibrada no mesmo tampão) a uma taxa de fluxo de 20 ml/min. A coluna foi lavada com 100 ml de metanol a 8%, 0,1% de TFA e foi desenvolvida com um gradiente (300 ml) de metanol de 24 a 48%, 0,1% de TFA, coletando 5 ml de frações. Frações contendo peptídeo foram combinadas e o solvente foi removido por evaporação rotativa. Os peptídeos foram dissolvidos em 0,1% de TFA e foram liofilizados.
As frações de peptídeo MD-915 e de MM-416776 foram analisadas por EMCL e HPLC padrão. Análise de EMCL revelou que MD-915 é mais homogêneo do que MM-416776 (ver a figura 1a; observar que peptídeo de MD-915 exibe pico menor (painel B) do que MM-416776 (painel A)).
Ib: Preparação de peptídeos ST de variante sintéticos e peptídeo ST do tipo selvagem
Peptídeos foram quimicamente sintetizados por uma companhia comercial de síntese de peptídeo. Rendimentos variáveis de peptídeo foram obtidos dependendo da eficiência de síntese química. Assim, os quatro peptídeos, em ordem descrescente de rendimento eram: Cys Cys Glu Tyr Cys
Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 31; MD-1100), 10-20% de rendimento; Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 29; MM416774); Asn Ser Ser Asn Tyr Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 28; MD-915); Asn Ser Ser Asn Tyr
Cys Cys Glu Leu Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 26; MM-416776), <5% de rendimento. Assim, trocas de aminoácidos específicos introduzidos nos peptídeos podem criar propriedades de fabricação aperfeiçoadas.
Figura 1b mostra o perfil de cromatografia de íon total de MD10 1100 sinteticamente fabricado. Figura 1c mostra o perfil de cromatografia de íon total da amostra em branco de controle. Há um principal pico presente na amostra de MD-1100 que não está presente na amostra de controle. Análise quantitativa sugere que o MD-1100 é >98% de puro.
Exemplo 2: Ativação do receptor de GC-C intestinal por um peptídeo ST va15 riante e peptídeo ST
A capacidade de MD-915, MM-416776 e MD-1100 de ativar o receptor de GC-C intestinal foi avaliada em um ensaio que emprega a linha de célula de carcinoma de cólon de ser humano de T84 (Amercan Type Culture Collection (Bethesda, Md)). Para os ensaios, células foram desenvolvi20 das para confluência em placas de cultura de 24 cavidades com uma mistura de 1:1 de meio de F12 de Ham e meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementada com 5% de soro de bezerro fetal, e foram usadas entre as passagens 54 e 60.
Resumidamente, monocamadas de célula de T84 em placas de 25 24 cavidades foram lavadas duas vezes com 1 ml/cavidade de DMEM, em seguida foram incubadas a 37°C por 10 min com 0,45 ml de DMEM contendo isobutilmetilxantina a 1 mM (IBMX), um inibidor de fosfodiesterase de nucleotídeo cíclico. Peptídeos testes (50 μΙ) foram então adicionados e foram incubados por 30 minutos a 37°C. O meio foi aspirado e a reação foi então 30 terminada pela adição de 0,5 ml de HCI a 0,1 N frio. As amostras foram mantidas sobre gelo por 20 minutos e então foram evaporadas até a secura, usando-se uma pistola de calor ou uma centrifugação a vácuo. As amostras secas foram ressuspensas em 0,5 ml de tampão de fosfato provido no kit Cayman Chemical Cyclic GMP EIA (Cayman Chemical, Ann Arbor, Ml). GMP cíclico foi medido por EIA de acordo com os procedimentos delineados no kit Cayman Chemical Cyclic GMP EIA.
A figura 2 mostra a atividade de variantes de peptídeos químicamente sintetizados neste ensaio de atividade de receptor de GC-C. Neste ensaio, MM416776 e dois diferentes peptídeos MD-1100 (MD-1100(a) e MD1100(b), sintetizados por dois diferentes métodos) tinham atividade comparável com MM-416776. Peptídeo MD-915 e MM-416776 foram quimicamente sintetizados de um modo idêntico àquele de MD-1100(b).
Exemplo 3: MD-915 e MM-416776 aumentam trânsito intestinal em camundonqos
A fim de determinar se os peptídeos aumentam a taxa de trânsito gastrointestinal, os peptídeos e os controles foram testados usando-se um ensaio de trânsito gastrointestinal (GIT) de murino (Moon e outros Infection and Immunity 25: 127, 1979). Neste ensaio, carvão vegetal, que pode ser prontamente visualizado no trato gastrointestinal é administrado a camundongos depois da administração de um composto de teste. A distância percorrida pelo carvão vegetal é medida e é expressa como uma percentagem do comprimento total do cólon.
Camundongos foram submetidos a jejum com livre acesso a água por 12 a 16 horas antes do tratamento com peptídeo ou tampão de controle. Os peptídeos foram administrados oralmente a 1 pg/kg - 1 mg/kg de peptídeo em tampão (Tris a 20 mM pH 7,5), 7 minutos antes de ser dada uma dose oral de 5% de carvão ativado (Aldrich 242276-250G). A camundongos de controle foram administrados tampão apenas, antes de ser dada uma dose de carvão ativado. Depois de 15 minutos, os camundongos foram sacrificados e seus intestinos a partir do estômago até o ceco foram dissecados. O peso total do intestino, bem como a distância percorrida desde estômago até a frente de carvão vegetal, foi medido para cada animal e os resultados são expressos como percentagem do comprimento total do intestino percorrido pela frente de carvão vegetal. Todos os resultados são relata46 dos como a média de 10 camundongos ± desvio padrão. Uma comparação da distância percorrida pelo carvão vegetal entre os camundongos tratados com peptídeo versus os camundongos tratados com veículo sozinho foi realizada usando-se um teste de Student e uma diferença estatisticamente significativa foi considerada para P<0,05. Valores de P são calculados usandose um Teste T de dois lados, que assumam variações desiguais.
Como pode ser visto na figura 3a, b, peptídeo ST do tipo selvagem (MM-416776 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 0,1 mg/kg), MD-1100 sinteticamente fabricado e Zelnorm® (0,1 mg/kg), uma droga aprovada para IBS, que é um agonista para receptor de serotonína 5HT4, aumentam a taxa de trânsito gastrointestinal neste modelo. A figura 4a mostra o resultado de um estudo que demonstra que a taxa de trânsito intestinal aumenta com uma dosagem crescente ou de MD-915 ou MM-416776 recombinantemente sintetizado. A figura 4b mostra os resultados de um estudo que demonstra que tanto peptídeo MD-1100 quanto MM-416776 quimicamente sintetizado aumentam as taxas de trânsito gastrointestinal mais do que ou um tampão Tris sozinho ou uma dose equivalente de Zelnorm®).
A experiência idêntica foi realizada para determinar se MD-1100 é eficaz em um regime de tratamento de dosagem crônica. Resumidamente, a 8 camundongos fêmeas CD1 de 8 semanas de idade são administrados, em doses orais, uma vez por dia durante 5 dias, ou MD-1100 (0,06 mg/kg ou 0,25 mg/kg em Tris a 20 mM pH 7,5) ou veículo sozinho (Tris a 20 mM pH 7,5). No quinto dia, um ensaio de GIT é realizado, idêntico àquele acima, exceto que 200 μΙ de uma solução de carvão vegetal a 10% é administrada. A figura 4c mostra os resulados de um estudo que demonstra que tanto Zelnorm® quanto MD-1100 quimicamente sintetizado são eficazes em um ensaio de motilidade gastrointestinal quando da dosagem crônica (diariamente por 5 dias). Os resultados são mostrados lado a lado com dosagem aguda (1 dia).
Exemplo 4: peptídeo MD-915 e peptídeo MM-416776 aumentam secreção intestinal em camundongos que mamam (ensaio de SuMi)
Peptídeo MM-416776 e MD-915 foram testados quanto a sua capacidade de aumentar secreção intestinal usando-se um modelo de secreção intestinal de camundongo que mama. Neste modelo, um composto de teste é administrado a camundongos que mamam, que têm entre 7 e 9 dias de idade. Depois que os camundongos são sacrificados, o trato gastro5 intestinal desde estômago até o ceco é dissecado (intestinos). As sobras (carcaça), bem como os intestinos, são pesados e a razão de peso de intestinos para carcaça é calculada. Se a razão for acima de 0,09, pode-se concluir que o composto de teste aumenta a secreção intestinal. A figura 5a mosta uma curva de dose - resposta para peptídeo ST do tipo selvagem 10 (MM-416776) neste modelo. A figura 5b mostra a curva de dose - resposta para peptídeo MD-1100 neste modelo. Estes dados mostram que peptídeo ST do tipo selvagem (adquiridos da TDT, Inc. West Chester, PA) e o peptídeo MD-1100 aumentam a secreção intestinal. O efeito de Zelnorm® foi também estudado. Como pode ser visto a partir da figura 5, Zelnorm® a 0,2 15 mg/kg não aumenta a secreção intestinal neste modelo. A figura 6a mostra uma curva de dose - resposta para o peptídeo MM-416776 recombinante descrito acima e o peptídeo MD-915 descrito acima. Como pode ser visto a partir da figura 6a, ambos os peptídeos aumentam a secreção intestinal neste modelo. Similarmente, a figura 6b mostra uma curva de dose - resposta 20 para MM-416776, MD-1100 e MD-915 quimicamente sintetizado, bem como peptídeo ST do tipo selvagem (adquirido da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Modelos de animais com hiperalgesia colônica
Hipersensibilidade à distenção colorretal é comum em pacientes com IBS e pode ser responsável pelo principal sintoma de dor. Tanto mode25 los de animais não inflamatórios quanto inflamatórios de hiperalgesia visceral até distenção foram desenvolvidos para investigar o efeito de compostos sobre a dor visceral em IBS.
I. Modelo de alodinia retal induzida por ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS)
Ratos Wistar machos (220-250 g) foram pré-mediçados com 0,5 mg/kg de acepromazina injetada intraperitoneamente (IP) e foram anestesiados por administração intramuscular de 100 mg/kg de cetamina. Pares de eletrodos de fio de nicromo (60 cm de comprimento e 80 pm de diâmetro) foram implantados no músculo estriado do abdômen, 2 cm lateralmente a partir da linha branca. As extremidades livres dos eletrodos foram exteriorizadas sobre o dorso do pescoço e foram protegidas por um tubo plástico 5 ligado à pele. Registros de eletromiografia (EMG) foram iniciados 5 dias depois da cirurgia. Atividade elétrica do músculo estriado do abdômen foi registrada com uma máquina de eletroecenfalografia (Mini VIII, Alvar, Paris, França), usando-se uma constante de tempo curto (0,03 seg), para remover sinais de baixa freqüência (<3 Hz).
Dez dias após a implantação cirúrgica, ácido trinitrobenzenossulfônico (TNBS) foi administrado, para induzir inflamação retal. TNBS (80 mg kg-1 em 0,3 ml de etanol a 50%) foi administrado intrarretalmente através de um cateter de borracha de silicone introduzido a 3 cm do ânus, sob leve anestesia de éter de dietila (Morteau e outros, 1994 Dig Dis Sei 39: 1239).
Após a administração de TNBS, os ratos foram colocados em túneis de plástico onde eles eram severamente limitados em mobilidade, por vários dias, antes da distenção colorretal (CRD). O composto experimental foi administrado uma hora antes de CRD, que foi realizado por inserção para dentro do reto, a 1 cm do ânus, de um balão longo de 4 cm produzido a partir de um 20 preservativo (Gue e outros, 1997 Neurogastroenterol. Motil. 9:271). O balão foi fixado sobre um cateter rígido tirado de uma sonda de embolectomia (Fogarty). O balão ligado ao cateter foi fixado na base do rabo. O balão, ligado a um barostato, foi inflado progressívamente, por etapas de 15 mm Hg, de 0 a 60 mmHg, cada etapa de inflação durando 5 mins. Avaliação da sensibilida25 de retal, como medida por EMG, foi realizada antes (1-2 dias) e 3 dias pós a instilação retal de TNBS.
O número de explosões de pico que corresponde a contrações abdominais foi determinado por períodos de 5 min. Análise estatística do número de contrações abdominais e avaliação das relações de dose-efeitos 30 foi realizada por uma análise de meio de variação (ANOVA) seguido por uma análise de regressão e pós-hoc (testes de Student ou Dunnett) para ED50 se apropriado.
A figura 7 mostra os resultados da experiência em que atividade λ de MD-1100 foi analisada no modelo colorretal de TNBS. Diminuições significativas na resposta abdominal são observadas a 0,3 μρ/kg e 3 pg/kg de MD-1100. Estes resultados demonstram que MD-1100 reduz a dor associa5 da a distenção colorretal neste modelo de animal.
II. Modelo de hiperalgesia induzida por esforço
A ratos Wistar machos (220-250 g) são cirurgicamente implantados com eletrodos de fio de nicromo como no modelo de TNBS. Dez dias pós-implantação cirúrgica, esforço de restrição parcial (PRS) é realizado, 10 como descrito por Wílliams e outros, por duas horas (Williams e outros, 1988 Gastroenterology 64:611). Resumidamente, sob leve anestesia com éter de etila, a parte dianteira dos ombros, a parte dianteira dos membros e o tronco toráxico são enrolados em uma armadura de fita de papel para restringir, mas não evitar movimentos do corpo. Animais de controle com perturbações f 15 similadas são anestesiados, mas não enrolados. Trinta minutos antes do fim da seção de PRS, aos animais são administrados composto de teste ou veículo. Trinta minutos até uma hora depois da conclusão de PRS, o procedimento de distenção de CRD é realizado como descrito acima para o modelo de TNBS, com o barostato a pressões de 15, 30, 45 e 60 mm Hg. Análise 20 estatística sobre o número de explosões é determinada e é analisada como no modelo de TNBS acima.
Modelo de contorção induzido porfenilbenzoquinona
O modelo de contorção induzido por pbQ pode ser usado para avaliar a atividade de controle de dor dos peptídeos e dos agonistas de re25 ceptor de GC-C da invenção. Este modelo é descrito por Siegmund e outros (1957 Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 95: 729-731). Resumidamente, uma hora depois da administração em doses orais com um composto de teste, por exemplo, um peptídeo, morfina ou veículo, solução de fenilbenzoquinona a 0,02% (PBQ) (12,5 ml/kg) é injetada, por rota intraperitoneal, para dentro de 30 camundongo. O número de distenções e contorções são registrados a partir do quinto até o décimo minuto depois da injeção de PBQ, e pode também ser contado entre o trigésimo quinto e quadragésimo minuto e entre o sexa50
I
J
Ml t gésimo e sexagésimo quinto minuto, para prover uma avaliação cinética. Os resultados são expressos como o número de distenções e contorções (média ± SEM) e a percentagem de variação do limiar nociceptivo calculada a partir do valor médio do grupo tratado com veículo. A significância estatística 5 de quaisquer diferenças entre os grupos tratados e o grupo de controle é determinada por um teste Dunnett, usando-se a variação residual depois de uma análise de caminho único de variação (P<0,05), usando-se Software SigmaStat.
As figuras 8a e 8b mostram o efeito de diferentes doses de MD10 915 e MD-1100 no ensaio de contorção com PBQ. Indometacina, uma
NSAID (droga antiinflamatória não-esteroidal) com atividade de controle de dor conhecida, foi usada como o controle positivo no ensaio. Reduções significativas em contorções foram observadas para MD-915 (1 mg/kg de dose) e MD-1100 (2,5 mg/kg de dose), em comparação com o controle de veículo.
Perda da eficácia na dose mais alta testada foi observada para múltiplos outros compostos (tais como antagonistas de 5HT-3) testados em ensaio similares. Os resultados neste estudo sugerem que tanto MD-915 quanto MD1100 têm efeito antinocicepetivos neste modelo de dor visceral comparável com as doses intermediárias de indometacina.
Exemplo 5: Determinação de Kd de MD-1100
Para determinara afinidade de MD-1100 para receptores de GCC encontrados em mucosa intestinal de rato, um ensaio de ligação de competição foi realizado, usando-se células epiteliais intestinais de rato. Células epiteliais oriundas do intestino delgado de ratos foram obtidas como descrito 25 por Kesslere outros (J. Biol. Chem. 245: 5281-5288 (1970)). Resumidamente, animais foram sacrificados e suas cavidades abdominais foram expostas. O intestino delgado foi enxaguado com 300 ml de solução salina gelada ou PBS. 10 cm do intestino delgado medido a 10 cm a partir do piloro foram removidos e foram cortados em segmentos de 2,54 cm (1 polegada). A mu30 cosa intestinal foi extrudada a partir do intestino por pressão leve entre uma peça de parapelícula e uma extremidade de pipeta P-1000. Células epiteliais intestinais foram colocadas em 2 ml de PBS e foram pipetadas para cima e «
para baixo com uma pipeta de 5 ml, para produzir uma suspensão de células. Concentração de proteína na suspensão foi medida usando-se o método Bradford (Anal. Biochem. 72:248-254 (1976)).
Um ensaio de ligação de competição foi realizado com base no método de Giannella e outros (Am. J. Physiol. 245: G492-G498) entre MD1100 e MM-416776 marcado com [125l]. A mistura de ensaio continha: 0,5 ml de DME com HEPES-KOH a 20 mM pH 7,0, 0,9 mg da suspensão de célula listada acima, 21,4 fmoles de [125I]-MM-416776 (42,8 pM), e diferentes concentrações de competidor MD-1100 (0,1 a 1000 mM). A mistura foi incubada à temperatura ambiente por 1 hora, e a reação foi interrompida por aplicação da mistura a filtros de fibra de vidro GF/B (Whatman). Os filtros foram lavados com 5 ml de PBS gelado e a radioatividade foi medida. A figura 9 mostra que o Kd para MD-1100 neste ensaio é de 4,5 mm. % de B/Bo é a percentagem da razão da radioatividade aprisionada em cada amostra (B), em com15 paração com a radioatividade retida em uma amostra de controle com nenhum competidor frio (Bo). Giannella e outros (Am. J. Physiol. 245:G492G498) observaram que o Kd para peptídeo ST do tipo selvagem no mesmo ensaio era de -13 nm.
Exemplo 6: Propriedades farmacocinéticas de MD-1100
Para estudar a farmacocinética de MD-1100, estudos de absorbabilidade em camundongos foram realizados por administração de MD1100 intravenosamente, via injeção na veia da calda, ou oralmente, por gavagem, a camundongos CD1 de 8 semanas de idade. Soro foi coletado a partir dos animais em vários pontos de tempo e foi testado quanto à presen25 ça de MD-1100 usando-se um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (kit Oxoid, ST EIA, cat N° TD0700). O ensaio utilizou anticorpos monoclonais contra peptídeo ST (anticorpos são providos no kit Oxoid) e MD-1100 sinteticamente fabricado. Figura 10a mostra dados de absorção para MD-1100 administrado intravenosamente e oralmente como detectado pelo ensaio
ELISA. MD-1100 parece ser minimamente sistematicamente absorvido e é <2,2% biodisponível.
Um estudo de biodisponibilidade similar foi realizado, no qual
EMCL, ao invés de ELISA, foi usado para detectar MD-1100. Inicialmente, amostras de soro foram extraídas a partir do sangue integral de camundongos expostos e de controle, em seguida foram injetados diretamente (10 ml) sobre uma coluna de extração de fase sólida em série (SPE) (coluna de Wa5 ters Oásis HLB 25 mm, 2,0 x 15 mm diretamente conectada), sem outro processamento, A amostra sobre a coluna de SPE foi lavada com uma solução a 95% de dH2O e 5% de metanol (2,1 ml/min, 1,0 min), então foi carregada sobre uma coluna analítica, usando-se um comutador de válvula que coloca a coluna de SPE em um caminho de fluxo invertido sobre a coluna analítica 10 (coluna Waters Xterra MS C8 5 mm IS, 2,1 x 20 mm). A amostra foi eiuída a partir da coluna analítica com um gradiente de fase reversa (Fase Móvel A: hidróxido de amônio a 10 mM em dH2O, Fase Móvel B: hidróxido de amônio a 10 mM em 80% de acetonitrila e 20% de metanol; 20% de B para os primeiros 3 minutos, em seguida elevação até 95% de B durante 4 min, e ma15 nutenção por 2 min, todos a uma taxa de fluxo de 0,4 ml/min). A 9,1 minutos, o gradiente retorna às condições iniciais de 20% de B por 1 min. MD-1100 eluiu a partir da coluna analítica a 1,45 minuto, e foi detectado por espectrometria de massa triplo-quadrapolar (MRM 764 (estado da carga +2)>182(estado da carga +1) Da; voltagem de cone = 30v; colisão = 20 eV; 20 resolução de origem = 2 Da em pico de base; resolução derivada = 2 Da em base de pico). A resposta do instrumento foi convertida em unidades de concentração por comparação com uma curva padrão, usando-se quantidades conhecidas de MD-1100 quimicamente sintetizado preparado e injetado no soro de camundongo, usando-se o mesmo procedimento.
A figura 10b mostra dados de absorção para IV e MD-1100 administrado oralmente como detectado por EMCL. Neste ensaio, MD-1100 parece similarmente minimamente sistematicamente absorvido e está <0,11% de disponibilidade.
Administração de peptídeos e agonistas de receptor de GC-C
Para tratamento de distúrbios gastrointestinais, os peptídeos e os agonistas da invenção são de preferência administrados oralmente, por exemplo, como um comprimido, gel, pasta, suspensão, líquido, pó ou em alguma outra forma. Composições oralmente administradas podem incluir aglutinantes, agentes flavorizantes e umectantes. Os peptídeos e os agonistas podem ser co-administrados com outros agentes usados para tratar distúrbios gastrointestinais incluindo, mas não limitados a, agentes de supres5 são de ácido, tais como agonistas de receptor de Histamina-2 (H2As), e inibidores de bomba de próton (PPIs). Os peptídeos e os agonistas podem também ser administrados por supositório retal. Para o tratamento de distúrbios do lado de fora do trato gastrointestinal, tais como falha cardíaca congestiva e hipertrofia prostática benigna, peptídeos e agonistas são de prefe10 rência administrados parenteralmente ou oralmente.
Os peptídeos descritos aqui podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros agentes. Por exemplo, os peptídeos podem ser administrados juntamente com um composto ou peptídeo analgésico. O composto ou peptídeo analgésico pode estar covalentemente ligado a um peptí15 deo descrito aqui, ou pode ser um agente separado que é administrado juntamente com, ou seqüencialmente com, um peptídeo descrito em uma terapia de combinação.
A terapia de combinação pode ser alcançada por administração de dois ou mais agentes, por exemplo, um peptídeo descrito aqui e um com20 posto ou peptídeo analgésico, cada um dos quais é formulado e administrado separadamente, ou por administração de dois ou mais agentes em uma única formulação. Outras combinações estão também incluídas por terapia de combinação. Por exemplo, dois agentes podem ser formulados juntos e administrados em combinação com uma formulação separada contendo um 25 terceiro agente. Embora os dois ou mais agentes na terapia de combinação possam ser administrados simultaneamente, eles não necessitam sê-lo. Por exemplo, a administração de um primeiro agente (ou combinação de agentes) pode preceder a administração de um segundo agente (ou combinação de agentes) por minutos, horas, dias ou semanas. Assim, dois ou mais agen30 tes podem ser administrados no período de minutos um do outro, ou no período de 1,2, 3, 6, 9, 12, 15, 18 ou 24 horas um do outro, ou no período de
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14 dias um do outro, ou no período de 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas um do outro. Em alguns casos, ainda são possíveis em intervalos mais longos. Embora em muitos casos seja desejável que os dois ou mais agentes usados em terapia de combinação estejam presente dentro do corpo do paciente ao mesmo tempo, isso não precisa ser assim.
Terapia de combinação pode também incluir duas ou mais administrações de um ou mais dos agentes usados na combinação. Por exemplo, se agente X e agente Y forem usados em uma combinação, poderiamse administrá-los seqüencialmente em qualquer combinação de um ou mais tempos, por exemplo, na ordem
X- Y -X, X-X- Y, Y -X- Y, Y - Y -X, X-X- Y - Y, etc.
Os agentes, sozinhos ou em combinação, podem ser obtidos com um meio ou veículo farmaceuticamente aceitável. Assim, eles podem ser combinados com materiais que não produzem uma reação adversa, alérgica, ou de outra maneira indesejável, quando administrados a um pacien15 te. Os veículos e os meios usados podem incluir solventes, dispersantes, revestimentos, agentes de promoção de absorção, agentes de liberação controlada, etc..
Os agentes, ou em uma forma livre, ou como um sal, podem ser combinados com um polímero, tal como ácido poliláctico-glicólico (PLGA), 20 ácido poli-(l)-láctico-glicólico-tartárico (P(I)LGT) (WO 01/12233), ácido poliglicólico (patente U.S. no. 3.773.919), ácido poliláctico (U.S. n° 4.767.628); poli(8-caprolactona), para aumentar uma formulação de liberação sustentada. Tais formulações podem ser usadas para implantes que liberam um peptídeo ou um outro agente durante um período de poucos dias, poucas sema25 nas, ou vários meses, dependendo do polímero, do tamanho de partícula do polímero, e do tamanho do implante (ver, por exemplo, U.S. n° 6.620.422). Outras fórmulas de liberação sustentada são descritas no EP 0467389 A2, na WO 93/241150, U.S. n° 5.612.052; na WO 97/40085, na WO 94/155587, U.S. n° 5.672.659, U.S. n° 5.893.985, U.S. n° 5.134.122, U.S. n° 5.192.741, 30 U.S. n° 5.192.741, e U.S. n° 5.445.832. Em tais formulações de liberação sustentada, micropartículas de peptídeo são combinadas com micropartículas de polímero. Um ou mais implantes de liberação sustentada podem ser colocados no intestino grosso, intestino delgado, ou ambos.
Os agentes podem ser administrados, por exemplo, por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção subcutânea, ou por outras vias. Os agentes podem ser administrados oralmente, por exemplo, como um 5 comprimido, gel, pasta, suspensão, líquido, pó, ou em outras formas. Composições administradas oralmente podem incluir aglutinantes, agentes flavorizantes e umectantes. Os agentes podem estar incluídos em dentifrícios ou lavagens orais. Assim, formulações orais podem incluir abrasivos ou agentes de formação de espuma. Os agentes podem também ser administrados 10 transdermalmente ou na forma de um supositório.
Os agentes podem ser uma base ou ácido livre, ou um seu sal farmacologicamente aceitável. Sólidos podem ser dissolvidos ou dispersos imediatamente antes da administração, ou ante rio rmente. Em algumas circunstâncias, as preparações incluem um conservante para prevenir o cres15 cimento de microorganismos. As formas farmacêuticas adequadas para injeção podem incluir soluções orgânicas ou aquosas, ou dispersões que incluem, por exemplo, água, álcool, um solvente orgânico, um óleo ou outro solvente ou dispersante (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e óleos vegetais). Agentes farmecêuticos podem ser esterilizados por esteri20 lização por filtragem ou por outros meios adequados.
Composições farmacêuticas adequadas de acordo com a invenção, em geral, incluirão uma quantidade do(s) composto(s) ativo(s) com um excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução estéril aquosa, para dar uma faixa de concentrações finais, dependendo do 25 uso pretendido. As técnicas de preparação são em geral conhecidas na técnica, como exemplifcadas por Remington's Pharmaceutical Sciences (18a ed., Mack Publishing Company, 1995).
Os agentes descritos aqui e agentes de terapia de combinação podem ser embalados como um kit que inclui doses únicas ou múltiplas de 30 dois ou mais agentes, cada uma embalada ou formulada individualmente, ou doses únicas ou múltiplas de dois ou mais agentes embalados ou formulados em combinação. Assim, um ou mais agentes podem estar presentes no
primeiro recipiente, e o kit pode opcionalmente incluir um ou mais agentes em um segundo recipiente. O recipiente ou recipientes são colocados dentro de uma embalagem, e a embalagem pode opcionalmente incluir instruções de dosagem ou administração. Um kit pode incluir componentes adicionais tais como seringas ou outros meios para a administração dos agentes, bem como diluentes ou outros meios para a formulação.
Agentes analgésicos
Os peptídeos descritos aqui podem ser usados em terapia de combinação com um agente analgésico, por exemplo, um composto analgésico ou um peptídeo analgésico. O agente analgésico pode opcionalmente estar covalentemente ligado a um peptídeo descrito aqui. Entre os agentes analgésicos úteis estão: bloqueadores de canal de Ca, antagonistas de receptor de 5HT (por exemplo, antagonistas de receptor de 5HT3, 5HT4 e 5HT1), agonistas de receptor de opióide (loperamida, fedotozina, e fentanila), antagonistas de receptor de NK1, agonistas de receptor de CCK (por exemplo, loxiglumida), antagonistas de receptor de NK1, antagonistas de receptor de NK3, inibidores de recaptação de norepinefrina- se roto nina(NSRI), agonistas de receptor de vanilóide e canabanóide, e sialorfina. Agentes analgésicos nas várias classes são descritos na literatura.
Entre os peptídeos analgésicos úteis estão peptídeos relacionados com sialorfina, incluindo aqueles compreendendo as sequências de aminoácidos QHNPR (SEQ ID NO: 111). incluindo: VQHNPR (SEQ ID NO: 112); VRQHNPR (SEQ ID NO: 113); VRGQHNPR (SEQ ID NO: 114); VRGPQHNPR (SEQ ID NO: 115); VRGPRQHNPR (SEQ ID NO: 116); VRGPRRQHNPR (SEQ ID NO: 117); e RQHNPR (SEQ ID NO: 118). Peptídeos relacionados com sialorfina se ligam à neprilisina e inibem a ruptura mediada por neprilisina da substância P e Met-encefalina. Assim, compostos ou peptídeos que são inibidores de neprilisina são agentes analgésicos úteis que podem ser administrados com os peptídeos da invenção em uma co-terapia, ou ligados aos peptídeo da invenção, por exemplo, por uma ligação covalente. Sialofina e peptídeos relacionados são descritos na patente U.S. n° 6.589.750; na patente U.S. n° 20030078200 A1; e WO 02/051435 A2.
Antagonistas e agomstas de receptor opióide podem ser administrados com os peptídeos da invenção em co-terapia ou ligados ao peptídeo da invenção, por exemplo, por uma ligação covalente. Por exemplo, antagonistas de receptor opióide, tais como naloxona, naltrexona, metil nalozona, nalmefeno, cipridima, beta funaltrexamina, naloxonazína, naltrindol, e nor-binaltorfimina, são acreditados serem úteis no tratamento de IBS. O que pode ser útil na formulação de antagonistas opióides deste tipo é uma formulação de liberação sustentada ou retardada, de modo que a liberação inicial do antagonista seja no intestino delgado médio a distai e/ou no cólon ascendente. Tais antagonistas são descritos no WO 01/32180 A2. Pentapeptídeo de encefalina (HOE825; Tyr-D-Lys-Gly-Phe-L-homosserina) é um agonista dos recepotores mu e delta opióides e é acreditado ser útil para aumentar a motilidade intestinal (Eur. J. Pharm. 219:445, 1992), e este peptídeo pode ser usado em combinação com os peptídeos da invenção. Também útil é a trimebutina, que é acreditada se ligar a receptores de mu/delta/kappa opióides e ativarem a liberação de mitilina, e modularem a liberação de gastrina, peptídeo intestinal vasoativo, gastrina e glucagons. Agonistas de receptor kappa opióides, tais como fedotozina, cetociclazocina, e compostos descritos no WO 03/097051 A2, podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção. Além disso, agonistas de receptor mu opióide, tais como morfina, difeniloxilato, fracefamida (H-Tyr-D-Ala-Phe(F)-Phe-NH2; WO 01/019849 Al) e loperamida, podem ser usados.
Tyr-Arg (ciotorfina) é um dipeptídeo que age por estimulação da liberação de met-encefalinas para elicitar um efeito analgésico (J. Biol. Chem 262:8165, 1987). Ciotorfina pode ser usada com ou ligada aos peptídeos da invenção.
Agonistas de receptor de CCK, tais como caerulein oriundo de anfíbios e outras espécies, são agentes analgésicos úteis que podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Peptídeos de Conotoxina representam uma grande classe de peptídeos analgésicos que agem em canais de Ca controlados por voltagem, receptores de NMDA ou receptores nicotínicos. Estes peptídeos podem ser
usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Análogos de peptídeo de timulina (Pedido FR 2830451) podem ter atividade analgésica e podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Antagonistas de receptor de CCK (CCKa ou CCKb), incluindo loxiglumida e dexloxiglumida (o Isômero R de loxiglumida) (WO 88/05774), podem ter atividade analgésica e podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Outros agentes analgésicos úteis incluem agonistas de 5-HT4, tais como tegaserod/zelnorm e lirexaprida. Tais agonistas são descritos nos: EP1321142 Al, WO 03/053432A1, EP 505322 A1, EP 505322 B1, U.S. n° 5.510.353, EP 507672 A1, EP 507672 B1, e U.S. n° 5.273.983.
Bloqueadores de canal de cálcio, tais como ziconotídeo, e compostos relacionados descritos nos, por exemplo, EP625162B1, US 5.364.842, U.S. n° 5.587.454, U.S. n° 5.824.645, U.S. n° 5.859.186, U.S. n° 5.994.305, U.S. n° 6.087.091, U.S. n° 6.136.786, WO 93/13128 A1, EP 1336409 A1, EP 835126 A1, EP 835126 B1, U.S. n° 5.795.864, U.S. n° 5.891.849, U.S. n° 6.054.429, WO 97/01351 A1, podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Vários antagonistas dos receptores de NK-1, NK-2, e NK-3 (para uma revisão ver Giardina e outros, 2003 Drugs 6:758) podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Antagonistas de receptor de NK1, tais como: aprepitant (Merck & Co Inc), vofopitant, ezlopitant (Pfizer, Inc.), R-673 (Hoffmann-La Roche Ltd), SR-14033, e compostos relacionados descritos nos, por exemplo, EP 873753 A1, US 20010006972 A1, US 20030109417 A1, WO 01/52844 A1, podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Antagonistas de receptor de NK-2, tais como nepadutant (Menarini Ricerche SpA), saredutant (Sanofi-Synthelabo), SR-144190 (SanofiSynthelabo) e UK-290795 (Pfizer Inc), podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Antagonistas de receptor de NK3, tais como osanetant (Sanofi-
Synthelabo), talnetant, e compostos relacionados descritos no, por exemplo, WO 02/094187 A2, EP 876347 A1, WO 97/21680 A1, US 6.277.862, WO 98/11090, WO 95/28418, WO 97/19927, e Boden e outros (J Med Chem. 39:1664-75, 1996) podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Inibidores de recaptação de norepinefrina-serotonina, tais como milnacipran, e compostos relacionados descritos no WO 03/077897 A1 podem ser usados com ou ligados aos peptídeos da invenção.
Antagonistas de receptor Vanilóide, tais como arvanil, e compostos relacionados descritos no WO 01/64212 A1 podem ser usados ou ligados aos peptídeos da invenção.
Onde o analgésico é um peptídeo e é covalentemente ligado a um peptídeo descrito aqui, o peptídeo resultante pode também incluir pelo menos um sítio de divagem de quimotripsina ou tripsina. Quando presente dentro do peptídeo, o peptídeo analgésico pode ser precedido por (se for no carbóxi terminal) ou seguido por (se for no amino terminal) um sítio de divagem de quimotripsina ou tripsina, que permite liberação do peptídeo analgésico.
Além disso, peptídeos relacionados com sialorfina, peptídeo analgésicos incluem: AspPhe, endomorfina-1, endomorfina-2, nocistatina, dalargina, lupron, zicnotídeo, e substância P.
Métodos de tratamento
Os peptídeos da invenção podem ser usados para o tratamento ou prevenção de câncer, crescimentos pré-cancerosos ou crescimentos metastáticos. Por exemplo, eles podem ser usados para a prevenção ou tratamento de: câncer colorretal metastásico local/colorretal, câncer do trato gastrointestinal, câncer de pulmão, câncer ou crescimentos pré-cancerosos ou crescimentos metastásicos de células epiteliais, pólipos, carcinoma de mama, colorretal, pulmão, ovariano, pancreático, prostático, renal, estômago, bexiga, fígado, esofágico e testicular, carcinoma (por exemplo, célula basal, basoescamoso, Brown-Pearce, carcinoma ductal, tumor de Ehrlich, célula de Krebs, Merkel, pulmão de célula pequena ou não pequena, célula em grão de aveia, papilar, bronquilar, célula escamosa, célula de transição, Walker), leucemia (por exemplo, célula B, célula T, HTLV, linfócito agudo ou crônico, mastócito, mileóide), histiocitonia, histiocitose, doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, plasmacitoma, reticuloendoteliose, adenoma, adeno5 carcinoma, adenofibroma, adenolinfoma, ameloblastoma, angioceratoma, hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia, angioma esclerosante, angiomatose, apudoma, branchionia, síndrome carcinóide maligna, doença cardíaca carcinóide, carcinossarcoma, cementoma, colangioma, colesteatoma, condrossarcoma, condroblastoma, condrossarcoma, cordoma, coristoma, crani10 ofaringioma, crondroma, cilindroma, cistadenocarcinoma, cistadenoma, filodos de cistossarconia, disgeninoma, ependimoma, sarcoma de Ewing, fibroma, fibrossarcoma, tumor de célula gigante, ganglioneuroma, glioblastoma, glomangioma, tumor de célula granulosa, ginandroblastoma, hamartoma, hemangioendotelioma, hemangioma, hemangio-pericitoma, hemangios15 sarcoma, hepatoma, tumor de célula das ilhotas, sarcoma de Kaposi, leiomioma, leiomiossarcoma, leucossarcoma, tumor de célula de Leydig, lipoma, lipossarcoma, linfaugioma, linfangiomioma, linfangiossarcoma, meduloblastoma, meningioma, mesenquioma, mesonefroma, mesotelioma, míoblastoma, mioma, miossarcoma, mixoma, mixossarcoma, neurilemoma, neuroma, 20 neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibroma, neurofibromatose, odontoma, osteoma, osteossarcoma, papiloma, paraganglioma, paraganglionia, não croinafina, pinealoma, rabdomioma, rabdomiossarcoma, tumor de célula de Sertoli, teratoma, tumor de célula de teca, e outras doenças nas quais as células se tornaram displásicas, imortalizadas ou transformadas.
Os peptídeos da invenção podem ser usados para o tratamento ou prevenção de: Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) (síndrome dominante autossômica) que precede câncer de cólon, câncer colorretal de não polipse hereditário (HNPCC), e síndrome dominante não hereditária .
Para o tratamento ou prevenção de câncer, crescimentos pré30 cancerosos e crescimentos metastásicos, os peptídeos podem ser usados em terapia de combinação com radiação ou agentes quimioterapêuticos, um inibidor de uma fosfodiesterase dependente de cGMP ou um inibidor de ci61 clooxigenase-2 seletivo (numerosos inibidores de ciclooxigenase-2 seletivos são descritos no WO 02062369, aqui incorporados por referência).
Os peptídeos podem ser para o tratamento ou prevenção de inflamação. Assim, eles podem ser usados sozinhos ou em combinação com o 5 inibidor de fosfodiesterase dependente de cGMP ou um inibidor de ciclooxigenase-2 seletivo para o tratamento de: inflamação de órgão, IBD (por exemplo, doença de Crohn, colite ulcerativa), asma, nefrite, hepatite, pancreatite, bronquite, fibrose cística, doença de intestino isquêmico, inflamações intestinais/alergias, doença coelíaca, proctite, gastroenterite eosnofílica, 10 mastocitose, e outros distúrbios inflamatórios.
Os peptídeos podem também ser usados para tratar distúrbios relacionados com insulina, por exemplo, diabetes mellitus tipo II, hiperglicemia, obesidade, distúrbios associados aos distúrbios em transporte de eletrólito ou glicose e secreção de insulina em células, ou distúrbios endócrinos.
Eles podem também ser usados em tratamento de resistência à insulina e diminuição pós-cirúrgica e não pós-cirúrgica em responsividade à insulina.
Os peptídeos podem ser usados para prevenir ou tratar distúrbios respiratórios, incluindo, inalação, ventilação e distúrbios de secreção de muco, hipertensão pulmonar, obstrução crônica de vasos e de vias aéreas, e 20 obstruções irreversíveis de vasos e brônquios.
Os peptídeos podem ser usados em terapia de combinação com um inibidor de fosfodiesterase (exemplos de tais inibidores podem ser encontrados na patente U.S. n° 6.333.354, incorporada aqui por referência).
Os peptídeos podem também ser usados para prevenir ou tratar: 25 retinopatia, nefropatia, angiopatia diabética, e formação de edema.
Os peptídeos podem também ser usados para prevenir ou tratar distúrbios neurológicos, por exemplo, cefaléia, ansiedade, distúrbios de movimento, agressão, psicose, ataques, ataques de pânico, histeria, distúrbios de sono, depressão, distúrbios esquizoafetivos, apnéia de sono, síndromes 30 de déficit de atenção, perda de memória e narcolepsia. Eles podem também ser usados como um sedativo.
Os peptídeos e peptídeos detectavelmente marcados podem ser usados como marcadores para identificar e detectar estágio ou doenças de diagnose e condições do intestino delgado, incluindo: doença de Crohn, colite, doença de intestino inflamatório, tumores, tumores benignos, tais como tumores estromais benignos, adenoma, angioma, polipos adenomatosos (pedinculados e séssil), maligno, tumores carcinóides, tumores de célula endócrina, linfoma, adenocarcinoma, carcinoma de intestino anterior, intestino médio e intestino posterior, tumor estromal gastroinstestinal (GIST), tais como leiomiorna, leiomioma celular, leiomioblastoma, e leiomiossarcoma, tumor de nervo autônomo gastrointestinal, síndromes de má absorção, doenças celíacas, diverticulose, divertículo de Meckel, divertículos colônicos, megacólon, doença de Hirschsprung, síndrome do intestino irritável, isquemia mesentérica, colite isquêmica, câncer colorretal, polipose colônica, síndrome de polipo, adenocarcinoma, síndrome de Liddle, miopatia de Brody, convulsões infantis, e coreoatetose.
Os peptídeos podem ser conjugados a uma outra molécula (por exemplo, molécula de diagnóstico ou terapêutica) para células alvo que portam o receptor de GCC, por exemplo, lesões de fibrose cística e células específicas que revestem o trato intestinal. Assim, eles podem ser usados para direcionar porções radioativas ou porções terapêuticas para o intestino, para aulixiar na imagem e diagnóstico ou tratamento de câncer colorretal local ou metastásico/colorretal e para fornecer cópias normais do gene supressor de tumor p53 ao trato intestinal.
Os peptídeos podem ser usados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar disfunção erétil.
Os peptídeos podem ser usados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar distúrbios de ouvido interno, por exemplo, para tratar doença de Meniere, incluindo sintomas da doença, tais como vertigem, perda de audição, tinido, sensação de entupimento no ouvido, e para manter homeostase de fluido no ouvido interno.
Os peptídeos podem ser usados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar distúrbios associados à retenção de fluido e de sódio, por exemplo, doenças do sistema de transporte de eletrólito63 água/eletrólito dentro do rim, intestino e sistema urogenital, falha cardíaca congestiva, hipertensão, hipotensão, cirrose de fígado, e síndrome nefrótica. Além disso, eles podem ser usados para facilitar diurese ou controlar fluido intestinal.
Os peptídeos podem ser usados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar distúrbios associados à secreção de bicarbonato, por exemplo, fibrose cística.
Os peptídeos podem ser usados sozinhos ou em terapia de combinação para tratar distúrbios associados à regeneração de célula de 10 fígado.
REIVINDICAÇÕES

Claims (35)

1. Peptídeo purificado, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 31; MD-1100).
2. Peptídeo purificado, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos: Cys Cys Glu Tyr Cys Cys Asn Pro Ala Cys Thr Gly Cys Tyr (SEQ ID NO: 31; MD-1100).
3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um distúrbio gastrointestinal.
4. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o distúrbio gastrointestinal é um distúrbio de motilidade gastrointestinal.
5. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o distúrbio gastrointestinal é selecionado do grupo que consiste em um distúrbio de motilidade gastrointestinal, síndrome do intestino irritável, constipação crônica, um distúrbio gastrointestinal funcional, doença de refluxo gastroesofageano, azia funcional, dispepsia, dispepsia funcional, dispepsia de não úlcera, gastroparesia, pseudo-obstrução intestinal crônica, pseudo-obstrução colônica, doença de Crohn, colite ulcerativa, e doença inflamatória de intestino.
6. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de obesidade.
7. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de falha cardíaca congestiva.
8. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de hiperplasia prostática benigna.
9. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de constipação.
10. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no aumento da atividade de um receptor de guanilato ciclase intestinal (GC-C).
11. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizaPetição 870180155135, de 26/11/2018, pág. 9/18 do pelo fato de que é para uso no tratamento de dor visceral.
12. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de inflamação
13. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de fibrose cística.
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2 envolvido por um revestimento entérico.
16. Composição farmacêutica de liberação controlada, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2 e uma matriz polimérica biodegradável.
17. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, um agente analgésico, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, um inibidor de fosfodiesterase, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
19. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer, um distúrbio respiratório, um distúrbio neurológico, um distúrbio associado à retenção de sódio e fluido, um distúrbio associado ao desequilíbrio de carbonato, disfunção erétil, um distúrbio relacionado com insulina, ou um distúrbio de ouvido interno.
20. Método de produção do peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende a provisão de uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo, o cultivo da célula sob condições em que o peptídeo é expresso, e isolamento do peptídeo expresso.
21. Método de produção do peptídeo como definido na reivindiPetição 870180155135, de 26/11/2018, pág. 10/18
3 cação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende a sintetização química do peptídeo e a purificação do peptídeo sintetizado.
22. Composição, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de falha cardíaca congestiva, em que a composição compreende um peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2 e um peptídeo natriurético, tais como peptídeo natriurético atrial, peptídeo natriurético cerebral, um peptídeo natriurético de tipo C, um diurético, ou um inibidor de enzima conversora de angiotensina.
23. Composição, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de hiperplasia prostática benigna, em que a composição compreende um peptídeo como definido na reivindicação 1 ou 2, e um inibidor 5-alfa redutase ou um inibidor alfa adrenérgico.
24. Composição, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de obesidade, em que a composição compreende um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 e o peptídeo de fragmento de hormônio de intestino YY3-36, glp-1 (peptídeo-1 de tipo glucagon), exendin-4 (um inibidor de glp-1), sibutramina, fentermina, fendimetrazina, cloridrato de benzfetamina (Didrex), orlistat (Xenical), cloridrato de dietilpropion (Tenuate), fluoxetina (Prozac), bupropion, efedra, cromo, garcínia cambogia, benzocaína, alga marinha (Fucus vesiculosus), quitosano, nomame herba, galega (Goat's Rue, French Lilac), ácido linoléico conjugado, L-carnitina, fibra (fibra de psílio, plantago, guar), cafeína, desidroepiandrosterona, germander (Teucrium chamaedrys), B-hidróxi-beta-metilbutirato ou piruvato.
25. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o distúrbio gastrointestinal é a síndrome do intestino irritável.
26. Peptídeo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a síndrome do intestino irritável é a síndrome do intestino irritável com constipação predominante.
27. Peptídeo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a síndrome do intestino irritável é a síndrome do intestino
Petição 870180155135, de 26/11/2018, pág. 11/18 irritável alternante.
28. Peptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o distúrbio gastrointestinal é constipação.
29. Peptídeo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a constipação é constipação crônica.
30. Peptídeo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a constipação é constipação idiopática.
31. Peptídeo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a constipação é causada pelo uso de opiáceo.
32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de um distúrbio gastrointestinal.
33. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o distúrbio gastrointestinal é a síndrome do intestino irritável ou constipação.
34. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a síndrome do intestino irritável é a síndrome do intestino irritável com constipação predominante.
35. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a constipação é constipação crônica.
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