PT1877396E - Dipiridil-di-hidropirazolonas e utilização dos seus derivados de 4-(piridina-3-il)-2-(piridina-2-il)-1,2-dihidro- 3h-pirazol-3-ona enquanto inibidores específicos da hif-prolil-4-hidroxilase para o tratamento de doenças cardiovasculares e hematológic - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "DIPIRIDIL-DI-HIDROPIRAZOLONAS E UTILIZAÇÃO DOS SEUS DERIVADOS DE 4-(PIRIDINA-3-IL)-2-(PIRIDINA-2-IL)-1,2-DI-HIDRO-3H-PIRAZOL-3-ONA ENQUANTO INIBIDORES ESPECÍFICOS DA HIF-PROLIL-4-HIDROXILASE PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS CARDIOVASCULARES E HEMATOLÓGICAS" A presente invenção diz respeito a novas dipiridil-di-hidropirazolonas, aos processos para a sua preparação, à sua utilização para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças e à sua utilização para a preparação de fármacos para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças, em particular, patologias cardiovasculares e hematológicas e patologias renais, e para favorecer a cicatrização de ferimentos.

Designa-se por hipoxia um fornecimento deficiente de oxigénio ao organismo humano ou aos seus componentes, que dificulte o funcionamento regular do organismo ou dos seus componentes, devido à sua duração e/ou à sua intensidade, ou que determine um colapso total do seu funcionamento. A hipoxia pode ser provocada por uma diminuição do oxigénio disponível no ar respirado (v.g., durante períodos de permanência a grande altitude), por perturbações da respiração externa (v.g., como resultado do funcionamento anormal dos pulmões ou obstrução do tracto respiratório), por uma diminuição do débito cardíaco (v.g., no caso de insuficiência cardíaca, sobrecarga ventricular direita aguda com embolia pulmonar), devido a uma capacidade excessivamente diminuta de transporte de oxigénio pelo sangue (v.g., como resultado de uma anemia ou de uma 2 intoxicação, v.g., com monóxido de carbono), demarcada localmente por um fluxo sanguíneo reduzido em consequência de oclusões vasculares (tipicamente, estados isquémicos, v.g., do coração, das extremidades inferiores ou do cérebro, macro e microangiopatia diabética) ou também por uma maior solicitação de oxigénio por um tecido (v.g., como resultado de um maior trabalho muscular ou devido a inflamações locais) [Eder, Gedigk (ed.), Allgemeine Pathologie und pathologische Anatomie, 33a ed., Springer Verlag, Berlim, 1990]. O organismo humano é capaz, dentro de intervalos limitados, de se adaptar aguda e cronicamente a situações de fornecimento de oxigénio insuficiente. Para além de uma resposta imediata que compreende, inter alia, um aumento do ritmo cardíaco e do ritmo respiratório e uma dilatação local dos vasos sanguíneos por acção de mecanismos automáticos vegetativo-nervosos, a hipoxia induz uma alteração na transcrição de diversos genes. A função dos produtos génicos serve aqui para compensar a falta de oxigénio. Assim, é reforçada a expressão de diversas enzimas da glicólise e do transportador I da glicose, resultando consequentemente um aumento da produção anaeróbia de ATP, tornando possível que a falta de oxigénio se prolongue [Schmidt, Thews (ed.), Physiologie des Menschen, 27a ed., Springer Verlag, Berlim, 1997; Lõffler, Petrides (ed.), Biochemie und Pathobiochemie, 7a ed., Springer Verlag, Berlim, 2003].

Além disso, a hipoxia determina uma maior expressão do factor de crescimento das células endoteliais vasculares, VEGF, daí resultando a estimulação da regeneração de vasos sanguíneos (angiogénese) em tecidos hipóxicos. Deste modo, 3 a longo prazo, melhora o fluxo sanguíneo através do tecido isquémico. Esta regulação automática apenas é, evidentemente, bastante inadequada no caso de diversas patologias cardiovasculares e no caso de patologias por oclusão vascular [ver a obra de Simons e Ware, Therapeutic angiogenesis in cardiovascular disease, Nat. Rev. Drug. Discov., 2 (11), 863-71 (2003)].

Além disso, nos casos de hipoxia sistémica, é reforçada a expressão da eritropoietina hormonal peptídica formada predominantemente nos fibroblastos intersticiais dos rins. Deste modo, é estimulada a formação de eritrócitos na medula óssea e, consequentemente, aumenta a capacidade de transporte de oxigénio. Este efeito tem sido e é utilizado pelos atletas de alta competição em treinos a grande altitude. Uma diminuição da capacidade do sangue para transportar oxigénio, v.g., em resultado de uma anemia após uma hemorragia, provoca normalmente um aumento da produção de eritropoietina no rim. Em algumas formas de anemia, este mecanismo regulador pode ser afectado ou a sua função normal pode ser prejudicada. Assim,, v.g., em pacientes que padeçam de insuficiência renal, a eritropoietina é realmente produzida no parênquima renal, mas em quantidades significativamente menores comparativamente com a capacidade do sangue para transportar oxigénio, daí resultando a chamada anemia renal. A anemia renal, em particular, mas também as anemias causadas por tumores e infecções com os VIH são convenientemente tratadas por administração parentérica de eritropoietina recombinante humana (rhEPO). Para esta terapia dispendiosa não há, presentemente, nenhuma terapia alternativa com nenhum medicamento para administração oral 4 [ver as obras: Eckardt, The potential of erythropoietin and related strategies to stimulate erythropoiesis, Curr. Opin. Investig. Drugs 2(8), 1081-5 (2001); Berns, Should the target hemoglobin for patients with chronic kidney disease treated with erythropoietic replacement therapy be changed?, Semin. Dial. 18 (1), 22-9 (2005)]. Estudos recentes demonstram que a eritropoietina, para além da sua acção de aumentar a eritropoiese, tem também uma acção protectora (antiapoptótica) sobre os tecidos hipóxicos, em particular no que respeita ao coração e ao cérebro, sendo independente disso. Além do mais, de acordo com estudos recentes, a terapia com eritropoietina reduz a gravidade média da morbidade em pacientes com insuficiência cardíaca [ver as obras: Caiola e Cheng, Use of erythropoietin in heart failure management, Ann. Pharmacother., 38 (12), 2145-9 (2004); Katz, Mechanisms and treatment of anemia in chronic heart failure, Congest. Heart. Fail., 10 (5), 243-7 (2004)] .

Os genes descritos anteriormente, induzidos pela hipoxia, têm a particularidade comum de o aumento da sua expressão, pela hipoxia, ser causado pelo chamado factor de transcrição induzível por hipoxia (HIF). O HIF é um factor de transcrição heterodimérico que compreende uma subunidade a e uma β. São descritas isoformas α do HIF, das quais a HIF-Ία e a HIF-2a são muitíssimo homólogas e são importantes para a expressão genica induzida pela hipoxia. Enquanto a subunidade β (das quais foram já descritas duas isoformas), também designada por ARNT (translocador nuclear do receptor de arilo hidrocarbonado), é expressa constitutivamente, a expressão da subunidade α depende do teor da célula em oxigénio. Em condições de normoxia a 5 proteína α do HIF é poliubiquitinizada e depois degradada por via proteassomal. Em condições de hipoxia, esta degradação é inibida, pelo que a subunidade α do HIF dimeriza com a subunidade ARNT e consegue activar os seus genes alvo. 0 dímero de HIF liga-se aqui aos chamados elementos responsáveis pela hipoxia (HRE) nas sequências reguladores dos seus genes alvo. Os HRE são definidos por uma sequência de consenso. Os HRE funcionais foram detectados em elementos reguladores de diversos genes induzidos pela hipoxia [ver as obras: Semenza, Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology, Trends Mol. Med., 7 (8), 345-50 (2001); Wenger e Gassmann, Oxygen (es) and the hypoxia-inducible factor-1, Biol. Chem., 378 (7), 609-16 (1997)]. O mecanismo molecular em que se baseia esta regulação da subunidade α do HIF foi já explicado pelos trabalhos de diversos grupos independentes de investigadores. O mecanismo é conservado de espécie para espécie: a isoforma HIF α é hidroxilado por uma subclasse de prolil-4-hidroxilases, dependentes do oxigénio, designadas por PHD ou EGLN, em dois radicais prolilo específicos (P402 e P564 da subunidade HIF-Ία humana). As HIF-prolil-4-hidroxilases são dioxigenases de conversão de 2-oxoglutarato, dependentes do ferro [Epstein et al., C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation, Cell 107 (1), 43-54 (2001); Bruick e McKnight, A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF, Science 294 (5545), 1337-40 (2001); Ivan et al., Biochemical purification and pharmacological inhibition of a mammalian prolyl hydroxylase acting on hypoxia-inducible factor, Proc. Natl. 6

Acad. Sei. U.S.A., 99 (21), 13459-64 (2002)]. As enzimas foram designadas por prolil-hidroxilases pela primeira vez em 2001 [Aravind e Koonin, The DNA-repair protein AlkB, EGL-9, and leprecan define new families of 2-oxoglutarate and irondependent dioxygenases, Genome Biol., 2 (3), research0007.1-0007.8, Epub 19 de Fev de 2001]. A proteína supressora do tumor pVHL, que conjuntamente com as elonginas B e C, forma o chamado complexo VBC, que adapta a subunidade α do HIF a uma ligase da ubiquitina E3, liga-se à subunidade α do HIF prolil-hidroxilada. Uma vez que a prolil-4-hidroxilação da subunidade α do HIF e a sua subsequente degradação decorrem em função da concentração de oxigénio intracelular, também se chamou às HIF-prolil-4-hidroxilases detectores do oxigénio celular. Foram já identificadas três isoformas destas enzimas: EGLN1/PHD2, EGLN2/PHD1 e EGLN3/PHD3. Duas destas enzimas (EGLN2/PHD1 e EGLN3/PHD3) são induzidas transcricionalmente, mesmo em condições de hipoxia, e são possivelmente responsáveis pela diminuição dos níveis de HlFa observados em condições de hipoxia crónica [ver a obra: Schofield e Ratcliffe, Oxygen sensing by HIF hydroxylases, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 5 (5), 343-54 (2004)] .

Uma inibição farmacológica selectiva das HIF-prolil-4-hidroxilases determina o aumento da expressão génica dos genes alvo dependentes do HIF e é consequentemente benéfica para a terapia de diversas síndromas patológicas. No caso de doenças do sistema cardiovascular, em particular, prevê-se que haja uma melhoria da evolução das doenças com a indução de novos vasos sanguíneos e com a modificação, na situação metabólica de órgãos isquémicos, da produção de ATP de aeróbia para anaeróbia. Uma melhoria da 7 vascularização de lesões crónicas favorece o processo de cicatrização, em especial no caso de úlcera crural de cicatrização difícil e no caso de outros ferimentos crónicos da pele. A indução de eritropoietina endógena, em determinadas formas de doenças, em particular em pacientes com anemia renal, constitui também um objectivo terapêutico que se pretende alcançar. Os inibidores de HIF prolil-4-hidroxilase até agora descritos na literatura científica não satisfazem os requisitos para serem considerados um fármaco. Estes ou são análogos competitivos do oxaglutarato (tais como, v.g., N-oxalilglicina), caracterizados pela sua altamente diminuta potência de acção e consequentemente ainda não revelaram nenhuma acção em modelos in vivo no sentido de produzirem uma indução dos genes alvo do HIF; ou são agentes que formam complexos com o ferro (quelantes) , tais como a desferroxamina, que actua como os inibidores não específicos de dioxigenases que contêm ferro e evidentemente, embora determinem uma indução dos genes alvo, tais como, v.g., a eritropoietina, in vivo, contrariam a eritropoiese ao formarem complexos com o ferro disponível. 0 objecto da presente invenção consiste em proporcionar novos compostos que são utilizados para tratar doenças, em particular doenças cardiovasculares e hematológicas.

No contexto da presente invenção, serão agora descritos compostos que actuam como inibidores específicos de HIF-prolil-4-hidroxilases e com base neste mecanismo concreto de acção realizam in vivo, após administração parentérica oral, a indução dos genes alvo de HIF, tais como, v.g., de eritropoietina, e os processos biológicos assim determinados, tais como, v.g., a eritropoiese.

Os compostos 2-heteroaril-4-aril-l,2-di-hidro-pirazolonas que possuem actividade bactericida e/ou fungicida que estão descritos nos documentos EP 165 448 e EP 212 281. A utilização de 2-heteroaril-4-aril-l,2-di-hidropirazolonas enquanto inibidores da lipoxigenase para o tratamento de patologias do tracto respiratório, cardiovascular e inflamatórias está descrita no documento EP 183 159. As 2,4-difenil-l,2-di-hidropirazolonas com actividade herbicida estão descritas no documento DE 2 651 008. A preparação e as propriedades farmacológicas de algumas 2-piridil-l, 2-di-hidropirazolonas estão descritas na obra Helv. Chim. Acta, 49 (1), 272-280 (1966). Nos documentos WO 96/12706, WO 00/51989 e WO 03/074550 estão reivindicados compostos que possuem uma estrutura parcial de di-hidropirazolona para o tratamento de diversas patologias. A presente invenção proporciona compostos que satisfazem a fórmula estrutural (I)

em que o símbolo A representa CH ou N, o símbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por alquilo (Ci-C6) , trifluorometilo, halogéneo, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi (Ci-C6) , amino, 9 alcoxi(Ci—C6)-carbonilo, hidroxicarbonilo e -C (=0)-NH-R4, em que o grupo alquilo (Ci-C6) pode ser substituído por hidroxilo, alcoxi(C1-C4), amino, monoalquil(C1-C4)-amino, dialquil (C1-C4)-amino ou um grupo de fórmula geral -NH-C(=0)-R5, -NH-C (=0) -NH-R6 ou -NH-S02-R7, em que o símbolo R5 representa um grupo alquilo (Ci-C6) , o qual pode ser substituído por hidroxilo, alcoxi (Ci-C6) , fenilo ou heteroarilo com 5 ou 6 membros, ou fenilo, em que cada um dos grupos fenilo e heteroarilo pode ser substituído uma a três vezes com um substituinte, igual ou diferente, seleccionado entre halogéneo, ciano, alquilo(C1-C4), hidroxilo, alcoxi(C1-C4), trifluorometilo ou trifluorometoxi, o símbolo R6 representa um grupo alquilo (Ci-Cê) , o qual pode ser substituído por hidroxilo ou alcoxi(C1-C4) e o símbolo R7 representa um grupo alquilo(Ci-C6) , e 0 símbolo R4 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-C6) , o qual pode ser substituído por hidroxilo, alcoxi(C1-C4) ou fenilo, em que o grupo fenilo pode ser substituído por halogéneo, ciano, alquilo(C1-C4), alcoxi(C1-C4), trifluorometilo ou trifluorometoxi, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre 0 conjunto constituído por halogéneo, ciano, nitro, alquilo (Ci-C6) , trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi (Ci-C6) , trifluorometoxi, amino, hidroxicarbonilo e -C(=0)-NH-R8, em que 10 os grupos alquilo (Ci-C6) e alcoxi (Ci-Cê) podem ser substituídos por hidroxilo e o símbolo R8 representa um átomo hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C4), o símbolo m representa o número 0, 1 ou 2, o símbolo n representa o número 0, 1, 2 ou 3, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R1 ou R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-Cõ) ou cicloalquilo (C3-C7) e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais.

Os compostos de acordo com a invenção são os compostos de fórmula estrutural (I) e os seus sais, solvatos e solvatos desses sais, os compostos incluídos na fórmula estrutural (I) que são referidos nas fórmulas gerais seguintes e seus sais, solvatos e solvatos desses sais, e os compostos incluídos na fórmula estrutural (I) que são referidos nos exemplos concretos e seus sais, solvatos e solvatos desses sais, em que os compostos incluídos na fórmula estrutural (I) e que são a seguir referidos não sejam já sais, solvatos ou solvatos desses sais.

Os compostos de acordo com a invenção podem existir sob formas estereoisoméricas (enantiómeros, diastereómeros), dependendo da sua estrutura. A invenção abrange assim os enantiómeros ou os diastereómeros e as suas misturas particulares. Os constituintes estereoisomericamente uniformes podem ser isolados a partir 11 de tais misturas de enantiómeros e/ou diastereómeros de um modo conhecido.

No caso de os compostos de acordo com a invenção poderem ocorrer sob formas tautoméricas, então a presente invenção abrange todas as formas tautoméricas.

Como sais preferidos, no contexto da presente invenção, refere-se os sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos de acordo com a invenção. Também estão abrangidos os sais que não sejam eles próprios adequados para utilização farmacêutica mas que possam ser utilizados, por exemplo, para isolar ou purificar os compostos de acordo com a invenção.

Como sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos de acordo com a invenção refere-se os sais de adição de ácido de ácidos minerais, ácidos carboxilicos e ácidos sulfónicos, v.g., sais de ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metano-sulfónico, ácido etano-sulfónico, ácido tolueno-sulfónico, ácido benzeno-sulfónico, ácido naftalenodissulfónico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido maleico e ácido benzóico. preferencialmente, etilamina,

Como sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos de acordo com a invenção refere-se também os sais de bases convencionais, tais como, a título exemplificativo e preferencialmente, sais de metais alcalinos (v.g., sais de sódio e de potássio), sais de metais alcalino-terrosos (v.g., sais de cálcio e de magnésio) e sais de amónio obtidos a partir de amónia ou de aminas orgânicas que possuem entre 1 e 16 átomos de carbono, tais como, a título exemplificativo e 12 dietilamina, trietilamina, etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, diciclo-hexilamina, dimetilaminoetanol, procaína, dibenzilamina, N-metilmorfolina, arginina, lisina, etilenodiamina e N-metilpiperidina.

De acordo com o presente contexto, define-se solvatos como sendo as formas dos compostos de acordo com a invenção que formam um complexo no estado sólido ou liquido por coordenação com moléculas de solvente. Os hidratos são uma forma especifica de solvatos, nos quais a coordenação tem lugar com a água. De acordo com o contexto da presente invenção, os hidratos são os solvatos preferidos.

Além do mais, a presente invenção também inclui pró-fármacos dos compostos de acordo com a invenção. 0 termo "pró-fármacos" designa compostos que são activos ou inactivos sob o ponto de vista biológico, mas que são convertidos (por exemplo, metabolicamente ou hidroliticamente) em compostos de acordo com a invenção no durante o seu tempo de espera no corpo.

De acordo com o contexto da presente invenção, os substituintes possuem as significações seguintes, salvo quando indicado de outro modo.

No contexto da presente invenção, os termos alquilo (Ci-C6) e alquilo (C1-C4) designam um radical alquilo de cadeia linear ou ramificada que possui respectivamente entre 1 e 6 ou 1 e 4 átomos de carbono. De preferência, o radical alquilo de cadeia linear ou ramificada possui entre 1 e 4 átomos de carbono. É possível referir a título exemplificativo e como preferenciais: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, 1-etilpropilo, n-pentilo e n-hexilo. 13

No contexto da presente invenção, os termos cicloalquilo (C3-C7) e cicloalquilo (C3-C6) designam um grupo cicloalquilo monociclico saturado que possui entre 3e 7 ou 3 e 6 átomos de carbono, respectivamente. De preferência, um radical cicloalquilo possui entre 3 e 6 átomos de carbono. É possível referir a título exemplificativo e como preferenciais: ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo e ciclo-heptilo.

No contexto da presente invenção, os termos alcoxi (Ci~ C6) e alcoxi (C1-C4) designam um radical alcoxi de cadeia linear ou ramificada que possui entre 2 e 6 ou 1 e 4 átomos de carbono, respectivamente. De preferência, o radical alcoxi de cadeia linear ou ramificada possui entre 1 e 4 átomos de carbono. É possível referir a título exemplificativo e como preferenciais: metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi e terc-butoxi.

No contexto da presente invenção, os termos alcoxi (Ci~ C6)-carbonilo e alcoxi(Ci~C4)-carbonilo designam um radical alcoxi de cadeia linear ou ramificada que possui entre 1 e 6 ou 1 e 4 átomos de carbono, respectivamente, e está ligado por meio de um grupo carbonilo. De preferência, o radical alcoxicarbonilo de cadeia linear ou ramificada possui entre 1 e 4 átomos de carbono. É possível referir a título exemplificativo e como preferenciais: metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, n-propoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo e terc-butoxicarbonilo.

No contexto da presente invenção, o termo monoalquil(C1-C4)-amino designa um grupo amino com um substituinte alquilo de cadeia linear ou ramificada que possui entre 1 e 4 átomos de carbono. É possível referir a título exemplificativo e como preferenciais: metilamino, 14 etilamino, n-propilamino, isopropilamino, n-butilamino e terc-butilamino.

No contexto da presente invenção, o termo dialquil(Ci~ C4)-amino designa um grupo amino com dois substituintes alquilo de cadeia linear ou ramificada, iguais ou diferentes, cada um dos quais possui entre 1 e 4 átomos de carbono. É possível referir a título exemplificativo e como preferenciais: N,N-dimetilamino, Ν,Ν-dietilamino, N-etil-N-metilamino, N-metil-N-n-propilamino, N-isopropil-N-metilamino, N,N-diisopropilamino, N-n-butil-N-metilamino e N-terc-butil-N-metilamino.

No contexto da presente invenção, o termo heteroarilo com 5 ou 6 membros designa um radical heterocíclico aromático (heteroaromático) que possui um total de 5 ou 6 membros de átomos do anel e um máximo e três heteroátomos do anel, iguais ou diferentes, seleccionados entre o conjunto constituído por N, 0 e/ou S, o qual está ligado por meio de uma átomo de carbono do anel ou facultativamente um átomo de azoto do anel. É possível referir a título exemplificativo e como preferenciais: furilo, pirrolilo, tienilo , pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo , piridilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo e triazinilo. É preferível um radical heteroarilo com 5 membros que possui um máximo de dois heteroátomos no anel seleccionados entre o conjunto constituído por N, 0 e/ou S, tal como, por exemplo, furilo, pirrolilo, tienilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo e isotiazolilo. 15

No contexto da presente invenção, o termo halogéneo designa átomos de flúor, cloro, bromo e iodo. São preferíveis átomos de flúor, cloro ou bromo.

No caso de os radicais nos compostos de acordo com a invenção serem substituídos, então os radicais podem ser, salvo quando indicado de outro modo, monossubstituídos ou polissubstituídos. No contexto da presente invenção, para todos os radicais com diversas ocorrências, as suas significações são independentes entre si. É preferível uma substituição com um, dois ou três substituintes iguais ou diferentes. É particularmente preferida uma substituição com um substituinte.

Como compostos preferidos de fórmula estrutural (I) refere-se os compostos em que o símbolo A representa CH ou N, o símbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por alquilo(Ci-C6) , trifluorometilo, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi (Ci-C6), amino, alcoxi(Ci-Ce)-carbonilo e hidroxicarbonilo, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por halogéneo, ciano, nitro, alquilo (Ci-C6) , trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi(Ci-C6) , trifluorometoxi, amino e hidroxicarbonilo, em que os grupos alquilo (Ci-Cô) e alcoxi (Ci-C6) podem ser substituídos por hidroxilo, o símbolo m representa o número 0, 1 ou 2, o símbolo n representa o número 0, 1, 2 ou 3, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R1 ou R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e 16 o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-Cê) ou cicloalquilo (C3-C7) , e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais.

Como compostos de fórmula estrutural (I) que também são preferidos refere-se os compostos em que o símbolo A representa CH, o símbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por alquilo(Ci-C6), flúor, cloro, bromo e -C (=0)-NH-R4, em que o grupo alquilo (Ci-Cê) pode ser substituído por hidroxilo, alcoxi (C1-C4) , amino, monoalquil (C1-C4)-amino, dialquil (C1-C4)-amino ou um grupo de fórmula geral -NH-C (=0) -R5, -NH-C (=0)-NH-R6 ou -NH-S02-R7, em que o símbolo R5 representa um grupo alquilo(Ci-Cê), o qual pode ser substituído por hidroxilo, metoxi, etoxi, fenilo ou heteroarilo com 5 membros, ou fenilo, em que cada um dos grupos fenilo e heteroarilo pode ser substituído uma a três vezes com um substituinte, igual ou diferente, seleccionado entre flúor, cloro, bromo, ciano, metilo, hidroxilo, metoxi, etoxi, trifluorometilo ou trifluorometoxi, e cada um dos símbolos R6 e R7 representa independentemente um grupo alquilo(Ci-C6), e o símbolo R4 representa um grupo alquilo (Ci-C6) , o qual pode ser substituído por hidroxilo, metoxi, etoxi ou fenilo, em que o grupo fenilo pode ser substituído por flúor, cloro, bromo, ciano, metilo, metoxi, etoxi, trifluorometilo ou trifluorometoxi, 17 o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por flúor, cloro, bromo, alquilo (Ci-C6) , trifluorometilo, hidroxicarbonilo e -C(=0)-NH-R8, em que o grupo alquilo (Ci-Cê) pode ser substituído por hidroxilo e o símbolo R8 representa um grupo alquilo (C1-C4) , o símbolo m representa o número 0, 1 ou 2, o símbolo n representa o número 0, 1 ou 2, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R1 ou R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais.

Como compostos de fórmula estrutural (I) particularmente preferíveis refere-se os compostos em que o símbolo A representa CH, o símbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por alquilo(C1-C4), trifluorometilo, nitro, alcoxi(Ci-C6), amino e alcoxi(C1-C4)-carbonilo, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por cloro, bromo, ciano, alquilo(Ci-C4) , trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi(C1-C4), trifluorometoxi e amino, em que os grupos alquilo (Ci-C6) e alcoxi (Ci—C6) podem ser substituídos por hidroxilo, o símbolo m representa o número 0 ou 1, o símbolo n representa o número 0, 1, 2 ou 3, 18 em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais.

Como compostos de fórmula estrutural que também são particularmente preferíveis refere-se os compostos em que o símbolo A representa CH, o símbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por alquilo (Ci-Cê) , flúor, cloro, bromo e -C(=0)-NH-R4, em que o grupo alquilo (Ci-C6) pode ser substituído por hidroxilo, amino, monoalquil (C1-C4) -amino ou um grupo de fórmula geral -NH-C(=0)-R5 ou -NH-C(=0)-NH-R6, em que o símbolo R5 representa um grupo alquilo (Ci-C6) , o qual pode ser substituído por fenilo ou pirazolilo, ou fenilo, em que cada um dos grupos fenilo e pirazolilo pode ser substituído uma a três vezes com um substituinte, igual ou diferente, seleccionado entre flúor, cloro, metilo ou trifluorometilo, e o símbolo R6 e R7 representa um grupo alquilo(Ci— C4), e o símbolo R4 representa um grupo alquilo (Ci-Cê) , o qual pode ser substituído por fenilo, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por cloro, bromo, ciano, alquilo(Ci— 19 C4) e trifluorometilo, em que o grupo alquilo (C1-C4) pode ser substituído por hidroxilo, o símbolo m representa o número 0, 1 ou 2, o símbolo n representa o número 0, 1 ou 2, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R1 ou R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais.

Como compostos que são particularmente importantes refere-se os compostos de fórmula estrutural (I-A)

em que o símbolo R1a representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo ou trifluorometilo e * p a Of2 9C · · , cada um dos símbolos R , R e R , iguais ou diferentes, representa independentemente um átomo de hidrogénio, cloro ou bromo ou um grupo ciano, metilo, hidroximetilo, metoxi ou etoxi, e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais.

Como compostos que são também particularmente importantes refere-se os compostos de fórmula estrutural (I-B)

em que cada um dos símbolos R1A e R1B, iguais ou diferentes, representa um átomo de hidrogénio, flúor ou cloro ou um grupo alquilo (Ci-C4) ou -C (=0) -NH-R4, em que o grupo alquilo (C1-C4) pode ser substituído por hidroxilo, amino, monoalquil (C1-C4) -amino ou um grupo de fórmula geral -NH-C(=0)-R5, em que o símbolo R5 representa um grupo alquilo(C1-C4) , o qual pode ser substituído por fenilo ou pirazolilo, ou fenilo, em que cada um dos grupos fenilo e pirazolilo pode ser substituído uma a três vezes com um substituinte, igual ou diferente, seleccionado entre flúor, cloro, metilo ou trifluorometilo, e o símbolo R4 representa um grupo alquilo (C1-C4) , o qual pode ser substituído por fenilo, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre 0 conjunto constituído por cloro, bromo, ciano, metilo, hidroximetilo ou trifluorometilo e o símbolo n representa o número 0, 1 ou 2, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais. 21

As definições dos radicais apresentadas mais minuciosamente em combinações particulares ou em combinações preferidas também podem ser alteradas por definições de radicais de outras combinações, independentemente das combinações particulares dos radicais apresentadas. São particularmente preferíveis combinações de duas ou mais significações preferidas apresentadas antes.

Os derivados 1,2-di-hidropirazol-3-ona de fórmula estrutural (I) de acordo com a invenção também podem estar sob a forma tautomérica lH-pirazol-5 (I') (veja-se o esquema 1); as duas formas tautoméricas estão expressamente abrangidas pela presente invenção.

Esquema 1

Λ m

A invenção também proporciona um processo para a preparação dos compostos de fórmula estrutural (I) de acordo com a invenção, o qual é caracterizado pelo facto de se fazer reagir os compostos de fórmula estrutural (II) 22 <ν*3

em que os símbolos R2, R3 e n possuem as significações definidas antes e o símbolo Z1 representa um grupo metilo ou etilo, num solvente inerte, facultativamente na presença de um ácido, com um composto de fórmula estrutural (III)

em que os símbolos A, R1 e m possuem as significações definidas antes, para se obter os compostos de fórmula estrutural (IV)

em que os símbolos Z1, A, R1, R2, R3, m e n possuem as significações definidas antes, e depois efectuar a ciclização destes compostos num solvente inerte e na presença de uma base, 23 sendo os compostos de fórmula estrutural (I) facultativamente convertidos com os correspondentes (i) solventes e/ou (ii) bases ou ácidos nos seus solvatos, sais e/ou solvatos desses sais.

Os compostos de fórmula estrutural (I) de acordo com a invenção, em que o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio, também podem ser preparados por meio de um processo em que os compostos de fórmula estrutural (V)

em que os símbolos Z1, R2 e n possuem as significações definidas antes, são submetidos a uma reacção de condensação com um composto de fórmula estrutural (VI) N—( (VI), H3c 0““Z2 em que o símbolo Z2 representa um grupo metilo ou etilo, para se obter os compostos de fórmula estrutural (VII)

em que os símbolos Z1, R2 e n possuem as significações definidas antes, 24 os quais se faz então reagir, na presença de um ácido, com um composto de fórmula estrutural (III) para se obter os compostos de fórmula estrutural (IV-A)

significações definidas antes, efectuando-se depois uma reacção de ciclização num solvente inerte e na presença de uma base.

Os compostos de acordo com a invenção também podem ser preparados facultativamente por conversões suplementares de grupos funcionais de substituintes individuais, em especial os apresentados a propósito das definições dos símbolos R1 e R2, partindo de compostos de fórmula estrutural (I) obtidos pelo processo anterior. Tais conversões têm lugar por meio de métodos convencionais e compreendem, por exemplo, reacções, tais como a substituição nucleofílica ou electrofílica, a oxidação, a redução, a hidrogenação, a esterificação, a clivagem de ésteres, a eterificação, a clivagem de éteres, a formação de carboxamidas, sulfonamidas e ureias e a introdução e remoção de grupos protectores temporários.

Como solventes inertes adequados para os passos do processo (II) + (III) -> (IV), (IV) -> (I) e (IV-A) -> (I) 25 refere-se especialmente álcoois, tais como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol ou terc-butanol. De preferência, utiliza-se etanol. 0 passo do processo (II) + (Hl) -> (IV) pode ser facultativamente efectuado de um modo vantajoso com a adição de um ácido. Para tal, são adequados os ácidos inorgânicos ou orgânicos convencionais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido metano-sulfónico ou ácido para-tolueno-sulfónico. De preferência, utiliza-se o ácido acético.

De um modo geral, a reacção (II) + (III) -> (IV) tem lugar a uma temperatura compreendida entre 0°C e +100°C e de preferência entre +10°C e +40°C.

As bases inorgânicas ou orgânicas convencionais são adequadas para o passo de ciclização (IV) -> (I) ou (IV-A) - > (I). Em particular, como bases refere-se hidróxidos de metais alcalinos, tais como, por exemplo, hidróxido de sódio ou de potássio, carbonatos de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos, tais como carbonato de sódio, potássio, cálcio ou césio, alcoolatos de metais alcalinos, tais como metanolato de sódio ou potássio, etanolato de sódio ou potássio ou terc-butilato de sódio ou potássio, ou hidretos de metais alcalinos, tais como hidreto de sódio. De preferência, utiliza-se etanolato de sódio.

De um modo geral, a reacção (IV) -> (I) ou (IV-A) -> (I) tem lugar a uma temperatura compreendida entre 0°C e +60°C e de preferência entre 0°C e +30°C. A sequência do processo (II) + (III) -> (IV) -> (I) pode ser efectuada num procedimento de reacção em duas 26 etapas ou como uma reacção de um recipiente de reacção, não se isolando o composto (IV) da etapa intermédia.

De preferência, o passo do processo (V) + (VI) -> (VII) tem lugar na ausência de um solvente e na presença de um excesso de composto (VI), sob irradiação de microondas. De um modo geral, a reacção tem lugar a uma temperatura compreendida entre +20°C e +150°C e de preferência entre +80°C e +120°C [conforme descrito por J.P. Bazureau et al., Synthesis 1998, 967; ibid. 2001 (4), 581].

De forma vantajosa, o passo do processo (VII) + (III) -> (IV-A) é efectuado mediante a adição de um ácido. Para tal, são adequados os ácidos inorgânicos ou orgânicos convencionais, tais como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido metano-sulfónico ou ácido para-tolueno-sulfónico. De preferência, utiliza-se ácido acético. Como solventes inertes que podem ser utilizados neste passo do processo refere-se álcoois, tais como metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol ou terc-butanol. Mais preferencialmente, a reacção tem lugar em ácido acético na ausência da adição de um solvente suplementar.

De um modo geral, a reacção (VII) + (III) -> (IV-A) tem lugar a uma temperatura compreendida entre 0°C e +60°C e de preferência entre +10°C e +30°C.

Todos os passos do processo podem ser efectuados a uma pressão normal, elevada ou reduzida (v.g., compreendida entre 0,5 bar e 5 bar). De um modo geral, utiliza-se a pressa normal.

Os compostos de fórmula estrutural (II) podem ser preparados por métodos conhecidos da literatura por acilação em C de ésteres de ácido carboxílico, a partir de 27 compostos de fórmula estrutural (V). Os compostos de fórmulas estruturais (III), (V) e (VI) estão comercialmente disponíveis ou são conhecidos da literatura ou podem ser preparados de um modo análogo a processos conhecidos descritos na literatura. A preparação de compostos de acordo com a invenção pode ser ilustrada pelos esquemas 2 a 4 de síntese seguintes. 28

Esquema 2 28

HO, HCGQB T 1 OEt IJ a) ÓEt

d)

[a): NaH, 18-coroa-6, tolueno, 1 hora à temperatura ambiente -> 1 hora a 90°C; b) : 1. Etanol, 16 horas à temperatura ambiente; 2. NaOEt, etanol, 30 minutos à temperatura ambiente; c): Etanol, 1 dia à temperatura ambiente; d) : NaOEt, etanol, 1 hora à temperatura ambiente]. 29

Esquema 3 29

[a): 1. LiHDMS, THF, -78°C -> 1 hora a 0°C; 2. Anidrido acético, -78°C; 3. 36 horas à temperatura ambiente; b) : Ácido acético glacial, etanol, 16 horas à temperatura ambiente; 2. NaOEt, etanol, 30 minutos à temperatura ambiente].

[a): Irradiação com microondas, 1 hora a 100°C; b) : 1. Ácido acético glacial, 2 horas à temperatura ambiente; 2. 30 processamento, NaHC03 aq.; 3. NaOEt, etanol, 30 minutos a 5°C; em alternativa, b) : Ácido canfor-10-sulfónico cat. , etanol, 78°C, 12 a 18 horas].

Os compostos de acordo com a invenção exibem um espectro de acção farmacológico valioso e imprevisto. Assim, são adequados para utilização como fármacos para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças em seres humanos e animais.

Os compostos de acordo com a invenção são reconhecidos como inibidores específicos de HIF-prolil-4-hidroxilases.

Com base nas propriedades farmacológicas, os compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças cardiovasculares, em particular insuficiência cardíaca, doença coronária, angina de peito, enfarte do miocárdio, apoplexia, arteriosclerose, hipertensão essencial, pulmonar e maligna e doença oclusiva das artérias periféricas. Os compostos são ainda adequados para o tratamento e/ou para a profilaxia de distúrbios na formação do sangue, tais como, v.g., anemias idiopáticas, anemia renal, anemias associadas a doenças tumorais, a uma infecção ou a outras doenças inflamatórias, tais como, v.g., artrite reumatóide.

Os compostos são ainda adequados para aumentar o hematócrito com o objectivo de obter sangue para uma auto-doação de sangue antes de cirurgias.

Além do mais, os compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados para o tratamento e/ou para a profilaxia de estados de isquemia associados a cirurgias e seus sintomas subsequentes após intervenções cirúrgicas, em especial em intervenções ao coração utilizando uma máquina 31 coração-pulmão (v.g., cirurgias de derivação, implantes de válvulas cardíacas), intervenções nas artérias carótidas, intervenções na aorta e intervenções com abertura ou penetração instrumental da parte superior do crânio. Os compostos são ainda adequados para o tratamento e/ou profilaxia gerais no caso de intervenções cirúrgicas com o objectivo de acelerar o processo de cura de feridas e de diminuir o tempo de convalescença.

Os compostos podem ainda ser utilizados para o tratamento e/ou para a profilaxia de cancro e para o tratamento e/ou para a profilaxia de uma diminuição do estado de saúde que ocorre durante o tratamento de cancro, em particular após terapia com citostáticos, antibióticos e irradiações.

Os compostos são ainda adequados para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças de tipo reumático e outras formas de doença do campo das doenças autoimunitárias e, em especial, para o tratamento e/ou para a profilaxia de uma diminuição do estado de saúde que ocorre durante o tratamento com medicamentos de tais doenças.

Além do mais, os compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças dos olhos {v.g., glaucoma), do cérebro {v.g., doenças de Parkinson, doença de Alzheimer, demência, sensação de dores crónicas), de doenças crónicas dos rins, insuficiência renal e insuficiência renal aguda, e para promover o processo de cura de feridas.

Além disso, os compostos são adequados para o tratamento e/ou para a profilaxia estados gerais de fraqueza física, até atingir caquexia, em especial, os 32 estados com uma ocorrência superior em idades mais avançadas.

Os compostos são ainda adequados para o tratamento e/ou para a profilaxia da disfunção sexual.

Além do mais, os compostos são adequados para o tratamento e/ou para a profilaxia de diabetes mellitus e seus sintomas associados, tais como, v.g., macroangiopatia e microangiopatia diabéticas, nefropatia e neuropatia diabéticas.

Os compostos de acordo com a invenção são ainda adequados para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças fibróticas, v.g., do coração, do pulmão e do fígado. A presente invenção proporciona a utilização dos compostos de acordo com a invenção para o tratamento e/ou para a prevenção de doenças e, em especial, as doenças supramencionadas.

Além do mais, a presente invenção proporciona a utilização dos compostos de acordo com a invenção para a preparação de um fármaco para o tratamento e/ou para a prevenção de doenças e, em especial, as doenças supramencionadas.

Além disso, a presente invenção proporciona um método para o tratamento e/ou para a prevenção de doenças, em especial, as doenças supramencionadas, utilizando uma quantidade activa pelo menos de um dos compostos de acordo com a invenção.

Os compostos de acordo com a invenção podem ser utilizados por si sós ou, se necessário, em combinação com outros compostos activos. Além disso, a presente invenção proporciona fármacos que compreendem pelo menos um dos 33 compostos de acordo com a invenção e um ou vários compostos activos, em especial, para o tratamento e/ou para a prevenção das doenças supramencionadas. Como compostos activos adequados na combinação, que podem ser referidos a titulo exemplificativo e preferenciais, refere-se: inibidores ACE, antagonistas do receptor da angiotensina II, bloqueadores dos receptores beta, antagonistas dos receptores de mineralocorticóides, aspirina, diuréticos, suplementos de ferro, suplementos de vitamina B12 e de ácido fólico, antagonistas de cálcio, estatinas e derivados de digitalis (digoxina).

Além do mais, a presente invenção proporciona fármacos que compreendem pelo menos um composto de acordo com a invenção, normalmente em conjunto pelo menos com uma ou várias substâncias auxiliares farmaceuticamente adequadas, inertes e não tóxicas, e a sua utilização para os fins supramencionados.

Os compostos de acordo com a invenção podem actuar de um modo sistémico e/ou local. Os compostos podem ser administrados de um modo adequado para tal fim, tal como, v.g., por via oral, parentérica, pulmonar, nasal, sublingual, lingual, bucal, rectal, dérmica, transdérmica, conjuntival, óptica ou sob a forma de um implante ou enxerto.

Os compostos de acordo com a invenção podem ser administrados em formas de administração adequadas para tais vias de administração.

As formas de administração que actuam de acordo com a técnica anterior, libertam os compostos de acordo com a invenção de um modo rápido e/ou modificado e compreendem os compostos de acordo com a invenção que são adequados para 34 administração, tais como, v.g., comprimidos (comprimidos não revestidos ou revestidos, por exemplo, revestimentos que sejam resistentes ao suco gástrico ou que se dissolvam de um modo retardado ou que sejam insolúveis e regulem a libertação do composto de acordo com a invenção), comprimidos finos/achatados, peliculas/produtos liofilisados ou cápsulas que se desintegrem rapidamente na cavidade oral (por exemplo, cápsulas de gelatina dura ou mole), comprimidos revestidos com açúcar, grânulos, trociscos, pós, emulsões, suspensões, aerossóis ou soluções. A administração parentérica pode ser efectuada contornando um passo de absorção (v.g., por via intravenosa, intra-arterial, intracardiaca, intraspinal ou intralombar) ou incluindo um passo de absorção (v.g., por via intramuscular, subcutânea, intracutânea, percutânea ou intraperitoneal) . Como formas de administração que são adequadas para administração parentérica refere-se, inter alia, formulações para injecção e infusão sob a forma de soluções, suspensões, emulsões, substâncias liofilizadas ou pós estéreis.

Para as outras vias de administração, v.g., formas de inalação de fármacos (inter alia, pós inaláveis, nebulizadores), são adequados gotas nasais, soluções ou aspersões, comprimidos, películas ou cápsulas para administração por via lingual, sublingual ou bucal, supositórios, preparações para ouvidos ou olhos, cápsulas vaginais, suspensões aquosas (loções, misturas agitáveis), suspensões liofílicas, unguentos, cremes, sistemas terapêuticos transdérmicos (v.g., adesivos), emulsões 35 medicinais semelhantes a leite, pastas, espumas, pós finos, implantes ou enxertos. A administração por via oral ou parentérica é preferível, em especial a administração por via oral.

Os compostos de acordo com a invenção podem ser convertidos para as formas de administração referidas. Tal pode ter lugar, de um modo conhecido per se, por mistura com substâncias auxiliares inertes e não tóxicas farmaceuticamente adequadas. Como substâncias auxiliares refere-se, inter alia, veículos (por exemplo, celulose microcristalina, lactose, manitol), solventes (v.g., polietileno-glicóis líquidos), agentes emulsionantes e agentes dispersantes ou humectantes (por exemplo, dodecil-sulfato de sódio, oleato de polioxissorbitano), aglutinantes (por exemplo, polivinilpirrolidona), polímeros naturais e sintéticos (por exemplo, albumina), estabilizadores (v.g., antioxidantes, tais como, por exemplo, ácido ascórbico), agentes corantes (v.g., pigmentos inorgânicos, tais como, v.g., óxidos de ferro) e agentes para ajustar o sabor e/ou o odor.

De um modo geral, é vantajoso utilizar, no caso da administração por via parentérica, quantidades compreendidas entre cerca de 0,001 mg/kg e 1 mg/kg e de preferência entre 0,01 mg/kg e 0,5 mg/kg de massa corporal para se obter resultados eficazes. No caso da administração por via oral, a dosagem está compreendida entre cerca de 0,01 mg/kg e 100 mg/kg, de preferência entre cerca de 0,01 mg/kg e 20 mg/kg e mais preferencialmente entre 0,1 mg/kg e 10 mg/kg de massa corporal.

No entanto, pode ser necessário alterar as quantidades referidas, em particular em função da massa corporal, da 36 via de administração, do comportamento individual face ao composto activo, da natureza da formulação e do momento ou intervalo de tempo que a administração tem lugar. Assim, em alguns casos, pode ser suficiente a administração de uma quantidade inferior à quantidade minima supramencionada, ao passo que, em outros casos, é necessário ultrapassar o limite superior supramencionado. No caso de se administrarem quantidades relativamente elevadas, será aconselhável distribui-las em diversas doses individuais ao longo do dia.

Os exemplos concretos seguintes ilustram a invenção. A invenção não está limitada aos exemplos.

Os dados percentuais nos ensaios e exemplos seguintes são percentagens em peso, salvo quando indicado de outro modo; as partes são partes em peso. As proporções de solventes, proporções de diluições e dados de concentrações de soluções liquido/liquido dizem, em cada caso, respeito ao volume. Ά. Exemplos Abreviaturas e acrónimos aq solução aquosa cat. catalítica d dia(s) DCI ionização química directa (em MS) DMF dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido teo. Teórico (rendimento) EI ionização por impacto de electrões (em MS) ESI ionização por electropulverização (em MS)

Et etilo 37 GC-MS cromatografia gasosa-espectroscopia de massa acoplada

h HPLC conc. LC-MS hora(s) cromatografia líquida de elevado rendimento concentrado cromatografia líquida-espectroscopia de massa acoplada

LiHMDS min MS MTBE NMR tr TA TFA THF hexametildissilazida de lítio minuto (s) espectroscopia de massa éter metil-terc-butílico espectroscopia por ressonância magnética nuclear tempo de retenção (em HPLC) temperatura ambiente ácido trifluoroacético tetra-hidrofurano Métodos LC-MS, HPLC e GC-MS: Método 1:

Instrumento: 'Micromass Platform LCZ' com HPLC 'Agilent Serie 1100'; coluna: 'Thermo Hypersil GOLD' 3 μ, 20 mm x 4 mm; eluente A: 1 L de água + 0,5 mL de ácido fórmico a 50% de força, eluente B: 1 L acetonitrilo + 0,5 mL de ácido fórmico a 50% de força; gradiente: 0,0 minuto 100% de A -> 0,2 minuto 100% de A -> 2,9 minutos 30% de A -> 3,1 minutos 10% de A -> 5,5 minutos 10% de A; forno: 50°C; caudal: 0,8 mL/minuto; detecção UV: 210 nm. 38 Método 2:

Instrumento: 'Micromass Platform LCZ' com HPLC 'Agilent Serie 1100'; coluna: 'Thermo HyPURITY Aquastar' 3 μ, 50 mm x 2,1 mm; eluente A: 1 L de água + 0,5 mL de ácido fórmico a 50% de força, eluente B: 1 L acetonitrilo + 0,5 ml de ácido fórmico a 50% de força; gradiente: 0,0 minuto 100% de A -> 0,2 minuto 100% de A -> 2,9 minutos 30% de A -> 3,1 minutos 10% de A -> 5,5 minutos 10% de A; forno: 50°C; caudal: 0,8 mL/minuto; detecção UV: 210 nm. Método 3:

Instrumento: 'Micromass Platform LCZ' com HPLC 'Agilent Serie 1100'; coluna: 'Phenomenex Synergi' 2 μ 'Hydro-RP Mercury, 20 mm x 4 mm; eluente A: 1 L de água + 0,5 mL de ácido fórmico a 50% de força, eluente B: 1 L acetonitrilo + 0,5 ml de ácido fórmico a 50% de força; gradiente: 0,0 minuto 90% de A -> 2,5 minutos 30% de A -> 3,0 minutos 5% de A -> 4,5 minutos 5% de A; caudal: 0,0 minuto de 1 mL/min -> 2,5 minutos/3,0 minutos/4,5 minutos de 2 mL/minuto; forno: 50°C; detecção UV: 208 a 400 nm. Método 4:

Dispositivo de MS: 'Micromass ZQ'; dispositivo de HPLC: 'Waters Alliance 2795'; coluna: 'Phenomenex Synergi' 2 μ

'Hydro-RP Mercury, 20 mm x 4 mm; eluente A: 1 L de água + 0,5 mL de ácido fórmico a 50% de força, eluente B: 1 L acetonitrilo + 0,5 ml de ácido fórmico a 50% de força; gradiente: 0,0 minuto 90% de A -> 2,5 minutos 30% de A -> 3,0 minutos 5% de A -> 4,5 minutos 5% de A; caudal: 0,0 minuto 1 mL/min -> 2,5 minutos/3,0 minutos/4,5 minutos 2 mL/minuto; forno: 50°C; detecção UV: 210 nm. 39 Método 5:

Dispositivo de: 'Micromass ZQ'; dispositivo de HPLC: ΉΡ 1100 Series'; UV DAD; coluna: 'Phenomenex Synergi' 2 μ 'Hydro-RP Mercury, 20 mm x 4 mm; eluente A: 1 L de água + 0,5 mL de ácido fórmico a 50% de força, eluente B: 1 L acetonitrilo + 0,5 ml de ácido fórmico a 50% de força; gradiente: 0,0 minuto 90% de A -> 2,5 minutos 30% de A -> 3,0 minutos 5% de A -> 4,5 minutos 5% de A; caudal: 0,0 minuto 1 mL/minuto -> 2,5 minutos/3,0 minutos/4,5 minutos 2 mL/minuto; forno: 50°C; detecção UV: 210 nm. Método 6:

Instrumento: ΉΡ 1100' com detecção DAD; coluna: 'Kromasil 100 RP-18', 60 mm x 2,1 mm, 3,5 pm; eluente A: 5 mL de HCIO4 (força de 70%)/L água, eluente B: acetonitrilo; gradiente: 0,0 minuto 2% de B -> 0,5 minuto 2% de B -> 4,5 minutos 90% de B -> 6,5 minutos 90% de B -> 7,5 minutos 2% de B; caudal: 0,75 mL/minuto; temperatura da coluna: 30°C; detecção UV: 210 nm. Método 7:

Instrumento: 'Micromass GCT, GC6890'; coluna: 'Restek RTX-35MS', 30 m x 250 pm x 0,25 pm; caudal constante com hélio: 0,88 mL/minuto; forno: 60°C; entrada: 250°C; gradiente: 60°C (manter 0,30 minuto), 50°C/minuto -> 120°C, 16°C/minuto -> 250°C, 30°C/minuto -> 300~C (manter 1,7 minutos). Método 8:

Instrumento de MS: 'Waters ZQ 2000'; instrumento HPLC: 'Agilent 1100', circuito com 2 colunas; amostrador 40 automático: HTC PAL; coluna: 'YMC-ODS-AQ', 50 mm x 4,6 mm, 3,0 pm; eluente A: água + 0,1% de ácido fórmico, eluente B: acetonitrilo + 0,1% de ácido fórmico; gradiente: 0,0 minuto 100% de A -> 0,2 minuto 95% de A -> 1,8 minutos 25% de A -> 1,9 minutos 10% de A -> 2,0 minutos 5% de A -> 3,2 minutos 5% de A -> 3,21 minutos 100% de A -> 3,35 minutos 100% de A; forno: 40°C; caudal: 3,0 mL/minuto; detecção UV: 210 nm.

Materiais de partida e intermediários

Exemplo IA 2-Hidrazino-4-metilpiridina

Prepara-se 3,33 g (30,0 mmol) de 2-flúor-4- metilpiridina em 40 mL de 2-etoxietanol, adiciona-se 14,6 mL (15,0 g, 300 mmol) de hidrato de hidrazina à solução e agita-se a mistura até à ebulição (temperatura de banho igual a 150°C) durante 16 horas. Concentra-se a solução de reacção num evaporador rotativo, introduz-se o resíduo em 100 mL de água e extrai-se a mistura com acetato de etilo (três vezes com 100 mL de cada vez) . Seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se. Seca-se o resíduo obtido sob uma pressão hipobárica.

Rendimento: 1,90 g (51% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-de) : δ = 7,83 (d, 1H) , 7,22 (s, 1H) , 6,51 (s, 1H), 6,38 (d, 1H), 4,04 (s, 2H), 2,17 (s, 3H) 41 LC-MS (método 1): tr = 0,80 minuto; MS (ESIpos): m/z = 124 [M+H] +.

Exemplo 2A Éster etilico do ácido 3- hidroxi-2-piridina-3-il -acrílico ; l i fS 1 N ò Prepara-se 1,65 g (10,0 mmol) de éster etílico do ácido 3-piridilacético em 20 mL de tolueno anidro em ambiente de árgon. Adiciona-se progressivamente à solução 410 mg (10,3 mmol) de uma solução de hidreto de sódio (60% de força em óleo de parafina) e 130 mg (0,50 mmol) de 18-coroa-6 e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos e depois a 85°C (temperatura de banho) durante 30 minutos. Depois, arrefece-se a mistura e adiciona-se, gota a gota, 1,48 g (20,0 mol) de éster etilico do ácido fórmico, a aproximadamente 20°C. Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 60 minutos e depois a 90°C (temperatura de banho) durante 60 minutos. Depois de se arrefecer, introduz-se a solução de reacção em cerca de 50 mL de uma solução saturada de cloreto de amónio e extrai-se com acetato de etilo cinco vezes com 40 mL de cada vez) . Lava-se as fases orgânica combinadas com 50 mL de uma solução saturada de cloreto de sódio, seca-se sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se. Lava-se o sólido obtido com pentano e seca-se sob uma pressão hipobárica.

Rendimento: 1,3 g (67% teórico) 42 42 1Η), 8,50 1H) , 7,35 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 11,38 (s lr, (d, 1H) , 8,39 (dd, 1H) , 7,97 (s, 1H) , 7,71 (d, (dd, 1H), 4,12 (q, 2H), 1,97 (t, 3H). MS (DCI): m/z = 194 [M+H]+.

Exemplo 3A Éster etílico do ácido 2-piridina-3-il-3-(piridina-2-il-hydrazono)-propiónico

w

Prepara-se 2,90 g (15,0 mmol) do composto do Exemplo 2A e 1,72 g (15,8 mmol) de 2-piridil-hidrazina em 75 mL de etanol e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 4 dias. Separa-se a mistura do solvente num evaporador rotativo e submete-se o resíduo a cromatografia através de gel de sílica 60 (fase móvel: diclorometano -> diclorometano/metanol a 2:1). Combina-se as fracções de produto e remove-se o solvente num evaporador rotativo. Após secagem sob uma pressão hipobárica, obtém-se 3,95 g (93% teórico) do composto em epígrafe. LC-MS (método 2): tr = 2,10 minutos; MS (ESIpos): m/z = 285 [M+H] +. 43

Exemplo 4A (6-Bromopiridina-3-il)-metanol

Br

Prepara-se 1,34 mL (1,34 mmol) de uma solução de hidreto de alumínio-lítio 1 M em THF em 5 mL de THF anidro, sob uma atmosfera de árgon, e adiciona-se, gota a gota, uma solução de 500 mg (2,69 mmol) de 6-bromo-3- piridinacarbaldeído em 3 mL de THF anidro a 0°C. Subsequentemente, agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 hora, adiciona-se 25 mL de acetato de etilo, sob arrefecimento com banho de gelo, e submete-se lentamente a hidrólise com 50 mL de uma solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio. Extrai-se a fase aquosa com acetato de etilo (três vezes, 20 mL de cada vez) . Lava-se as fases orgânicas combinadas com uma solução saturada de cloreto de sódio, seca-se sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se num evaporador rotativo. Depois de se remover os resíduos de solvente sob uma pressão hipobárica, obtém-se 375 mg (74% teórico) do composto em epígrafe. LC-MS (método 3): tr = 1,02 minutos; MS (ESIpos): m/z = 189 [M+H] +.

Exemplo 5A (6-Cloro-5-metilpiridina-3-il)-metanol

0 composto em epígrafe é obtido por reacção de 3,11 g (20,0 mmol) de 6-cloro-5-metilnocotinaldeído [cuja 44 preparação se encontra descrita no documento DE 4429465-A1, Exemplo 7] com 1,51 g (40,0 mmol) de boro-hidreto de sódio em 30 mL de água e subsequente extracção da fase aquosa com diclorometano. Seca-se sob uma pressão hipobárica o produto obtido após remoção do solvente num evaporador rotativo e utiliza-se directamente.

Exemplo 6A 2-bromo-5-(clorometil)-piridina

Introduz-se 3,69 g (19,7 mmol) do composto do Exemplo 4A num recipiente de reacção sob uma atmosfera de árgon e adiciona-se, gota a gota, 25 mL de cloreto de tionilo a -60°C (temperatura de banho). Agita-se a mistura a -60°C durante 1 hora. Concentra-se à temperatura ambiente num evaporador rotativo e adiciona-se ao resíduo 50 mL de uma solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio e 50 mL de acetato de etilo. Extrai-se a fase aquosa com acetato de etilo (quatro vezes, 25 mL de cada vez). Seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se, remove-se o solvente num evaporador rotativo e seca-se o resíduo sob uma pressão hipobárica.

Rendimento: 3,71 g (91% teórico) LC-MS (método 1): tr = 3,28 minutos; MS (ESIpos): m/z = 208 [M+H] +. 45

Exemplo 7A 2-Cloro-5-(clorometil)-3-metilpiridina

H»C

Ct cr n A preparação tem lugar de um modo idêntico ao Exemplo 6A, a partir de 1,00 g (6,35 mmol) de (6-cloro-5-metilpiridina-3-il)-metanol e de 5 mL de cloreto de tionilo. Obtém-se 1,26 g do composto em epígrafe, o qual é se faz reagir sem mais purificação. LC-MS (método 4): tr = 1,92 minutos; MS (ESIpos): m/z = 176 [M]+.

Exemplo 8A (6-Bromopiridina-3-il)-acetonitrilo

Br h

Introduz-se 3,75 g (18,2 mmol) do composto do Exemplo 6A em 20 mL de DMF, adiciona-se 979 mg (20,0 mmol) de cianeto de sódio e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 2 dias. Introduz-se a mistura de reacção numa mistura de 250 mL de uma solução saturada de cloreto de amónio e 200 mL de acetato de etilo e extrai-se a fase aquosa com acetato de etilo (três vezes, 100 mL de cada vez) . Seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se, concentra-se e seca-se o resíduo sob uma pressão hipobárica. Faz-se reagir o produto assim obtido sem mais purificação.

Rendimento: 3,23 g (90% teórico) 46 LC-MS (método 3): tr = 1,46 minutos; MS (ESIpos): m/z = 197 [M+H] +.

Exemplo 9A (6-Cloro-5-metilpiridina-3-il)-acetonitrilo

A síntese tem lugar de um modo análogo à do Exemplo 8A, a partir de 1,26 g (7,14 mmol) do composto do Exemplo 7A. Purifica-se o produto impuro obtido por cromatografia através de gel de sílica 60 (fase móvel: diclorometano -> diclorometano/metanol a 50:1).

Rendimento: 215 mg (18% teórico) LC-MS (método 1): tr = 2,95 minutos; MS (ESIpos): m/z = 167 [M+H]+.

Exemplo 10A Éster etílico do ácido (2-cloropiridina-3-il)-acético

Adiciona-se 22,0 g (144 mmol) de (6-cloropiridina-3-il)-acetonitrilo a uma mistura de 270 mL de etanol e 101 mL de ácido sulfúrico concentrado e agita-se a mistura ao refluxo durante 24 horas. Adiciona-se a mistura lentamente, gota a gota e sob agitação, a uma mistura de 350 g de hidrogeno-carbonato de sódio e 1 L de água. Extrai-se a fase aquosa com diclorometano (cinco vezes, 400 mL de cada vez). Seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se e separa-se do solvente 47 num evaporador rotativo. Obtém-se 23,1 g (80% teórico) do composto em epígrafe, o qual se faz reagir sem mais purificação. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 8,32 (d, 1H) , 7,78 (dd, 1H), 7,49 (d, 1H), 4,10 (q, 2H) , 3,77 (s, 2H) , 1,19 (t, 3H) . LC-MS (método 3): tr = 1,91 minutos; MS (ESIpos): m/z = 200 [M+H] +.

Os compostos apresentados no quadro 1 foram obtidos de um modo análogo ao descrito no Exemplo 10A, a partir dos eductos correspondentes:

Quadro 1

Exemplo n° Estrutura MS (ESI) [M+H]+ LC-MS tr [minuto] (método) Rendimento (% teórica) 11A YY J-V sr n O 246 2,02 (5) 55 12Ά XT cr h O 214 2,14 (5) 86

Exemplo 13A Éster etílico do ácido (5-bromopiridina-3-il)-acético

Introduz-se 1,00 g (4,63 mmol) de ácido (5-bromopiridina-3-il)-acético em 20 mL de etanol, adiciona-se 2 mL de ácido sulfúrico concentrado e agita-se a mistura ao refluxo de um dia para o outro. Introduz-se a solução de reacção numa mistura de 100 mL de uma solução saturada de 48 hidrogeno-carbonato de sódio e 100 mL de acetato de etilo, sob agitação, e extrai-se a fase aquosa com acetato de etilo (três vezes, 50 mL de cada vez) . Seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se, concentra-se e separa-se o resíduo de vestígios de solvente sob uma pressão hipobárica, de um dia para o outro. Rendimento: 1,06 g (94% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 8,61 (d, 1H) , 8,48 (d, 1H), 8,01 (dd, 1H), 4,10 (q, 2H) , 3,78 (s, 2H) , 1,20 (t, 3H) . LC-MS (método 5): tr = 2,06 minutos; MS (ESIpos): m/z = 246 [M+H]+.

Exemplo 14A Éster etílico do ácido 2-(6-bromopiridina-3-il)-3-(dimetilamino)-acrílico

s\f

Dissolve-se 1,30 g (2,98 mmol) do composto do Exemplo 11A em 6 mL de dimetilformamida-dietil-acetal e agita-se a mistura, sob irradiação de microondas, a 100°C durante 60 minutos. Concentra-se a mistura num evaporador rotativo e submete-se o resíduo a cromatografia através de gel de sílica 60 (fase móvel: ciclo-hexano -> ciclo-hexano/acetato de etilo a 1:3).

Rendimento: 854 mg (96% teórico) 49 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 8,11 (d, 1H) , 7,61 (s, 1H), 7,54 (d, 1H), 7,48 (dd, 1H), 4,01 (q, 2H), 2,70 (s lr, 6H), 1,12 (t, 3H). MS (DCI, NH3): m/z = 316 [M+NH4]+ LC-MS (método 4): tr = 1,88 minutos; MS (ESIpos): m/z = 299 [M+H] +.

Os compostos apresentados no quadro 2 foram obtidos de um modo análogo ao descrito no Exemplo 10A, a partir dos eductos correspondentes:

Quadro 2

50 (continuação)

51

Exemplo 18A Éster etílico do ácido 3-oxo-2-piridina-3-il-butanóico

o ch3 -

Sob uma atmosfera de árgon, introduz-se 500 mg (3,0 mmol) de piridina-3-acetato de etilo em 5 mL de THF anidro e adiciona-se, gota a gota, uma solução de hexametildissilazida de lítio (6,7 mL, 1 M em THF) a -78°C. Decorridos 15 minutos, aquece-se a mistura até 0°C, depois agita-se durante 1 hora e arrefece-se novamente até -78°C. Após a adição de 340 mg (3,3 mmol) de anidrido acético, agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 36 horas. Adiciona-se uma solução aquosa de cloreto de amónio, extrai-se a mistura com diclorometano, seca-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio e concentra-se sob uma pressão hipobárica. Obtém-se 488 mg do composto em epígrafe com uma pureza de 70%, o qual se faz reagir sem mais purificação. LC-MS (método 1): tr = 2,24 minutos; MS (ESIpos) : m/z = 208 [M+H] +.

Exemplo 19A (5-Metilpiridina-3-il)-acetonitrilo

A preparação do composto em epígrafe encontra-se descrita no documento DE 2 854 210-C2 (quadro 2, Exemplo 37) . 52

Exemplo 20A Éster etílico do ácido 5-(cianometil)-piridina-2-carboxílico

CN

O

Introduz-se 10,5 g (52,6 mmol) de éster etílico do ácido 5-(clorometil)-piridina-2-carboxílico [preparado de acordo com H. Barth et al., Liebigs Ann. Chem., 1981, 2164-2179] em 75 mL de DMF anidro e adiciona-se progressivamente 2,58 g (52,6 mmol) de cianeto de sódio à temperatura ambiente, ao longo de 3 horas. Introduz-se então a mistura em 500 mL de uma solução saturada de cloreto de amónio e extrai-se com diclorometano (quatro vezes, 100 mL de cada vez) . Seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, concentra-se e purifica-se o resíduo por cromatografia através de gel de sílica (fase móvel: ciclo-hexano -> ciclo-hexano/acetato de etilo a 1:4). Obtém-se 3,80 g (38% teórico) do composto em epígrafe. 1H-NMR (300 MHz, DMS0-d6) : δ = 8,69 (d, 1H) , 8,10 (d, 1H), 7,99 (dd, 1H), 4,36 (q, 2H) , 4,24 (s, 2H) , 1,34 (t, 3H) . LC-MS (método 3): tr = 1,45 minutos; MS (ESIpos): m/z = 191 [M+H] +.

Os compostos apresentados no quadro 3 foram obtidos de um modo análogo ao descrito no Exemplo 10A, a partir dos eductos correspondentes: 53 53 Quadro 3 Exemplo n° Estrutura MS (ESI) [M+H] + LC-MS tr [minuto] (método) Rendimento (% teórica) 21A X. J O N 180 2,16 (1) 93 22A 1 í I I 1 ΟγΑ/ 0 CMg 0 238 1,79 (3) 82

Exemplo 23A Éster metílico do ácido (4-metilpiridina-3-il)-acético

A síntese do composto em epígrafe tem lugar de um modo análogo à do Exemplo 13A, a partir de 200 mg (1,32 mmol) de ácido (4-metilpiridina-3-il)-acético.

Rendimento: 235 mg (99% teórico) 1H-NMR (300 MHz, DMSO-dê) : Ô = 8,32 (d, 1H) , 7,56 (dd, 1H), 7,20 (dd, 1H), 4,08 (q, 2H) , 3,67 (s, 2H) , 2,44 (s, 3H), 1,18 (t, 3H). LC-MS (método 1): tr = 1,86 minutos; MS (ESIpos): m/z = 180 [M+H] +.

Exemplo 24A Éster etílico do ácido (6-metilpiridina-3-il)-acético

54 A síntese do composto em epígrafe tem lugar de um modo análogo à do Exemplo 13A, a partir de 493 mg (3,26 mmol) ácido (6-metilpiridina-3-il)-acético [preparação: N. Sperber et al., J. Am. Chem. Soc., 81, 704-709 (1959)].

Rendimento: 580 mg (99% teórico) 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ = 8,32 (d, 1H) , 7,57 (dd, 1H) , 7,20 (d, 1H) , 4,08 (q, 2H) , 3,67 (s, 2H) , 2,44 (s, 3H), 1,18 (t, 3H). LC-MS (método 1): RI = 1,85 minutos; MS (ESIpos): m/z = 180 [M+H] +.

Os compostos apresentados no quadro 4 foram obtidos de um modo análogo ao descrito no Exemplo 14A, a partir dos eductos correspondentes:

Quadro 4

Exemplo n° Estrutura Rendimento (% teórica) MS (ESI) [M+H]+ ; LC-MS tr [minuto] (método) "H-NMR 25A j| CH, L O H 84 m/z = 235; 1,08 minutos (5) (400 MHz, DMSO-dg) : δ = 8,21 (d, 1H), 8.11 (d, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,32 (s, 1H), 4,00 (q, 2H), 2,66 (s, 6H), 2,28 (s, 3H), 1.11 (t, 3H) 55 (continuação)

Exenplo n° Estrutura Rendimento (% teórica) MS (ESI) [M+H]+ ; LC-MS tr [minuto] (método) “H-NMR 26A fh [f CHs JL j o MjC N 50 m/z = 235; 2,17 minutos (D 27A W, f”''™' *L -J O N 35 m/z = 235; 2,21 minutos (D 28A OH. Ϊ 3 -Nn ff CHí Cl 1 0 CR Y H a 0 81 m/z = 293; 2,02 minutos (5) (300 MHz, DMSO-d6) : δ = 8,44 (d, 1H), 7,96 (d, 1H), 7,68 (s, 1H), 7,66 (dd, 1H), 4,33 (q, 2H), 4,03 (1, 2H), 2,71 (s lr, 6H), 1,33 (t, 3H), 1,13 (t, 3H) 56

Os compostos apresentados no quadro 5 foram obtidos de um modo análogo ao descrito no Exemplo IA, a partir das correspondentes 2-cloropiridinas. Em vez do processamento descrito no Exemplo IA, neste caso concentra-se a solução de reacção e agita-se o resíduo com uma mistura de éter dietílico e diclorometano. Remove-se por filtração o excesso de cloridrato de hidrazina cristalino, concentra-se o filtrado, seca-se sob uma pressão hipobárica e faz-se reagir o produto sem mais purificação.

Quadro 5

Exemplo n° Estrutura MS (ESI) [M+H] + ; LC-MS tr [minuto] (método) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-de) 29A Τ' β'γΐ N N 2 H m/z = 202; 2,14 minutos (D δ = 7,99 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 6,70 (s, 1H), 4,14 (s, 2H), 2,22 (s, 3H) 30A N 2 H m/z = 144; 0,78 minuto (D δ = 7,96 (d, 1H), 7,65 (s, 1H), 7,50 (dd, 1H), 6,73 (d, 1H), 4,18 (s, 2H) 31A N H m/z = 188; 1,00 minuto (D 32A li Jv H 2 H m/z = 236; 1,32 minutos (D δ = 8,11 (d, 1H), 7,67 (dd, 1H), 7,62 (s, 1H) , 6,60 (d, 1H), 4,14 (s, 2H) 57

Exemplo 33A

Nitrilo do ácido 2-hidrazino-isonicotínico

Introduziu-se 20,0 g (144 mmol) de nitrilo do ácido 2-cloroisonicotínico em 150 mL de 1-Bbtanol, adiciona-se 303 mL (303 mmol) de uma solução 1 M de hidrato de hidrazina em e aquece-se a mistura (temperatura de banho de 110°C) durante 16 horas. Concentra-se a mistura e purifica-se o resíduo por cromatografia rápida através de gel de sílica (fase móvel: diclorometano/metanol a 10:1).

Rendimento: 9,48 g (49% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-de) : Ô = 8,15 (d, 1H) , 8,05 (s, 1H), 7,01 (s, 1H), 6,83 (dd, 1H), 4,30 (s, 2H) . LC-MS (método 1): tr = 0,52 minutos; MS (ESIpos): m/z = 135 [M+H] +.

Exemplo 34A (6-hidrazinopiridina-3-il)-metanol

De um dia para o outro, aquece-se ao refluxo 20,0 g (139 mmol) de (6-cloropiridina-3-il)-metanol em 400 mL de uma solução aquosa de hidrato de hidrazina com uma força de 35%. Concentra-se a mistura, adiciona-se tolueno, concentra-se novamente a mistura e agita-se o resíduo com uma mistura de diclorometano, metanol e éter dietílico. 58

Remove-se o resíduo cristalino (cloridrato de hidrazina), concentra-se o filtrado e seca-se o resíduo sob uma pressão hipobárica.

Rendimento: 19,3 g (99% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-de) : δ = 7,91 (d, 1H) , 7,40 (dd, 1H) , 7,29 (s, 1H), 6,66 (d, 1H) , 4,93 (s, 1H) , 4,31 (s, 2H), 4,14 (s, 2H). LC-MS (método 1): tr = 0,50 minuto; MS (ESIpos): m/z = 140 [M+H]+.

Exemplo 35A (4-Metoxipiridina-2-il)-hidrazona de benzofenona

Sob uma atmosfera de árgon, aquece-se a 90°C 500 mg (3,48 mmol) de 2-cloro-4-metoxipiridina, 752 mg (3,83 mmol) de hidrazona de benzofenona, 469 mg (4,88 mmol) de terc-butilato de sódio, 15,6 mg (0,07 mmol) de acetato de paládio (II), 21,2 mg (0,17 mmol) de ácido fenil-borónico e 43,4 mg (0,07 mmol) 2,2'-bis- (difenilfosfino)-1,1'-binaftilo racémico em tolueno desgaseificado, de um dia para o outro. Depois de se arrefecer, verte-se a mistura de reacção sobre água, extrai-se diversas vezes a fase aquosa com acetato de etilo, seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra- 59 se. Purifica-se o residuo por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água) . Rendimento: 872 mg (83% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 10,8 (s, 1H) , 8,07 (d, 1H) , 7,70-7, 64 (m, 5H) , 7,50-7,38 (m, 5H) , 6,94 (d, 1H) , 6,78 (dd, 1H), 3,92 (s, 3H) . LC-MS (método 3): tr = 1,70 minutos; MS (ESIpos): m/z = 304 [M+H] +.

Exemplo 36A 2-Hidrazino-4-metoxipiridina

Aquece-se 850 mg (2,80 mmol) do composto do Exemplo 35A em ácido clorídrico concentrado até 65°C, de um dia para o outro. Depois de se arrefecer, lava-se a mistura de reacção com diclorometano e concentra-se. Obtém-se 470 mg do produto impuro sob a forma do cloridrato. Agita-se 250 mg deste produto com tris(2-aminoetil)-amina ligada a um polímero em diclorometano à temperatura ambiente e de um dia para o outro. Filtra-se a mistura, concentra-se o filtrado e seca-se o resíduo sob uma pressão hipobárica elevada.

Rendimento: 170 mg (39% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 7,78 (d, 1H) , 7,26 (s, 1H), 6,25 (d, 1H), 6,15 (dd, 1H), 4,09 (s, 2H) , 3,73 (s, 3H) . 60 LC-MS (método 1): tr = 0,89 minuto; MS (ESIpos): m/z = 140 [M+H]\

Exemplo 37A 3-(Clorometil)-2-metilpiridina

'3

Introduz-se 1,00 g (8,12 mmol) de 3-(hidroximetil)-2-metilpiridina num recipiente de reacção e adiciona-se lentamente 5,9 mL (81,2 mmol) de cloreto de tionilo a 0°C. Agita-se a mistura ao refluxo durante 3 horas. Concentra-se, adiciona-se uma solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio ao resíduo e extrai-se diversas vezes a mistura com éter dietílico. Lava-se as fases orgânicas combinadas com uma solução saturada de cloreto de sódio, seca-se sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se.

Rendimento: 0,98 g (85% teórico) GC-MS (método 7): tr = 4,85 minutos; MS (EIpos): m/z = 141 [M]+.

Exemplo 38A (2-Metilpiridina-3-il)-acetonitrilo

Introduz-se 970 mg (6,85 mmol) do composto do Exemplo 37A em 10 mL de DMF, adiciona-se 336 mg (6,85 mmol) de cianeto de sódio e agita-se a mistura a 45°C de um dia para o outro. Introduz-se a mistura em 75 mL de uma solução saturada de cloreto de amónio e extrai-se diversas vezes 61 com diclorometano. Seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se. Purifica-se o resíduo por cromatografia rápida através de gel de sílica (fase móvel: diclorometano/metanol a 20:1). Rendimento: 795 mg (88% teórico) GC-MS (método 7): tr = 6,14 minutos; MS (EIpos): m/z = 132 [M]+.

Exemplo 39A Éster etílico do ácido (2-metilpiridina-3-il)-acético

Introduz-se 790 mg (5,98 mmol) do composto do Exemplo 38A em 10 mL de etanol, adiciona-se lentamente 4 mL de ácido sulfúrico concentrado e aquece-se a mistura ao refluxo durante 6 horas. Depois de se arrefecer, neutraliza-se a mistura com 6,00 g de hidrogeno-carbonato de sódio e com uma solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio. Extrai-se diversas vezes a fase aquosa com acetato de etilo, seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se. Faz-se reagir o resíduo sem mais purificação.

Rendimento: 614 mg (57% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 8,34 (dd, 1H) , 7,57 (dd, 1H), 7,18 (dd, 1H) , 4,10 (q, 2H) , 3,73 (s, 2H) , 2,40 (s, 3H), 1,18 (t, 3H) . LC-MS (método 1): tr = 1,84 minutos; MS (ESIpos): m/z = 180 [M+H] +. 62

Exemplo 40A Éster etílico do ácido (6-trifluorometilpiridina-3-il)-acético

F

Sob uma atmosfera de árgon, introduz-se 4,23 g (20,6 mmol) de ácido (6-trifluorometilpiridina-3-il)-acético [obtido a partir de [6-(trifluorometil)-piridina-3-il]-metanol, de um modo idêntico ao esquema de reacção dos Exemplos 37A, 38A e 41] em 200 mL de etanol, adiciona-se 0,2 mL de ácido sulfúrico concentrado e aquece-se a mistura ao refluxo durante 5 horas. Depois de se arrefecer, concentra-se a solução de reacção, retoma-se o resíduo em acetato de etilo e lava-se a mistura com uma solução de hidrogeno-carbonato de sódio. Extrai-se novamente a fase aquosa diversas vezes com acetato de etilo, seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se. Purifica-se o resíduo por cromatografia rápida através de gel de sílica (fase móvel: gradiente de ciclo-hexano -> ciclo-hexano/acetato de etilo a 1:1).

Rendimento: 3,24 g (67% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 8,69 (s, 1H) , 8,02 (d, 1H) , 7,89 (d, 1H), 4,13 (q, 2H) , 3,91 (s, 2H) , 1,21 (t, 3H) . LC-MS (método 3): tr = 2,12 minutos; MS (ESIpos): m/z = 234 [M+H] +. 63

Exemplo 41A 3-hidroxi-2-(6-trifluorometil- Éster etílico do ácido piridina-3-il)-acrílico

Sob uma atmosfera de árgon, introduz-se 3,46 g (14,8 mmol) do composto do Exemplo 40A em 50 mL de tolueno anidro, adiciona-se progressivamente 712 mg (17,8 mmol) de uma suspensão de hidreto de sódio (força de 60% em óleo de parafina) e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 hora e a 80°C durante 20 minutos. Depois de se arrefecer, adiciona-se, gota a gota, 392 mg (1,48 mmol) de 18-coroa-6 e depois, sob arrefecimento com gelo, 2,20 g (29,7 mol) de éster etílico do ácido fórmico. Agita-se a mistura a 0°C durante 1 hora e depois à temperatura ambiente durante 1 hora. Adiciona-se uma mistura de 100 mL de acetato de etilo e 150 mL de ácido clorídrico 0,1 M, separa-se as fases, extrai-se diversas vezes a fase aquosa com acetato de etilo, seca-se as fases orgânicas combinadas sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se. Purifica-se o resíduo por cromatografia rápida através de gel de sílica (fase móvel: gradiente de ciclo-hexano/acetato de etilo) .

Rendimento: 3,9 g (100% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 11,8 (s, 1H) , 8,70 (d, 1H), 8,03 (s, 1H), 8,00 (d, 1H) , 7,87 (d, 1H) , 4,15 (q, 2H), 1,21 (t, 3H). 64

Exemplo 42A Éster etílico do ácido 3-(dimetilamino)-2-piridina-3-il-acrílico

De um dia para o outro, aquece-se, a 100°C, 37,4 g (226 mmol) de éster etílico do ácido piridina-3-ilacético em 100 g (679 mmol) de dietilacetal de dimetilformamida. Depois de se arrefecer, concentra-se a mistura e purifica-se previamente o resíduo por cromatografia rápida através de gel de sílica (fase móvel: gradiente de ciclo-hexano/acetato de etilo a 1:1 -> acetato de etilo/etanol a 9:1). Submete-se o produto obtido a purificação final por destilação sob uma pressão hipobárica (1 mbar, temperatura de banho de 200°C).

Rendimento: 35,0 g (70% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-dg) : δ = 8,37 (dd, 1H) , 8,31 (dd, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,51 (dt, 1H), 7,29 (ddd, 1H), 4,00 (q, 2H), 2,67 (s, 6H), 1,11 (t, 3H) . LC-MS (método 1): tr = 2,38 minutos; MS (ESIpos): m/z = 221 [M+H] +.

Exemplo 43A Éster etílico do ácido 3-(dimetilamino)-2-(2-metilpiridina-3-il)-acrílico 65 f3

De um dia para o outro, aquece-se, a 100°C, 600 mg (3,35 mmol) do composto do Exemplo 39A em 1,7 mL (10,0 mmol) de dietilacetal de dimetilformamida. Depois de se arrefecer concentra-se a mistura e purifica-se o resíduo por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água).

Rendimento: 619 mg (79% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-dg) : δ = 8,30 (dd, 1H) , 7,54 (s, 1H), 7,38 (dd, 1H), 7,13 (dd, 1H), 4,05-3,92 (m, 2H), 2,62 (s, 6H), 2,30 (s, 3H), 1,08 (t, 3H). LC-MS (método 1): tr = 2,19 minutos; MS (ESIpos): m/z = 235 [M+H] +.

Exemplos concretos

Exemplo 1 4-Piridina-3-il-2-pirimidina-2-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Sob uma atmosfera de árgon, introduz-se 193 mg (1 mmol) do composto do Exemplo 2A e 116 mg (1,05 mmol) de 2-hidrazinopirimidina em 2 mL de etanol anidro e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 20 horas. Adiciona- 66 se então progressivamente 40 mg (1 mmol) de uma suspensão de hidreto de sódio (força de 60% em óleo de parafina) , ficando a solução de reacção turva. Depois, agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 10 minutos. Adiciona-se então 1 mL de ácido clorídrico 1 M à mistura de reacção escura, provocando a separação de um precipitado. Remove-se por filtração o precipitado com sucção, lava-se o resíduo com água (2x1 mL) e seca-se sob uma pressão hipobárica. Obtém-se 173 mg (72% teórico) do composto em epígrafe. 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : Ô = 12,8 (s lr, 1H) , 9,04 (d, 1H), 8,92 (d, 2H) , 8,38 (m, 2H) , 8,19 (d, 1H) , 7,50 (dd, 1H), 7,42 (dd, 1H) . LC-MS (método 5): tr = 0,59 minuto; MS (ESIpos): m/z = 240 [M+H] +.

Exemplo 2 2- (4-Metilpiridina-2-il)-4-piridina-3-il-l, 2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Sob uma atmosfera de árgon, dissolve-se 1,53 g (7,90 mmol) do composto do Exemplo 2A e 2,92 g (23,7 mmol) do composto do Exemplo IA em 2 mL de etanol anidro e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 16 horas. Adiciona-se 537 mg (7,90 mmol) de etanolato de sódio, assumindo a solução de reacção uma coloração vermelho escuro. Agita-se então a mistura à temperatura ambiente 67 durante 30 minutos e adiciona-se 7,9 mL de ácido clorídrico 1 M. Concentra-se parcialmente a solução, originando a separação de um precipitado. Remove-se por filtração o precipitado, lava-se com água (duas vezes, 5 mL de cada vez) e com MTBE (5 mL) e seca-se sob uma pressão hipobárica. Obtém-se 435 mg (22% teórico) do composto em epígrafe. 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,06 (d, 1H) , 8,35 (m, 3H), 8,20 (d, 1H) , 8,08 (s, 1H) , 7,37 (dd, 1H) , 7,21 (d, 1H), 2,45 (s, 3H). LC-MS (método 5): tr = 1,42 minutos; MS (ESIpos): m/z = 253 [M+H] +.

Exemplo 3 4-Piridina-3-il-2-[5-(trifluorometil)-piridina-2-il]-1,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

O composto é preparado de um modo análogo ao do Exemplo 2, a partir de 580 mg (3,00 mmol) do composto do Exemplo 2A e 558 mg (3,00 mmol) de 2-hidrazino-5-(trifluorometil)-piridina.

Rendimento: 55 mg (6% teórico) HPLC (método 6): tr = 3,7 minutos. MS (ESIpos): m/z = 307 [M+H]+ 1H-NMR (do aduto de etanol) (300 MHz, DMSO- d6) : δ = 13,3 (s, 1H), 9,14 (d, co co s* 1—1 (d, 1H), 8,66 (d, 1H) , 8,60 (s, 1H), 8,31-8,41 (m, 3H) , 7,40 (dd, 1H), 4,36 (s, 1H), 3,45 (q, 2H), 1,05 (t, 3H) . 68

Exemplo 4 Éster terc-butílico do ácido 2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-isonicotínico

0 composto é preparado de um modo análogo ao do Exemplo 2, a partir de 500 mg (2,59 mmol) do composto do Exemplo 2A e 662 mg (2,85 mmol) de éster terc-butilico do ácido 2-Hidrazino-isonicotinico. Obtém-se 288 mg (33% teórico) do composto em epígrafe com o aspecto de um sólido amarelo. 1H-NMR (300 MHz, CDC13) : Ò = 12,7 (s lr, 1H) , 8,97 (d, 1H) , 8,47-8,41 (m, 3H) , 8,03 (dt, 1H) , 7,91 (s, 1H) , 7,76 (dd, 1H), 7,32 (dd, 1H) , 1,64 (s, 9H). LC-MS (método 5): tr = 1,75 minutos; MS (ESIpos): m/z = 339 [M+H] +.

Exemplo 5 4-Piridina-3-il-2-[4-(trifluorometil)-piridina-2-il]-1,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

69 0 composto é preparado de um modo análogo ao do Exemplo 2, a partir de 18 mg (0,09 mmol) do composto do Exemplo 2A e 18 mg (0,10 mmol) de 2-hidrazino-4-(trifluorometil)-piridina [R. A. Evans, C. Wentrup, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 15, 1062-1064 (1992)]. Obtém-se 11,7 mg (41% teórico) do composto em epígrafe com o aspecto de um sólido amarelo. 1H-NMR (400 MHz, CDC13) : δ = 12,6 (s lr, 1H), 8,97 (s, 1H) , 8,53 (d, 1H), 8,46 (d, 1H) , 8,25 (s, 1H) , 8,01 (d, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,32 (dd, 1H). LC-MS (método 5): tr = 1,50 minutos; MS (ESIpos): m/z = 307 [M+H] +.

Exemplo 6 2-Piridina-2-il-4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3- ona

Sob uma atmosfera de árgon, introduziu-se 3,95 g (13,9 mmol) do composto do Exemplo 3A em 80 mL de etanol anidro e adiciona-se progressivamente 945 mg (13,9 mmol) de etanolato de sódio à temperatura ambiente. Depois de se agitar durante 30 minutos, adiciona-se, gota a gota, 13,9 mL de ácido clorídrico 1 M. Remove-se por filtração e com sucção o precipitado que se tinha separado, lava-se com etanol frio (20 mL) e com água (duas vezes, 20 mL de cada vez) e seca-se sob uma pressão hipobárica. Obtém-se 2,80 g (85% teórico) do composto em epígrafe. 70 1H-NMR (400 MHz, CDC13) : Ô = 13,5 (s lr, 1H), 8,97 (d, 1H) , 8,44 (dd, 1H) , 8,34 (d, 1H), 8,05- 7,91 (m, 3H) , 7,87 (s, 1H), 7,31 (dd, 1H), 7,25 (m, 1H). HPLC (método 6): tr = 3,00 minutos. MS (DCI): m/z = 239 [M+H]+.

Exemplo 7 4-(6-Cloropiridina-3-il)-2-piridina-2-il-l, 2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Agita-se 5,06 g (19,9 mmol) do composto do Exemplo 16A e 4,34 g (39,7 mmol) de 2-hidrazinopiridina em 100 de ácido acético glacial à temperatura ambiente, durante 2 horas. Concentra-se a mistura, retoma-se 0 resíduo em 300 mL de acetato de etilo e lava-se a mistura com uma solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio (duas vezes, 100 mL de cada vez). Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se. Retoma-se o resíduo obtido em 100 mL de etanol, adiciona-se progressivamente 1,49 g (21,9 mmol) de etanolato de sódio, sob arrefecimento com gelo, e depois agita-se a mistura a 0°C durante 30 minutos. Adiciona-se à solução de reacção 22 mL de ácido clorídrico 1 M a 0°C e agita-se a mistura durante mais 30 minutos. Remove-se por filtração e com sucção o precipitado formado e lava-se com etanol frio. Após secagem sob uma pressão hipobárica, obtém-se 3,18 g (59% teórico) do composto em epígrafe. 71 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ = 8,93 (s, 1H) , 8,50 (d, 2H), 8,34 (d, 2H), 8,05 (dd, 1H) , 7,51 (d, 1H) , 7,36 (dd, 1H) . LC-MS (método 3): tr = 2,27 minutos; MS (ESIpos): m/z = 273 [M+H] +.

Os compostos apresentados no quadro 6 foram obtidos de um modo análogo ao descrito no Exemplo 7, a partir dos eductos correspondentes:

Quadro 6

Exemplo n° Estrutura MS (ESI) [M+H] + LC-MS tr [minuto] (método) Rendimento (% teórica) 8 Hf jt U—Λ H 287 2,37 (3) 49 9 f\ KXY Η—? H 317 2,32 (5) 63 10 yv. 0 A J H CH, H 287 2,38 (3) 97

Exemplo 11 5-[2-(4-Metilpiridina-2-il)-3-oxo-2,3-di-hidro-lH-pirazol-4-il]-piridina-2-carbonitrilo 72

Sob uma atmosfera de árgon, introduz-se 100 mg (0,35 mmol) do composto do Exemplo 8, 81,9 mg (0,70 mmol) de cianeto de zinco e 40,3 mg (0,03 mmol) de tetraquis-(trifenilfosfino)-paládio(0) em 4 mL de DMF anidro e agita-se a mistura de reacção a 190°C durante 90 minutos, sob irradiação com microondas (dispositivo de funcionamento único 'Explorer', CEM). Remove-se por filtração a mistura de reacção, com sucção, sobre terra de diatomáceas, enxagua-se o resíduo com DMF e concentra-se o filtrado num evaporador rotativo. Submete-se o resíduo assim obtido a cromatografia por HPLC preparativa (coluna: 'YMC GEL ODS-AQ S-5'/15 pm; gradiente: acetonitrilo/água + 0,2% de TFA, 10:90 -> 95:5). Lava-se o sólido obtido a partir das fracções combinadas de produto com 6 mL de diclorometano, remove-se por filtração e com sucção e seca-se sob uma pressão hipobárica.

Rendimento: 7 mg (7% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,23 (d, 1H) , 8,55 (s, 1H), 8,43 (dd, 1H), 8,35 (d, 1H), 8,15 (s, 1H) , 7,94 (d, 1H), 7,25 (d, 1H), 2,47 (s, 3H) . LC-MS (método 3): tr = 2,01 minutos; MS (ESIpos): m/z = 278 [M+H] +.

Exemplo 12 5-(3-Oxo-2-piridina-2-il-2,3-di-hidro-lH-pirazol-4-il)-piridina-2-carbonitrilo 73

A preparação tem lugar de um modo idêntico ao do Exemplo 11, a partir de 100 mg (0,37 mmol) do composto do Exemplo 7.

Rendimento: 12 mg (12% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,27 (s, 1H) , 8,66 (s, 1H) , 8,50 (m, 2H) , 8,35 (d, 1H), 8,08 (dd, 1H), 7,97 (d, 1H), 7,38 (dd, 1H). LC-MS (método 3): tr = 1,70 minutos; MS (ESIpos): m/z = 264 [M+H] +.

Exemplo 13 4-(5-Bromopiridina-3-il)-2-piridina-2-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

A síntese do composto em epígrafe é efectuada de um modo análogo à do Exemplo 7, a partir de 1,40 g (3,50 mmol) do composto do Exemplo 17A.

Rendimento: 345 mg (31% teórico) LC-MS (método 5): tr = 2,24 minutos; MS (ESIpos): m/z = 319 [M+H] +.

Exemplo 14 5-(3-Oxo-2-piridina-2-il-2,3-di-hidro-lH-pirazol-4-il)-nicotinonitrilo 74

A preparação tem lugar de um modo idêntico ao do Exemplo 11, a partir de 50 mg (0,16 mmol) do composto do Exemplo 13.

Rendimento: 20 mg (48% teórico) 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,40 (d, 1H) , 8,76 (d, 1H) , 8,72 (m, 1H) , 8,61 (s, 1H) , 8,51 (d, 1H) , 8,36 (d, 1H), 8,07 (dd, 1H), 7,37 (dd, 1H) . LC-MS (método 3): tr = 1,65 minutos; MS (ESIpos): m/z = 264 [M+H] +.

Exemplo 15 5-Metil-2-piridina-2-il-4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Adiciona-se 22 pL de ácido acético glacial a uma solução de 58 mg (0,28 mmol) do composto do Exemplo 18A e 34 mg (0,31 mmol) de 2-hidrazinopiridina em 0,4 mL de etanol absoluto e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Adiciona-se 19 mg de etilato de sódio, depois agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos e neutraliza-se então com ácido clorídrico 1 N. Depois de se adicionar água, extrai-se a mistura com diclorometano, seca-se a fase orgânica sobre 75 sulfato de magnésio, filtra-se e concentra-se. Agita-se o resíduo com éter diisopropílico e remove-se o sólido por filtração com sucção. Após secagem, obtém-se 13,5 mg (19% teórico) do composto em epígrafe. 1H-NMR (400 MHz, CDC13) : δ = 13,28 (s lr, 1H) , 8,83 (s, 1H), 8,47 (d, 1H), 8,30 (d, 1H) , 7, 95- 7,86 (m, 3H) , 7,33 (dd, 1H), 7,18 (t, 1H), 2,44 (s, 3H). LC-MS (método 1): tr = 2,11 minutos; MS (ESIpos): m/z = 253 [M+H] +.

Exemplo 16 4-(6-Hidroxipiridina-3-il)-2-piridina-2-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Q H

H

Prepara-se 50,0 mg (0,18 mmol) do composto do Exemplo 7 e 600 mg (7,74 mmol) de acetato de amónio e aquece-se a 180 °C, sob a forma de uma suspensão em 3 mL de ácido acético glacial, num microondas de posição única ('Explorer', CEM) e durante 2 horas. Depois de se detectar uma conversão completa por HPLC analítica, adiciona-se tolueno e remove-se os componentes voláteis por destilação azeotrópica. Retoma-se o resíduo em água e remove-se o sólido restante por filtração. Depois, lava-se o pó ligeiramente acastanhado com água e depois com MTBE. Após secagem, obtém-se 39 mg (84% teórico) do composto em epígrafe. 76 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6) : δ = 12,7 (s lr, 1H) , 11,58 (s lr, 1H), 8,47 (d, 1H) , 8,32 (m, 1H) , 8,21 (s, 1H) , 8,01 (m, 2H), 7,87 (dd, 1H) , 7,32 (dd, 1H) , 6,39 (d, 1H) . LC-MS (método 3): tr = 1,31 minutos; MS (ESIpos): m/z = 255 [M+H] +.

Os compostos apresentados no quadro 7 foram obtidos de um modo análogo ao descrito no Exemplo 7, a partir dos eductos correspondentes:

Quadro 7

Exemplo n° Estrutura MS (ESI) [M+H]+ LC-MS tr [minuto] (método) Rendimento (% teórica) 17 j? rfA J H 253 1,06 (5) 9* 18 fu à Y Ym> N-—* H 253 2,20 (1) 13* 19 QVr9 N HaC 253 1,01 (5) 30* 20 f\ s f\X0 fV ? ΕΓ CH, 311 1,90 (3) 31 [* Purificação do produto impuro por HPLC preparativa (coluna: 'YMC Gel ODS-AQ S-5'/15 μπι; gradiente: acetonitrilo/ /água + 0,2% de ácido trifluoroacético, 10:90 -> 95:5 77

Exemplo 21 4-[6-(Hidroximetil)-piridina-3-il]-2-piridina-2-il-l, 2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Introduz-se 73 mg (1,93 mmol) de boro-hidreto de sódio em 20 mL de etanol e adiciona-se 115 mg (1,03 mmol) de cloreto de cálcio a 0°C. Adiciona-se progressivamente o composto do Exemplo 20 (400 mg, 1,29 mmol) e agita-se a mistura a 0°C durante 1 hora e depois à temperatura ambiente durante 4 horas. Para se completar a reacção, adiciona-se mais 73 mg (1,93 mmol) de boro-hidreto de sódio e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 20 horas. Submete-se a hidrólise com 5 mL de água e acidifica-se ligeiramente a mistura com ácido clorídrico 1 N. Agita-se então a mistura à temperatura ambiente durante 1 hora. Concentra-se, retoma-se o resíduo em cerca de 16 mL de uma mistura de DMSO/água (1:1) e purifica-se, em porções, por HPLC preparativa (coluna: 'YMC Gel ODS-AQ S-5'/15 pm; gradiente: acetonitrilo/água + 0,2% de ácido trifluoroacético, 10:90 -> 95:5).

Rendimento: 332 mg (96% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMS0-(I6): δ = 9,19 (s, 1H) , 8,71 (d, 1H), 8,64 (s, 1H) , 8,51 (d, 1H) , 8,37 (d, 1H) , 8,09 (dd, 1H), 7,81 (d, 1H), 7,38 (dd, 1H), 4,77 (s, 2H) . LC-MS (método 3): tr = 0,65 minutos; MS (ESIpos): m/z = 269 [M+H]+. 78

Exemplo 22 2-Piridina-2-il-4-(6-trifluorometilpiridina-3-il)-1,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Dissolve-se 261 mg (1,00 mmol) do composto do Exemplo 41A e 115 mg (1,05 mmol) de 2-hidrazinopiridina em 5 mL de etanol anidro, sob uma atmosfera de árgon, e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 20 horas. Adiciona-se 68 mg (1,00 mmol) de etanolato de sódio, agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos e adiciona-se ácido clorídrico 1 M e uma pequena quantidade de etanol, separando-se um precipitado. Remove-se este material por filtração, lava-se com uma pequena quantidade de etanol e seca-se sob uma pressão hipobárica.

Rendimento: 180 mg (59% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,26 (s, 1H) , 8,63 (s, 1H) , 8,55 (d, 1H), 8,51 (d, 1H) , 8,35 (d, 1H) , 8,05 (t, 1H), 7,87 (d, 1H), 7,37 (dd, 1H). LC-MS (método 4): tr = 2,15 minutos; MS (ESIpos): m/z = 307 [M+H] +.

Exemplo 23

Cloridrato de 2-(5-hidroximetil-piridina-2-il)-4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona 79

Dissolve-se 4,00 g (18,2 mmol) do composto do Exemplo 42A, 2,70 g (19,4 mmol) do composto do Exemplo 34A e 450 mg (1,94 mmol) do ácido canfor-10-sulfónico em 120 mL de etanol anidro e aquece-se a mistura ao refluxo de um dia para o outro. Depois de se arrefecer, remove-se por filtração com sucção o precipitado formado, lava-se com etanol e éter dietilico, coloca-se em suspensão em metanol, adiciona-se um excesso de uma solução de ácido clorídrico 4 N em 1,4-dioxano e concentra-se novamente a mistura. Agita-se o residuo com uma mistura de metanol e diclorometano, remove-se por filtração com sucção e seca-se.

Rendimento: 3,23 g (66% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,36 (s, 1H) , 8,91 (d, 1H) , 8,72 (s, 1H), 8,61 (d, 1H) , 8, 45-8,43 (m, 1H) , 8,36 (d, 1H), 8,04 (dd, 1H), 7,98 (dd, 1H) , 4,58 (s, 2H) . LC-MS (método 1): tr = 2,12 minutos; MS (ESIpos): m/z = 269 [M+H] +.

Os compostos apresentados no quadro 8 foram preparados a partir dos correspondentes eductos de um modo análogo ao descrito no Exemplo 23. A purificação do precipitado particular pode ser efectuada, em alternativa, por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, na presença ou na ausência de adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado). 80

Quadro 8

81 (continuação)

82

Exemplo 29 2- (4-Cianopiridina-2-il)-4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Prepara-se 545 mg (4,06 mmol) do composto do Exemplo 33A e 1,07 g (4,88 mmol) do composto do Exemplo 42A e agita-se em 15 mL de ácido acético glacial à temperatura ambiente e durante 2 horas. Concentra-se a mistura, retoma-se o resíduo em 300 mL de acetato de etilo e lava-se a mistura diversas vezes com uma solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio, filtra-se e concentra-se. Retoma-se o resíduo em 30 mL de etanol, adiciona-se 1,33 g (4,88 mmol) de uma solução de etanolato de sódio com 25% de força em etanol à temperatura ambiente e agita-se a mistura durante 30 minutos. Ajusta-se o valor de pH até 5 por adição de ácido clorídrico 1 M, remove-se por filtração com sucção o sólido formado, lava-se com éter dietílico e seca-se sob uma pressão hipobárica elevada.

Rendimento: 890 mg (83% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,01-8,98 (m, 2H) , 8,54 (dd, 1H), 8,18 (dt, 1H), 8,01 (dd, 1H), 7,85 (s, 1H), 7,39 (dd, 1H), 7,14 (dd, 1H) . LC-MS (método 5): tr = 1,13 minutos; MS (ESIpos): m/z = 264 [M+H] +. 83

Exemplo 30 2-(5-Cloropiridina-2-il)-4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Prepara-se 250 mg (1,74 mmol) do composto do Exemplo 30A e 460 mg (2,09 mmol) do composto do Exemplo 42A e agita-se em 4 mL de ácido acético glacial à temperatura ambiente durante 0,5 hora. Concentra-se a mistura, retoma-se o resíduo em acetato de etilo e lava-se a mistura diversas vezes com uma solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio, filtra-se e concentra-se. Retoma-se o resíduo em 9 mL de etanol, adiciona-se 664 mg (2,44 mmol) de uma solução de etanolato de sódio com 25% de força em etanol à temperatura ambiente e agita-se a mistura durante 1 hora. Ajusta-se o valor de pH até 5 por adição de ácido clorídrico 1 M, agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro, remove-se por filtração com sucção o sólido formado, lava-se com água e seca-se sob uma pressão hipobárica elevada.

Rendimento: 239 mg (50% teórico) ^-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,04 (d, 1H) , 8,51 (d, 1H), 8,39 (d, 1H), 8,22 (dt, 1H), 8,10 (dd, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,92 (dd, 1H), 7,20 (dd, 1H) . LC-MS (método 5): tr = 1,33 minutos; MS (ESIpos): m/z = 273 [M+H]+. 84

Exemplo 31 2-(5-Iodopiridina-2-il)-4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

A síntese do composto em epígrafe é efectuada de um modo análogo à do Exemplo 30, a partir de 250 mg (1,06 mmol) do composto do Exemplo 32A e 281 mg (1,28 mmol) do composto do Exemplo 42A.

Rendimento: 80 mg (21% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSOdg) : δ = 9,12 (s, 1H) , 8,70 (s, 1H) , 8,54-8,46 (m, 1H) , 8, 40-8,25 (m, 4H) , 7,43-7,36 (m, 1H) . LC-MS (método 3): tr = 1,44 minutos; MS (ESIpos): m/z = 365 [M+H] +.

Exemplo 32 2-(5-Bromopiridina-2-il)-4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

A síntese do composto em epígrafe é efectuada de um modo análogo à do Exemplo 30, a partir de 250 mg (1,33 mmol) do composto do Exemplo 31A e 351 mg (1,60 mmol) do composto do Exemplo 42A.

Rendimento: 166 mg (39% teórico) 85 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,06 (d, 1H) , 8,50 (d, 1H) , 8,46 (s, 1H), 8,24 (d, 1H) , 8,16 (d, 1H) , 8,13 (s, 1H), 8,08 (dd, 1H), 7,24 (dd, 1H) . LC-MS (método 5): tr = 1,40 minutos; MS (ESIpos): m/z = 318 [M+H]\

Exemplo 33 2-(5-Bromo-4-metilpiridina-2-il)-4-piridina-3-il-l, 2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Prepara-se 300 mg (1,49 mmol) do composto do Exemplo 29A e 392 mg (1,78 mmol) do composto do Exemplo 42A e agita-se em 7 mL de ácido acético glacial à temperatura ambiente durante 36 horas. Concentra-se a mistura, retoma-se o resíduo em acetato de etilo e lava-se a mistura diversas vezes com uma solução saturada de hidrogeno-carbonato de sódio. Seca-se a fase orgânica sobre sulfato de magnésio, filtra-se e concentra-se. Retoma-se o resíduo em 13 mL de etanol, adiciona-se 566 mg (2,08 mmol) de uma solução de etanolato de sódio com 25% de força em etanol à temperatura ambiente e agita-se a mistura durante 1 hora. Ajusta-se o valor de pH até 5 por adição de ácido clorídrico 1 M, concentra-se a mistura e purifica-se o resíduo por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 55 mg (11% teórico) 86 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : Ô = 9,41 (s, 1H) , 8,99 (d, 1H) , 8,86 (s, 1H), 8,67 (d, 1H) , 8,60 (s, 1H) , 8,45 (s, 1H), 8,03 (dd, 1H), 2,47 (s, 3H) . LC-MS (método 3): tr = 1,53 minutos; MS (ESIpos): m/z = 331 [M+H] +.

Exemplo 34

Cloridrato de 4-(6-cianopiridina-3-il)-2-(4-metilpiridina-2-il)-1,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

CN

Dissolve-se 50 mg (136 pmol) do composto do Exemplo 24 em 0,6 mL de l-metil-2-pirrolidona, adiciona-se 31,9 mg (272 pmol) de cianeto de zinco e 15,7 mg (14 pmol) de tetraquis(trifenilfosfino)-paládio(0) e aquece-se a mistura num microondas a 200°C, durante 30 minutos. Filtra-se a mistura através de terras de diatomáceas, efectuando a eluição com metanol. Ajusta-se o valor de pH do filtrado até uma valor ligeiramente ácido por adição de ácido clorídrico 1 M, remove-se o precipitado por filtração e purifica-se por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 13 mg (31% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,25 (s, 1H) , 8,57 (s, 1H) , 8,44 (d, 1H), 8,36 (d, 1H) , 8,15 (s, 1H) , 7,95 (d, 1H), 7,25 (d, 1H), 2,47 (s, 3H) . 87 LC-MS (método 4): tr = 2,20 minutos; MS (ESIpos): m/z = 278 [M+H] +.

Exemplo 35

Dicloridrato de 2-[4-(aminometil)-piridina-2-il]-4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Dissolve-se 100 mg (380 pmol) do composto do Exemplo 29 em 10 mL de ácido acético glacial, adiciona-se 50,0 mg de catalisador (paládio a 10% sobre carvão) e agita-se a mistura de um dia para o outro, em ambiente de hidrogénio, à temperatura ambiente e a pressão normal. Filtra-se então a mistura de reacção, concentra-se e purifica-se o residuo por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 64 mg (49% teórico) 1H-NMR (400 MHz , DMSO-de) : δ = 9, 38 (s, 1H) , 8, 93 (d, 1H) , 8,79 (s, 1H), 8,75 (s, 3H) , 8, 64 (d, 1H) , 8,56 (d, 1H), 8,48 (s, 1H), 7,99 (dd, 1H) , 7,54 (d, 1H) , 4,21 (q, 2H) . LC-MS (método 1): tr = 1,39 minutos; MS (ESIpos): m/z = 268 [M+H] +.

Exemplo 36

Cloridrato de N-{[2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-piridina-4-il]-metil}-butanamida

Dissolve-se 80,0 mg (235 pmol) do composto do Exemplo 35 e 22,8 mg (259 pmol) de ácido butirico em 5 mL de DMF, adiciona-se, sob arrefecimento com gelo, 119 mg (1,18 mmol) de trietilamina e 90,2 mg (470 pmol) de cloridrato de l-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Purifica-se directamente a mistura de reacção por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 7 mg (7% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-dê) : δ = 9,33-9,31 (m, 1H) , 8,87 (d, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,61-8,56 (m, 2H) , 8,43 (d, 1H), 8,25 (s, 1H), 7,96 (dd, 1H) , 7,26 (d, 1H) , 4,41 (d, 1H) , 2,19 (t, 2H), 1,58 (sext, 2H), 0,90 (t, 3H). LC-MS (método 1): tr = 2,26 minutos; MS (ESIpos): m/z = 338 [M+H]+.

Exemplo 37

Cloridrato de N-isopropil-N'-{[2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-piridina-4-il]-metil}-ureia 89

Dissolve-se 40,0 mg (470 μπιοί) de isocianato de isopropilo em 5 mL de DMF, sob uma atmosfera de árgon, adiciona-se 80,0 mg (235 μπιοί) do composto do Exemplo 35 e 71,4 mg (705 μπιοί) de trietilamina e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Concentra-se então a mistura e purifica-se o resíduo por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 80 mg (85% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO -d6) : δ = 9, 35 (s, 1H), 8,95 (d, 1H), 8,66 (S, 1H), 8,59 (d, 1H) , co ND (d, 1H), 8,24 (s, 1H), 8,02 (dd, 1H), 7,27 (d, 1H) , 6, 55 (s, 1H), 4,35 (s, 2H), 3,76-3,63 (m, 1H) , 2,75 (s, 1H), 1, 08-1,03 (m, 6H) . LC-MS (método 1): tr = 2,81 minutos; MS (ESIpos): m/z = 353 [M+H] +.

Exemplo 38

Cloridrato de N-{[2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-piridina-4-il]-metil}-metano-sulfonamida

x HCi 90

Dissolve-se 80,0 mg (235 μπιοί) do composto do Exemplo 35 e 53,9 mg (470 μπιοί) de cloreto de ácido metano-sulfónico, sob uma atmosfera de árgon e sob arrefecimento com gelo, adiciona-se 152 mg (1,18 mmol) de N,N-diisopropiletilamina e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Purifica-se directamente a mistura de reacção por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 31 mg (34% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : Ô = 9,34 (s, 1H), 8,88 (d, 1H), 8,69 (S, 1H), 8,59 (d, 1H), 8,47 (d, 1H), 8,40 (s, 1H), 7,95 (dd, 1H), 7,89 (t, 1H), 7,36 (d, 1H), 4,36 (d, 2H) , 2,99 (s, 3H) . LC-MS (método 1): tr = 2,35 minutos; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H] +.

Exemplo 39 Ácido 6-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-nicotínico

Dissolve-se 1,49 g (4,81 mmol) do composto do Exemplo 25 em 60 mL de 1,4-dioxano, adiciona-se 40 mL de uma solução aquosa de hidróxido de lítio 1 M e aquece-se a mis ao refluxo durante 1 hora. Arrefece-se então a mistura de reacção até 0°C, ajusta-se o pH para um valor fracamente ácido com 40 mL de ácido clorídrico 1 M e agita-se a 0°C 91 durante 2 horas. Remove-se por filtração com sucção o precipitado formado, lava-se com água e com éter dietilico e seca-se sob uma pressão hipobárica elevada.

Rendimento: 1,20 g (88% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSOde) : δ = 9,40 (s, 1H) , 9,00-8,94 (m, 2H), 8,90 (s, 1H) , 8,66 (d, 1H) , 8, 60-8,54 (m, 1H) , 8,49 (dd, 1H), 8,02 (dd, 1H). LC-MS (método 3): tr = 0,63 minuto; MS (ESIpos): m/z = 283 [M+H]+.

Exemplo 40

Cloridrato de N-benzil-6-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-nicotinamida

Dissolve-se 50 mg (177 pmol) do composto do Exemplo 39 em 2 mL de DMF, adiciona-se 1,9 mg (16 pmol) de 4-N,N-dimetilaminopiridina, 71,0 mg (549 pmol) de N,N-diisopropiletilamina e 98,0 mg (188 pmol) de hexa-fluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)-tripirrolidino-fosfónio e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adiciona-se 25,2 mg (235 pmol) de benzilamina e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante mais 5 horas. Para se completar a reacção, adiciona-se mais 25 mg (235 pmol) de benzilamina e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Submete-se a mistura de reacção a pré-purificação por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de 92 acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado), depois submete-se a cromatografia rápida através de gel de sílica (fase móvel: gradiente de diclorometano/metanol), faz-se precipitar o produto impuro a partir de metanol e purifica-se novamente o precipitado por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 21 mg (30% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-dg) : δ = 9,41 (s, 1H) , 9,38-9,33 (m, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,95 (d, 1H), 8,87 (s, 1H), 8,64 (d, 1H) , 8,56-8,49 (m, 2H) , 7,99 (dd, 1H) , 7,38-7, 32 (m, 4H) , 7,30-7,24 (m, 1H), 4,53 (d, 2H). LC-MS (método 5): tr = 1,50 minutos; MS (ESIpos): m/z = 372 [M+H]+.

Exemplo 41 Ácido 2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-isonicotínico

Coloca-se em suspensão 200 mg (760 pmol) do composto do Exemplo 29 numa mistura de 6 mL de etanol e 4 mL de água, adicionou-se 0,6 mL de uma solução de hidróxido de sódio com 50% de força e aquece-se a mistura ao refluxo durante 1 hora. Depois de se arrefecer, ajusta-se o pH para um valor fracamente ácido com ácido clorídrico 1 M e 93 remove-se por filtração com sucção o precipitado, lava-se com água e seca-se.

Rendimento: 180 mg (84% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,11 (d, 1H) , 8,86 (s, 1H), 8,62 (d, 1H), 8,46 (s, 1H) , 8,32 (dd, 1H) , 8,28 (dt, 1H), 7,69 (dd, 1H), 7,36 (dd, 1H). LC-MS (método 1): tr = 2,19 minutos; MS (ESIpos): m/z = 283 [M+H] +.

Exemplo 42 Éster metilico do ácido 2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-isonicotinico

Dissolve-se 150 mg (531 pmol) do composto do Exemplo 41 em 20 mL de metanol, adiciona-se 1 mL de ácido sulfúrico concentrado e aquece-se a mistura ao refluxo de um dia para o outro. Depois de se arrefecer, remove-se por filtração com sucção o precipitado formado, lava-se com metanol e seca-se.

Rendimento: 117 mg (74% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-dg) : δ = 9,41 (d, 1H), 8,99-8,94 (m, 2H), 8,86 (s, 1H) , 8,71 (d, 1H) , 8,66 (d, 1H), 8,01 (dd, 1H), 7,78 (dd, 1H) , 3,96 (s, 3H) . LC-MS (método 4): tr = 1,03 minutos; MS (ESIpos): m/z = 297 [M+H] +. 94 94 Exemplo 43 Cloridrato de 2- [4- (hidroximetil)-piridina-2-il] -4-piridina-3-il-l,2-di-hidro-3H-pirazol-3-ona

Introduz-se 197 mg (1,77 mmol) de cloreto de cálcio e 319 mg (8,44 mmol) de boro-hidreto de sódio em 26 mL de etanol, adiciona-se progressivamente 50 mg (169 pmol) do composto do Exemplo 42 a 0°C e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Ajusta-se o pH até um valor ligeiramente ácido por adição de ácido clorídrico 1 M, concentra-se e purifica-se o resíduo por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 32 mg (63% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-dê) : δ = 9,34 (s, 1H) , 8,93 (d, 1H), 8,66 (s, 1H), 8,58 (d, 1H) , 8,42 (d, 1H) , 8,36 (s, 1H), 8,00 (dd, 1H), 7,34 (d, 1H), 4,68 (s, 2H) . LC-MS (método 1): tr = 2,14 minutos; MS (ESIpos): m/z = 269 [M+H]\

Exemplo 44 Ácido 5- (3-oxo-2-piridina-2-il-2,3-di-hidro-lH-pirazol-4-il)-nicotínico 95

Coloca-se em suspensão 100 mg (380 pmol) do composto do Exemplo 14 numa mistura de 3 mL de etanol e 2 mL de água, adiciona-se 0,3 mL de uma solução de hidróxido de sódio com uma força de 50% e aquece-se a mistura ao refluxo durante 2 horas. Depois de se arrefecer, remove-se por filtração com sucção o precipitado, lava-se com éter dietilico e seca-se.

Rendimento: 50 mg (47% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-de) : δ = 9,04 (d, 1H) , 8,47-8,42 (m, 2H), 8,36-8,33 (m, 2H) , 7,75-7,70 (m, 1H) , 7,68 (s, 1H), 7,01-6,97 (m, 1H). LC-MS (método 5): tr = 1,28 minutos; MS (ESIpos): m/z = 283 [M+H]+.

Exemplo 45 N-Metil-5-(3-oxo-2-piridina-2-il-2,3-di-hidro-lH-pirazol-4-il)-nicotinamida

CHj

Dissolve-se 45,0 mg (159 pmol) do composto do Exemplo 44 em 1 mL de DMF, adiciona-se 1,9 mg (16 pmol) de 4-N,N-dimetilaminopiridina, 24,7 mg (191 pmol) de N,N-di-isopropiletilamina e 100 mg (191 pmol) de hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)-tripirrolidinofosfónio e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 15 minutos. 96

Adiciona-se 120 pL (239 μιηοΐ) de uma solução de metilamina 2 M em THF e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Para se completar a conversão, adiciona-se mais 120 pL (239 pmol) de uma solução de metilamina 2 M em THF e agita-se novamente a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Purifica-se directamente a mistura de reacção por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água). Rendimento: 23 mg (49% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,18 (s, 1H) , 8,74 (d, 1H) , 8, 64-8,57 (m, 2H) , 8,53-8,44 (m, 2H) , 8,40-8,25 (m, 1H) , 8, 09-8,03 (m, 1H) , 7,40-7,34 (m, 1H), 2,83 (d, 3H) . LC-MS (método 3): tr = 1,21 minutos; MS (ESIpos): m/z = 296 [M+H] +.

Exemplo 46

Cloridrato de N-{[2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-piridina-4-il]-metil}-2-fenilacetamida

H

Dissolve-se 80,0 mg (235 pmol) do composto do Exemplo 35 e 35,2 mg (259 pmol) de ácido fenilacético em 5 mL de DMF, adicionou-se, sob arrefecimento com gelo, 119 mg (1,18 mmol) de trietilamina, 90,2 mg (470 pmol) de cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida e 127 mg (941 pmol) de hidrato de 1-hidroxi-lH-benzotriazole e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. 97

Remove-se por filtração o precipitado e purifica-se o filtrado por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 58 mg (57% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,38 (d, 1H) , 8,97 (dt, 1H) , 8,88 (t, 1H), 8,72 (s, 1H) , 8,62 (d, 1H) , 8,41 (d, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,04 (dd, 1H), 7,36-7,29 (m, 4H) , 7,26- 7,21 (m, 2H), 4,42 (d, 2H), 3,56 (s, 2H). LC-MS (método 3): tr = 1,30 minutos; MS (ESIpos): m/z = 386 [M+H] +.

Exemplo 47

Cloridrato de N-{ [2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-piridina-4-il]-metil}-acetamida

Dissolve-se 80,0 mg (235 pmol) do composto do Exemplo 35 em 5 mL de DMF, adiciona-se, sob arrefecimento com gelo, 71,4 mg (705 pmol) de trietilamina e 20,3 mg (259 pmol) de cloreto de acetilo e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Purifica-se directamente a mistura por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 33 mg (41% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ = 9,37 (s, 1H) , 8,97 (d, 1H) , 8,71 (s, 1H) , 8,68 (t, 98 1Η), 8,61 (d, 1H), 8,43 (d, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,03 (dd, 1H), 7,28 (d, 1H), 4,40 (d, 2H), 1,95 (s, 3H) . LC-MS (método 1): tr = 2,09 minutos; MS (ESIpos): m/z = 310 [M+H] +.

Exemplo 48

Cloridrato de N-{[2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-piridina-4-il]-metil}-benzamida

Dissolve-se 60,0 mg (176 pmol) do composto do Exemplo 35 em 4 mL de DMF, adiciona-se, sob arrefecimento com gelo, 53,5 mg (529 pmol) de trietilamina e 27,3 mg (194 pmol) de cloreto de benzoilo e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Purifica-se directamente a mistura de reacção por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido clorídrico concentrado).

Rendimento: 36 mg (50% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMS0-d6) : δ = 9, 35-9,29 (m, 2H) , 8,91 (d, 1H), 8,68 (s, 1H), 8,59 (d, 1H), 8,44 (d, 1H) , 8,34 (s, 1H) , 8,01-7,92 (m, 3H) , 7,62-7, 48 (m, 3H) , 7,35 (d, 1H) , 4,62 (d, 2H). LC-MS (método 4): tr = 1,07 minutos; MS (ESIpos): m/z = 372 [M+H]+. 99

Exemplo 49 N-Benzil-2- (5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-1-il)-isonicotinamida

H

Dissolve-se 60,0 mg (213 pmol) do composto do Exemplo 41 em 24 mL de DMF, adiciona-se 2,6 mg (21 pmol) de 4-N,N-dimetilaminopiridina, 65,9 mg (510 pmol) de N, N-diisopropiletilamina e 265 mg (510 pmol) de hexa-fluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)-tripirrolidino-fosfónio e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 45 minutos. Adiciona-se 68,3 mg (638 pmol) de benzilamina e agita-se a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Para se completar a conversão, adiciona-se mais 65,9 mg (510 pmol) de N,N-diisopropiletilamina e 265 mg (510 pmol) de hexa-fluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)-tripirrolidino-fosfónio, agita-se a mistura à durante 45 minutos, adiciona-se mais 68,3 mg (638 pmol) de benzilamina e agita-se então a mistura à temperatura ambiente de um dia para o outro. Concentra-se e purifica-se o residuo por HPLC preparativa (coluna RP18; fase móvel: gradiente de acetonitrilo/água, com adição de 0,1% de ácido fórmico).

Rendimento: 35 mg (44% teórico) 1H-NMR (400 MHz, DMSO-C16): Ô = 9,49 (t, 1H), 9,26 (s, 1H) , 8,79 (s, 1H), 8, 70-8, 62 (m, 3H), 8,52 (d, 1H) , 7,76- 100 7,70 (m, 2H) , 7,37-7, 34 (m, 4H) , 7,31-7,24 (m, 1H) , 4,52 (d, 2H) . LC-MS (método 5): tr = 1,57 minutos; MS (ESIpos): m/z = 372 [M+H] +.

Exemplo 50 3-(4-Cloro-lH-pirazol-l-il)-N-{[2-(5-oxo-4-piridina-3-il-2,5-di-hidro-lH-pirazol-l-il)-piridina-4-il]-metil}-propanamida

Dissolve-se 17,5 mg (100 pmol) de ácido 3-(4-cloro-lH-pirazol-l-il)-propanóico, 41,7 mg (130 pmol) de tetrafluoroborato de O-(benzotriazol-l-il)-Ν,Ν,Ν',N'-tetrametilurónio e 20,2 mg (200 pmol) de trietilamina em 0,2 mL de DMSO. Adiciona-se uma solução de 33,9 mg (100 pmol) do composto do Exemplo 35 em 0,2 mL de DMSO e agita-se a mistura de reacção à temperatura ambiente de um dia para o outro. Remove-se por filtração o precipitado formado e purifica-se o filtrado por HPLC (método 8).

Rendimento: 5,8 mg (14% teórico) LC-MS (método 8): tr = 1,20 minutos; MS (ESIpos): m/z = 424 [M+H] +.

Os compostos apresentados no quadro 9 foram preparados de um modo análogo ao descrito no Exemplo 50, a partir do composto do Exemplo 35 e dos correspondentes ácido carboxílicos: 101

Quadro 9

Exemplo n° Estrutura MS (ESI) [M+H]+ ; LC-MS tr [minuto] (método) Rendimento (% teórica) 51 Ϊ7Τ! 'i \ H n—* H m/ z = 438; 1,27 minutos (8) 12 52 H r—H >1^ ('γ ~'/~'í "X, s CH> WSVv* H m/ z = 530; 1,32 minutos (8) 11 53 H * o ^ 'N 1 / V^ |^MjJj H m/ z = 468; 1,48 minutos (8) 18 54 ,OM, H m/ z = 476; 1,60 minutos (8) 9 55 H,Ç H m/ z = 444; 1,28 minutos (8) 16 102 (continuação)

Exemplo n° Estrutura MS (ESI) [M+H]+ ; LC-MS tr [minuto] (método) Rendimento (% teórica) 56 '"'iy" 0 .. N Π 1 Γ > to \ // H m/ z = 404; 1,13 minutos (8) 14 57 F^n ** "ò^ H m/ z = 404; 1,11 minutos (8) 13 58 _ M N™0 αΧ^/^í \ ^ ÃX") N—’ H m/ z = 425; 1,21 minutos (8) 15 59 Hí\ H:C H X ΧΛι %XW1 L Q ^ “Π 1 ΓΊ VN J-V1 ír m/ z = 418; 1,16 minutos (8) 19 60 F..C u V™N fíL CrÁiX^^XÍ Jl 0 ^ | ο Λ I r' \ CH* W^yvi fsj1"'*11 H m/ z = 506; 1,48 minutos (8) 9 103 (continuação)

Exemplo n° Estrutura MS (ESI) [M+H]+; LC-MS tr [minuto] (método) Rendimento (% teórica) 61 H r:ft Ύ 0 y f* \ ch, \ 1 Si i y v "· n-y H m/ z = 438; 1,27 minutos (8) 14 [Exemplo 55: a síntese do material de partida, o ácido 3-(4-hidroxi-3,5-dimetilfenil)propiónico encontra-se descrita na obra J. Med. Chem. 1995, 38, 695-707] B. Avaliação da actividade farmacológica

As propriedades farmacológicas dos compostos de acordo com a invenção podem ser demonstradas como a seguir se descreve.

Abreviaturas DMEM meio de Eagle modificado por Dulbecco FCS soro de vitelo fetal TMB 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina

Tris tris(hidroximetil)-aminometano 1. Ensaios in vitro para determinar a actividade e a selectividade dos inibidores de HIF-prolil-4-hidroxilase 1. a) Inibição da actividade de HIF-prolil-hidroxilase

O HIF hidroxilado liga-se especificamente ao complexo de proteína de Hippel-Lindau-elongina B-elongina C 104 (complexo VBC). Esta interacção ocorre apenas se o HIF for hidroxilado num radical poliol conservado. É isto a base para a determinação bioquímica da actividade de HIF-prolil-hidroxilase. O ensaio é efectuado conforme se descreve [Oehme F., Jonghaus W., Narouz-Ott L., Huetter J., Flamme I., Anal. Biochem. 330 (1), 74-80 (2004)].

Utiliza-se uma placa de microtitulação de 96 cavidades transparente, recoberta com NeutrAvidin HBC' (Pierce), que fica a incubar com caseína bloqueadora durante 30 minutos. Depois lava-se a placa três vezes com 200 pL, de cada vez, de tampão de lavagem (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, caseína bloqueadora a 10% (v/v), Tween 20 a 0,05% (v/v), por cavidade. Acrescenta-se o péptido biotina-DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (Eurogentec, 4102 Seraing, Bélgica) com uma concentração de 400 nM em 100 pL de tampão de lavagem. Este péptido serve de substrato para a prolil-hidroxilação e é ligado à placa de microtitulação. Após uma incubação durante 30 minutos, efectua-se a lavagem da placa três vezes com tampão de lavagem, mantém-se a incubar com biotina 1 mM em caseína bloqueadora durante 30 minutos e depois lava-se novamente três vezes com tampão de lavagem.

Para que tenha lugar a reacção com a prolil-hidroxilase, o substrato peptídico ligado à placa fica a incubar com um lisado celular contendo prolil-hidroxilase, durante 1 a 60 minutos. A reacção tem lugar em 100 pL de tampão de reacção (Tris 20 mM, pH 7,5, KC1 5 mM, MgCl2 1,5 mM, 2-oxoglutarato 1 pM-1 mM, FeS04 10 pM, ascorbato 2 mM), à temperatura ambiente. Além disso, a mistura de reacção contém também diversas concentrações do inibidor prolil-hidroxilase que se pretende estudar. A substância experimentada é utilizada preferencialmente, mas não 105 exclusivamente, em concentrações compreendidas entre 1 nM e 100 μΜ. Extingue-se a reacção lavando a placa três vezes com tampão de lavagem.

Para a determinação quantitativa da prolil-hidroxilação acrescenta-se uma proteina de fusão que contém tiorredoxina proveniente de E. coli e o complexo VBC em 80 pL de tampão de ligação (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 120 mM) . Decorridos 15 minutos, acrescenta-se 10 pL de uma solução de anticorpos policlonais anti-tiorredoxina provenientes de coelho, em tampão de ligação. Decorridos mais 30 minutos, acrescenta-se 10 pL de uma solução de anti-imunoglobulina do coelho acoplada a peroxidase de rábano em tampão de ligação. Após a incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, lava-se a placa três vezes com tampão de lavagem para se remover os anticorpos e o complexo VBC não ligados. Para se determinar a quantidade de complexo VBC ligado, mantém-se a placa a incubar com TMB durante 15 minutos. Extingue-se a reacção de cor acrescentando 100 pL de ácido sulfúrico 1 M. Determina-se a quantidade de complexo VBC ligado medindo a densidade óptica a 450 nm. Esse valor é proporcional à quantidade de prolina-hidroxilada no substrato peptidico.

Em alternativa, é possível utilizar um complexo VBC acoplado a európio (Perkin Eimer) para detecção da prolil-hidroxilação. Neste caso, determina-se a quantidade de complexo VBC pela fluorescência em função do tempo. Também é possível utilizar o complexo VBC marcado com [ 35S ] — metionina. Para tal, é possível preparar o complexo VBC marcado radioactivamente por transcrição-tradução in vitro, em lisado de reticulócitos. 106

Os compostos de acordo com a invenção inibem a actividade de HIF-prolil-hidroxilase neste ensaio com um valor CI50 ^ 10 μΜ. No quadro 10 estão agrupados resultados representativos.

Quadro 10

Exemplo n° CI50 [μΜ] 6 0,43 23 vo co 0 26 0, 76 34 CO \—1 0 35 2,3 43 1,5 46 0, 70 47 2,2 48 1,9 50 1,9 1. b) Ensaio celular funcional in vitro

Quantifica-se a actividade dos compostos de acordo com a invenção recorrendo a uma linhagem de células recombinantes. As células são obtidas originalmente a partir de uma linhagem de células do carcinoma pulmonar humano (A549, ATCC: Colecção Americana de Culturas Tipo, Manassas, VA 20108, E.U.A.). A linhagem de células experimentais é estavelmente transfectada com um vector que contém o gene repórter da luciferase de Photinus pyralis (doravante aqui designada por luciferase) sob o controlo de um promotor artificial mínimo. O promotor artificial mínimo é constituído por dois elementos responsáveis pela hipoxia a montante de um bloco TATA [Oehme F., Ellinghaus 107 P., Kolkhof Ρ., Smith Τ. J., Ramakrishnan S., Hutter J., Schramm M., Flamme I., Biochem. Biophys. Res. Commun., 296 (2), 343-9 (2002)]. Sob o efeito da hipoxia (v.g., criação em cultura na presença de oxigénio a 1% durante 24 horas), ou sob a acção de inibidores da dioxigenase, não selectivos (v.g., desferroxamina numa concentração de 100 μΜ, cloreto de cobalto numa concentração de 100 μΜ ou éster dietilico de N-oxalilglicina numa concentração de 1 μΜ) , a linhagem das células experimentais produz luciferase que pode ser detectada e quantificada recorrendo a reagentes de bioluminescência adequados (v.g., sistema de ensaio de luciferase 'Steady-Glo®', Promega Corporation, Madison, WI 53711, E.U.A.) e a um luminómetro adequado.

Procedimento de ensaio. No dia anterior ao da experiência, as células foram aplicadas, numa quantidade exactamente calculada de meio de cultura (DMEM, FCS a 10%, glutamina 2 mM), em placas de microtitulação de 384 ou 1536 cavidades e colocou-se tudo num incubador celular (humidade atmosférica de 96%, C02 a 5% v/v, 37°C) . No dia do ensaio acrescentou-se ao meio de cultura as substâncias experimentais em concentrações graduadas. Às células dos lotes que serviram de contraprovas negativas não se acrescentou nenhuma substância experimental. Como contraprova positiva para a determinação da sensibilidade das células aos inibidores, acrescentou-se 10-ferroxamina, v.g., numa concentração final de 100 μΜ. Decorridas 6 a 24 horas após a transferências das substâncias experimentais para as cavidades das placas de microtitulação, faz-se a medição do sinal no luminómetro. Traça-se um gráfico que relaciona dose/efeito, em função dos valores medidos, o qual serve de base para a determinação da concentração 108 eficaz a cinquenta por cento (doravante designada por valor CE50) .

Os compostos de acordo com a invenção têm valores CE50 ^ 30 μΜ no ensaio aqui descrito. No quadro 11 estão agrupados resultados representativos.

Quadro 11

Exemplo n° CEso [pM] 6 4,9 23 13,4 26 6,0 34 4,7 35 17,2 43 7,6 46 7,4 47 12,4 48 18,9 50 7,1 1. c) Ensaio celular funcional in vitro sobre a modificação da expressão genica

Para se investigar a modificação da expressão dos ARNm específicos em linhagens de células humanas após o tratamento com uma substância experimental, foram criadas em cultura em placas de 6 ou 24 cavidades as seguintes linhagens de células: células de hepatoma humano (HUH, Banco de Células JCRB, Japão), fibroblastos do rim embrionário humano (HEK/293, ATCC, Manassas, VA 20108, E.U.A.), células do carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC, Manassas, VA 20108, E.U.A.), células endoteliais da veia 109 umbilical humana (HUVEC, Cambrex, East Rutherford, New Jersey 07073, E.U.A.). Decorridas 24 horas após a adição da substância experimental, efectua-se a lavagem das células com soluto salino tamponado com fosfato e obtém-se o ARN total a partir delas recorrendo a um método conveniente (v.g., reagente Trizol®, Invi trogen GmbH, 76131 Karlsruhe, Alemanha).

Para uma experiência de análise tipica utiliza-se 1 pg de cada ARN total assim obtido que é digerido com DNase I e traduzido para um ADN complementar (ADNc), recorrendo a uma reacção com uma transcriptase inversa adequada (Sistema de Transcrição Inversa ImProm-II, Promega Corporation, Madison, WI 53711, E.U.A.). Em cada caso, utiliza-se 2,5% do lote de ADNc assim obtido, para a reacção em cadeia com polimerase. Estuda-se o nível de expressão do ARNm dos genes que estão a ser investigados, recorrendo à reacção em cadeia com polimerase, em tempo real e quantitativa [TaqMan-PCR; Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M., Genome Res., 6 (10), 986-94 (1996)], utilizando um instrumento de detecção de sequências ΆΒΙ Prism 7700' (Applied Biosystems, Inc.). As combinações de iniciadores-sondas aqui utilizadas foram geradas por meio da aplicação informática 'Primer Express 1,5' (Applied Biosystems, Inc.). Concretamente, foram estudados os ARNm de eritropoietina, carboanidrase IX, lactato-desidrogenase A e do factor do crescimento das células endoteliais vasculares.

As substâncias de acordo com a presente invenção determinam um aumento significativo, dependente da dose, no ARNm de genes induzidos por hipoxia em células de origem humana. 110 2. Ensaios in vivo para detecção da acção no sistema cardiovascular 2. a) Ensaio in vivo de modificação da expressão génica

Os compostos experimentais, dissolvidos em solventes adequados, são administrados a murganhos ou ratos quer por via oral, por meio de um tubo no estômago, quer por via intraperitoneal ou intravenosa. As doses típicas são de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 e 300 mg de substância por kg de massa corporal e por administração. Os animais de contraprova receberam apenas solvente. Decorridas 4, 8 ou 24 horas após a administração da substância experimental, os animais são sacrificados com uma sobredose de isoflurano e com uma subsequente fractura do pescoço, sendo-lhes removidos os órgãos que irão ser investigados. Partes dos órgãos são congeladas instantaneamente em azoto líquido. Obtém-se o ARN total a partir de partes dos órgãos, conforme descrito em B. 1. a) e é traduzido num ADNc. Estuda-se o nível de expressão do ARNm dos genes que estão a ser investigados, recorrendo à reacção em cadeia com polimerase, em tempo real e quantitativa [TaqMan-PCR; Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M., Genome Res., 6 (10), 986-94 (1996)], utilizando um instrumento de detecção de sequências 'ABI Prism 7700' (Applied Biosystems, Inc.).

As substâncias de acordo com a presente invenção determinam um aumento significativo, dependente da dose, do ARNm de eritropoietina no rim após a administração oral ou parentérica, comparativamente com o placebo de contraprova. 111 2. b) Determinação da concentração de eritropoietina no soro

Administra-se a substância experimental, num solvente adequado, a murganhos ou a ratos, quer por via intraperitoneal quer por via oral, uma ou duas vezes por dia. As doses típicas são de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 e 300 mg de substância por kg de massa corporal e por administração. Os animais de contraprova, com placebo, receberam apenas solvente. Antes da administração e também quatro horas após a última administração de substância, retira-se dos animais 50 pL de sangue pelo plexo venoso retroorbital ou pela veia caudal, sob anestesia ligeira. Acrescenta-se ao sangue lítio-heparina para que ficasse incoagulável. Obtém-se o plasma sanguíneo por centrifugação. Determina-se o teor em eritropoietina no plasma sanguíneo, recorrendo a um protocolo ELISA para eritropoietina (imunoensaio Epo de murganho Quantikine®, R&D Systems, Inc., Minneapolis, E.U.A.), de acordo com as instruções do fabricante. Os valores medidos são convertidos em pg/mL, recorrendo a uma medição de referência efectuada para a eritropoietina do murganho.

As substâncias de acordo com a presente invenção determinam um aumento significativo, dependente da dose, da eritropoietina no plasma após uma administração por via oral ou parentérica, comparativamente com o valor inicial e com a contraprova com placebo. 2. c) Determinação da composição celular do sangue periférico

Administra-se a substância experimental, num solvente adequado, a murganhos ou ratos, por via intraperitoneal ou 112 oral, uma ou duas vezes por dia, durante vários dias. As doses típicas são, v.g., de 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 50, 100 e 300 mg de substância por kg de massa corporal e por administração. Os animais de contraprova recebem apenas solvente. No final do estudo, retira-se sangue dos animais pelo plexo venoso do canto do olho ou pela veia caudal, com anestesia ligeira, e acrescenta-se citrato de sódio ao sangue para ficar incoagulável. Determina-se as concentrações de eritrócitos, leucócitos e trombócitos nas amostras de sangue, recorrendo a um aparelho electrónico de medida adequado. Determina-se a concentração de reticulócitos, observando ao microscópio, em cada caso, 1000 eritrócitos, recorrendo a esfregaços sanguíneos contrastados com uma solução contrastante adequada para este efeito (ΚΑΒΕ Labortechnik, Numbrecht). Para a determinação do hematócrito, retira-se sangue do plexo venoso retroorbital por meio de um capilar de hematócrito e lê-se visualmente o valor do hematócrito após centrifugação do capilar, numa centrifugadora adequada para este fim.

As substâncias de acordo com a presente invenção determinam um aumento significativo, dependente da dose, do hematócrito, do número de eritrócitos e dos reticulócitos após a administração oral e parentérica, comparativamente com o valor inicial e com a contraprova com placebo. C. Exemplos concretos para composições farmacêuticas

Os compostos de acordo com a invenção podem ser convertidos em formulações farmacêuticas tal como a seguir se descreve. 113

Comprimido

Composição 100 mg do composto de acordo com invenção, 50 mg de lactose (mono-hidrato), 50 mg de amido de milho (natural), 10 mg de polivinilpirrolidona (PVP 25) (BASF, Ludwigshafen, Alemanha) e 2 mg de estearato de magnésio.

Peso total de 212 mg, Diâmetro 8 mm, raio da curvatura 12 mm.

Preparação

Efectua-se a granulação de uma mistura do composto de acordo com a invenção, de lactose e do amido com uma solução com 5% de força (p/p) de PVP em água. Após secagem, mistura-se os grânulos com estearato de magnésio durante 5 minutos. Comprime-se tal mistura com uma prensa convencional de comprimidos (ver supra para o formato dos comprimidos). Utiliza-se uma força de compressão de 15 kN, como valor recomendado para a compressão.

Suspensão para administração por via oral

Composição 1000 mg do composto de acordo com a invenção, 1000 mg de etanol (a 96%), 400 mg de 'Rhodigel®' (goma de xantano da FMC, Pennsylvania, E.U.A.) e 99 g de água. 10 mL da suspensão oral correspondem a uma dose individual de 100 mg do composto de acordo com a invenção.

Preparação 114

Coloca-se em suspensão Rhodigel® em etanol e adiciona- se à suspensão o composto de acordo com a invenção. Adiciona-se água, sob agitação. Agita-se a mistura durante aproximadamente 6 horas até terminar o aumento de volume de Rhodigel®.

Solução para administração por via oral

Composição 500 mg do composto de acordo com a invenção, 2,5 g de polissorbato e 97 g de polietileno-glicol 400. 20 g da solução oral correspondem a uma dose individual de 100 mg do composto de acordo com a invenção.

Preparação

Sob agitação, coloca-se em suspensão o composto de acordo com a invenção numa mistura de polietileno-glicol e polissorbato. Mantém-se sob agitação até se completar a solução do composto de acordo com a invenção.

Solução i.v.

Dissolve-se o composto de acordo com a invenção, numa concentração inferior à solubilidade de saturação, num solvente fisiologicamente aceitável (v.g., solução salina isotónica, solução de glicose a 5% e/ou solução a 30% de PEG 400) . Submete-se a solução a filtração estéril e transfere-se para recipientes de injecção estéreis e isentos de agentes pirogénicos. 115

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • EP 165448 A [0013] • EP 212281 A [0013] • EP 183159 A [0013] • DE 2651008 [0013] • WO 9612706 A [0013] • WO 0051989 A [0013] • WO 03074550 A [0013] • DE 4429465 AI [0103] • DE 2854210 C2 [0123]

Literatura citada na descrição, para além das patentes de invenção • Allgemeine Pathologie und pathologische Anatomie.

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Lisboa, 3/04/2009

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula estrutural (I)

em que o símbolo A representa CH ou N, o símbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por alquilo (Ci-C6) , trifluorometilo, halogéneo, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi (Ci—Cõ) , amino, alcoxi (Ci-C6) -carbonilo, hidroxicarbonilo e -C (=0)-NH-R4, em que o grupo alquilo(Ci-C6) pode ser substituído por hidroxilo, alcoxi(C1-C4) , amino, monoalquil (C1-C4) -amino, dialquil (C1-C4) -amino ou um grupo de fórmula geral -NH-C(=0)-R5, -NH-C(=0)-NH-R6 ou -NH-SO2-R7, em que o símbolo R5 representa um grupo alquilo(Ci-C6) , o qual pode ser substituído por hidroxilo, alcoxi (C1-C4), fenilo ou heteroarilo com 5 ou 6 membros, ou fenilo, em que cada um dos grupos fenilo e heteroarilo pode ser substituído uma a três vezes com um substituinte, igual ou diferente, seleccionado entre halogéneo, ciano, alquilo(C1-C4), hidroxilo, alcoxi(C1-C4), trifluorometilo ou trifluorometoxi, o símbolo R6 representa um grupo alquilo(Ci-C6), o qual pode ser substituído por hidroxilo ou alcoxi (C1-C4) e o símbolo R7 representa um grupo alquilo (Ci-Cê) , 2 e o símbolo R4 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-C6) , o qual pode ser substituído por hidroxilo, alcoxi(C1-C4) ou fenilo, em que 0 grupo fenilo pode ser substituído por halogéneo, ciano, alquilo(C1-C4), alcoxi(C1-C4), trifluorometilo ou trifluorometoxi, o símbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por halogéneo, ciano, nitro, alquilo (Ci-Cê) , trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi (Ci-Cê) , trifluorometoxi, amino, hidroxicarbonilo e -C(=0)-NH-R8, em que os grupos alquilo (Ci-Cê) e alcoxi (Ci-Cê) podem ser substituídos por hidroxilo e o símbolo R8 representa um átomo hidrogénio ou um grupo alquilo (C1-C4) , o símbolo m representa o número 0, 1 ou 2, o símbolo n representa o número 0, 1, 2 ou 3, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R1 ou R1, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e o símbolo R2 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-Cê) ou cicloalquilo (C3-C7) e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais. 1 Composto de fórmula estrutural (I) de acordo com a reivindicação 1, em que o símbolo A representa CH ou N, 2 o símbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por alquilo (Ci—C6) , 3 trifluorometilo, ciano, nitro, hidroxilo, alcoxi (Ci-C6), amino, alcoxi (Ci-Cê)-carbonilo e hidroxicarbonilo, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por halogéneo, ciano, nitro, alquilo(Ci-Cê) , trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi (Ci-Cê) , trifluorometoxi, amino e hidroxicarbonilo, em que os grupos alquilo (Ci-C6) e alcoxi (Ci-C6) podem ser substituídos por hidroxilo, o símbolo m representa o número 0, 1 ou 2, o símbolo n representa o número 0, 1, 2 ou 3, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R1 ou R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e o símbolo R1 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-Cô) ou cicloalquilo (C3-C7) e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais. 1 Composto de fórmula estrutural (I) de acordo com a reivindicação 1, em que 4 em que cada um dos grupos fenilo e heteroarilo pode ser substituído uma a três vezes com um substituinte, igual ou diferente, seleccionado entre flúor, cloro, bromo, ciano, metilo, hidroxilo, metoxi, etoxi, trifluorometilo ou trifluorometoxi, e cada um dos símbolos R6 e R7 representa independentemente um grupo alquilo(Ci-Cê), e o símbolo R4 representa um grupo alquilo(Ci-C6) , o qual pode ser substituído por hidroxilo, metoxi, etoxi ou fenilo, em que o grupo fenilo pode ser substituído por flúor, cloro, bromo, ciano, metilo, metoxi, etoxi, trifluorometilo ou trifluorometoxi, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por flúor, cloro, bromo, alquilo (Ci-C6) , trifluorometilo, hidroxicarbonilo e -C (=0)-NH-R8, em que o grupo alquilo (Ci—C6) pode ser substituído por hidroxilo e o símbolo R8 representa um grupo alquilo (C1-C4) , o símbolo m representa o número 0, 1 ou 2, o símbolo n representa o número 0, 1 ou 2, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R1 ou R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais. 5

4. Composto de fórmula estrutural (I), de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, em que o simbolo A representa CH, o simbolo R1 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por alquilo (C1-C4) , trifluorometilo, nitro, alcoxi (C1-C4) , amino e alcoxi (Ci-C4)-carbonilo, o simbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por cloro, bromo, ciano, alquilo (C1-C4) , trifluorometilo, hidroxilo, alcoxi (C1-C4), trifluorometoxi e amino, em que os grupos alquilo(C1-C4) e alcoxi(C1-C4) podem ser substituídos por hidroxilo, o símbolo m representa o número 0 ou 1, o símbolo n representa o número 0, 1, 2 ou 3, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais. 6 o símbolo R5 representa um grupo alquilo(C1-C4), o qual pode ser substituído por fenilo ou pirazolilo, ou fenilo, em que cada um dos grupos fenilo e pirazolilo pode ser substituído uma a três vezes com um substituinte, igual ou diferente, seleccionado entre flúor, cloro, metilo ou trifluorometilo, e o símbolo R1 representa um grupo alquilo(C1-C4) e o símbolo R4 representa um grupo alquilo(C1-C4), o qual pode ser substituído por fenilo, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre o conjunto constituído por cloro, bromo, ciano, alquilo(C1-C4) e trifluorometilo, em que 0 grupo alquilo(C1-C4) pode ser substituído por hidroxilo, o símbolo m representa o número 0, 1 ou 2, o símbolo n representa o número 0, 1 ou 2, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R1 ou R2, então as suas significações podem ser iguais 1 ou diferentes, e o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais. 1 Composto de fórmula estrutural (I-A) de acordo com a reivindicação 1 7

em que o símbolo R1a representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo ou trifluorometilo e 9 A oja op1 , cada um dos símbolos R , R e R , iguais ou diferentes, representa independentemente um átomo de hidrogénio, cloro ou bromo ou um grupo ciano, metilo, hidroximetilo, metoxi ou etoxi, e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais.

7. Composto de fórmula estrutural (I-B) de acordo com a reivindicação 1,

H em que cada um dos símbolos R1A e R1B, iguais ou diferentes, representa independentemente um átomo de hidrogénio, flúor ou cloro ou um grupo alquilo (C1-C4) ou -C (=0) -NH-R4, em que o grupo alquilo (C1-C4) pode ser substituído por hidroxilo, amino ou um grupo de fórmula geral -NH-C(=0)-R5, em que o símbolo R5 representa um grupo alquilo (C1-C4) , o qual pode ser substituído por fenilo ou pirazolilo, ou fenilo, em que cada um dos grupos fenilo e pirazolilo pode ser substituído uma a três vezes com um substituinte, igual ou diferente, seleccionado entre flúor, cloro, metilo ou trifluorometilo, e o símbolo R4 representa um grupo alquilo (C1-C4) , o qual pode ser substituído por fenilo, o símbolo R2 representa um substituinte seleccionado entre 0 conjunto constituído por cloro, bromo, ciano, metilo, hidroximetilo ou trifluorometilo e o símbolo n representa o número 0, 1 ou 2, em que, no caso haverem diversas ocorrências do símbolo R2, então as suas significações podem ser iguais ou diferentes, e seus sais, solvatos e solvatos dos seus sais.

8. Processo para a preparação de um composto de fórmula estrutural (I), (I-A) ou (I-B), de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se fazer reagir os compostos de fórmula estrutural (II)

em que os símbolos R2, R3 e n possuem as significações definidas nas reivindicações 1 a 7 e 9 o símbolo Ζ1 representa um grupo metilo ou etilo, num solvente inerte, facultativamente na presença de um ácido, com um composto de fórmula estrutural (III)

em que os símbolos A, R1 e m possuem as significações definidas nas reivindicações 1 a 7, para se obter os compostos de fórmula estrutural (IV)

(IV) em que os símbolos Z1, A, R1, R2, R3, m e n possuem as significações definidas antes, e depois efectuar a ciclização destes compostos num solvente inerte e na presença de uma base, sendo os compostos de fórmula estrutural (I), (I-A) ou (I- B) facultativamente convertidos com os correspondentes (i) solventes e/ou (ii) bases ou ácidos nos seus solvatos, sais e/ou solvatos desses sais.

9. Processo para a preparação de um composto de fórmula estrutural (I), (I-A) ou (I-B), de acordo com uma qualquer 10 das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de os compostos de fórmula estrutural (V)

ÍV), em que os símbolos R2 e n possuem, em cada caso, as significações definidas nas reivindicações 1 a 7 e o símbolo Z1 representa um grupo metilo ou etilo, serem submetidos a uma reacção de condensação com um composto de fórmula estrutural (VI) H3C Q-f M , ** nf o~~r em que o símbolo Z2 representa um grupo metilo ou etilo, para se obter os compostos de fórmula estrutural (VII) CH, I ,

(VO). em que os símbolos Z1, R2 e n possuem as significações definidas antes, os quais se faz então reagir, na presença de um ácido, com um composto de fórmula estrutural (III)

11 em que os símbolos A, R1 e m possuem, em cada caso, as significações definidas nas reivindicações 1 a 7, para se obter os compostos de fórmula estrutural (IV-A)

(fV-Â) em que os símbolos Z1, A, R1, R2, m e n possuem as significações definidas antes, efectuando-se depois uma reacção de ciclização num solvente inerte e na presença de uma base.

10. Composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças.

11. Utilização de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7, para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças cardiovasculares, insuficiência cardíaca, anemia, doenças crónicas dos rins e insuficiência renal.

12. Medicamento que compreende um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7 em combinação com uma substância auxiliar farmaceuticamente adequada, inerte e não tóxica. 12

13. Medicamento que compreende um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7 em combinação com um outro composto activo seleccionado entre o conjunto constituído por inibidores ACE, antagonistas do receptor da angiotensina II, bloqueadores dos receptores beta, antagonistas dos receptores de mineralocorticóides, aspirina, diuréticos, suplementos de ferro, suplementos de vitamina B12 e de ácido fólico, antagonistas de cálcio, estatinas e derivados de digitalis (digoxina).

14. Medicamento de acordo com uma das reivindicações 12 ou 13, para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças cardiovasculares, insuficiência cardíaca, anemia, doenças crónicas dos rins e insuficiência renal.

15. Método para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou para a profilaxia de doenças cardiovasculares, insuficiência cardíaca, anemia, doenças crónicas dos rins e insuficiência renal em seres humanos e animais, utilizando uma quantidade activa pelo menos de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 7 ou de um medicamento de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 14. Lisboa, 3/04/2009