PT1842557E - Vetor de fármaco e kit de vetor de fármaco para inibição da fibrose - Google Patents

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PT1842557E
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Yoshiro Niitsu
Junji Kato
Yasushi Sato
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Nitto Denko Corp
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Description

1
DESCRIÇÃO
"VETOR DE FÁRMACO E KIT DE VETOR DE FÁRMACO PARA INIBIÇÃO DA FIBROSE"
Campo Técnico A presente invenção refere-se a um medicamento que contém um vetor de fármaco utilizado num sistema de administração de fármaco (DDS, do inglês Drug Delivery System) , para as células estreladas, e um kit para a preparação do referido medicamento, que compreende um retinoide como componente e um fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento das células estreladas, que é um fármaco dirigido a uma molécula constituinte da matriz extracelular segregada por células estreladas, ou a uma ou mais moléculas que têm a função de produzir ou segregar uma molécula constituinte da matriz celular tal de acordo com o especificado na reivindicação 1.
Antecedente da Técnica A fibrose do figado é causada, embora sem limitação, por células estreladas hepáticas (HSC), que são ativadas como resultado de, por exemplo, doenças virais hepática devido ao virus da hepatite B ou C, esteato-hepatite não alcoólica, diabetes relacionada com a desnutrição, parasitas, doenças infeciosas, tais como tuberculose ou sífilis, congestão intra-hepática devido a doença cardíaca, ou cicatrização de feridas de lesões de tecido, etc. no interior do fígado que acompanha um distúrbio na passagem da bílis, etc., e a matriz extracelular produzida e segregada excessivamente (ECM), tal como uma pluralidade de tipos de moléculas de colagénio e fibronectina sendo 2 depositadas no tecido intersticial. A fase final da fibrose hepática é a cirrose hepática, e uma vez que insuficiência hepática, carcinoma hepatocelular, etc., são causadas, a fim de prevenir e/ou inibir o progresso das mesmas, há um desejo para o desenvolvimento de um vetor de fármaco e kit de vetor de fármaco para inibir, pelo menos, a fibrose hepática.
Além disso, a pancreatite crónica desenvolve-se como resultado de fibrose pancreática pelo mesmo mecanismo que o descrito para a fibrose hepática (Madro A et ai., Med. Sei. Monit.f julho de 2004, 10 (7) : RA166-70; Jaster R, Mol Câncer. 6 de outubro, 2004; 3(1): 26). No entanto, um meio eficaz para inibir o progresso da fibrose do pâncreas ou pancreatite crónica ainda não foi encontrado.
Como meio eficaz para inibir a fibrose do fígado ou do pâncreas, há uma possibilidade de que as células estreladas sejam um dos candidatos alvo importantes (Fallowfield J A, Iredale J P, Expert Opin Ther Targets. Outubro 2004; 8(5): 423-35; Pinzani M, Rombouts K. Dig Liver Dis., abril de 2004, 36 (4): 231-42). No processo de fibrose, as células estreladas são ativadas por citoquinas a partir de células de Kupffer ou células que se infiltram e são transformadas em células ativadas e há uma acentuada produção de matriz extracelular (ECM). As células estreladas são conhecidas como células de armazenamento de vitamina A, e que pertencem à família dos miofibroblastos. Por outro lado, as células estreladas produzem matriz metaloproteinase (MMP), o seu fator inibidor (TIMP), uma citoquina tal como o TGF-β ou PDGF, e um fator de crescimento tal como HGF, e desempenham um papel importante na fibrose hepática. As células estreladas 3 ativadas aumentam a capacidade contráctil e estão envolvidas na regulação do fluxo sanguíneo e, além disso, aumentam a expressão de vários tipos de recetores de citoquinas e tornam-se altamente sensíveis à citoquina.
No que diz respeito a métodos terapêuticos para a fibrose que foram experimentados até a presente data, podem ser citados o controlo do metabolismo do colagénio, a promoção do sistema de degradação do colagénio, a inibição da ativação das células estreladas, etc. Os mesmos incluem a inibição do TGFp (conhecido como factor de ativação de células estreladas e promoção da produção de matriz extracelular (ECM)) utilizando um receptor tipo II de TGFP truncado (Qi Z et al., Proc Natl Acad Sei EUA, 2 de março, 1999; 96(5): 2345-9), um receptor do tipo II de TGFP solúvel (George J et al., Proc Natl Acad Sei EUA 26 de outubro, 1999; 96(22): 12719-24), HGF (tradução japonesa publicada 5-503076 de um pedido de patente PCT; Ueki K et al. f Nat Med. , fevereiro de 1999, 5(2): 226-30), etc., promoção da produção de metaloproteinases de matriz (MMP) por meio de HGF ou um vetor que contém o gene de MMP (Iimuro Y et al., Gastroenterology 2003, 124: 445-458.), inibição de TIMP, que é um inibidor de MMP, por meio de ARN antisentido, etc. (Liu W B et al., World J Gastroenterol., fevereiro de 2003; 9(2): 316-9), controlo da ativação de células estreladas por meio de um ligando de PPARy (Marra, F et al. , Gastroenterology., agosto de 2 0 0 0; 119(2): 466-78), ou um antagonista do receptor tipo I de angiotensina-II (H Yoshij i et al., Hepatology., outubro de 2001, 34 (4 Pt 1) : 745-50), inibição do desenvolvimento de células estreladas por inibição da ação do PDGF, por meio do inibidor de tirosina-quinase do PDGF, 4 etc. (Liu X J et al. , World J Gastroenterol. , agosto de 2002, 8(4): 739-45), e inibição dos canais de sódio, por meio de amilorida (Benedetti, A. et al., Gastroenterology., fevereiro de 2001; 120(2): 545-56), etc., e indução de apoptose de células estreladas, por meio do Composto 861 (Wang L, et al. , World J Gastroenterol., 1 de outubro, 2004, 10(19): 2831-2835), gliotoxina (Orr J G et al. , Hepatology., julho de 2004, 40(1): 232-42), etc. No entanto, em todos os casos, uma vez que a especificidade da ação e/ou a especificidade do órgão são baixas, há problemas com os efeitos e com os efeitos secundários.
No que diz respeito à síntese da proteína de colagénio, há muitos pontos indefinidos em relação à via metabólica, e um método terapêutico que utiliza um fármaco que inibe a mesma não foi estabelecido como um método terapêutico que seja eficaz e seguro para um organismo vivo, em termos de efeitos secundários. Isto é, num método no qual as moléculas envolvidas na produção de colagénio são visadas, a especificidade para o alvo não pode ser melhorada devido à diversidade da função das moléculas, e a possibilidade de causar efeitos secundários é elevada. Se o colagénio, que é o produto final, pudesse ser inibido diretamente, isto seria razoável como um método terapêutico comum para os processos de fibrose, e, a fim de fazer isso, seria necessário controlar todos os diferentes tipos de colagénio representados pelos Tipos I a IV ao mesmo tempo.
Como meio eficaz para controlar a síntese de vários tipos de moléculas de colagénio simultaneamente sem perda de especificidade ao colagénio, pode-se considerar um método para controlar a função da Hsp47. A proteína Hsp47 é uma 5 chaperona molecular específica do colagénio que é essencial para o transporte intracelular e maturação molecular, que são comuns aos processos de síntese para vários tipos de colagénio. Desse modo, se em células estreladas a função da Hsp47 puder ser controlada especificamente, há uma possibilidade de inibir a fibrose hepática, mas não existem relatos de que um tal método terapêutico esteja a ser tentado.
Os presentes inventores prepararam uma ribozima que controla especificamente a função da Hsp47 num sistema celular, e mostraram que a produção e secreção de colagénio pode ser controlada pela ribozima ao mesmo tempo (Sasaki, H, et al., Journal of Immunology, 2002, 168: 5178-83; Hagiwara S, et al., J Med Gene. 2003, 5: 784-94). A fim de controlar especificamente a síntese da Hsp47, pode-se utilizar ARNsi, que é mais fácil de otimizar do que a ribozima. O ARNsi (pequeno ARN de interferência, do inglês small interfering RNA, siRNA) utilizado na presente memória descritiva é um termo geral para o ARN de cadeia dupla utilizado no ARNi (ARN de interferência) . O ARNi é um fenómeno em que o ARN de cadeia dupla (ARN de cadeia dupla; ARNds), que é formado a partir do ARN sentido e ARN antisentido e é homólogo com um dado gene, destrói um segmento homólogo de um transcrito (ARNm) do gene. Foi originalmente exposto numa experiência utilizando um nemátodo (Fire A, et al: Nature (1998) 391: 806-811), e demonstrou que a indução de um mecanismo semelhante está presente em células de mamíferos (Ui-Tei K, et al. : FEBS Lett (2000) 479: 79-82). Além disso, Elbashir et al. demonstraram que um ARNds curto com um comprimento da ordem de 21 a 23 bp pode induzir o ARNi num sistema de
células de mamífero, sem exibir citotoxicidade (Elbashir S 6 M et al: Nature (2001) 411: 494-498). No entanto, para que os efeitos de tais moléculas sejam exibidos de forma eficaz, é necessário utilizar um método que é específico para um órgão alvo. A Publicação de Patente 2 descreve um conjugado de administração de fármaco de ligação ao receptor da vitamina, e a sua preparação. O conjugado de administração de fármaco consiste numa unidade de ligação ao receptor da vitamina, um ligante bivalente (L) e um fármaco. A unidade de ligação ao receptor da vitamina é uma vitamina ou um análogo de ligação ao receptor da vitamina ou um seu derivado, e o fármaco inclui análogos ou seus derivados. A unidade de ligação ao receptor da vitamina é ligada de forma covalente ao ligante bivalente, e o fármaco ou o análogo ou o seu derivado, é ligado de forma covalente ao ligante bivalente, em que o ligante bivalente (L) compreende um ou mais ligantes espaçadores, ligantes libertáveis, e ligantes de heteroátomos. São também descritos métodos e composições farmacêuticas para eliminação de populações de células patogénicas usando o conjugado de administração de fármaco. A Publicação de Patente 3 refere-se a métodos para tratar doenças hepáticas num indivíduo que envolve a administração de um indutor de apoptose que é capaz de seletivamente induzir a apoptose de células estreladas hepáticas no fígado do indivíduo ou de um agente que é capaz de dar origem a tal indutor no indivíduo. Além disso, a divulgação proporciona métodos para tratar a fibrose hepática num indivíduo que compreendem a administração seletiva de um indutor de apoptose especificamente para as células estreladas hepáticas do indivíduo ou de um agente que é capaz de dar origem a um indutor de apoptose de células estreladas hepáticas. 7
[Publicação da Patente 1] Tradução japonesa 5-503076 de um pedido PCT
[Publicação de Patente 2] WO 204/069159 A2 [Publicação de Patente 3] WO 204/019921 A2 [Publicação Não Relativa a Patente 1] Madro A et al., Med Sei Monit., julho de 2004, 10 (7): RA166-70 [Publicação Não Relativa a Patente 2] Jaster R, Mol. Câncer., 6 de outubro, 2004; 3(1): 26 [Publicação Não Relativa a Patente 3] Fallowfield J A, Iredale J P, Expert Opin Ther Targets., outubro de 2004, 8 (5): 423-35 [Publicação Não Relativa a Patente 4] Pinzani M, Rombouts K. Dig Liver Dis., abril de 2004; 36 (4): 231-42 [Publicação Não Relativa a Patente 5] Qi Z et al., Proc Natl Acad Sei EUA., 2 de março, 1999; 96(5): 2345-9 [Publicação Não Relativa a Patente 6] George J et al.,
Proc Natl Acad Sei EUA., 26 de outubro, 1999; 96 (22) : 12719-24 [Publicação Não Relativa a Patente 7] Ueki K et al., Nat. Med., fevereiro, 1999, 5 (2): 226-30 [Publicação Não Relativa a Patente 8] Iimuro Y et al.,
Gastroenterology 2003; 124:. 445-458 [Publicação Não Relativa a Patente 9] Liu W B et al.,
World J Gastroenterol., fevereiro, 2003; 9 (2): 316-9 [Publicação Não Relativa a Patente 10] Marra F et al.,
Gastroenterology., agosto, 2000; 119 (2): 466-78 [Publicação Não Relativa a Patente 11] Yoshiji H et al., Hepatology., outubro de 2001; 34 (4 Pt 1): 745-50 [Publicação Não Relativa a Patente 12] Liu X J et al.,
World J Gastroenterol., agosto de 2002, 8(4): 739-45 [Publicação Não Relativa a Patente 13] Benedetti, A et al., Gastroenterology., fevereiro de 2001; 120(2): 545-56 8 [Publicação Não Relativa a Patente 14] Wang L et al., World J Gastroenterol, 1 de outubro, 2004, 10 (19 ) : 2831- 2835 [ Publicação Não Relativa a Patente 15] Orr J G et al., Hepatology., julho, 2004, 40(1): 232-42 [ Publicação Não Relativa a Patente 16] Sasaki H et al., Journal of Immunology, 2002, 168: 5178-83 [ Publicação Não Relativa a : Patente 17] Hagiwara S et al., J Gene Med. 2003, 5: 784-94 [ Publicação Não Relativa a Patente 18] Fire A et al: . Nature (1998 ) 391: 806-811 [ Publicação Não Relativa a Patente 19] Ui-Tei K et al: . FEBS Lett (2000) 479: 79-82 [ Publicação Não Relativa a Patente 20] Elbashir s M et al: Nature (2001 ) 411: 494-498 [ Publicação Não Relativa a Patente 21] Yasuhiko Tabata,
New Developments in Drug Delivery System DDS Tecnology and Their Application - Cutting-edge technology for biomecial research and advance medicai treatment, Medicai Do, ISBN: 4944157932, 2003 [Publicação Não Relativa a Patente 22] Mitsuru Hashida, Drug Delivery Systems - New challenges for drug discovery and therapy, New Series Bioscience, Kagaku-dojin, ISBN: 4759803858, 1995
Divulgação da Invenção
Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção A fim de atingir um tecido e/ou um órgão, a aplicação de um sistema de administração de fármaco (DDS) é um meio eficaz (Yasuhiko Tabata, New Developments in Drug Delivery System DDS Tecnology and Their Application - Cutting-edge 9 technology for biomecial research and advance medicai treatment, Médico Do, ISBN: 4944157932, 2003: Mitsuru
Hashida, Drug Delivery Systems - New challenges for drug discovery and therapy, Nova Bioscience Series, Kagaku-dojin, ISBN: 4759803858, 1995). Como um vetor de fármaco utilizado no sistema de administração de fármaco (DDS), existem aqueles em que se aplica uma micela polimérica, um lipossoma, uma microemulsão, etc. Como técnica para aumentar a especificidade destes vetores para um órgão-alvo, são conhecidas técnicas em que um anticorpo e/ou um ligando para antigénio ou receptor especifico para um órgão e/ou tecido é misturado ou ligado ao vetor, e uma técnica na qual são utilizadas as propriedades fisico-químicas do vetor, mas não existe qualquer técnica conhecida para o caso particular em que as células estreladas são atingidas.
Meios para Resolver os Problemas A presente invenção relaciona-se com um medicamento que contém um vetor de fármaco e um kit de preparação para o medicamento de acordo com o especificado nas
reivindicações apensas que permitem que um fármaco terapêutico seja especificamente transportado para as células estreladas. 0 vetor de fármaco na presente invenção pode estar em qualquer forma tal como micela polimérica, lipossoma, emulsão, microesfera, e nanoesfera, e por ligação à mesma ou incluindo ai a vitamina A (VA) , um retinoide tal como, por exemplo, tretinoina, adapaleno ou palmitato de retinol, ou Fenretinida (4-HPR), um fármaco terapêutico pode ser especificamente transportado às células estreladas hepáticas. Além disso, pelo uso do vetor de fármaco que encerra no mesmo uma ribozima, um ARN 10 antisentido, ou um ARNsi que especificamente inibe a HSP47, que é uma chaperona molecular especifica para o colagénio, ou TIMP, que é um inibidor de MMP, a secreção dos colagénios do tipo I a IV pode ser inibida simultaneamente, e como resultado a fibrinogénese pode ser eficazmente inibida.
Desse modo, a presente invenção relaciona-se com o medicamento e kit de preparação para o medicamento de acordo com o especificado nas reivindicações apensas.
Além disso, é divulgado neste documento um vetor específicos para células estreladas que tem um retinoide como componente.
Além disse , é divulgado neste documento um vetor de fármaco em que o retinoide inclui a vitamina A. Além disse , é divulgado neste documento um vetor de fármaco em que o retinoide está contido a 0,2 a 20% em peso. Além disse , é divulgado neste documento um vetor de fármaco em que está em qualquer das formas de micela polimérica, lipossoma, emulsão, microesfera e nanoesfera •
Além disso, a presente invenção refere-se a um medicamento para tratar um distúrbio relacionado com as células estreladas, o medicamento incluindo o vetor de fármaco e um fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas como especificado nas reivindicações apensas. 11
Além disso, a presente invenção refere-se ao medicamento em que o distúrbio é selecionado do grupo que consiste em hepatite, fibrose hepática, cirrose hepática, cancro do fígado, pancreatite, fibrose pancreática, cicatrização das cordas vocais, fibrose da mucosa das cordas vocais e fibrose da laringe.
Além disso, a presente invenção refere-se ao medicamento em que o fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas é selecionado do grupo que consiste num inibidor da produção de TIMP de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, e um ARNsi, ribozima, ácido nucleico antisentido ou polinucleótido quimérico de DNA/ARN, ou um vetor que expressa o mesmo, que visa uma molécula constituinte de matriz extracelular produzida por células estreladas ou uma ou mais moléculas que têm a função de produzir ou segregar a molécula constituinte de matriz extracelular.
Além disso, a presente invenção refere-se ao medicamento em que a molécula que tem a função de produzir ou segregar a molécula constituinte de matriz extracelular é a proteína HSP47.
Além disso, a presente invenção refere-se ao medicamento em que o fármaco e o vetor de fármaco são misturados num local de tratamento médico ou na sua proximidade.
Além disso, a presente invenção refere-se a um kit de preparação para o medicamento de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, o kit incluindo um ou mais recipientes que contêm um ou mais dos fármacos para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células 12 estreladas, um constituinte de vetor de fármaco e um retinoide.
Além disso, é divulgado neste documento um método para tratar um distúrbio relacionado com as células estreladas, o método incluindo administrar uma quantidade eficaz do medicamento a um indivíduo em necessidade do mesmo.
Além disse, é divulgado neste documento um método em que o distúrbio é selecionado do grupo que consiste em hepatite, fibrose hepática, cirrose hepática, cancro do fígado, pancreatite, fibrose pancreática, cancro pancreático, cicatrização das cordas vocais, fibrose das cordas vocais e fibrose da faringe.
Além disso, é divulgado neste documento um método em que o medicamento é administrado parentericamente.
Além disso, é divulgada neste documento a utilização do vetor de fármaco na produção de um medicamento para o tratamento de um distúrbio relacionado com células estreladas.
Além disso, é divulgado neste documento um método de administração de fármaco para as células estreladas, utilizando o vetor de fármaco.
Além disso, a presente invenção também se refere a um medicamento de acordo com o especificado nas reivindicações apensas que compreende um vetor de fármaco, para inibição da fibrose, que inclui um retinoide como componente e transporta um fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas 13 especificamente para células estreladas, o medicamento de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, compreendendo um vetor de fármaco, para inibição da fibrose, em que o retinoide inclui a vitamina A, o medicamento de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, compreendendo um vetor de fármaco, para inibição da fibrose, em que o retinoide é contido a 0,2% a 20%, o medicamento de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, compreendendo um vetor de fármaco, para inibição da fibrose, em que o mesmo é em qualquer forma tal como micela polimérica, lipossoma, emulsão, microesfera, e nanoesfera, o medicamento de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, compreendendo um vetor de fármaco, para inibição da fibrose, em que o fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas inclui um ou mais fármacos selecionados de um inibidor da produção de TIMP de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, compreendendo um vetor de fármaco, para inibição da fibrose, em que o fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas inclui um ARNsi, uma ribozima ou um ARN antisentido, ou um vetor que expressa o mesmo, que visa uma molécula constituinte de matriz extracelular produzida por células estreladas, ou que visa uma ou mais moléculas que têm a função de produzir ou segregar a molécula constituinte de matriz extracelular, e o medicamento de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, compreendendo um vetor de fármaco, para inibição da fibrose, em que a molécula que tem a função de produzir ou segregar a molécula constituinte de matriz extracelular é a proteina HSP47. 14
Além disso, a presente invenção refere-se a um kit de preparação para o medicamento da presente invenção para inibição da fibrose que inclui um ou mais recipientes que contêm um ou mais de um fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas, um constituinte de vetor de fármaco e um retinoide, o kit de preparação para o medicamento da presente invenção para inibição da fibrose, em que o retinoide inclui a vitamina A, o kit de preparação para o medicamento da presente invenção para inibição da fibrose em que o retinoide está contido a 0,2% a 20%, o kit de preparação para o medicamento da presente invenção para inibição da fibrose, em que o mesmo está em qualquer forma tal como micela polimérica, lipossoma, emulsão, microesfera, e nanoesfera, o kit de preparação para o medicamento da presente invenção para inibição da fibrose, em que o fármaco para controlar atividade ou o desenvolvimento de células estreladas inclui um ou mais fármacos selecionados de um inibidor de produção de TIMP de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, o kit de preparação para o medicamento da presente invenção para inibição da fibrose, em que o fármaco para controlar atividade ou o desenvolvimento de células estreladas inclui um ARNsi, uma ribozina, ou um ARN antisentido, ou um vetor que expressa o mesmo, que visa uma molécula constituinte de matriz extracelular segregada por células estreladas, ou que visa uma ou mais moléculas que têm a função de produzir ou segregar a molécula constituinte da matriz extracelular, e o kit de preparação para o medicamento da presente invenção para inibição da fibrose, em que a molécula que tem a função de produzir ou segregar a molécula constituinte de matriz extracelular é a proteína HSP47. 15
Efeitos da Invenção
Por meio da utilização do medicamento e do kit de preparação para o medicamento da invenção que contém o vetor de fármaco que permite que um fármaco terapêutico seja transportado especificamente para as células estreladas como meios eficazes para a prevenção, eliminação ou melhoria de fibrose e/ou várias tipos de distúrbios relacionadas com a fibrose, podem ser proporcionados efeitos terapêuticos inovadores, como mostrado pelos Exemplos. Isto é, uma vez que o medicamento e o kit de preparação para o medicamento da presente invenção visam especificamente as células estreladas, as condições clinicas que se desenvolvem principalmente devido às células estreladas, tais como, por exemplo, a fibrose, podem ser inibidas de forma eficiente e eficaz, ao mesmo tempo minimizando os efeitos secundários.
Breve Descrição dos Desenhos [FIG. 1] Um diagrama que mostra um protocolo com relação à avaliação do efeito de gp46-ARNsi in vitro utilizando células NRK, e determinação da sequência, tempo e concentração ótimos.
[FIG. 2] Um diagrama fotográfico que mostra o resultado de transferência de western de gp46 e de actina (24 horas de cultura, exame da sequência ótima).
[FIG. 3] Um diagrama fotográfico que mostra o resultado de transferência de western de gp46 e de actina (24 horas de cultura, exame da concentração ótima). 16 [FIG. 4] Um diagrama fotográfico que mostra o resultado de transferência de Western de gp46 e actina (concentração de 50 nM, exame do tempo de cultura ótimo).
[FIG. 5] Um diagrama que mostra um protocolo para avaliar a inibição da expressão de colagénio por gp46 ARNsi em células NRK.
[FIG. 6] Um qráfico que mostra a inibição da síntese de colagénio por ARNsi.
[FIG. 7] Um diagrama fotográfico que mostra a transfeção de ARNsi específica para HSC.
[FIG. 8] Um diagrama fotográfico para avaliar percentual específico da transfeção de ARNsi para HSC.
[FIG. 9] Um diagrama fotográfico para avaliar a inibição da expressão de gp46 por ARNsi.
[FIG. 10] Um diagrama fotográfico que mostra coloração pela técnica de Azan de fígado de rato ao qual foi administrado DMN.
[FIG. 11] Um diagrama que mostra um protocolo de tratamento de LC de rato.
[FIG. 12] Um diagrama fotográfico que mostra coloração pela técnica de Azan de fígados de ratos com LC aos quais foi administrado VA-Lip-gp46ARNsi.
[FIG. 13] Um diagrama que mostra um método para extrair a parte manchada por meio de NIH Image (6 posições sendo 17 tomadas aleatoriamente a partir de uma imagem manchada pela técnica de Azan).
[FIG. 14] Um gráfico que mostra a proporção por área ocupada por porções fibróticas em histologia do fígado (proporção de colagénio por área, %).
[FIG. 15] Um gráfico que mostra a quantidade de hidroxiprolina no tecido hepático.
[FIG. 16] Um gráfico que mostra a curva de sobrevivência para a cirrose hepática de ratos aos quais VA-Lip-gp46ARNsi foi administrado por via intraportal.
[FIG. 17] Um diagrama fotográfico que mostra coloração pela técnica de Azan de tecido hepático de cirrose hepática de ratos aos quais VA-Lip-gp46ARNsi foi administrado por via intraportal.
[FIG. 18] Um gráfico que mostra a curva de sobrevivência para a cirrose hepática de ratos aos quais VA-Lip-gp46ARNsi foi administrado por via intraportal.
[FIG. 19] Um diagrama fotográfico que mostra coloração pela técnica de Azan de tecido hepático de cirrose hepática de ratos aos quais VA-Lip-gp46ARNsi foi administrado por via intraportal.
[FIG. 20] Um gráfico que mostra a curva de sobrevivência para a cirrose hepática de ratos aos quais VA-Lip-gp46ARNsi foi administrado por via intravenosa. 18 [FIG. 21] Um gráfico que mostra a curva de sobrevivência para a cirrose hepática de ratos aos quais VA-Lip-gp46ARNsi foi administrado por via intravenosa.
[FIG. 22] Um diagrama fotográfico que mostra coloração pela técnica de Azan de tecido hepático de cirrose hepática de ratos aos quais VA-Lip-gp46ARNsi foi administrado por via intravenosa.
[FIG. 23] Um diagrama que mostra a melhora da eficiência de transfeção de VA-Lip-gp46ARNsi por RBP.
[FIG. 24] Um diagrama que mostra a inibição da transfeção de VA-Lip-gp46ARNsi pelo anticorpo anti-RBP.
Melhor Modo de Realizar a Invenção 0 retinoide na presente invenção inclui a vitamina A, bem como um retinoide num estado em que está dissolvido ou misturado com um meio que o pode dissolver ou o reter.
Qualquer retinoide pode ser utilizado na presente invenção, desde que esteja ativamente acumulado por células estreladas; exemplos de retinoide incluem, mas não estão limitados ao ácido retinoico, adapaleno, palmitato de retinol, e em especial a vitamina A (ácido retinoico), e Fenretinida (4-HPR). A presente invenção utiliza a propriedade das células estreladas para incorporar positivamente um retinoide e usando o retinoide como um vetor de fármaco ou por ligação ou sendo incluido em outro componente do vetor de fármaco, um fármaco de acordo com as reivindicações é transportado especificamente para as células estreladas. 19 0 vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção, por conseguinte, pode conter um componente vetor de fármaco que não seja o retinoide. Tal componente não é particularmente limitado, e qualquer componente conhecido nos campos da medicina e da farmácia podem ser utilizados, mas é preferível que seja capaz de incluir o retinoide ou de ligar-se ao mesmo. Exemplos de tal componente incluem um lípido, por exemplo, um fosfolípido tal como glicerofosfolípido, um esfingolípido tal como esfingomielina, um esterol, tal como colesterol, um óleo vegetal tal como óleo de soja ou óleo de semente de papoula, óleo mineral, e uma lecitina como lecitina de gema de ovo, mas os exemplos não se limitam a estes. Entre eles, aqueles que podem formar um lipossoma, são preferíveis, por exemplo, fosfolípidos naturais, tais como lecitina, fosfolípidos semissintéticos, tais como dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), e diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) e colesterol.
Além disso, o vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção pode conter uma substância que melhora a incorporação em células estreladas, por exemplo, proteína de ligação ao retinol (RBP). A ligação ou a inclusão do retinoide com o vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção pode também ser realizada por ligação, ou incluindo o retinoide com outro componente do vetor de fármaco por meio de métodos químicos e/ou físicos. Alternativamente, a ligação ou a inclusão do retinoide com o vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção pode também ser realizada por mistura do derivado de retinoide, que tem 20 afinidade de formação e os componentes básicos do vetor de fármaco, nos componentes do vetor de fármaco durante a preparação do vetor de fármaco. A quantidade de retinoide ligada ou incluida no vetor de fármaco da presente invenção pode ser de 0,01% a 100% como uma proporção em peso em relação aos componentes do vetor de fármaco, de preferência de 0,2% a 20%, e mais preferencialmente de 1% a 5%. O vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção pode estar em qualquer forma, desde que o fármaco de acordo com as reivindicações possa ser transportado para atingir as células estreladas, e exemplos da forma incluem, mas não estão limitados a micelas poliméricas, lipossomas, emulsão, microesferas, e nanoesferas. Além disso, o vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção pode incluir no seu interior o fármaco que está a ser transportado, a ser ligado ao exterior do fármaco, a ser transportado, ou a ser misturado com o fármaco que está a ser transportado desde que o retinoide nele incluido seja pelo menos parcialmente exposto na parte exterior da preparação antes de atingir as células estreladas, o mais tardar. O vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção visa especificamente as células estreladas e permite que um efeito desejado, tal como, por exemplo, a inibição ou prevenção de fibrose, seja exposto com 0 efeito máximo e efeitos secundários minimos transportando de forma eficaz para as células estreladas um fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas de acordo com o especificado nas reivindicações apensas. 21
Desse modo, na presente invenção, o "fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas" pode ser qualquer fármaco que direta ou indiretamente iniba as ações fisico-quimicas das células estreladas envolvidas na promoção de fibrose de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, incluindo inibidores da produção de TIMP que são um ácido nucleico antisentido de TIMP.
Outros exemplo do "fármaco para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas", pode incluir um fármaco para controlar o metabolismo de uma matriz extracelular tal como o colagénio, por exemplo, uma sustância que tem um efeito na inibição da expressão de uma molécula alvo, tal como ARNsi, ribozima e ácido nucleico antisentido (incluindo ARN, ADN, APN, e um compósito dos mesmos), e vetores que expressam o mesmo, que visam uma molécula constituinte de matriz extracelular produzida por células estreladas, ou que visa uma ou mais moléculas que têm a função de produzir ou segregar a molécula constituinte de matriz extracelular. 0 ARNsi é um ARN de cadeia dupla que tem um sequência especifica para uma molécula alvo, tal como um ARNm, e promove a degradação da molécula alvo, assim inibindo a expressão de um material formado desse modo, tal como, por exemplo, uma proteína (ARN de interferência). Desde que o princípio foi publicado por Fire et al. (Nature, 391: 806- 811, 1998) uma vasta gama de investigação foi realizada na otimização do RNAsi, e um especialista na técnica está familiarizado com estas técnicas. Além disso, materiais com exceção do ARNsi que causam interferência de ARN ou 22 outra reação de inibição de expressão génica foram intensamente investigados e atualmente existe um grande número destes materiais.
Por exemplo, o documento JP, A, 2003-219893 descreve um polinocleótido de cadeia dupla formado de ARN e ADN gue inibe a expressão de um gene alvo. Este polinucleótico pode ser um hibrido de ADN/ARN no qual uma das duas cadeias é ADN e a outra é ARN, ou um ADN/ARN quimérico no qual uma porção da mesma cadeia é ADN e a outra porção é ARN. Um polinucleótido desse tipo é de preferência formado de 19 a 25 nucleótidos, mais preferencialmente 19 a 23 nucleótidos, e ainda mais preferencialmente 19 a 21 nucleótidos; no caso do híbrido de ADN/ARN, é preferível que a cadeia de sentido seja o ADN e a cadeia antisentido seja o ARN, e no caso do ADN/ARN quimérico, é preferível que uma porção no lado a montante do polinucleótido de cadeia dupla seja o ARN. Um polinucleótido desse tipo pode ser preparado de modo a ter qualquer sequência de acordo com um método sintético químico conhecido per se.
No que diz respeito à molécula alvo, por exemplo, é preferível uma molécula que pode inibir a secreção de todas as moléculas constituintes de matriz extracelular, e exemplos de tal molécula incluem, mas não se limitam a HSP47. A HSP47 ou uma sequência génica homóloga da mesma é divulgada como, por exemplo, N° de acesso do GenBank AB010273 (humana), X60676 (murganho), ou M69246 (rato, gp4 6) .
Os exemplos preferidos do material que é transportado pelo vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção inclui um ARNsi, um híbrido de ADN/ARN ou 23 polinucleótido quimérico, e um ácido nucleico antisentido que visa a HSP47. 0 fármaco que é administrado pelo vetor de fármaco contido no medicamento da presente invenção, de acordo com o especificado nas reivindicações apensas, pode ser marcado ou não. A marcação é útil ao nivel de ensaio e investigação, em particular uma vez que a viabilidade de transporte ou um aumento ou diminuição em células estreladas podem ser monitorizados. Um marcador pode ser selecionado daqueles conhecidos dos especialistas na técnica; por exemplo, qualquer isótopo radioativo, um material que pode se ligar a um material a ser marcado (por exemplo, um anticorpo), um material fluorescente, um fluoróforo, um material quimiluminescente, e uma enzima. A presente invenção também se refere a um medicamento para o tratamento de um distúrbio relacionado com as células estreladas de acordo com o especificado na reivindicação 5 apensa. 0 distúrbio relacionado com as células estreladas aqui referido significa fibrose, hepatite e pancreatite, em particular hepatite crónica, fibrose hepática, cirrose hepática, pancreatite crónica e fibrose pancreática. Além disso, de acordo com relatórios recentes, uma vez que as células estreladas estão presentes nas cordas vocais (por exemplo, Fuja T J et al. , Cell Tissue Res. 2005; 322(3): 417-24), os distúrbios acima mencionados incluem distúrbios das cordas vocais e laringe, tais como cicatrização das cordas vocais, fibrose da mucosa das cordas vocais, e fibrose da laringe.
No medicamento da presente invenção, o vetor de fármaco pode incluir um fármaco no seu interior, ser ligado ao 24 exterior de uma substância que contém o fármaco, ou ser misturado com um fármaco desde que o retinoide incluído no vetor de fármaco esteja pelo menos parcialmente exposto sobre o exterior da preparação antes da mesma atinqir as células estreladas, o mais tardar. Desse modo, dependendo da via de administração ou maneira pela qual o fármaco é libertado, o medicamento pode ser revestido com um material apropriado, como, por exemplo, um revestimento entérico ou um material que se desinteqra ao longo do tempo, ou pode ser incorporado num sistema apropriado de libertação de fármaco. 0 medicamento da presente invenção pode ser administrado por meio de vários tipos de via incluindo as vias oral e parentérica; exemplos destas vias incluem, mas não estão limitadas à via oral, intravenosa, intramuscular, subcutânea, local, retal, intra-arterial, intraportal, intraventricular, transmucosa percutânea, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonar, e intrauterina, e o medicamento pode ser preparado de uma forma apropriada para cada via de administração. Tal forma e método de preparação podem utilizar qualquer forma e método conhecidos como apropriado (por exemplo, "Hyoujun Yakuzaigaku" (Standard Pharmaceutics) , Ed. Y. Watanabe et al.f Nankodo, 2003, etc.).
Exemplos de formas adequadas para a administração oral incluem, mas não estão limitados a pó, grânulo, comprimido, cápsula, líquido, suspensão, emulsão, qel, e xarope, e exemplos de formas adequadas para administração parentérica incluem injeções, tais como solução injetável, suspensão injetável, emulsão injetável, e um tipo de injeção de preparação no local. A formulação para a 25 administração parentérica pode estar na forma de uma solução ou suspensão estéril, isotónica, aquosa, ou não aquosa. 0 medicamento da presente invenção pode ser fornecido em qualquer configuração, mas do ponto de vista da estabilidade em armazenamento, é de preferência fornecido numa configuração que permite a preparação no local, por exemplo, numa configuração que permite que um médico e/ou farmacêutico, uma enfermeira ou outro paramédico prepare-o no local de tratamento ou na sua proximidade. Neste caso, o medicamento da presente invenção é fornecido como um ou mais recipientes que contêm pelo menos um componente essencial para os mesmos, e é preparado antes da utilização, por exemplo, dentro de 24 horas, de p referência dentro de 3 horas, e mais preferencialmente imediatamente antes da utilização. Ao realizar a preparação, um reagente, um solvente, um equipamento de preparação etc., que estão normalmente disponíveis no local de preparação podem ser usados conforme apropriado.
Por conseguinte, a presente invenção inclui um kit de preparação de medicamentos, que contém um ou mais recipientes que contêm um ou mais de um constituinte do vetor de fármaco, um retinoide e um fármaco. 0 kit da presente invenção pode conter, para além daqueles descritos acima, uma bula, etc., na qual é descrito um método de preparação ou um método de administração do vetor de fármaco e o medicamento da presente invenção.
Além disso, o kit da presente invenção pode conter todos os componentes para completar o vetor de fármaco ou o medicamento da presente invenção, mas não precisa necessariamente conter todos os componentes. 0 kit da 26 presente invenção, portanto, não precisa conter um reagente ou um solvente, que normalmente encontram-se disponíveis num local de tratamento médico, uma instalação experimental, etc., tais como, por exemplo, água estéril, solução salina, ou uma solução de glucose. 0 medicamento da presente invenção pode ser utilizado num método para o tratamento de um distúrbio relacionado com as células estreladas, o método incluindo a administração de uma quantidade eficaz do medicamento a um indivíduo com necessidade do mesmo. A quantidade eficaz aqui referida é uma quantidade que suprime o aparecimento do distúrbio alvo, reduz os sintomas do mesmo, ou impede progresso do mesmo, e é de preferência uma quantidade que impede o inicio do distúrbio alvo ou que cura o distúrbio alvo. É também, de preferência numa quantidade que não cause um efeito adverso que exceda o beneficio da administração. Essa quantidade pode ser determinada de forma adequada por um teste in vitro utilizando células de cultura, etc., ou por um teste num modelo animal tal como um murganho, um rato, um cão ou um porco, e tais métodos de teste são bem conhecidos dos especialistas na técnica. A dosagem de um medicamento da presente invenção administrado como aqui descrito depende do tipo de fármaco utilizado ou do tipo de retinoide e, por exemplo, quando um ARNsi para Hsp47 é utilizado como fármaco, o peso do fármaco é, por exemplo, 0,01 até 45 mg/kg/dia, de preferência 0,1 a 30 mg/kg/dia, mais preferencialmente 1 a 20 mg/kg/dia, e mais preferencialmente 4 a 6 mg/kg/dia. Quando a vitamina A é utilizada como retinoide, a vitamina A é tipicamente administrada a uma dosagem de 10 a 20 mg/kg/dia. O retinoide contido no vetor de fármaco e a 27 dosagem do fármaco utilizado no método aqui descrito são conhecidos dos especialistas na técnica, ou são determinados de forma adequada pelo teste acima mencionado, etc.
Uma dosagem especifica de um medicamento da presente invenção como aqui descrito pode ser determinada tendo em consideração várias condições de um individuo que necessita de tratamento, por exemplo, a gravidade dos sintomas, as condições gerais de saúde do individuo, a idade, peso, sexo do individuo, a dieta, o momento e a frequência de administração, um medicamento utilizado em combinação, a capacidade de resposta ao tratamento e, a conformidade com o tratamento, e pode ser diferente da dose tipica acima referida.
No que diz respeito à via de administração, existem várias vias, incluindo as vias oral e parentérica, tais como, por exemplo, as vias oral, intravenosa, intramuscular, subcutânea, local, retal, intra-arterial, intraportal, intraventricular, transmucosa, percutânea, intranasal, intraperitoneal, intrapulmonar e intrauterina. A frequência da administração depende das propriedades do medicamento utilizado e as condições acima mencionadas do individuo e pode ser, por exemplo, uma pluralidade de vezes por dia (isto é, 2, 3, 4, 5 ou mais vezes por dia), uma vez por dia, a cada poucos dias (isto é, a cada 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias, etc.), uma vez por semana, ou uma vez a cada poucas semanas (isto é, uma vez a cada 2, 3 ou 4 semanas etc.). 28
No método aqui descrito, o termo "individuo" significa qualquer individuo vivo, de preferência um animal, mais preferencialmente um mamífero, e ainda mais preferencialmente um indivíduo humano. 0 indivíduo pode ser saudável ou estar afetado com algum distúrbio, e, no caso de tratamento de um distúrbio ser pretendido, o indivíduo geralmente significa um indivíduo afetado com o distúrbio ou em risco de ser afetado.
Além disso, o termo "tratamento" inclui todos os tipos de intervenção profilática e/ou terapêutica medicamente aceitável para a finalidade da cura, remissão temporária, prevenção, etc., de um distúrbio. Por exemplo, quando o distúrbio é a fibrose hepática, o termo "tratamento" inclui a intervenção medicamente aceitável para diversos fins, incluindo atrasar ou parar o desenvolvimento da fibrose, retrocesso ou desaparecimento das lesões, prevenção do aparecimento da fibrose ou prevenção de recidiva. 0 medicamento da presente invenção é também adequado para utilização num método para administrar um fármaco a células estreladas, utilizando o vetor de fármaco. Este método inclui, mas não está limitado a uma etapa de suportar uma substância a ser administrada no vetor de fármaco para produzir o medicamento, e uma etapa de administrar ou adicionar o medicamento com o vetor de fármaco que transporta a substância ou meio a ser administrado a um organismo vivo que contém células estreladas, tal como por exemplo, um meio de cultura. Estas etapas podem ser realizadas, conforme apropriado, de acordo com qualquer método conhecido, o método descrito na presente memória descritiva, etc. Este método de 29 administração pode ser combinado com outro método de administração, por exemplo, um outro método de administração em que um órgão onde estão presentes células estreladas seja o alvo, etc.
Exemplos
Os exemplos a seguir destinam-se a explicar a presente invenção.
Exemplo de Preparação 1 Preparação de ARNsi para gp46
Entre as sequências ótimas para o reconhecimento de ARNsi em atingir uma sequência de base de Hsp47, que é uma chaperona molecular comum para colagénio (tipos I a IV), as sequências A e B foram preparadas de acordo com um programa de desenho de oligo ARNsi por iGENE Therapeutics, Inc. A sequência C foi preparada através de pesquisa na Internet usando o Localizador de Alvo de ARNsi (http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) da
Ambion, Inc. e selecionando 19 sequências de base que se tornariam um alvo para a gp46 de rato (homóloga da Hsp47 humana, número de acesso do GenBank M69246). Ao efetuar o design, tomou-se cuidado em 1) começar em 75 a 100 bases a jusante do codão de iniciação, 2) posicionar o primeiro dimero AA, e 3) assegurar que o conteúdo de GC era de 30% a 70%. Neste exemplo, prepararam-se os ARNsi com as sequências adiante. A: GUUCCACCAUAAGAUGGUAGACAAC (cadeia de ARNsi de direção avançada de 25 bases a começar da 757a na sequência, SEQ ID NO: 1) 30 B: CCACAAGUUUUAUAUCCAAUCUAGC (cadeia de ARNsi de direção avançada de 25 bases a começar da 1626a na sequência, SEQ ID NO: 2) C: GAAACCUGUAGAGGCCGCA (cadeia de ARNsi de direção avançada de 19 bases a começar da 64a na sequência, SEQ ID NO: 3)
Exemplo de Referência 2
Inibição da expressão de gp46 pelo ARNsi preparado Células normais de rim de rato (células NRK), que tinham gp46 de rato e eram fibroblastos produtores de colagénio, foram transfetadas com 0,1 nM para ARNsi 50 nM e cultivadas durante 12 a 48 horas (Fig. 1). A quantidade de expressão de gp4 6 foi verificada pelo método de transferência de Western (Figs. 2 a 4, a banda superior correspondendo a gp46, a banda inferior correspondendo a um controlo de actina). Todos os ARNsi inibiram a expressão da proteina gp46 de forma extraordinária em comparação com um veiculo (Fig. 2) . No ensaio abaixo, foi utilizada a Sequência A do ARNsi, que demonstrou o efeito mais forte. A inibição por ARNsi era dependente da concentração (Fig. 3); a expressão da proteina por gp46 foi inibida em cerca de 90% por de ARNsi 50 nM às 48 horas (Fig. 4) .
Exemplo de Referência 3
Inibição da sintese de colagénio pelo ARNsi preparado A fim de examinar a quantidade de colagénio sintetizado, 3H-prolina foi adicionada ao sobrenadante da cultura de fibroblastos de ratos (células NRK), nas condições acima 31 mencionadas (concentração de ARNsi de 50 nM, tempo de 48 horas) , e após a transfeção, a quantidade de 3H na proteina segregada foi analisada (Fig. 5) . A quantidade de colagénio sintetizado foi calculada a partir da proporção de proteina segregada no sobrenadante para proteina degradada pela colagenase, quando se cultiva fibroblastos transfetados de gp46ARNsi na presença de 3H-prolina de acordo com um relatório de Peterkofsky et ai., (Peterkofsky et ai., Biochemistry. 16 de março, 1971, 10 (6) : 988-94) .
[Equação 1] proporção da síntese de colagénio = colagenase - fração sensível x 100 (5.4 x colagenase - fração insensível + colagenase - fração sensível) A proporção da sintese de colagénio em fibroblastos de ratos diminuiu em cerca de 40% em comparação com um grupo de controlo (Fig. 6).
Exemplo de Referência 4
Transfeção específica de ácido nucleico para células estreladas hepáticas (HSC)
Uma emulsão (VA-Lip-GFP) foi preparada por mistura de plasmídeo de expressão da GFP e VA encapsulada em lipossoma formada por mistura de 10% de VA e lipossoma, e em seguida foi administrada por via intraportal a um rato, o tecido hepático foi recolhido e fixado. A emulsão foi preparada com base na suposição que a quantidade de plasma para um rato de 200 g fosse de cerca de 10 mL, e definindo 32 as concentrações de VA e GFP no sangue portal a 10 μΜ. Especificamente, 25 mg de todo o trans-retinol (VA) foi primeiro dissolvido em 87 pL de DMSO, para dar assim uma solução mãe de 100 mM. 1 pL desta solução mãe de VA foi misturado com 10 pL de lipofectamina e 179 pL de PBS, 10 pg de plasmideo de expressão de GFP foram ainda adicionados a esta para dar um total de 200 pL, e a mistura foi agitada em vórtice durante 3 minutos para dar VA-Lip-GFP. O abdómen de um rato SD foi aberto, e a VA-Lip-GFP foi lentamente injetada numa veia periférica. 48 horas após a injeção, o tecido hepático foi colhido. Uma vez que comparado com outras células hepáticas o filamento intermediário desmina é expresso especificamente nas células estreladas hepáticas (HSC), quando o tecido hepático fixo foi corado com anticorpo marcado com anti-desmina Alexa Fluor 568, e foi examinada uma imagem dupla de fluorescência com GFP, foi confirmado que a GFP foi expressa nas células estreladas hepáticas (HSC) (Fig. 7) . Para os controlos não tratados e um grupo ao qual o vetor plasmideo de expressão da GFP foi administrado sozinho, não foi observada a expressão em células estreladas hepáticas de ratos, mas num grupo ao qual a VA-Lip-GFP foi administrada, a expressão de GFP foi observada especificamente em células estreladas.
Exemplo 5
Análise quantitativa da taxa de transfeção de ácidos nucleicos
Da mesma forma que no Exemplo 4, excepto que gp46ARNsi marcado com FITC foi usado em vez do plasmideo de expressão da GFP, foi preparada uma emulsão (VA-Lip-gp46ARNsi (FITC)) 33 contendo VA encapsulada em lipossomas e gp46ARNsi marcado com FITC, e administrada por via intraportal a um rato SD (10 yg como a quantidade de ARNsi/200 yL) . 48 horas após a administração o tecido hepático foi colhido, aSMA (actina de músculo liso), que, em comparação com outras células hepáticas é expressa especificamente em HSC, foi corada com anticorpo anti-aSMA marcado com Alexa Fluor 568, os núcleos das células foram corados com DAPI, e uma imagem de fluorescência foi examinada por um microscópio confocal de varredura a laser (LSM) . Como mostrado no lado esquerdo da Fig. 8, num grupo em que a VA-Lip-gp4 6ARNsi (FITC) foi administrada, observou-se um grande número de células que emitem fluorescência verde devido a FITC e fluorescência vermelha devido a Alexa Fluor 568, e quando uma análise quantitativa foi realizada pelo NIH Image (o número de células foi contado pela escolha de quaisquer 10 campos de uma fotografia de microscópio de fluorescência X1000), a eficiência de transfeção foi de 77,6% (média de 10 campos). Por outro lado, no grupo ao qual foi administrada a LIP-gp46ARNsi (FITC), não contendo VA, a eficiência de transfeção foi um valor baixo de 14,0% e, além disso, a transfeção em células que não fossem as células estreladas foi observada a 3,0% (lado direita da Fig. 8). Constatou-se a partir dos resultados acima que a eficiência de transfeção em células estreladas é aumentada consideravelmente pela inclusão de VA.
Exemplo 6
Inibição da expressão de gp46 por VA-Lip-gp46ARNsi
No que diz respeito a uma outra secção do tecido colhido no Exemplo 5, gp46 foi corado com Alexa Fluor 568 marcado com 34 o anticorpo anti-Hsp47 e os núcleos das células foram corados com DAPI, e uma imagem de fluorescência foi examinada por um microscópio confocal de varredura a laser. Como mostrado na Fig. 9, observou-se que, num grupo ao qual a VA-Lip-gp46ARNsi foi administrada, a expressão de gp46, que pode ser observado como uma fluorescência vermelha (lado direito na figura), foi drasticamente reduzida em comparação com um grupo de controle ao qual foi administrado ARNsi aleatório VA-Lip contendo ARNsi aleatório, que não era especifico para gp46 (lado esquerdo da figura) . A taxa de inibição da expressão relativa a uma média de 6 campos do grupo de controlo foi de 75%, que era extremamente elevada, quando o número de células gp4 6-negativas foi examinado pela escolha de quaisquer 10 campos de uma fotografia de microscópio de fluorescência X1000 utilizando NIH Image da mesma maneira que no Exemplo 7.
Exemplo 7
Tratamento de LC de rato (administração intraportal 1)
De acordo com um relatório de Jezequel et al. (Jezequel A M et al. , J Hepatol., outubro de 1987, 5(2): 174-81), um modelo de LC de rato foi preparado utilizando dimetilnitrosamina (DMN) (Fig. 10). Especificamente, uma dose de 1 mL/kg de dimetilnitrosamina (DMN) a 1% (administração intraperitoneal) 1 foi administrada a um rato SD (macho) de 5 semanas de idade 3 dias consecutivos por semana. Como já relatado, um aumento em fibra foi observado a partir da segunda semana, e na quarta semana este foi acompanhado pelos resultados de fibrose acentuada, destruição da estrutura do lóbulo hepático, e sendo observada a formação de nódulos regenerativos (Fig. 35 11) . Em seguida, por meio do mesmo método que no Exemplo 4, foi preparada uma emulsão (VA-Lip-gp46ARNsi) formulando gp46ARNsi como um lipossoma e por mistura com 10% de VA, e foi administrada. A administração de VA-Lip-gp46ARNsi foi iniciada na 3a semana, altura em que foi observada fibrose suficiente, e a avaliação foi realizada na 4a e 5a semanas. Uma vez que foi confirmado pelo Exemplo 2 que os efeitos foram observados durante até 48 horas in vitro, a administração foi realizada duas vezes por semana (Fig. 11). A quantidade administrada foi determinada de acordo com um relatório em que ARNsi foi injetado diretamente (McCaffery et ai., Nature., 4 de julho, 2002/ 418 (6893): 38-9), e era de 40 yg como a quantidade total de ARNsi. Da coloração pela técnica de Azan do fígado após a administração de ARNsi, na quarta semana, não houve diferença evidente entre um grupo ao qual foi administrado soro fisiológico, um grupo ao qual ARNsi (aleatório) foi administrado, e um grupo ao qual ARNsi (gp46) foi administrado, mas na quinta semana, observou-se uma diminuição na quantidade de fibras para o grupo ao qual foi administrado gp46ARNsi (Fig. 12) . A fim de analisar quantitativamente a quantidade de fibras, uma porção não corada foi extraída utilizando NIH Image, a sua área foi medida (Fig. 13), e uma redução significativa na área de colagénio foi observada para o grupo ao qual foi administrado gp46ARNsi (Fig. 14) . Além disso, a fim de avaliar o grau de fibrose usando uma outra medida, a quantidade de hidroxiprolina, que é um indicador da fibrose, foi medida quantitativamente por um método padrão. Especificamente, depois de 20 mg de tecido hepático liofilizado ter sido hidrolisado com HC1 durante 24 horas, o líquido da reação foi centrifugado e o sobrenadante foi tratado com um reagente tal como uma 36 solução de Ehrlich e centrifugado. 0 sobrenadante foi recuperado, e a quantidade de hidroxiprolina no tecido hepático foi medida por medição da absorvância a 560 nm (Hepatology, novembro de 1998, vol. 28: 1247-1252) . Como mostrado na Fig. 15, no grupo ao qual foi administrado gp46ARNsi, a quantidade de hidroxiprolina tornou-se muito pequena.
Exemplo 8
Tratamento de LC de rato (administração intraportal 2)
Além disso, a fim de examinar uma alteração na taxa de sobrevivência pela administração do medicamento da presente invenção, em conformidade com um método por Qi Z et al. (Proc Natl Acad Sei EUA, 2 de março, 1999; 96 (5): 2345-9), foi preparado um modelo de LC de rato usando dimetilnitrosamina (DMN) numa quantidade que foi aumentada em 20% sobre o valor normal. Neste modelo, um total de 4 administrações por via intraportal foram realizadas na primeira e segunda semanas. Detalhes da administração foram: PBS, Lip-gp46ARNsi, ARNsi aleatório VA-Lip, e VA-Lip- gp4 6ARNsi (n = 7 para cada grupo) . Após a terceira semana, todos os controlos (o grupo ao qual foi administrado PBS, o grupo ao qual ARNsi aleatório VA-Lip foi administrado, e o grupo a que a Lip-gp46ARNsi tinha sido administrada) estavam mortos, mas 6 de 7 sobreviveram para o grupo ao qual a VA-Lip-gp46ARNsi foi administrada (Fig. 16) . Além disso, na coloração do figado pela técnica de Azan no 21° dia, foi observada uma diminuição evidente na quantidade de fibra para o grupo ao qual foi administrado gp46ARNsi (Fig. 17). 37
Exemplo 9
Tratamento de LC de rato (administração intraportal 3)
Numa outra experiência, a administração por via intraportal foi realizada a partir da 3a semana para modelo de LC de ratos (1% de DMN 1 mg/kg, administrada por via intraperitoneal, 3 vezes por semana), preparada de acordo com o método por Qi Z et al. , e um método por Ueki T et al. (Nat Med., fevereiro de 1999, 5(2): 226-30), como mostrado na tabela abaixo (n = 6 para cada grupo). PBS foi adicionado a cada substância a ser administrada de modo a perfazer um volume total de 200 yL, e a frequência de administração era de uma vez por semana.
[Tabela 1]
Grupo de tratamento Teor da administração Dosagem \—1 1 03 VA VA 200 nmol Csl 1 cr» Lip-gp46ARNsi Lipossoma 100 nmol, gp46ARNsi 20 yg co 1 cr» ARNsi VA-Lip-aleatório VA 200 nmol, lipossoma 100 nmol, ARNsi aleatório 20 yg 9-4 VA-Lip-gp46ARNsi VA 200 nmol, lipossoma 100 nmol, gp46ARNsi 20 yg
Dos resultados obtidos, nos o grupo exceto o grupo ao qual foi administrado o medicamento da presente invenção (grupo de tratamento 9-4) grupos, todos os 6 ratos estavam mortos no 45° dia após começar a administração de DMN, mas no grupo ao qual o medicamento da presente invenção tinha sido administrado, todos os indivíduos exceto um caso, que estava morto no 36° dia, sobreviveram durante mais de 70 dias após a administração inicial de DMN (Fig. 18) . Para 38 os indivíduos mortos, a quantidade de fibras hepáticas foi analisada quantitativamente com base na área de colaqénio da mesma maneira que no Exemplo 7, e o aumento na quantidade de fibras hepáticas foi extraordinariamente inibido pela administração de VA-Lip-qp46ARNsi (Fig. 19).
Exemplo 10
Tratamento de LC de rato (administração intravenosa) A administração intravenosa foi realizada a partir da 3a semana para modelo de LC de ratos (1% de DMN 1 pg/peso corporal (g), por via intraperitoneal 3 vezes por semana) , preparada da mesma maneira que no Exemplo 9, como mostrado na tabela adiante (n = 6 para cada grupo). PBS foi adicionado a cada substância a ser administrada de modo a perfazer um volume total de 200 pL. O período de administração foi até à morte, excepto que foi até a 7a semana para o Grupo 10-4 e a 6a semana para o Grupo 10-10.
[Tabela 2]
Grupo de tratamento Teor da administração Dosagem Frequência da administração 10-1 VA VA 200 nmol 10-2 Lip-gp46ARNsi lipossoma 100 nmol, gp46ARNsi 100 yg 10-3 ARNsi aleatório VA 200 nmol, lipossoma VA-Lip 100 nmol, ARNsi aleatório 100 yg Duas vezes por semana 10-4 VA-Lip-gp46ARNsi VA 200 nmol, lipossoma 100 nmol, gp46ARNsi 100 pg 39 10 - 5 PBS 200 pL 10 - 6 VA VA 200 nmol 10 - 7 VA-Lip VA 200 nmol, lipossoma 100 nmol 10 - 8 Lip-gp46ARNsí lipossoma 100 nmol, gp46ARNsi 150 pg 10 - 9 ARNsi aleatório VA-Lip VA 200 nmol, lipossoma 100 nmol, ARNsi aleatório 150 pg Três vezes por semana 10 - 10 VA-Lip-gp4 6ARNsi VA 200 nmol, lipossoma 100 nmol, gp46ARNsi 150 pg A partir dos resultados, nos grupos exceto os grupos aos quais o medicamento da presente invenção tinha sido administrado (grupos de tratamento, 10-4 e 10-10) todos os 6 ratos estavam mortos no 45° dia após o início da administração de DMN, mas nos grupos em que o medicamento da presente invenção tinha sido administrado, todos os indivíduos, exceto um caso em que dois ratos estavam mortos no 45° dia no grupo de tratamento 10-4, sobreviveram por mais de 70 dias após o início da administração de DMN (Figs. 20 e 21). Para os indivíduos mortos, a quantidade de fibras hepáticas foi analisada quantitativamente, da mesma maneira que no Exemplo 7, e o aumento na quantidade de fibras hepáticas foi extraordinariamente inibida pela administração de VA-Lip-gp46ARNsi (Fig. 22).
Os resultados acima mencionados demonstram que o medicamento da presente invenção é extremamente eficaz para a prevenção e tratamento de fibrose, em que estão envolvidas as células estreladas.
Exemplo 11 40
Melhoria dos resultados por RBP (proteína de ligação ao retinol) A influência da RBP na eficiência de transfeção de VA-Lip-gp46ARNsi foi analisada usando LI90, que é uma linha de células derivadas de células estreladas hepáticas humanas. 100 nM de VA-Lip-gp46ARNsi (FITC) preparados no Exemplo 5, juntamente com várias concentrações (isto é, 0, 0,1, 0,5, 1, 2, 4, ou 10%) de FBS (soro fetal bovino), foram adicionados a LI 90 durante a cultura e incubados durante 48 horas, uma imagem de fluorescência foi observada por LSM, e a quantidade de ARNsi incorporada em células individuais foi analisada quantitativamente por FACS. FBS continha cerca de 0,7 mg/dL de RBP. Como mostrado na Fig. 23, FBS (RBP) deu um aumento dependente da concentração, na quantidade de transfeção de ARNsi. Subsequentemente, 100 nM de VA-Lip-gp46ARNsi (FITC) e 4% de FBS, juntamente com 10 yg (21,476 nmol) de anticorpo anti-RBP, foram adicionados a LI90 durante a cultura, e a eficiência de transfeção de ARNsi foi avaliada da mesma maneira. Como mostrado na Fig. 24, o aumento na quantidade de transfeção pela RBP foi significativamente diminuída pela adição do anticorpo anti-RBP. Os resultados acima mencionados mostram que a RBP é eficaz em melhorar ainda mais a transfeção do medicamento da presente invenção. LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Hokkaido
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<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> RNAsi para gp46 de rato <4 0 0> 2 ccacaaguuu uauauccaau cuagc <210> 3 <211> 19
<212> ARN <213> Artificial <220> <223> RNAsi para gp46 de rato <4 0 0> 3 gaaaccugua gaggccgca
Lisboa, 31 de Outubro de 2013

Claims (10)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Medicamento que compreende um vetor de fármaco que compreende um retinoide como componente, e um fármaco para controlar a atividade ou desenvolvimento de células estreladas, em que o fármaco para controlar da atividade ou desenvolvimento de células estreladas é selecionado de (i) o qrupo que consiste num RNAsi, ribozima, ácido nucleico antisentido, ou polinucleótido quimérico de DNA/ARN, ou um vetor que expressa o mesmo, que visa uma molécula constituinte de matriz extracelular produzida por células estreladas ou uma ou mais moléculas que têm a função de produzir ou seqregar a molécula constituinte de matriz extracelular (ii) o grupo consistindo numa ribozima ou um RNAsi que especificamente inibe o TIMP, e (iii) um inibidor da produção de TIMP que é um ácido nucleico antisentido de TIMP.
2. Medicamento de acordo com a Reivindicação 1, em que o componente retinoide é selecionado de vitamina A, tretinoina, adapaleno, ou palmitato de retinol, e Fenretinida (4-HPR).
3. Medicamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 2, em que o vetor de fármaco está em qualquer uma das formas de micela polimérica, lipossoma, emulsão, microesfera e nanoesfera. 2
4. Medicamento de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, em que a molécula que tem a função de produzir ou segregar a molécula constituinte de matriz extracelular é a HSP47.
5. Medicamento para uso no tratamento de um distúrbio relacionado com células estreladas, que compreende a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o distúrbio é selecionado do grupo que consiste em fibrose, hepatite e pancreatite.
6. Medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 5, em que a fibrose é selecionado do grupo que consiste em fibrose hepática, cirrose hepática, fibrose pancreática, cicatrização das cordas vocais, fibrose da mucosa das cordas vocais e fibrose da laringe.
7. Medicamento para uso de acordo com a Reivindicação 5 ou 6, em que a molécula que tem a função de produzir ou segregar a molécula constituinte de matriz extracelular é a HSP47.
8. Medicamento para uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 5 a 7, em que o componente retinoide é selecionado de vitamina A, tretinoina, adapaleno, ou palmitato de retinol, e Fenretinida (4-HPR).
9. Medicamento para uso de acordo com qualquer uma das Reivindicações 5 a 8, em que o vetor de fármaco está em qualquer uma das formas de micela polimérica, lipossoma, emulsão, microesfera e nanoesfera. 3
10. Kit de preparação para o medicamento de acordo com as reivindicações 5 a 9, o kit compreendendo um ou mais recipientes que contêm um ou mais dos fármacos para controlar a atividade ou o desenvolvimento de células estreladas, de acordo com o especificado na reivindicação 1, um retinoide, e um constituinte de vetor de fármaco que não seja o retinoide. Lisboa, 31 de Outubro de 2013
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