PT1663194E - Utilizaã†o de saha para o tratamento de mesotelioma - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Utilização de SAHA para o tratamento de mesotelioma"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a composições farmacêuticas para utilização em métodos para o tratamento de cancros, por exemplo, mesotelioma. Mais especificamente, a presente invenção diz respeito à utilização de composições farmacêuticas que compreendem a suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) para a preparação de um medicamento para o tratamento de mesotelioma. As formulações orais das composições farmacêuticas apresentam perfis farmacocinéticos favoráveis tais como elevada biodisponibilidade e dão origem surpreendentemente a níveis elevados no sangue dos compostos activos durante um prolongado intervalo de tempo.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

No decurso deste pedido de patente fazem-se referência a diversas publicações através de números árabes entre parêntesis. As citações completas destas publicações podem ser encontradas no final da memória descritiva imediatamente antes das reivindicações. 0 cancro é uma perturbação em que uma população de células se tornou, em vários graus, não responsiva a mecanismos de controlo que normalmente governam a proliferação e a diferenciação. 2 0 mesotelioma é uma forma rara de cancro em que as células malignas (cancerosas) que se encontram no mesotélio, um saco protector que cobre a maior parte dos órgãos internos do corpo. 0 mesotélio é uma membrana que cobre e protege a maior parte dos órgãos internos do corpo. É composta por duas camadas de células: uma camada rodeia imediatamente o órgão; a outra forma um saco em torno do mesmo. 0 mesotélio produz um fluido lubrificante que é libertado entre estas camadas, permitindo o movimento dos órgãos (tais como o batimento do coração e a expansão e contracção dos pulmões) para deslizarem facilmente contra estruturas adjacentes. 0 mesotélio tem nomes diferentes, dependendo da sua localização no corpo. 0 peritoneu é o tecido mesotelial que cobre a maior parte dos órgãos na cavidade abdominal. A pleura é a membrana que rodeia os pulmões e reveste a parede da cavidade do peito. 0 pericárdio cobre e protege o coração. 0 tecido mesotelial que rodeia os órgãos reprodutores masculinos internos é denominado túnica vaginalis testis. A túnica serosa do útero cobre os órgãos reprodutores internos nas mulheres. Na maior parte dos casos, o mesotélio começa na pleura ou peritoneu. Os tumores malignos que proveem do mesotélio pleural encontram-se fortemente ligados à exposição ao amianto.

Muito embora taxas de incidência referidas tenham aumentado nos últimos 20 anos, o mesotelioma é ainda um cancro relativamente raro. Cerca de 2000 novos casos de mesotelioma são diagnosticados nos Estados Unidos da América cada ano. O mesotelioma ocorre mais frequentemente nos homens do que nas mulheres e o risco aumenta com a 3 idade, mas esta doença pode aparecer tanto em homens como em mulheres em qualquer idade. A respiração curta e a dor no peito devidas à acumulação de fluido na pleura são frequentemente sintomas de mesotelioma pleural. Os sintomas de mesotelioma peritoneal incluem perda de peso e dor abdominal e inchaço devido à acumulação de fluido no abdómen. Outros sintomas de mesotelioma peritoneal podem incluir obstrução do intestino, anomalias na coagulação do sangue, anemia e febre. Se o cancro se tiver espalhado para além do mesotélio para outras partes do corpo, os sintomas podem incluir dor, perturbação do acto de engolir ou inchaço do pescoço ou da face. 0 prognóstico do mesotelioma é sombrio ("dismal"), com uma resposta pobre à cirurgia radical, quimioterapia corrente, terapia de radiação e terapia de combinação. 0 espalhamento microscópico de células de cancro na parede do peito e no diafragma são comuns mesmo quando tal espalhamento não pode ser detectado por ensaios de rotina.

Durante muitos anos houve duas estratégias principais para o tratamento quimioterapêutico do cancro: 1) bloqueio da proliferação de células tumorais dependentes da hormona mediante interferência com a produção ou acção periférica de hormonas sexuais; e 2) matar células de cancro directamente por exposição das mesmas a substâncias citotóxicas, as quais danificam tanto as populações de células neoplásticas como normais. A despeito de muitos avanços no campo da oncologia, a maior parte dos tumores sólidos permanece incurável nos 4 estágios avançados. Na maior parte dos casos utiliza-se a terapia citotóxica, contudo, ela provoca frequentemente morbidez significativa no paciente sem beneficio clinico significativo. Agentes mais específicos e menos tóxicos para tratar e controlar estados malignos avançados tornam--se necessários.

Uma abordagem alternativa para a quimioterapia do cancro é a indução da diferenciação terminal das células neoplásticas (1). Em modelos de cultura de células a diferenciação tem sido reportada por exposição de células a uma variedade de estímulos, incluindo: AMP cíclico e ácido retinóico (2,3), aclarubicina e outras antraciclinas (4).

Existe evidência abundante de que a transformação neoplástica não destrói necessariamente o potencial das células cancerosas para se diferenciarem (1,5,6). Existem muitos exemplos de células de tumor que não respondem aos reguladores normais da proliferação e parecem encontrar-se bloqueadas na expressão do seu programa de diferenciação e ainda podem ser induzidas para diferenciar e interromper a replicação. Uma variedade de agentes, incluindo alguns compostos polares relativamente simples (5,7-9), derivados de vitamina D e ácido retinóico (10-12), hormonas esteróides (13), factores de crescimento (6,14), protéases (15,16), promotores de tumor (17,18) e inibidores da síntese do ADN ou do ARN (4,19-24), podem induzir diversas linhas de células transformadas e explantes de tumor primários humanos para exprimirem características mais diferenciadas.

Estudos precoces identificaram uma série de compostos polares que eram indutores eficazes da diferenciação num 5 número de linhas de células transformadas (8,9). Destes, o indutor mais eficaz era o composto híbrido polar/apolar N,Ν'-hexametileno bisacetamida (HMBA) (9). 0 uso deste composto polar/apolar para induzir células de eritroleucemia murina (MELC) para sofrerem diferenciação eritróide com supressão de oncogenicidade provou ser um modelo útil para estudar a diferenciação intermediária de células transformadas (5,7-9). A diferenciação eritróide terminal de MELC induzida por HMBA é um processo de fases múltiplas. Por adição de HMBA a MELC (745A-DS19) em cultura, existe um período de latência compreendido entre 10 e 12 horas antes do compromisso para se detectar a diferenciação terminal. O compromisso é definido como sendo a capacidade que as células têm para exprimir diferenciação terminal a despeito da remoção do indutor (25). Por exposição continuada a HMBA existe um recrutamento progressivo de células para as diferenciar. Os presentes inventores referiram que as linhas de células MELC tornadas resistentes para níveis relativamente baixos de vincristina tornaram-se acentuadamente mais sensíveis à acção indutora de HMBA e podem ser induzidas para se diferenciarem com pouco ou nenhum período de latência (26). A HMBA é susceptível de induzir alterações fenotípicas consistentes com a diferenciação numa ampla variedade de linhas de células (5). As características do efeito induzido pelo fármaco têm sido estudadas mais extensivamente no sistema de células eritroleucemia murina (MELC) (5,25,27,28). A indução por MELC de diferenciação é quer dependente do tempo quer da concentração. A concentração mínima requerida para demonstrar um efeito in vitro na maior parte das estirpes encontra-se compreendida entre 2 e 3 mM; a duração mínima de exposição contínua de 6 um maneira geral requerida para induzir a diferenciação numa porção substancial (>20%) da população sem continuação da exposição ao fármaco é igual a cerca de 36 horas. 0 alvo primário da acção de HMBA não é conhecido. Há provas de que a proteina quinase C se encontra envolvida no caminho de diferenciação mediada pelo indutor (29) . Os estudos in vitro proporcionaram uma base para a avaliação do potencial de HMBA como agente de citodiferenciação no tratamento de cancros humanos (30). Foram completadas diversas experiências clinicas de fase I com HMBA (31-36). As experiências clinicas demonstraram que este composto pode induzir uma resposta terapêutica em pacientes com cancro (35,36). No entanto, estas experiências clinicas de fase I demonstraram igualmente que a eficácia potencial da HMBA é limitada, em parte, pela toxicidade relacionada com a dose que impede alcançar niveis óptimos do sangue e pela necessidade de administração intravenosa de grandes quantidades do agente, durante intervalos de tempo prolongados.

Referiu-se que o número de compostos relacionados com a HMBA com um grupo de polares separados por ligações apoiares que, numa base molar, são tão activos (37) ou 100 vezes mais activos do que HMBA (38) . Como uma classe, no entanto, verificou-se que os dimeros simétricos tais como HMBA e compostos afins não são melhores agentes de citodiferenciação.

Verificou-se inesperadamente que os melhores compostos compreendem dois grupos terminais polares separados por uma cadeia flexível de grupos metileno, em que um ou ambos os grupo(s) terminal (ais) polar (es) é(são) um grupo 7 hidrofóbico grande. De preferência, os grupos terminais polares são diferentes e apenas um é um grupo hidrofóbico grande. Estes compostos são inesperadamente mil vezes mais activos do que a HMBA e dez vezes mais activos do que os compostos afins de HMBA. 0 inibidores de histona desacetilase tais como suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA), pertencem a esta classe de agentes que têm a capacidade para induzir a interrupção do crescimento das células de tumor, a diferenciação, e/ou apoptose (39). Estes compostos são orientados num sentido de mecanismos inerentes à capacidade de uma célula neoplástica se tornar maligna, uma vez que eles não parecem ter toxicidade em doses eficazes para a inibição do crescimento do tumor em animais (40). Há várias linhas de evidência que a acetilação e a desacetilação da histona constitui mecanismos através dos quais se consegue a regulação de transcrição em uma célula (41). Julga-se que estes efeitos ocorrem através de alterações na estrutura da cromatina por alteração da afinidade das proteínas da histona para o ADN em hélice no nucleossoma. Há cinco tipos de histonas que foram identificados (designados Hl, H2A, H2B, H3 e H4) . As histonas H2A, H2B, H3 e H4 encontram-se nos nucleossomas e Hl é um ligador localizado entre nucleossomas. Cada nucleossoma contém dois de cada tipo de histona dentro do seu núcleo, excepto para Hl, que se encontra presente de maneira individual na porção exterior da estrutura do nucleossoma. Julga-se que quando as proteínas da histona são hipoacetiladas, há uma afinidade maior da histona para a estrutura do fosfato de ADN. Esta afinidade faz com que o ADN se ligue apertadamente há histona e torne o ADN inacessível aos elementos reguladores de transcrição e há maquinaria. A regulação dos estados acetilados ocorre através do equilíbrio de actividade entre dois complexos enzimáticos, histona acetil transferase (HAT) e histona desacetilase (HDAC). Julga-se que o estado hipoacetilado se destina a inibir a transcrição de ADN associado. Este estado hipoacetilado é catalisado por complexos grandes de multiproteínas que incluem enzimas de HDAC. Em particular, HDAC tem mostrado catalisar a remoção dos grupos acetilo a partir das histonas de grupo de cromatina.

Julga-se que a inibição de HDAC por SAHA ocorre através da interacção directa com o sítio catalítica da enzima conforme demonstrado por estudos de cromatografia de raio X (42) . Julga-se que o resultado da inibição de HDAC tem um efeito generalizado sobre o genoma, mas pelo contrário, afecta apenas um pequeno subconjunto do genoma (43) . A evidência proporcionada por microrredes de ADN utilizando linhas de células malignas cultivadas com um inibidor HDAC mostra que há um número finito (1-2%) de genes cujos produtos são alterados. Por exemplo, as células tratadas em cultura com inibidores HDAC mostram uma indução consistente do inibidor quinase dependente de ciclina p21 (44) . Esta proteína desempenha um papel importante na interrupção do ciclo das células. Julga-se que os inibidores HDAC aumentam a velocidade de transcrição de p21 pela propagação do estado hiperacetilado das histonas na região do gene p21, tornando deste modo o gene acessível à maquinaria de transcrição. Os genes cuja expressão não é afectada pelos inibidores HDAC não apresentam alterações na acetilação de histonas associadas regionais (45). 9

Mostrou-se em vários casos que a interrupção da actividade de HAT ou HDAC se encontra implicada no desenvolvimento de um fenótipo maligno. Por exemplo, na leucemia promielocítica aguda, a oncoproteína produzida pela fusão de PML e RAR alfa parece suprimir a transcrição do gene especifico através do recrutamento de HDACs (46) . Deste modo, a célula neoplástica não consegue completar a diferenciação e conduz a proliferação em excesso da linha de células leucémicas.

As patentes de invenção norte-americanas n°s 5 369 108, 5 932 616, 5 700 811, 6 087 367 e 6 511 990, concedidas a alguns dos presentes inventores, descrevem compostos úteis para a indução selectiva da diferenciação terminal de células neoplásticas, compostos esses que têm dois grupos terminais polares separados por uma cadeia flexível de grupos metileno ou por um grupo rígido fenilo, em que um ou ambos os grupos terminais polares são um grupo hidrofóbico grande. Alguns dos compostos têm um grupo hidrofóbico grande adicional da mesma extremidade da molécula que o primeiro grupo hidrofóbico o qual aumenta ainda a actividade de diferenciação cerca de 100 vezes num ensaio enzimático e cerca de 50 vezes num ensaio de diferenciação das células. Processos para sintetizar os compostos utilizados nos métodos e nas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção encontram--se completamente descritos nas patentes citadas anteriormente.

Além da sua actividade biológica como agentes antitumor, os compostos descritos nas patentes de invenção citadas anteriormente foram recentemente identificados como úteis para o tratamento ou a prevenção de uma ampla 10 variedade de doenças e condições mediadas pela tioredoxina (TRX), tais como doenças inflamatórias, doenças alérgicas, doenças auto-imunes, doenças associadas com stress oxidativo de doenças caracterizadas por hiperproliferação celular (pedido de patente de invenção norte-americana n.° 10/369094, depositado em 15 de Fevereiro de 2003. Além disso, estes compostos foram identificados como sendo úteis para o tratamento de doenças do sistema nervoso central (SNC) tais como doenças neurodegenerativas e para o tratamento do cancro do cérebro (Veja-se, o pedido de patente de invenção norte-americana N.° 10.2073401, depositado em 16 de Outubro de 2002) .

As patentes de invenção mencionadas anteriormente não descrevem formulações orais especificas dos inibidores HDAC ou dosagens especificas e esquemas de dosagem dos compostos citados que são eficazes para o tratamento do cancro, por exemplo, o mesotelioma. De maneira importante, as patentes de invenção mencionadas anteriormente não descrevem formulações orais que possuem perfis farmacocinéticos favoráveis tais como biodisponibilidade elevada que dá origem a niveis elevados no sangue dos compostos activos durante um intervalo de tempo prolongado. Há uma necessidade urgente de obter dosagens apropriadas e escalas de dosagem destes compostos, e de desenvolver formulações, de preferência formulações orais, que dêem origem a niveis no sangue terapeuticamente eficazes e estáveis dos compostos activos durante um intervalo de tempo prolongado, e que sejam eficazes para tratamento de um cancro. 11

Kelly W. et al., Eur. J. Canc., vol 38, 2003 abstr. 2321 referem uma experiência clinica de fase 1 de uma formulação oral de SAHA.

Heaney M. et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22, 2003, abstr. 2321 descrevem as experiências clinicas com SAHA em pacientes fortemente pré-tratados com malignidades hematológicas.

Kelly W. K. et al., Exp. Op. Invest. Drugs, vol. 11, n.° 12, 2002, pág. 1695-1713, referem inibidores de histona desacetilase e a sua utilização em ensaios clínicos.

Cao X.X. et al., Am J. Resp. Cell Mol. Biol., vol. 25, n.° 5, 2001, pág. 562-568 descrevem um inibidor de histona desacetilase que provoca a regulação para baixo da expressão do gene bcl-xl e a morte apoptótica da célula em mesotelioma.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção respeito à utilização da suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) representada pela estrutura:

ou a um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, e um veículo ou diluente aceitável em farmácia, para a preparação de um medicamento oral para administração a um indivíduo para o tratamento de cancros, por exemplo, o mesotelioma. Mais especificamente, a 12 presente invenção diz respeito a métodos de tratamento do mesotelioma mediante administração de uma composição farmacêutica que compreende inibidores HDAC, por exemplo, suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA).

As formulações orais das composições farmacêuticas possuem perfis farmacocinéticos favoráveis tais como elevada biodisponibilidade e dão origem com surpresa a niveis elevados no sangue dos compostos activos durante um intervalo de tempo prolongado. A presente invenção proporciona ainda um regime de dosagem diário seguro, destas composições farmacêuticas, as quais são fáceis de seguir, e que resultam numa quantidade terapeuticamente eficaz dos inibidores HDAC in vivo. A presente invenção proporciona um método de tratamento do mesotelioma num individuo com a necessidade de um tal tratamento, mediante administração ao individuo de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, conforme se descreve na presente memória descritiva. A SAHA pode ser administrada numa dose diária total de até 800 mg, de preferência por via oral, uma vez, duas vezes, ou três vezes ao dia, continuamente (todos os dias) ou intermitentemente (por exemplo, 3-5 dias por semana). A SAHA oral tem sido administrada com segurança em estudos clinicos de fase I a pacientes que sofrem de mesotelioma ou DLBL. 13

Além disso, a presente invenção proporciona a utilização de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC conforme descrito na presente memória descritiva, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, para a preparação de um medicamento para administração a um indivíduo com a necessidade de um tal tratamento para 0 tratamento de mesotelioma. 0 inibidor HDAC pode ser administrado por uma dose diária total até 800 mg, de preferência por via oral, uma vez, duas vezes ou três vezes por dia, de maneira continua (isto é, todos os dias) ou de maneira intermitente (por exemplo, 3-5 dias por semana).

Os inibidores de HDAC são úteis para o tratamento do mesotelioma.

Os inibidores de HDAC apropriados para utilização na presente invenção incluem mas sem ficarem limitados a estes derivados do ácido hidroxâmico, Ácidos Gordos de Cadeia Curta (SCFAs), tetrapéptidos ciclicos, derivados da benzamida, ou derivados de cetona electrofilicos, conforme descrito na presente memória descritiva. Exemplos de inibidores HDAC apropriados para utilização nos métodos da presente invenção são: A) Derivados do ácido hidroxâmico escolhidos de entre bis--hidroxamida do ácido m-carboxicinâmico (CBHA), Tricostatina A (TSA), Tricostatina C, Ácido Salicil-hidroxâmico, Ácido Azelaico Bis-hidroxâmico (ABHA), Azelaico-l-Hidroxamato-9-Anilida (AAHA), 6-(3-Clorofenil-ureído), Ácido capróico Hidroxâmico (3C1-UCHA), Oxamflatina, A-161906, Escriptaide, PXD-101, LAQ-824, CHAP, MW2796 e MW2996. 14

Inibidores HDAC específicos incluem, por exemplo:

Suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA), que é representada pela fórmula estrutural seguinte:

Piroxamida, que é representada pela fórmula estrutural seguinte:

Bishidroxamida do ácido m-carboxicinâmico (CBHA), que é representada pela fórmula estrutural seguinte:

As composições farmacêuticas que compreendem o inibidor HDAC são administradas por via oral, por exemplo incluídas numa cápsula de gelatina. De acordo com uma outra forma de realização, as composições farmacêuticas encontram-se ainda compreendidas em celulose microcristalina, croscarmelose de sódio e estearato de magnésio.

Os inibidores HDAC podem ser administrados em uma dose diária total que pode variar de paciente para paciente, e que pode ser administrada em escalas de dosagem variadas. As dosagens apropriadas são uma dosagem diária total 15 compreendida entre cerca de 25-4000 mg/m2 administrada por via oral uma vez ao dia, duas vezes ao dia ou três vezes ao dia, de maneira continua (todos os dias) ou intermitente (por exemplo, 3-5 dias por semana) . Além disso, as composições podem ser administradas em ciclos, com períodos de repouso entre os ciclos (por exemplo, tratamento durante duas a oito semanas com um período de repouso de até uma semana entre tratamentos).

De preferência, administra-se a composição uma vez ao dia numa dose de cerca de 200-600 mg. De preferência, administra-se a composição duas vezes ao dia numa dose de cerca de 200-400 mg. De preferência, administra-se a composição duas vezes ao dia numa dose de cerca de 200-400 mg de maneira intermitente, por exemplo três, quatro ou cinco dias por semana. De preferência, administra-se a composição três vezes ao dia para uma dose de cerca de 100--2 5 0 mg.

De preferência, a dose diária é igual a 200 mg, a qual pode ser administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia, ou três vezes ao dia. De acordo com uma forma de realização, a dose diária é igual a 300 mg, a qual pode ser administrada uma vez ao dia ou duas vezes ao dia. De preferência, a dose diária é igual a 400 mg, a qual pode ser administrada uma vez ao dia ou duas vezes ao dia.

Também se descrevem na presente memória descritiva métodos para induzir de maneira selectiva a diferenciação terminal, a interrupção do crescimento das células e/ou a apoptose de células neoplásticas, por exemplo, células de linfoma num indivíduo, inibindo deste modo a proliferação de tais células no referido indivíduo, mediante 16 administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC, por exemplo SAHA, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, e um veículo ou diluente aceitável em farmácia. Uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC na presente invenção pode ser de até uma dose total diária de 800 mg.

Descrevem-se também na presente memória descritiva métodos para inibir a actividade de uma histona desacetilase num indivíduo, mediante administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC, por exemplo, SAHA, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, e um veículo ou diluente aceitável em farmácia. Uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC pode ser de até uma dose diária total de 800 mg.

Descrevem-se também na presente memória descritiva métodos in vitro para induzir de maneira selectiva a diferenciação terminal, a interrupção do crescimento das células e/ou a apoptose de células neoplásticas, por exemplo, células linfoma, inibindo deste modo a proliferação das células, pelo contacto das células com uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC, por exemplo, SAHA, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Também se descrevem na presente memória descritiva métodos in vitro para a inibição da actividade de uma histona desacetilase, pela histona desacetilase com uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC, por exemplo, SAHA, 17 ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Também se descreve na presente memória descritiva um regime de dosagem diário seguro da formulação de composições farmacêuticas que compreendem um inibidor HDAC que é fácil de seguir e de aderir. Estas composições farmacêuticas são apropriadas para a administração oral e são úteis para o tratamento do cancro, por exemplo, o mesotelioma, mediante indução selectiva da diferenciação terminal, da interrupção do crescimento das células, e/ou da apoptose de células neoplásticas, e/ou mediante inibição de histona desacetilase (HDAC).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS 0 que precede e outros objectos, caracteristicas e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da descrição seguinte mais particular de forma de realização preferida da invenção, conforme ilustrado nos desenhos anexos nos quais caracteristica de referência iguais referem-se às mesmas partes no decurso das diferentes vistas. Os desenhos não são necessariamente à escala, pondo ênfase pelo contrário da ilustração dos princípios da invenção. A figura 1 é uma fotografia de uma mancha de Western (painel superior) que mostra as quantidades de histona 4 acetilada (a-AcH4) no plasma sanguíneo de pacientes após uma dose oral ou intravenosa (IV) de SAHA. Administra-se a SAHA IV a 200 mg com infusão durante duas horas. Administra-se a SAHA oral uma cápsula individual de 200 mg. 18 A quantidade de a-AcH4 encontra-se ilustrada nos pontos de tempo indicados.

Painel de fundo: Corante azul de Coomassie. A figura 2 é uma fotografia de uma mancha de Western (painéis superiores) que mostra as quantidades de histona 4 acetilada (a-AcH4) no plasma sanguíneo de pacientes com um tumor sólido, após uma dose oral ou intravenosa (IV) de SAHA. Em SAHA IV e Oral foram administradas tal como indicado na figura 1. A quantidade de a-AcH4 é apresentada nos pontos de tempo indicados. A experiência é indicada em duplicado (Fig. 2A e Fig. 2B) . Painéis de fundo: Corante azul de Coomassie. A figura 3 é uma fotografia de uma mancha de Western (painéis superiores) que mostra as quantidades de histona 4 acetilada (a-AcH4) (figura 3A) e histona 3 acetilada (a-AcH3) (figuras 3B-E) no plasma sanguíneo de pacientes após uma dose oral ou intravenosa IV de SAHA, no dia 1 e no dia 21. A SAHA IV e Oral foram administradas tal como indicado na figura 1. A quantidade de a-AcH4 ou a-AcH3 encontra-se representada nos pontos de tempo indicados. Painéis de fundo: Corante azul de Coomassie. A figura 4 é uma fotografia de uma mancha de Western (painéis superiores) que mostra as quantidades de histona 3 acetilada (a-AcH3) no plasma sanguíneo de pacientes com um tumor sólido, após uma dose oral ou intravenosa (IV) de SAHA. A SAHA IV e Oral foram administradas tal como se ilustra na figura 1. A quantidade de a-AcH3 encontra-se 19 representada nos pontos de tempo indicados. Painel de fundo: Corante azul de Coomassie. A figura 5 é uma fotografia de uma mancha de Western (painéis superiores) que mostra as quantidades de histona 3 acetilada (a-AcH3) no plasma sanguineo de pacientes após uma dose oral ou intravenosa (IV) de SAHA. Administrou-se SAHA IV para 400 mg e fundido no decurso de duas horas. Administrou-se a SAHA oral numa cápsula individual de 400 mg. A quantidade da a-AcH4 encontra-se representada nos pontos de tempo indicados. A experiência encontra-se representada em triplicado (Fig. 5A e B). Painéis de fundo: Corante azul de Coomassie. A figura 6 é uma fotografia de uma mancha de Western (painel superior) que mostra as quantidades de histona 3 acetilada (a-AcH3) no plasma sanguineo de pacientes com um tumor sólido, após uma dose oral ou intravenosa (IV) de SAHA. Administrou-se SAHA IV e Oral tal como se ilustrou na figura 5. A quantidade de a-AcH3 é representada nos pontos de tempo indicados. Painel de fundo: Corante azul de Coomassie. A figura 7 é uma fotografia de uma mancha de Western (painéis superiores) que mostra as quantidades de histona 3 acetilada (a-AcH3) no plasma sanguineo de pacientes com um tumor sólido após uma dose oral ou intravenosa (IV) de SAHA, no dia 1 e no dia 21. Administrou-se SAHA IV e Oral tal como indicado na figura 4. A quantidade de a-AcH4 ou a-AcH3 encontra-se representada nos pontos de tempo indicados. A experiência é representada em triplicado (Fig. 7A-C). Painéis de fundo: Corante azul de Coomassie. 20

A figura 8 é uma fotografia de uma mancha de Western (painéis superiores) que mostra as quantidades de histona 3 acetilada (a-AcH3) no plasma sanguíneo de pacientes após uma dose oral ou intravenosa (IV) de SAHA. Administraram-se SAHA IV e Oral tal como se indicou na figura 5. A quantidade de a-AcH3 é representada nos pontos de tempo indicados. Painéis de fundo: Corante azul de Coomassie.

As figuras 9A-C são gráficos que mostram a concentração média no plasma de SAHA (ng/ml) nos pontos de tempo indicados após a administração. A figura 9A: dose oral (200 mg e 400 mg) sob jejum no dia 8. A figura 9B: dose oral (200 mg e 400 mg) com alimento no dia 9. A figura 9C: dose IV no dia 1. A figura 10 mostra a semi-vida aparente de uma dose oral de 200 mg e 400 mg de SAHA, nos dias 8, 9 e 22. A figura 11 mostra a AUC (ng/ml/hr) de uma dose oral de 200 mg e 400 mg de SAHA, nos dias 8, 9 e 22. A figura 12 mostra a biodisponibilidade de SAHA após uma dose oral de 200 mg e 400 mg, nos dias 8, 9 e 22. A figura 13 é uma exploração por Tomografia

Computadorizada ("Scan CT") de um tumor de mesotelioma de um doente, antes (esquerda) e após (direita) seis meses de tratamento com SAHA para uma dose de 300 mg duas vezes ao dia 3 dias por semana. A figura 14 é uma exploração por Tomografia

Computadorizada ("Scan CT") realizada a partir de um paciente com um linfoma de células grandes difusas, antes 21 de tratamento (A) e após (B) 2 meses de tratamento com SAHA para uma dose de 400 mg BID durante 1 mês seguida por 400 mg QD durante um mês. A figura 15 é uma exploração por Tomografia Computadorizada ("scan PET") realizada a partir de um doente com um linfoma de células grandes difusas, antes do tratamento (A) e após (B) 2 meses de tratamento com SAHA para uma dose de 400 mg BID durante 1 mês seguida por 400 mg QD durante um mês. A figura 16 é uma exploração por Tomografia Computadorizada ("scan CT") realizada a partir de um doente com um linfoma de células grandes difusas, antes do tratamento (A) e após (B) 1 mês de tratamento com SAHA para uma dose de 600 mg QD. A figura 17 é uma exploração por Tomografia de emissão de positrões ("scan PET") realizada a partir de um doente com um linfoma de células grandes difusas, antes do tratamento (A) e após (B) 2 meses de tratamento com SAHA para uma dose de 200 mg BID.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a composições farmacêuticas para utilização em métodos de tratamento de cancros, por exemplo, o mesotelioma. Mais especificamente, a presente invenção diz respeito à utilização de composições farmacêuticas que compreendem inibidores HDAC, por exemplo, suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) para a preparação de um medicamento para o tratamento do mesotelioma. Em aspectos específicos, as composições de 22 acordo com a presente invenção são utilizadas para o tratamento do mesotelioma.

As formulações orais das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção possuem perfis farmacocinéticos favoráveis tais como elevada biodisponibilidade e, surpreendentemente, dão origem a niveis elevados no sangue dos compostos activos durante um intervalo de tempo prolongado. Deste modo, a presente invenção proporciona ainda um regime de dosagem diário seguro destas composições farmacêuticas, que é fácil de seguir, e o qual resulta numa quantidade terapeuticamente eficaz dos inibidores HDAC in vivo.

Por consequência, a presente invenção proporciona um método de tratamento do mesotelioma num indivíduo com necessidade de um tal tratamento, mediante administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC conforme descrito na presente memória descritiva, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 0 inibidor HDAC pode ser administrado em uma dose diária total de até 800 mg, de preferência por via oral, uma vez, duas vezes ou três vezes ao dia, de maneira continua (isto é, todos os dias) ou intermitente (por exemplo, 3-5 dias por semana). O inibidor HDAC é a suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA). A presente invenção proporciona um método de tratamento do mesotelioma num indivíduo com necessidade de um tal tratamento, mediante administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade 23 eficaz de suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) ou de um sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, conforme se descreve na presente memória descritiva. Pode administrar-se a SAHA uma dose diária total de até 800 mg, de preferência por via oral, uma vez, duas vezes ou três vezes ao dia, de maneira continua (todos os dias) ou intermitente (por exemplo, 3-5 dias por semana). A SAHA é representada pela estrutura seguinte:

O termo "tratamento" nas suas diversas formas gramaticais em relação com a presente invenção refere-se à prevenção (isto é, quimioprevenção) , cura, inversão, atenuação, alivio, minimização, supressão ou paragem dos efeitos deletérios de um estádio de doença, progressão de uma doença, agente causador de uma doença (por exemplo, bactérias ou vírus) ou outra condição anormal. Por exemplo, o tratamento pode envolver o alivio de um sintoma (isto é, não necessariamente todos os sintomas) de uma doença ou a atenuação da progressão de uma doença. Visto que alguns dos métodos inventivos envolvem a remoção fisica do agente etiológico, o perito na matéria reconhecerá que são igualmente eficazes em situações em que o composto inventivo é administrado antes de, ou simultaneamente com, a exposição ao agente etiológico (tratamento profiláctico) e situações em que os compostos inventivos são administrados após (mesmo bastante depois) a exposição ao agente etiológico. O tratamento do cancro, tal como utilizado na presente memória descritiva, refere-se à inibição parcial, ou total, 24 ao atraso ou à prevenção da progressão no cancro incluindo metástases de cancro; inibição, atraso ou prevenção da recorrência de cancro incluindo metástases cancerosas; ou a prevenção do inicio ou desenvolvimento do cancro (quimioprevenção) num mamífero, por exemplo um ser humano.

Tal como utilizada na presente memória descritiva, a expressão "quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico" destina-se a englobar qualquer quantidade que consiga a resposta biológica desejada. Na presente invenção, a resposta biológica desejada é a inibição parcial ou total, o atraso, ou a prevenção da progressão do cancro incluindo metástases cancerosas; inibição, atraso ou prevenção da recorrência do cancro incluindo metástases cancerosas; ou a prevenção do início ou desenvolvimento do cancro (quimioprevenção) num mamífero, por exemplo um ser humano. 0 método de acordo com a presente invenção destina-se ao tratamento ou quimioprevenção de paciente humanos com cancro. No entanto, é também provável que o método seja eficaz no tratamento do cancro noutros mamíferos.

Histona Desacetilases e inibidores e Histona Desacetilase

As Histona desacetilases (HDACs) tal como essa expressão é utilizada na presente memória, são enzimas que catalisam a remoção dos grupos acetilo dos restos lisina nas caudas amino terminais de histonas nucleares que formam o nucleossoma. Como tal, as HDACs conjuntamente com as histona acetil transferases (HATs) regulam o estado de acetilação das histonas. A acetilação da histona afecta a expressão do gene e os inibidores de HDACs, tais como o 25 composto híbrido polar suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) com base no ácido hidroxâmico induzem a interrupção do crescimento, a diferenciação e/ou a apoptose de células transformadas in vitro e inibem o crescimento do tumor in vivo. Pode dividir-se as HDACs em três classes com base na sua homologia estrutural. A classe I HDACs (HDACs 1, 2, 3 e 8) comporta semelhanças com a proteína de levedura RPD3, são localizadas no núcleo e encontram-se em complexos associados com os co-repressores transcricionais. A classe II HDACs (HDACs 4, 5, 6, 7 e 9) são semelhantes à proteínas de levedura HDA1 e tem simultaneamente localização subcelular nuclear e citoplasmática. Tanto os HDACs de classe I e classe II são inibidos por inibidores de HDAC com base em ácido hidroxâmico, tais como SAHA. Os HDACs de classe III formam uma classe estruturalmente distante de enzimas dependentes NAD que são relacionadas com as proteínas de levedura SIR2 e não são inibidas pelos inibidores HDAC à base de ácido hidroxâmico.

Os inibidores da histona desacetilase ou HDAC, tal como é o termo utilizado na presente memória descritiva, são compostos susceptíveis de inibir a desacetilação de histonas in vivo, in vitro ou ambas. Como tais, os inibidores de HDAC inibem a actividade de pelo menos uma histona desacetilase. Como resultado da inibição da desacetilação de pelo menos uma histona, ocorre um aumento na histona acetilada e a acumulação de histona acetilada num marcador biológico apropriado para determinar a actividade nos inibidores de HDAC. Por consequência, os processos que podem determinar a acumulação de histonas acetiladas podem ser utilizados para determinar a actividade inibidora de HDAC dos compostos de interesse. Deve entender-se que os compostos que podem inibir a 26 actividade de histona desacetilase podem também ligar a outros substratos e como tal podem inibir outras moléculas biologicamente activas tais como enzimas. Deve também entender-se que os compostos de acordo com a presente invenção são susceptíveis de inibir quaisquer das histonas desacetilases indicadas anteriormente, ou quaisquer outras histonas desacetilases.

Por exemplo, em pacientes que recebem inibidores HDAC, a acumulação de histonas acetiladas em células mononucleares periféricas bem como no tecido tratado com inibidores HDAC pode ser determinada contra um controlo apropriado. A actividade inibidora de HDAC de um composto particular pode ser determinada in vitro utilizando, por exemplo, um ensaio enzimático que mostra a inibição de pelo menos uma histona desacetilase. Além disso, a determinação da acumulação de histonas acetiladas em células tratadas com uma composição particular pode ser determinativa da actividade inibidora de HDAC de um composto.

Os ensaios para acumulação de histonas acetiladas são bem conhecidos na literatura. Veja-se, por exemplo, Marks, P.A. et al., J. Natl. Câncer Inst., 92:1210-1215, 2000, Butler, L.M. et al., Câncer Res. 60:5165-5170 (2000),

Richon, V. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 95:3003-3008, 1998, e Yoshida, M. et al., J. Biol. Chem., 265:17174-17179, 1990.

Por exemplo, um ensaio enzimático para determinar a actividade de um composto inibidor HDAC pode ser conduzido como segue. Resumidamente, o efeito de um composto inibidor 27 HDAC sobre a afinidade de um epitope humano purificado-alvo (Flag) HDAClpode ser determinada mediante incubação da preparação enzima na ausência de substrato sobre gelo durante cerca de 20 minutos com a quantidade indicada de composto inibidor. Pode adicionar-se o substrato (histona derivada de células eritroleucemia murina marcada com [3H]acetilo) e pode incubar-se a amostra durante 20 minutos à temperatura de 37°C num volume total de 30 μΐι. Pode então interromper-se a reacção e pode extrair-se o acetato libertado e determinar-se a quantidade de radioactividade libertada mediante contagem de cintilação. Um ensaio alternativo útil para a determinação da actividade de um composto inibidor HDAC é o "HDAC Fluorescent Activity Assay; Drug Discovery Kit-AK-500" disponível a partir de BIOMOL® Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA.

Podem conduzir-se estudos in vivo como segue. Animais, por exemplo, murganhos, podem ser injectados por via intraperitoneal com um composto inibidor HDAC. Pode isolar--se os tecidos seleccionados, por exemplo, cérebro, baço, fígado, etc., a intervalos de tempo predeterminados, post administração. Podem isolar-se as histonas a partir de tecidos essencialmente conforme descritos por Yoshida et al., J. Biol. Chem. 265:17174-17179, 1990. Pode submeter-se a electroforese quantidades iguais de histonas (cerca de 1 μρ) sobre geles de poliacrilamida-SDS a 15% e pode então transferir-se para filtros Hybond-P (disponíveis a partir de Amersham). Podem bloquear-se os filtros com leite a 3% e podem ser sondados com um anticorpo H4 anti-acetilado com histona policlonal purificado de coelho (a-Ac-H4) e anticorpo H3 anti-acetilado com histona (a-Ac-H3) (Upstate Biotechnology, Inc.). Podem visualizar-se níveis de histona acetilada utilizando um anticorpo conjugado de cabra anti- 28 coelho peroxídase de rábano-bastardo (1:5000) e o substrato quemiluminescente SuperSignal (Pierce). Como carga de controlo para a proteína de histona, podem realizar-se geles paralelos e corar-se com Azul de Coomassie (CB).

Além disso, mostrou-se que os inibidores HDAC à base de ácido hidroxâmico regulam a expressão do gene p21WAFI. A proteína p21WAFI é induzida no decurso de 2 horas de cultura como inibidores HDAC numa variedade de células transformadas utilizando processos convencionais. A indução do gene p21WAFI encontra-se associada com a acumulação de histonas acetiladas na região de cromatina deste gene. A indução de p21WAFI pode, por consequência, ser reconhecida como envolvendo a paragem do ciclo de células G1 provocada por inibidores HDAC em células transformadas.

Tipicamente, os inibidores HDAC caiem em cinco classes gerais: 1) derivados do ácido hidroxâmico; 2) Ácidos Gordos de Cadeia Curta (SCFAs); Tetrapéptidos cíclicos; 4) benzamidas; e 5) cetonas electrofílicas. A Derivados do Ácido Hidroxâmico tais como suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) (Richon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 3003-3007 (1998)); bis-hidroxamida do ácido m-carboxicinâmico (CBHA) (Richon et al., supra); piroxamida; análogos de tricostatina tais como tricostatina A (TSA) e tricostatina C (Koghe et al. 1998 Biochem. Pharmacol. 56: 1359-1364); ácido salicilhidroxâmico (Andrews et al., International J. Parasitology 30, 761-768 (2000)); ácido suberoílo bishidroxâmico (SAHA) (patente de invenção norte-americana n.° 5 608 108); ácido azelaico bishidroxâmico (ABHA) (Andrews et al., supra); azelaico-l-hidroxamato-9-anilida (AAHA) (Qiu et al., Mol. Biol. Cell 11, 2069-2083 (2000)); 29 ácido 6-(3-clorofenilureido)-carpoico-hidroxâmico (3C1--UCHA); oxamflatina [ácido (2E)-5-[3-[(fenilsulfonil)--aminolfenil]-pent-en-4-inohidroxâmico (Kim et al. Oncogene, 18:2461-2470 (1999)); A-161906, Scriptaid (Su et al. 2000 Câncer Research, 60:3137-3142); PXD-101 (Prolifix); LAQ-824; CHAP; MW2796 (Andrews et al., supra); MW2996 (Andrews et al., supra); ou quaisquer dos ácidos hidroxâmicos nas patentes de invenção norte-americanas n°s 5 369 108, 5 932 616 5 700 811, 6 087 367 e 6 511 990.

Tem-se constatado que a SAHA se liga directamente à bolsa catalítica da enzima histona desacetilase. A SAHA induz a paragem do ciclo celular, a diferenciação, e/ou a apoptose e células transformadas em cultura e inibe o crescimento de tumor em roedores. A SAHA é eficaz na indução destes efeitos tanto em tumores sólidos como em cancros hematológicos. Observou-se que a SAHA é eficaz na inibição de crescimento de tumores em animais sem qualquer toxicidade para o animal. A inibição do crescimento de tumor induzida por SAHA encontra-se associada com uma acumulação de histonas acetiladas no tumor. A SAHA é eficaz na inibição do desenvolvimento e crescimento continuado de tumores mamários (C-metilnitrosureia) induzidos por carcinógeno em ratos. A SAHA foi administrada aos ratos na sua dieta no decurso de 130 dias do estudo. Deste modo, a SAHA é um agente anti-tumoral activo por via oral e não tóxico cujo mecanismo de acção envolve a inibição da actividade da histona desacetilase.

Os inibidores HDAC preferidos são os que se encontram descritos nas patentes de invenção norte-americanas n.° 5 369 108, 5 932 616, 5 700 811, 6 087 367 e 6 511 990, 30 concedidas a alguns dos presentes inventores que descrevem os compostos. O inibidor HDAC utilizado na presente invenção é representado pela estrutura de fórmula 3, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, e um veiculo ou excipiente aceitável em farmácia.

na qual o simbolo n representa um número inteiro compreendido entre 5 e cerca de 8.

De acordo com uma forma de realização preferida da fórmula geral 3, o simbolo n representa o número 6. O inibidor HDAC é a SAHA (4), ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, e um veiculo ou excipiente aceitável em farmácia. Pode representar-se a SAHA pela seguinte fórmula estrutural:

(4)

Descreve-se igualmente na presente memória descritiva composições farmacêuticas que compreendem sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico dos inibidores HDAC com ácidos orgânicos ou inorgânicos, por exemplo, sais de adição de ácido que podem, por exemplo, ser ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido metanossulfónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido acético, ácido benzóico; ácido oxálico, ácido cítrico, ácido 31 carbónico, ácido fosfórico e similares. Podem também utilizar-se sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico preparados a partir do tratamento com base inorgânica, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio ou hidróxidos férricos, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e similares.

Descrevem-se igualmente na presente memória descritiva composições farmacêuticas que compreendem hidratos dos inibidores HDAC. 0 termo "hidrato" inclui mas sem ficar limitados a estes hemi-hidrato, mono-hidrato, di-hidrato, tri-hidrato e similares. A presente invenção também engloba composições farmacêuticas que compreendem qualquer forma sólida ou liquida de SAHA. Os inibidores HDAC podem apresentar-se em forma cristalina, em forma amorfa, e podem ter qualquer tamanho da partícula. As partículas de inibidor HDAC podem ser micronizadas, ou podem ser aglomeradas, grânulos em partículas, pós, óleos, suspensões oleosas, ou qualquer outra forma física líquida ou sólida.

Utilizações Terapêuticas de Inibidores HDAC 1. Tratamento de Cancro

Conforme demonstrado na presente memória descritiva, os inibidores HDAC são úteis para o tratamento do cancro que compreende a administração ao referido indivíduo de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de um inibidor de histona desacetilase descrito na presente memória descritiva. 32 0 temor "cancro" refere-se ao cancro provocado pela proliferação de células neoplásticas, tais como mesoteliomas, por exemplo, mesoteliomas tais como mesotelioma pleural, mesotelioma peritoneal, e mesotelioma fibroso benigno. 2. Tratamento do Mesotelioma

Conforme se demonstrou na presente memória descritiva, os inibidores HDAC são úteis para o tratamento do mesotelioma.

Existem diversos tipos de mesotelioma. Os mesoteliomas pleural e peritoneal (malignos) envolvem tumores do tecido mesotelial associados com exposição ao amianto. Histologicamente, estes tumores são compostos por tipos de células epitelóide, sarcomatóide ou fibrose ou células tipo misto (também chamadas células de tipo bifásico). 0 mesotelioma fibroso benigno é um tumor sólido raro da pleura que produz dor no peito, dispneia, febre e osteoartropatia hipertrófica.

Um sistema de estágio utilizado para um mesotelioma é o sistema de Butchart. Este sistema baseia-se principalmente na extensão da massa de tumor maligno primário e divide os mesoteliomas em estádios I a IV. 33 33 Estádio I: 0 mesotelioma encontra-se presente apenas num lado do peito e não está a desenvolver-se na parede do peito. Estádio II: 0 mesotelioma invade a parede do peito ou envolve o esófago (passagem de alimentos que liga a garganta ao estômago), coração, ou desenvolveu-se na pleura ou noutro do peito. Os nódulos linfáticos no peito podem também encontrar-se envolvidos. Estádio III: 0 mesotelioma cresceu através do diafragma no peritoneu (revestimento de cavidade abdominal) ou espalhou-se pelos nódulos linfáticos para além daqueles que se encontram no peito. Estádio IV: 0 mesotelioma espalhou-se através da corrente sanguínea para outros órgãos (metástases).

Classificação

Conforme contemplado na presente memória descritiva, os inibidores HDAC de acordo com a presente invenção são úteis para tratar todos os estádios de mesotelioma, isto é estádios I, II, III e IV indicados anteriormente.

Terapia de combinação

As utilizações da presente invenção podem também compreender a administração inicial ao indivíduo de um agente anti-tumoral de modo a tornar as células neoplásticas no indivíduo resistentes a um agente anti--tumoral e administração subsequentemente de uma quantidade eficaz de qualquer das composições de acordo com a presente invenção, eficazes para induzir de maneira selectiva uma diferenciação terminal, uma paragem do crescimento das 34 células e/ou apoptose de tais células, ou para tratar o cancro ou proporcionar quimioprevenção. 0 agente anti-tumoral pode ser um de numerosos agentes de quimioterapia tais como um agente de alquilação, um antimetabolito, um agente hormonal, um antibiótico, uma colquicina, um alcaloide vinca, L-asparaginase, procarbazina, hidroxiureia, mitotano, nitrosoureias, ou uma imidazole carboxamida. Agentes apropriados são os agentes que promovem a despolarização da tubulina. De preferência o agente anti-tumor é a colchicina ou um alcaloide vinca; são especialmente preferidos vinblastina e a vincristina. Na forma de realização em que o agente anti-tumor é a vincristina, as células são tratadas de preferência de modo que sejam resistentes à vincristina para uma concentração de cerca de 5 mg/ml. 0 tratamento das células para as tornar resistentes a um agente anti-tumoral pode ser efectuada mediante contacto das células com o agente durante um intervalo de tempo igual a pelo menos 3 a 5 dias. 0 contacto das células resultantes com qualquer dos compostos indicados anteriormente tem lugar conforme se descreveu antes. Além dos compostos de quimioterapia anteriores, os compostos podem também ser administrados conjuntamente com terapia de radiação.

Dosagens e Escalas de Dosagens 0 regime de dosagem que utiliza os inibidores HDAC pode ser escolhido de acordo com uma variedade de factores que incluem o tipo, a espécie, a idade, o peso, o sexo e o tipo de cancro que está a ser tratado; a gravidade (isto é, o estádio) do cancro a ser tratado; a via de administração; a função renal e hepática do paciente; e o composto 35 particular ou o seu sal utilizado. Um clinico assistente ou um veterinário com conhecimentos normais na matéria pode determinar facilmente e prescrever a quantidade eficaz do fármaco necessário para tratar, por exemplo, para prevenir, inibir (total ou parcialmente) ou interromper o progresso da doença.

As dosagens apropriadas são uma dosagem diária total compreendida entre cerca de 25-400 mg/m2 administrada por via oral uma vez ao dia, duas vezes ou dia ou três vezes ao dia, de maneira continua (todos os dias) ou maneira intermitente (por exemplo, 3-5 dias por semana). Por exemplo, a SAHA pode ser administrada numa dose diária total de até 800 mg. O inibidor HDAC pode ser administrado uma vez ao dia (QD) , ou em doses múltiplas divididas diárias, tais como duas vezes ao dia (BID), e três vezes ao dia (TID) . 0 inibidor HDAC pode ser administrado para uma dosagem diária total de até 800 mg, por exemplo 150 mg, 200 mg, 30 0 mg, 400 mg, 600 mg ou 800 mg, que podem ser administrado em doses múltiplas diárias conforme se descreveu anteriormente. De preferência, a administração realiza-se por via oral. A composição pode ser administrada uma vez ao dia para uma dose de cerca de 200-600 mg; duas vezes ao dia para uma dose de cerca de 200-400 mg; duas vezes do dia para uma dose de cerca de 200-400 mg de maneira intermitente, por exemplo três, quatro ou cinco dias por semana; e três vezes ao dia para uma dose de cerca de 100-250 mg. A dose diária é de 200 mg, a qual pode ser administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia ou três vezes ao dia; a dose diária pode ser igual a 300 mg, a qual 36 pode ser administrada uma vez ao dia, duas vezes ao dia, ou três vezes ao dia; a dose diária pode ser igual a 400 mg, a qual pode ser administrada uma vez ao dia ou duas vezes ao dia; a dose diária pode ser igual a 150 mg, a qual pode ser administrada duas vezes ao dia ou três vezes ao dia.

Além disso, a administração pode ter lugar de maneira contínua, isto é, todos os dias ou de maneira intermitente. Os termos "intermitente" ou "intermitentemente" tais como utilizados na presente memória descritiva significam a interrupção ou o início de quer intervalos regulares ou irregulares. Por exemplo, a administração intermitente de um inibidor HDAC pode ser a administração um a seis dias por semana ou pode significar a administração média em ciclos (por exemplo, administração diária durante duas a oito semanas consecutivas, em seguida um período de repouso sem qualquer administração durante até uma semana) ou pode significar a administração em dias alternados. A SAHA ou qualquer dos inibidores HDAC pode ser administrada ao paciente em uma dosagem diária total compreendida entre 25-4000 mg/m2.

Um protocolo de tratamento compreende a administração contínua (isto é, todos os dias) , uma vez, duas vezes ou três vezes ao dia para uma dose total diária na gama compreendida entre cerca de 200 mg e cerca de 600 mg.

Um outro protocolo de tratamento compreende a administração intermitente de entre três e cinco dias por semana, uma vez, duas vezes ou três vezes ao dia para uma dose total diária na gama compreendida entre cerca de 200 mg e cerca e 600 mg. 37 0 inibidor HDAC pode ser administrado de maneira continua uma vez ao dia para uma dose de 400 mg ou duas vezes ao dia para uma dose de 200 mg. 0 inibidor HDAC pode ser administrado de maneira intermitente três dias por semana, uma vez por dia para uma dose de 400 mg duas vezes por dia para uma dose de 200 mg; quatro dias por semana, uma vez diariamente para uma dose de 400 mg ou duas vezes diariamente para uma dose de 200 mg; cinco dias por semana, uma vez diariamente para uma dose de 400 mg ou duas vezes por dia para uma dose de 200 mg; ou administrado de maneira continua uma vez por dia para uma dose de 600 mg, duas vezes por dia para uma dose de 300 mg, ou três vezes por dia para uma dose de 200 mg. 0 inibidor HDAC pode ser administrado de maneira intermitente três dias por semana, uma vez ao dia para uma dose de 600 mg, duas vezes ao dia para uma dose de 300 mg, ou três vezes ao dia para uma dose de 200 mg; quatro dias por semana, uma vez ao dia para uma dose de 600 mg, duas vezes ao dia para uma dose de 300 mg, ou três vezes ao dia para uma dose de 200 mg; ou cinco dias por semana, uma vez ao dia para uma dose de 600 mg, duas vezes ao dia para uma dose de 300 mg, ou três vezes ao dia para uma dose de 200 mg.

Além disso, pode administrar-se o inibidor HDAC de acordo com as escalas descritas anteriormente, consecutivamente durante algumas semanas, seguido por um periodo de repouso. Por exemplo, o inibidor HDAC pode ser administrado de acordo com uma qualquer das escalas descritas anteriormente entre duas e oito semanas, seguido por um periodo de repouso de uma semana, ou duas vezes ao 38 dia para uma dose de 300 mg durante três a cinco dias por semana. O inibidor HDAC pode ser administrado três vezes ao dia durante duas semanas consecutivas, seguido por uma semana de repouso. A presente invenção proporciona um regime de dosagem diário seguro destas formulações, o qual é fácil de seguir e de aderir. As formulações das composições de acordo com a presente invenção são, por consequência, úteis para induzir de maneira selectiva a diferenciação terminal, a paragem do crescimento das células, e/ou a apoptose de células de neoplásticas e, por consequência, auxiliam no tratamento de tumores.

Composições farmacêuticas

Os compostos de acordo com a presente invenção e os seus derivados, fragmentos, análogos, os seus sais ou hidratos homólogos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, podem ser incorporados em composições farmacêuticas apropriadas para administração por via, conjuntamente com um veiculo ou excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Tais composições compreendem tipicamente uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer dos compostos anteriores e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. De preferência, a quantidade eficaz é uma quantidade eficaz para induzir de maneira selectiva a diferenciação terminal de células neoplásticas apropriadas e menos do que uma quantidade que provoca a toxicidade num paciente.

As composições de acordo com a presente invenção podem ser formuladas em qualquer forma de dosagem unitária 39 (líquida ou sólida) apropriada para a administração por via oral, por exemplo, sob a forma de um grânulo, um comprimido, um comprimido revestido, uma cápsula, uma cápsula de gelatina, uma solução, uma suspensão, ou uma dispersão. De acordo com uma forma de realização correntemente preferida, a composição a encontra-se sob a forma de uma cápsula de gelatina.

Pode utilizar-se qualquer excipiente inerte que seja vulgarmente utilizada como veículo ou diluente nas formulações da presente invenção, tais como por exemplo, uma goma, um amido, um açúcar, um material celulósico, um acrilato, ou as suas misturas. Um diluente preferido é a celulose microcristalina. As composições podem compreender ainda um agente desintegrante (por exemplo croscarmelose de sódio) e um lubrificante (por exemplo, estearato de magnésio), e além disso podem compreender um ou mais aditivos escolhidos de entre um ligando, um tampão, um inibido de protéase, um agente tensioactivo, um agente solubilizante, um plastificante, um emulsionante, um agente estabilizante, um agente que aumenta a viscosidade, um edulcorante, um agente formador de película, ou qualquer das suas combinações. Além disso, as composições de acordo com a presente invenção podem representar-se sob a forma de formulações de libertação controlada ou de libertação imediata.

Uma forma de realização é uma composição farmacêutica para administração por via oral que compreende SAHA ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, celulose microcristalina, croscarmelose de sódio e estearato de magnésio. De preferência, a composição compreende 50-70% em peso de inibidor HDAC ou um seu sal ou 40 hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, 20-40% em peso de celulose microcristalina, 5-1,5% em peso de croscarmelose de sódio e 0,1-5% em peso de estearato de magnésio. As composições podem compreender cerca de 50-200 mg de um inibidor HDAC.

As composições farmacêuticas são administradas por via oral e, deste modo, são formuladas sob uma forma apropriada para administração por via oral, isto é, sob a forma de uma preparação sólida ou de uma preparação liquida. As formulações sólidas orais apropriadas incluem comprimidos, cápsulas, pastilhas, grânulos, microgrânulos ("pellets") e similares. As formulações orais liquidas apropriadas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e similares. De acordo com uma forma de realização da presente invenção, formula-se a composição em uma cápsula. De acordo com isto, as composições podem compreender além do composto activo inibidor HDAC e o veiculo ou diluente inertes, uma cápsula de gelatina dura.

Tal como utilizada na presente memória descritiva, "veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" pretende-se que inclua quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardadores isotónicos e da absorção e similares, compatíveis com a administração farmacêutica, tais como água estéril isenta de pirogénios. Os veículos apropriados são descritos na edição mais recente de Remington's Pharmaceutical Sciences, um texto de referência padrão neste domínio. Exemplos preferidos de tais veículos ou diluentes incluem, mas sem ficarem limitados a estes, água, soro fisiológico, soluções de Ringer, solução e dextrose e albumina de soro humano a 5%. 41

Podem utilizar-se igualmente liposomas e veículos não aquosos tais como óleos fixos. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na especialidade. Excepto na medida em que qualquer meio convencional ou agente seja incompatível com o composto activo, é contemplada a sua utilização na composição. Os compostos suplementares activos podem também ser incorporados nas composições.

Os veículos sólidos/diluentes incluem, mas sem ficarem limitados a estes, uma goma, um amido (por exemplo, amido de milho, amido pré-gelatinizado), um açúcar (por exemplo, lactose, manitol, sacarose, dextrose), um material celulósico (por exemplo, celulose microcristalina), um acrilato (por exemplo, acrilato de polimetilo), carbonato de cálcio, óxido de magnésio, talco, ou as suas misturas.

Para formulações líquidas, os veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêuticos podem ser soluções, suspensões ou emulsões aquosas ou não aquosas, ou óleos. Exemplos de solventes não aquosos são o propileno glicol, polietileno glicol, e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Exemplos de óleos são os de origem do petróleo, animal, vegetal ou sintético, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, azeite, óleo de girassol e óleo de fígado de peixe. As soluções ou suspensões podem também incluir os seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injecção, solução de soro fisiológico, óleos não voláteis, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos 42 tais como álcool benzílico ou metilo parabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA); tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos, e agentes para o ajustamento da tonicidade tais como cloreto de sódio ou dextrose. Pode ajustar-se o pH com ácidos ou base, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio.

Além disso, as composições podem compreender ainda ligantes (por exemplo, acácia, amido de milho, gelatina, carbómero, etilcelulose, goma guar, hidroxipropilcelulose, hidroxpropilmetilcelulose, povidona), agentes desagregrantes (por exemplo, amido e milho, amido de batata, ácido alginico, dióxido de silício, croscarmelose de sódio, crospovidona, goma guar, de amido e sódio, Primogel), tampões (por exemplo, tris-HCl, acetato, fosfato) de vários pH e força iónica, aditivos tais como albumina ou gelatina para prevenir a absorção a superfícies, detergentes (por exemplo: Tween 20, Tween 80; Pluronic F68, sais de ácido biliar), inibidores da protéase, agentes tensioactivos (por exemplo, sulfato de laurilo e sódio), intensificadores da permeação, agentes solubilizantes (por exemplo, glicerol, polietileno glicol), um agente de deslizamento (por exemplo, dióxido de silício coloidal), anti-oxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio, hidroxianisole butilado), estabilizantes (por exemplo, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose), agentes que aumentam a viscosidade (por exemplo, carbómero, dióxido de silício coloidal, etilcelulose, goma guar), edulcorantes (por exemplo, sacarose, aspartame, ácido cítrico), agentes aromatizantes (por exemplo, hortelã-pimenta, salicilato de 43 metilo ou aroma de laranja), conservantes (por exemplo, Timerosal, álcool benzílico, parabenos), lubrificantes (por exemplo, ácido esteárico, estearato de magnésio, polietileno glicol, sulfato de laurilo e sódio), auxiliares do fluxo (por exemplo, dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por exemplo, ftalato de dietilo, citrato de dietilo), emulsionantes (por exemplo, carbómero, hidroxipropilcelulose, sulfato de laurilo e sódio), revestimentos poliméricos (por exemplo, poloxâmeros ou poloxaminas), agentes de formação de revestimento e de pelicula (por exemplo, etilcelulose, acrilatos, polimetacrilatos) e/ou adjuvantes.

De preferência, preparam-se os compostos activos com veículos que protegerão o composto contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de libertação retardada, incluindo implantes e sistemas de libertação microencapsulados. Podem utilizar-se polímeros biocompatíveis biodegradáveis, tais como etileno acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicólico, colagénio, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para os peritos na matéria. Os materiais podem ser igualmente obtidos pela via comercial a partir de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc.. Podem também utilizar-se suspensões lipossómicas (incluindo lipossomas destinados a infectar células com anticorpos monoclonais para antigénios virais) como veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Podem preparar-se estes últimos de acordo com os processos conhecidos dos peritos na especialidade, por exemplo, conforme descrito na patente de invenção norte--americana N.° 4 522 811. 44 É especialmente vantajoso formular composições orais em uma forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma unitária de dosagem tal como utilizada na presente memória descritiva refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veiculo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas por e dependente directamente das caracteristicas únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e das limitações inerentes na arte de compostagem de tais compostos activos para o tratamento de indivíduos.

As composições farmacêuticas podem ser incluídas num contentor, numa embalagem, ou num dispositivo distribuidor conjuntamente com instruções para a administração. A administração diária pode ser repetida continuamente durante um período de vários dias a vários anos. 0 tratamento oral pode continuar durante uma semana e a vida do paciente. De preferência, a administração tem lugar durante cinco dias consecutivos tempo após o qual o paciente pode ser avaliado para determinar se é necessária mais administração. A administração pode ser contínua ou intermitente, isto é, o tratamento durante um número de dias consecutivos seguido por um período de repouso.

As composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas por via intravenosa no primeiro dia de 45 tratamento, com a administração oral no segundo dia e todos os dias seguintes consecutivos.

As composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas com a finalidade de prevenir a progressão de uma doença ou a estabilização do crescimento de um tumor. A preparação das composições farmacêuticas que contêm um componente activo é bem conhecida na especialidade, por exemplo, mediante mistura, granulação, ou processos de formação de comprimidos. 0 ingrediente terapêutico activo é frequentemente misturado com excipientes que são aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico e compatíveis com o ingrediente activo. Para a administração por via oral, mistura-se os agentes activos com aditivos habituais para esta finalidade, tais como veículos, estabilizantes, ou diluentes inertes, e convertem-se por métodos habituais em formas apropriadas para administração, tais como comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas de gelatina dura ou mole, soluções aquosas, alcoólicas ou oleosas e similares conforme pormenorizado anteriormente.

A quantidade do composto administrado ao paciente é inferior à quantidade que causaria toxicidade no paciente. A quantidade do composto que é administrada ao paciente pode ser inferior à quantidade que provoca uma concentração do composto no plasma do paciente igual ou excesso do nível tóxico do composto. De preferência, a concentração do composto no plasma do paciente é mantida a cerca de 10 nM. A concentração do composto no plasma do paciente pode ser mantida a cerca de 25 nM. A concentração do composto no plasma do paciente pode ser mantida a cerca de 50 nM. A 46 concentração do composto no plasma do paciente pode ser mantida a cerca de 100 nM. A concentração do composto no plasma do paciente pode ser mantida a cerca de 500 nM. A concentração do composto no plasma do paciente pode ser mantida a cerca de 1000 nM. A concentração do composto no plasma do paciente pode ser mantida a cerca de 2500 nM. A concentração do composto no plasma do paciente pode ser mantida a cerca de 5000 nM.

Verificou-se com HMBA que administração do composto numa quantidade compreendida entre cerca de 5 gm/m2/dia e cerca de 30 gm/m2/dia, particularmente igual a 20 gm/m2/dia, é eficaz sem produzir toxicidade no paciente. A quantidade óptima do composto que deve ser administrada ao paciente na prática da presente invenção dependerá do composto particular utilizado e do tipo de cancro a ser tratado.

De acordo com uma forma de realização correntemente preferida da presente invenção, a composição farmacêutica compreende suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA); celulose microcristalina tal como um veiculo ou diluente; croscarmelose de sólido como desintegrante; e estearato de magnésio como lubrificante. Uma outra forma de realização correntemente preferida da invenção é uma formulação sólida de SAHA com celulose microcristalina, NF (Avicel Ph 101), croscarmelose de sódio, NF (AC-Di-sol) e estearato de magnésio, NF, que contida numa cápsula de gelatina. A percentagem do ingrediente activo e dos diversos excipientes nas formulações pode variar. Por exemplo, a composição pode compreender entre 20 e 90%, de preferência entre 50-70% em peso da histona desacetilase (HDAC) . Além 47 disso, a composição pode compreender entre 10 e 70%, de preferência entre 20-40% em peso de celulose microcristalina com um veiculo ou diluente. Além disso, a composição pode compreender entre 1 e 30%, de preferência entre 5-11% em peso de croscarmelose de sódio como desintegrante. Além disso, a composição pode compreender entre 0,1-5% em peso de estearato de magnésio como lubrificante. De acordo com uma outra forma de realização preferida, a composição compreende cerca de 50-200 mg do inibidor HDAC (por exemplo 50 mg, 100 mg e 200 mg para o inibidor HDAC, isto é SAHA) . De acordo com uma forma de realização particularmente preferida, a composição apresenta-se sob a forma de uma cápsula de gelatina.

Uma forma de realização corrente preferida corresponde a 200 mg de SAHA sólido com 89,5 mg de celulose microcristlina, 9 mg de croscarmelose de sódio e 1,5 mg de estearato de magnésio contidos numa cápsula de gelatina.

Utilizações In Vitro:

Descrevem-se igualmente na presente memória descritiva métodos in-vitro para induzir de maneira selectiva a diferenciação terminal, a interrupção do crescimento das células e/ou a apoptose de células neoplásticas, por exemplo, células de linfoma, inibindo deste modo a proliferação de tais células, mediante contacto das células in vitro com uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC, por exemplo, SAHA ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Descrevem-se igualmente na presente memória descritiva métodos in-vitro para inibir a actividade de uma histona 48 desacetilase, pela histona desacetilase com uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC, por exemplo, SAHA, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

Deste modo, a presente invenção proporciona igualmente composições farmacêuticas para utilização em métodos de indução selectiva da diferenciação terminal, a interrupção do crescimento das células e/ou a apoptose de células neoplásticas, por exemplo, células de linfoma no indivíduo, inibindo deste modo a proliferação de tais células no referido indivíduo, mediante administração ao indivíduo da referida composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC, por exemplo, SAHA, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, e um veiculo ou diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Uma quantidade eficaz de um inibidor HDAC pode ser de até uma dose diária total de 800 mg. A presente invenção proporciona igualmente a utilização de SAHA na preparação de um medicamento oral para inibir a actividade de uma histona desacetilase num indivíduo, mediante administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de SAHA, ou um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e um veiculo ou diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Uma quantidade eficaz de um inibidor de HDAC na presente invenção pode ser até uma dose diária total de 800 mg. 49

EXEMPLOS A invenção é ilustrada no Exemplos que se seguem. Esta secção é apresentada para auxiliar a interpretação da invenção mas não se pretende com ela, e não deve ser construída deste modo, limitar de qualquer modo a invenção conforme indicada nas reivindicações que se seguem a seguir. EXEMPLO 1

Síntese de SAHA A SAHA pode ser sintetizada de acordo com o processo delineado abaixo, ou de acordo com o processo descrito na patente de invenção norte-americana N.° 5 369 108, ou de acordo com qualquer outro processo.

Síntese de SAHA

Fase 1 - Síntese do ácido Suberanílico

Em um frasco de 22 L colocaram-se 3500 g (20,09 moles) de ácido subérico, e fundiu-se o ácido com calor. Subiu-se a temperatura até 175°C, e adicionaram-se então 2040 g (21,92 moles) de anilina. Elevou-se a temperatura até 190°C e manteve-se a essa temperatura durante 20 minutos. Despejou-se o produto fundido em um tanque de Nalgene que contém 4017 g de hidróxido de potássio dissolvido em 50 L de água. Agitou-se a mistura durante 20 minutos após a adição do produto fundido. Repetiu-se a reacção à mesma escala, e despejou-se um segundo produto fundido na mesma 50 solução de hidróxido de potássio. Após se ter agitado cuidadosamente a mistura, desligou-se o agitador e deixou--se assentar a mistura. Filtrou-se então a mistura através de uma almofada de Celite (4200 g) (o produto foi filtrado para remover o semi-produto neutro) do ataque pela anilina em ambas as extremidades do ácido subérico). O filtrado contém o sal do produto e também o sal de ácido subérico que não reagiu. Deixou-se assentar a mistura uma vez que a filtração era muito lenta, levando diversos dias). Acidificou-se o filtrado utilizando 5 L de ácido cloridrico concentrado; agitou-se a mistura durante uma hora, e deixou-se então depositar durante a noite. Isolou-se o produto mediante filtração, e lavou-se no funil com água desionizada (4 x 5 L) . Colocou-se o bolo do filtro húmido num frasco de 72 L com 44 L de água desionizada, aqueceu-se a mistura até 50°C e isolou-se o sólido mediante filtração a quente (o produto desejado estava contaminado com ácido subérico que tinha uma solubilidade muito maior em água quente. Realizaram-se diversas triturações a quente para remover o ácido subérico. Verificou-se o produto mediante RMN[D6DMS0] para monitorar a remoção de ácido subérico). Repetiu-se a trituração a quente com 44 L de água à temperatura de 50°C. Isolou-se novamente o produto mediante filtração e lavou-se com 4 L de água quente. Secou-se durante o fim-de-semana numa estufa de vácuo à temperatura de 65°C utilizando uma bomba de Nash como fonte de vazio (a bomba de Nash é uma bomba de anel liquido (água) e produz um vazio de cerca de 29 polegadas de mercúrio. Para facilitar a retirada da água utilizou-se uma purga de árgon intermitente); obtiveram-se 4182,8 g de ácido suberanilico. O produto continha ainda uma pequena quantidade, de ácido subérico; por consequência, realizou-se a trituração 51 a quente gradualmente à temperatura de 65°C, utilizando cerca de 300 g do produto de cada vez. Filtrou-se cada porção, e lavou-se cuidadosamente com mais água quente (um total de cerca de 6 L) . Repetiu-se esta operação para purificar o lote completo. Removeu-se completamente o ácido subérico do produto. Combinou-se o produto sólido num frasco e agitou-se com 6 L de metanol/água (1:2), e em seguida isolou-se mediante filtração e secagem ao ar no filtro no decurso de um fim-de-semana. Colocou-se em tabuleiros e secou-se numa estufa de vazio à temperatura de 65°C durante 45 horas utilizando a bomba de Nash e a sangria de árgon. O produto final tinha um peso de 3278,4 g (rendimento 32,7%).

Fase 2 - Síntese de Suberanilato de Metilo

P ff f

Num frasco de 50 L equipado com agitador mecânico, e um condensador colocaram-se 3229 g de ácido suberanílico proveniente da fase anterior, 20 L de metanol e 398,7 g de resina Dowex 50WX2-400. Aqueceu-se a mistura a refluxo e manteve-se a refluxo durante 18 horas. Filtrou-se a mistura para remover as esferas da resina e levou-se o filtrado a um resíduo com um evaporador rotativo.

Transferiu-se o resíduo do evaporador rotativo para um frasco de 50 L equipado com um condensador e um agitador mecânico. Ao frasco adicionaram-se 6 L de metanol e aqueceu-se a mistura para se obter uma solução. Em seguida adicionaram-se 2 L de água desionizada e desligou-se a fonte de calor. Deixou-se arrefecer a mistura agitada e colocou-se então o frasco num banho de gelo e arrefeceu-se a mistura. Isolou-se o produto sólido mediante filtração e 52 lavou-se o bolo de filtro com 4 L de metanol/água frio (1:1). Secou-se o produto à temperatura de 45°C numa estufa de vazio utilizando uma bomba de Nash para uma duração total de 64 horas para se obter 2850 g (rendimento 84%) de suberanilato de metilo. CSL Lote # 78-794-92-3 1.

Fase 3 - Sintese de SAHA Bruto ,.....- « o o f ^♦ NHtOH»íCi ................... Xísssa/ A um frasco de 50 L equipado com agitador mecânico, termopar, e entrada de atmosfera inerte adicionaram-se 1451,9 g de hidroxilamina, cloridrato, 19 L de metanol anidro e um lote de 3,93 L de uma solução de metóxido de sódio em metanol. Carregou-se então o frasco com 2748,0 g de suberanilato de metilo, seguido por 1,9 L de uma solução de metóxido de sódio a 30% em metanol. Deixou-se a mistura sob agitação durante 16 horas e 10 minutos. Aproximadamente metade da mistura reaccional foi transferida do balão reaccional (frasco 1) para um frasco de 50 L (frasco 2) equipado com um agitador mecânico. Em seguida adicionaram--se 27 L de água desionizada ao frasco 1 e agitou-se

mistura durante 10 minutos. Retirou-se o valor do pH utilizando um medidor de pH e o pH era igual a 11,56. Ajustou-se o pH da mistura a 12,02 mediante adição de 100 ml de uma solução de metóxido de sódio a 30% em metanol; isto proporciona uma solução límpida, (a mistura reaccional a esta altura continha uma pequena quantidade de sólido. Ajustou-se a pH para se obter uma solução límpida a partir da qual precipitou o produto da precipitação). Diluiu-se a mistura reaccional no frasco 2 pela mesma maneira, adicionaram-se 27 L de água desionizada e ajustou-se o pH pela adição de 100 ml de uma solução de metóxido de sódio a 53 30% à mistura, para se obter um pH de 12,01 (solução limpida).

Acidificou-se a mistura reaccional em cada frasco pela adição de ácido acético glacial ao precipitado do produto. O frasco 1 tinha um pH final de 8,98 e o frasco 2 tinha um pH final de 8,70. Isolou-se o produto de ambos os frascos mediante filtração utilizando um funil de Buchner e um pano de filtração. Lavou-se o bolo do filtro com 15 L de água desionizada e cobriu-se o funil e secou-se parcialmente o produto no funil sob vazio durante 15,5 horas. Removeu-se o produto e colocou-se em cinco tabuleiros de vidro. Colocaram-se os tabuleiros numa estufa de vácuo e secou-se o produto até peso constante. O primeiro período de secagem foi de 22 horas à temperatura de 60°C utilizando uma bomba de Nash como fonte de vaio com uma purga de árgon. Removeram-se os tabuleiros sob vácuo e pesaram-se. Os tabuleiros voltaram à estufa e o produto seco durante mais 4 horas e 10 minutos utilizando uma bomba de óleo como fonte de vácuo e sem purga de árgon. Embalou-se o material em um saco duplo de polietileno 4-mill e colocaram-se num contentor exterior de plástico. O peso final após a amostragem foi de 2633,4 g (95,6%).

Fase 4 - Recristalização de SAHA Bruto

Recristalizou-se a SAHA bruto a partir de metanol/água. Carregou-se um frasco de 50 L equipado com um agitador mecânico, termopar, condensador, e entrada de atmosfera inerte coma SAHA bruta para ser recristalizada (2525,7 g), seguida por 2625 ml de água desionizada e 15755 ml de metanol. Aqueceu-se o material a refluxo para se obter uma solução. Em seguida adicionaram-se 5250 ml de 54 água desionizada à mistura reaccional. Interrompeu-se o aquecimento e deixou-se a mistura arrefecer. Uma vez a mistura arrefecida suficientemente para que o frasco pudesse ser manuseado com segurança (28°C), removeu-se o frasco da manta de aquecimento e colocou-se num tubo para utilização com um banho de arrefecimento. Adicionou-se gelo/água ao tubo para arrefecer a mistura até à temperatura de -5°C. Mantém-se a mistura a uma temperatura inferior a essa temperatura durante 2 horas. Isolou-se o produto mediante filtração e lavou-se o bolo do filtro com 1,5 L de metanol/água frio (2:1) . Cobriu-se o funil e secou-se parcialmente o produto sob vazio durante 1,75 horas. Removeu-se o produto do funil e colocou-se em 6 tabuleiros de vidro. Colocaram-se os tabuleiros numa estufa de vazio e secou-se o produto durante 64,75 horas à temperatura de 60°C utilizando uma bomba de Nash como fonte de vazio e utilizando uma sangria de árgon. Removeu-se os tabuleiros para pesagem, e voltaram então à estufa e secaram-se durante mais 4 horas à temperatura de 60°C para se obter um peso constante. A fonte de vazio para o segundo período de secagem é uma bomba de óleo, e não se utilizou qualquer sangria de árgon. Embalou-se o material em sacos duplos de polietileno de 4-mill e colocaram-se num recipiente de tubo exterior de plástico. O peso final após secagem era igual a 2504,9 g (92,5%). EXEMPLO 2

Doseamento oral de suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA)

Antecedentes: Do tratamento com agentes de diferenciação celular polares híbridos resultou a inibição 55 do crescimento de tumor sólido humano derivado de linhas de células e enxertos. 0 efeito é mediado em parte pela inibição de histona desacetilase. A SAHA é um inibidor potente da histona desacetilase que tem mostrado apresentar a capacidade para induzir a interrupção do crescimento das células de tumor, a diferenciação, e a apoptose no laboratório e em estudos pré-clínicos.

Objectivos: Para definir um regime oral diário seguro de SAHA pode ser utilizado em estudos de Fase II. Além disso, avaliou-se o perfil farmacocinético da formulação oral de SAHA. A biodisponibilidade oral da SAHA em seres humanos em jejum vs estado não jejum e efeitos anti-tumor do tratamento foram igualmente monitorizados. Adicionalmente, determinaram-se os efeitos biológicos de SAHA em tecidos normais e em células de tumor e documentaram-se as respostas com respeito aos niveis de acetilação da histona.

Doentes: Pacientes com um estado avançado histologicamente documentado, tumores sólidos adultos primários ou metastáticos que eram refractários à terapia convencional ou para os quais não existe qualquer terapia convencional curativa. Os pacientes devem ter um Karnofsky Performance Status de >70% e hematologia adequada, hepática e função renal. Os pacientes têm de estar pelo menos quatro semanas de qualquer quimioterapia anterior, terapia de radiação ou outros fármacos anticancro sobre investigação.

Escala de Dosagens: Um primeiro dia, trataram-se em primeiro lugar os pacientes com 200 mg de SAHA administrado por via intravenosa. A partir do segundo dia, trataram-se os pacientes com doses diárias de SAHA oral de acordo com o 56

Quadro 1. Cada grupo recebeu uma dose diferente de SAHA. "QD" indica a dosagem num dia; "Q12 horas" indica a dosagem duas vezes ao dia. Por exemplo, os pacientes no Grupo IV receberam duas doses de 800 mg de SAHA por dia. Administraram-se doses aos doentes diariamente e de maneira continua. Recolheram-se amostras de sangue no dia um e no dia 21 do tratamento oral. Os pacientes eram retirados do tratamento com SAHA por via oral devido à progressão da doença, à regressão do tumor, a efeitos secundários inaceitáveis, ou tratamento com outras terapias.

Quadro 1 : Escala de Dose Oral de SAHA

Grupo Dose oral (mg) Número de dias Programação Diária de Dosagem I 200 Continuo QD II 400 Continuo QD III 400 Continuo QD 12horas IV 800 Continuo QD 12horas V 1200 Continuo QD 12horas VI 1600 Continuo QD 12horas VII 2000 Continuo QD 12horas

Resultados: A comparação de niveis de plasma no soro mostra a elevada biodisponibilidade de SAHA administrado por via oral, tanto quando o doente estava em jejum como quando o paciente não estava em jejum, em comparação com SAHA administrado via intravenosa (IV VAGA). "AUC"é uma estimativa da biodisponibilidade de SAHA em (ng/ml)min, em que 600 ng/ml é igual a 2,5 μΜ de SAHA. O AUC tomado conjuntamente com a semi-vida (t1/2) mostra a biodisponibilidade global de SAHA oral melhor do que IV SAHA. Craax é a concentração máxima de SAHA observada após 57 administração. Administrou-se IV SAHA à razão de 200 mg infundidos no decurso de duas horas. Administrou-se o SAHA oral numa cápsula única de 200 mg. Os Quadros 2 e 3 resumem os resultados de um ensaio por HPLC (LCMS utilizando um padrão deuterado) que quantifica a quantidade de SAHA no plasma do sangue dos pacientes versus tempo; utilizando uma histona-4 (a-AcH4) como marcador.

Quadro 2 : Níveis de Plasma no Soro de SAHA Oral - Paciente N.2 1 IV Oral (jejum) Oral (ausência de jejum) r ^max (ng/ml) 1329 225 328 tl/2 (min) 20 80 64 AUC (ng/ml)min 153 000 25 000 59 000

Quadro 3 : Níveis de Plasma no Soro de SAHA Oral - Paciente N.s 2 IV Oral (jejum) Oral (ausência de jejum) ^max (ng/ml) 1003 362 302 tl/2 (min) 21 82 93 AUC (ng/ml)min 108 130 63 114 59 874

As figuras 1 a 8 são slides de HPLC que mostram a quantidade de a-AcH4 em doentes nos grupos I e II, medidas até 10 horas após a recepção da dose oral, em comparação com os niveis de a-AcH4 quando se administrou por via intravenosa SAHA. A fig. 9 mostra a concentração média no plasma de SAHA (nm/ml) nos pontos de tempo indicados após a administração. A fig. 9A: Dose oral (200 mg e 400 mg) sob jejum no Dia 8. A fig. 9B: Dose oral (200 mg e 400 mg) com alimento no Dia 9. A fig. 9C: Dose IV no dia 1. A fig. 10 mostra a semi-vida aparente da dose oral de SAHA de 200 mg e 400 mg, nos Dias 8, 9 e 22. A fig. 11 mostra AUC (ng/ml/hr) de uma dose oral de SAHA de 200 mg e 400 mg, nos Dias 8, 9 e 22. A figura 12 mostra a biodisponibilidade de 58 SAHA após uma dose oral de 200 mg e 400 mg nos Dias 8, 9 e 22 . EXEMPLO 3

Dosagem oral de suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) - Escalada de Dose

De acordo com uma outra experiência, envolveram-se vinte e cinco pacientes com tumores sólidos do braço A, envolveram-se três pacientes com linfomas de Hodgkin ou não Hodgkin no braço B e envolveu-se um doente com leucemia aguda e um doente com sindrome mielodisplástico no braço C, conforme se ilustra no Quadro 4.

Quadro 4 : Esquema Escalado de Dose e Número de Pacientes em Cada Nivel de Dose

Grupo Dose (mg/dia) Escala de Dosagem N. 0 de Dias de Dosagem Período de Repouso N. ° de Pacientes Envolvidos (Braço A/Braço B/Braço C)* I 200 uma vez ao dia Continuo Nenhum 6/0/0 II 400 uma vez ao dia Continuo Nenhum 5/4/2 III 400 q 12 horas Continuo Nenhum 6/3/0 IV 600 uma vez ao dia Continuo Nenhum 4/3/0 V 200 q 12 horas Continuo Nenhum 4/3/0 VI 300 q 12 horas Continuo Nenhum -/-/- Sub-totais: 25/13/2 Total = 40 *Braço A = tumor sólido, braço B = linfoma, braço C = leucemia

Resultados:

De entre onze pacientes tratados no Grupo II, um paciente experimentou a diarreia DLT de grau 3 e a desidratação de grau 3 durante o primeiro ciclo de 59 tratamento. Nove pacientes entraram no Grupo III. Dois pacientes não foram avaliados quanto à determinação de toxicidade no dia 28 uma vez que houve uma terminação precoce devido à progressão rápida da doença. Dos sete pacientes restantes, cinco experimentaram DLT durante o primeiro ciclo de tratamento: diarreia/desidratação (n=l), fadiga/desidratação (n=l), anorexia (n=l), desidratação (n=l) e anorexia/desidratação (n=l). Estes cinco pacientes recuperaram em aproximadamente uma semana após o estudo do fármaco se ter mantido. Foi-lhes reduzido subsequentemente a dose para 400 mg QD, que parece ser bem tolerada. Os dias médios de 400 mg BID para todos os pacientes no Grupo III foi de 21 dias. Com base nas observações da escala de dosagem de 400 mg ql2 horas julgou-se ter excedido a dose máxima tolerada. Prosseguiu-se o protocolo alterado seguinte no Grupo IV para uma dose de 600 mg uma vez ao dia. Os sete pacientes envolvidos no grupo IV, dois não foram avaliados no dia 28 na avaliação da toxicidade devido a uma terminação precoce do estudo devida a uma progressão rápida da doença. Três pacientes experimentaram DLT durante o primeiro ciclo de tratamento: anorexia/desidratação/ fadiga (N=l), e diarreia/desidratação (n=2). A dose de 600 mg foi consequentemente julgada como tendo excedido a dose

máxima tolerada e a dose de 4 0 0 mg uma vez ao dia foi definida como a dose máxima tolerada para cada administração oral diária. 0 protocolo foi alterado para avaliar níveis adicionais de dose de duas vezes ao dia doseando uma tabela de 2 0 0 mg BID e 300 mg BID administrados continuamente. A análise farmacocinética ínterim foi baseada em 18 pacientes tratados nos níveis de dosagem iguais a 200 mg QD, 400 QD e 400 mg BID. De uma maneira geral, as 60 estimativas médias de Cmax e AUCinf de SAHA administrado por via oral sob uma condição de jejum ou com alimento aumentaram proporcionalmente com a dose na gama de dosagem de 200 mg a 400 mg. Globalmente, a fracção de AUCinf devido a extrapolação era igual a 1% ou inferior. Estimativas médias para semi-vida aparente eram variáveis através destes grupos sob uma condição de jejum ou com alimento, variando entre 61 e 114 minutos. As estimativas médias Cmax, variam entre 233 ng/ml (0,88 μΜ) e 570 ng/ml (2,3 μΜ) . A fracção biodisponível de SAHA calculada a partir dos valores de AUCinf após a infusão IV e vias orais, verificou--se ser de aproximadamente 0,48.

Isolaram-se células mononucleares de sangue periférico pré-terapia, imediatamente pós-perfusão e entre 2-10 horas após a ingestão oral de cápsulas de SAHA para determinar o efeito de SAHA sobre a extensão da acetilação da histona numa célula hospedeira normal. Isolaram-se as histonas e sondaram-se com um anticorpo (H3) de histona anti-acetilada seguida pelo anticorpo secundário HRP. As análises preliminares demonstraram um aumento da acumulação de histonas acetiladas nas células mononucleares periféricas que podiam ser detectadas até 10 horas após a ingestão de cápsulas de SAHA a 400 mg por dia de nivel de dosagem.

Treze doentes continuaram o tratamento durante 3-12 meses com resposta ou doença estável: tiróide (n=3), glândula do suor (n=l), renal (2), laringe (n=l), próstata (n=l), linfoma de Hodgkin (n=2), linfoma de não Hodgkin (n=2), e leucemia (n=l).

Seis doentes apresentaram uma redução tumoral a partir de explorações por tomografia computadorizada ("scans CT"). 61 61 Três desses seis resposta parcial metastático e dois respostas parciais mg BID (n=2) e 600 doentes satisfizeram os critérios de (um doente com cancro da laringe doentes com linfomas não Hodgkin). Essas ocorreram para niveis de dosagem de 400 mg QD (n=l).

As dosagens descritas anteriormente tinham sido administradas duas vezes ao dia de maneira intermitente. Os doentes receberam a SAHA duas vezes ao dia três a cinco dias por semana. Verificou-se a resposta do doente com administração da SAHA duas vezes ao dia a 300 mg durante três dias por semana. EXEMPLO 4

Doseamento Intravenoso de SAHA O quadro 5 mostra uma escala de dosagem para doentes que receberam SAHA por via intravenosa. Os doentes começaram no Grupo I, que recebe 300 mg/m2 de SAHA durante cinco dias consecutivos por semana durante uma semana, para uma dose total de 1500 mg/m2. Os doentes foram então observados durante um período de duas semanas e prosseguiu--se para o Grupo II, prosseguiu-se então através dos Grupos a menos que o tratamento tenha terminado devido a progressão da doença, a regressão do tumor, a efeitos secundários inaceitáveis ou ao doente ter recebido outro tratamento. 62

Quadro 5 : Aumento Padrão da Dose de SAHA - Administrado por Via Intravenosa

Grupo Dose (mg/m2) Número de Dias/Semana Número de Semanas Consecutivas Período de Observação (Semanas) Dose Total (mg/m2) I 300 5 1 2 1500 II 300 5 2 2 3000 III 300 5 3 1* 4500 IV 600 5 3 1* 9000 V 800 5 3 1* 13500 VI 1200 5 3 1* 18000 VII 1500 5 3 1* 22500 *Pacientes Hematológicos com início no nível de dose III. EXEMPLO 5

Tratamento de Mesotelioma com SAHA

Três pacientes com mesotelioma foram envolvidos em estudos de Fase I com SAHA. Aos pacientes administrou-se SAHA oral duas vezes ao dia para uma dose de 300 mg ou 400 mg durante três dias por semana. Observou-se uma resposta parcial após tratamento com SAHA de acordo com o regime anterior durante 6 semanas. A figura 13 é uma exploração por tomografia computadorizada ("scan CT") de um tumor de mesotelioma de um doente, antes (PRE - painel esquerdo) e após (POST -painel direito) tratamento com SAHA duas vezes ao dia para uma dose de 300 mg três dias por semana durante 6 meses. Os resultados demonstram que a SAHA é eficaz no tratamento de tumores de mesotelioma em pacientes.

Muito embora a presente invenção tenha sido particularmente ilustrada e descrita com referência às formas de realização preferidas da mesma, deve entender-se pelos especialistas na matéria que diversas alterações de forma e de pormenor podem ser introduzidos na mesma sem que 63 se verifique um afastamento do significado da invenção descrita. 0 âmbito da presente invenção inclui o objecto das reivindicações que se seguem. 64

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Lisboa 29 de Junho de 2010.

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) representada pela estrutura:

ou de um seu sal ou hidrato aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e de um veiculo ou diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, para a preparação de um medicamento oral para administração a um individuo para o tratamento de mesotelioma.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1., em que o referido medicamento se destina à administração duas vezes por dia em uma dose de 300 mg de maneira intermitente.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 2., em que o referido medicamento se destina à administração três a cinco dias por semana.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 2., em que o referido medicamento se destina à administração três dias por semana.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 1., em que a SAHA é o principio activo no referido medicamento. Lisboa, 29 de Junho de 2010.