WO2015190700A1 - 패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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박현주
이선미
유자경
김소진
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases, containing a histone deacetylase (HDAC) inhibitor as an active ingredient.
  • HDAC histone deacetylase
  • the present invention relates to ( E ) -N -hydroxy-4- (2-styrylthiazol-4-yl) butanamide (( E ) -N -hydroxy-4- (2-styrylthiazol-4-yl ) butanamide), N- (4-fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl-1 H -pyrazole-3-carboxamido) ethyl) thiazole-4-carboxamide ( N- (4-Fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl-1 H -pyrazole-3-carboxamido) ethyl) thiazole-4-carboxamide), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient,
  • Histone deacetylase plays a role in controlling gene expression by regulating deacetylation of histone protein residues.
  • HDAC Histone deacetylase
  • acetylation of histones controlled by acetylases and deacetylases is known to regulate gene expression, it has emerged as a very important concept.
  • histone deacetylase is an important factor in regulating cell tumorigenesis and differentiation by promoting cell proliferation by inhibiting expression of cell proliferation inhibitors.
  • SAHA anti-cancer drug vorinostat
  • SAHA anti-cancer drug vorinostat
  • HDAC inhibitors have significant side effects such as fatigue, diarrhea and thrombocytopenia.
  • CTCL cutaneous T-cell lymphoma
  • adverse reactions such as pulmonary embolism, squamous cell carcinoma and anemia and sepsis have been reported in CTCL patients regardless of their association with this drug.
  • HDAC inhibitors have a limitation that more effective treatment results can be obtained when they are used together with other therapeutic agents rather than only one, there is a growing interest in developing new HDAC inhibitors to overcome these problems. .
  • histone deacetylase inhibitors effectively suppress excessive inflammatory reactions in addition to anticancer use, thereby increasing the potential as therapeutic agents for immune-related diseases.
  • histone deacetylase inhibitors inhibit excessive inflammatory responses has been reported.
  • Sepsis is a representative disease of systemic inflammatory reactions.
  • TNF- ⁇ , IL which mediates or promotes inflammatory responses for the treatment of sepsis, is based on the overactivation of the inflammatory system during initial sepsis, a major clinical feature of the onset.
  • mediators such as -6 and IL-1
  • HDAC histone deacetylase
  • the present invention aims to find a novel HDAC inhibitor having little side effects and excellent anti-inflammatory effect.
  • the present invention is to provide a novel hydroxamate-based and non-hydroxyxamate-based HDAC inhibitors that can be used as a preventive or therapeutic agent for sepsis or septic shock through structure-based virtual search and synthesis.
  • the invention to the general formula (I) of (E) - N - hydroxy-4- (2-styryl-4-yl) butane amide ((E) - N -hydroxy- 4- (2-styrylthiazol-4 -yl) butanamide) (hereinafter referred to as "9a" compound), N- (4-fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl-1 H -pyrazole-3-ka) Copymido) ethyl) thiazole-4-carboxamide ( N- (4-Fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl- 1H -pyrazole-3-carboxamido) ethyl) thiazole-4-carboxamide) ( Hereinafter, referred to as "8e” compound), or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of ( E ) -N -hydroxy-4- (2-styrylthiazol-4-yl) butanamide (( E ) -N -hydroxy-4- (2- styrylthiazol-4-yl) butanamide), N- (4-fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl- 1H -pyrazole-3-carboxamido) ethyl) thiazole-4-car carboxamide (N - (4-Fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl-1 H -pyrazole-3-carboxamido) ethyl) thiazole-4-carboxamide), or a pharmaceutically acceptable salts of the object It provides a method for the prevention or treatment of inflammatory diseases comprising the step of administering to.
  • the present invention provides a pharmaceutically effective amount of ( E ) -N -hydroxy-4- (2-styrylthiazol-4-yl) butanamide (( E ) -N -hydroxy-4- (2- styrylthiazol-4-yl) butanamide), N- (4-fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl- 1H -pyrazole-3-carboxamido) ethyl) thiazole-4-car Radical amide ( N- (4-Fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl-1 H -pyrazole-3-carboxamido) ethyl) thiazole-4-carboxamide) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for inflammatory diseases It provides a method used for the prevention or treatment of.
  • the ( E ) -N -hydroxy-4- (2-styrylthiazol-4-yl) butanamide is characterized in that the histone deacetylase (HDAC) inhibitor.
  • HDAC histone deacetylase
  • the ( E ) -N -hydroxy-4- (2-styrylthiazol-4-yl) butanamide is characterized in that it is a histone deacetylase 6 (HDAC6) inhibitor.
  • HDAC6 histone deacetylase 6
  • the N- (4-fluorophenethyl) -2- (2- (5-methyl-1 H -pyrazole-3-carboxamido) ethyl) thiazole-4- Carboxamide is characterized by being a histone deacetylase (HDAC) inhibitor.
  • HDAC histone deacetylase
  • the inflammatory disease is characterized in that sepsis or septic shock.
  • the present invention can provide a novel target protein for the treatment of inflammatory diseases including sepsis or septic shock.
  • the present invention can provide a therapeutic use for inflammatory diseases including sepsis or septic shock as a novel use of histone deacetylase inhibitors.
  • the use of the newly synthesized histone deacetylase inhibitors in the present invention can provide an effective treatment for sepsis and septic shock.
  • FIG. 2 shows the results of analysis of inflammatory cytokine TNF- ⁇ (FIG. 2A), IL-6 (FIG. 2B), and NO (FIG. 2C) production changes in order to confirm anti-inflammatory responses to the 9a and 8e compounds of the present invention. to be.
  • Figure 3a is the observation of the survival rate of CLP-induced sepsis for the 9a compound of the present invention
  • Figure 3b is a result of the observation of the survival rate of CLP-induced sepsis for the 8e compound of the present invention.
  • FIG. 4A is a result of histone deacetylase inhibitory activity of the compound 9a of the present invention
  • FIG. 4B is a result of histone deacetylase inhibitory activity of the compound 8e of the present invention.
  • FIG. 5 is a result of analyzing the inhibitory effect of sepsis-derived hyperinflammatory response to the compounds 9a and 8e of the present invention
  • Figure 5a shows the TNF- ⁇ production inhibitory effect
  • Figure 5b shows the IL-6 production inhibitory effect.
  • a newly synthesized histone deacetylase inhibitor successfully inhibits multiple organ dysfunction syndrome (MODS) associated with overactivation of inflammatory cytokines due to sepsis and further damage to organs. It was confirmed that by lowering it can be effectively used in the development of sepsis and septic shock therapy.
  • MODS organ dysfunction syndrome
  • HDAC inhibitory effects are obtained through modification and optimization steps for the lead material selected in the search using a structure-based virtual search technology. Materials with visible or non-hydroxamate structures were obtained.
  • structure-based ligand design refers to homology modeling based on known three-dimensional structures of biomolecules such as receptors and enzymes, or known protein structures having similarities.
  • structural models it refers to a method of searching for substances that can bind to and regulate their activity.
  • the HDAC enzymatic assay was performed and two hit ligands showing histone deacetylase inhibitory effects were identified.
  • HDAC enzymatic assays were performed to introduce hydroxamate functional groups for derivative synthesis of hit ligands with inhibitory activity or to develop lead compounds through derivative synthesis.
  • a second virtual search was conducted on a compound library of more than 90% purity to purchase 11 compounds having thiazol rings in common in the spacer region.
  • HDAC enzymatic assay was performed.
  • three hit ligands showing HDAC inhibitory effects were identified, and 13 derivatives thereof were synthesized and subjected to HDAC enzymatic assay.
  • the Zn-binding group was methyl pyrazole N- (4-fluorophenethyl).
  • HDAC6 histone deacetylation of ⁇ -tubulin and histone, respectively. It was.
  • 9a and 8e compounds synthesized in the present invention using the animal model to investigate the in vivo HDAC inhibitory activity and anti-septic effect.
  • these compounds significantly reduced IL-6, TNF- ⁇ , and NO, which were increased by systemic excessive inflammatory responses due to sepsis.
  • ALT, AST, BUN, creatinine and LDH which are representative biomarkers of multi-organ dysfunction, were also effectively reduced.
  • 9a and 8e compounds statistically significantly increased survival in sepsis.
  • compositions of the present invention may further comprise components such as existing therapeutically active ingredients, other adjuvants, pharmaceutically acceptable carriers and the like.
  • pharmaceutically acceptable carriers include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like.
  • ⁇ means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle, etc. Mean mammal.
  • pharmaceutically effective amount means the type and severity of the disease to be administered, the age and sex of the patient, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of administration, the duration of treatment, the factors including the concurrent drug and other medicines It is determined according to factors well known in the art and can be easily determined by those skilled in the art in such an amount that the maximum effect can be obtained without side effects in consideration of all the above factors.
  • composition of the present invention is not limited in the method of administration as long as it can reach the target tissue.
  • examples include oral administration, arterial injection, intravenous injection, transdermal injection, intranasal administration, coronary administration or intramuscular administration.
  • the daily dosage is about 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times a day.
  • the X-ray crystal structure (PDB id 1C3R) of HDLP (Histone Deacetylase-Like Protein) bound to HDSA inhibitor TSA (Trichostatin A) was used as the target receptor structure.
  • Pharmacological groups were constructed using the Unity program and 3D ligand searches of about 100,000 compounds were performed.
  • the pharmacological group of TSA designated the aromatic ring structure as an essential hydrophobic center and set the distance between the hydrophobic center and the hydroxamate structure to 9.05 ⁇ 0.1 mm 3.
  • the aliphatic chain connecting the aromatic ring structure of the TSA and the hydroxysamate structure was left as an essential structure, and both ends were replaced with other atoms or structures.
  • the hydroxyl structure of TSA was left as an essential structure and the OH at the end was set to be substituted with another atom or structure.
  • the phenolic-OH of Tyr297, which forms the essential hydrogen bond with hydroxamate, was designated as a hydrogen bond H-donor and set up to search for hydrogen bond H-acceptors within a radius of 2 ms. 2,503 compounds satisfying this pharmacological group were selected as the primary hit list.
  • the first hit list was subjected to rigid docking to the HDLP active site (TSA binding site) using DOCK4.0 program, and 2,032 compounds that stably bind to the active site were selected second. They were rescanned by flexible docking using FlexX program, and 315 ligands with high binding energy ranking were selected. After predicting the HDAC inhibitory activity of these tertiary selected ligands using the 3D-QSAR / CoMSIA model for the existing HDAC inhibitor, non-hydroxamate MS-275 (N- (2-Aminophenyl) -4- [N- (164 candidate compounds predicted to have higher inhibitory activity than pyridine-3ylmethoxycarbonylaminomethyl] benzamide) were selected.
  • a virtual drug search was performed on 27,390 compounds of the LeadQuest database, which is a commercially available compound library of 95% purity or higher, as follows.
  • 301 ligands having a high binding energy ranking were selected while forming two or more hydrogen bonds with Tyr297 and His131 or His132.
  • HDAC inhibitory activity values of these secondary selected ligands were predicted using the 3D-QSAR / CoMSIA model for existing HDAC inhibitors, followed by non-hydroxamate MC-275 (N- (2-Aminophenyl) -4- [N- (Priridine-3ylmethoxycarbonyl) aminomethyl] benzamide) was selected after the final selection of 50 candidate compounds predicted to have higher inhibitory activity.
  • Example 1-1 Since the two hydroxamate hit ligands obtained in Example 1-1 had a styrylthio-propanamide structure in common, amide was substituted with a hydroxamate group as a Zn-binding group, and a styrylthio group as a styryl thiazol group as a spacer to increase inhibitory activity.
  • Substituted 9a compound was synthesized as follows.
  • Phosphorus pentasulfide (1.11 g, 5 mmol) was added to a stirred solution of cinnamamide (1.47 g, 10 mmol) compound 5 in pyridine anhydride (4.4 mL), and the resulting yellow / orange solution was added for 2 hours. Heated under reflux and cooled at room temperature. Water (10 mL) was poured into the mixture, followed by extraction with diethyl ether (3 ⁇ 10 mL). The extract was washed with 1N-HCl and water and dried over MgSO 4 .
  • Example 1-1 Based on the successful results obtained in Example 1-1, a second virtual search was performed on a library containing about 27,000 compounds having a purity of 90% or more and 90% purity to further discover a non-hydroxamate-based HDAC inhibitor. Eleven compounds with thiazol rings replaced with linkers were purchased and subjected to the HDAC enzymatic assay.
  • tert- butyl2- (4- (4-fluorophenethylcarbamoyl) thiazol-2-yl) ethylcarbamate (66.8 mg, 0.17 mmol) was dissolved in TFA (2 mL) and methylene chloride (2 mL), and the reaction mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The organic solvent was evaporated in vacuo. The resulting product was diluted with water, basified with saturated aqueous sodium bicarbonate solution to pH 8 and extracted with methylene chloride. The organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and evaporated to give 7e compound (29.2 mg). The residue was used for next step without further purification.
  • Pan-HDAC fluorescence activity was determined using Fluor de Lys (Biomol, Plymouth Meeting, PA) having an acetylated lysine side chain, and the SPECTRAmax GEMINI XS microplate spectrofluorometer and SOFTMAX PRO V.3.1. 2 systems (Molecular Devices) were used (Ex 355 nm, Em 460 nm, cut off filter 455 nm).
  • the total reaction volume for pan-HDAC analysis was 25 ul, and all assay components were diluted with HDAC assay buffer (50 mM Tris / Cl, pH8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl and 1 mM MgCl 2 ).
  • HDAC assay buffer 50 mM Tris / Cl, pH8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl and 1 mM MgCl 2 ).
  • the reaction was carried out on half-volume white 96-well plates (Costar3693).
  • the pan-HDAC assay mixture contains 9a and 8e compounds as HDAC substrates, rhHDAC isoforms and inhibitors, and the positive control is MS-275 (N- (2-Aminophenyl) -4- [N- (pyridine-3ylmethoxycarbonyl) aminomethyl] benzamide )
  • the negative control contains neither HDAC nor inhibitor.
  • reaction solution was reacted for 20 minutes at room temperature, diluted 20 times with cold assay buffer, and quenched with 25ul of HDAC-FDL Developer (KI-105; Biomol) containing 2uM TSA.
  • HDAC-FDL Developer KI-105; Biomol
  • the plate was allowed to react for 20 minutes at room temperature to develop a fluorescent signal.
  • Final HDAC inhibitory activity results were calculated for each IC50 value using the GraphPad Prism 4.0 program.
  • Dispense RAW264.7 cells into 96 well plates 9a compounds at 0, 0.1, 0.5, 2.5, 12.5 and 62.5 uM concentrations, 8e compounds at 0, 0.1, 0.5, 2.5, 12.5, 62.5, 312.5 and 1562.5 uM concentrations Each was treated for 24 hours. After 24 hours, MTT solution was added and reacted for 4 hours, and then the change in absorbance was measured at 540 nm.
  • 9a compound showed no cytotoxicity at concentrations of 0.1, 0.5, 2.5, 12.5uM, and showed a slight cytotoxicity at a high concentration of 62.5uM.
  • the 8e compound showed no cytotoxicity at concentrations of 0, 0.1, 0.5, 2.5, 12.5, 62.5, and 312.5 uM, and showed cytotoxicity at a high concentration of 1562.5 uM.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • TNF- ⁇ and IL-6 After inducing macrophage activation by administration of Lipopolysaccharide (LPS), secretion of TNF- ⁇ and IL-6 to confirm that 9a and 8e compounds alter inflammatory cytokine (TNF- ⁇ and IL-6) production Concentration was measured by ELISA method. That is, 23 hours after dispensing RAW264.7 cells into 24 wells, 9a and 8e compounds were treated at 0, 0.1, 0.5, 2.5, 12.5 and 62.5 uM concentrations, respectively. LPS was treated after 1 hour and TNF- ⁇ and IL-6 concentrations were measured using an ELISA kit (BD Biosciences, USA) after 24 hours.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • 9a and 8e compounds were found to inhibit TNF- ⁇ and IL-6 overproduction of LPS-induced macrophages.
  • the secretion concentration of NO was measured by the NO assay method. That is, the measurement of the secretion concentration of NO was carried out in the same manner as the inflammatory cytokine concentration measurement except that the reaction end was reacted with the griess reagent and then the change in absorbance was measured at 540 nm.
  • mice 8-week-old C57BL / 6 male mice (Orient Bio Co., Ltd.) were purified for 7 days or more in a breeding room where brightness was controlled at 12 ⁇ 1 ° C, relative humidity 55 ⁇ 15%, and roughness 300-500 Lux. After visual observation, only normal animals were used for the experiment, and solid feed and water for experimental animals were ingested freely.
  • mice were intraperitoneally injected with anesthetics, followed by cecal ligation and puncture (CLP) to induce sepsis. That is, the medial abdominal incision was made and the cecum was exposed to the outside, so that the end of the ileocecal valve was ligated with silk sutures and two holes were made in the cecum using a needle. The caecum, including fecal matter, was put back into the abdominal cavity and sutured, and 4 ml / 100 g b.wt. of saline was injected through subcutaneous injection.
  • CLP cecal ligation and puncture
  • the 9a compound was dissolved in physiological saline at 5, 10 and 20 mg / kg concentrations and the 8e compound at 10 and 20 mg / kg concentrations, respectively, and was intraperitoneally injected 2 hours before and immediately after CLP.
  • Drug administration was performed by dissolving 9a and 8e compounds in physiological saline at 10 mg / kg each, and intraperitoneal injection two times before and immediately after CLP.
  • Drug administration was performed by dissolving 10 mg / kg of 9a and 8e compounds in physiological saline, respectively, and intraperitoneal injection two times before and immediately after CLP.
  • TNF- ⁇ and IL-6 concentrations were measured using the ELISA kit (BD Biosciences, USA).
  • the concentration of TNF- ⁇ and IL-6 was significantly suppressed in sepsis after administration of 9a and 8e compounds in the serum of CLP-induced sepsis mice.
  • 9a and 8e compounds inhibit the production of inflammatory cytokines in sepsis, thereby suppressing the over-inflammatory response in sepsis.
  • Drug administration was performed by dissolving 10 mg / kg of 9a and 8e compounds in physiological saline, respectively, and intraperitoneal injection two times before and immediately after CLP.
  • ALT Alanine aminotransferase
  • AST glutamic oxaloacetic transaminase
  • BUN blood urea nitrogen
  • creatinine concentrations were measured to observe the extent of impairment of renal function.
  • lactate dehydrogenase (LDH; lactate dehydrogenase, hereinafter referred to as LDH) concentration was measured to evaluate the extent of tissue cell damage.
  • the 9a compound produced by the computer-aided drug design method inhibits the production of pro-inflammatory cytokines associated with selective inhibition of HDAC6.
  • Tubastatin A a selective inhibitor of HDAC6, is positive for HDAC6 and HDAC1.
  • Each HDAC enzymatic assay was compared.
  • the fluorescent activity for the detection of the inhibitory effect of HDAC6 and HDAC1 of 9a compound was based on Fluor de Lys-SIRT1 (Biomol, Plymouth Meeting, PA) having an acetylated lysine side chain, Measured by plus (PROMEGA) (excitation 340 ⁇ 360nm, emission 440 ⁇ 460nm).
  • HDAC assay buffer I 50 mM Tris / Cl, pH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl 2
  • HDAC assay buffer II 50 mM Tris / Cl, pH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 1 mg / ml BSA.
  • Analytical mixtures of HDAC6 and HDAC1 include Fluor de Lys-Substrate, HDAC isoform, and HDAC inhibitors.
  • the positive control group and the negative control group used Tubastatin A compound and DMSO, respectively.
  • the reaction solution was reacted at room temperature for 20 minutes, treated with Developer II diluted with HDAC assay buffer I, and then reacted at room temperature for about 15 minutes to detect fluorescent signals.
  • the HDAC6 IC 50 value of the 9a compound was 199.3 nM by the enzymatic assay, and the HDAC1 IC 50 value was 13805 nM, which showed a 70-fold selective inhibition effect on HDAC6. It was.
  • HDAC6 present in the cytoplasm tends to induce deacetylation of ⁇ -tubulin in the cytoplasm regardless of deacetylation of histones in the nucleus. Through the change of the amount, the intracellular HDAC6 selective inhibition of 9a compound was further confirmed.
  • HeLa cell lysates were extracted 24 hours after treatment with Trichosatidin A (TSA), Tubastatin A and 9a compounds in HeLa cells (cervical cancer cells) cultured in 6well plates at concentrations of 2, 2 and 10 ⁇ M, respectively.
  • TSA Trichosatidin A
  • Tubastatin A 9a compounds in HeLa cells (cervical cancer cells) cultured in 6well plates at concentrations of 2, 2 and 10 ⁇ M, respectively.
  • acetylated ⁇ -tubulin and acetylated histone H3 antibodies were compared.
  • Tubastatin A has a selective inhibitory effect of HDAC6 as a positive control group
  • TSA does not have a selective inhibitory effect of HDAC6 as a negative control group
  • these two types of HDAC inhibitors and 9a compound was treated at the above concentration, As shown in 8 (a), it was confirmed that the amount of acetylated histone H3 was increased only in the TSA treatment group.
  • tubastadin A and 9a compounds were treated at different concentrations (0.01, 0.1, 1, 10 ⁇ M) to observe changes in the expression levels of acetylated ⁇ -tubulin and acetylated histone H3.
  • Tubastatin A was found to increase the acetylated ⁇ -tubulin at 0.1 ⁇ M concentration
  • 9a compound was confirmed to increase from 1 ⁇ M
  • acetylated histone H3 was expressed in both substances The change in could not be confirmed.

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Abstract

본 발명은, 히스톤 디아세틸라아제(HDAC) 저해제를 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 본 발명은 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드, N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 패혈증 및 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 부작용이 거의 없고 패혈증 치료 효과가 뛰어난 신규 HDAC 저해제 화합물을 제공할 수 있다.

Description

패혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은, 히스톤 디아세틸라아제(HDAC) 저해제를 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드 ((E)-N-hydroxy-4-(2-styrylthiazol-4-yl)butanamide), N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드(N-(4-Fluorophenethyl)-2-(2-(5-methyl-1H-pyrazole-3-carboxamido)ethyl) thiazole-4-carboxamide), 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 패혈증 및 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
히스톤 디아세틸라아제(HDAC, histone deacetylase)는 히스톤 단백질 잔기의 탈아세틸화를 조절함으로써 유전자의 발현을 제어하는 역할을 한다. 아세틸라아제 및 디아세틸라아제에 의하여 조절되는 히스톤의 아세틸화가 유전자 발현을 조절함이 알려지면서 매우 중요한 개념으로 부각되고 있다. 특히, 히스톤 디아세틸라아제는 세포증식 억제인자의 발현을 저해함으로써 세포증식을 촉진시켜 세포의 종양화 및 분화를 조절하는데 중요한 인자이다. 따라서, HDAC 활성 억제는 암을 비롯한 기타 다른 질병 치료를 위한 표적으로 많은 주목을 받아 왔다. 대표적으로 미국 식약청에 의해 허가된 항암제인 보리노스타트(SAHA)가 최근 항암뿐만 아니라 항염증의 이중 작용을 가지고 있다는 것이 발표되었다.
그러나, 현재 임상에서 피부 T세포 림프종 (CTCL) 환자의 치료제로 사용되고 있는 HDAC 억제제로서 hydroxamate 구조를 가진 보리노스타트 약물은 피로, 설사 구역, 혈소판 감소증 등 상당히 많은 부작용을 수반하고 있다. 또한, 임상시험에서 CTCL 환자에게서 이 약물과의 연관성에 상관없이 폐색전증, 편평세포암종 및 빈혈, 패혈증 등의 중대한 이상반응이 보고되었다. 더욱이, HDAC 저해제는 한가지 만을 사용하는 것 보다는 다른 치료제와 병용하였을 경우 좀 더 효과적인 치료결과를 얻을 수 있다는 한계가 있기 때문에, 이러한 종래 문제를 극복하기 위해 새로운 HDAC 저해제 개발에 대한 관심이 높아지고 있는 실정이다.
최근 히스톤 디아세틸라아제 억제제가 항암 용도 이외에 과도한 염증반응을 효율적으로 억제한다는 것이 밝혀짐으로써 면역관련 질환에 대한 치료제로서의 가능성이 부각되고 있다. 그러나, 현재 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제가 어떻게 과도한 염증반응을 억제시키는지에 대한 명확한 발병기전은 보고되지 않고 있다.
한편, 패혈증은 전신 염증반응의 대표적 질환으로 발병과정에서 나타나는 임상적 주요 특성인 초기 패혈증시의 염증계의 과활성화를 바탕으로, 패혈증의 치료를 위하여 염증반응을 매개하거나 촉진하는 TNF-α, IL-6, IL-1과 같은 매개체를 억제하려는 수많은 시도가 있으나 현재까지 환자의 생존율을 크게 개선하지 못하고 있는 실정이다.
패혈증은 전세계적으로 중환자실 이환율 및 사망률의 주요한 원인으로 미국의 경우 해마다 750,000명의 패혈증 환자가 발생하며 이 중 210,000명이 사망하는 치사율이 매우 높은 질환이다. 국내에서도 정확한 통계는 없지만 매우 높은 발병률을 나타내고 있다. 패혈증 치료제는 전 세계적으로 릴리사의 자이그리스 (Xigris)가 유일하였으나, 2010년 시장에서 퇴출됨으로써 현재 패혈증 치료약물은 전 세계적으로 없는 실정이다. 따라서 패혈증 치료약물의 개발은 임상적으로 상당한 의의를 가지며 치료제의 시장성도 매우 크다고 할 수 있다.
히스톤 디아세틸라아제 (HDAC)의 과발현 상태에서 p53, p21 및 gelsolin 등의 종양억제인자는 발현이 억제되어 종양화의 원인이되므로, HDAC 억제제는 히스톤의 과아세틸화와 세포사멸를 유도하는 항암제로 많은 개발 연구가 보고되고 있으나, 아직까지 항암 이외에 패혈증 억제효과가 있는 HDAC 저해제는 개발된 사례가 없다.
이에, 본 발명은 부작용이 거의 없고 항염증 효과가 뛰어난 신규의 HDAC 억제제를 발굴하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, 본 발명에서는 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 예방 또는 치료제로 사용할 수 있는 새로운 하이드록사메이트계 및 비하이드록사메이트계 HDAC 억제제를 구조기반 가상검색 및 합성을 통하여 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 하기 화학식 1의 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드 ((E)-N-hydroxy-4-(2-styrylthiazol-4-yl)butanamide) (이하, "9a" 화합물이라 한다), 하기 화학식 2의 N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드(N-(4-Fluorophenethyl)-2-(2-(5-methyl-1H-pyrazole-3-carboxamido)ethyl) thiazole-4-carboxamide) (이하, "8e" 화합물이라 한다), 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2015004300-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2015004300-appb-I000002
또한, 본 발명은, 약학적으로 유효량의 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드 ((E)-N-hydroxy-4-(2-styrylthiazol-4-yl)butanamide), N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드(N-(4-Fluorophenethyl)-2-(2-(5-methyl-1H-pyrazole-3-carboxamido)ethyl) thiazole-4-carboxamide), 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 약학적으로 유효량의 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드 ((E)-N-hydroxy-4-(2-styrylthiazol-4-yl)butanamide), N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드(N-(4-Fluorophenethyl)-2-(2-(5-methyl-1H-pyrazole-3-carboxamido)ethyl) thiazole-4-carboxamide) 또는 이것의 약학적으로 허용가능한 염을 염증성 질환의 예방 또는 치료에 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드는 히스톤 디아세틸라아제(HDAC) 저해제인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드는 히스톤 디아세틸라아제6(HDAC6) 저해제인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드는 히스톤 디아세틸라아제(HDAC) 저해제인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 염증성 질환은 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 기존의 HDAC 저해제의 항암 용도 범위를 뛰어넘는 새로운 치료제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 포함한 염증성 질환의 치료를 위한 신규 타깃 단백질을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 히스톤 디아세틸라아제 저해제의 신규용도로서 패혈증 또는 패혈성 쇼크를 포함한 염증성 질환의 치료용도를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에서 새로이 합성된 히스톤 디아세틸라아제 저해제를 이용할 경우, 패혈증 및 패혈증성 쇼크에 대한 효과적인 치료법을 제공할 수 있다.
도 1은, 본원발명의 9a 및 8e 화합물에 대한 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시한 결과이다.
도 2는, 본원발명의 9a 및 8e 화합물에 대한 항염증 반응을 확인하기 위하여 염증성 사이토카인 TNF-α(도 2A)과 IL-6(도 2B) 및 NO(도 2C) 생성 변화를 분석한 결과이다.
도 3a는 본원발명의 9a 화합물에 대한 CLP 유도 패혈증의 생존율 관찰 결과이고, 도 3b는 본원발명의 8e 화합물에 대한 CLP 유도 패혈증의 생존율 관찰 결과이다.
도 4a는, 본원발명의 9a 화합물에 대한 히스톤 디아세틸라아제 억제능 분석 결과이고, 도 4b는 본원발명의 8e 화합물에 대한 히스톤 디아세틸라아제 억제능 분석 결과이다.
도 5는, 본원발명의 9a 및 8e 화합물에 대한 패혈증 유래 과염증 반응 억제 효과를 분석한 결과로서, 도 5a는 TNF-α 생성 억제 효과를, 도 5b는 IL-6 생성 억제 효과를 나타낸다.
도 6은, 본원발명의 9a 및 8e 화합물에 대한 패혈증 유래 다장기 손상 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 7은, 본원발명의 9a 화합물에 대한 HDAC6와 HDAC1 억제능 비교를 위하여, HDAC enzymatic assay를 실시한 결과이다.
도 8은, 본원발명의 9a 화합물에 대한 HDAC6의 선택적 억제능 확인을 위하여, 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과이다.
본 발명에서는 새로이 합성된 히스톤 디아세틸라아제 저해제가 패혈증으로 인한 염증성 사이토카인의 과활성화와 더 나아가 장기의 손상과 관련된 다장기 기능부전증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)을 억제하여 사망률을 성공적으로 낮춤으로써 패혈증 및 패혈증성 쇼크 치료제 개발에 효과적으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
우선, 종래 알려지지 않은 신규의 히스톤 디아세틸라아제 저해제를 발굴하기 위하여, 구조 기반 가상 검색 기술을 이용하여 검색에서 선별된 선도물질에 대해서는 변형(modification)과 최적화(optimization) 단계를 거쳐 HDAC 억제 효과를 보이는 hydroxamate 구조 또는 non-hydroxamate 구조를 가진 물질을 확보하였다.
이때, 구조 기반 가상 검색 기술(Structure-Based Ligand Design)이란, 수용체나 효소와 같은 생체거대분자의 3차원 구조가 밝혀지거나, 기존에 유사성을 갖는 알려진 단백질 구조를 바탕으로 상동성 모델링(homology modeling) 연구를 수행하여 구조 모델을 확보한 경우, 이들 단백질에 결합하여 활성을 조절할 수 있는 물질을 탐색하는 방법을 말한다.
이 방법 중 하나는 컴퓨터를 이용하여 대규모 화합물군(chemical library)의 데이터베이스를 표적 수용체에 도킹시켜 스크리닝하는 가상 약효 검색법 (virtual screening)이 있는데, 수십만개의 방대한 화합물을 대상으로 robotics 시설을 이용, assay를 수행하여 약물선도물질을 발굴하는 고효율 약효검색(HTS) 기술에 비해 경비와 시간이 많이 절감되는 장점이 있다. 최근 가상 약효 검색법으로 뛰어난 활성을 가진 선도 화합물을 찾아낼 확률과 도킹된 구조의 예측력을 향상시킨 연구방법들이 축적되면서 빠르게 유의성있는 선도화합물을 발굴한 연구결과들이 많이 보고되고 있다.
본 발명에서도, 1차적으로 이러한 가상 약효 검색법 (virtual screening)을 통하여, 상용화된 화합물 라이브러리인 Specs와 Chemdiv 데이터베이스의 약 10만개 화합물을 대상으로 가상검색을 수행함으로써 히스톤 디아세틸라아제 활성부위에 결합력이 우수할 것으로 예측되는 화합물을 구매한 후, HDAC enzymatic assay를 수행한 결과 히스톤 디아세틸라아제 억제 효과를 보이는 선도(hit) 리간드 2종을 발굴하였다. 즉, HDAC enzymatic assay를 수행하여 억제활성이 있는 hit 리간드들의 유도체 합성으로 hydroxamate 기능단을 도입하거나 유도체 합성을 통해 리드 화합물을 개발하였다.
상기 hit 리간드 2종이 공통적으로 styrylthio-propanamide 구조를 가지고 있었으므로 억제활성을 높이기 위해 Zn-binding group으로서 amide를 hydroxamate group으로 치환시키고, spacer로서 styrylthio group을 styryl thiazol group으로 치환하는 최적화 과정을 거쳐, 최종적으로 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드(이하, "9a" 화합물이라 함)을 합성하였다.
또한, 첫 번째 가상검색의 성공적인 결과를 바탕으로 non-hydroxamate계 억제제를 찾고자 순도 90% 이상의 화합물 라이브러리를 대상으로 두 번째 가상검색을 수행하여 spacer부분에 공통적으로 thiazol ring을 가진 11개의 화합물을 구매하여 HDAC enzymatic assay를 수행하였다. 그 결과 HDAC 억제 효과를 보이는 hit리간드 3종을 발굴하였으며, 이의 유도체 13종을 합성하여 HDAC enzymatic assay를 수행하여, 그 중 최종적으로 Zn-binding group이 methyl pyrazole인 N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드(이하, "8e" 화합물이라 함)이 HDAC억제 활성이 IC50 = 0.1M로서 가장 뛰어남을 확인하였다.
또한, 9a 화합물에 대하여 HDAC enzymatic assay와 western blot analysis 를 수행함으로써, HDAC6에 대하여 선택적인 억제효과를 보이는 리간드인지 확인하였다. 이를 위해, 현재 HDAC6 선택적 억제제로 널리 알려져 있는 Tubastatin A를 양성대조군으로 하였으며, α-tubulin과 히스톤의 탈아세틸화에 관여하는 HDAC6와 HDAC1에 대하여 각각 enzymatic assay를 실시하여 Tubastatin A와 함께 그 효능을 비교하였다. 그 결과, 9a 화합물이 나타내는 HDAC6에 대한 억제활성은 IC50 = 199.3nM로서, HDAC1에 대한 억제활성에 비하여 70배 이상의 선택성을 보임을 알 수 있었다.
이어서, 9a 화합물을 세포에 농도별로 처리한 후 웨스턴 분석을 실시한 결과, 히스톤이 탈아세틸화되면서 아세틸-히스톤은 관찰되지 않았으나, 아세틸-α-tubulin은 증가되는 현상이 관찰되었다. 이러한 결과는, 9a 화합물이 HDAC6에 대하여 선택적인 억제활성을 지닌 화합물임을 더욱 입증하는 것이다.
또한, 본 발명에서 합성된 9a 및 8e 화합물에 대하여 동물 모델을 이용하여 in vivo HDAC 억제활성 및 항패혈증 효과를 규명하였다. 그 결과, 이들 화합물은 패혈증에 의한 전신적 과도한 염증반응에 의해 증가한 IL-6, TNF-α, NO를 유의적으로 감소시켰다. 또한, 다장기 기능 부전의 대표적인 바이오마커인 ALT, AST, BUN, creatinine 및 LDH도 효율적으로 감소하였다. 최종적으로 9a 및 8e 화합물은 패혈증 상황에서 생존율을 통계적으로 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과는 9a 및 8e 화합물이 패혈증 상황에서 최종적으로 과도한 염증반응을 억제함으로써 패혈증 상황에서 보호적 작용을 한다는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한 본 발명에서 "약제학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 가상약효검색(Virtual Screening) 및 후보 약물 합성
1-1. 가상 약효 검색(Virtual Screening)
상용화된 화합물 라이브러리인 Specs와 Chemdiv 데이터베이스의 약 10만개 화합물을 대상으로 다음과 같은 방법으로 가상 약효 검색을 수행하였다.
HDAC 억제제인 TSA (Trichostatin A)가 결합된 HDLP (Histone Deacetylase-Like Protein)의 X-ray 결정구조 (PDB id = 1C3R)를 타겟 수용체 구조로 사용하였다. Unity 프로그램을 이용하여 약리단을 구축하고 약 10만개 화합물의 3D 리간드 검색을 수행하였다. TSA의 약리단은 방향족 환구조를 필수적인 소수성 센터로 지정하였고, 소수성 센터와 하이드록사메이트 구조와의 거리를 9.05±0.1Å로 설정하였다. TSA의 방향족 환구조와 하이드록사메이트 구조사이를 연결하는 지방족 사슬을 필수 구조로 남기고 양쪽 끝을 다른 원자나 구조로 치환 될 수 있도록 설정하였다. 지방족 사슬 양쪽 끝과 각각 연결되는 방향족 환구조 및 하이드록사메이트 구조와의 거리를 각각 3.97±0.1Å, 2.45±0.1Å로 지정하였다. TSA의 하이드록사메이트 구조를 필수 구조로 남기고 끝의 OH를 다른 원자나 구조로 치환될 수 있도록 설정하였다. 하이드록사메이트와 필수적인 수소 결합을 형성하는 Tyr297의 페놀성-OH를 수소결합 H-공여자로 지정하고 반경 2Å 이내에 수소결합 H-수용자를 검색할 수 있도록 설정하였다. 이렇게 지정된 약리단을 만족하는 2,503개의 화합물이 1차 hit list로 선정되었다.
1차 hit list를 DOCK4.0 프로그램을 이용하여 HDLP 활성부위 (TSA 결합부위)에 rigid 도킹을 수행하였고, 활성부위에 안정하게 결합하는 2,032개 화합물을 2차 선정하였다. 이들을 FlexX 프로그램을 이용한 flexible 도킹으로 재검색하였고, 결합에너지 랭킹이 높은 리간드 315개를 3차 선정하였다. 기존 HDAC 억제제에 대한 3D-QSAR/CoMSIA 모델을 이용하여 이들 3차 선별된 리간드들의 HDAC 억제 활성값을 예측한 후, non-hydroxamate MS-275(N-(2-Aminophenyl)-4-[N-(pyridine-3ylmethoxycarbonyl)aminomethyl]benzamide)보다 억제 활성이 뛰어나게 예측된 164개 후보 화합물들을 최종 선정하여 구매 후 활성테스트를 수행하였다.
순도 95% 이상의 상용화된 화합물 라이브러리인 LeadQuest 데이터베이스 27,390개의 화합물을 대상으로 다음과 같은 방법으로 가상 약효 검색을 수행하였다. HDAC 억제제인 TSA (Trichostatin A)가 결합된 HDLP (Histone Deacetylase-Like Protein)의 X-ray 결정구조 (PDB id = 1C3R)를 타겟 수용체 구조로 사용하였다. FlexX-Pharm 프로그램을 이용한 가상검색을 수행하기 위해 TSA가 결합된 활성부위에서 약리단 constraints (필수적인 수소결합 H-공여자로서 Tyr297의 페놀성-OH, 필수적인 소수성 센터로서 TSA의 방향족 환구조, 필수적인 금속이온 Zn2 +, 선택적인 수소결합 H-수용자로서 His131과 His132의 이미다졸환의 질소)으로 설정하였다. FlexX-Pharm 검색을 통해 약리단 constraints을 만족하는 3,995개의 화합물이 일차 hit list로 선정되었고, 이들을 FlexX와 Surflex-Dock 프로그램을 이용하여 HDLP의 활성부위 (TSA 결합부위)에 2차 도킹을 수행하고 각각 CScore모듈로 결합에너지 스코어를 분석했다.
또한, Tyr297와 His131 또는 His132과 두 개 이상의 수소결합을 형성하면서 결합에너지 랭킹이 높은 리간드 301개를 선정하였다. 이들 2차 선별된 리간드들의 HDAC 억제 활성값을 기존 HDAC 억제제에 대한 3D-QSAR/CoMSIA 모델을 이용하여 예측한 후, non-hydroxamate MC-275(N-(2-Aminophenyl)-4-[N-(pyridine-3ylmethoxycarbonyl)aminomethyl]benzamide)보다 억제 활성이 뛰어나게 예측된 50개 후보 화합물들을 최종 선정하여 구매 후 활성테스트를 수행하였다.
1-2. 구조 기반 리간드 디자인(structure-based ligand design)
<9a 화합물>
상기 실시예 1-1에서 얻어진 hydroxamate hit 리간드 2종이 공통적으로 styrylthio-propanamide 구조를 가지고 있었으므로 억제활성을 높이기 위해 Zn-binding group으로서 amide를 hydroxamate group으로 치환시키고, spacer로서 styrylthio group을 styryl thiazol group으로 치환하여 다음과 같이 9a 화합물을 합성하였다.
[9a 화합물 합성 모식도]
Figure PCTKR2015004300-appb-I000003
상기 9a 화합물 합성 모식도를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
① 화합물 2; 모노메틸글루타르산(Monomethyl glutarate) 합성
메탄올(15 mL) 중 글루타르산 무수물(5.0 g, 44 mmol) 용액에 나트륨메톡시드(sodium methoxide) (50 mg, 1 mmol)를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 6시간 교반하였다. 감압하에 용매를 완전히 제거하여 잔여물인 모노메틸글루타르산을 수득하였으며, 이것을 더이상의 정제과정 없이 다음 단계에 이용하였다.
② 화합물 3; 메틸 5- 클로로 -5- 옥소펜타노에이트 (Methyl 5- chloro -5-oxopentanoate) 합성
벤젠(20 mL) 중 crude 모노메틸글루타르산 용액에 디메틸포름아미드 (2 drops)을 첨가하고, thionyl chloride (6.9 mL, 94.3 mmol)를 실온에서 30분 동안 액적으로 첨가(dropwise)하였다. 이 반응 혼합물을 3시간 동안 환류시키고, 용매를 진공하에서 제거하여 잔여물인 메틸 5-클로로-5-옥소펜타노에이트를 수득하였으며, 이것을 더이상의 정제과정 없이 다음 단계에 이용하였다.
③ 화합물 4; 메틸 6- 브로모 -5- 옥소펜타노에이트 (Methyl 6- bromo -5-oxohexanoate) 합성
0℃ 질소 분위기하에서, 디에틸에테르 (400 mL) 중 디아조메탄 용액(121.6 mmol)에 메틸 5-클로로-5-옥소펜타노에이트 (4.0 g, 24.3 mmol)를 첨가하였다. 2시간 후, N2를 상기 용액에 버블링하여 CH2N2를 제거하였다. 잔여물은 빙초산(10mL)으로 처리하고, 브롬화수소산(hydrobromic acid)(33% in acetic acid, 5mL)를 액적으로 첨가하였다. 이 혼합물을 24시간 동안 실온에서 워밍한 후, 포화 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate) 용액 및 물로 세정하였다. 이후, 유기층은 MgSO4로 건조, 여과 및 증발시켜 잔여물인 메틸 6-브로모-5-옥소펜타노에이트를 수득하고 칼럼 크로마토그래피(Hexane:EtOAc = 4:1)로 정제하였다(2.4g, 25%). 1H NMR (300 MHz, CDCl3): d3.88 (s,2H), 3.68 (s,3H), 2.75 (t,J=4.0Hz,2H), 2.37 (t,J=4.0Hz,2H), 1.95 (q,J=4.0Hz,2H).
④ 화합물 6; ( E )-3-phenylprop-2-enethioamide 합성
피리딘 무수물 (4.4mL) 중 화합물 5인 cinnamamide (1.47g, 10mmol)의 교반 용액에 오황화인(Phosphorus pentasulfide) (1.11 g, 5 mmol)을 첨가하고, 그 결과 얻어진 yellow/orange 용액을 2시간 동안 환류하에 가열한 후 실온에서 식혔다. 이 혼합물에 물(10mL)을 부어 디에틸에테르(3×10mL)로 추출하고, 이 추출물을 1N-HCl과 물로 세척한 후 MgSO4로 건조시켰다. 여과후, 용매를 진공하에서 증발제거하여 갈색의 고체물을 얻고, 벤젠으로 결정화하여 황색의 니들형 물질인 (E)-3-phenylprop-2-enethioamide를 수득하였다(1.07g, 66%); 1H NMR (300MHz, CDCl3): d7.78 (d,J=15.0Hz,1H), 7.58-7.55 (m,2H), 7.45-7.37 (m,5H), 6.88 (d,J=15.0Hz,1H).
⑤ 화합물 7; ( E )- 메틸4 -(2- 스티릴티아졸 -4-일) 부타노에이트 (( E )- methyl4 -(2-styrylthiazol-4-yl)butanoate) 합성
(E)-3-phenylprop-2-enethioamide (79mg, 0.48mmol) 및 메틸 6-브로모-5-옥소펜타노에이트 (72mg, 0.32mmol)의 혼합물을 MeOH (2mL) 중에서 밤새 실온 교반하였다. 이 반응 혼합물을 증발에 의해 농축시키고 잔여물을 칼럼 크로마토그래피(Hexane:EtOAc = 4:1)로 정제하여 화합물 (E)-메틸4-(2-스티릴티아졸-4-일)부타노에이트를 수득하였다 (72mg, 78%); 1H NMR (300MHz, CDCl3): d7.53 (s,1H), 7.51 (s,1H), 7.40-7.23 (m,5H), 6.84 (s,1H), 3.68 (s,3H), 2.83 (t,J=7.5Hz,2H), 2.40 (t,J=7.5Hz,2H), 2.13-2.03 (m,2H).
⑥ 화합물 8; ( E )-4-(2- 스티릴티아졸 -4-일) 부타논산 (( E )-4-(2-styrylthiazol-4-yl)butanoicacid) 합성
THF (6mL) 및 MeOH (6mL) 중의 (E)-메틸4-(2-스티릴티아졸-4-일)부타노에이트 (1.0g, 3.48mmol) 용액에 1N-NaOH (6mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 교반한 후 용매를 증발 제거하였다. 수층을 10% 수성 시트르산 용액 (pH 3.0)으로 산화하고, 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층은 MgSO4로 건조, 여과하고, 용매를 증발제거하여 얻어진 잔여물 (E)-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부타논산은 더 이상의 정제 없이 다음 단계에 이용하였다.
⑦ 최종 화합물 9a; ( E )- N -히드록시-4-(2- 스티릴티아졸 -4-일) 부탄아미드 (( E )- N -hydroxy-4-(2-styrylthiazol-4-yl)butanamide) 합성
무수 DMF(22mL) 중의 (E)-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부타논산 교반 용액에 1-히드록시벤조트리아졸 하이드레이트 (0.66 g, 4.9 mmol)을 실온에서 첨가한 후, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸-카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC, 0.85 g, 5.7 mmol)를 더 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 염산 (0.29 g, 4.15 mmol) 및 Et3N (574ul, 4.15mmol)를 가하여 실온에서 밤새 교반하였다. 이후, 용매를 진공하에 제거하고, 잔여물을 에틸아세테이트로 희석한 후 포화 수성 NaHCO3로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조, 여과 및 진공 농축시켰다. 농축된 산물을 플래쉬 크로마토그래피로(10% methanol in chloroform) 정제하여 최종 화합물 9a, 즉 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드를 수득하였다 (0.4g, 40%). 1H NMR (500MHz, DMSO-d6): d10.36 (s,1H), 8.67 (s,1H), 7.69 (s,1H), 7.67 (s,1H), 7.41-7.32 (m,5H), 7.26 (s,1H), 2.70 (t,J=7.5Hz,2H), 2.02 (t,J=7.5Hz,2H), 1.89 (t,J=7.5Hz,2H); 13C NMR (125MHz, DMSO-d6): d169.57, 166.07, 136.32, 133.92, 129.55, 129.50, 127.88, 122.18, 116.54, 114.62, 32.49, 31.08, 25.52.
<8e 화합물>
상기 실시예 1-1에서 얻어진 성공적인 결과를 바탕으로 non-hydroxamate계 HDAC 억제제를 추가로 발굴하고자 순도 90% 이상의 화합물 27,000 여개를 포함한 라이브러리를 대상으로 두 번째 가상검색을 수행하여 spacer부분에 공통적으로 thio linker와 대체되는 thiazol ring을 가진 11개의 화합물을 구매하여 HDAC enzymatic assay를 수행하였다.
그 결과, HDAC 억제 효과를 보이는 hit리간드 3종을 발굴하였다. 2종은 Zn-binding group이 methyl pyrazole인 화합물, 1종은 hydroxy acetamide인 화합물이었다. 억제활성을 높이기 위해 이들의 capping group을 다양하게 바꾼 유도체 14종을 합성하여 HDAC enzymatic assay를 수행하였다. 그 중 최종적으로 Zn-binding group이 methyl pyrazole이고 capping group이 para-플루오로페닐 에틸기인 화합물 N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드(8e 화합물)이 HDAC억제 활성이 IC50 = 0.1M로서 가장 뛰어남을 확인하였다.
[8e 화합물 합성 모식도]
Figure PCTKR2015004300-appb-I000004
상기 8e 화합물 합성 모식도를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
① 화합물 1e; N -Boc-β-alanine 합성
디옥산(480 mL)과 물(240 mL)의 혼합물 중 β-alanine(21.36 g, 240 mmol)의 교반용액에, 1N NaOH (240 mL)을 0℃에서 첨가한 후, di-tert-butyldicarbonate (57.62g,264mmol)을 가하여 실온에서 6시간 교반하였다. 이후, 이 용액을 진공에서 약 60-80ml로 농축, 냉각하여, 에틸아세테이트(100mL)로 희석하고, KHSO4 희석액으로 산화시켜 pH 2-3으로 하였다. 수층을 에틸아세테이트로 반복 추출하여 얻은 산물을 물로 세정한 후 무수 MgSO4 로 건조시켜, 백색 결정체인 N-Boc-β-alanine을 수득하였다(34.06g, 75%).
② 화합물 2e; N -( tert -Butoxycarbonyl)-β-alaninamide 합성
THF(405mL)과 Et3N(25.3mL, 180mmol) 중의 N-Boc-β-알라닌(34.06g, 180mmol) 혼합물을 -10℃까지 냉각한 후, 차가운 에틸클로로포메이트(17.21mL, 180mmol)를 액적으로 첨가(dropwise)하여 -10℃에서 20분간 교반하였다. 20% NH3 용액(38.11ml, 448mmol)을 가한 후, 실온에서 차츰 식히며 밤새 교반하였다. 감압 증발에 의해 얻어진 산물을 뜨거운 EtOAc로 수차례 추출하고, EtOAc/헥산으로 재결정화하여 백색 결정체인 N-(tert-Butoxycarbonyl)-β-alaninamide를 수득하였다(31.3g,92%); 1H NMR(300MHz, CDCl3): δ5.73(brs,1H), 5.48(brs,1H), 5.13 (brs,1H), 3.44-3.38(m,2H), 2.45(t,J=6.0Hz,2H), 1.44(s,9H).
③ 화합물 3e; N -( tert -Butoxycarbonyl)-β-thioalaninamide 합성
THF (110mL) 중의 N-(tert-Butoxycarbonyl)-β-alaninamide (4.97g, 26.4mmol) 및 P2S5 (7.04g, 15.8mmol) 혼합물을 실온에서 24시간 아르곤 분위기하에 교반하였다. 여과후 수층 잔여물을 CHCl3로 추출하고, 유기층을 brine으로 세정한 후 MgSO4 로 건조 및 농축하였다. 이후, EtOAc으로 재결정화하여 고체인 N-(tert-Butoxycarbonyl)-β-thioalaninamide를 수득하였다(3.48g, 65%).
④ 화합물 4e; Ethyl 2-(2-( tert - butoxycarbonylamino )ethyl) thiazole -4-carboxylate 합성
DMF (5ml) 중의 N-(tert-Butoxycarbonyl)-β-thioalaninamide (3.48g, 17mmol) 및 ethyl bromopyruvate (1.44ml, 11.4mmol)를 12시간 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석한 후 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 brine으로 세정한 후 MgSO4 로 건조, 여과 및 농축하였다. 이후, 잔여물을 flash chromatography (Hexane:EtOAc=1:1)로 정제하여 백색 고체인 ethyl 2-(2-(tert-butoxycarbonylamino)ethyl)thiazole-4-carboxylate를 수득하였다 (2.02g, 40%); 1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 8.08 (s,1H), 4.95 (s,1H), 4.42 (q,J=7.2Hz,2H), 3.61-3.55 (m,2H), 3.26 (t,J=6.5Hz,2H), 1.43 (s,9H), 1.41 (t,J=7.2Hz,3H).
⑤ 화합물 6e; tert - butyl2 -(4-(4- fluorophenethylcarbamoyl ) thiazol -2-yl)ethylcarbamate 합성
THF(2mL)과 물(2mL) 중의 ethyl 2-(2-(tert-butoxycarbonylamino)ethyl)thiazole-4-carboxylate 교반용액(0.25g, 0.83mmol)에, LiOH (52.17mg, 1.25mmol)를 실온에서 첨가하고, 그 반응 혼합물을 2시간 교반하였다. 유기용매를 제거한 후 얻어진 수용액을 10% 수성 시트르산 용액으로 산화하여 pH 2-3으로 한 후, 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조, 여과 및 증발시켜 5e 화합물을 얻었다. 잔여물을 더 이상의 정제과정 없이 다음 단계에 이용하였다. 메틸렌클로라이드(3 mL) 중의 5e 화합물 교반용액에, 디이소프로필에틸아민(1.0 mL, 5.74 mmol) 및 4-플루오로페네틸아민(0.4 mL, 3.06 mmol)을 실온에서 아르곤 분위기하에 첨가한 후, EDCㆍHCl (1 g, 6.14 mmol)을 더 가하였다. 밤새 교반후, 혼합물을 메틸렌클로라이드로 추출하여, 1N HCl, 1N NaOH 및 brine으로 세정하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고, 진공에서 농축하였다. 얻어진 산물을 flash chromatography (Hexane:EtOAc=2:1)에 의해 정제하여 tert-butyl2-(4-(4-fluorophenethylcarbamoyl)thiazol-2-yl)ethylcarbamate를 수득하였다(721.82mg, 60% yield); 1H NMR (300MHz, CDCl3):δ 8.00 (s,1H), 7.36 (brs,1H), 7.23-7.19 (m,2H), 7.04-7.00 (m,2H), 3.66 (q,J=7.0Hz,2H), 3.56 (d,J=6.6Hz,2H), 3.17 (t,J=6.6Hz,2H), 2.91 (t,J=7.5Hz,2H), 1.45 (s,9H).
⑥ 최종 화합물 8e; N -(4- Fluorophenethyl )-2-(2-(5-methyl-1 H -pyrazole-3-carboxamido)ethyl) thiazole-4-carboxamide 합성
tert-butyl2-(4-(4-fluorophenethylcarbamoyl)thiazol-2-yl)ethylcarbamate(66.8mg, 0.17mmol)를 TFA (2mL) 및 메틸렌클로라이드 (2mL)에 녹인 후, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 교반하고, 유기용매를 진공하에 증발시켰다. 얻어진 산물을 물로 희석하고, 포화 수상 sodium bicarbonate 용액으로 염기화시켜 pH 8로 하고, 메틸렌클로라이드로 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조, 여과 및 증발시켜 7e 화합물을 얻었다(29.2mg). 잔여물을 더 이상의 정제 없이 다음 단계에 이용하였다. 메틸렌클로라이드(3mL) 중의 7e 화합물 교반용액에, 디이소프로필에틸아민 (13.1 L, 0.093 mmol) 및 5-메틸-1H-피라졸-3-카르복실산 (14.1 mg, 0.11 mmol)을 실온에서 아르곤 분위기하에 첨가한 후, EDCㆍHCl (43.2 mg, 0.28 mmol)을 더 가하였다. 밤새 교반후, 혼합물을 메틸렌클로라이드로 추출하여, 1N HCl, 1N NaOH 및 brine으로 세정하였다. 유기층을 MgSO4로 건조하고, 진공에서 농축하였다. 얻어진 산물을 flash chromatography (MC:MeOH=15:1)에 의해 정제하여 N-(4-Fluorophenethyl)-2-(2-(5-methyl-1H-pyrazole-3-carboxamido)ethyl) thiazole-4-carboxamide를 수득하였다(72% yield for 2 steps); 1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 10.02(brs,1H), 7.98(s,1H), 7.58-7.54(brd,2H), 7.22-7.18(m,2H), 7.00-6.96(m,2H), 6.57(s,1H), 3.85(q,J=6.5Hz,2H), 3.85(q,J=6.5Hz,2H), 3.66(q,J=7.5Hz,2H), 3.26(t,J=6.5Hz,2H), 2.91(t,J=7.0Hz,2H), 2.33(s,3H); HRMS ESI: (M+H)+calcd 401.1316, found 401.1316.
1-3. HDAC enzymatic assay
상기 실시예 1-1과 1-2에서 확보된 화합물들을 대상으로 HDAC enzymatic assay를 수행한 결과, HDAC 억제 효과를 보이는 hydroxamate계 hit 리간드 2종 및 non-hydroxamate계 hit 리간드 3종을 발굴하였다. 이때, HDAC enzymatic assay는 다음과 같은 방법으로 실시하였다.
Pan-HDAC 형광 활성은 아세틸화 라이신 측쇄(acetylated lysine side chain)를 갖는 Fluor de Lys (Biomol, Plymouth Meeting, PA)을 기질로 하여, SPECTRAmax GEMINI XS microplate 분광형광계(spectrofluorometer) 및 SOFTMAX PRO V.3.1.2 system (MolecularDevices)로 측정하였다(Ex 355nm, Em 460nm, cut off filter 455nm).
pan-HDAC 분석용 총 반응액 부피는 25ul이고, 모든 분석 성분은 HDAC assay buffer (50mM Tris/Cl, pH8.0, 137mM NaCl, 2.7mM KCl and 1mM MgCl2)로 희석하였다. 반응은 half-volume white 96-well plates (Costar3693)에서 수행하였다. pan-HDAC 분석 혼합물에는 HDAC 기질, rhHDAC isoform 및 저해제로서 9a 및 8e 화합물을 포함하며, 양성 대조군은 MS-275(N-(2-Aminophenyl)-4-[N-(pyridine-3ylmethoxycarbonyl)aminomethyl]benzamide)가 함유되어 있고, 음성 대조군은 HDAC와 저해제 모두 함유되어 있지 않다.
반응액을 실온에서 20분간 반응시키고, cold assay buffer로 20배 희석, 2uM TSA가 함유된 HDAC-FDL Developer (KI-105; Biomol) 25ul로 급랭(quenching)시켰다. 플레이트를 실온에서 20분간 반응시켜 형광 신호를 현상(developing)하였다. 최종 HDAC 억제 활성 결과값은 GraphPad Prism 4.0 프로그램을 이용하여 각각의 IC50 값을 계산하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 양성 대조군(MS-275)에 비하여 9a 및 8e의 IC50 값이 매우 낮아 HDAC 억제 활성 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.
저해제 화합물 IC50 (uM)
MS-275 (양성 대조군) 11.09
9a 1.48
8e 0.1
실시예 2: 대식세포를 이용한 항염증 효과 분석
상기 실시예 1에서 합성한 9a 및 8e 화합물에 대하여, 하기와 같이 세포 생존율 및 항염증 효과를 분석하였다.
2-1. 세포독성 분석(MTT assay)
96 well plate에 RAW264.7 세포를 분주하고 9a 화합물은 0, 0.1, 0.5, 2.5, 12.5 및 62.5uM 농도별로, 8e 화합물은 0, 0.1, 0.5, 2.5, 12.5, 62.5, 312.5, 1562.5uM 농도별로 각각 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후, MTT용액을 첨가하여 4시간 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 9a 화합물은 0.1, 0.5, 2.5, 12.5uM 농도에서는 세포독성을 보이지 않았으며, 62.5uM 고농도에서 약간의 세포독성을 보였다. 또한, 8e 화합물은 0, 0.1, 0.5, 2.5, 12.5, 62.5, 312.5uM 농도에서는 세포독성을 보이지 않았으며, 1562.5uM 고농도에서 세포독성을 보였다.
2-2. 염증성 사이토카인 및 NO의 과생성 억제 효과
LPS(Lipopolysaccharide) 투여에 의해 대식세포 활성화를 유도한 후, 9a 및 8e 화합물이 염증성 사이토카인(TNF-α 및 IL-6) 생성을 변화시키는지 확인하기 위하여, TNF-α 및 IL-6의 분비 농도를 ELISA법을 통해 측정하였다. 즉, 24 well에 RAW264.7 세포를 분주하고 23시간 뒤, 9a 및 8e 화합물을 각각 0, 0.1, 0.5, 2.5, 12.5 및 62.5uM 농도별로 처리하였다. 1시간 뒤 LPS를 처리하고 24시간 뒤 TNF-α 및 IL-6 농도를 ELISA 키트 (BD Biosciences, USA)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 9a 및 8e 화합물은 LPS로 유도한 대식세포의 TNF-α 및 IL-6 과생성을 억제시킴을 알 수 있었다.
또한, LPS 투여에 의해 대식세포 활성화를 유도한 후, 9a 및 8e 화합물이 NO 생성을 변화시키는지 확인하기 위하여, NO의 분비 농도를 NO assay법을 통해 측정하였다. 즉, NO의 분비 농도측정은 반응 최종물을 griess reagent와 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도의 변화를 측정한 것을 제외하고는 상기 염증성 사이토카인 농도측정법과 동일한 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 9a 및 8e 화합물은 NO 과생성을 억제시킴을 알 수 있었다.
실시예 3: 패혈증에 대한 생존율 평가
3-1. 실험동물 준비
8주령의 C57BL/6계 웅성 생쥐((주)오리엔트바이오)를 온도 23±1℃, 상대습도 55±15% 및 조도 300-500 Lux로 12시간 간격으로 명암이 조절되는 사육실에서 7일 이상 순화시킨 후 육안적 증상을 관찰하여 정상적인 동물만을 실험에 사용하였으며, 실험동물용 고형 사료 및 물은 자유롭게 섭취시켰다.
3-2. CLP (cecal ligation and puncture)에 의한 패혈증 유도
생쥐에 마취제를 복강주사하여 마취시킨 후 맹장 결찰 및 천공(cecal ligation and puncture, 이하 'CLP'라 함)으로 패혈증을 유발시켰다. 즉, 복강 정중부를 절개한 후 맹장을 외부로 노출시켜 회맹장판(ileocecal valve)의 말단을 실크 봉합선으로 결찰하고 바늘을 이용하여 맹장에 두 개의 구멍을 만든 후 일정량의 분변을 유출시켰다. 분변을 포함하여 맹장을 다시 복강 내에 넣고 봉합한 후 4 ml/100 g b.wt.의 생리식염수를 피하주사를 통해 주입하였다.
3-3. 약물 투여방법
9a 화합물은 5, 10, 20 mg/kg 농도로, 8e 화합물은 10, 20 mg/kg 농도로, 각각 생리식염수에 용해시킨 후, CLP 시행 2시간 전 및 직후에 총 2회 복강주사하였다.
3-4. 생존율 관찰
CLP를 실시한 직후 24시간부터 10일째까지 24시간 간격으로 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 일) 하루 한번 사망여부를 확인하여 생존율을 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 9a 및 8e 화합물은 CLP 유도 패혈증에서 사망률을 개선시킴을 알 수 있었다.
실시예 4: 히스톤 디아세틸라아제 억제능 분석
동물모델에서 9a 및 8e 화합물의 히스톤 디아세틸라아제 억제능을 확인하기 위하여, Western blot법을 이용하여 Histone H4의 아세틸화 정도를 분석하였다.
4-1. 약물 투여방법
약물 투여는 9a 및 8e 화합물 각각을 10 mg/kg씩 생리식염수에 용해시킨 후, CLP 시행 2시간 전 및 직후에 총 2회 복강주사하였다.
4-2. Histone H4의 아세틸화 정도 분석
CLP 후 1, 3 및 6시간 마취 하에 생쥐의 간장을 적출하여 PRO-PREP을 이용하여 단백질을 추출한 뒤 SDS-PAGE에 의해 Histone H4의 아세틸화 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 9a 및 8e 화합물의 10 mg/kg 투여군은 모두 아세틸화-Histone H4 발현이 현저히 증가됨을 알 수 있었는 바, 9a 및 8e 화합물이 히스톤 디아세틸라아제를 억제함을 확인하였다.
실시예 5: 혈중 염증성 사이토카인 농도 분석
패혈증시 나타나는 과염증 반응에 대하여 9a 및 8e 화합물 투여에 따른 항염증 효과를 확인하기 위하여, 염증 유발 사이토카인인 TNF-α와 IL-6의 혈중 농도를 측정하였다.
5-1. 약물 투여방법
약물 투여는 9a 및 8e 화합물 10 mg/kg씩 각각 생리식염수에 용해시킨 후, CLP 시행 2시간 전 및 직후에 총 2회 복강주사하였다.
5-2. 혈중 염증성 사이토카인 농도분석
CLP 후 6시간에 혈액을 채취하여 분리한 혈청에서 TNF-α 및 IL-6의 농도를 ELISA 키트 (BD Biosciences, USA)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, CLP로 유도된 패혈증 생쥐의 혈청에서 9a 및 8e 화합물 투여 후 패혈증시 현저하게 증가된 TNF-α 및 IL-6의 농도가 억제되었다. 이로써 9a 및 8e 화합물은 모두 패혈증에서 염증유발 사이토카인의 생성을 억제하여 패혈증시 과염증반응을 억제하는 것을 알 수 있었다.
실시예 6: 장기 손상 지표 분석
패혈증시 나타나는 장기 손상 반응에 대하여 9a 및 8e 화합물 투여에 따른 억제효과를 확인하기 위하여, 혈청 내 ALT, AST, LDH, BUN 및 크레아티닌의 활성을 분석하였다.
6-1. 약물 투여방법
약물 투여는 9a 및 8e 화합물 10 mg/kg씩 각각 생리식염수에 용해시킨 후, CLP 시행 2시간 전 및 직후에 총 2회 복강주사하였다.
6-2. 장기 손상 지표 분석
CLP 후 6시간에 혈액을 채취하여 분리한 혈청에서 알라닌 아미노트랜스퍼레이즈 (ALT; alanine aminotransferase, 이하 ALT라고 함) 및 글루타믹 옥살로세틱 트란스아미나제 (AST; glutamic oxaloacetic transaminase, 이하 AST라고 함) 농도를 측정하여 간 기능의 손상 정도를 평가하였다.
또한, 혈액내 요소 질소 (blood urea nitrogen, 이하 BUN이라고 함) 및 크레아티닌(creatinine) 농도를 측정하여 신장 기능의 손상 정도를 관찰하였다.
또한, 락테이트 디하이드로게네이즈 (LDH; lactate dehydrogenase, 이하 LDH라 함) 농도를 측정하여 조직세포의 손상 정도를 평가하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, CLP로 유도된 패혈증 생쥐의 혈청에서 9a 및 8e 화합물 투여 후 패혈증시 현저하게 증가된 ALT, AST, BUN, 크레아티닌 및 LDH 농도가 억제됨을 확인할 수 있었는 바, 패혈증에 의한 장기 손상이 억제됨을 알 수 있다.
실시예 7: 9a 화합물의 HDAC6 선택적 억제효과 확인
7-1. HDAC enzymatic assay를 통한 9a 화합물의 HDAC6와 HDAC1 억제능 비교
컴퓨터 약물설계 방법으로 만들어진 9a 화합물이 염증유발 사이토카인의 생성을 억제하는 효과는 HDAC6에 대한 선택적인 억제능과 연관된다는 전제하에, HDAC6의 선택적 억제제로 알려진 Tubastatin A를 양성대조군으로 하여 HDAC6와 HDAC1에 대한 각각의 HDAC enzymatic assay를 비교실시하였다.
구체적으로, 9a 화합물의 HDAC6와 HDAC1의 억제효능 검출을 위한 형광 활성은 아세틸화 라이신 측쇄(acetylated lysine side chain)를 갖는 Fluor de Lys-SIRT1(Biomol, Plymouth Meeting, PA)을 기질로 하여, Glomax Multi plus(PROMEGA)로 측정하였다(excitation 340~360nm, emission 440~460nm). HDAC6와 HDAC1 분석용 총 반응액 부피는 50㎕이고, 분석 성분은 HDAC assay buffer I(50 mM Tris/Cl, pH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2)과 HDAC assay buffer II(50 mM Tris/Cl, pH 8.0, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1mg/ml BSA)로 희석하여 사용하였다. HDAC6와 HDAC1의 분석 혼합물에는 Fluor de Lys-Substrate, HDAC isoform, 및 HDAC 저해제들이 포함된다. 이때, 양성대조군과 음성대조군은 각각 Tubastatin A 화합물과 DMSO를 사용하였다. 반응액은 실온에서 20분간 반응시키고 HDAC assay buffer I으로 희석한 Developer II를 처리한 후, 실온에서 약 15분간 반응시켜 형광 신호를 검출하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 9a 화합물의 경우 enzymatic assay에 의한 HDAC6 IC50값은 199.3 nM이었고, HDAC1 IC50값은 13805 nM로써, HDAC6에 대해 70배 정도 선택적 억제효과를 발휘함을 확인하였다.
7-2. Western blot을 통한 9a 화합물의 HDAC6 선택적 억제능 확인
세포질 내에 존재하는 HDAC6는 핵내 히스톤의 탈아세틸화와 관계없이 세포질의 α-tubulin의 탈아세틸화를 유도하는 경향이 존재하기 때문에, 9a 화합물의 농도변화에 따른, acetylated α-tubulin과 acetylated 히스톤 H3의 양의 변화를 통해, 9a 화합물의 세포내 HDAC6 선택적 억제능을 더욱 확인하였다.
구체적으로, Trichosatidin A(TSA), Tubastatin A 및 9a 화합물을 각각 2, 2 및 10μM의 농도로, 6well 플레이트에서 배양된 HeLa 세포(자궁경부암세포)에 처리한지 24시간 후 HeLa 세포 용해물을 추출한 다음, acetylated α-tubulin과 acetylated 히스톤 H3 항체를 처리하여 비교하였다. 이때, Tubastatin A는 양성대조군으로서 HDAC6의 선택적 억제효능을 가지고 있으며, TSA는 음성대조군으로서 HDAC6의 선택적 억제효능이 존재하지 않는데, 이들 2종류의 HDAC 억제제와 9a 화합물을 상기 농도로 처리한 결과, 도 8(a)에 나타낸 바와 같이 TSA 처리군에서만 acetylated 히스톤 H3의 양이 증가됨을 확인하였다.
이후, Tubastadin A와 9a 화합물을 농도별(0.01, 0.1, 1, 10μM)로 처리하여 acetylated α-tubulin과 acetylated 히스톤 H3의 발현양의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 8(b)에 나타낸 바와 같이, Tubastatin A는 0.1μM 농도에서 acetylated α-tubulin이 증가되기 시작하였고, 9a 화합물은 1μM에서부터 증가되는 것을 확인한 반면, acetylated 히스톤 H3는 두 물질 모두 발현양의 변화를 확인할 수 없었다.
즉, 9a 화합물을 농도별(0.01, 0.1, 1, 10μM)로 HeLa 세포에 처리했을 때, HeLa 세포질에 존재하는 HDAC6의 활성은 억제되나 핵내에 존재하는 히스톤의 활성은 억제되지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는, 9a 화합물이 HDAC6를 선택적으로 억제하는 효과를 발휘함을 의미하는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1의 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드 ((E)-N-hydroxy-4-(2-styrylthiazol-4-yl)butanamide),
    하기 화학식 2의 N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드(N-(4-Fluorophenethyl)-2-(2-(5-methyl-1H-pyrazole-3-carboxamido)ethyl) thiazole-4-carboxamide), 또는
    이것의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015004300-appb-I000005
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2015004300-appb-I000006
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드 및 N-(4-플루오로페네틸)-2-(2-(5-메틸-1H-피라졸-3-카복사미도)에틸)티아졸-4-카복사미드는 히스톤 디아세틸라아제(HDAC) 저해제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 (E)-N-히드록시-4-(2-스티릴티아졸-4-일)부탄아미드는 히스톤 디아세틸라아제6(HDAC6) 저해제인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 염증성 질환은 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제 1 항의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환의 치료 방법.
  6. 제 1 항의 조성물의 염증성 질환 치료 용도.
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