PT1472281E - Gene que confere resistência a phytophthora infestans (míldio) em solanaceae - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "GENE QUE CONFERE RESISTÊNCIA A PHYTOPHTHORA INFESTANS (MÍLDIO) EM SOLANACEAE" 0 míldio, causado pelo agente patogénico oomicete Phytophthora infestans é, a nível mundial, a doença mais destrutiva para a cultura da batata. A doença também ameaça a cultura do tomate. A urgência na obtenção de cultivares resistentes tem-se intensificado à medida que estirpes do agente patogénico mais virulentas, específicas de culturas e resistentes a pesticidas estão rapidamente a emergir.

Uma forma de prevenir quebras nas culturas ou rendimentos baixos é a aplicação de fungicidas que evitam ou curam uma infecção por P. infestans. No entanto, a aplicação de protetores das culturas é largamente considerada um fardo para o ambiente. Assim, em vários países ocidentais, a legislação tornou-se mais restritiva e parcialmente proibitiva relativamente à aplicação de fungicidas específicos, tornando o controlo químico da doença mais difícil. Uma abordagem alternativa é o uso de variedades portadoras de resistência parcial ou total ao míldio. Foram descritos dois tipos de resistência ao míldio e usados no melhoramento da batata. Um tipo é conferido por uma série de genes dominantes principais que tornam o hospedeiro incompatível com raças específicas do agente patogénico (resistência específica de raça). Foram identificados onze desses genes R (Rl-Rll) e crê-se que tenham tido origem na espécie de batata selvagem Solanum demissum, a qual é nativa do México, onde se encontra a maior variação genética do agente patogénico. Vários destes genes R foram mapeados no mapa genético da batata (revisto em Gebhardt and Valkonen, 2001 Annu. Rev. Phytopathol. 39: 79-102) . RI e R2 estão situados nos cromossomas 5 e 4, respectivamente. R3, R6 e R7 estão situados no cromossoma 11. Genes R desconhecidos que conferem resistência específica de raça contra o míldio foram igualmente descritos em S. tuberosum ssp. andigena e S. berthaultii (Ewing et al., 2000 Mol. Breeding 6: 25-36).

Devido ao elevado nível de resistência e facilidade de transferência, muitas variedades possuem resistência derivada de S. demissum. Infelizmente, a resistência específica de raça derivada de S. demissum, ainda que quase completa, não é durável. Uma vez as novas variedades crescidas numa escala maior em campos comerciais, novas virulências emergem em P. infestans que tornam o agente patogénico capaz de ultrapassar a resistência introgressiva. O segundo tipo de resistência, designada resistência de campo e, frequentemente, de natureza quantitativa, pensa-se ser não específica de raça e mais durável. A resistência de campo ao míldio pode ser encontrada em várias espécies de Solanum Mexicanas e da América Central e do Sul (Rossi et al, 1986 PNAS 95:9750-9754). S. bulbocastanum diplóide do México e da Guatemala é uma das espécies de tubérculos conhecida pelos seus elevados níveis de resistência de campo ao míldio (Niederhauser and Mills, 1953 Phytopathology 43: 456-457). Apesar das diferenças nos números de equilíbrio do endos-perma, a introgressão da característica resistência em S. bulbocastanum foi bem sucedida. As manipulações da ploidia e uma série de cruzamentos demorados resultaram em germo-plasma derivado de S. bulbocastanum resistente a P. Infestans (Hermsen and Ramanna, 1969 Euphytica 18:27-35; 1973 Euphytica 22:457-466; Ramanna and Hermsen, 1971 Euphytica 20:470-481; Hermsen and De Boer, 1971 Euphytica 20: 171- 180). No entanto, quase 40 anos após os primeiros cruzamentos e esforços intensos e continuados de melhoramento pelos criadores de batata na Holanda com este germo-plasma, os cultivares resistentes ao míldio ainda não foram introduzidos no mercado. A produção bem sucedida de híbridos somáticos de S. bulbocastanum e S. tuberosum foi igualmente descrita (Thieme et al., 1997 Euphytica 97(2): 189-200; Helgeson et al, 1998 Theor Appl. Genet 96:738-742). Encontrou-se que alguns destes híbridos e germoplas- mas de retrocruzamento eram altamente resistentes ao míldio, mesmo sob pressão extrema da doença. Apesar das descrições de supressão de recombinação, a resistência no material de retrocruzamento pareceu estar no cromossoma 8 dentro de um intervalo de aproximadamente 6 cM entre os marcadores RFLP CP53 e CT64 (Naess et al., 2000 Theor. Appl Genet 101:697-704). Um marcador CAPS derivado da sonda RFLP do tomate CT88 co-segregou com a resistência. A supressão da recombinação entre os cromossomas de S. bulbocastanum e S. tuberosum forma um obstáculo potencial para a reconsti tuição com êxito do germoplasma recorrente de batata cultivada até um nivel que pode corresponder aos padrões de novas variedades de batata. 0 isolamento dos genes que codificam a resistência encontrada em S. bulbocastanum e subsequente transformação dos cultivares existentes com estes genes, seria uma abordagem mais directa e rápida quando comparado com o melhoramento por introgressão. A clonagem e caracterização molecular de numerosos genes R de plantas que conferem resistência a doença por bactérias, fungos, virus, nemátodos e insectos permitiram identificar várias propriedades estruturais caracte-risticas dos genes R das plantas (revisto em Dangl and Jones, 2001 Nature 411, 826-833). A maioria são membros de familias multigénicas estreitamente ligadas e todos os genes R caracterizados até agora, com a excepção de Pto, codificam repetições ricas em leucina (LRRs), estruturas que se mostrou estarem envolvidas em interacções de proteína-proteína. Os genes R com LRRs podem ser divididos em duas classes com base na presença de um local putativo de ligação a nucleótidos (NBS). Os genes R da classe NBS-LRR compreendem motivos que são partilhados com proteínas reguladoras da apoptose em animais (van der Biezen et al., 1998 Curr. Biol. 8, 226-227; Aravind et al, 1999 Trends Biochem. Sei. 24, 47-53) e podem ser subdivididos em dois subgrupos com base no seu domínio N-terminal, o qual apresenta similaridade de sequências com a proteína Toll de Drosophlla e o domínio do receptor de interleucina-1 de mamífero (TIR-NBS-LRR) ou possui um potencial fecho de leucinas ou domínio de hélices alfa enroladas (CC-NBS-LRR; Pan et al., 2000 Genetics. 155:309-22). Os genes R LRR sem um NBS codificam proteínas transmembranares, cuja região N-terminal extracelular é composta por LRRs (Jones et al., 1994 Adv. Bot. Res.24, 89-167). Estes genes podem ser divididos em dois subgrupos com base na presença de um domínio citossólico de cinase de serina/treonina (Song et al., 1995 Science, 270, 1804-1806). Quatro genes R foram actualmente clonados a partir da batata. Os quatro, incluindo o gene RI derivado de S. demissum, que conferem resistência específica de raça ao míldio, pertencem à classe CC-NBS-LRR dos genes R das plantas (Bendahmane et al., 1999 Plant Cell 11, 781-791; Bendahmane et al. , 2000 Plant J. 21, 73-81; van der Vossen et al., 2000 Plant Journal 23, 567-576; Ballvora et al., 2002 Plant Journal 30, 361-371). A divulgação proporciona um ácido nucleico isolado ou recombinante compreendendo um ácido nucleico codificador da sequência de aminoácidos da fig. 8 ou um fragmento funcional ou um seu homólogo. A proteína codificada pelos referidos aminoácidos foi detectada como membro de um grupo de genes identificáveis por análise de árvores filo-genéticas, os quais até agora consistem nas proteínas Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb (aqui também designado por grupo de genes Rpi-blb) da figura 9. A análise de árvores filogenéticas foi realizada como se segue. Primeiro produz-se um alinhamento de múltiplas sequências e/ou preferencialmente das sequências de aminoácidos deduzidas dos genes a serem analisados usando CLUSTALW (http://www2.ebi.ac.uk/clustalw), que é o normalmente usado na arte. ClustalW produz um ficheiro.dnd, que pode ser lido por TREEVIEW (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html). A árvore filogenética descrita na Figura 9A é um filograma.

Os estudos filogenéticos das sequências de aminoácidos deduzidas de Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3~blb, RGC4-blb e dos genes mais semelhantes da arte (conforme definido pelo BLASTX) derivados de diversas espécies, usando o método de Neighbour-Joining de Saitou and Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425), mostram que os genes correspondentes ou seus equivalentes funcionais do grupo de genes Rpi-blb podem ser colocados num ramo separado (Figura 9A) .

As comparações de sequências entre os quatro membros do grupo de genes Rpi-blb identificados no clone BAC 8005-8 SPB4 mostram que a homologia de sequências dentro do grupo de genes Rpi-blb varia entre 70% e 81% ao nivel da sequência de aminoácidos. A sequência de aminoácidos deduzida de Rpi-blb partilha a homologia global mais elevada com RGC3-blb (81% de identidade da sequência de aminoácidos; Tabela 4) . Quando os diferentes dominios são comparados, é claro que os dominios efectores presentes nas metades N-terminais das proteínas (dominios de hélices alfa enroladas e NBS-ARC) partilham um grau de homologia mais elevado (91% de identidade de sequências) que as metades C-terminais destas proteínas que se pensa possuírem os domínios de reconhecimento (LRRs; 71% de identidade da sequência de aminoácidos). A comparação das quatro sequências de aminoácidos revelou um total de 104 resíduos de aminoácidos específicos de Rpi-blb (Figura 10). A maioria destes está situada na região LRR (80/104) . Dentro desta última região, estes resíduos específicos estão concentrados no subdomínio LRR xxLxLxxxx. A frequência relativa destes resíduos de aminoácidos especificados dentro deste subdomínio LRR é mais de duas vezes superior (28,3%) ao observado no resto do domínio LRR (12,3%). Os resíduos posicionados à volta dos dois resíduos de leucina conservados no consenso xxLxxLxxxx pensa-se que estejam expostos a solventes e provavelmente envolvidos na criação/manutenção da especificidade de reconhecimento da proteína de resistência.

As sequências de outros membros do grupo de genes Rpi-blb podem ser obtidas através do rastreio de DNA genómico ou de bibliotecas de insertos, e.g. bibliotecas BAC com sequências iniciadoras baseadas em sequências assinatura do gene Rpi-blb. O rastreio de várias bibliotecas BAC de Solanum com as séries de sequências iniciadoras A e/ou B (Tabela 2 e Figura 7) identificou numerosos homólogos de Rpi-blb derivados de diferentes espécies de Solanum. O alinhamento destas sequências adicionais com as apresentadas na Figura 10 ajudará na identificação de outros membros do grupo de genes Rpi-blb e de resíduos de aminoácidos específicos contidos responsáveis pela especi ficidade de resistência a P. infestans. Ainda, a testagem de sequências adicionais nas análises de árvores filogené-ticas atrás descritas, e.g. usando o método de Neighbour-Joining de Saitou and Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425), proporciona identificação adicional de genes pertencentes ao grupo de genes Rpi-blb. A descrição proporciona o desenvolvimento de uma população com mapeamento intra-especifico de S. bulbocastanum que segregou a resistência não especifica de raça ao mildio. A resistência foi mapeada no cromossoma 8, numa região situada 0,3 cM distai de CT88. Devido à natureza não especifica da raça da resistência, a resistência ao mildio de S. bulbocastanum foi sempre pensada como sendo independente do gene R. No entanto, com o presente invento demonstramos pela primeira vez que a resistência não especifica de raça de S. bulbocastanum é de facto conferida por um gene portador de similaridade com um gene R do tipo NBS- LRR. A divulgação ainda proporciona a análise molecular desta região genómica e o isolamento por clonagem baseado no mapa de um fragmento de DNA do progenitor resistente possuidor de um gene R, designado Rpi-blb. Este fragmento de DNA foi subclonado a partir de um cromossoma bacteriano artificial (BAC) de aproximadamente 80 kb que continha quatro sequências tipo gene R completas num arranjo tipo agrupamento. A transformação de uma variedade de batata susceptivel por Agrobacterium tumefaciens revelou que uma das quatro sequências tipo gene R corresponde a Rpi-blb que confere resistência ao mildio não especifica de raça. A caracterização do gene Rpi-blb mostrou que é um membro da classe NBS-LRR dos genes R de plantas. As sequências funcionalmente caracterizadas mais próximas de trabalhos anteriores são membros da familia de genes de resistência 12 no tomateiro. Estas sequências possuem uma identidade de sequência de aminoácidos global de aproximada-mente 32% com a de Rpi-blb.

Assim, numa primeira realização, o invento proporciona um ácido nucleico isolado ou recombinante, o referido ácido nucleico codificador de um produto de gene tendo a sequência de Rpi-blb ou um seu fragmento funcional que é capaz de proporcionar um membro da familia Solanaceae com resistência não especifica de raça contra um agente patogénico oomicete. 0 isolamento do gene como aqui proporcionado que codifica a caracteristica de resistência pretendida contra o mildio e subsequente transformação das variedades existentes de batata e tomate com este gene proporciona agora uma abordagem mais directa e rápida comparativamente com o cruzamento introgressivo. Os resultados aqui proporcionados oferecem possibilidades de estudar ainda a base molecular da interacção com o agente patogénico de plantas, o papel ecológico dos genes R numa espécie de batata Mexicana e são úteis para o desenvolvimento de uma variedade de batata ou tomate resistente através da modificação genética.

Ao contrário dos genes R até agora clonados e descritos, o gene que aqui proporcionamos é o primeiro gene R isolado a partir de uma espécie de Solanum que proporciona resistência não especifica de raça contra um agente patogénico oomicete. Notavelmente, o invento proporciona aqui um ácido nucleico em que a referida espécie de Solanum que é dotada da resistência pretendida compreende S. tuberosum. Em particular, é o primeiro gene que foi isolado a partir de um parente filogeneticamente distinto da batata cultivada, S. bulbocastanum, para a qual foi demonstrado por ensaios de complementação, que é funcional em S. tuberosum. Estes dados implicam que o gene Rpi-blb pode facilmente ser aplicado na produção de batata sem necessidade de cruzamento introgressivo demorado e complexo.

As definições que se seguem são dadas para os termos usados na descrição e exemplos que se seguem. - Ácido nucleico: uma molécula de DNA ou RNA de cadeia dupla ou simples. - Oligonucleótido: uma molécula de ácido nucleico de cadeia simples e curta.

Sequência iniciadora: o termo sequência iniciadora refere-se a um oligonucleótido que pode iniciar a sintese de ácido nucleico. - Homologia: Homologia é o termo usado para a similaridade ou identidade de informação de sequências biológicas. A homologia pode ser encontrada ao nivel da sequência de nucleótidos e/ou sequência de aminoácidos codificada. Para o cálculo da percentagem de identidade, pode ser usado o algoritmos BLAST (Altschul et al., 1997 Nucl. Acids Res. 25:3389- 3402) usando parâmetros por defeito ou, em alternativa, o algoritmo GAP (Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453), usando parâmetros por defeito, os quais estão incluídos no pacote de programas Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA. As pesquisas BLAST assumem que as proteínas podem ser modeladas como sequências aleatórias. No entanto, muitas proteínas reais compreendem regiões de sequências não aleatórias que podem ser segmentos homopoliméricos, repetições de período curto ou regiões enriquecidas num ou mais aminoácidos. Tais regiões de baixa complexidade podem ser alinhadas entre proteínas não relacionadas, mesmo apesar de outras regiões da proteína serem totalmente diferentes. Pode ser empregue uma série de programas com filtros de baixa complexidade para reduzir tais alinhamento de baixa complexidade. Por exemplo, os filtros de baixa complexidade SEG (Wooten and Federhen, 1993 Comput. Chem. 17: 149-163) and XNU (Claverie and States, 1993 Comput. Chem. 17: 191-201) podem ser empregues sozinhos ou em combinação.

Como aqui usado, "identidade de sequências" ou "identidade" no contexto de duas sequências proteicas (ou sequências nucleotídicas) inclui referência aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação específica. Quando a percentagem de identidade de sequên cias é usada na referência a proteinas é reconhecido que as posições dos residuos que não são idênticas frequentemente diferem em substituições de aminoácidos conservadas, em que os aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas semelhantes (e.g. carga ou hidrofobicidade) e portanto não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as sequências diferem em substituições conservadas, a percentagem de identidade de sequências pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservada das substituições. As sequências, que diferem em tais substituições conservadas são referidas como tendo "similaridade de sequências" ou "similaridade". Meios para fazer estes ajustes são bem conhecidos dos familiarizados com a arte. Tipicamente isto envolve a pontuação de substituições conservadas como uma não correspondência parcial em vez de total, aumentando assim a percentagem de identidade de sequências. Assim, por exemplo, sempre que a um aminoácido idêntico seja atribuída uma pontuação de 1 e uma substituição não conservada seja dada uma pontuação de zero, a uma substituição conservada é atribuída uma pontuação entre 0 e 1. A pontuação de substituições conservadas é calculada, e.g., de acordo com o algoritmo de Meyers and Miller (Computer Applic. Biol. Sei. 4: 11-17, 1988) . Como aqui usado, "percentagem de identidade de sequências" significa o valor determinado pela comparação de duas sequências com alinhamento óptimo ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência de aminoácidos ou da sequência de nucleótidos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (i.e., espaços vazios) comparativamente com a sequência de referência para alinhamento ótimo das duas sequências. A percentagem é calculada através da determinação do número de posições em que ocorre o residuo de aminoácido ou base de ácido nucleico idêntico em ambas as sequências para dar o número de posições com correspondência, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de sequências. De preferência, a sequência de aminoácidos da proteina do invento partilha pelo menos 82% ou mais de homologia com a sequência descrita na Fig. 8. Como se mostra na Tabela 4, a sequência funcionalmente caracterizada de trabalhos anteriores mais próxima (membros do grupo de genes de resistência a Fusarium 12 no tomate) possui um nivel mais baixo de identidade da sequência de aminoácidos que isto (32% relativamente à de Rpi-blb). A homologia dentro do grupo de genes do presente invento varia entre 70% e 81% ao nivel da sequência de aminoácidos.

As sequências de ácido nucleico homólogas são sequências de ácido nucleico codificadoras de uma proteina homóloga como definida atrás. Um exemplo de tal ácido nucleico é a sequência proporcionada na figura 6A. No entanto, existem muitas sequências que codificam uma proteina que é 100% idêntica à proteina descrita na fig. 8. Isto é devido à oscilação ("wobble") dos tripletos de nucleótidos, em que mais de um tripleto pode codificar o mesmo aminoácido. Assim, mesmo sem ter um efeito na sequência de aminoácidos da proteína, a sequência nucleotídica codificadora desta proteína pode variar substancialmente. É reconhecido que as sequências de nucleótidos codificadoras das sequências de aminoácidos que são 100% idênticas à referida proteína podem conter ainda mais variações. Assim, a percentagem de identidade ao nível da sequência de ácido nucleico pode variar dentro de limites mais largos, sem afastamento da divulgação. - Promotor: o termo "promotor" destina-se a significar uma curta sequência de DNA à qual se ligam RNA-polimerase e/ou outros factores de iniciação da transcrição antes da transcrição do DNA ao qual o promotor está funcionalmente ligado, permitindo que a transcrição ocorra. O promotor está geralmente situado a montante (5') da sequência codificadora. No seu âmbito mais largo, o termo "promotor" inclui o local de ligação da RNA-polimerase assim como elementos de sequências reguladoras situados a várias centenas de pares de bases, ocasionalmente ainda mais longe, do sinal de iniciação da transcrição. Tais sequências reguladoras são, e.g., sequências que estão envolvidas na ligação de factores proteicos que controlam a eficácia da iniciação da transcrição em resposta a condições fisiológicas. A região do promotor deverá ser funcional na célula hospedeira e, de preferência, corresponde à região do promotor natural do gene de resistência Rpi-blb. No entanto, qualquer região de promotor heterólogo pode ser usada desde que seja funcional na célula hospedeira onde se pretende a expressão. O promotor heterólogo pode ser constitutivo ou regulável, específico de tecido ou não específico. Um promotor constitutivo como seja o promotor 35S de CaMV ou promotores de T-DNA, todos bem conhecidos na arte, é um promotor que substancialmente não está sujeito a regulação, como seja indução ou repressão, mas que permite uma transcrição estável e substancialmente inalterada da sequência de DNA a que está funcionalmente ligado em todas as células activas do organismo, desde que sejam preenchidos outros requisitos para que a transcrição ocorra. É possível usar um promotor específico de tecido, o qual dirige a expressão nas partes da planta que são susceptíveis à infecção pelo agente patogénico. No caso de Phytophthora, pode ser usado um promotor que dirige a expressão nas folhas, como seja o promotor da ferredoxina. Um promotor regulável é um promotor cuja função é regulada por um ou mais factores. Estes factores podem ser tais que pela sua presença asseguram a expressão da sequência de DNA relevante ou podem, em alternativa, ser tais que suprimam a expressão da sequência de DNA de forma que a sua ausência cause a expressão da sequência de DNA a ser expressa. Assim, o promotor e, facultativamente, a sua sequência reguladora associada podem ser activados pela presença ou ausência de um ou mais factores para afectar a transcrição das sequências de DNA da construção genética do invento. Sequências de promotor adequadas e meios para obtenção de um aumento da transcrição e da expressão são conhecidos dos familiarizados com a arte. - Terminador: o terminador da transcrição serve para terminar a transcrição do DNA em RNA e é, de preferência, selec- cionado do grupo consistindo em sequências do terminador da transcrição de plantas, sequências do terminador da transcrição de bactérias e sequências do terminador da transcrição de virus de plantas conhecidas dos familiarizados com a arte. - Gene: o termo "gene" é usado para indicar uma sequência de DNA que está envolvida na produção de uma cadeia poli-peptídica e que inclui regiões anteriores e posteriores à região codificadora (sequências 5' a montante e 3' a jusante) assim como sequências intervenientes, os chamados in-trões, os quais são colocados entre segmentos codificadores individuais (os chamados exões) ou na região a montante 5' e a jusante 3'. A região a montante 5' pode compreender uma sequência reguladora que controla a expressão do gene, tipicamente um promotor. A região a jusante 3' pode compreender sequências que estão envolvidas na terminação da transcrição do gene e facultativamente sequências responsáveis pela poliadenilação do transcrito e a região não traduzida 3'. 0 termo "gene de resistência" é um ácido nucleico isolado de acordo com o invento, o referido ácido nucleico codificador de uma produto de gene que é capaz de dotar uma planta com resistência contra um agente pato-génico, mais especificamente a referida planta sendo um membro da familia Solanaceae, mais de preferência batata ou tomate, o referido agente patogénico sendo mais especifi-camente um agente patogénico oomicete, mais especificamente Phytophthora infestans, o referido ácido nucleico de preferência compreendendo uma sequência como descrito na Fig. 8 ou parte dela. Um fragmento funcionalmente equivalente de tal gene de resistência ou ácido nucleico codifica um fragmento de um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos como descrita na Fig. 8 ou parte dela, o referido fragmento apresentando a característica de proporcionar resistência a uma infecção por oomicete como seja a causada por P. infes-tans quando incorporada e expressa numa planta ou célula vegetal. - Produto do gene de resistência: um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos como descrito na Fig. 8 ou parte dela, ou um polipéptido homólogo e/ou funcionalmente equivalente apresentando a característica de proporcionar pelo menos resistência parcial a uma infecção por oomicete, como seja a causada por P. infestans, quando incorporado e expresso numa planta ou célula vegetal. Equivalentes funcionais da proteína do invento são proteínas que são homólogas e são obtidas a partir das proteínas descritas na Fig. 8 por substituição, adição e/ou deleção de um aminoácido, mantendo ao mesmo tempo a sua actividade de resistência ao agente patogénico. Tais equivalentes podem ser facilmente preparados através da manipulação da proteína in vivo, e.g. através da alteração da grelha de leitura aberta capaz de codificar a proteína de forma que a sequência de aminoácidos seja assim afetada. Desde que as alterações nas sequências de aminoácidos não anulem a actividade da proteína tais equivalentes estão incluídos no presente invento. Ainda, deverá ser entendido que os equivalentes deverão ser deriváveis da proteína descrita na fig. 8, mantendo ao mesmo tempo a actividade biológica, i.e. a totalidade ou uma grande parte dos intermediários entre a proteina equivalente e a proteina descrita na fig. 8 deverá ter atividade de resistência ao agente patogénico. Uma grande parte significará 30% ou mais dos intermediários, de preferência 40% ou mais, mais de preferência 50% ou mais, mais de preferência 60% ou mais, mais de preferência 70% ou mais, mais de preferência 80% ou mais, mais de preferência 90% ou mais, mais de preferência 95% ou mais, mais de preferência 99% ou mais.

Equivalentes preferidos são equivalentes em que a região de repetições rica em leucinas é altamente homóloga da região LRR como descrito na fig. 8. Outros equivalentes preferidos são equivalentes em que o dominio efector N- terminal é essencialmente o mesmo do dominio efector de

Rpi-blb. A proteina do invento compreende um dominio efector N-terminal distinto e um dominio de repetições rico em leucinas. Crê-se que a conservação destas regiões seja essencial para a função da proteina, ainda que seja permitida alguma variação. No entanto, as outras partes da proteina são menos importantes para a função e podem ser mais susceptiveis a alteração.

De forma a proporcionar um teste rápido e simples para testar se as proteínas modificadas e/ou construções de genes capazes de expressar as referidas proteínas modifica das aqui descritas, ou quaisquer outras construções novas que sejam óbvias para os familiarizados com a matéria após leitura deste pedido, de facto podem dar uma resposta de resistência os familiarizados com a arte podem realizar um teste rápido de expressão transitória conhecido pelo nome de ATTA (ensaio de expressão transitória em Agrobacterium tumefaciens). Neste ensaio (do qual pode ser encontrada uma descrição detalhada em Van den Ackerveken, G„ et ai, Cell 87, 1307-1316, 1996) a sequência nucleotidica codificadora da proteina modificada que se pretende testar é colocada sob o controlo do promotor CaMV 35S e introduzida numa estirpe de Agrobacterium que é também usada nos protocolos de transformação estável. Após incubação das bactérias com acetosiringona ou qualquer outro composto fenólico conhecido por aumentar a transferência de T-DNA para Agrobacterium, 1 ml da cultura de Agrobacterium foi infiltrado numa folha de planta in situ (de, e.g., planta do tabaco ou batata ou tomate) através de injecção, após o que as plantas foram colocadas numa estufa e infectadas com um agente patogénico, de preferência P. infestans. Após 2-5 dias, as folhas podem ser avaliadas relativamente à ocorrência de sintomas de resistência.

No presente invento, identificámos e isolámos o gene da resistência Rpi-blb, o qual confere resistência não especifica de raça contra Phytophthora infestans. O gene foi clonado a partir de um genótipo de Solanum bulbocas-tanum que é resistente a P. infestans. O gene de resistência isolado de acordo com o invento pode ser transferido para uma planta hospedeira susceptível usando a transformação mediada por Agrobacterium ou qualquer outro método de transformação conhecido e está envolvido na passagem da planta hospedeira a resistente a aqentes patoqénicos de plantas, especialmente P. infestans. A planta hospedeira pode ser batata, tomate ou qualquer outra planta, em particular um membro da família Solanaceae que possa ser infectado por tal agente patogénico de plantas. 0 presente invento proporciona também uma sequência de ácido nucleico codificadora desta proteína ou um seu equivalente funcional, de preferência compreendendo o gene Rpi-blb, o qual está descrito na Figura 6.

Com a proteína de resistência Rpi-blb ou fragmento funcionalmente equivalente da mesma de acordo com o invento, possui-se um meio eficaz de controlo de agentes patogénicos de plantas, uma vez que o gene codificador da proteína pode ser usado para a transformação de genótipos de plantas susceptíveis, produzindo assim plantas geneticamente transformadas tendo uma susceptibilidade reduzida ou sendo de preferência resistentes a uma gente patogénico de plantas. Em particular, uma planta geneticamente transformada com o gene de resistência Rpi-blb de acordo com o invento, possui uma susceptibilidade reduzida a P. infestans .

Numa realização preferida, o gene de resistência Rpi-blb compreende a sequência codificadora apresentada na Figura 6A ou qualquer sequência homóloga ou parte dela pre cedida de uma região de promotor e/ou seguida de uma região de terminador. A região do promotor deverá ser funcional em células vegetais e, de preferência, corresponde à região do promotor nativo do gene Rpi-blb. No entanto, pode igualmente ser empregue uma região de promotor heterólogo que seja funcional em células vegetais, conjuntamente com as sequências codificadoras.

Ainda, o invento está relacionado com a proteína de resistência a Rpi-blb que é codificada pelo gene Rpi-blb de acordo com o invento e que possui uma sequência de aminoácidos apresentada na Figura 8. 0 sinal que desencadeia a expressão do gene de resistência em S. bulbocastanum ou nas plantas transgénicas do invento é provavelmente causado pela presença de um agente patogénico, mais especificamente pelo agente pato-génico P. infestans. Tais sistemas são conhecidos para outras interacções de agente patogénico-planta (Element, Z., In: Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, eds.: Mount, M.S. and Lacy, G.H., New York, Academic Press, 1982, pp. 149-177), e o uso deste sistema pode ser feito para aumentar a aplicabilidade da proteína de resistência resultando numa resistência a mais agentes patogénicos (ver EP 474 857). Este sistema utiliza o composto indutor derivado do agente patogénico e o gene de resistência correspondente, em que o gene da resistência quando activado pela presença do indutor conduz a morte celular local (reacção de hipersensibilidade). No caso do presente gene de resistência, o componente indutor correspondente ainda não foi descrito, mas pensa-se que isto seja conseguido por alguém familiarizado com a arte. Uma vez o composto indutor isolado, será possivel transformar o gene codificador do referido indutor juntamente com o gene codificador da proteína de resistência na planta, pelo que um dos genes está sob o controlo de um promotor induzivel pelo agente pato-génico. Estes promotores são conhecidos na arte (e.g., prpl, Fisl, Bet v 1, Vstl, gstAl, e sesquiterpeno ciclase, mas pode ser usado qualquer promotor induzivel por um agente patogénico que seja activado após infecção com o agente patogénico). Se a planta transgénica possuir tal sistema, então o ataque pelo agente patogénico, que é capaz de activar o promotor induzivel pelo agente patogénico, causará a produção do componente que está sob o controlo do referido promotor e este, em associação com o outro componente a ser expresso constitutivamente, causará a ocorrência da reação de resistência. É igualmente possivel mutar a proteina de resistência fazendo com que ela esteja num estado activo (ver EP 1060257). Uma vez que isto resultará permanentemente na ocorrência da reacção de resistência, que em último caso conduz à morte celular local, deverá ter-se cuidado em não expressar constitutivamente a proteina de resistência. Isto pode ser conseguido colocando a proteina de resistência mutada sob o controlo de um promotor induzivel pelo agente patogénico, o que não só permitirá a expressão da proteina de resistência activa apenas quando do ataque do agente patogénico, como também permitirá que uma gama mais larga de agentes patogénicos induza a reacção de hipersensibi-lidade. A mutação dos residuos de treonina e serina para residuos de ácido aspártico e ácido glutâmico frequentemente conduz a activação, como foi demonstrado em muitas proteínas cuja actividade é modulada por fosforilação, e.g. numa proteina activada por MAPK (Engel et al, 1995, J. Biol. Chem. 270, 27213-27221), e numa proteina cinase MAP-cinase (Huang et al., 1995 Mol. Biol.Cell 6, 237-245). Igualmente mutantes com deleções C- e N-terminais assim como deleções internas destas proteínas podem ser testados relativamente aos mutantes adequados.

Uma forma menos dirigida de identificação de mutantes interessantes para os quais a actividade constitutiva seja induzida é através da propagação do DNA codificador da proteina nas chamadas estirpes indutoras de mutações de E. coli.

Uma forma rápida de testar todos os mutantes relativamente à sua adequação para induzir uma resposta hipersensivel é através do chamado ensaio ATTA (Van den Ackerveken, G., et al., Cell 87, 1307-1316, 1996). Muitos mutantes podem ser testados com baixo esforço para identificar os que induzem uma HR quando da expressão. A divulgação também proporciona um vector compreendendo um ácido nucleico como aqui proporcionado, o referido ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de conferir a um membro da família Solanaceae resistência contra um agente patogénico oomicete ou um seu equivalente funcional isolado ou ácido nucleico recom-binante, em particular em que o referido membro compreende S. tuberosum ou Lycopersicon esculentum. 0 invento também proporciona uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou um vector de acordo com o invento. Um exemplo da referida célula hospedeira é proporcionado na descrição detalhada aqui apresentada. Numa realização particular, a referida célula hospedeira compreende uma célula vegetal. Como célula vegetal, prefere-se uma célula derivada de um membro da família Solanaceae, em particular em que o referido membro compreende S. tuberosum ou Lycopersicon esculentum. A partir de tal célula, ou protoplasto, pode surgir uma planta transgénica, como seja uma batateira ou um tomateiro trans-génico com resistência contra uma infecção por oomicete. A divulgação também proporciona assim uma planta, tubérculo, fruto ou semente ou progenitura derivada dos mesmos compreendendo uma célula de acordo com o invento.

Ainda, o invento proporciona uma substância proteica, apresentando a característica de conferir pelo menos resistência parcial a uma infecção por oomicete, como seja uma causada por P. infestans, quando incorporada e expressa numa planta ou célula vegetal. Em particular, é proporcionada tal substância proteica que é codificada por um ácido nucleico de acordo com o invento. Numa realização preferida, o invento proporciona uma substância proteica compreendendo uma sequência de aminoácidos como descrito na Figura 8 ou um seu equivalente funcional. De preferência, tal equivalente funcional compreenderá uma ou mais sequências que são relativamente únicas para Rpi-blb comparativamente com RGC3~blb, RGC-blb e RGC4-blb. Tais sequências podem ser assinaladas no alinhamento (ver fig. 10A) e serão as sequências RPLLGEM, AKMEKEKLIS, KHSYTHMM, FFYTLPPLEKFI, GDSTFNK, NLYGSGMRS, LQYCTKLC, GSQSLTCM, NNFGPHI, TSLKIYGFRGIH, nHECPFLTLS, RICYNKVA e KYLTISRCN. Pensa-se que uma ou mais destas sequências proporcionem as carac-teristicas funcionais da proteina Rpi-blb.

Ainda, a divulgação proporciona uma molécula de ligação dirigida a um ácido nucleico de acordo com o invento. Por exemplo, o gene Rpi-blb pode ser usado para o desenho de oligonucleótidos complementares de uma cadeia da sequência de DNA como descrito na Figura 7 e Tabela 2. Tais oligonucleótidos como aqui proporcionados são úteis como sondas para o rastreio de bibliotecas, sondas de hibridação para análise Southern/Northern, sequências iniciadoras para PCR, para usar num kit de diagnóstico para a detecção de resistência a doença, etc. Tais oligonucleótidos são fragmentos úteis de um ácido nucleico isolado ou recombinante como aqui proporcionado, o referido ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de conferir a um membro da familia Solanaceae resistência contra um fungo oomicete ou um seu equivalente funcional ou ácido nucleico recombinante, em particular em que o referido membro com preende S. tuberosum ou Lycopersicon esculentum. Podem ser facilmente seleccionados de uma sequência como descrito na Figura 6 ou parte dela. Um ponto particular de reconhecimento compreende o dominio LRR como aqui identificado. Tal molécula de ligação de acordo com o invento é usada como sonda ou sequência iniciadora, por exemplo dotada de uma marca, em particular em que a referida marca compreende uma fracção excitável que a torna útil para detectar a presença da referida molécula de ligação. 0 invento ainda proporciona um método para selecção de uma planta ou material vegetal, ou progenitura dos mesmos, relativamente à sua susceptibilidade ou resistência a uma infecção por oomicete compreendendo a testagem de pelo menos parte da referida planta ou material vegetal ou sua progenitura relativamente à presença ou ausência de um ácido nucleico, o referido ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de dotar um membro da familia Solanaceae com resistência contra um fungo oomicete ou relativamente à presença do referido produto de gene, o referido método de preferência compreendendo o contacto de pelo menos parte da referida planta ou material vegetal, ou progenitura da mesma, com uma molécula de ligação de acordo com o invento e determinação da ligação da referida molécula à referida parte. 0 referido método é particularmente útil quando o referido oomicete compreende P. infestans, permitindo seleccionar plantas ou material vegetal relativamente à resistência contra o mildio, por exemplo em que a referida planta ou material compreende S. tuberosum. Pensa- se que através da análise de árvores filogenéticas como discutido atrás, as proteínas que sejam altamente homólogas de Rpi-blb e que confiram resistência contra agentes pato-génicos de plantas sejam facilmente identificadas. Um exemplo disto é a detecção de três proteínas altamente homólogas RGCl-blb, RGC3~blb e RGC4-blb, as quais ainda não se demonstrou que confiram resistência a P. infestans, mas que no entanto se pensa estarem envolvidas na resistência a agentes patogénicos em plantas.

Igualmente, o invento proporciona o uso de um ácido nucleico ou de um vector ou de uma célula ou de uma substância ou de uma molécula de ligação de acordo com o invento num método para conferir a uma planta ou à sua progenitura resistência contra uma infecção por oomicetes, em particular em que o referido oomicete compreende P. infestans, especialmente em que a referida planta copreende S. tuberosum, o referido método para conferir à planta ou à sua progenitura pelo menos resistência parcial contra uma infecção por oomicetes compreendendo obtenção da referida planta ou parte da mesma com um gene codificador de uma proteína de resistência ou seu fragmento funcional compreendendo um ácido nucleico, a referida proteína de resistência sendo capaz de conferir a um membro da família Solanaceae resistência contra um fungo oomicete ou dotando a referida planta ou parte dela com um ácido nucleico ou um vector ou célula ou uma substância de acordo com o invento.

Ainda, o invento proporciona uma S. bulbocastanum ou parte da mesma, como seja um tubérculo ou semente, sus-ceptível a uma infecção por oomicete causada por P. infestans. 0 invento é ainda descrito na descrição detalhada abaixo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. Mapa geográfico do México indicando a origem das variedades de Solanum bulbocastanum usadas para isolar o gene Rpi-blb. As letras a, b, e c indicam as origens geográficas relativas às variedades de S. bulbocastanum usadas.

Figura 2. Mapas de ligação genética do locus Rpi- blb no cromossoma 8 de S. bulbocastanum. As linhas horizontais indicam as posições relativas dos marcadores ligados à resistência ao míldio. As distâncias entre os marcadores estão indicadas em centimorgans. A. Posição genética do locus Rpi-blb relativamente aos marcadores TG513, CT88 e CT64 (n=508 genótipos). B. Mapa de ligações genéticas de alta densidade do locus Rpi-blb (n=2109 genótipos).

Figura 3. Mapa físico do locus Rpi-blb. A. Mapa genético e físico da região genómica de S. bulbocastanum contendo Rpi-blb. As setas verticais indicam as posições relativas dos marcadores ligados a resistência. Os números acima da linha horizontal indicam o número de recombinantes identificados entre os marcadores flanqueantes em 2109 plantas filhas. Os rectângulos representam os clones de cromossoma bacteriano artificial (BAC). B. Posições relativas dos genes candidatos à resistência ao mildio em BAC SPB4. C. Representação esquemática da estrutura do gene Rpi-blb. As linhas horizontais indicam exões. As caixas abertas representam sequências codificadoras. As linhas com ângulos para baixo indicam a posição de uma sequência de intrão com 678 nucleótidos.

Figura 4. Análise de hibridação Southern da sequência BAC que abrange o locus Rpi-blb. Os nomes acima de cada pista representam os nomes de clones BAC. Estão indicados os nomes das enzimas de restrição usadas para digerir o DNA BAC antes da transferência Southern.

Figura 5. Ensaios da doença em folhas destacadas. A. Fenótipos resistente (esquerda), intermédio (centro) e susceptivel (direita) encontrados na população de mapea-mento de S. bulbocastanum B8 6 dias após inoculação (d.p.i) com goticulas de esporangiósporos de P. infestans. B. Complementação genética para resistência ao mildio em batata. Os fenótipos de doença, caracteristicos das folhas, derivados de batateiras transgénicas portadoras de RGC1-blb, RGC2-blbr RCG3~blb ou RGC4-blb 6 d.p.i. com goticulas de esporangiósporos de P. infestans. As construções genéticas portadoras de RGCs foram transferidas para o cultivar de batateira susceptivel Impala através de transformação mediada por Agrobacterium. C. Complementação genética de resistência ao mildio em tomate. 0 fenótipo de doença caracteristico das folhas derivado de tomateiros transgé-nicos portadores de Rpi-blb 6 d.p.i. com goticulas de espo-rangiósporos de P. infestans (painel da esquerda). A construção genética portadora de Rpi-blb foi transferida para o cultivar de tomateiro susceptivel Moneymaker através de transformação mediada por Agrobacterium.

Figura 6. Sequências de ácido nucleico de membros do grupo de gene Rpi-blb. A. Sequência de ácido nucleico codificadora do gene Rpi-blb. B. Sequência de ácido nucleico codificadora do gene Rpi-blb incluindo a sequência do intrão (posição 428-1106). C. Sequência do fragmento de DNA genómico Seal de 5,2 kb de S. bulbocastanum BAC SPB4 presente em pRGC2-blb, a construção genética usada para a complementação genética para resistência ao mildio. O fragmento genómico é portador do gene Rpi-blb incluindo elementos reguladores naturais necessários à expressão correcta do gene. O codão de iniciação (ATG na posição 1191-1193) e o codão de terminação (TAA na posição 4781-4783) estão sublinhados. D. Sequência de ácido nucleico codificadora de RGCl-blb incluindo a sequência do intrão (posição 428-708). E. Sequência de ácido nucleico codificadora de RGCl-blb incluindo a sequência do intrão (posição 428-1458). F. Sequência de ácido nucleico codificadora de RGC4-blb incluindo as sequências dos intrões (posições 434-510, 543-618 e 743-1365).

Figura 7. Posições relativas das sequências ini ciadoras. A barra horizontal representa a sequência codificadora do gene Rpi-blb. Os números representam as posições dos nucleótidos. As setas horizontais indicam as posições relativas e orientação das sequências iniciadoras. GSP1 e GSP2 representam sequências iniciadoras especificas externas e internas do gene usadas para as experiências 3' RACE. GSP3 e FSP4 representam sequências iniciadoras externas e internas especificas do gene usadas para as experiências 5' RACE. A(F), A(R), B(F) e B (R) são sequências iniciadoras usadas para amplificar os homólogos de Rpi-blb. A posição do local de restrição Nsil usado para fazer a troca de dominios entre homólogos de Rpi-blb está indicada.

Figura 8. Sequência proteica deduzida de Rpi-blb. A sequência de aminoácidos deduzida a partir da sequência de DNA de Rpi-blb está dividida em três dominios (A-C) , como descrito no Exemplo 6. Os residuos hidrofóbicos no dominio A que formam o primeiro e o quarto residuos das repetições héptadas de potenciais dominios de hélices alfa enroladas estão sublinhados. Os motivos conservados nas proteínas R estão escritos em minúsculas e em itálico no dominio B. Os residuos que correspondem ao consenso da LRR citoplasmática estão indicados a cheio no dominio C. Na sequência foram introduzidos pontos para alinhar a sequência com a sequência LRR de consenso dos LRRs citoplasmá- ticos.

Figura 9. Análise das árvores filogenéticas. A. Árvores filogenética de sequências do estado da arte que partilham algum grau de homologia com a sequência de aminoácidos deduzida de Rpi-blb e os seus membros do grupo de genes RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb. A árvore foi feita de acordo com o método de Neighbour-Joining de Saitou e Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425). Um asterisco indica que foi atribuída uma função ao gene. O grupo de genes Rpi-blb está delimitado por uma caixa. B. Árvore filogenética de sequências do estado da arte que partilham algum grau de homologia com a sequência de aminá-cidos deduzida de Rpi-blb. Nesta análise estão incluídas as sequências homólogas de Rpi-blb, B149-blb, SHIO-tub, SH20-tub e T118-tar, as sequências identificadas através da amplificação por PCR usando sequências iniciadoras especificas do grupo de genes Rpi-blb. C. Posições relativas das sequências de DNA do estado da arte que apresentam homologia significativa com partes da sequência do gene Rpi-blb. As linhas horizontais representam as posições relativas das sequências homólogas. O grau de homologia está indicado à direita de cada linha. O comprimento da sequência homóloga está indicado acima de cada linha.

Figura 10. Alinhamento do produto previsto do gene Rpi-blb com as sequências de proteina previstas dos homólogos de Rpi-blb. A. Alinhamento dos produtos proteicos deduzidos codificados por Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3~blb e RGC4-blb. A sequência de aminoácidos completa de Rpi-blb está apresentada e os residuos de aminoácidos de RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb que diferem do residuo correspondente em Rpi-blb. Os traços indicam espaços inseridos para manter um alinhamento óptimo. Os resíduos de aminoácidos que são específicos de Rpi-blb, quando comparados com os das posições correspondentes em RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb, estão evidenciados a cheio. As reqiões das LRRS que correspondem aos consensos L..L..L.L..C/N/S..α..αΡ estão sublinhadas. Os motivos conservados no domínio NBS estão indicados em minúsculas. B. Alinhamento dos produtos proteicos deduzidos codificados por Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3~blb, RGC4-blb, B149-blb, SHIO-tub, SH20~tub e Til 8- tar.

Figura 11. Esquema global das trocas de domínios feitas entre Rpi-blb e os homólogos RGCl-blb e RGC3-blb. A linha a tracejado vertical indica a posição do local Nsil usado para fazer as trocas. R e S indicam se as plantas transgénicas portadoras das construções quiméricas específicas são resistentes ou susceptíveis à infecção pelo míldio, respectivamente.

Parte experimental

Para o mapeamento do gene de resistência a Rpi-blb, foi desenvolvida uma população com mapeamento intra-específico de S. bulbocastanum. Um passo crucial neste processo foi a identificação de genótipos susceptíveis de S. bulbocastanum. Para tal, várias variedades de S. bulbocastanum derivadas de diferentes grupos/áreas no México foram analisadas relativamente à resistência ou suscep- tibilidade a P. infestans num ensaio com folhas destacadas (Tabela 1 e Figura 1) . As estirpes testadas BGRC 8008 e BGRC 7999 não continham fenótipos susceptíveis. No entanto, nas estirpes BGRC 8005, BGRC 8006 e BGRC 7997 encontrou-se susceptibilidade em 9%, 7% e 14% das plântulas analisadas, respectivamente. Um clone susceptivel a P. infestans com a designação BGRC 8006 foi subsequentemente seleccionado e cruzado com um clone resistente designado BGRC 8005. A população F1 resultante foi usada para mapear o locus Rpi-blb e é portanto referida como a população B8. O rastreio inicial de 42 genótipos B8 relativamente à resistência a P. infestans num ensaio com folhas destacadas sugeriu que a resistência a P. infestans em S. bulbocastanum designada 8005 poderia ser causada por um único gene dominante R ou por um grupo de genes estreitamente ligado. Dos 42 genótipos testados, 22 foram pontuados como resistentes e 16 como susceptiveis numa experiência repetida. Os fenótipos de resistência das restantes 4 plântulas permaneceram indefinidos. De modo a determinar a posição no cromossoma desta resistência de S. bulbocastanum, os genótipos B8 com um fenótipo claro foram usados para análise de marcadores. Encontrou-se que o marcador especifico do cromossoma 8 TG330 (Tabela 2) está ligado em fase de repulsão com o fenótipo de resistência, uma vez que apenas um recombinante foi obtido entre este marcador e a resistência nos 12 genótipos B8. Ainda, encontrou-se que o marcador do cromossoma 8 CT88 (Tabela 2) está totalmente ligado em fase de repulsão a resistência, indicando que o locus responsável pela resistência, designado Rpi-blb, estava situado nesta região do cromossoma 8.

Por este motivo, marcadores específicos do cromossoma 8 do tomateiro mapeados como proximais e distais relativamente a CT88 (TG513 e CT64; Tanksley et al., 1992 Genetics 132: 1141-1160; Tabela 2) foram desenvolvidos em marcadores CAPS e testados em 512 genótipos B8 com fenótipos de resistência conhecidos. Um total de cinco genótipos recombinantes CY64-CT88 e 41 genótipos recombinantes CT88-TG513 foram identificados neste rastreio (Figura 2A). O locus de resistência Rpi-blb foi mapeado 1 evento de recombinação distai relativamente à marca CT88 (Figura 2A). O mapeamento fino do locus Rpi-blb foi realizado com marcadores CAPS derivados das sequências das fronteiras esquerda (L) e direita (R) de clones BAC isolados a partir de uma biblioteca BAC preparada a partir do genótipo resistente de S. bulbocastanum BGRC 8005-8. A biblioteca BAC foi inicialmente testada com os marcadores CT88 e CT64. Os clones BAC identificados com estes marcadores foram usados

como BACs de sementeira para andamento subsequente ao longo do cromossoma relativamente ao locus Rpi-blb. Um total de 2109 genótipos B8 foi testado relativamente a recombinação entre os marcadores TG513 e CT64. Todos os genótipos recombinantes (219/2109) foram subsequentemente testados com todos os marcadores disponíveis no intervalo genético CT88-CT64. Estes dados em conjunto com os dados de resistência a doença de cada recombinante, obtidos através de ensaios com folhas destacadas, posicionaram o locus Rpi-blb entre os marcadores SPB33L e B149R, um intervalo genético de 0,1 cM (4/2109 recombinantes) fisicamente abrangendo os clones BAC sobreponíveis SPB4 e B49 (Figuras 2b e 3) . Dentro deste intervalo a resistência co-segregou com o marcador SPB42L no extremo de BAC, a sequência do qual é altamente homóloga dos fragmentos NBS parciais do tomate (e.g. Q194, Q137, Q152, Q153;Pan et al., 2000 Genetics 155: 309-322). As análises Southern dos clones BAC abrangendo o intervalo SP33L-B149R usando como sonda um fragmento de PCR do marcador SPB42L, marcado com 32P, revelou a presença de pelo menos 4 cópias desta sequência tipo gene R dentro do intervalo Rpi-blb (Figura 4) . Ainda, todas estas cópias estavam presentes em BAC SPB4. A sequenciação e anotação do inserto completo deste clone BAC de facto identificou quatro candidatos a gene R completo (RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3-blb e RGC4-blb) da classe NBS-LRR dos genees R vegetais. Um marcador de PCR que estava situado entre RGCl-blb e RGC4-blb revelou recombinação entre resistência a P. infestans e RGC4-blb, excluindo a possibilidade de RGC4-blb ser Rpi-blb. Apesar deste resultado, os quatro RGCs foram seleccionados para análise de complementação.

Fragmentos genómicos de aproximadamente lOkb portadores de RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3-blb ou RGC4-blb foram subclonados a partir de BAC SPB4 no vector binário de transformação de plantas pBINPLUS (van Engelen et al., 1995 Trans. Res. 4, 288-290) e transferidos para uma variedade de batata susceptivel usando métodos de transformação adequados. Os transformantes primários foram testados relativamente à resistência a P. infestans como descrito no Exemplo 1. Apenas a construção genética portadora de RGC2-blb foi capaz de complementar o fenótipo susceptível; 86% dos transformantes primários portadores de RGC2-blb eram resistentes (Tabela 3) enquanto todos os transformantes primários contendo RGCl-blb, RGC3~blb e RGC4-blb eram completamente susceptiveis a P. infestans. Os transformantes resistentes contendo RGC2-blb mostraram fenótipos de resistência semelhantes ao progenitor resistente S. bulbocastanum (Figura 5). RGC2-blb foi portanto designado o gene Rpi-blb, a sequência de DNA do qual está apresentada na Figura 6.

EXEMPLO 1: ENSAIO DE DOENÇA 0 fenótipo de S. bulbocastanum e os genótipos de S. tuberosum transgénicos para resistência a P. infestans foram determinados através de ensaios com folhas destacadas. As folhas de plantas crescidas durante 6 a 12 semanas na estufa foram colocadas em pedaços de espuma de florista saturados com água, aproximadamente 35x4x4 cm, e colocadas num tabuleiro (40 cm de largura, 60 cm de comprimento e 6 cm de altura) com um fundo perfurado. Cada uma das folhas foi inoculada com duas goticulas ou mais (25 μΐ cada) da solução de esporangiósporos no lado abaxial. Subsequentemente, o tabuleiro foi colocado num saco de plástico sobre outro tabuleiro em que foi colocado um papel de filtro saturado com água e incubado numa câmara climatizada a 17°C e um fotoperiodo de 16h/8h dia/noite com luz fluorescente (Philips TLD50W/84HF). Após 6 dias, as folhas foram avaliadas relativamente ao desenvolvimento dos sintomas da doença por P. infestans. As plantas com folhas que claramente mostraram lesões de esporulação 6 dias após inoculação foram consideradas como tendo um fenótipo sus-ceptível, enquanto as plantas com folhas que não apresentaram sintomas visíveis ou necrose no lado da inoculação na ausência de esporulação clara foram consideradas foram consideradas resistentes. Os ensaios foram realizados com o complexo P. infestans isolado 655-2A (raça 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11), que foi adquirido ao Plant Research International BV (Wageningen, The Netherlands).

EXEMPLO 2: MAPEAMENTO DO LOCUS DE RESISTÊNCIA

Rpi-blb

Material vegetal

Para produzir uma população com mapeamento intra-específico que segregou o gene de resistência a P. infestans presente em S. bulbocastanum variedade BGRC 8005 (CGN 17692, PI 275193), foi necessário um genótipo suscep- tível de S. bulbocastanum. Várias variedades de S. bulbocastanum derivadas de diferentes grupos/áreas no México foram analisadas relativamente à resistência ou suscep- tibilidade a P. infestans num ensaio com folhas destacadas (Tabela 1 e Figura 1). Nas variedades BGRC 8008 e BGRC 7999 não foi detectada susceptibilidade. Nas variedades BGRC 8005, BGRC 8006 e BGRC 7997 a susceptibilidade estava presente em apenas 9%, 7% e 14% das plântulas analisadas, respectivamente. Assim, foram obtidos apenas alguns genó-tipos susceptíveis de S. bulbocastanum. A população com mapeamento intraspecífico de S. bulbocastanum (B8) foi produzida através do cruzamento de um clone susceptivel a P. infestans da variedade BGRC 8006 com um clone resistente da variedade BGRC 8005. DNA de 2109 plantas filhas foi extraido de folhas jovens de acordo com Doyle and Doyle (1989 Focus 12, 13-15).

Análise do marcador CAPS

Para a análise por PCR, prepararam-se misturas de reacção 15 μΐ contendo 0,5 pg de DNA, 15 ng de cada uma das sequências iniciadoras, 0,2 mM de cada dNTP, 0,6 unidades de Taq-polimerase (15 U/μΙ, SphaeroQ, Leiden, The Nether-lands), 10 mM Tris-HCl pH 9, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,1% Triton X-100 e 0,01% (w/v) gelatina. Os PCRs foram realizados usando o seguinte perfil de ciclos: 25 segundos de desnaturação do DNA a 94°C, 30 segundos de empa- relhamento (ver Tabela 1) e 40 segundos de extensão a 72°C. Como primeiro passo na amplificação por PCR, o DNA foi desnaturada durante 5 min a 94°C e finalizado por um passo extra de extensão durante 5 min a 72°C. As reacções de amplificação foram realizadas num termociclador Biometra® T-Gradient ou Biometra® Uno-II (Westburg, Leusden, The Netherlands). Dependendo do marcador, o produto de PCR foi digerido com uma enzima de restrição adequada. Na Tabela 2 está apresentada uma visão global dos marcadores incluindo sequências iniciadoras, temperatura de emparelhamento e enzimas de restrição. Subsequentemente, os produtos de PCR (digeridos) foram analisados por electroforese em géis de agarose ou acrilamida. Para a análise por gel de acril-amida, foram usados os kits CleanGel DNA Analysis Kit e DNA Silver Staining Kit (Amersham Pharmacia Biotech Benelux, Roosendaal, the Netherlands).

Mapeamento genético do locus Rpi-blb

Inicialmente um pequeno grupo de 42 plantas filhas da população B8 foi testado relativamente à resistência a P. infestans num ensaio com folhas destacadas. As plantas com folhas que claramente mostraram lesões de esporulação 6 dias após inoculação foram consideradas como tendo um fenótipo susceptível enquanto as plantas com folhas sem sintomas ou necrose visíveis no lado da inoculação na ausência de esporulação clara foram consideradas como sendo resistentes. Das 42 plântulas, 22 foram avaliadas como resistentes e 16 como susceptíveis. 0 fenótipo das 4 plântulas restantes manteve-se indeterminado nesta fase inicial. Estes dados indicam que a resistência poderá ser devida a um único gene dominante ou a um grupo de genes estreitamente ligados. Para determinar a posição no cromossoma, as plântulas com um fenótipo claro foram usadas para análise de marcadores. Encontrou-se que o marcador do cromossoma 8 TG330 está ligado em repulsão com o fenótipo de resistência, uma vez que apenas um recombinante foi obtido entre este marcador e resistência em 12 plântulas B8. Ainda, encontrou-se que o marcador do cromossoma 8 CT88 está completamente ligado em fase de repulsão a resistência, indicando que um gene de resistência está situado no cromossoma 8.

Subsequentemente, os marcadores específicos do cromossoma 8 que tinham sido mapeados como proximal e distai relativamente a CT88 (Tanksley et al, 1992 Genetics 132: 1141-1160) foram desenvolvidos para marcadores CAPS. De forma a mapear estes marcadores com maior precisão, mais 512 indivíduos da população B8 foram testados relativamente à resistência ao míldio usando o ensaio com folhas destacadas. Simultaneamente, as plantas foram classificadas relativamente aos marcadores CT64, CT88 e TG513. Para 5 plântulas, detectou-se recombinação entre os marcadores CT64 e CT88, enquanto 41 plântulas eram recombinantes entre os marcadores CT88 e TG513 (Figura 2A). O gene da resistência Rpi-blb foi mapeado entre os marcadores CT64 e CT88. Nesta fase, o posicionamento de CT88 proximal relativamente a Rpi-blb foi baseado em apenas uma plântula recombinada.

De forma a determinar a posição de Rpi-blb com mais precisão relativamente aos marcadores disponíveis, mais 1555 plântulas da população B8 foram crescidas e analisadas relativamente à recombinação entre os marcadores TG513 e CT64. Assim, foi testado um total de 2109 clones individuais da progenitura da população B8. A recombinação entre os marcadores TG513 e CT64 foi detectada em 219 destas plântulas (10,4 cM) . Todos os recombinantes foram testados com o marcador CT88 e fenotipados relativamente à característica de resistência usando o ensaio com folhas destacadas. De acordo com resultados anteriores, o gene Rpi-blb foi mapeado entre os marcadores CT88 e CT64 (Figura 2B) . EXEMPLO 3: CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA BAC PARA S. BULBOCASTANUM E CONSTRUÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA BAC CONTÍGUA ABRANGENDO O LOCUS Rpi-blb

Construção da biblioteca BAC

Um clone resistente de S. bulbocastanum (blb) variedade BGRC 8005 (CGN 17692, PI 275193) heterozigótico para o locus Rpi-blb, foi usado como fonte de DNA para a construção de uma biblioteca BAC genómica, daqui em diante referida como biblioteca BAC 8005-8. A preparação de DNA de

elevada massa molecular e a construção da biblioteca BAC foram realizadas como descrito em Rouppe van der Voort et al. (1999 MPMI 12: 197-206). Aproximadamente 130000 clones com um tamanho médio do inserto de 100 kb, que correspondem a 15 equivalentes de genoma foram obtidos no final. Um total de aproximadamente 83000 clones individuais foi guardado em 216 placas de microtitulação de 384 alvéolos (Invitrogen, The Netherlands) contendo tampão de congelação LB (36 mM K2HPO4, 13,2 mM KH2PO4, 1,7 mM citrato, 0,4 mM MgS04, 6,8 mM (NH4)2SO4, 4,4 % V/V glicerol, 12,5 pg/ml cloranfenicol em meio LB) a -80°C. Mais 50000 clones foram guardados como lotes de bactérias contendo -1000 colónias brancas. Estas foram geradas raspando as colónias das placas de agar em meio LB contendo 18% de glicerol e 12,5 pg/ml de cloranfenicol com um espalhador de vidro estéril. Os chamados super-lotes foram igualmente guardados a -80°C.

Rastreio da biblioteca BAC e construção de um mapa físico do locus Rpi-blb Δ biblioteca BAC 8005-8 foi inicialmente testada com os marcadores CAPS CT88 e CT46. Isto foi realizado como se segue. Para a primeira parte da biblioteca de aproxima-damente 83000 clones guardados em placas de microtitulação de 384 alvéolos, isolou-se DNA de plasmideo usando o protocolo de lise alcalina convencional (Sambrook et al., 1989 in Molecular cloning: a laboratory manual 2nd edn, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) a partir das bactérias reunidas de cada placa para produzir 216 lotes de placas. Para identificar os clones BAC individuais portadores dos marcadores CAPS, os lotes das placas foram testados por PCR. Uma vez um lote de placa individual identificado como positivo para um marcador CAPS particular, a fila e coluna positivas foram identificadas através de um rastreio por PCR em duas dimensões. Para tal, a placa mãe de 384 alvéolos foi replicada duas vezes em meio LB contendo cloranfenicol (12,5 pg/ml). Após crescimento das colónias durante 16 horas a 37°C usou-se uma placa para raspar as 16 colónias de cada coluna em conjunto. As bactérias de cada fila ou coluna foram ressuspensas em 200 μΐ de tampão TE. A análise dos marcadores CAPS em 5 μΐ destas suspensões bacterianas foi subsequentemente realizada levando à identificação de clones BAC positivos individuais. Para a segunda parte da biblioteca, guardada como 50 lotes de aproximadamente 1000 clones, o DNA plasmidico foi isolado a partir de cada lote de clones usando o protocolo de lise alcalina convencional e realizou-se PCR para identificar os lotes positivos. As bactérias correspondentes aos lotes positivos foram diluídas e semeadas em placas de agar LB contendo cloranfe-nicol (12,5 pg/ml). Colónias brancas individuais foram subsequentemente picadas para placas de microticulação de 384 alvéolos e os clones BAC positivos individuais foram subsequentemente identificados como descrito atrás. Os nomes de clones BAC isolados a partir dos super-lotes possuem o prefixo SP (e.g. SPB33).

Os insertos dos clones BAC foram estimados como se segue. Os clones BAC positivos foram analisados através do isolamento de DNA plasmídico de 2 ml de cultura crescida durante a noite (meio LB suplementado com 12,5 mg/ml de cloranfenicol) usando o protocolo de minipreparação por lise alcalina convencional e ressuspenso em 20 μΐ de TE. O DNA plasmídico (10 μΐ) foi digerido com 5 U de Notl durante 3 hr a 37°C para libertar o DNA genómico do vector pBeloBACll. O DNA digerido foi separado por electroforese CHEF num gel de 1% de agarose em 0,5x TBE a 4°C usando um sistema BIORAD CHEF DR II (Bio-Rad Laboratories, USA) a 150 volts com um tempo de pulso constante de 14 seg durante 16 horas. O rastreio da biblioteca BAC 8005-8 com o marcador CT88 identificou dois clones BAC positivos: B139 e B180, com os insertos de DNA de batata de 130 e 120 kb, respectivamente (Figura 3A). A digestão com Mbol do produto de PCR CT88 gerado a partir destes clones BAC e de vária plantas filhas resistentes e susceptiveis da população com mapeamento B8 revelou que BAC139 era portador do alelo CT88 que estava ligado em cis à resistência. Para identificar a posição relativa no genoma de BAC B139, pares de sequências iniciadoras para PCR foram desenhados para a sequência dos extremos direito (R) e esquerdo (L) do inserto. A sequenciação do extremo BAC foi realizada como descrito no Exemplo 4 usando 0,5 pg de DNA BAC como matriz. Marcadores CAPS polimórficos foram desenvolvidos por digestão dos produtos de PCR dos dois genótipos parentais da população B8 e de dois genótipos de progenitura resistente e susceptivel com várias enzimas de restrição que cortam em locais de 4 bases (Tabela 2) . O rastreio dos 37 genótipos B8 recom-binantes CT88-CT64 mapeou 5 dos 7 recombinantes CT88-Rpi-blb entre CT88 e B139R, indicando que o marcador B139R estava relativamente mais perto do locus Rpi-blb que o marcador CT88. O rastreio dos 216 lotes de placas com B139R não conduziu à identificação de um clone BAC positivo. O rastreio dos 50 super-lotes identificou os clones BAC positivos SPB33 e SPB42 com os insertos de DNA de 85 e 75 kb, respectivamente (Figura 3A) . O rastreio da biblioteca BAC completa com SPB33L identificou os clones BAC positivos B149 e SPB4. O clone BAC SPB4 continha o alelo SPB33L que estava ligado em cis a resistência, enquanto o clone BAC B149 não. No entanto, o rastreio do painel de recombinantes CT88-CT64 com B149R revelou que este BAC estendia-se pelo locus Rpi-blb. B149R foi separado do locus Rpi-blb por dois eventos de recombinação (Figura 3A) . O rastreio da biblioteca BAC 8005-8 com B149R identificou o clone BAC B49 como tendo o alelo B149R que estava ligado em cis a resistência. Este clone BAC juntamente com o clone BAC SPB4 formou portanto uma sequência continua BAC que se estendia pelo locus Rpi-blb (Figura 3) . EXEMPLO 4: ANÁLISE DA SEQUÊNCIA DE BAC SPB4 E IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS AO GENE DE RESISTÊNCIA DENTRO DO LOCUS Rpi-blb

Dentro do intervalo SPB33L-B149R a resistência co-segregou com o marcador SPB42L do extremo BAC, a sequência do qual era altamente homóloga dos fragmentos NBS parciais do tomate (e.g., Q194, Q137, Q97, Q152, Q153; Pan et al., 2000 Genetics 155:309- 22). A análise Southern dos clones BAC abrangendo o intervalo SPB33L-B149R, usando como sonda um fragmento de PCR do marcador SPB42L marcado com

Q O P, revelou a presença de pelo menos 4 copias desta sequência tipo gene R dentro do intervalo Rpi-blb (Figura 4) . Ainda, todas estas cópias estavam presentes em BAC SPB4. A sequência de DNA do clone BAC SPB4 foi portanto determinada por análise de múltiplas sequências mais curtas ("shotgun sequences"). Gerou-se uma série de subclones aleatórios com um tamanho médio do inserto de 1,5 kb. 10 pg de DNA purificado com CsCl foi partido durante 6 segundos em gelo com uma amplitude de 6 microns em 200 μΐ de TE usando um sonicador MSE soniprep 150. Após precipitação com etanol e ressuspensão em 20 μΐ de TE, os extremos dos fragmentos de DNA foram reparados por incubação com DNA-polimerase T4 a 11°C durante 25 minutos numa mistura de reacção de 50 μΐ compreendendo tampão DNA-polimerase T4 IX (New England BioLabs, USA), 1 mM DTT, 100 μΜ dos 4 dNTP's e 25 U DNA-polimerase T4 (New England Biolabs, USA), seguido de incubação a 65°C durante 15 minutos. O DNA partido foi subsequentemente separado por electroforese em gel de 1% de agarose SeaPlaque LMP (FMC) . A fracção com um tamanho de 1,5-2,5 kb foi removida do gel e dialisada contra 50 ml de TE durante 2 hr a 4°C. As fatias de agarose dialisadas foram então transferidas para um tubo Eppendorf de 1,5 ml, fundidas a 70°C durante 5 min, digeridas com 1 unidade de GELASE (Epicentre Technologies, USA) por 100 mg de gel de agarose durante 1 hr a 45°C e o DNA foi subsequentemente precipitado. Os fragmentos de 1,5-2,5 kb foram ligados a 16°C num vector pBluescript SK+ (Stratagene Inc.) cortado com EcoRV e desfosforilado. A mistura de ligação foi subsequentemente usada para transformar células competentes E. coli DH10B ElectroMAX (Life Technologies, UK) por electroporação usando o sistema BioRad Gene Pulser. Os parâmetros estabelecidos no BioRad Gene Pulser foram como recomendados para E. coli pelo fabricante. As células foram espalhadas em placas de agar Luria Bertani (LB) contendo ampicilina (100 pg/ml), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosidase (Xgal) (100 pg/ml), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosidase (Xgal) (64 pg/ml) e isopropil-1-tio-p-D-galactósido (IPTG) (32 pg/ml). As placas foram incubadas a 37°C durante 24 horas. Colónias brancas individuais foram crescidas em blocos de fundo plano de 96 alvéolos (1,5 ml de meio Terrific Broth contendo 100 pg/ml de ampicilina). 0 DNA plasmídico foi isolado com um sistema QIAprep 96 Turbo Miniprep conjuntamente com o BioRobot™ 9600 (QIAGEN) de acordo com as instruções dos fabricantes. As reacções de sequenciação foram realizadas usando o kit de sequenciação ABI PRISM BigDye™ Terminator cycle (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os clones foram sequenciados bidireccionalmente usando sequências iniciadoras universais. Os produtos de sequenciação foram separados por electroforese capilar num analisador de DNA Perkin Elmer ABI 3700. A montagem automática das leituras de múltiplas sequências mais curtas ("shotgun") foi realizada usando os programas Phred-Phrap (Ewing and Green, 1998 Genome Research 8, 186-194; Ewing et al., 1998 Genome Research 8,

175-185). Um total de 835 leituras gerou uma cobertura global de sequências BAC igual a 5x. Os intervalos entre sequências foram fechados por andamento através de sequências iniciadoras ("primer walking") ou através de uma abordagem de PCR combinatório. A sequência foi finalmente editada em Phred qualidade 40 (1 erro cada 10000 nt) através de inspecção manual da montagem usando o editor de sequências Gap4 e re-sequenciação de todas as regiões de baixa qualidade. A sequência completa do inserto de BAC SPB4 consistiu em 77283 nucleótidos. A análise da sequência contigua de BAC SPB4 usando o programa informático GENSCAN (Burge and Karlin, 1997 J. Mol. Biol: 268, 78-94), GENEMARK (Lukashin and

Borodovsky, 1998 NAR 26, 1107-1115) e BLASTX (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215, 403-410) identificou quatro sequências candidatas ao gene R completo (RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3~blb e RGC4-blb) pertencente às classes NBS-LRR dos genes R de plantas. Um marcador CAPS desenhado entre RGCl-blb e RGC4-blb, marcador RGC1-4, revelou recombinação entre a resistência a P. infestans e RGC4-blb, excluindo a possibilidade de RGC4-blb ser Rpi-blb (Figura 3A e B). Apesar deste resultado, os quatro RGCs foram seleccionados para análise de complementação.

EXEMPLO 5: ANÁLISE DE COMPLEMENTAÇÃO

Subclonagem de genes candidatos e transformação de Agrobacterium tumefaciens

Os fragmentos genómicos de aproximadamente 10 kb contendo RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3- blb ou RGC4-blb foram subclonados a partir do clone BAC SPB4 no vector de transformação binário de plantas pBINPLUS (van Engelen et al., 1995 Trans. Res. 4, 288-290) . A digestão com enzimas de restrição do DNA do clone BAC SPB4 e subsequente selecção por tamanho foi realizado como se segue. Aliquotas de ~1 pg de DNA foram digeridas com 1 U, 0,1 U ou 0,01U da enzima de restrição Sau3Al durante 30 min. O DNA de BAC parcialmente digerido foi sujeito a electroforese CHEF a 4°C em TBE 0,5X usando um tempo de pulso crescente linear de 1-10 seg e uma força de campo de 6V/cm durante 16 hr. Após electroforese, o gel de agarose foi corado com brometo de etídio para localizar a região do gel contendo fragmentos de DNA de aproximadamente 10 kb de tamanho. Esta região foi cortada do gel usando uma lamela de vidro e dialisada contra 50 ml de TE durante 2 hr a 4°C. As fatias de agarose dialisadas foram então transferidas para um tubo Eppendorf de 1,5 ml, fundidas a 70°C durante 5 min e digeridas com 1 unidade de GELASE (Epicentre Technologies, USA) por 100 mg de gel de agarose durante 1 hr a 45°C. A ligação do DNA do tamanho seleccionado a pBINPLUS, digerido com BamHI e desfosforilado, e subsequente transformação de células competentes E. coli DH10B ElectroMAX (Life Technologies, UK) com o DNA ligado foram realizadas como descrito no Exemplo 5, usando o BioRad Gene Pulser para electroporação. As células foram semeadas em placas de agar de Luria Bertani (LB) contendo canamicina (50 pg/ml), Xgal (64 pg/ml) e IPTG (32 pg/ml). As placas foram incubadas a 37°C durante 24 horas. Colónias brancas individuais foram crescidas em placas de 96 alvéolos (100 μΐ de meio LB contendo 50 pg/ml de canamicina). Um total de 480 clones foi testado por PCR relativamente à presença de RGCs usando as sequências iniciadoras SPB42LF e SPB42LR ou RGC4F e RGC4R (Tabela 2.). Os clones positivos foram seleccionados para isolamento de plasmídeo e posterior caracterização. A identificação dos clones portadores de RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3~blb ou RGC4-blb foi realizada por sequenciação dos fragmentos de PCR SPB42L derivados dos clones positivos. A posição relativa dos RGCs dentro de um subclone foi determinada por sequenciação dos extremos do clone e subsequente comparação das sequências com a sequência completa do inserto BAC. Finalmente quatro plasmídeos binários, pRGCl-blb, pRGC2- blb, pRGC3-blb e pRGC4-blb foram seleccionados e transferidos para Agrobacterium tumef adens estirpes AGLO (Lazo et al, 1991 Bio/Technology 9, 963-967), LBA4404 (Hoekema et al, 1983 Nature 303: 179- 180) ou UIA143 (Farrand et al., 1989 J. of Bacteriology 171, 5314-5321) por electroporação usando o aparelho BioRad Gene Pulser ou por conjugação. Os parâmetros do BioRad Gene Pulser foram os recomendados para A. tumefaciens pelo fabricante. A conjugação foi realizada como descrito por Simon et al. (1983 Bio/Tech. 1, 784-791) . As células foram semeadas em placas de agar de Luria Bertani (LB) contendo canamicina (100 mg/1) e rifampicina (50 mg/1). As placas foram incubadas a 28°C durante 48 horas. As culturas em pequena escala de colónias seleccionadas foram crescidas em meio LB contendo canamicina (100 mg/1) e rifampicina (50 mg/1) . O DNA plasmídico foi isolado como anteriormente descrito e a integridade dos plasmídeos foi verificada por análise de restrição quando do re-isolamento a partir de A. tumefaciens e subsequente transformação de E. coli. As culturas de A. tumefaciens portadoras de um plasmídeo com o padrão de DNA correcto foram usadas para transformar um genótipo de batata susceptível.

Transformação de uma variedade de batata susceptível

As estirpes de A. tumefaciens foram crescidas durante 2 dias a 28°C em 20 ml de meio LB suplementado com 50 mg/1 de rifampicina e 25 mg/1 de canamicina. Subsequentemente, 0,2 ml de cultura de A. tumefaciens foi diluído em 10 ml de meio LB contendo os mesmos antibióticos e crescida durante a noite (28°C). Δ cultura crescida durante a noite foi centrifugada (30 min, 2647 xg) e o sedimento foi ressuspenso em 50 ml de meio MS(Murashige and Skoog, 1962 Physiol. Plant. 15, 473-497) suplementado com 30 g/1 de sucrose (MS30).

Batatas de semente certificadas da variedade Impala foram descascadas e a superfície esterilizada durante 30 min numa solução de hipoclorito de sódio a 1% contendo 0,1% Tween-20. Os tubérculos foram então bem lavados em grandes volumes de água destilada estéril (4 vezes, 10 min). Discos de aproximadamente 2 mm de espessura e 7 mm de diâmetro, foram fatiados a partir de cilindros de tecido do tubérculo preparados com perfurador de cortiça. Os discos de tubérculo foram transferidos para meio líquido MS30 contendo A. tumefaciens e incubados durante 15 min. Após remoção da solução de A. tumefaciens, os discos de tubérculo foram transferidos para meio de regeneração contendo MS30, 0,9 mg/1 de IAA, 3,6 mg/1 de zeatina ribósido e 8 g/1 de agar (Hoekema et ai., 1989

Bio/Technology 7, 273-278). As placas foram incubadas a 24°C, 16 hr de luz diurna (Philips TLD50W/84HF) . Após 48 horas de co-cultura, os discos de tubérculo foram lavados durante 5 min em meio líquido MS incluindo antibióticos, 200 mg/1 de vancomicina, 250 mg/1 de cefotaxim e 75 mg/1 de canamicina e transferidos para meio de regeneração suplementado com os mesmos antibióticos. As placas foram incubadas a 24°C, 16 horas de luz diurna (Philips TLD50W/84HF). Cada três semanas, os discos de tubérculo foram transferidos para meio fresco. Os rebentos que regeneraram foram transferidos para meio MS30 contendo 75 mg/1 de canamicina. Os rebentos com raizes foram propagados in vitro e testados relativamente à ausência de células de A. tumefaciens através de incubação de um pedaço de caule em 3 ml de meio LB (3 semanas, 37°C, 400 rpm) . Uma planta da cada regenerante transformada foi transferida para a estufa.

Complementação do fenótipo susceptível em batata

Os transformantes primários foram testados relativamente à resistência a P. infestans como descrito no Exemplo 1. Apenas a construção genética portadora de RGC2-blb foi capaz de complementar o fenótipo susceptivel; 15 de 18 RCG2-blb contendo os transformantes primários eram resistentes (Tabela 3) enquanto os transformantes primários com RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb eram totalmente suscep- tíveis a P. infestans. Os transformantes resistentes a RGC2-blb mostraram fenótipos de resistência semelhantes aos do progenitor S. bulbocastanum resistente (Figura 5). RGC2-blb foi portanto designado o gene Rpi-blb, a sequência de DNA do qual está apresentada na Figura 6.

Transformação de tomate susceptível

Sementes de tomate susceptivel da linha Money-maker foram lavadas em 70% de etanol para dissolver o revestimento da semente e lavadas com água estéril. Subsequentemente, as sementes foram esterilizadas na superfície em 1,5% de hipoclorito de sódio durante 15 minutos, lavadas três vezes em água estéril e colocadas em contentores contendo 140 ml de meio MS pH 6,0 (Murashige and Skoog, 1962 Physiol. Plant. 15, 473-497) suplementado com 10 g/1 de sucrose (MS 10) e 160 ml de vermiculite. As sementes foram deixadas a germinar durante 8 dias a 25°C e 0,5 W/M2 de luz.

Explantes de cotilédones com oito dias de idade foram pré-cultivados durante 24 horas em placas de Petri contendo uma cama da de suporte com duas semanas de idade de suspensão de células de tabaco semeadas em meio de co-cultura (MS30 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, The Netherlands), 0,5 g/1 tampão MES e 8 g/1 de agar Daichin).

As culturas crescidas durante a noite de A. tumefaciens foram centrifugadas e o sedimento foi ressus-penso em meio de suspensão de células (MS30 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch, 0,5 g/1 de tampão MES, pH 5,8) contendo 200 μΜ acetosiringona para uma D.O.600 final de 0,25. Os explantes foram então infectados com a cultura de A. tumefaciens estirpe UIA143 (Farrand et al., 1989 J. of Bacteriology 171, 5314-5321) crescida durante a noite e diluída, contendo o plasmideo auxiliar pCH32 (Hamilton et al., 1996 PNAS 93, 9975-9979) e pRGC2-blb durante 25 minutos, secos com papel de filtro e co-cultivados durante 48 horas nas placas com a camada de suporte original. As condições de cultura foram como descrito atrás.

Após co-cultura, os explantes de cotilédones foram transferidos para placas de Petri com meio selectivo indutor de rebentos (MS pH 5,8 suplementado com 10 g/1 de glucose, incluindo vitaminas Nitsch, 0,5 g/1 de tampão MES, 5 g/1 de agargel, 2 mg/1 de zeatina ribósido, 400 mg/1 car-benicilina, 100 mg/1 canamicina, 0,1 mg/1 IAA) e cultivados a 25°C com 3-5 W/m2 de luz. Os explantes foram subcul-tivados cada 3 semanas em meio fresco. Os rebentos que surgiram foram dissecados a partir dos calos subjacentes e transferidos para contentores com meio selectivo indutor de raízes (MS10 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch, 0,5 g/1 de tampão MES, 5 g/1 de agargel, 0,25 mg/1 IBA, 200 mg/1 carbenicilina e 100 mg/1 canamicina).

Complementação do fenótipo susceptível em tomate

Para investigar se Rpi-blb poderia complementar o fenótipo susceptível em tomate, os transformantes primários de Moneymaker portadores da construção do gene Rpi-blb foram inicialmente testados com os isolados de P. infestans derivados de batata IP0655-2A e IP0428. Sete de nove transformantes primários eram resistentes (Tabela 3) . Face à observação que os isolados de P. infestans de batata testados eram menos virulentos em tomate que em batata, os transformantes primários foram igualmente testados com um isolado de P. infestans colhido de plantas de tomate de jardim susceptíveis. Apesar destes isolado ser significativamente mais virulento em Moneymaker que os anterior-mente testados, os 7 transformantes primários mantiveram-se resistentes. Estes resultados ilustram a potencial eficácia do gene Rpi-blb não só contra isolados do complexo derivado de batata como também contra os especializados em tomate.

Análise molecular de transformantes primários

Análise por RT-PCR

Para produzir cDNA, uma mistura de 19 μΐ contendo 1 pg de RNA total ou poliA, 0,25 mM de cada dNTP, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT e 530 ng de sequência iniciadora oligo d(T),

GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) 18 foi desnaturada (1 min 83°C). Subsequentemente, a mistura foi colocada a 42°C e adicionado 1 μΐ de transcriptase reversa (transcrip-tase MMLV, Promega Benelux b.v., Leiden, The Netherlands). Após 60 min, a mistura foi aquecida durante 1 min a 99°C e transferida para gelo. 2 μΐ de cDNA foi usado para PCR convencional.

Amplificação rápida dos extremos de cDNA

Os extremos 5' e 3' do cDNA Rpi-blb foram determinados por amplificação rápida de extremos de cDNA (RACE) usando o kit GeneRacer™ (Invitrogen™, The Netherlands) . 3' RACE foi realizado com as sequências iniciadoras GSP1 (5'- GAGGAATCCATCTCCCAGAG) e GSP2 (5'-GTGCTTGAAGAGATGATAATTCACGAG) em combinação com a sequência iniciadora GeneRacer™ 3 ' e sequência iniciadora interna

GeneRacer™ 3'. 5' RACE foi realizado com cDNA sintetizado com a sequência iniciadora GSP3 (5' -GTCCATCTCACCAAGTAGTGG) usando as sequências iniciadoras GSP4 (5' -GAAATGCTCAGTAACTCTCTGG) e GSP5 (5'- GGAGGACTGAAAGGTGTTGG) em combinação com a sequência iniciadora GeneRacer™ 5' e a sequência iniciadora interna GeneRacer™ 5' (Figura 7).

EXEMPLO 6: ESTRUTURA DO GENE Rpi-blb E DA PROTEÍNA CORRESPONDENTE 0 tamanho e a estrutura do gene Rpi-blb foram determinados por comparação com a sequência genómica derivada do inserto de pRGC2-blb com fragmentos de cDNA gerados através da amplificação rápida 5' e 3' dos extremos de cDNA. RACE identificou fragmentos de cDNA 5'e 3' específicos de Rpi-blb de uma única espécie, respectivamente, sugerindo que o clone genómico codifica um único transcrito especifico de Rpi-blb. A sequência codificadora do transcrito Rpi-blb tem 2913 nucleótidos. 0 transcrito Rpi-blb putativo estima-se ter 3138 nucleótidos (nt) e possui uma região não traduzida (UTR) 5' e 3' de 44 e 181 nt, respectivamente. 0 gene Rpi-blb possui um único intrão de 678 nt começando 428 nt a seguir ao codão de iniciação ATG do gene (Figura 3C). A grelha de leitura aberta deduzida do gene Rpi- blb codifica um polipéptido previsto de 970 aminoácidos com uma massa molecular estimada de 110,3 kD (Figura 8). Vários motivos funcionais presentes nos genes R da classe NBS-LRR dos genes R de plantas são aparentes na proteina codificada que pode ser subdividida em 3 dominios (A, B e C; Figura 8). A parte N-terminal da proteina possui potenciais dominios de hélices alfa enroladas, repetições de héptadas em que o primeiro e o quarto residuo são geralmente hidrofó-bicos (dominio A). O dominio B possui o NBS e outros motivos que constituem o dominio NB-ARC (ARC para Apaf-1, proteina R e CED-4) das proteínas R e reguladores da morte celular em animais (van der Biezen and Jones, 1998) . Este dominio inclui os motivos Ap-ATPase presentes nas proteínas de origem eucariótica e procariótica (Aravind et al, 1999 Trends Biochem. Sei. 24, 47-53) . A metade C-terminal de

Rpi-blb compreende uma série de 19-20 LRRs irregulares (dominio C) . Os LRRs podem ser alinhados de acordo com a sequência de consenso LxxLxxLxLxxC/N/SxxLxxLPxxa, onde x designa qualquer residuo e "a" designa as posições dos aminoácidos alifáticos, seguido de uma região de comprimento variável. Este formato de repetição aproxima-se do consenso das LRRs citoplasmáticas (Jones and Jones, 1997 Adv. Bot. Res.24, 89-167).

EXEMPLO 7: HOMÓLOGOS NATURAIS E VARIANTES ARTIFICIAIS DO GENE Rpi-blb

Homólogos naturais

As pesquisas de homologia BLASTN com a sequência de DNA codificadora do gene Rpi-blb identificaram uma série de sequências com homologia significativa com segmentos curtos do gene Rpi-blb (Figura 9C). Os nucleótidos 549-1245 da sequência codificadora do gene Rpi-blb partilham 81-90% de identidade de sequência com os fragmentos NBS parciais de tomate (e.g. Q194, Q137, Q198 and Q199; Pan et ai., 2000 Genetics. 155:309-22). Estas sequências homólogas variam de comprimento entre 525 e 708 nucleótidos e são fragmentos de PCR que foram identificados por varrimento sistemático do genoma do tomate usando pares de sequências iniciadoras (degeneradas) em motivos NBS ubiquos (Pan et ai., 2000 Genetics. 155:309-22; Leister et ai., 1996 Nat Genet. 14:421-429). Uma outra região do gene Rpi-blb que partilha homologia significativa com uma sequência do estado da arte compreende os nucleótidos 76-805 da sequência codificadora. Esta sequência de 729 nt de comprimento partilha 91% de identidade de sequências com um EST de batata (base de dados EMBL n° de acesso BG890602; Figura 9C) . A sequência do gene Rpi-blb a jusante do nucleótido 1245, compreendendo a região LRR, partilha homologia com qualquer sequência do estado da arte. As pesquisas de homologia BLASTX com a sequência codificadora do gene Rpi-blb revelaram que a homologia com a sequência de aminoácidos de vários genes do estado arte não excede 36% de identidade de sequências (Tabela 4) . A melhor pontuação BLASTX foi obtida com um gene NBS-LRR derivado de Oryza sativa (36,5% de identidade de sequências de aminoácidos). Os genes NLS-BRR que partilham uma homologia de sequências global de 27-36% de identidade de sequências de aminoácidos com Rpi-blb podem ser encontrados, entre outros, em Arabidopsis thaliana, Phaseolus vulgaris, Lycopersicon esculentum (grupo de genes 12 de Fusarium; Ori et al. , 1997 Plant Cell, 9, 521-532;

Simons et al, 1998 Plant Cell 10, 1055-1068), Zea mays,

Hordeum vulgare e Lactuca sativa. Os estudos filogenéticos das sequências de aminoácidos deduzidas de Rpi-blb, RGC1-blb, RGC3-blb, RGC4-blb e os dos genes do estado da arte homólogos (como definido por BLASTX) derivados de diversas espécies, usando o método de Neighbour-Joining de Saitou and Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425), mostram que membros do grupo de genes Rpi-blb podem ser colocados num ramo separado (Figura 9).

Comparações de sequências dos quatro RGCs do grupo de genes Rpi-blb identificados no clone BAC 8005-8 SPB4 mostram que a homologia e sequências dentro do grupo de genes Rpi-blb varia entre 70% e 81% ao nivel dos aminoácidos. A sequência de aminoácidos deduzida de Rpi-blb partilha a maior homologia global com RGC3-blb (81% de identidade da sequência de aminoácidos; Tabela 4) . Quando os diferentes dominios são comparados é claro que as metades N-terminais das proteinas (dominios hélices alfa enroladas e NB-ARC) partilham um maior grau de homologia (91% de identidade da sequência de aminoácidos) que as metades C-terminais destas proteinas (LRRs; 71% de identidade da sequência de aminoácidos). O extremo N das proteinas NBS-LRR influencia a necessidade de componentes de sinalização a jusante e pensa-se portanto que seja o dominio efector putativo (Feys and Parker, 2000 Trends

Genet 16:449-55). A região C-terminal LRR está implicada, através de estudos genéticos, na especificidade do reconhecimento do indutor (Ellis et al. , 2000 Trends Plant Sei. 5:373- 379; Dodds et al, 2001 Plant Cell 13: 163-78). A comparação das quatro sequências de aminoácidos revelou um total de 104 residuos de aminoácidos especificos de Rpi-blb (Figura 10A) . A maioria destes está situada na região LRR (80/104). Dentro desta última região, estes residuos especificos estão concentrados no subdominio LRR xxLxLxxxx. A frequência relativa destes residuos de aminoácidos especificados dentro deste subdominio LRR é mais de duas vezes superior (28,3%) ao observado no resto do dominio LRR (12,3%). Os residuos posicionados à volta dos dois residuos de leucina conservados no consenso xxLxxLxxxx pensa-se que estejam expostos a solventes e estão provavelmente envolvidos na criação/manutenção da especificidade do reconhecimento da proteina de resistência .

Sequências de outros homólogos do gene Rpi-blb podem ser obtidas através do rastreio DNA genómico ou de bibliotecas de insertos, e.g. bibliotecas BAC, com sequências iniciadoras baseadas em sequências assinatura do gene Rpi-blb. O rastreio de várias bibliotecas BAC de Solanum com as séries de sequências iniciadoras A e/ou B (Tabela 2 e Figura 7) identificaram outros homólogos derivados de Solanum bulbocastanum (B149-blb), S. tuberosum (SHIO-tub e SH20~tub) e S. tarijense (T118-tar} . A comparação das sequências das 8 proteínas reduz o número de resíduos de aminoácidos específicos de Rpi-blb para 51 (51/970; 5,25%) (Figura 10B) . A maioria destes está situada na região LRR (42/51; 82%). A frequência relativa destes resíduos de aminoácidos específicos dentro do subdomínio LRR xxLxlxxxx é 3,3 vezes superior ao observado no resto do domínio LRR (18,8% versus 5,7%, respectivamente). Estes dados claramente sugerem que a evolução da especificidade da resistência a P. infestans dentro do grupo de genes Rpi-blb evoluiu principalmente através de mudança drástica nos resíduos específicos de LRR de Rpi-blb. A inclusão de outros homólogos de Rpi-blb nas análises de árvores filogenéticas atrás descritas, usando o método de Neighbour-Joining de Saitou and Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425), ainda justifica mais a análise de árvores filogenéticas como um método para definir as sequências homólogas de Rpi-blb (Figura 9B) . Qualquer produto do gene R funcional que partilhe pelo menos 70% de identidade de sequências ao nível dos aminoácidos acabará no mesmo ramo dos produtos de genes do grupo de genes Rpi-blb e pode ser definido como sendo um homólogo de Rpi-blb.

Variantes artificiais A troca de domínios entre os diferentes homólogos pode ser feita para avaliar o papel das diferentes sequências de resistência a P. infestans. A enzima de restrição

Nsil, por exemplo, que reconhece a sequência de DNA ATGCAT presente no motivo conservado MHD pode ser usada para trocar o domínio LRR completo de Rpi-blb com o de RGCl-blb ou RGC3~blb usando técnicas conhecidas dos familiarizados com a arte. Foram construídas variantes quiméricas do gene Rpi-blb que codificam a metade N-terminal de Rpi-blb e a metade C-terminal de RGCl-blb ou RGC3-blb e vice versa, i.e., a metade N-terminal de RGCl-blb ou RGC3~blb e a metade C-terminal de Rpi-blb (Figura 11). Estas variantes foram usadas para transformar o genótipo de batata suscep-tível Impala e testadas relativamente à resistência a P. infestans. Os genes RGC3-blb quiméricos contendo o domínio LRR de Rpi-blb eram resistentes a P. infestans indicando que a especificidade do gene Rpi-blb é codificada por esta parte do gene.

Tabela 1. Perspectiva global da susceptibilidade a P. infestans em diferentes variedades de S. bulbocastanum

a As letras a, b e c representam as origens geográficas relativas descritas na

Figura 1

Tabela 2. Perspectiva global dos marcadores usados no mapeamento de Rpi-blb

aOrientação da sequência iniciadora; F: directa, R: reversa

bsequências iniciadoras de acordo com códigos IUB ca.s.: específico de alelo

Tabela 3. Complementação da susceptibilidade ao míldio em batata e tomate

aTransformantes primários obtidos a partir de transformação dos genótipos de batata e tomate susceptiveis Impala (IMP) e Moneymaker (MM), respectivamente, com construções de T-DNA contendo os candidatos ao gene Rpi-blb

Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3~blb ou RGC4-blb. Foram usadas na transformação as estirpes AGLOb, LBA4404c ou UIA143d. A resistência foi testada em

ensaios com folhas destacadas usando os isolados do complexo IPO655-2A e IPO428-2.

Tabela 4. Comparação da homologia de sequências de nucleótidos e de aminoácidos

“Percentagem de identidade de nucleótidos (nt) e aminoácidos (aa). bForam feitas comparações separadas para as metades N-terminal (N) e C-terminal (C) das sequências proteicas. A fronteira entre as duas metades é o local de restrição conservado Nsil na sequência de DNA (posição 1417 da sequência codificadora Rpi-blb) .

Lisboa, 7 de janeiro de 2015

Claims (19)

REIVINDICAÇÕES

1. Um ácido nucleico isolado ou recombinante compreendendo (i) uma sequência de ácido nucleico como descrita na fig. 6; ou (ii) um ácido nucleico codificador da sequência de aminoá-cidos da fig. 8; ou (iii) um ácido nucleico codificador de um polipéptido tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 82% idêntica à sequência de aminoácidos da fig. 8, compreendendo um domínio LRR e sendo capaz de proporcionar resistência contra uma infecção por Phytophthora quando incorporado e expresso numa planta ou célula vegetal.

2. 0 ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, o referido ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de dotar um membro da familia das Solanaceae com resistência contra um agente patogénico Phytophthora.

3. 0 ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, em que o referido membro da familia Solanaceae é S. tuberosum.

4. Um vector compreendendo um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Uma célula hospedeira compreendendo um vector de acordo com a reivindicação 4 ou transformado com o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

6. Uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, em que a sequência codificadora que confere resistência á infecção por Phytophthora está sob o controlo de um promotor heterólogo.

7. A célula de acordo com a reivindicação 5 ou 6 sendo uma célula vegetal.

8. A célula de acordo com a reivindicação 7 em que a referida planta é um membro da familia Solanaceae.

9. A célula de acordo com a reivindicação 8 em que a planta é Solanum tuberosum ou Lycopersicon escu- lentum.

10. Uma planta compreendendo uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9.

11. Uma parte derivada de uma planta de acordo com a reivindicação 10, compreendendo uma célula hospedeira de acordo com as reivindicações 5 a 9.

12. A parte de acordo com a reivindicação 11 compreendendo um tubérculo ou um fruto, de preferência um tubérculo de batata ou um fruto de tomate.

13. Descendência de uma planta de acordo com a reivindicação 10, compreendendo uma célula hospedeira de acordo com as reivindicações 5 a 9.

14. Uma substância proteica codificada por um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

15. Uso de um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou de um vector de acordo com a reivindicação 4 ou de uma célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9 ou de uma substância de acordo com a reivindicação 14 num método para conferir a uma planta, ou à sua descendência, resistência contra uma infecção por Phytophthora.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15 em que a referida Phytophthora compreende Phytophthora infestans.

17. Uso de acordo com a reivindicação 15 ou 16 em que a referida planta compreende S. tuberosum.

18. Um método para conferir a uma planta, ou à sua descendência, resistência contra uma infecção por Phytophthora compreendendo a dotação da referida planta ou parte dela com um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou com um vector de acordo com a reivindicação 4 ou com uma célula de acordo com as reinvin-dicações 5 a 9 ou com uma substância de acordo com a reivindicação 14 .

19. Um método para selecção de uma planta ou material vegetal, ou descendência deste, relativamente à sua susceptibilidade ou resistência a uma infecção por Phytophthora compreendendo a realização de testes em pelo menos uma parte da referida planta ou material vegetal, ou descendência do mesmo, relativamente à presença ou ausência de um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3. Lisboa, 7 de janeiro de 2015