CN1646561A

CN1646561A - 赋予茄科植物抗蔓延疫霉(晚疫病)抗性的基因

Info

Publication number: CN1646561A
Application number: CNA038078767A
Authority: CN
Inventors: 约瑟夫斯·雅各布斯·亨德里克斯·玛丽亚·阿尔夫斯; 埃德温·安德瑞斯·赫拉德·范德沃森
Original assignee: KWEEK EN RES BEDRIJF AGRICO B
Current assignee: J R Sang Apeloa Co
Priority date: 2002-02-08
Filing date: 2003-02-07
Publication date: 2005-07-27
Anticipated expiration: 2023-02-07
Also published as: PL207545B1; US7485773B2; WO2003066675A1; EP2330118A1; CN1646561B; US20030221215A1; UA87436C2; EP2330118B1; RU2361920C2; EP1472281B8; RU2004126958A; CA2475467C; PT1472281E; MXPA04007690A; US7795398B2; DK1472281T3; PL372391A1; CA2475467A1; EP1334979A1; BRPI0307510B1

Abstract

本发明涉及植物疾病领域，特别涉及卵菌感染如晚疫病，该疾病对于茄科植物如马铃薯和番茄栽培品种的生产具有重大意义。本发明提供了一种为植物或其子代提供抗卵菌感染抗性的方法，包含为所述植物或其部分提供一种基因或其功能性片段，所述基因或其功能性片段包含一种核酸，所述核酸编码一种能够为茄科植物的成员提供抗卵菌抗性的基因产物。

Description

赋予茄科植物抗蔓延疫霉(晚疫病)抗性的基因

由卵菌病原体(Oomycete pathogen)蔓延疫霉(Phytophthorainfestans)导致的晚疫病(Late blight)对于马铃薯栽培是世界范围的破坏性最大的疾病。该疾病也威胁到番茄的产量。由于致病力更强的、更具有农作物特异性的和对杀虫剂更具抗性的病原体株正迅速出现，因此迫切需要获得有具有抗性的栽培品种。

防止作物歉收或减产的方法是应用杀真菌剂，它可防止或治愈由蔓延疫霉导致的感染。但是，应用农作物防虫剂被普遍地认为对于环境是一种负担。因此，在某些西方国家，立法变得更加严格并部分地禁止应用特异性杀真菌剂，导致对疾病进行化学控制更加困难。一种替代性方法是使用携带部分或完全抗晚疫病抗性的栽培品种。在马铃薯栽培中已经描述和使用了两种类型的抗晚疫病抗性。一种由一系列主要的显性基因赋予，所述基因使宿主无法与病原体的特定的品种(races)相适应(品种特异性抗性)。已经鉴定了11个这样的R基因(R1-R11)，认为它们来源于野生马铃薯品种Solanum demissum，其原产于墨西哥，当地的病原体具有最多的遗传变异性。这些R基因中有一些已经在马铃薯的遗传图中被定位(见Gebhardt和Valkonen，2001 Annu.Rev.Phytopathol.39：79-102)。R1和R2分别位于染色体5和4，R3、R6和R7位于染色体11。在S.tuberosum ssp andigena和S.berthaultii内，也已经描述了未知的传递品种特异性抗晚疫病抗性的R基因(Ewing等，2000 Mol.Breeding 6：25-36)。由于高水平的抗性和易于转移，许多栽培品种含有S.demissum来源的抗性。不过，尽管由S.demissum产生的品种特异性抗性几乎是完全的，但是并不持久。一旦最新种植的栽培品种在商业领域内大规模生长，蔓延疫霉就出现新的致病性，使病原体能够克服基因渗入的抗性(introgressed resistance)。第二种抗性，术语称为野外抗性(fieldresistance)，本质上是定量的(quantitative)，被认为不具有品种特异性，但更加持久。在一些墨西哥和中南美茄科品种(species)中可发现晚疫病的野外抗性(Rossi等，1986 PNAS 95：9750-9754)。

墨西哥和危地马拉的二倍体S.bulbocastanum是一种已知具有高水平抗晚疫病野外抗性的带有块茎的品种(Niederhauser和Mills，1953Phytopathology 43：456-457)。尽管胚乳平衡数(endosperm balancenumbers)不同，S.bulbocastanum抗性性状的渗入已经成功完成。通过倍数性操控(Ploidy manipulations)和一系列单调的过渡杂交(bridgecrosses)产生了S.bulbocastanum来源的晚疫病抗性生殖质(germplasm)(Hermsen和Ramanna，1969 Euphytica 18：27-35；1973 Euphytica 22：457-466；Ramanna和Hermsen，1971 Euphytica 20：470-481；Hermsen和De Boer，1971 Euphytica 20：171-180)。但是，在第一次杂交后几乎40年，虽然荷兰的马铃薯育种者努力用这种生殖质进行密集不断的栽培，但晚疫病抗性栽培品种仍然没有引入市场。已经报道成功产生了S.bulbocastanum和马铃薯(S.tuberosum)的体细胞杂种(Thieme等，1997 Euphytica 97(2)：189-200；Helgeson等，1998 Theor Appl.Genet 96：738-742)。已经发现，一些杂种和回交种生殖质(backcrossed germplasm)甚至在极度的疾病压力下对晚疫病具有高度的抗性。尽管报道了抑制的重组，抗性在回交物中看起来在染色体8上的RFLP标记CP53和CT64之间大约6cM的间隔内(Naess等，2000 Theor.Appl Genet 101：697-704)。来源于番茄RFLP探针CT88的CAPS标记物与抗性共分离(cosegregatedwith resistance)。S.bulbocastanum和马铃薯染色体之间的重组的抑制，对于反复栽培的马铃薯生殖质的成功重建以便达到符合最新种植的马铃薯栽培品种的标准的水平形成一种潜在的障碍。分离S.bulbocastanum中发现的编码抗性的基因并随后用这些基因转化现有的栽培品种，与基因渗入培育相比，这是更加直接和快速的方法。

对产生抗细菌、霉菌、病毒、线虫和昆虫的疾病抗性的许多植物R基因的克隆和分子特征的描述已经确定植物R基因特有的结构特征(综述见Dangl和Jones，2001 Nature 411，826-833)。大多数是紧密连锁多基因家族，且迄今为止，所有已经被描述的R基因的成员，除了Pto以外，均编码富亮氨酸重复区(LRR)，该结构显示参与蛋白质-蛋白质相互作用。基于是否存在一种推定的三重核苷酸结合位点(NBS)，可将含有LRR的R基因分成2类。NBS-LRR类的R基因包含与动物凋亡调节蛋白质共享的基序(van der Biezen等，1998 Curr Biol.8，226-227；Aravind等，1999Trends Biochem.Sci.24，47-53)，基于它们N端结构域，其可被细分为2个亚组，其或者显示与果蝇Toll蛋白和哺乳动物白细胞介素-1受体结构域(TIR-NBS-LRR)相似的序列，或者包含一种潜在的亮氨酸拉链或卷曲螺旋(coiled-coil)结构域(CC-NBS-LRR；Pan等，2000 Genetics.155：309-22)。没有NBS的LRR R基因编码跨膜蛋白质，其胞外N末端区域由LRR组成(Jones等，1994 Adv.Bot.Res.24，89-167)。基于是否存在一种胞质丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，这些基因可被分成2个亚组(Song等，1995 Science，270，1804-1806)。当前，已从马铃薯克隆了4个R基因。包括传递品种特异性抗晚疫病抗性的来源于S.demissum的R1基因在内的所有4个基因属于植物R基因的CC-NBS-LRR类(Bendahmane等，1999Plant Cell 11，781-791；Bendahmane等，2000 Plant J.21，73-81；van derVossen等，2000 Plant Journal 23，567-576；Ballvora等，2002 Plant Journal 30，361-371)。

本发明提供了一种分离或重组的核酸，其包含编码图8的氨基酸序列的核酸或其功能片段或同源物。已经发现由所述氨基酸编码的蛋白质是系统发生树分析确认的、由图9的蛋白质Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb组成的基因簇(在此也称为Rpi-blb基因簇)的成员。

如下进行系统发生树分析。首先，使用本领域内标准应用的CLUSTALW(http：//www2.ebi.ac.uk/clustalw)分析核酸序列和/或优选推导的基因氨基酸序列产生的多重序列对比。ClustalW生成一个.dnd文件，可由TREEVIEW(http：//taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html)读取。图9A描述的系统发生树是一种系统发生谱图(phylogram)。

使用Saitou和Nei的邻近相关法(Neighbour-Joining method)(1987Molecular Biology and Evolution 4，406-425)，对Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb、RGC4-blb的推定的氨基酸序列和本领域不同品种来源的最相似的基因(由BLASTX定义)的氨基酸序列的系统发生进行研究，发现Rpi-blb基因簇相应的基因或其功能性片段可被放置在一个单独的分枝内(图9A)。

在8005-8BAC克隆SPB4上鉴别的4个Rpi-blb基因簇成员之间的序列比较显示，Rpi-blb基因簇内的序列同源性在氨基酸序列水平上在70％和81％之间不等。推定的Rpi-blb氨基酸序列与RGC3-blb具有最高的总体同源性(81％氨基酸序列相同性；表4)。当比较不同的结构域时，很清楚的显示，存在于这些蛋白质的N末端部分的效应物结构域(卷曲螺旋和NBS-ARC结构域)比这些蛋白质的被认为包含识别结构域(LRR；71％氨基酸序列相同性)的C末端部分具有更高程度的同源性(91％序列相同性)。比较所有4个氨基酸序列显示总共有104个Rpi-blb特异性氨基酸残基(图10)。多数的这些残基位于LRR区域(80/104)。在后部的区域内，这些特异性残基被集中在LRR亚结构域xxLxLxxxx内。在LRR亚结构域内的这些特异性氨基酸残基的相对频率(28.3％)比在LRR结构域其余部分(12.3％)内观察到的高两倍。位于共有序列xxLxxLxxxx中2个保守亮氨酸残基周围的残基被认为是溶剂暴露的(solvent exposed)并因此很可能涉及产生/维持抗性蛋白质的识别特异性。

Rpi-blb基因簇的另外的成员的序列可通过使用基于Rpi-blb基因特征序列引物，筛选基因组DNA或插入文库如BAC文库而获得。用引物组A和/或B(表2和图7)筛选不同茄科BAC文库，鉴别了不同茄科品种来源的Rpi-blb同源物。将这些另外的序列与图10呈现的那些序列进行对比将有助于鉴别造成蔓延疫霉抗性特异性的Rpi-blb基因簇的另外的成员及其特异性氨基酸残基。此外，采用如上描述的系统发生树分析法测试另外的序列，如使用Saitou和Nei的邻近距离法(1987 MolecularBiology和Evolution 4，406-425)，可为属于Rpi-blb基因簇的另外的基因提供鉴定。

本发明涉及建立一种分离了品种非特异性抗晚疫病抗性的S.bulbocastanum的种内作图(intraspecific mapping)群体(population)。抗性位于染色体8，距离CT88末梢0.3cM的区域内。由于抗性的品种非特异性的属性，S.bulbocastanum晚疫病抗性始终被认为是R基因非依赖性的。但是，在本发明中我们首次证明，S.Bulbocastanum的品种非特异性抗性事实上是由一种与NBS-LRR型的R基因相似的基因所赋予的。

本发明更进一步涉及对这个基因组区域进行分子分析以及通过基于图谱的克隆而分离抗性亲代的一种DNA片段，该DNA片段携带一种R基因，被称为Rpi-blb。从一种大约80kb的细菌人工染色体(BAC)克隆中亚克隆这个DNA片段，该BAC克隆包含簇样排列(cluster-likearrangement)的4个完整的R基因样序列。用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)转化一种易感的马铃薯栽培品种发现，上述4个R基因样序列之一相应于提供品种非特异性的抗晚疫病抗性的Rpi-blb基因。Rpi-blb基因的特征显示它是植物R基因NBS-LRR类的成员之一。现有技术中最接近的功能性特征序列是番茄内I2抗性基因家族成员。这些序列与Rpi-blb序列具有大约32％的总体的氨基酸序列相同性。

因此，在第一个实施方案中，本发明涉及一种分离或重组核酸，所述核酸编码一种具有Rpi-blb序列的基因产物或其功能性片段，其提供茄科成员品种非特异性的抗卵菌病原体的抗性。

分离在此涉及的编码所需的抗晚疫病抗性性状的基因以及随后使用这个基因转化现有的马铃薯和番茄栽培品种提供了一种比基因渗入育种更简单和快速的方法。在此提供的结果为更进一步研究植物病原体相互作用的分子原理和墨西哥野生马铃薯种内R基因的生态学作用提供可能性，并对于发展通过遗传修饰方法产生有抗性的马铃薯或番茄栽培品种是有用的。

与迄今为止所克隆的和描述的R基因不同，我们在此涉及的基因是首次从一种品种非特异性抗疫霉病原体的茄科品种中分离的R基因。显著地，本发明在此涉及一种核酸，其中所述具有所需的抗性的茄科品种包含马铃薯。具体而言，它是从一种在系统发生上与栽培的马铃薯不同的亲缘植物即S.bulbocastanum中分离的第一个基因，通过互补分析(complementation assays)显示，该基因在马铃薯内具有功能。这些数据提示，Rpi-blb基因很容易应用于马铃薯的生产，而不需要长时间和复杂的基因渗入育种。

如下定义涉及用于如下描述和实施例中的术语。

-核酸：一种双链或单链DNA或RNA分子。

-寡核苷酸：一种短单链核酸分子。

-引物：术语引物涉及一种可以起始核酸合成的寡核酸。

-同源性：同源性是用于生物学序列信息相似性或相同性的术语。同源性出现在核酸序列和/或编码的氨基酸序列水平，使用默认参数的BLAST算法(Altschul等，1997 Nucl.Acids Res.25：3389-3402)，或使用默认参数的GAP算法计算相同性的百分率，它们都包括于WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group(GCG)，575 ScienceDr.，Madison，Wisconsin，USA。BLAST研究假定蛋白质可被模仿为随机序列。但是，许多真实的蛋白质包含非随机序列区域，它们可能是同聚物序列段(homopolymeric tracts)，短片段重复，或富含一种或多种氨基酸的区域。这样的低复杂性区域可在无关蛋白质之间构成排列，即使蛋白质的其它区域完全不同。许多低复杂性过滤程序可被执行以减少这样的低复杂性排列。例如，SEG(Wooten和Federhen，1993 Comput.Chem.17：149-163)和XNU(Claverie和States，1993 Comput.Chem.17：191-201)低复杂性过滤可被单独或联合执行。

在本文中使用的2个蛋白序列(或核苷酸序列)的“序列相同性”或“相同性”指的是，当排列通过一种特异性的比较窗口达到最大限度的符合程度时2个序列中相同的残基。当序列相同性的百分比指的是蛋白质时，已认可不同的残基位置可通过保守氨基酸取代而不同，氨基酸被其他具有相似化学性质的氨基酸残基所取代(例如，电荷或疏水性)并因此没有改变分子的功能性质。序列的保守的取代不同，序列相同性百分比可被上调校正取代的保守性质。通过这样的保守的取代而改变的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。本领域技术人员熟知进行这些校正的手段。代表性地，这包括评价一种保守的取代作为一种部分而不是一种全部的错配，因此，增加序列相同性百分比。因而，例如，如果一种同样的氨基酸获得1分而一种非保守取代获得零分，则一种保守的取代得分为0到1之间。例如，依据Meyers和Miller的算法，计算保守取代的得分(Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17，1988)。在此使用的“序列相同性百分比”指通过一种比较窗口比较2个最佳排列的序列，其中在比较窗口内的部分氨基酸序列或核苷酸序列与所参比的序列进行2个序列的最佳对比时，可以包含添加或缺失(例如，缺口)。通过确定位置数计算比例，其中在所述的位置上相同的氨基酸或核酸碱基残基出现在2个序列中以产生匹配的位置数，匹配的位置数被比较窗口的总位置数除且结果乘100以产生序列相同性百分比。优选地，本发明蛋白质的氨基酸序列与图8描述的序列具有至少82％或更高的同源性。表4显示，现有技术的最接近的功能性特征序列(番茄的12镰刀霉(Fusarium)抗性基因簇成员)具有一种更低水平的氨基酸序列相同性(就Rpt-blb而言为32％)。本发明基因簇内的同源性在氨基酸序列水平上在70％和81％之间不等。

同源核酸序列是编码一种如上所述相应蛋白质的核酸序列。这样的核酸的实例如图6A提供的序列。但是，有许多的编码与图8描述的蛋白质100％相同的蛋白质的序列。这是由于核苷酸三联体内的摆动(wobble)，不只一种三联体可编码同一种氨基酸。因此，编码这个蛋白质的核苷酸序列可以充分地改变而不会对蛋白质的氨基酸序列产生影响。已公认，编码与所述蛋白质不是100％相同的氨基酸序列的核苷酸序列可能包含更多的变异。因此，核酸序列水平的相同性百分比可具有更大范围的改变而没有脱离本发明。

-启动子：术语“启动子”的意思是一小段DNA序列，它与RNA聚合酶和/或其它转录起始因子结合，之后，启动子与转录DNA功能性连接，允许转录发生。启动子通常位于编码序列(5′)上游，在它主要范围内，术语“启动子”包括RNA聚合酶结合位点和位于从转录起始位点的几百个碱基对内，偶尔甚至更远处的调节序列元件。这样的调节序列是，例如，涉及结合在反应于生理条件的控制转录起始效力的蛋白质因子的序列。启动子区域在宿主细胞内是有功能的并且优选相应于Rpi-blb抗性基因的天然启动子区域。但是，可以使用任何异源启动子，只要在需要表达的宿主细胞中其是功能性的。异源启动子可以是组成性的或可调节的，组织特异性或非特异性的。本领域内技术人员熟知组成性启动子如CaMV35S启动子或T-DNA启动子，其是基本上不受调节(例如诱导或抑制)的启动子，但是，在所用生物体的活性细胞内只要转录的其它要求满足，它允许其功能性结合的DNA序列稳定地和基本上不改变地转录。有可能使用一种组织特异性启动子，它在易于感染病原体植物的部位驱动表达。在晚疫病中，可以使用在叶内驱动表达的启动子，例如使用铁氧化还原蛋白启动子。一种可调节的启动子是其功能可由一种或多种因子调节的启动子。这些因子可以是那些通过它们的存在确保相应DNA序列的表达，或者是其存在抑制DNA序列表达因而它们的缺乏导致DNA序列的表达。因此，启动子和与它任选地相关的调节序列可被影响本发明遗传构建的DNA序列转录的一种或多种因子的存在或缺乏激活。适当的启动子序列和获得一种增加转录和表达的手段是本领域技术人员所熟知的。

-终止子：转录终止子的作用是终止DNA转录为RNA并且优选地，从本领域技术人员熟知的植物转录终止子序列、细菌转录终止子序列和植物病毒终止子序列组中选择。

-基因：术语“基因”指一种产生多肽链的DNA序列，并且其包括前述的和如下的编码区域(5′-上游和3′-下游序列)及被置于单个编码片段之间(所谓的外显子)或5′-上游或3′-下游区域之间的间隔序列，称为内含子。5′-上游区域包含一种控制基因表达的调节序列，代表性的如启动子。3′-下游区域包含有关基因转录终止的序列以及任选的负责转录物和3′-的非编码区的聚腺苷酸的序列。术语“抗性基因”是本发明的分离核酸，所述核酸编码一种基因产物，其能够为植物提供抗病原体的抗性，更特异性的所述植物是茄科成员，更优选马铃薯和番茄，更特异性的所述病原体是卵菌病原体，更特异性的是晚疫病，更特异性的是蔓延疫霉，所述核酸优选包含如图8描述的序列或其部分，或一种基本上具有相似的功能的和结构特性的同源序列。这样一种抗性基因或由本发明提供的核酸的功能性等价片段编码一种如图8描述的氨基酸序列的多肽片段，或其部分，或一种同源的和/或功能性等价多肽，所述片段当掺入和在植物或植物细胞中表达时显示提供至少部分抗菌卵感染如蔓延疫霉导致的感染的抗性。

-抗性基因产物：具有如图8所述的氨基酸序列的多肽或其部分，或一种同源的和/或功能性等价多肽，其在植物或植物细胞掺入和表达时提供至少部分抗如蔓延疫霉导致的菌卵感染的抗性。

本发明蛋白质的功能性等价物是蛋白质，其通过替代，添加和/或缺失图8描述的蛋白质一种或多种氨基酸，但仍然保留它们的抗病原体活性而获得的蛋白质和与其同源的蛋白质。通过体内蛋白质工程很容易制备这样的等价物，例如，通过改变能够编码蛋白质的开放阅读框，氨基酸序列因而受到影响。只要氨基酸序列的改变没有完全地废除所述蛋白质的活性，此类等价物便包括在本发明内。此外，可以理解当保持生物活性时，图8描述的蛋白质可以衍生等价物，即等价的蛋白质和图8描述的蛋白质之间所有或大部分中间物具有抗病原体活性。大部分指30％或更多的中间物，优选40％或更多，更优选50％或更多，更优选60％或更多，更优选70％或更多，更优选80％或更多，更优选90％或更多，更优选95％或更多，更优选99％或更多。

优选的等价物是含有与图8描述的LRR区域具有高度同源性的富含亮氨酸重复区域的等价物。其它优选的等价物是其N末端受体结构域与Rpi-blb受体结构域基本上相同的等价物。

本发明的蛋白质包含一种不同的N末端受体结构域和一种富含亮氨酸重复结构域。已知，保留这些区域对于蛋白质功能是必需的，虽然一些变异是被允许的。但是，蛋白质的其它部分对于功能是不重要的，而且可能更容易改变。

为了提供一种快速和简单的实验，以明确在此描述的修饰的蛋白质和/或能够表达所述修饰蛋白质的基因构建体，或任何那些通过阅读本申请后对本领域技术人员而言是显而易见的新的构建体，是否确实可以产生一种抗性反应，本领域技术人员可以进行一种已知的快速的名为ATTA(根癌农杆菌瞬时表达化验)的瞬时表达实验。在这个实验(Van denAckerveken，G，等，Cell 87，1307-1316，1996中有详细的描述)中，编码被检测的修饰蛋白质的核酸序列被置于CaMV 35S启动子的控制下，并被导入也用于稳定转化方案的农杆菌株中。将细菌用acetosyringon和或任何其它已知增强农杆菌T-DNA转移的酚类化合物孵育后，注射1ml农杆菌培养液渗透入原位植物叶子(例如，来自于烟草或马铃薯或番茄植物)，然后植物被放置在温室并被病原体，优选蔓延疫霉感染。2-5天后，以叶子出现抗性症状进行评分。

在本发明中，我们已经鉴定和分离抗性基因Rpi-blb，它传递品种非特异性抗蔓延疫霉抗性。该基因克隆自抗蔓延疫霉的Solanumbulbocastanum基因型。使用农杆菌介导的转化或任何其它已知的转化方法，依据本发明分离的抗性基因可被转化到一种易感的宿主植物，并且有关的传递宿主植物抗植物病原体的抗性，特别是抗蔓延疫霉。宿主植物可以是马铃薯，番茄或任何其它植物，特别是可被这样的植物病原体感染的茄科成员之一。本发明也提供一种编码这个蛋白质或其功能性等价物的核酸序列，优选包含图6描述的Rpi-blb基因。

依据本发明的Rpi-blb抗性蛋白质或其功能性等价物片段，有了一种具有控制植物病原体的有效方法，因为编码蛋白质的基因可被用于转化易感植物基因型，因此，产生的经遗传学转化的植物具有一种减低的易感性或优选抗植物病原体的抗性。特别的，一种用本发明的Rpi-blb抗性基因的遗传转化的植物对蔓延疫霉具有一种减低的易感性。

在优选的实施方案中，Rpi-blb抗性基因包含图6A提供的编码序列或其任何同源序列或部分，其前有启动子区域和/或后有终止子区域。在植物细胞中，启动子区域具有功能性，并且优选对应于Rpi-blb基因的天然启动子区域。但是，在植物细胞中具有功能性的不同启动子区域也可与编码序列联合使用。

另外，本发明涉及依据本发明由Rpi-blb基因编码的Rpi-blb抗性蛋白质并且其具有图8提供的氨基酸序列，或其功能性等价物。

引发抗性基因在野生型S.bulbocastanum或本发明的转基因植物中表达的信号可能是由于存在病原体，更特异性的是由于存在蔓延疫霉。这样的系统在其它病原体-植物相互作用中是已知的(Klement，Z.，In：Phytopathogenic Prokaryotes，Vol.2，eds.：Mount，M.S.和Lacy，G.H.，NewYork，Academic Press，1982，pp.149-177)，并且使用这个系统可增加抗性蛋白质导致更多病原体抗性的实用性(见EP 474 857)。这个系统利用病原体来源的激发子(elicitor)化合物和相应的抗性基因，其抗性基因由于激发子的存在而被激活将导致局部细胞死亡(超敏反应)。对于本发明的抗性基因，相应的激发子成分还没有被揭示，但是已确信这对于本领域技术人员来说是可以完成。一旦激发子成分被分离，将有可能转化编码所述激发子的基因和编码抗性蛋白质的基因进入植物，所述基因之一被置于一种病原体-诱导的启动子的控制下。这些启动子是本领域熟知的(例如prpl，Fisl，Bet v 1，Vstl，gstAI，和倍半萜烯环化酶(sesquiterpenecyclase)，但是可以使用病原体感染后启动的任何病原体-诱导启动子)。如果转基因植物包含这样一种系统，能够引发病原体-诱导启动子的病原体攻击将产生所述启动子控制下的成分，并且，这与其他组成型表达成分一起，将导致抗性反应发生。

也有可能突变抗性蛋白质为活性状态(见EP1060257)。因为这将总是导致抗性反应发生，最终导致局部细胞死亡，注意不要组成型表达抗性蛋白质。要实现此目的，可将突变的抗性蛋白质置于一种病原体-诱导启动子控制下，其不仅允许仅当病原体攻击时表达活性抗性蛋白质，而且也允许更大范围病原体来诱导超敏反应。苏氨酸和丝氨酸残基突变为天冬氨酸和谷氨酸残基常常产生激活，如许多活性蛋白质显示被磷酸化作用调节，例如，MAPK-活性蛋白质(Engel等，1995，J.Biol.Chem.270，27213-27221)和MAP-激酶-激酶蛋白质(Huang等，1995 Mol.Biol.Cell 6，237-245)。同样，这些蛋白质C-和N-末端以及内在缺失的突变体可以用于测试合适的突变体。

鉴定组成活性被诱导的所需的突变体的一种间接方法是通过在所谓大肠杆菌突变基因株内扩增编码蛋白质DNA。

测试所有已制成的突变体以适宜引发一种超敏反应的快速方法是通过所谓ATTA实验(Van den Ackerveken，G，等，Cell 87，1307-1316，1996)。很容易筛选许多突变体以鉴别那些将在表达时引发HR的突变体。

本发明也提供一种载体，其包含在此提供的核酸或一种分离或重组核酸的功能性等价物，所述核酸编码能够为茄科(Solanaceae)成员之一提供抗卵菌病原体抗性的基因产物，特别地，在此所述成员包含马铃薯或Lycopersicon esculentum。

本发明也提供一种包含依据本发明的一种核酸或一种载体的宿主细胞。例如，在此举例详细描述的所述细胞。在一种详细地实施方案中，所述宿主细胞包含一种植物细胞。作为一种植物细胞，来源于一种茄科成员的植物细胞为优选，特别地，其中所述成员包含马铃薯或Lycopersicon esculentum。从这样一种细胞，或原生质体，或转基因植物，可生产例如抗卵菌感染的转基因马铃薯植物或番茄植物。因此，本发明也提供一种植物，或块茎根，果实或种子或部分或子代来源，其包含一种依据本发明的细胞。

此外，本发明提供一种蛋白质物质，当在一种植物或植物细胞掺入和表达时，呈现至少部分抗例如蔓延疫霉导致的晚疫病卵菌感染抗性的特性。特别地，提供的这样一种蛋白质物质由一种依据本发明的核酸编码。在一种优选的实施方案中，本发明提供一种包含图8描述的氨基酸序列的蛋白质物质或其功能性等价物。优选地，这样一种功能性等价物将包含一种或更多的序列，其与RGC3-blb、RGC-blb和RGC4-blb比较，只与Rpl-blb唯一相关。在对比中可以发现这样的序列(见图10A)并且将是序列RPLLGEM，AKMEKEKLIS，KHSYTHMM，FFYTLPPLEKFI，GDSTFNK，NLYGSGMRS，LQYCTKLC，GSQSLTCM，NNFGPHI，TSLKIYGFRGIH，IIHECPFLTLS，RICYNKVA，和KYLTISRCN。已确信一种或多种这些序列可提供蛋白质Rpl-blb的功能性特性。

此外，本发明提供一种与本发明核酸结合的分子。例如，Rpl-blb基因可被用于设计互补于图7和表2描述的单链DNA序列的寡核酸。在此提供的寡核酸用作筛选文库的探针，Southern/Northern分析的杂交探针，PCR的引物，用于检测疾病抗性诊断试剂盒等等。这样的寡核酸是在此提供的分离或重组核酸的有用的片段，所述核酸编码能够为一种茄科成员提供抗卵菌抗性的一种基因产物，或一种分离或重组核酸的功能性等价物，特别地，在此所述成员包含马铃薯或Lycopersicon esculentum。它们很容易从图6所描述的一种序列或其部分挑选，一种特别识别位点包含在此已鉴别的LRR结构域。这样一种本发明的结合分子被用作探针或引物，例如提供标记物，特别地，在此所述标记物包含一种用来检测所述结合分子存在的可激发部分(excitable moiety)。

此外，本发明提供一种筛选植物或植物材料或其子代的抗卵菌感染的易感性或抗性的方法，包含检测至少部分所述植物或植物材料或其子代存在或缺乏一种核酸，所述核酸编码能够为一种茄科成员提供抗卵菌抗性的一种基因产物，或检测所述基因产物的存在，优选的所述方法包含将至少部分所述植物或植物材料或其子代和本发明结合分子接触并确定所述分子结合到所述部分。所述方法特别有用，其中所述卵菌包含蔓延疫霉，允许选择抗晚疫病的植物或植物材料，例如，其中所述植物或材料包含马铃薯。如上讨论由系统发生树分析已确信，蛋白质与Rpi-blb有高度同源性，将产生抗容易鉴定的植物病原体抗性。举例，检测三个高度同源的蛋白质RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb，显示没有产生抗蔓延疫霉抗性，但是仍然已确信它们与植物的病原体抗性相关。

同样，本发明提供了使用本发明的一种核酸或载体或细胞或物质或结合分子为一种植物或其子代提供至少部分抗卵菌感染的方法，特别地，在此所述卵菌包含蔓延疫霉，特别地，在此所述植物包含马铃薯，所述提供一种植物或其子代至少部分抗卵菌感染的方法包含为所述植物或其部分提供编码一种抗性蛋白质或其功能性片段的包含核酸的基因，所述抗性蛋白质能够为一种茄科成员提供抗卵菌抗性，或为所述植物或其部分提供依据本发明的一种核酸或一种载体或一种细胞或一种物质。

此外，本发明提供一种分离的S.bulbocastanum或其部分，例如一种块茎或种子，其易感于蔓延疫霉导致的卵菌感染。

本发明更进一步的详细描述如下。

附图说明

图1.墨西哥地理图，指示用于分离Rpi-blb基因的Solanumbulbocastanum保藏物(accessions)的来源。字母a、b和c指示使用的S.bulbocastanum保藏物的相关的地理来源。

图2.S.bulbocastanum染色体8上Rpi-blb基因座的遗传连锁图。水平线指示连接晚疫病抗性标记的相关位置。标记物之间的距离以厘摩(centimorgan)显示。A.Rpi-blb基因座相对于标记物TG513、CT88和CT64(n＝508基因型)的遗传位置。B.Rpi-blb基因座的高密度遗传连锁图谱(n＝2109基因型)。

图3.Rpi-blb基因座的物理图谱。A.包含Rpi-blb的S.bulbocastanum基因组区域的遗传图谱和物理图谱。垂直箭头指示连接抗性标记物的相关位置。横线上的数指示在2109子代植物中位于侧翼的标记物之间鉴定的重组体的数目。长方形表示细菌人工染色体(BAC)克隆。B.BACSPB4上抗晚疫病候选基因相关位置。C.Rpi-blb基因结构示意图。水平线指示外显子。开放的框表示编码序列。向下成角的线(Lines angleddownwards)指示一种678核苷酸长的内含子序列的位置。

图4.Southern印迹分析BAC克隆生成的Rpi-blb基因座。每条线上的名称代表BAC克隆的名称。给出了Southern印迹之前用于消化BACDNA的限制性内切酶的名称。

图5.离脱叶疾病(Detached leaf disease)分析。A.以蔓延疫霉包囊孢子小滴孵育后6天(6d.p.i)，在S.bulbocastanum绘图的B8群体中发现抵抗表型(左)、中间表型(中间)和易感(右)表型。B.马铃薯晚疫病抗性的遗传互补。以蔓延疫霉包囊孢子小滴孵育后6天的携带RGC1-blb、RGC2-blb、-blb或RGC4-blb的转基因马铃薯植物来源的叶的特征性疾病表型。通过农杆菌介导的转化，携带RGC的遗传构建体被传递给易感马铃薯栽培品种Impala。C.番茄的晚疫病抗性遗传互补。以蔓延疫霉包囊孢子小滴孵育后6天的携带Rpi-blb的转基因番茄植物来源的番茄叶的特征性的疾病表型(左侧)。通过农杆菌介导的转化，携带Rpi-blb的遗传构建体被转化到易感番茄栽培品种Moneymaker。

图6.Rpi-blb基因簇成员的核酸序列。A.编码Rpi-blb基因的核酸序列。B.编码包括内含子序列(位于428-1106)在内的Rpi-blb基因的核酸序列。C.存在于pRGC2-blb的S.bulbocastanum BAC SPB4的5.2kb ScaI基因组DNA片段序列，用于晚疫病抗性遗传互补的遗传构建体。携带Rpi-blb基因的基因组片段包括正确表达基因必需的天然调节元件。起始密码子(ATG位于1191-1193)和终止密码子(TAA位于4781-4783)以下划线表示。D.编码包括内含子序列(位于428-708)在内的RGC1-blb的核酸序列。E.编码包括内含子序列(位于428-1458)在内的RGC3-blb的核酸序列。F.编码包括内含子序列(位于434-510、543-618和743-1365)在内的RGC4-blb的核酸序列。

图7.相关引物位置。水平条代表编码Rpi-blb基因的序列。数字代表核苷酸位置。水平箭头指示相关引物位置和方向。GSP1和GSP2代表用于3′RACE实验的嵌套基因特异性引物。GSP3和GSP4代表用于5′RACE实验的嵌套基因特异性引物。A(F)、A(R)、B(F)和B(R)是用于Rpi-blb同源物扩增的引物。用于Rpi-blb同源物之间结构域交换的限制性位点NsiI的位置被指示出来。

图8.推定的Rpi-blb蛋白质序列。从Rpi-blb的DNA序列推定的氨基酸序列被分成3个结构域(A-C)，如实施例6描述。潜在的卷曲螺旋结构域的七肽重复域的第一个和第四个残基形成结构域A，其中疏水的残基被下划线标出。R蛋白质的保守基序在结构域B中以小写的斜体字母表示。匹配LRR细胞质共有序列的残基在结构域C中以粗体表示。在序列中引入圆点以便将序列与LRR细胞质序列的共有LRR序列进行对比。

图9.系统发生树分析。A.本领域序列系统发生树的状态，该序列与推定的Rpi-blb氨基酸序列以及它的基因簇成员RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb具有一定程度同源性。依据Saitou和Nei(1987 MolecularBiology and Evolution 4，406-425)的邻近距离法绘制系统发生树。星号表示基因已被指派功能。Rpi-blb基因簇被置于框内。B.本领域序列系统发生树的状态，该序列与推定的Rpi-blb氨基酸序列具有一定程度同源性。包括在这个分析中的有Rpi-blb同源序列B149-blb、SH10-tub、SH20-tub和T118-tar，使用Rpi-blb基因簇特异性引物，通过PCR扩增鉴定序列。C.本领域DNA系统发生树的状态，该序列显示出与部分Rua-bulb基因序列存在显著的同源性。水平线代表同源序列的相关位置。每条线的右边显示同源性程度。在每条线上显示同源序列的长度。

图10.预测的Rpi-blb基因产物与预测的Rpi-blb同源物蛋白质序列的对比。A.由Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb编码的推定的蛋白质产物排列。显示全部的Rpi-blb氨基酸序列和RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb的氨基酸残基与Rpi-blb内相应的残基不同。破折号指示插入的缺口以维持最佳排列。当与RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb内的相应位置比较时，Rpi-blb特异性的氨基酸残以突出粗体表示。符合共有序列L..L..L.L..C/N/S..a..aP的LRR区域被下划线标出。NBS结构域的保守基序以小写字母表示。B.由Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb、RGC4-blb、B149-blb、SH10-tub、SH20-tub和T118-tar编码的推定的蛋白质产物对比。

图11.在Rpi-blb和同源的RGC1-blb和RGC3-blb之间产生结构域交换的示意图。竖向虚线表示用于发生交互的NsiI位点的位置。R和S表示转基因植物是否携带分别对抗或易感于晚疫病的特异性嵌合结构。

实验部分

为了Rpi-blb抗性基因作图，建立了一种S.Bulbocastanum的种内作图群体。在这个过程中的一种关键步骤是鉴定易感的S.bulbocastanum基因型。为此目的，用离脱叶分析来分析来源于不同簇/不同墨西哥地域的一些S.bulbocastanum保藏物的抗蔓延疫霉抗性或易感性(表1和图1)。已筛选的保藏物BGRC 8008和BGRC 7999B不含有易感基因型。但是，在保藏物BGRC 8005、BGRC 8006和BGRC 7997中，分析种子发现，易感性分别是9％、7％和14％。随后筛选出一种蔓延疫霉易感克隆保藏物BGRC 8006，并与一种抗性克隆保藏物BGRC 8005进行杂交。产生的F1群体被用于绘制Rpi-blb基因座并且此后称为B8群体。

在离脱叶分析中初步筛选抗蔓延疫霉抗性的42个B8基因型，提示通过一种单显性R基因或一种紧密连锁基因簇可在S.bulbocastanum保藏物8005P中产生晚疫病抗性。在测试的42个基因型中，在重复实验中有22个被评分为抗性，16个为易感性。剩下的4个秧苗抗性表型仍不清楚。为了确定这个S.bulbocastanum抗性在染色体的位置，使用确定表型的B8基因型作为标记物分析。染色体8特异性标记物TG330(表2)在互斥相(repulsion phase)与抗性表型连锁，因为在这个标记物和12B8基因型抗性之间只获得一种重组体。此外，发现染色体8标记物CT88(表2)在互斥相与抗性完全连锁，说明称为Rpi-blb的位于染色体8的这个区域的基因座是产生抗性的原因。为此原因，番茄染色体8靠近CT88(TG513和CT64；Tanksley等，1992 Genetics 132：1141-1160；Table 2)末梢的特异性标记物被插入CAPS标记物并在512个B8基因型中测试已知抗性表型。在这个筛选中鉴定出共5个CT64-CT88重组体基因型和41个CT88-TG513重组体基因型(图2A)。Rpi-blb抗性基因座被绘制为距标记物CT88远端的1个重组体事件(图2A)。

完成带有CAPS标记物的精细的Rpi-blb基因座作图，CAPS标记物来源于由抗性S.bulbocastanum基因型BGRC 8005-8制备的BAC文库分离的左侧(L)和右侧(R)BAC边界序列。使用标记CT88和CT64初筛BAC文库。采用这些标记物鉴定的BAC克隆被用作种BAC以便随后进行染色体步行(chromosome walk)达到Rpi-blb基因座。对总共2109个B8基因型筛选标记物TG513和CT64之间的重组。随后使用在CT88-CT64基因间隔内所有的可得标记物筛选所有的重组基因型(219/2109)。这些数据连同通过离脱叶分析获得的每个重组体的疾病抗性数据，将Rpi-blb基因座定位于标记物SPB33L和B149R之间，为一0.1cM的基因间隔(4/2109重组体)，被重叠的BAC克隆SPB4和B49(图2b和3)物理性横跨。在这个间隔内，抗性与BAC末端标记物SPB42L发生共分离，其序列与部分番茄来源的NBS片段具有高度同源性(例如，Q194、Q137、Q152、Q153；Pan等，2000 Genetics 155：309-322)。使用SPB42L标记物的³²p-标记的PCR片段作为一种探针的Southern分析BAC克隆生成的SP33L-B149R间隔，显示至少存在4个如Rpi-blb间隔内序列样的R基因拷贝(图4)。此外，所用这些拷贝存在于BAC SPB4上。测序和注释这个完全插入的BAC克隆确实鉴定了4个完全的植物R基因NBS-LRR类的R基因候选物(RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb和RGC4-blb)。一种位于RGC1-blb和RGC4-blb之间的PCR标记物显示蔓延疫霉抗性和RGC4-blb之间的重组，排除了RGC4-blb是Rpi-blb的可能性。尽管有这个发现，仍筛选所有4个RGC进行互补分析。

从BAC SPB4亚克隆大约10kb携带RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb或RGC4-blb的基因组片段进入双重植物转化载体pBINPLUS(vanEngelen等，1995 Trans.Res.4，288-290)，并使用标准转化方法转化一种易感性马铃薯栽培品种。检测初步转化体的蔓延疫霉抗性，如实施例1描述。只有携带RGC2-blb的遗传构建能够补足易感的表型；86％的携带RGC2-blb初步转化体有抗性(表3)，但是，所有包含RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb的初步转化体完全易感于蔓延疫霉。包含抗RGC2-blb的转化体显示与S.bulbocastanum抗性亲代类似的抗性表型(图5)。因此，RGC2-blb被指定为Rpi-blb基因，图6提供了其DNA序列。

实施例1：疾病分析

通过离脱叶分析确定抗蔓延疫霉的S.bulbocastanum的表型和转基因马铃薯的基因型。树叶来源于在温室中生长6到12个星期的植物，其被种在一片水饱和种花用泡沫塑料中，大约35×4×4cm，放置在底部穿孔的盘子中(40cm宽，60cm长，6cm高)。每片树叶在离轴面接种2个或更多(每个25μl)包囊孢子小滴溶液。随后，盘子被放入一种塑料袋，在每个盘子顶上放上一张水饱和的滤纸，17℃孵育16/18小时，白天/夜晚，使用荧光灯(Philips TLD50W/84HF)的光照周期。6天后，根据出现的蔓延疫霉疾病症状评价树叶。植物的树叶清晰地显示孵育6天后形成孢子损伤，被认为是易感型表型，但是，植物的树叶显示在接种边缘没有可见的症状或坏死，缺乏显著的孢子形成，被认为具有抗性。使用从植物研究国际组织BV(Wageningen，The Netherlands)获得的蔓延疫霉复合分离物655-2A(种1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11)进行分析。

实施例2：Rpi-blb抗性基因座作图

植物材料

为了产生一种分离存在于S.bulbocastanum保藏物BGRC 8005(CGN 17692，PI275193)上的蔓延疫霉抗性基因的种内作图群体，需要一种易感的S.Bulbocastanum基因型。离脱叶分析从来源于不同簇/不同墨西哥地域的几个S.bulbocastanunt保藏物的蔓延疫霉抗性或易感性(表1和图1)。在保藏物BGRC 8008和BGRC 7999中没有检测到易感性。在保藏物BGRC 8005，BGRC 8006和BGRC 7997中，分析秧苗的易感性分别只有9％，7％和14％。因此，只获得少数易感的S.bulbocastanum基因型。

将一种蔓延疫霉易感克隆保藏物BGRC 8006与一种抗性克隆保藏物BGRC 8005杂交产生S.bulbocastanum(B8)的种内作图群体。依据Doyle和Doyle(1989 Focus 12，13-15)从新生树叶提取2109子代植物的DNA。

CAPS标记物分析

为进行PCR分析，准备15μl反应混合物，包含0.5μg DNA，每个引物15ng，0.2mM每种dNTP，0.6单位的Taq-聚合酶(15U/l，SphaeroQ，Leiden，The Netherlands)，10mM Tris-HCl pH9，1.5mM MgCl₂，50mM KCl，0.1％Triton X-100和0.01％(w/v)凝胶。采用如下循环完成PCR：94℃，DNA变性25秒，退火30秒(见表1)，72℃延伸40秒。在PCR扩增的第一步DNA 94℃变性5分钟，在最后步骤照，额外在72℃延伸5分钟。在Biometra^ T-Gradient或Biometras^ Uno-II热循环仪(Westburg，Leusden，The Netherlands)上完成扩增反应。依靠标记物，使用适当的限制性酶消化PCR产物。标记物的一般观察，包含引物序列，退火温度和限制性酶，在表2给出。随后，琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳分析已消化的PCR产物。使用Clean凝胶DNA分析试剂盒和DNA银染试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech Benelux，Roosendaal，the Netherlands)进行丙烯酰胺凝胶分析。

Rpi-blb基因座遗传作图

最初，离脱叶分析筛选一小群B8群体的42个子代植物的蔓延疫霉抗性。植物树叶清晰的显示接种6天后形成孢子损害，被认为具有易感表型，然而当植物树叶显示缺少明显的孢子形成时，在接种边缘没有可见症状或坏死，被认为具有抗性。42个秧苗中，22个被评分为抗性，16个为易感性。剩下的4个秧苗的表型在最初阶段仍不清楚。这些数据说明抗性是由于一种单显性基因或一种紧密连锁基因簇。为了确定染色体位置，使用可靠表型的秧苗进行标记物分析。发现染色体8标记物TG330在互斥相与抗性表型连锁，在12B8秧苗中的这个标记物和抗性之间只获得一种重组体。此外，发现染色体8标记物CT88在互斥相与抗性完全连锁，说明抗性基因位于染色体8上。

随后，已被作图的靠近CT88(Tanksley等，1992 Genetics 132：1141-1160)末端的染色体8特异性标记物发展为CAPS标记物。为了更精确绘制这些标记物，使用离脱叶疾病分析筛选另外的512个B8群体个体的晚疫病抗性。同时，评价植物的标记物CT64、CT88和TG513。有5个秧苗检测到标记物CT64和CT88之间的重组，有41个秧苗检测到在标记物CT88和TG513(图2A)之间重组。在标记物CT64和CT88之间绘制抗性基因Rpi-blb。在这个时期，仅基于一种重组秧苗将Rpi-blb定位于与CT88邻近的位置。

为了更好的确定Rpi-blb相对于获得的标记物的位置，生长和分析B8群体的另外1555个秧苗在标记物TG513和CT64之间的重组。因此，筛选B8群体的总共2109个个体子代克隆。在219个秧苗中检测标记物TG513和CT64之间的重组(10.4cM)。利用离脱叶分析筛选所有这些重组体的标记物CT88和抗性特性的表型。与早期的结果一致，在标记物CT88和CT64之间(图2B)绘制Rpi-blb基因。

实施例3：构建一种S.BULBOCASTANUM BAC文库以及构建一种连续的横跨Rpi-blb基因座的BAC重叠群

BAC文库构建

Rpi-blb基因座杂合的一种S.bulbocastanum(blb)保藏物BGRC 8005(CGN 17692，PI275193)的抗性克隆被用作构建一种基因组BAC文库的DNA来源，此后称为8005-8 BAC文库。如Rouppe van der Voort等(1999MPMI 12：197-206)描述完成高分子量DNA制备和BAC文库构建。最终获得具有平均插入100kb大小的大约130,000克隆，其相应于15个基因组等价物。总共大约83,000单个克隆被储存于216 384-孔微量板(Invitrogen，The Netherlands)，包含LB冻存缓冲液(在LB培养基中含36mM K₂HPO₄，13.2Mm KH₂PO₄，1.7mM柠檬酸盐，0.4mM MgSO₄，6.8mM(NH₄)₂SO₄，4.4％V/V甘油，12.5μg/ml氯霉素)，储存于-80℃。另50,000克隆被储存作为细菌库，其包含大约1000个白色克隆。使用一种消毒的玻璃涂布器自这些琼脂板中挑克隆放入包含18％甘油和12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中。这些所谓的超细菌库也储存于-80℃。

筛选BAC文库和构建一种Rpi-blb基因座物理图谱。

使用CAPS标记物CT88和CT64初筛8005-8 BAC文库。按如下步骤完成。文库的第一部分大约83,000克隆储存在384孔微量板中，使用标准碱性裂解方法(Sambrook et al.，1989 in Molecular cloning：a laboratorymanual 2nd edn，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York)从每板细菌库分离质粒DNA产生216板细菌库。PCR筛选培养板细菌库鉴别携带CAPS标记物的单个BAC克隆。一旦一种单个培养板细菌库被鉴定为特异性的CAPS标记物阳性，通过双向PCR筛选确定阳性的行和列。为此目的，在含氯霉素(12.5μg/ml)的LB培养基中2次复制384孔母板。克隆37℃生长16小时后，一种培养板每行刮下24克隆，其他培养板每列刮下16克隆。每行或列的细菌以200μl TE缓冲液重悬。随后，0.5μl细菌悬液分析CAPS标记物可鉴定单阳性BAC克隆。文库第二部分，储存大约50库近1000个克隆，使用标准碱裂解方法从每个克隆库分离质粒DNA并且完成PCR鉴定阳性库。相应阳性库的细菌被稀释和种入含氯霉素(12.5μg/ml)的LB琼脂板。随后，单个白色克隆被挑进384孔微孔板，随后，单阳性BAC克隆按如上描述鉴定。从超细菌库中分离的BAC克隆的名称带有前缀SP(例如SPB33)。

BAC克隆插入片段的大小如下评估。使用从2ml过夜培养物中(LB培养基补充12.5mg/ml氯霉素)使用标准碱裂解小量制备方法分离质粒DNA分析阳性BAC克隆并重悬在20μl TE。质粒DNA(10μl)使用5个单位NotI，37℃消化3个小时，从pBeloBAC11载体释放基因组DNA。使用BIORAD CHEF DR II系统(Bio-Rad Laboratories，USA)，150V，14秒恒定脉冲时间，1％琼脂糖凝胶，0.5X TBE进行CHEF电泳16个小时，分离消化的DNA。

筛选带有标记物CT88的8005-8 BAC文库，鉴定2个阳性BAC克隆：B139和B180，分别有130和120kb的马铃薯DNA插入(图3A)。消化从这些BAC克隆产生的CT88 PCR产物以及几个抗性和易感性带有MboI的B8群体的子代植物揭示带有CT88等位基因的BAC139与抗性顺式连锁。为了鉴定BAC B139相关的基因组位置，基于插入物的右边(R)和左边(L)末端设计一对PCR引物。如实施例4描述，使用0.5μg BACDNA为模板完成BAC末端测序。使用数种切割4-碱基的限制性内切酶消化B8群体双亲基因型的PCR产物以及双抗性和双易感性子代基因型，建立多态性CAPS标记物(表2)。通过筛选37个CT88-CT64重组B8基因型将7个CT88-Rpi-blb重组体中的5个定位于CT88和B139R之间，说明标记物B139R比标记物CT88相对更靠近Rpi-blb基因座。以B139R筛选216个培养板细菌库没有鉴定出一种阳性BAC克隆。筛选50个超细菌库，鉴定了分别插入85kb和75kb DNA的阳性BAC克隆SPB33和SPB42(图3A)。筛选全部的SPB33L BAC库鉴定阳性BAC克隆B149和SPB4。BAC克隆SPB4含SPB33L等位基因，它与抗性顺式连锁，然而BAC克隆B149没有。但是，筛选B149R的CT88-CT64重组板显示这个BAC横跨Rpi-blb基因座。通过2个重组事件从Rpi-blb基因座分离B149R(图3A)。筛选8005-8 BAC库B149R鉴定BAC克隆B49同样具有B149R等位基因可与抗性顺式连锁。因此，这个BAC克隆与BAC克隆SPB4形成一种横跨Rpi-blb基因座的BAC重叠群(图3)。

实施例4：BAC SPB4序列分析和Rpi-blb基因座的抗性候选基因的鉴定

在SPB33L-B149R间隔内，抗性与BAC和标记物SPB42L共分离，它的序列与番茄的部分NBS片段有高度同源性(如Q194，Q137，Q97，Q152，Q153；Pan等，2000 Genetics 155：309-22)。使用一种³²P标记的SPB42L标记物的PCR片段作为探针进行Southern分析BAC克隆生成的SPB33L-B149R间隔，揭示在Rpi-blb间隔内至少存在4个R基因样序列拷贝(图4)。此外，所有这些拷贝存在于BAC SPB4上。因此，通过鸟枪序列分析(shotgun sequence analysis)确定BAC克隆SPB4的DNA序列。产生一组随机的平均插入1.5kb大小的亚克隆。10μg CsCl纯化的DNA溶于200μlTE中，使用一种MSE soniprep 150超声粉碎仪，6微伏在冰上剪切6秒。乙醇沉淀后重悬于20μl TE，使用T4 DNA聚合酶修复DNA末端片段，11℃孵育25分钟，50μl反应混合液包含1xT4 DNA聚合酶缓冲液(New England BioLabs，USA)1mM DTT，100μM所有4种dNTP′s和孵育65℃，15分钟后，加入T4 DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，USA)。随后，使用1％SeaPlaque LMP琼脂糖凝胶(FMC)电泳分离剪切的DNA。从胶上切下1.5-2.5kb大小片段并在50ml TE中透析2小时，4℃。透析后的琼脂糖片被转移到1.5ml Eppendorf管，70℃融化5分钟，每100mg琼脂糖使用1个单位GELASE(Epicentre Technologies，USA)消化，45℃，1小时。随后，沉淀DNA。使用EcoRV限制性内切酶和去磷酸化的pBluescript SK+vector(Stratagene Inc.)16℃，连接1.5-2.5kb片段。随后，通过使用BioRad Gene Pulser的电穿孔将连接混合物转化ElectroMAX E.coli DH10B感受态细胞(Life Technologies，UK)。BioRad Gene Pulser的设置推荐使用操作手册。细胞涂布在Luria Broth(LB)琼脂板上，其含有氨苄青霉素(100μg/ml)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，Xgal)(64μg/ml)和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside，IPTG)(32μg/ml)。平板在37℃孵育23小时。在96孔平底烧瓶中生长单个白色菌落(1.5ml Terrific Broth培养基，含有100μg/ml氨苄青霉素)。

按照手册使用QIAprep 96 Turbo Miniprep系统和BioRobot^TM9600(QIAGEN)分离质粒DNA。按照手册使用ABI PRISM BigDye^TMTerminator cycle sequencing试剂盒(Stratagene)进行测序反应。所用克隆使用通用引物双向测序。测序产物使用Perkin Elmer ABI 3700 DNA分析仪毛细管电泳分离。

使用Phred-Phrap programs(Ewing和Green，1998 Genome Research8，186-194；Ewing等，1998 Genome Research 8，175-185)完成鸟枪法自动集合读数。提供覆盖全部BAC序列5x的总共835个读数。通过引物步行(primer walking)或一种联合PCR方法闭合重叠群之间的间隔。最终，序列在Phred quality 40(每10,000nt，1个错误)上使用Gap4 contig editor手动观察和再次测序所有低质量区域的集合编辑序列。BAC SPB4插入体的完整序列由77,283个核苷酸组成。

使用电脑程序GENSCAN(Burge和Karlin，1997 J.Mol.Biol：268，78-94)，GENEMARK(Lukashin和Borodovsky，1998 NAR 26，1107-1115)和BLASTX(Altschul等，1990 J.Mol.Biol.215，403-410)分析BAC SPB4临近的序列鉴定4个属于植物R基因NBS-LRR类的完全R基因候选序列(RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb和RGC4-blb)。在RGC1-blb和RGC4-blb之间设计一种CAPS标记物，标记物RGC1-4显示出蔓延疫霉抗性和RGC4-blb之间的重组，排除RGC4-blb是Rpi-blb的可能性(图3A和B)。尽管有这个发现，仍筛选所有4个RGC进行互补分析。

实施例5：互补分析

候选基因亚克隆并转化到根癌农杆菌

大约10kb的携带RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb或RGC4-blb的基因组片段从BAC克隆SPB4亚克隆进入双重植物转化载体pBINPLUS(van Engelen等，1995 Trans.Res.4，288-290)。限制性内切酶消化BAC克隆SPB4 DNA并按如下方法完成随后的大小筛选。使用1单位，0.1单位或0.01单位的Sau3AI限制性内切酶消化部分大约1μg DNA，30分钟。部分消化的BAC DNA进行CHEF电泳，在4℃，0.5X TBE，使用一种1-10秒频率的直流增加脉冲和磁场强度6V/cm，16小时。电泳后，用EB染色琼脂糖凝胶定位大约10kb大小DNA片段的区域。使用玻璃盖玻片(glasscoverslip)将这个区域从凝胶切下，在50ml TE中透析2小时，4℃。透析的凝胶碎片转入一种1.5ml Eppendorf管，70℃，融化5分钟，每100mg琼脂糖凝胶使用1单位GELASE(Epicentre Technologies，USA)消化45℃，1小时。连接BamHI消化的筛选大小的DNA和去磷酸化的pBINPLUS，随后，转化连接的DNA到ElectroMAX E.Coli DH10B感受态细胞(Life Technologies，UK)，使用BioRad基因脉冲发生器电传孔法如实施例5描述完成。细胞被涂布在含卡那霉素(50μg/ml)，Xgal(64μg/ml)和IPTG(32μg/ml)的LB琼脂糖板上，板子在37℃孵育24小时，在96孔板中生长出单个白色克隆(100μl LB培养基包含50μg/ml卡那霉素)。使用引物SPB42LF和SPB42LR或RGC4F和RGC4R(表2)PCR筛选总共480个克隆的RGC存在。筛选的阳性克隆用于质粒分离和更进一步的特性。对阳性克隆来源的SPB42L PCR片段测序完成携带RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb或RGC4-blb克隆的鉴定。对克隆末端测序确定RGC在一种亚克隆的相对位置并随后比较这些序列与完全的BAC插入序列。最后，筛选出4个双重质粒pRGC1-blb、pRGC2-blb、pRGC3-blb和pRGC4-blb并使用BioRad基因脉冲发生器电穿孔法或通过结合转化质粒进入根癌农杆菌株AGLO (Lazo等，1991 Bio/Technology 9，963-967)，LBA4404(Hoekema等，1983 Nature 303：179-180)或UIA143(Farrand等，1989 J.of Bacteriology 171，5314-5321)。BioRad基因脉冲发生器设置为说明书推荐的根癌农杆菌株设置。按照Simon等(1983Bio/Tech.1，784-791)等的描述完成结合。细胞被涂布在含卡那霉素(100mg/l)和利福平(50mg/l)的LB琼脂糖板上。板子在28℃孵育48小时。在含卡那霉素(100mg/l)和利福平(50mg/l)的LB培养基中进行筛选克隆的小量培养。如先前所述分离质粒DNA并通过限制酶切分析从根癌农杆菌再次分离和随后的转化到大肠杆菌来检验质粒的完整。携带一种正确DNA序列模式质粒的根癌培养物被用于转化一种易感的马铃薯基因型。

转化易感的马铃薯栽培品种

根癌农杆菌株在20ml补充50mg/l利福平和25mg/l卡那霉素的LB培养基，28℃，生长2天。随后，0.2ml根癌农杆菌培养物被稀释到含同样抗生素的10ml LB培养基，生长过夜(28℃)。过夜的培养物离心(30min，2647xg)。沉淀重悬在补充有30mg/l蔗糖(MS30)的50ml MS培养基(Murashige和Skoog，1962 Physiol.Plant.15，473-497)。

马铃薯栽培品种Impala的合格种子被剥开并且表面在含0.1％Tween-20的1％次氯酸钠溶液中灭菌30分钟。然后，用大量无菌蒸馏水(4次，10分钟)彻底冲洗块茎。从corkborer制备的柱状块茎组织切下大约2mm厚，7mm直径的圆片。块茎圆片被转入含根癌农杆菌的MS30液体培养基，孵育15分钟。去除根癌农杆菌溶液后，块茎圆片被转入含MS30，0.9mg/l IAA，3.6mg/l玉米素核糖甙(zeatine riboside)和8g/l琼脂(Hoekema等，1989 Bio/Technology 7，273-278)的再生培养基。培养盘在24℃孵育，16小时/每天(Philips TLD50W/84HF)。共同培养48小时后，块茎圆片在含抗生素200mg/l万古霉素，250mg/l头孢噻肟和75mg/l卡那霉素的液体MS培养基中漂洗5分钟，并被转入补充同样抗生素的再生培养基。培养盘在24℃孵育，16小时/每天(Philips TLD50W/84HF)。每3个星期，块茎圆片被转入新鲜培养基。再生芽被转入含75mg/l卡那霉素的MS30培养基。体外繁殖根芽，在3ml LB培养基孵育一片茎(3星期，37℃，400转)测试根癌农杆菌细胞的缺乏。每种转化再生体的一株植物被转入温室。

马铃薯中易感表型的互补

如实施例1描述检测初代转化体内抗蔓延疫霉的抗性。只有携带RGC2-blb的遗传构建可以补足易感表型，包含初代转化体的15/18的RGC2-blb具有抗性(表3)，因此，包含RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb的所有初代转化体是完全易感于蔓延疫霉。RGC2-blb转化体抗性显示与S.Bulbocastanum抗性双亲类似的抗性表型(图5)。因此，RGC2-blb被指定为Rpi-blb基因，图6提供了其DNA序列。

易感番茄的转化

易感番茄系Moneymaker的易感种子在70％乙醇中漂洗以溶解种子外衣并使用无菌水冲洗。随后，使用1.5％次氯酸钠将种子表面消毒15分钟，用无菌水漂洗3次并被放置在装有140ml MS培养基，pH6.0(Murashige和Skoog，1962 Physiol.Plant.15，473-497)，补充了10g/l蔗糖(MS10)和160ml vermiculite的容器里。将这些种子留下发芽，生长8天，25℃，0.5W/M²光照。

生长8天的旧子叶外植体在一种培养皿中预培养24小时，平皿包含一种生长2星期的种植在共同培养基中的烟草悬浮细胞旧饲养层(MS30pH5.8补充Nitsch维生素(Duchefa Biochemie BV，Haarlem，TheNetherlands)，0.5g/l MES缓冲液和8g/l Daichin琼脂)培养皿中。

将过夜培养的根癌农杆菌离心，沉淀重悬在包含200μM乙酰丁香酮到最终O.D.₆₀₀为0.25的细胞悬浮培养基中(MS30 pH5.8补充Nitsch维生素，0.5g/l MES缓冲液，pH5.8)。然后，外植体被稀释的培养过夜的含有辅助质粒pCH32(Hamilton等，1996 PNAS 93，9975-9979)和pRGC2-blb的根癌农杆菌株UIA143(Farrand等，1989 J.of Bacteriology171，5314-5321)感染25分钟，印迹在无菌滤纸上干燥，在原始的饲养层板上共同培养48小时。培养条件如上所述。

共同培养之后，子叶外植体被转化到装有选择性芽诱导培养基(MSpH5.8，补充10g/l葡萄糖，包括Nitsch维生素，0.5g/l MES缓冲液，5g/l琼脂凝胶，2mg/l玉米素核糖甙，400mg/l羧苄青霉素，100mg/l卡那霉素，0.1mg/l IAA)的培养皿，培养25℃，3-5W/m²光照。外植体每3个星期传代培养加入新鲜培养基。从下面的愈伤组织切下形成的芽并转入装有选择性根诱导培养基(MS10，pH5.8，补充Nitsch维生素，0.5g/l MES缓冲液，5g/l琼脂凝胶，0.25mg/l IBA，200mg/l羧苄青霉素和100mg/l卡那霉素)的容器。

番茄中易感表型的互补

研究是否Rpi-blb能够补充番茄中的易感表型，携带Rpi-blb基因构建体的Moneymaker初级转化体最初遇到蔓延疫霉分离群体IP0655-2A和IP0428来源的马铃薯的挑战。7/9初级转化体具有抗性(表3)。由于观察到检测马铃薯蔓延疫霉分离群体在番茄上比在马铃薯上具有更少的致病性，也对初级转化体用易感的住宅花园番茄植物中收集获得的蔓延疫霉分离群体进行测试。即使这个分离群体在Moneymaker上比先前测试的一种显著地具有更高的致病性，所有7个初级转化体保留抗性。这些结果阐明Rpi-blb基因的潜在效力不仅对抗马铃薯来源的复合分离群体也对抗番茄上的这些特异性的。

分子分析初级转化体

RT-PCR分析

为了制备DNA，变性19μl混合液(1分钟，83℃)，包含1μg总或polyA RNA，每个dNTP 0.25mM，50mM Tris-HCl pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT和530ng oligo d(T)引物，将GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)₁₈变性1分钟。随后，混合液被放在42℃，加入1μl反转录酶(M-MLV reversetranscriptase，Promega Benelux b.v.，Leiden，The Netherlands)。60分钟后，混合物加热1分钟，99℃，转移到冰上。2μl DNA用于标准PCR。

快速扩增cDNA末端。

使用GeneRacer^TM试剂盒(Invitrogen^TM，The Netherlands)快速扩增cDNA ends(RACE)鉴定Rpi-blbcDNA的5′和3′末端。使用引物GSP1(5′-GAGGAATCCATCTCCCAGAG)和GSP2(5′-GTGCTTGAAGAGATGATAATTCACGAG)联合使用GeneRacer^TM 3引物和GeneRace^TM 3′嵌套引物完成3′RACE。使用引物GSP3(5′-GTCCATCTCACCAAGTAGTGG)，GSP4(5′-GAAATGCTCAGTAACTCTCTGG)和GSP5(5′-GGAGGACTGAAAGGTGTTGG)联合使用GeneRacer^TM 5′和GeneRacer^TM 5′嵌套引物在cDNA合成上完成5′RACE。(图7)

实施例6：Rpi-blb基因和相应蛋白质的结构

比较由5′和3′快速扩增cDNA末端产生的cDNA片段插入pRGC2-blb来源的基因组序列，鉴定Rpi-blb基因的大小和结构。RACE分别鉴定单一种类的5′和3′Rpi-blb特异性cDNA片段，提示基因组克隆编码一种单Rpi-blb特异性转录。Rpi-blb转录的编码序列是2913个核酸。推定的Rpi-blb转录估计有3138核苷酸(nt)和分别含有一种44和181nt长的5′-和3非翻译区(UTR)。Rpi-blb基因含有一种位于基因的翻译开始密码子ATG之后，从428nt开始的678nt的单内含子(图3C)。

推定的Rpi-blb基因开放阅读框编码一种预知其分子量约为110.3kD的970氨基酸多肽(图8)。显然，植物R基因的NBS-LRR类的R基因上的几个功能性基序存在于编码的被分为3个结构域的蛋白质中(A、B和C；图8)。蛋白质的N末端部分包含可能的卷曲螺旋结构域，七肽重复位于通常是疏水的第一和第四残基(结构域A)。携带NBS的结构域B和其它基序组成R蛋白质的NB-ARC结构域(Apaf-1，R蛋白质，和CED-4的ARC)和动物体内的细胞死亡调节子(van der Biezen和Jones，1998)。这个结构域包括存在于真核和原核来源蛋白质中的Ap-ATPase基序(Aravind等，1999 Trends Biochem.Sci.24，47-53)。Rpi-blb的C末端的一半包含一系列19-20不规则的LRR(结构域C)。依据共有序列LxxLxxLxLxxC/N/SxxLxxLPxxa，LRR可被排列，x指任何残基，“a”指脂肪族氨基酸的位置，其后跟随一种变化的长度。这个重复形式近似细胞质LRR的共有序列(Jones和Jones，1997 Adv.Bot.Res.24，89-167)。

实施例7：Rpi-blb基因的天然同源物和人工变体

天然同源物

Rpi-blb基因的编码DNA序列的BLASTN的同源性研究鉴定了许多序列与Rpi-blb基因短的序列段(short stretches)有显著的同源性(图9C)。Rpi-blb基因编码序列的核苷酸549-1245与部分番茄的NBS片段享有81-90％序列相同性(例如Q194，Q137，Q198和Q199；Pan等，2000Genetics.155：309-22)。这些同源序列的长度在525和708核苷酸之间变化，它们是PCR片段，基于普遍存在的NBS基序使用(简并)引物对系统扫描番茄基因组鉴定PCR片段(Pan等，2000 Genetics.155：309-22；Leister等，1996 Nat Genet.14：421-429)。与现有技术显著同源的Rpi-blb基因的另一种区域包含编码序列的核苷酸76-805。这个729nt长的序列与马铃薯的EST(EMBL数据库，保藏号BG890602；图9C)有91％的序列相同性。Rpi-blb基因序列的下游核苷酸1245，包含LRR区域，与现有技术任何序列无显著同源性。Rpi-blb基因编码序列的BLASTX同源搜索揭示多种现有技术的序列的氨基酸序列同源性不超过36％的序列相同性(表4)。衍生自Oryza sativa的NBS-LRR基因获得了最好BLASTX分数(36.5％氨基酸序列相同性)。与Rpi-blb具有27-36％氨基酸序列相同性的全部序列同源性的NBS-LRR基因可在鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、番茄(Lycopersicon esculentum)(镰刀霉I2基因簇；Ori等，1997 Plant Cell，9，521-532；Simons等，1998 Plant Cell 10，1055-1068)、玉蜀黍(Zea mays)、大麦(Hordeum vulgare)和莴苣(Lactucasativa)中发现。使用Saitou和Nei的邻近距离法(1987 Molecular Biology和Evolution 4，406-425)，Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb，RGC4-blb的推定氨基酸序列和衍生自多个品种的现有基因(BLASTX限定)的同源物的系统发生研究显示Rpi-blb基因簇的成员可以置于一种分枝中(图9)。

在8005-8 BAC克隆SPB4上鉴定的Rpi-blb基因簇的4个RGC的序列比较显示Rpi-blb基因簇的序列同源性在氨基酸水平在70％和81％之间变化。Rpi-blb的推定氨基酸序列与RGC3-blb具有最高的全部同源性(81％氨基酸序列相同性；表4)。当比较不同的结构域时，很清楚蛋白质的N末端(卷曲螺旋和NB-ARC结构域)(91％氨基酸序列相同性)比这些蛋白质的C末端享有更高程度的同源性(LRR；71％氨基酸序列相同性)。NBS-LRR蛋白质的N末端影响下游信号成分的需要，因此被认为是假定的受体结构域(Feys和Parker，2000 Trends Genet 16：449-55)。通过遗传研究，诱导物识别特异性提示了C末端的LRR区域，(Ellis等，2000Trends Plant Sci.5：373-379；Dodds等，2001 Plant Cell 13：163-78)。

比较所有4个氨基酸序列揭示总共104 Rpi-blb特异性氨基酸残基(图4A)。这些中的多数位于LRR区域内(80/104)。在后面的区域内，这些特异性的残基集中在LRR亚结构域xxLxLxxxx内。这些特异性的氨基酸残基在LRR亚结构域内相关的频率(28.3％)是其余LRR结构域(12.3％)观察到的2倍高。在共有序列xxLxxLxxxx内位于2个保守亮氨酸残基周围的残基被认为溶剂暴露并因此可能涉及创造/保持抗性蛋白质识别特异性。

通过筛选基因组DNA或插入文库，获得Rpi-blb基因另外的同源物序列，例如，基于Rpi-blb基因序列信号的BAC文库的引物。筛选不同的茄科植物BAC文库的引物组A和/或B(表2和图7)鉴定其它茄科植物bulbocastanum(B149-blb)，马铃薯(SH10-tub和SH20-tub)和S.tarijense(T118-tar)来源的Rpi-blb同源物。比较所有8个蛋白质序列减少特异性的氨基酸残基数量到51(51/970；5.25％)(图10B)。多数位于LRR区域内(42/51；82％)。在LRR亚结构域xxLxlxxxx内这些特异性的氨基酸残基的相关频率是其余LRR结构域观察到的3.3倍高(分别是18.8％对5.7％)。这些数据清晰的显示蔓延疫霉特异性抗性在Rpi-blb基因簇内的发展主要通过转变Rpi-blbLRR特异性的残基。

使用Saitou和Nei的邻近距离法(1987 Molecular Biology和Evolution4，406-425)，在上述系统发生树分析中包含另外的Rpi-blb同源物，更加证明系统发生树分析作为一种定义Rpi-blb同源物序列的方法(图9B)。在氨基酸水平，具有至少70％序列相同性的任何功能性R基因产物，作为Rpi-blb基因簇的基因产物在同样的分枝上结束，因此被定义为Rpi-blb的同源物。

人工变体

结构域在不同同源物之间交换可确定不同序列在蔓延疫霉抗性中的作用。例如，限制性内切酶NsiI，其识别存在于保守MHD基序内的DNA序列ATGCAT，使用本领域技术人员熟知的技术，其可用于Rpi-blb与RGC1-blb或RGC3-blb之间交换完全的LRR结构域。Rpi-blb基因嵌合的变体被制成，它编码Rpi-blb N末端的一半，RGC1-blb或RGC3-blb C末端的一半和反之，即，RGC1-blb或RGC3-blb的N末端和Rpi-blb的C末端(图11)。这些变体被转化到易感的马铃薯基因型Impala，检测蔓延疫霉抗性。嵌合RGC3-blb基因包含Rpi-blb的LRR结构域，可对抗蔓延疫霉说明Rpi-blb基因的特异性由这部分基因所编码。

表1.蔓延疫霉易感性在不同S.bulbocastanum保藏物的概况

S.bulbocastanum 保藏物 # # # ％

CGN BGRC PI 植物 R V 易感性基因簇^a

17692 8005 275193 11 10 1 9 A

8006 275194 16 15 1 6 A

17693 8008 275198 19 18 0 B

17687 7997 243505 35 25 4 14 B

17688 7999 255518 19 19 0 0 C

^a字母a、b和c代表如图1所示的有关的地理起源

表2.用于Rpi-blb作图的标记物的概况

标记物方向^a 序列^b 退火温度(℃) 限制性酶^c

TG513 F CGTAAACGCACCAAAAGCAG 58 a.s.

R GATTCAAGCCAGGAACCGAG

TG330 F CAGCTGCCACAGCTCAAGC 56 TaqI

R TACCTACATGTACAGTACTGC

CT88 F GGCAGAAGAGCTAGGAAGAG 57 MboI

R ATGGCGTGATACAATCCGAG

F TTCAAGAGCTTGAAGACATAACA 60 a.s.

R ATGGCGTGATACAATCCGAG

CT64 F ACTAGAGGATAGATTCTTGG 56 CfoI

R CTGGATGCCTTTCTCTTATGT

B139R F GATCAGAAGTGCCTTGAACC 56 TaqI

R CAAGGAGCTTGGTCAGCAG

SPB33L F ATTGCACAGGAGCAGATCTG 59 Hinfl

R TGTAAGAGAGCAAGAGGCAC

SPB42L F AGAGCAGTCTTGAAGGTTGG 58 CfoI

R GATGGTAACTAAGCCTCAGG

B149R F GACAGATTTCTCATAAACCTGC 58 MseI/XbaI

R AATCGTGCATCACTAGAGCG

RGC1-4 F TGTGGAGTAAGAGAGGAAGG 62 SspI/MseI

R TCAGCTGAGCAGTGTGTGG

A F ATGGCTGAAGCTTTCATTCAAGTTCTG 60

R TCACACCGCTTGATCAGTTGTGGAC

B F TRCATGAYCTMATCCATGATTTGC 60

R GMAATTTTGTGCCAGTCTTCTCC

^a引物方向，F：正向，R ：反向

^b依据IUB编码的引物序列.

^ca.s.：等位基因特异性

表3.在马铃薯和番茄中晚疫病易感性的互补

基因型^a 含有RGA的植物/转化体 R植物/含有RGA的植物

IMP(RGC1-blb) 15/17^b 0/15

8/9^d 0/8

IMP(RGC2-blb) 6/31^c 6/6

12/14^d 9/12

IMP(RGC3-blb) 0/6^c -

5/5^d 0/5

IMP(RGC4-blb) 18/19^b 0/18

1/12^C 0/1

IMP(vector) 8/8^b 0/8

9/10^d 0/9

MM(RGC2-blb) 9/11^d 7/9

^a以含有Rpi-blb基因候选基因RGC1-blb、RGC2-blb、RGC3-blb或RGC4-blb的T-DNA构建体分别转化易感马铃薯和番茄基因型Impala(IMP)和Moneymaker(MM)获得的初级转化体。根癌农杆菌株AGL0^b、LBA4404^c或UIA143^d被用于转化。使用复合分离物IPO655-2A和IPO428-2，采用离脱叶分析检测抗性。

表4.比较核苷酸和氨基酸序列同源性

		8005-8 BAC SPB4			水稻RGC	拟南芥RGC	番茄I2C-1
		8005-8 BAC SPB4						RGC3-blb	RGC1-blb	RGC4-blb
		Rpi-blb	nt^a	88				RGC3-blb	RGC1-blb	RGC4-blb	84	81	-	-	-
aa^a	81		nt^a	88	76	70	36	32	32		84	81	-	-	-
	81		N^b C^b91 71	N C79 72	76	70				N C75 66

^a核苷酸(nt)和氨基酸(aa)序列相同性百分比。

^b分别比较蛋白质序列N末端和C末端的部分。两个部分的边缘是DNA序列内保守的NsiI限制性位点(位于Rpi-blb编码序列的1417位)。

Claims

1.一种分离的或重组的核酸，其包含一种编码图8的氨基酸序列或其功能性片段或同源物的核酸。

2.权利要求1的片段，其编码图8的氨基酸序列的富含亮氨酸重复(LRR)片段。

3.权利要求1或2的核酸，所述核酸编码一种能够为茄科(Solanaceae)成员提供抗卵菌病原体抗性的基因产物或其功能性等价物。

4.权利要求3的核酸，其中所述茄科成员包含马铃薯(S.tuberosum)。

5.权利要求3的核酸，其中所述抗性是品种非特异性的。

6.权利要求1到5中任一项的核酸，其包含如图6所示的Rpi-blb的序列或其部分。

7.权利要求1到5中任一项的核酸，其至少包含一种LRR结构域。

8.包含权利要求1到7中任一项的核酸的载体。

9.一种宿主细胞，其包含权利要求1到7中任一项的核酸或权利要求8的载体。

10.权利要求9的细胞，包含植物细胞。

11.权利要求10的细胞，其中所述植物包含一种茄科成员。

12.一种植物，其包含权利要求9到11中任一项的细胞。

13.来源于权利要求12的植物的一部分。

14.权利要求13的一部分，其中所述块茎包含马铃薯或所述果实包含番茄。

15.权利要求12的植物的子代。

16.由权利要求1到7中任一项的核酸编码的蛋白质物质。

17.一种蛋白质物质，其包含一种如图8所示的氨基酸序列或其功能性等价物。

18.一种针对权利要求1到7中任一项的核酸的结合分子。

19.权利要求18的结合分子，其包含一种探针或引物。

20.权利要求18或19的结合分子，其具有一种标记物。

21.权利要求20的结合分子，其中所述标记物包含一种可激发部分。

22.权利要求1到7中任一项的核酸或权利要求8的载体或权利要求9到11中任一项的细胞或权利要求16或17的物质或权利要求18到21中任一项的结合分子在为一种植物或其子代提供抗卵菌感染抗性的方法中的应用。

23.权利要求22的应用，其中所述卵菌包含蔓延疫霉(Phytophthorainfestans)。

24.权利要求22或23的应用，其中所述植物包含马铃薯。

25.为一种植物或其子代提供至少部分抗卵菌感染抗性的方法，所述方法包括为所述植物或其部分提供一种基因或其功能性片段，其包含一种相应于一个基因簇中的一种基因的核酸，该基因簇可经系统发生树分析而鉴定为相应于图9的Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb基因簇，所述核酸编码一种能够为茄科植物的成员提供抗卵菌真菌抗性的基因产物，或者所述方法包括为所述植物或其部分提供权利要求1到7中任一项的核酸或权利要求8的载体或权利要求9到11中任一项的细胞或权利要求16或17的物质。

26.筛选植物或植物材料或其子代对于卵菌感染的易感性或抗性的方法，包含检测至少部分所述植物或植物材料或其子代中一种相应于一个基因簇中的一种基因的核酸的存在或缺失，该基因簇可经系统发生树分析而鉴定为相应于图9的Rpi-blb、RGC1-blb、RGC3-blb和RGC4-blb基因簇，所述核酸编码一种能够为茄科植物的成员提供抗卵菌真菌抗性的基因产物。

27.权利要求26的方法，包含将至少部分所述植物或植物材料或其子代与权利要求18到21中任一项的结合分子相接触并确定所述分子结合到所述部分。

28.权利要求27的方法，其中所述卵菌包含蔓延疫霉。

29.权利要求27或28的方法，其中所述植物包含马铃薯。

30.一种分离的S.bulbocastanum或其部分，其对由蔓延疫霉导致的卵菌感染具有易感性。