BRPI0307510B1 - vetor, uso de um ácido nucléico, de um vetor, de uma célula ou de uma substância, e, métodos para proporcionar uma planta ou sua prole com resistência pelo menos parcial contra uma infecção de oomiceto, e para selecionar uma planta ou um material de planta ou sua prole para sua suscetibilidade ou resistência a uma infecção de oomiceto - Google Patents

Abstract

"ácido nucléico, fragmento, vetor, célula hospedeira, planta, parte derivada de uma planta, prole, substância proteinácea, molécula de ligação, uso de um ácido nucléico, métodos para proporcionar uma planta ou sua prole com resistência pelo menos parcial contra uma infecção de oomiceto, e para selecionar uma planta ou um material de planta ou sua prole para sua suscetibilidade ou resistência a uma infecção de oomiceto, e,s. bulbocastanum isolado ou sua parte". a invenção refere-se ao campo da doença de plantas, em particular às infecções de oomiceto tal como míldio, uma doença de maior importância para a produção de solanaceae tal como cultivares de batata e de tomate. a invenção proporciona um método para proporcionar uma planta ou sua prole com resistência contra uma infecção de oomiceto compreendendo a provisão da citada planta ou de sua parte com um gene ou um seu fragmento funcional compreendendo um ácido nucleico, o citado ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de proporcionar um membro de solanaceae com resistência contra um fungo oomiceto.

Description

"VETOR, USO DE UM ÁCIDO NUCLÉ1CO. DE UM VETOR. DE UMA CÉLULA OU DE UMA SUBSTÂNCIA, E, MÉTODOS PARA PROPORCIONAR UMA PLANTA OU SUA PROLE COM RESISTÊNCIA PELO MENOS PARCIAL CONTRA UMA INFECÇÃO DE OOMICETO, E PARA SELECIONAR UMA PLANTA OU UM MATERIAL DE PLANTA OU SUA PROLE PARA SUA SUSCETIBILIDADE OU RESISTÊNCIA A UMA INFECÇÃO DE OOMICETO" Míldio, causado pelo patógeno oomiceto Phytophthora infesícms é em todo o mundo a doença mais destrutiva para o cultivo de batata. A doença também ameaça a cultura de tomate. A urgência da obtenção de cultivares resistentes tem intensificado porque cepas de patógenos resistentes a pesticida e especializados em cultura, mais virulentos estão emergindo mais rapidamente.

Um modo de prevenir as falhas de cultura ou rendimentos reduzidos é a aplicação dc fungicidas que previnem ou curam uma infecção dc P. infestam·. Contudo, a aplicação de agentes protetores é amplamente considerada uma carga para o meio ambiente. Assim, em vários países ocidentais, a legislação está se tomando mais restritiva e parcialmente proibitiva à aplicação de fungicidas específicos, tornando o controle químico da doença mais difícil. Uma abordagem alternativa é o uso de cultivares que hospedam resistência parcial ou completa ao míldio. Dois tipos de resistência ao míldio têm sido descritos e usados na geração de batata. Um tipo é conferido por uma série de genes dominantes, maiores, que tornam o hospedeiro incompatível com raças específicas do patógeno (resistência específica à raça). Onze de tais genes R (RI-RI /) têm sido identificados e, como se acredita, são originários da espécie selvagem de batata Sokmum demissmn, que é nativa do México, onde a variação genética maior do patógeno é encontrada. Vários destes genes R têm sido mapeados sobre o mapa genético da batata (revisto em Gebhardt e Valkonen, 2001 Annu. Rev. Phytopathol. 39: 79-102). RI e R2 estão localizados nos cromossomos 5 e 4, respectivamente. R3, R6 e R7 estão localizados no cromossomo 11. Genes R desconhecidos conferidores de resistência específica à raça ao míldio também têm sido descritos em S. tuberosum ssp. andigena e S. berthaulíii (Ewing et al., 2000 Mol. Breeding 6: 25-36. Por causa o nível alto de resistência e da facilidade de transferência, muitos cultivares contêm resistência derivada de S. demissum. Infelizmente, resistência específica à raça derivada de S. demissum, embora quase completa, não é durável. Uma vez por semana os cultivares germinados são crescidos em grande escala em campos comerciais, novas virulências emergem em P. infestans que tomam o patógeno capaz de suplantar a resistência introduzida. O segundo tipo de resistência, chamado de resistência de campo e com freqüência de natureza quantitativa, é considerado não-específica à raça e mais durável. A resistência de campo ao míldio pode ser encontrada em várias espécies de Solanum no México e nas Américas Central e do Sul (Rossi et al., 1986 PNAS 95: 9750-9754). S. bulbocastanum diplóide do México e da Guatemala é uma das espécies possuindo tubérculo que é conhecida por seus níveis altos de resistência de campo ao míldio (Niederhauser e Mills, 1953 Phytopathology 43: 456-457). A despeito das diferenças nos números de balanço de endosperma, a introgressão da característica de resistência de S. bulbocastanum tem sido bem sucedida. Manipulações de ploidia e uma série de cmzamentos de ponte tediosos têm resultado em germoplasma resistente a P. infestans, derivado de S. bulbocastanum (Hermsen e Ramanna, 1969 Euphytica 18: 27-35; 1973 Euphytica 22: 457-466; Ramanna e Hermsen, 1971 Euphytica 20: 470-481; Hermsen e De Boer, 1971 Euphytica 20: 171-180). Contudo, quase 40 anos após os primeirns cruzamentos e os esforços de geração intensos e contínuos pelos cultivadores de batata nos Países Baixos com este germoplasma, cultivares resistentes ao míldio ainda permanecem para serem introduzidos no comércio. A produção bem sucedida de híbridos somáticos de S. bulbocastanum e de S. tuberosum também tem sido relatada (Thieme et al., 1997 Euphytica 97 (2): 189-200; Helgeson et al., 1998 Theor Appl. Genet 96: 738-742). Alguns destes híbridos e germoplasma reversivelmente cruzado foram, como verificado, elevadamente resistentes ao míldio, até mesmo sob pressão de doença extrema. A despeito dos esforços de supressão de recombinação, a resistência em material reversivelmente cruzado pareceu estar no cromossomo 8 dentro de um intervalo de aproximadamente 6 cM entre os marcadores CP53 e CT64 de RFLP (Naess et al., 2000 Theor. Appl Genet 101: 697-704). Um marcador CAPS derivado de tomate RFLP sonda CT88 co-segregou com resistência. Supressão de recombinação entre os cromossomos de S. bulbocastanum e de S. tuberosum forma um obstáculo potencial para a reconstituição bem sucedida de germoplasma de batata cultivada para um nível que poderia atender aos padrões para os cultivares de batata recém-germinados. Isolamento dos genes que codificam a resistência encontrados em S. bulbocastanum e transformação subseqüente dos cultivares existentes com estes genes, seria uma abordagem mais direta e rápida quando comparada com a geração por introgressão. A clonagem e a caracterização molecular de numerosos genes R de planta conferidores de resistência à doença causada por bactérias, fungos, vírus, nematódeos, e insetos têm identificado vários aspectos estruturais característicos de genes R de planta (revisto em Dangl e Jones, 2001 Nature 411,826-833). São em sua maioria membros de famílias de multigene fortemente ligadas e todos os genes R caracterizados até agora, com a exceção de Pto, codificam repetições ricas em leucina (LRRs), estruturas que, como mostrado, estão envolvidas rm interações de pi oteíim-proieína. Genes R contendo LRR podem ser divididos em duas classes baseadas na presença de um sítio de ligação de nucleotídeo (NBS) tripartite putativo. Os genes R da classe NBS-LRR compreendem motivos que são compartilhados com proteínas regulatórias de apoptose animal (van der Biezen et al., 1998 Curr. Biol. 8, 226-227; Aravind et al., 1999 Trends Biochem. Sei. 24, 47-53) e podem ser subdivididos em dois subgrupos baseados em seu domínio N-terminal, que quer exibe similaridade de seqüência para a proteína Drosophila Toll e o domínio de receptor de interleucina-1 de mamífero (TIR-NBS-LRR), quer contém um domínio em super-hélice ou de fechamento de leucina potencial (CC-NBS-LRR; Pan et al., 2000 Genetics. 155: 309-22). Os genes R de LRR sem um NBS codificam proteínas de transmembrana, cuja região N-terminal extracelular é composta de LRRs (Jones et al., 1994 Adv. Bot. Res. 24,89-167). Estes genes podem ser divididos em dois subgrupos baseados na presença de um domínio de serina/treonina quinase citossólica (Song et al., 1995 Science, 270,1804-1806). Quatro genes R têm sido correntemente clonados de batata. Todos os quatro, incluindo o gene RI derivado de S. demissum conferidor de resistência específica à raça ao míldio, pertencem à classe CC-NBS-LRR de genes R de planta (Bendahmane et al., 1999 Plant Cell 11,781-791; Bendahmane et al., 2000 Plant J. 21,73-81 ; van der Vossen et al., 2000 Plant Journal 23,567-576 ; Ballvora et al., 2002 Plant Journal 30, 361-371). A invenção proporciona um ácido nucleico recombinante e isolado compreendendo um ácido nucleico codificador de seqüência de aminoácidos da fig. 8 ou um seu fragmento funcional ou um seu homólogo. A proteína codificada pelo citado aminoácido tem sido detectada como sendo membro de um grupo de genes identificáveis pela análise de árvore filogenética, que até este ponto consiste das proteínas Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb (aqui também chamado de grupo de gene Rpi-blb) da figura 9 A análise de árvore filogenética é realizada como segue.

Primeiro um alinhamento de múltiplas seqüências é realizado das seqüências de ácido nucleico e/ou preferivelmente das seqüências de aminoácidos deduzidas dos genes a serem analisados usando CLUSTALW (http://www2.ebi.ac.uk/clustalw), que está em uso padrão na arte. ClustalW produz um arquivo .dnd, que pode ser lido por TREEVIEW (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod. html).

Estudos filogenéticos das seqüências de aminoácidos deduzidas de Rpi-blb, RGCl-blb, RGCS-blb, RGC4-blb e daquelas dos genes mais semelhantes da arte (como definidos pelo BLASTX) derivados de diversas espécies, usando o método de Neighbour-Joining de Saitou and Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4,406-425), mostra que os genes correspondentes ou seus fragmentos funcionais do grupo de genes Rpi-blb pode ser posicionado em um ramo separado (Figura 9A).

Comparações de seqüências entre os quatro membros do grupo de genes Rpi-blb identificados no 8005-8 BAC clone SPB4 mostram que homologia de seqüência dentro do grupo de genes Rpi-blb varia entre 70% e 81% em nível de seqüência de aminoácidos. A seqüência de aminoácidos deduzida de Rpi-blb compartilha a homologia total mais elevada com RGCS-blb (identidade de seqüência de aminoácidos de 81%; Tabela 4). Quando os domínios diferentes são comparados está claro que os domínios efetores presentes nas metades N-terminais das proteínas (domínios em super-hélice e NBS-ARC) compartilham um grau maior de homologia (identidade de seqüência de 91%) do que as metades C-terminais destas proteínas que, como considerado, contêm os domínios de reconhecimento (LRRs; identidade de seqüência de aminoácidos de 71%). Comparação de todas as quatro seqüências de aminoácidos revelou um total de 104 resíduos de aminoácidos específicos de Rpi-blb (Figura 10). Estes em sua maioria estão localizados na região de LRR (8,0/104) Dentro da últi ma região, cslcs resíduos especiticos estão concentrados no subdomínio xxLxLxxxx de LRR. A freqüência relativa destes resíduos aminoácidos específicos dentro deste subdomínio de LRR é mais do que duas vezes maior (28,3%) do que aquela observada no restante do domínio de LRR (12,3%). Os resíduos posicionados ao redor de dois resíduos de leucina conservados no consenso xxLxLxxxx são, como considerado, para serem expostos a solvente e estão portanto provavelmente envolvidos na geração/manutenção da especificidade de reconhecimento da proteína de resistência.

As seqüências de membros adicionais do grupo de genes Rpi-blb podem ser obtidas pela triagem de bibliotecas de insertos ou de DNA genômico, por exemplo bibliotecas de BAC com iniciadores baseados em seqüências de assinatura do gene Rpi-blb. Triagem de várias bibliotecas de BAC de Solanum com conjuntos de iniciadores A e/ou B (Tabela 2 e Figura 7) identificou numerosos homólogos de Rpi-blb derivados de diferentes espécies de Solanum. O alinhamento destas seqüências adicionais com aquelas apresentadas na Figura 10 ajudará a identificar os membros adicionais do grupo de genes Rpi-blb e os resíduos de aminoácido nas mesmas responsáveis pela especificidade de resistência a P. infestam. Em adição, teste de seqüências adicionais nas análises de árvore filogenética acima descritas, por exemplo usando o método de Neighgour-Joining de Saitou e Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425), proporciona identificação adicional dos genes pertencentes ao grupo de genes Rpi-blb. A invenção proporciona o desenvolvimento de um mapeamento intra-específico de população de S. bulbocastanum que segregou resistência não-específica à raça ao míldio. A resistência foi mapeada no cromossomo 8, em uma região localizada 0,3 cM distai de CT88. Devido à natureza de resistência não-específica à raça, a resistência de S. bulbocastanum ao míldio tem sempre sido considerada como sendo independente de gene R. Contudo, ^υιη a. presente invenção demonstramos pela primeira vez que a resistência não-específica à raça de S. bulbocastanum é na verdade conferida por um gene possuindo semelhança a um gene R do tipo NBS-LRR. A invenção adicionalmente proporciona a análise molecular desta região genômica e o isolamento por clonagem baseada em mapa de um fragmento de DNA da organismo parental resistente que hospeda um gene R, chamado de Rpi-blb. Este fragmento de DNA foi subclonado de um clone de cromossomo artificial bacteriano (BAC) de aproximadamente 80 kb que continha quatro sequências semelhantes a gene R completas em um arranjo semelhante a grupo. A transformação de um cultivar de batata suscetível por Agrobacterium tumefaciens revelou que uma das quatro seqüências semelhantes a gene R corresponde a Rpi-blb que proporciona a resistência não-específica à raça ao míldio. A caracterização do gene Rpi-blb mostrou que ele é um membro da classe NBS-LRR dos genes R de planta. As seqüências mais rigorosamente funcionalmente caracterizadas da arte anterior são membros da família de genes de resistência 12 em tomate. Estas seqüências possuem uma identidade de seqüência de aminoácidos total de aproximadamente 32% com aquela de Rpi-blb.

Assim, em uma primeira modalidade, a invenção proporciona um ácido nucleico recombinante ou isolado, o citado ácido nucleico codificador de um produto de gene possuindo a seqüência de Rpi-blb ou um seu fragmento funcional que é capaz de proporcionar um membro da família Solanaceae com resistência não-específica à raça contra um patógeno oomiceto. O isolamento do gene como aqui proporcionado que codifica a característica de resistência desejada ao míldio e a transformação subseqüente dos cultivares de batata e de tomate existentes com este gene agora proporcionam uma abordagem muito mais direta e mais rápida quando euiupaiaua üum a geração de inirogressão. Os resultados aqui proporcionados oferecem possibilidades de estudo adicional da base molecular da interação de patógeno de planta, do papel ecológico dos genes R em uma espécie de batata mexicana e são úteis para o desenvolvimento de cultivares de batata ou de tomate resistentes por meio de modificação genética.

Em contraste com os genes R clonados e descritos até agora, o gene que aqui proporcionamos é o primeiro gene R isolado de uma espécie de Solanum que proporciona resistência não-específica à raça contra um patógeno oomiceto. Notavelmente, a invenção proporciona aqui um ácido nucleico no qual a citada espécie de Solanum que é proporcionada com a resistência desejada compreende S. tuberosum. Em particular, é o primeiro gene que tem sido isolado de uma planta parental filogeneticamente distinta de batata cultivada, S. bulbocastanum, para o qual foi mostrado por análise de complementação, que é funcional em S. tuberosum. Estes dados implicam que o gene Rpi-blb pode ser facilmente aplicado na produção de batata sem uma necessidade de geração de introgressão complexa e consumidora de tempo.

As seguintes definições são proporcionadas para os termos usados na descrição e nos exemplos que seguem. Ácido nucleico: uma molécula de RNA ou de DNA de fita simples ou de fita dupla.

Oligonucleotídeo: uma molécula de ácido nucleico de fita simples curta.

Iniciador: o termo iniciador refere-se a um oligonucleotídeo que pode iniciar a síntese de ácido nucleico.

Homologia: homologia é o termo usado para a similaridade ou identidade de informação de seqüência biológica. Homologia pode ser verificada em nível de seqüência de nucleotídeos e/ou de seqüência de aminoácidos. Para o cálculo da identidade percentual s ãlgcntmu BLAST puue ser utilizado (Àitschul et al., 1997 Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402) usando parâmetros básicos ou, altemativamente o algoritmo GAP (Needleman e Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48: 443-453), usando parâmetros básicos, que estão ambos incluídos no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA. Pesquisas de BLAST assume que as proteínas podem ser modeladas como sequência randômicas. Contudo, muitas proteínas reais compreendem regiões de seqüências não-randômicas que podem ser tratos homopoliméricos, repetições de período curto, ou regiões enriquecidas em um ou mais aminoácidos. Tais regiões de complexidade baixa podem ser alinhadas entre proteínas não relacionadas embora outras regiões das proteínas sejam inteiramente dessemelhantes. Numerosos programas de filtro de baixa complexidade podem ser empregados para reduzir tais alinhamentos de baixa complexidade. Por exemplo, os filtros de baixa complexidade SEG (Wooten e Federhen, 1993 Comput. Chem. 17: 149-163) e XNU (Claverie and States, 1993 Comput. Chem. 17: 191-201) podem ser empregados sozinhos ou em combinação.

Como aqui usado, 'identidade de seqüência' ou 'identidade' no contexto de duas seqüências de proteína (ou seqüências de nucleotídeo) inclui referências aos resíduos na duas seqüências que são os mesmos quando alinhados para a máxima correspondência sobre uma janela de comparação específica. Quando a percentagem de identidade de seqüência é usada em referência às proteínas é reconhecido que as posições de resíduo que não são idênticas com freqüências diferem por substituições de aminoácido não conservativas, onde os aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácido com propriedades químicas semelhantes (por exemplo carga ou hidrofobicidade) e portanto não mudam as propriedades funcionais da molécula. Onde as seqüências diferem em substituições conservativas, a percentagem de identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa das substituições. É dito que as seqüências, que diferem por tais substituições conservativas possuem 'similaridade de seqüência' ou 'similaridade'. Meios para realizar estes ajustes são bem conhecidos pelas aquelas pessoas experientes na arte. Tipicamente isto envolve o escore de uma substituição conservativa como uma combinação inadequada parcial em vez de total aumentando deste modo a identidade de seqüência percentual. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idêntico é dado um escore de 1 e uma substituição não-conservativa é dada um escore de zero, uma substituição conservativa é dado um escore entre 0 e 1. O escore de substituições conservativas é calculado, por exemplo de acordo com o algoritmo de Meyers e Miller (Computer Applic. Biol. Sei. 4: 11-17,1988).

Como aqui usado, 'percentagem de identidade de seqüência' significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, na qual a porção da seqüência de aminoácidos ou da seqüência de nucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, hiatos) em comparação com a seqüência de referência para o alinhamento ótimo das duas seqüências. A percentagem é calculada pela determinação do número de posições na qual o resíduo base de ácido nucleico ou de aminoácido idêntico ocorre em ambas as seqüências para dar o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de seqüência. Preferivelmente, a sequência de aminoácidos da proteína da invenção compartilha pelo menos homologia de 82% ou maior com a seqüência como mostrado na Fig. 8. Como mostrado na Tabela 4, a seqüência mais rigorosamente funcionalmente caracterizada da arte anterior (membros do grupo de genes 12 de resistência a Fusarium em tomate) possui um nível muito menor de identidade de seqüência de aminoácidos do que esta (32% com respeito àquela de Rpi-blb). Homologia dentro do grupo de genes da presente invenção varia entre 70% e 81% em nível de seqüência de aminoácidos.

Seqüências de ácido nucleico homólogas são seqüências de ácido nucleico codificadoras de uma proteína homóloga como definida acima. Um exemplo de um tal ácido nucleico é a seqüência proporcionada na figura 6A. Contudo, há muitas seqüências que codificam uma proteína que é 100% idêntica à proteína como mostrada na fig. 8. Isto é devido à oscilação nos tripletes de nucleotídeos, onde mais do que um triplete pode codificar um e o mesmo aminoácido. Assim, até mesmo sem haver um efeito sobre a seqüência de aminoácidos da proteína a seqüência de nucleotídeos r codificadora desta proteína pode ser variada substancialmente. E sabido que as seqüências de nucleotídeos codificadoras de seqüências de aminoácidos que não são 100% idênticas à citada proteína podem conter ainda mais variações. Portanto, a identidade percentual em nível de seqüência de ácido nucleico pode variar dentro de limites amplos, sem se desviar da invenção.

Promotor: o termo "promotor" é intencionado para significar uma seqüência de DNA curta na qual a RN A polimerase e/ou outros fatores de iniciação de transcrição se ligam antes da transcrição do DNA no qual o promotor está funcionalmente conectado, permitindo a ocorrência da transcrição. O promotor está normalmente situado a montante (5') da seqüência codificadora. Em seu escopo mais amplo, o termo "promotor" inclui o sítio de ligação de RNA polimerase bem como os elementos de seqüência regulatória localizados dentro de várias centenas de pares de base, ocasionalmente ainda mais longe, do sítio de iniciação de transcrição. Tais seqüências regulatórias são, por exemplo, seqüências que estão envolvidas na ligação de fatores de proteína que controlam a efetividade da iniciação de transcrição em resposta às condições fisiológicas. A região de promotor deve ser funcional na célula hospedeira e preferivelmente corresponde à região de promotor natural do gene de resistência Rpi-blb. Contudo, qualquer região de promotor heteróloga pode ser usada desde que seja funcional na célula hospedeira onde a expressão é desejada. O promotor heterólogo pode ser quer constitutivo quer regulável, específico para tecido ou não específico. Um promotor constitutivo tal como o promotor CaMV 35S ou promotores T-DNA, todos bem conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte, é um promotor que está sujeito a substancialmente nenhuma regulação tal como indução ou repressão, mas que permite uma transcrição constante e substancialmente não modificada da seqüência de DNA na qual está funcionalmente ligado em todas as células ativas do organismo desde que outros requerimentos para a transcrição ocorrer sejam r totalmente atendidos. E possível o uso de um promotor tecido-específico, que é condutor da expressão naquelas partes da planta que são propensas à infecção de patógeno. No caso de Phytophthora um promotor que conduz a expressão nas folhas, tal como promotor ferredoxina, pode ser utilizado. Um promotor regulável é um promotor cuja função é regulada por um ou mais fatores. Estes fatores quer podem ser tais que sua presença garante a expressão da seqüência de DNA relevante que podem, altemativamente, se tais que suprimem a expressão da seqüência de DNA de modo que sua ausência causa a expressão da seqüência de DNA. Assim, o promotor e opcionalmente sua seqüência regulatória associada podem ser ativados pela presença ou ausência de um ou mais fatores para afetar a transcrição das seqüências de DNA do construto genético da invenção. Seqüências de promotor adequadas e meios para a obtenção de uma expressão e uma transcrição aumentadas são conhecidos por aquelas pessoas experientes na arte.

Terminador: o terminador de transcrição serve para terminar a transcrição do DNA em RNA e é preferivelmente selecionado do grupo consistindo de seqüências de terminador de transcrição de planta, seqüências de terminador de transcrição bacterianas e seqüências de terminador de vírus de planta conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte.

Gene: o termo "gene" é usado para indicar uma seqüência de DNA que está envolvida na produção de uma cadeia de polipeptídeo e que inclui as regiões precedentes e posteriores à região codificadora (seqüências a montante de 5'e a jusante de 3') bem como seqüências interventoras, os denominados introns, que estão posicionadas entre segmentos codificadores individuais (denominados exons), ou na região a jusante de 5'ou a montante de 3'. A região a montante de 5' pode compreender uma seqüência regulatória que controla a expressão do gen, tipicamente um promotor. A região a jusante de 3' pode compreender seqüências que estão envolvidas na terminação da transcrição do gene e opcionalmente seqüências responsáveis pela poliadenilação do transcrito e da região 3' não traduzida. O termo "gene de resistência" é um ácido nucleico isolado de acordo com a invenção o citado ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de proporcionar uma planta com resistência contra um patógeno, mais especificamente a citada planta sendo da família Solanaceae, mais preferivelmente batata ou tomate, o citado patógeno sendo mais especificamente um patógeno oomiceto, mais especificamente Phytophthora, mais especificamente Phytophthora infestans, o citado ácido nucleico preferivelmente compreendendo uma seqüência como mostrada na Fig. 8 ou sua parte, ou uma seqüência homóloga com características essencialmente funcionais e estruturais. Um fragmento funcionalmente equivalente de um tal ácido nucleico ou gene de resistência como proporcionado pela invenção codifica um fragmento de um polipeptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos como mostrada na Fig. 8 ou sua parte, ou um polipeptídeo homólogo e/ou funcionalmente equivalente, o citado fragmento exibindo a característica de proporcionar pelo menos resistência parcial a uma infecção de oomiceto tal como a causada por P. infestans quando incorporado e expressado em uma planta ou célula de planta.

Produto de gene de resistência: um polipeptídeo possuindo uma seqüência de aminoácidos como mostrada na Fig. 8 ou sua parte, ou um polipeptídeo homólogo e/ou funcionalmente equivalente exibindo a característica de proporcionar pelo menos resistência parcial a uma infecção de oomiceto tal como a causada por P. infestans quando incorporado e expressado em uma planta ou célula de planta. Funcionalmente equivalentes da proteína da invenção são proteínas que são homólogas à e são obtidas da proteína mostrada na fig. 8 por substituição, adição e/ou deleção de um ou mais aminoácidos, ao mesmo tempo ainda retendo sua atividade de resistência contra patógeno. Tais equivalentes podem ser prontamente preparados por engenharia de proteínas in vivo, por exemplo pela mudança da matriz de leitura aberta capaz de codificar a proteína de modo que a sequência de aminoácidos seja deste modo afetada. Desde que as mudanças nas seqüências de aminoácidos não eliminem todas juntas a atividade da proteína tais equivalentes estão incorporadas na presente invenção. Além do mais, deve ser entendido que equivalentes devem ser deriváveis da proteína mostrada na fig. 8 ao mesmo tempo que retêm a atividade biológica, isto é todos, ou uma parte dos intermediários entre a proteína equivalente e a proteína mostrada na fig. 8 devem ter atividade de resistência contra patógeno. Uma grande parte significaria 30% ou mais dos intermediários, preferivelmente 40% ou mais, com maior preferência 50% ou mais, com maior preferência 70% ou mais, com maior preferência 80% ou mais, com maior preferência 90% ou mais, com maior preferência 95% ou mais, com maior preferência 99% ou mais.

Equivalentes preferidos são equivalentes nos quais a região de repetição rica em leucina é elevadamente homóloga à região de LRR como mostrado na fig. 8. Outros equivalentes preferidos são equivalentes nos quais o domínio efetor N-terminal é essencial o mesmo que o domínio efetor de Rpi-blb. A proteína da invenção compreende um domínio efetor N-terminal e um domínio de repetições rico em leucina. Acredita-se que a conservação destas regiões é essencial para a função da proteína, embora alguma variação seja permissível. Contudo, as outras partes da proteína são menos importantes para a função e podem ser mais suscetíveis à mudança.

Com o propósito de proporcionar um teste rápido e simples de se as proteínas modificadas e/ou os construtos de gene capazes de expressarem as citadas proteínas modificadas que são aqui descritos ou quaisquer construtos novos que são óbvios para a pessoa experiente na arte após uma leitura deste pedido podem dar de fato uma resposta de resistência a pessoa experiente na arte pode realizar um teste de expressão transiente rápido conhecido pelo nome ATTA (Ensaio de Expressão Transiente de Agrobacterium tumefaciens). Neste ensaio (cuja uma descrição detalhada pode ser encontrada em Van den Ackerveken, G., et al., Cell 87,1307-1316, 1996), a seqüência de nucleotídeos codificadora da proteína modificada que é para ser testada é colocada sob o controle do promotor CaMV 35S e introduzida em uma cepa de Agrobacterium que também é usada em protocolos para transformação estável. Após a incubação das bactérias com acetosiringona ou qualquer outro composto fenólico que, como se sabe, intensifica a transferência de T-DNA de Agrobacterium, 1 mL da cultura de Agrobacterium é infiltrado para dentro de uma folha de planta in situ (de por uma planta de batata ou de tabaco ou de tomate) por injeção após a qual as plantas são deixadas em uma estufa e infectadas com um patógeno, preferivelmente P. infestans. Após 2-5 dias as folhas podem ser avaliadas para a ocorrência de sintomas de resistência.

Na presente invenção temos identificado e isolado o gene de resistência Rpi-blb, que confere resistência não-específica à raça contra Phytophthora infestans. O gene foi clonado de um genótipo de Solanum bulbocastanum que é resistente contra P. infestans. O gene de resistência isolado de acordo com a presente invenção pode ser transferido para uma planta hospedeira suscetível usando transformação mediada por Agrobacterium ou qualquer outro método de transformação conhecido, e está envolvido na conferência à planta hospedeira de resistência contra patógenos de planta, especialmente P. infestans. A planta hospedeira pode ser batata, tomate ou qualquer outra planta, em particular um membro da família Solanaceae que pode ser infectada por um tal patógeno de planta. A presente invenção também proporciona uma seqüência de ácido nucleico codificadora desta proteína ou de um seu equivalente funcional, preferivelmente compreendendo o gene Rpi-blb, que é mostrado na Figura 6.

Com a proteína de resistência Rpi-blb ou um seu fragmento funcionalmente equivalente de acordo com a invenção, pode-se ter um meio efetivo de controle contra patógenos de planta, visto que o gene codificador da proteína pode ser usado para transformar genótipos de planta suscetíveis para deste modo produzir plantas geneticamente modificadas possuindo uma suscetibilidade reduzida ou sendo preferivelmente resistentes a um patógeno de planta. Em particular, uma planta geneticamente transformada com o gene de resistência Rpi-blb de acordo com a invenção possui uma suscetibilidade reduzida a P. infestans.

Em uma modalidade preferida o gene de resistência Rpi-blb compreende a seqüência codificadora proporcionada na Figura 6A ou qualquer sua seqüência homóloga ou parte precedida por uma região de promotor e/ou seguida por uma região de terminador. A região de promotor deve ser funcional em células de planta, e preferivelmente corresponde à região de promotor nativa do gene Rpi-blb. Contudo, uma região de promotor heteróloga que é funcional em células de planta pode ser usada conjuntamente com as seqüências codificadoras.

Em adição a invenção refere-se à proteína de resistência Rpi-blb que é codificada pelo gene Rpi-blb de acordo com a invenção e que possui uma seqüência de aminoácidos proporcionada na Figura 8, ou um seu equivalente funcional. O sinal que dispara a expressão do gene de resistência em S. bulbocastanum de tipo selvagem ou nas plantas transgênicas da invenção é provavelmente causado pela presença de um patógeno, mais especificamente o patógeno P. infestans. Tais sistemas são conhecidos para outras interações de patógeno-planta (Klement, Z. , em: Phytopathogenic Prokaryotes, Vol. 2, eds.: Mount, M. S. e Lacy, G. H., New York, Academic Press, 1982, pp. 149-177), e o uso deste sistema pode ser feito para aumentar a aplicabilidade da proteína de resistência resultando em uma resistência contra mais patógenos (veja EP 474.857). Este sistema faz uso do composto evocatório derivado do patógeno e o gene de resistência correspondente, no qual o gene de resistência quando ativado pela presença do composto evocatório acarretará a morte celular local (reação hipersensível). No caso da presença de gene de resistência, o componente evocatório correspondente não tem sido ainda descrito, mas é crido que isto é realizável por uma pessoa experiente na arte. Uma vez isolado o componente evocatório será possível transformar o gene codificador de citado componente evocatório juntamente com o gene codificador da proteína de resistência para dentro da planta, por meio do qual um dos genes está sob o controle de um promotor induzível por patógeno. Estes promotores são bem conhecidos na arte (por exemplo, prpl, Fisl, Bet v 1, Vstl, gsíA 1, e sesquiterpeno-ciclase, mas qualquer promotor induzível por patógeno que é ligado após a infecção de patógeno pode ser usado). Se a planta transgênica contiver um tal sistema, então o ataque de patógeno que é capaz de disparar o promotor induzível por patógeno causará a produção do componente que está sob o controle do citado promotor, e isto, em conexão com o outro componente sendo expressado constitutivamente, causará a ocorrência da reação de resistência.

Também é possível mutar a proteína de resistência fazendo com que ela fique em um estado ativo (veja EP 1060257). Visto que isto permanentemente resultaria na ocorrência da reação de resistência, que finalmente acarretaria a morte celular local, cuidado deve ser tomado para não se expressar constitutivamente a proteína de resistência. Isto pode ser realizado pela colocação da proteína de resistência mutada sob o controle de um promotor induzível por patógeno, que não apenas permitiria a expressão da proteína de resistência ativa apenas nos momentos de ataque de patógeno, mas também permitiria que uma variedade de patógenos mais ampla induzisse a reação hipersensível. Mutação de resíduos de treonina e de serina para resíduos de ácido aspártico e de ácido glutâmico ffeqüentemente acarreta ativação, como foi mostrado em muitas proteínas cuja atividade é modulada por fosforilação, por exemplo em uma proteína ativada por MAPK (Engel et al., 1995, J. Biol. Chem. 270,27213-27221), e em uma proteína MAP-quinase-quinase (Huang et al., 1995 Mol. Biol. Cell 6,237-245). Também mutantes C-terminais e N-terminais bem como de deleção interna destas proteínas podem ser testados para mutantes adequados.

Um modo mais indireto de identificação de mutantes de interesse cuja atividade constitutiva é induzida é por intermédio da propagação do DNA codificador de proteína nas denominadas cepas 'mutadoras' de E. coli.

Um modo rápido de testar todos os mutantes preparados para sua suscetibilidade de evocar uma resposta hipersensível é por meio de um denominado ensaio ATTA (Van den Ackerveken, G.,et al., Cell 87,1307-1316, 1996). Muitos mutantes podem ser selecionados com baixo esforço para identificar aqueles que evocarão um HR sob expressão. A invenção também proporciona um vetor compreendendo um ácido nucleico como aqui proporcionado, o citado ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de proporcionar um membro da família Solanaceae com resistência contra um patógeno oomiceto, ou um ácido nucleico funcionalmente equivalente isolado ou recombinante em particular no qual o citado membro compreende S. tuberosum ou Lycopersicon esculentum. A invenção também proporciona uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou um vetor de acordo com a presente invenção. Um exemplo de citada célula hospedeira é proporcionado aqui na descrição detalhada. Em uma modalidade particular, a citada célula hospedeira compreende uma célula de planta. Como uma célula de planta é preferida uma célula derivada de um membro da família Solanaceae, em particular na qual o citado membro compreende S. tuberosum ou Lycopersicon esculentum. De uma tal célula, ou protoplasto, pode decorrer uma planta transgênica, tal como planta de batata transgênica ou planta de tomate transgênica com resistência contra uma infecção de oomiceto. A invenção portanto também proporciona uma planta, uma raiz de tubérculo, um fruto ou uma semente ou parte ou prole derivado da mesma compreendendo uma célula de acordo com a invenção.

Em adição, a invenção proporciona uma substância proteinácea, exibindo a característica de proporcionar resistência pelo menos parcial contra uma infecção de oomiceto tal como a causada por P. infestans quando incorporada e expressada em uma planta ou célula de planta. Em particular uma tal substância proteinácea é proporcionada a qual é codificada por um ácido nucleico de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona uma substância proteinácea compreendendo uma seqüência de aminoácidos como mostrada na figura 8 ou um seu equivalente funcional. Preferivelmente, um tal equivalente funcional compreenderá uma ou mais seqüências que são relativamente incomuns a Rpl-blb em comparação com RGC3-blb, RGC-blb e RGC4-blb. Tais seqüências podem ser assinaladas no alinhamento (veja a Figura 10) e seriam as seqüências RPLLGEM, AKMEKEKLIS, KHSYTHMM, FFYTLPPLEKFI, GDSTFNK, NLYGSGMRS, LQYCTKLC, GSQSLTCM, NNFGPHI, TSLKIY GFRGIH, IIHECPFLTLS, RICYNKVA, e KYLTISRCN. É crido que uma ou mais destas seqüências proporcionam as características funcionais da proteína Rpl-blb.

Em adição, a invenção proporciona uma molécula de ligação direcionada em um ácido nucleico de acordo com a invenção. Por exemplo, o gene Rpi-blb pode ser usado para o projeto de oligonucleotídeos complementares a uma fita da sequência de DNA como mostrado na Figura 7 e na Tabela 2. Tais oligonucleotídeos como aqui proporcionados são úteis como sondas para seleção de biblioteca, sondas de hibridização para análise de Southem/Northem, iniciadores para PCR, para uso em um jogo de diagnóstico para a detecção de resistência contra doença e assim por diante. Tais oligonucleotídeos são fragmentos úteis de um ácido nucleico recombinante ou isolado como aqui proporcionado, o citado ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de proporcionar um membro da família Solanaceae com resistência contra um fungo oomiceto, ou um ácido nucleico funcionalmente equivalente ou recombinante, em particular no qual o citado membro compreende S. tuberosum ou Lycopersicon esculeníum. Podem ser prontamente selecionados de uma seqüência como a mostrada na figura 6 ou sua parte. Um ponto particular de reconhecimento compreende o domínio de LRR como aqui identificado. Uma tal molécula de ligação de acordo com a invenção é usada com uma sonda ou um iniciador, por exemplo proporcionado com um marcador, em particular no qual o citado marcador compreende um grupo excitável que o toma útil para detectar a presença de citada molécula de ligação. A invenção adicionalmente proporciona um método para selecionar uma planta ou um material de planta ou sua prole para sua suscetibilidade ou resistência a uma infecção de oomiceto compreendendo o teste de pelo menos parte da citada planta ou do material de planta ou de sua prole para a presença ou ausência de um ácido nucleico, o citado ácido nucleico codificador de um produto de gene que é capaz de proporcionar a um membro da família Solanaceae com resistência contra um fungo oomiceto, ou para a presença de citado produto de gene, o citado método preferivelmente compreendendo o contacto de pelo menos parte de citada planta ou material de planta ou sua prole com uma molécula de ligação de acordo com a invenção e determinação da ligação da citada molécula na citada parte. O citado método é particularmente útil no qual o citado oomiceto compreende P. ínfestans, permitindo a seleção de plantas ou de material de planta para a resistência ao míldio, por exemplo no qual a citada planta ou material compreende S. tuberosum. É crido que pela análise de árvore filogenética como discutida acima, as proteínas que são elevadamente homólogas a Rpi-blb e que dariam resistência contra patógenos de planta poderíam ser facilmente identificadas. Um exemplo disto é a detecção de três proteínas elevadamente homólogas RGCJ-blb, RGC3-blb e RGC4-blb, que se dão resistência a P. ínfestans, ainda não tem sido mostrado, mas que conduto, como de acredita, estão envolvidas na resistência contra patógeno em plantas.

Também, a invenção proporciona o uso de um ácido nucleico ou um vetor ou uma célula ou uma substância ou uma molécula de ligação de acordo com a invenção em um método para proporcionar uma planta ou sua prole com resistência pelo menos parcial contra uma infecção de oomiceto, em particular no qual o citado oomiceto compreende P. ínfestans especialmente no qual a citada planta compreende S. tuberosum, o citado método para proporcionar uma planta ou sua prole com resistência pelo menos parcial contra uma infecção de oomiceto compreendendo a provisão de citada planta ou de sua prole com um gene codificador de uma proteína de resistência ou seu fragmento funcional compreendendo um ácido nucleico, a citada proteína de resistência sendo capaz de proporcionar um membro da família Solanaceae com resistência contra um fungo oomiceto, ou de proporcionar a citada planta ou sua prole com um ácido nucleico ou um vetor ou uma céiuia ou uma substância de acordo com a invenção.

Em adição, a invenção proporciona um S. bulbocastanum isolado, ou sua parte, tal como um tubérculo ou uma semente, suscetível a uma infecção de oomiceto causada por P. infestans. A invenção é adicionalmente descrita na descrição detalhada abaixo.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. mapa geográfico do México indicando a origem dos espécimes de Solanum bulbocastanum usados para isolar o gene Rpi-blb. As letras a, b e c indicam as origens geográficas relativas dos espécimes usados de S. bulbocastanum.

Figura 2. Mapas de ligação genética do locus Rpi-blb no cromossomo 8 de S. bulbocastanum. Linhas horizontais indicam as posições relativas de marcadores ligados à resistência ao míldio. Distâncias entre os marcadores estão indicadas em centimorgans. A. Posição genética do locus Rpi-blb relativa aos marcadores TG513, CT88 e CT64 (n = 508 genótipos). B. Mapa de ligação genética de alta densidade do locus Rpi-blb (n = 2109 genótipos).

Figura 3. Mapa físicos do locus Rpi-blb. A. Mapa genético e físico da região genômica de S. bulbocastanum contendo Rpi-blb. Setas verticais indicam as posições relativas de marcadores ligados à resistência. Números acima da linha horizontal indicam o número de recombinantes identificados entre os marcadores flanqueadores em 2109 plantas de prole. Retângulos representam clones de cromossomo artificial bacteriano (BAC). B. Posições relativas de genes candidatos para resistência ao míldio em BAC SPB4. C. Representação esquemática da estrutura do gene Rpi-blb. Linhas horizontais indicam exons. Boxes abertos representam a seqüência codificadora. Linhas anguladas para baixo indicam a posição de uma seqüência de intron de comprimento de 678 nucleotídeos.

Figura 4. Análise de Southern blot de contig de BAC expressando o locus Rpi-blb. Os nomes acima de cada banda representam os nomes de clones de BAC. Os nomes das enzimas de restrição usadas para digerir o BAC DNA antes do Southern blotting estão indicados.

Figura 5. Ensaios de doença de folha solta. A. Fenótipos resistente (esquerda), intermediário (centro) e suscetível (direita) encontrados 5 na população B8 de mapeamento de S. bulbocastanum 6 dias após a inoculação (d.p.i.) com gotículas de esporangiósporo de P. infestans. B. Complementação genética para resistência ao míldio em batata. Fenótipos de doença característicos de folhas derivadas de plantas de batata transgênica hospedando RGCl-blb, RGC2-blb, -blb ou RGC4-blb 6 d. p.i. com gotículas ) de esporangiósporo de P. infestans. Construtos genéticos hospedando as RGCs foram transferidos para o cultivar de batata suscetível Impala por meio de transformação mediada por Agrobacteríum. C. Complementação genética para resistência ao míldio em batata. Fenótipo de doença característico de uma folha de tomate derivada de plantas de tomate transgênicas hospedando > Rpi-blb 6 d.p.i. com gotículas de esporangiósporo de P. infestans (painel esquerdo). O construto genético hospedando Rpi-blb foi transferido para o cultivar de tomate suscetível Moneymaker por meio de transformação mediada por Agrobacteríum.

Figura 6. Sequências de ácido nucleico dos membros de grupo ) de genes Rpi-blb. A. Seqüência de ácido nucleico codificadora de gene Rpi-blb. B. Seqüência de ácido nucleico codificadora de gene Rpi-blb incluindo a seqüência de intron (posição 428-1106). C. Seqüência do fragmento de DNA genômico de Seal de 5,2 kb de BAC SPB4 de S. bulbocastanum em PRGC2-blb, o construto genético usado para complementação genética para !5 resistência ao míldio. O fragmento genômico hospeda o gene Rpi-blb incluindo elementos regulatórios naturais necessários para corrigir a expressão do gene. O códon de iniciação (ATG posição 1191-1193) e o códon de terminação (TAA posição 4781-4783) estão sublinhados: D: Seqüência dé ácido nucleico codificadora de RGCl-blb incluindo a seqüência de intron (posição 428-708). E. Seqüência de ácido nucleico codificadora de RGCS-blb incluindo a seqüência de intron (posição 428-1458). F. Seqüência de ácido nucleico codificadora de RGC4-blb incluindo as seqüências de intron (posições 434-510, 543-618 e 743-1365).

Figura 7. Posições relativas de iniciador. A barra horizontal representa a seqüência codificadora do gene Rpi-blb. Números representam as posições de nucleotídeo. Setas horizontais indicam as orientações e posições relativas de iniciador. GSP1 e GSP2 representam iniciadores específicos de gene agrupado usados para experimentos de 3' RACE. GSP3 e GSP4 representam iniciadores específicos de gene agrupado usando para experimentos de 5' RACE. A(F), A(R), B(F) e B(F) são iniciadores utilizados para amplificar homólogos de Rpi-blb. É indicada a posição do sítio de restrição Nsil usado para preparar trocas de domínio entre homólogos de Rpi-blb.

Figura 8. Seqüência de proteína Rpi-blb deduzida. A seqüência de aminoácidos deduzida da seqüência de DNA de Rpi-blb é dividida em três domínios (A-C), como descrito no Exemplo 6. Resíduos hidrofóbicos no domínio A que formam os primeiro e quarto resíduos de repetições héptadas de domínios em super-hélice potenciais estão sublinhados. Motivos conservados em proteínas R estão escritos em letra minúscula e em itálico no domínio B. Resíduos combinando o consenso de LRR citoplásmica são indicados em negrito no domínio C. Pontos na seqüência têm sido introduzidos para alinhar a seqüência à seqüência de LRR de consenso de LRRs citoplásmicas.

Figura 9. Análise de árvore filogenética. A. Árvore filogenética de seqüências do estado da técnica que compartilham algum grau de homologia com a seqüência de aminoácidos deduzida de Rpi-blb g seus membros de grupo de genes RGCi-blb, KGC3-blb, e RGC4-blb. A árvore foi feita de acordo com o método de Neighbour-Joining de Saitou e Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4,406-425). Um asterisco indica que o gene tem sido contemplado com uma função. O grupo de genes Rpi-blb está realçado. B. Árvore filogenética de seqüências do estado da técnica que compartilham algum grau de homologia com a seqüência de aminoácidos deduzida de Rpi-blb. Estão incluídas nesta análise as seqüências homólogas a Rpi-blb: B149-blb, SHIO-tub, SH20-tub e T118-tar, seqüências identificadas por meio de amplificação por PCR usando os iniciadores específicos para grupo de genes Rpi-blb. C. Posições relativas de seqüências de DNA do estado da técnica que mostram homologia significativa com partes da seqüência de gene Rpi-blb. O grau de homologia está indicado à direita em cada linha. O comprimento da seqüência homóloga está indicado acima de cada linha.

Figura 10. Alinhamento do produto de gene Rpi-blb predito com as seqüências de proteína preditas de homólogos de Rpi-blb. A. Alinhamento dos produtos de proteína preditos codificador por Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb. A seqüência de aminoácidos completa de Rpi-blb é mostrada e os resíduos de aminoácido de Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb que diferem do resíduo correspondente em Rpi-blb. Linhas tracejadas indicam hiatos inseridos para manter alinhamento ótimo. Os resíduos de aminoácido que são específicos para Rpi-blb, quando comparados com aqueles nas posições correspondentes em RGCl-blb, RGC3-blb e RGC4-blb, são realçados em negrito. As regiões das LRRs que correspondem ao consenso L..L..L.L..C/N/S..a..aP estão sublinhadas. Motivos conservados no domínio NBS estão indicados em letra minúscula. B. Alinhamento de produtos de proteína deduzidos codificados por Rpi-blb, RGCl-blb, RGC3-blb, RGC4-blb, B149-blb, SHIO-tub, SH20-tub e TI 18-tar.

Figura 11. Visão geral esquemática de trocas de domínio entre Rpi-blb e homólogos RQCUblb θ RGC3-blb. A linha pontilhada vertical indica a posição do sítio Nsil usado para preparar as trocas. R e S indicam se as plantas transgênicas hospedando construtos quiméricos específicos são resistentes ou suscetíveis à infecção de míldio, respectivamente.

Parte Experimental Para o mapeamento do gene de resistência Rpi-blb uma 5 população de mapeamento intra-específica de S. bulbocastanum foi desenvolvida. Uma etapa crucial neste processo foi a identificação de genótipos de S. bulbocastanum suscetíveis. Para este propósito vários espécimes de S. bulbocastanum originários de diferentes agrupamentos/áreas no México foram analisados para suscetibilidade ou resistência a P. infestans 10 em um ensaio de folha destacada (Tabela 1 e Figura 1). Os espécimes selecionados BGRC 8008 e BGRC 7999 não continham genótipos suscetíveis. Contudo nos espécimes BGRC 8005, BRGC 8006 e BRGC 7997, suscetibilidade foi encontrada em 9%, 7% e 14% das plantas novas analisadas respectivamente. Um clone suscetível a P. infestans de espécime BGRC 8006 15 foi subseqüentemente selecionado e cruzado com um clone resistente de espécime BGRC 8005. A população F1 resultante foi usada para mapear o locus Rpi-blb e é daqui por diante referida como a população B8.

Triagem inicial de 42 genótipos de B8 para a resistência contra P. infestans em um ensaio de folha destacada sugeriu que a resistência contra 20 P- infestans em espécime 8005 de S. bulbocastanum pôde ter sido causada por um gene R de domínio único, ou um grupo de genes fortemente ligados. Dos 42 genótipos testados, 22 apresentaram escore de resistência e 16 foram suscetíveis em um experimento repetido. Fenótipos de resistência das 4 plantas novas restantes permaneceram não esclarecidos. Com o propósito de 25 se determinar a posição no cromossomo da resistência de S. bulbocastanum, os genótipos B8 com um fenótipo indubitável foram usados para análise de marcador. Foi verificado que o marcador TG330 específico para cromossomo 8 (Tabela 2) está ligado na fase Jc icpulsão com o íenotipo de resistência, porque apenas um recombinante foi obtido entre este marcador e a resistência nos 12 genótipos de B8. Além do mais, foi verificado que o marcador CT88 para cromossomo 8 (Tabela 2) está completamente ligado na fase de repulsão à resistência, indicando que o locus responsável pela resistência, chamado de Rpi-blb, estava localizado nesta região do cromossomo 8. Por esta razão, marcadores específicos para cromossomo 8 de tomate que mapeiam próximos e distais de CT88 (TG513 e CT64; Tanksley et al., 1992 Genetics 132: 1141-1160; Tabela 2) foram desenvolvidos em marcadores CAPS e testados em 512 genótipos de N8 com fenótipos de resistência conhecidos. Um total de cinco genótipos recombinante de CT64-CT88 e 41 genótipos recombinantes de CT88-TG513 foram identificados nesta triagem (Figura 2A). O locus de resistência Rpi-blb foi mapeado 1 evento de recombinação distai ao marcador CT88 (Figura 2A).

Mapeamento fino do locus Rpi-blb foi realizado com marcadores CAPS derivados das seqüências de borda esquerda (L) e direita (R) de clones BAC isolados de uma biblioteca de BAC preparada do genótipo BGRC 8005-8 de S. bulbocastanum. A biblioteca de BAC foi inicialmente selecionada com marcadores CT88 e CT64. Os clones de BAC identificados com estes marcadores foram usados como BACs semente para uma subseqüente caminhada sobre o cromossomo no locus Rpi-blb. Um total de 2109 genótipos de B8 foi selecionado para recombinação entre os marcadores TG513 e CT64. Todos os genótipos recombinantes (219/2109) foram subseqüentemente selecionados com todos os marcadores disponíveis no intervalo genético de CT88-CT64. Estes dados juntos com os dados de resistência à doença de cada recombinante, obtidos pelos ensaios de folha destacada, posicionaram o locus de Rpi-blb entre os marcadores SPB33L e B149R, um intervalo genético de 0,1 cM (4/2109 recombinantes) fisicamente expressado pelos clones de BAC sobrepostos SPB4 e B49 (Figuras 2b e 3). Dentro deste intervalo resistência m=segr@gsu com υ marcador terminal de BAC SPB42L, cuja seqüência foi elevadamente homóloga aos fragmentos de NBS parciais de tomate (por exemplo Q194, Q137, Q152, Q153; Pan et al. Genetics 155: 309-322). Análise de Southern de clones de BAC expressando o intervalo SP33L-B149R usando um fragmento de PCR marcado com 32P do marcador SPB42L como uma sonda revelou a presença de pelo menos 4 cópias deste gene R como seqüência dentro do intervalo de Rpi-blb (Figura 4). Em adição, todas estas cópias estavam presentes no BAC SPB4. Seqüenciamento e anotação do inserto completo deste clone de BAC na verdade identificaram quatro candidatos de gene R (RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3-blb e RGC4-blb) da classe NBS-LRR de genes R de planta. Um marcador de PCR que estava localizado entre RGCl-blb e RGC4-blb revelou recombinação entre resistência contra P. infestans e RGC4-blb, excluindo a possibilidade de RGC4-blb ser Rpi-blb. A despeito desta descoberta, todos os quatro RGCs foram selecionados para análise de complementação.

Fragmentos genômicos de aproximadamente 10 kg hospedando RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3-blb e RGC4-blb foram subclonados de BAC SPB4 no vetor de transformação de planta binário pBINPLUS (van Engelen et al., 1995 Trans. Res. 4, 288-290) e transferidos para um cultivar de batata suscetível usando métodos de transformação padrão. Transformantes primários foram testados para resistência contra P. infestans como descrito no Exemplo 1. Apenas o construto genético hospedando RGC2-blb foi capaz de complementar o fenótipo suscetível a P. infestans. Os transformantes contendo RGC2-blb resistentes mostraram fenótipos de resistência semelhantes aos da planta parental resistente S. bulbocastanum (Figura 5). RGC2-blb foi portanto designado de gene Rpi-blb, cuja seqüência de DNA é proporcionada na Figura 6.

EXEMPLO 1: ENSAIO DE DOENÇA O fenótipo de genótipos de S. tuberosum transgênico e de S. bulbocastanum para resistência contra B. infcstuns foi determinado pelos ensaios de folha destacada. Folhas de plantas crescidas por 6 a 12 semanas em estufa foram posicionadas em pedaços de espuma de floristas saturadas com água, de aproximadamente 35 cm x 4 cm x 4 cm, e colocadas em uma bandeja (40 cm de largura, 60 cm de comprimento e 6 cm de altura) com um fundo perfurado. Cada folha foi inoculada com duas gotículas ou mais (25 pL cada) de solução de esporangiósporo em um lado abaxial. Subseqüentemente, a bandeja foi posicionada dentro de um saco de plástico sobre o topo de uma bandeja, dentro do qual um papel de filtro saturado com água foi posicionado, e incubada em uma sala aclimatada a 17°C e um fotoperíodo de 16 h de dia e 8 h de noite com luz fluorescente (Philips TLD50W/84HF). Após 6 dias, as folhas foram avaliadas para o desenvolvimento de sintomas de doença de P. infestans. As plantas com folhas que claramente mostraram lesões de esporulação 6 dias após a inoculação foram consideradas em possuírem um fenótipo suscetível enquanto que as plantas com folhas não mostrando sintomas ou necrose visíveis no lado de inoculação na ausência de esporulação clara foram consideradas resistentes. O ensaio foi realizado com isolado complexo de P. infestans 655-2A (raça 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11), que foi obtido da Plant Research International BV (Wageningen, Países Baixos). EXEMPLO 2: MAPEAMENTO DO LOCUS DE RESISTÊNCIA Rpi-blb Material de planta Com o propósito de produzir uma população de mapeamento intra-específica que segregasse o gene de resistência contra P. infestans presente em espécime BGRC 8005 de S. bulbocastanum (CGN 17692, PI 275193), um genótipo de S. bulbocastanum suscetível foi requerido. Vários espécimes de S. bulbocastanum originários de diferentes agrupamentos/áreas no México foram analisados para suscetibilidade ou resistência a P. infestans em um ensaio de folha destacada (Tabela 1 e Figura 1). Nos espécimes BGRC 8008 e BGRC 7999 nenhuma suscetibilidade foi detectada. Nos espécimes BGRC 8005, BGRC 8006 e BGR 7997 foi encontrada suscetibilidade presente em apenas 9%, 7% e 14% das plantas novas analisadas, respectivamente. Assim, apenas uns poucos genótipos de S. bulbocastanum suscetíveis foram obtidos. A população de mapeamento intra-específica de S. bulbocastanum (B8) foi produzida pelo cruzamento de um clone suscetível a P. infestans de espécime BGRC 8006 com um clone resistente de espécime BRGC 8005. DNA de 2109 plantas de prole foi extraído de folhas jovens de acordo comDoyle e Doyle (1989 Focus, 12, 13-15).

Análise de marcador CAPS

Para análise de PCR, misturas reacionais de 15 pL foram preparadas contendo 0,5 pg de DNA, 15 ng de cada iniciador, cada dNTP a 0,2 mM, 0,6 unidade de Taq-polimerase (15 U/pL, SphaeroQ, Leiden, Países Baixos), 10 mL de Tris-HCl pH 9, MgCl2 a 1,5 mM, KC1 a 50 mM, 0,1% de Triton X-100 e 0,01% (p/v) de gelatina). As PCRs foram realizadas usando o seguinte perfil de ciclo: 25 segundos de desnaturação de DNA a 94°C, 30 segundos de anelamento (veja a Tabela 1) e 40 segundos de alongamento a 72°C. Como uma primeira etapa na amplificação por PCR o DNA foi desnaturado por 5 min a 94°C e finalizado por uma etapa de alongamento extra de 5 min a 72°C. As reações de amplificação foram realizadas em um Biometra® T-Gradient ou Biometra® Uno-II Thermocycler (Westburg, Leusden, Países Baixos). Dependendo do marcador, o produto de PCR foi digerido com uma enzima de restrição adequada. Uma visão geral dos marcadores incluindo seqüências de iniciador, temperatura de anelamento e enzimas de restrição, é dada na Tabela 2. Subseqüentemente, os produtos de PCR (digeridos) foram analisados por eletroforese em geles de agarose ou de acrilamida. Para a análise em gel de acrilamida, foram usados CleanGel DNA Analysis Kit e DNA Silver Staining Kit (Amersham Pharmacia Biotech Bpppliix, Roosêndaal, Países Baixos;.

Mapeamento genético do locus Rpi-blb Inicialmente um grupo pequeno de 42 plantas de prole da população B8 foi selecionado para a resistência contra P. infestans em um ensaio de folha destacada. Plantas com folhas que claramente mostraram lesões de esporulação 6 dias após a inoculaçào foram consideradas como possuindo um fenótipo suscetível enquanto que as plantas com folhas não mostrando necrose ou sintomas visíveis no lado de inoculação na ausência de esporulação clara foram consideradas resistentes. Das 42 plantas novas, 22 foram resistentes e 16 suscetíveis. O fenótipo de 4 plantas novas restantes permaneceu não claro nesta fase inicial. Os dados indicaram que a resistência podería ser devido a um gene de domínio único ou a um grupo de genes fortemente ligados. Com o propósito de se determinar a posição no cromossomo, as plantas novas com um fenótipo confiável foram usadas para a análise de marcador. Foi verificado que o marcador TG830 para cromossomo 8 está ligado na repulsão com o fenótipo resistente, visto que apenas um recombinante foi obtido entre este marcador e a resistência em 12 plantas novas B8. Além do mais, foi verificado que o marcador CT88 para o cromossomo 8 está completamente ligado na fase de repulsão para resistência, indicando que um gene de resistência estava localizado no cromossomo 8.

Subseqüentemente, marcadores específicos para cromossomo 8 que haviam sido mapeados próximos e distais a CT88 (Tanksley et al., 1992 Genetics 132: 1141-1160) foram desenvolvidos para marcadores CAPS. Com o propósito de mapear estes marcadores mais precisamente, outros 152 indivíduos da população B8 foram selecionados para resistência ao míldio usando o ensaio de folha destacada. Simultaneamente, plantas foram avaliadas para os marcadores CT64, CT88 e TG513. Para 5 plantas novas, recombinação foi detectada entre os marcadores CT64 e C88, enquanto que 41 plantas novas foram recombinantes entre marcadores CT88 e TG513 (Figura 2A). Gene de resistência Rpi-bib foi mapeado entre os marcadores CT64 e CT88. Neste estágio, o posicionamento de CT88 proximal a Rpi-blb foi baseado em apenas uma planta nova recombinada.

Com o propósito de determinar a posição de Rpi-blb mais precisamente em relação aos marcadores disponíveis, outras 1555 plantas novas da população B8 foram crescidas e analisadas para recombinação entre os marcadores TG513 e CT64. Assim, um total de 2109 clones de descendência individuais da população B8 foi selecionado. Recombinação entre os marcadores TG513 e CT64 foi detectada em 218 destas plantas novas (10,4 cM). Todos os recombinantes foram selecionados com o marcador Ct88 e fenotipados para a característica de resistência pelo uso do ensaio de folha destacada. Em concordância com os resultados iniciais, o gene Rpi-blb foi mapeado entre os marcadores CT88 e CT64 (Figura 2B).

EXEMPLO 3: CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE BAC DE S. BULBOCASTANUM E CONSTRUÇÃO DE UM CONTIG DE BAC CONTÍGUO EXPRESSANDO O LOCUS Rpi-blb Construção de biblioteca de BAC

Um clone resistente de espécime BGRC 8005 de S. bulbocastanum (blb) (CGN 17692, PI 275193) heterozigoto para o locus Rpi-blb, foi usado como DNA fonte para a construção de uma biblioteca de BAC genômica, daqui por diante referida como a biblioteca de 8005-8 BAC. Preparação de DNA de peso molecular alto e a construção de biblioteca de BAC foram realizadas como descrito em Rouppe van der Voort et al. (1999 MPMI 12: 197-206). Aproximadamente 130.000 clones com um tamanho de inserto médio de 100 kb, que corresponde a 15 equivalentes de genoma foram finalmente obtidos. Um total de aproximadamente 83.000 clones individuais foi armazenado em 216 placas de microtítulo de 384 cavidades (Invitrogen, Países Baixos) contendo tampão de congelamento LB (K2HP04 a 36 mM, KH2P04 a 13,2 mM, citrato a 1,7 mM, MgS04 a 0,4 mM, (NH4)2S04 a 6,9 rpM, 4,4% v/v ds glicciol, doranfemcol a 12,5 pg/mL em meio LB) a -80°C. Outros 50.000 clones foram armazenados como reuniões bacterianas contendo -1.000 colônias brancas. Estas foram geradas pela raspagem de colônias das placas de ágar para dentro de meio LB contendo 18% de glicerol e cloranfenicol a 12,5 pg/mL usando um espalhador de vidro estéril. Estas denominadas super-reuniões também foram armazenadas a -80°C.

Triagem da biblioteca de BAC e construção de um mapa físico do locus Rpi-blb A biblioteca de 8005-8 BAC foi inicialmente selecionada com marcadores CAPS CT88 e CT64. Isto foi realizado como segue. Para a primeira parte, da biblioteca de aproximadamente 83.000 clones armazenados em placas de microtítulo de 384 cavidades, DNA plasmídeo foi isolado usando o protocolo de lise alcalina padrão (Sambrook e tal., 1989 em Molecular cloning: a laboratory manual 2nd edn, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) das bactérias reunidas de cada placa para produzir 216 reuniões de placa. Para identificar os clone de BAC individuais transportando os marcadores CAPS as reuniões de placa foram selecionadas por PCR. Uma vez identificada uma reunião de placa individual como sendo positiva para um marcador CAPS particular a fila positiva e a coluna positiva foram identificadas por meio de uma triagem por PCR bidimensional. Para este propósito, a placa mãe de 384 cavidades foi replicada duas vezes sobre meio LB contendo cloranfenicol (12,5 pg/mL). Após o crescimento das colônias por 15 h a 37°C, uma placa foi usada para raspar as 24 colônias de cada fila juntas e a outra placa foi empregada para raspar as 16 colônias de cada coluna juntas. Bactérias de cada fila ou coluna foram ressuspensas em 200 pL de tampão TE. Análise de marcador CAPS em 5 pL destas suspensões bacterianas foi subseqüentemente realizada levando à identificação de clones de BAC positivos individuais. Para a segunda parte da biblioteca, armazenada como 50 reuniões de aproximadamente 1.000 clones, DNA plasmídeo foi isolado de rada reunião de clones usando o protocolo de lise alcalina padrão e PCR foi conduzida para identificar as reuniões positivas. Bactérias correspondendo às reuniões positivas foram diluídas e plaqueadas sobre placas de ágar LB contendo cloranfenicol (12,5 pg/mL). Colônias brancas individuais foram subsequentemente aplicadas em placas de microtítulo de 384 cavidades e os clones de BAC positivos individuais foram subseqüentemente identificados como descrito acima. Nomes de clones de BAC isolados das super-reuniões trazem o prefixo SP (por exemplo SPB33).

Tamanhos de inserto de clones de BAC foram estimados como segue. Clones de BAC positivos foram analisados pelo isolamento de DNA plasmídeo de culturas noturnas de 2 mL (meio LB suplementado com cloranfenicol a 12,5 mg/mL) usando protocolo de minipreparação de lise alcalina padrão e ressuspensos em 20 pL de TE. DNA plasmídeo (10 pL) foi digerido com 5 U de Notl por 3 h a 37°C para liberar o DNA genômico do vetor pBeloBAC 11.0 DNA digerido foi separado por eletroforese CHEF em um gel de agarose a 1% em 0,5 X TBE a 4 usando um sistema BIORAD CHEF DR II (Bio-Rad Laboratories, USA) a 150 volts com um tempo de pulso constante de 14 s por 16 h.

Triagem da biblioteca de 8005-u BAC com marcador CT88 identificou dois clones de BAC positivos: BI39 e BI80, com insertos de DNA de batata de 130 kb e 120 kb, respectivamente (Figura 3A0. Digestão do produto de PCT CT88 gerado destes clones de BAC e de várias plantas de prole resistentes e suscetível da população de mapeamento B8 com Mbol revelou que BAC 139 trazia o alelo CT88 que estava ligado em cis na resistência. Para identificar a posição de genoma relativa de BAC B319, pares de iniciadores de PCR foram projetados baseados na seqüência das extremidades direita (R) e esquerda (L) do inserto. Seqüenciamento de extremidade de BAC foi realizado como descrito no Exemplo 4 utilizando 0,5 pg de BAC DNA como modelo. Marcadores CAPS polimórficos foram desenvqlYirins pela digestão dus produtos de PCR dos dois genótipos parentes da população B8 e dois genótipos de prole suscetíveis e de dois resistentes com várias enzimas de restrição cortadores de base-4 (Tabela 2). Triagem dos 37 genótipos B8 recombinantes CT88-CT64 mapeou 5 de 7 recombinantes CT^-Rpi-blb entre CT88 e B139R, indicando que o marcador B138R estava relativamente mais próximo do locus Rpi-blb do que o marcador CT88. Triagem das 216 reuniões de placa com B139R não acarretou a identificação de um clone BAC positivo. Triagem de 50 super-reuniões identificou os clones de BAC positivos SPB33 e SPB42 com inseridor de DNA de 85 kb e 75 kb, respectivamente (Figura 3A). Triagem da biblioteca de BAC completa com SPB33L identificou os clones de BAC positivos BI49 e SPB4. Clone SPB4 de BAC continha o alelo SPB33L que estava ligado em cis na resistência enquanto que o clone BI49 de BAC não. Contudo, triagem do painel recombinante CT88-CT64 com B149R revelou que este BAC expressou o locus Rpi-blb. B149R estava separado do locus Rpi-blb por dois eventos recombinantes (Figura 3A). Triagem da biblioteca de 8005-8 BAC com B149R identificou clone B49 de BAC como possuindo o alelo B419R que estava ligado em cis na resistência. Este clone de BAC junto com o clone SPB4 de BAC portanto formou um contig de BAC que expressou o locus Rpi-blb (Figura 3).

EXEMPLO 4: ANÁLISE DE SEQÜÊNCIA DE BAC SPN4 E IDENTIFICAÇÃO DE CANDIDATOS DE GENE DE RESISTÊNCIA DENTRO DO LOCUS Rpi-blb Dentro do intervalo SPB33L-B149R resistência co-segregou com marcador de extremidade de BAC SPB42L, cuja seqüência foi elevadamente homóloga aos fragmentos NBS parciais de tomate (por exemplo Q194, Q137, Q152, Q153; Pan et al. Genetics 155: 309-322). Análise de Southern de clones de BAC expressando o intervalo SP33L-B149R usando um fragmento de PCR marcado com 32P do marcador SPB42L como uma sonda revelou a presença de pelo menos 4 cópias deste gene R como seqüência dentro do intervalo de Rpi-blb (Figura 4). Em adição, todas estas cópias estavam presentes no BAC SPB4. A seqüência de DNA de clone SPB4 de BAC foi portanto determinada pela análise de seqüência de shotgun. Um conjunto de subclones randômicos com um tamanho de inserto médio de 1,5 kb foi gerado. 10 pg de DNA purificado com CsCl foram cisalhados por 6 segundos sobre gelo em 6 micrômetros de amplitude em 200 pL de TE usando um sonicador MSE soniprep 150. Após precipitação em etanol e ressuspensão em 20 pL de TE as extremidades dos fragmentos de DNA foram reparadas por incubação com T4 DNA polimerase a 11°C por 25 minutos em uma mistura reacional de 50 pL compreendendo tampão 1 x T4 DNA polimerase (New England BioLabs, USA), DTT a 1 mM, todos 4 DNTP's a 100 pM, e 25 U de T4 DNA polimerase (New England BioLabs, USA), seguido pela incubação a 65°C por 15 minutos. O DNA cisalhado foi subseqüentemente separado por eletroforese sobre gel de agarose SeaPlaque LMP a 1 % (FMC). A fração com um tamanho de 1,5-2,5 kb foi excisada do gel e dialisada contra 50 mL de TE por 2 h a 4°C. Fatias de agarose dialisadas foram então transferidas para um tubo Eppendorf de 1,5 mL, fundidas a 70°C por 5 min, digeridas com 1 unidade de GELASE (Epicentre Technologies, USA) por 100 mg de gel de agarose por lha 45°C, e o DNA foi subseqüentemente precipitado. Os fragmentos de 1,5-2,5 kb foram ligados a 16°C em um vetor pBluescript SK+ desfosforilado e clivado por enzima de restrição EcoRV (Stratagene Inc.). A mistura de ligação foi subseqüentemente usada para transformar células competentes ElectroMAX E. coli DH10B (Life Technologies, UK) por eletroporação usando o BioRad Gene Pulser. Ajustes no BioRad Gene Pulser foram como recomendado para E. coli pelo fabricante. As células foram espalhadas sobre placas de ágar com calco de Luria (LB) contendo ampicilina (100 pg/mL), 5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-galactosídeo (Xgal) 64 pg/mL) e isopropil-l-tio-P-D-galactosídeo (IPTG) (32 pg/mE). Placas foram incubadas a 3/”C por 24 horas. Colônias brancas individuais foram crescidas em blocos de fundo plano de 96 cavidades (1,5 mL de meio Terrific Broth contendo ampicilina a 100 pg/mL).

DNA plasmídeo foi isolado usando o sistema QIAprep 96 Turbo Miniprep conjuntamente com BioRobot® 9600(QIAGEN) de acordo com as instruções do fabricante. Reações de seqüenciamento foram realizadas usando o ABI PRISM BigDye® Terminator cycle sequencing kit (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os clones foram seqüenciados bidirecionalmente utilizando iniciadores universais. Produtos de seqüência foram separados por eletroforese capilar em um Perkin Elmer ABI 3 700 DNA Analyzer. A montagem automática das leituras de shotgun foi realizada usando programas Phred-Phrap (Ewing e Green, 1998 Genome Research 8,186-194; Ewing et al., 1998 Genome Research 8, 175-185). Um total de 835 leituras proporcionou uma cobertura de seqüência de BAC igual a 5 x. Hiatos entre contigs foram fechados por caminhada sobre iniciador ou por meio de uma abordagem de PCR combinatória. A seqüência foi finalmente editada na qualidade 40 de Phred (1 erro a cada 10.000 nt) por inspeção manual da montagem usando o editor Gap4 contig e resseqüenciamento de todas as regiões de qualidade baixa. A seqüência completa do inserto de SPB4 de BAC consistiu de 77.283 nucleotídeos.

Análise da seqüência contígua de SPB4 de BAC usando o programa de computador GENSCAN (Burge e Karlin, 1997 J. Mol.Biol : 268,78-94), GENEMARK (Lukashin e Borodovsky, 1998 NAR 26,1107-1115) e BLASTX (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215,403-410) identificou quatro seqüências candidatas de gene R completas {RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3-blb e RGC4-blb) pertencentes à classe NBS-LRR de genes R de planta. Um marcador CAPS projetado entre RGCl-blb e RGC4-blb, marcador RGC1- 4 revelou recombinação entre resistência contra P. infestans e RGC4-blb, excetuando a possibilidade de RGC4-blb ser Rpi-blb (Figure 3A e B). A despeito desta descoberta, todos os quatro RGCs foram selecionados para análise de complementação.

EXEMPLO 5: ANÁLISE DE COMPLEMENTAÇÃO

Subclonagem de genes candidatos e transformação em Agrobacterium íumefaciens 5 Fragmentos genômicos de aproximadamente 10 kb hospedando RGCl-blb, RGC2-blb, RGC3-blb ou RGC4-blb foram subclonados de clone SPB4 de BAC em vetor de transformação de planta binário pBINPLUS (van Engelen et al., 1995 Trans. Res. 4,288-290). Digestão por enzima de restrição do DNA do clone SPB4 de BAC e 0 subseqüente seleção de tamanho foram realizadas como segue. Alíquotas de ~1 pg de DNA foram digeridas com 1 U, 0,1 U ou 0,01 U de enzima de restrição Sau3Al por 30 minutos. O DNA de BCA parcialmente digerido foi submetido à eletroforese CHEF a 4°C em 0,5 X TBE usando um tempo de pulso crescente linear de 1-10 segundos e um campo de força de 6 v/cm por 5 16 h. Após eletroforese, o gel de agarose foi corado com brometo de etídio para localizar a região do gel contendo os fragmentos de DNA de aproximadamente 10 kb de tamanho. Esta região foi excisada do gel usando uma lamínula de vidro e dialisada contra 50 mL de TE por 2 h a 4°C. Fatias de agarose dialisadas foram então transferidas para um tubo Eppendorf de 1,5 :0 mL, fundidas a 70°C por 5 minutos e digeridas com 1 unidade de GELASE (Epicentre Technologies, USA) por 100 mg de gel agarose por 1 hora a 45°C. Ligação do DNA de tamanho selecionado em pBINPLUS desfosforilado e digerido com BamHl e subseqüente transformação de células competentes ElectroMAX E. coli DH10B (Life Technologies, UK) com o DNA ligado 5 foram realizadas como descrito no Exemplo 5, usando o BioRad Gene Pulser para eletroporação. As células foram espalhadas sobre placas de ágar de caldo de Luria (LB) contendo canamicina (50 μg/mL), Xgal (64 pg/mL) e IPTG (32 jug/mL). As placas fsrain incubadas a 37°C por 24 horas. Colônias brancas individuais foram crescidas em placas de 96 cavidades (100 pL de meio LB contendo canamicina a 50 μg/mL). Um total de 480 colônias foi selecionado por PCR para a presença de RGCs usando os iniciadores SPB42LF e SPB42LR ou RGC4F e RGC4R (Tabela 2). Clones positivos foram selecionados para isolamento de plasmídeo e caracterização adicional. Identificação de clones hospedando RGCJ-blb, RGC2-blb, RGCS-blb ou RGC4-blb foi realizada pelo seqüenciamento dos fragmentos de PCR de SPB42L derivados de clones positivos. A posição relativa de RGCs dentro de um subclone foi determinada pelo seqüenciamento das extremidades do clone e subseqüente comparação das seqüências com a seqüência de inserto de BAC completa. Finalmente quatro plasmídeos binários, pRGCl-blb, pRGC2-blb, pRGC3-blb e pRGC4-blb foram selecionados e transferidos para cepas AGLO de Agrobacterium tumefaciens (Lazo et al., 1991 Bio/Technology 9,963-967), LBA4404 (Hoekema et al., 1983 Nature 303: 179-180) ou UIA143 (Farrand et al., 1989 J. of Bacteriology 171,5314-5321) quer por eletroporação usando o BioRad Gene Pulser quer por conjugação. Ajustes do BioRad Gene Pulser foram como recomendado para A. tumefaciens pelo fabricante. Conjugação foi conduzida como descrita por Simon et al. (1983 Bio/Tech.l, 784-791). As células foram espalhadas cobre placas de ágar de caldo Luria (LB) contendo canamicina (100 mg/L) e rifampicina (50 mg/L). As placas foram incubadas a 28°C por 48 horas. Culturas em escala pequena das colônias selecionadas foram crescidas em meio LB contendo canamicina (100 mg/L) e rifampicina (50 mg/L). DNA plasmídeo foi isolado como descrito previamente e a integridade dos plasmídeos foi verificada por análise de restrição sobre reisolamento de A. tumefaciens e transformação subseqüente para E. coli. Culturas de A. tumefaciens hospedando um plasmídeo com o padrão de DNA correto foram usadas para transformar um genótipo de batata suscetível. Transformação de cultivar de batata suscetível Cepas de A. tumefaciens foram crescidas por 2 dias a 28°C em 20 mL de meio LB suplementado com rifampicina a 50 mg/L e canamicina a 25 mg/L. Subseqüentemente, 0,2 mL de cultura de A. tumefaciens foi diluído em 10 mL de meio LB contendo os mesmos antibióticos e crescido durante a noite (28°C). A cultura noturna foi centrifugada (30 min, 2647 x g) e a pelota foi ressuspensa em 50 mL de meio MS (Murashige e Skoog, 1962 Physiol. Plant. 15,473-497) suplementado com sacarose a 30 g/L (MS30).

Batatas de semente certificadas de cultivar Impala foram descascadas e a superfície esterilizada por 30 min em uma solução de hipoclorito de sódio a 1% contendo 0,1% de Tween-20. Tubérculos foram então lavados intensamente em grandes volumes de água destilada esterilizada (4 vezes, 10 minutos). Discos de aproximadamente 2 mm de espessura e 7 mm de diâmetro, foram fatiados de cilindros de tecido de tubérculo preparado com um furador de rolhas. Os discos de tubérculo foram transferidos para dentro de meio MS30 líquido contendo A. tumefaciens e incubados por 15 min. Após remoção da solução de A. tumefaciens, os discos de tubérculo foram transferidos para meio de regeneração contendo MS30, IAA a 0,9 mg/L, zeatina ribosídeo a 3,6 mg/L e ágar a 8 g/L (Hoekema et al., 1989 Bio/Technology 7,273-278). As placas foram incubadas a 24°C, duração diária de 16 horas (Philips TLD50W/84HF). Após 48 horas de co-cultivo, os discos de tubérculo foram lavados por 5 min em meio MS líquido incluindo antibióticos, vancomicina a 200 mg/L, cefotaxima a 250 mg/L e canamicina a 75 mg/L, e transferidos para meio de regeneração suplementado com os mesmos antibióticos. As placas foram incubadas a 24°C, duração diária de 16 horas (Philips TLD50W/84HF). A cada três semanas, os discos de tubérculo foram transferidos para meio fresco. Rebentos regenerados foram transferidos para meio MS30 contendo canamicina a 75 mg/L. Rebentos com raiz foram propagados in vitro e testados para a ausência de células de A. tumefaciens pela incubação de um pedaço de caule em 3 mL de meio LB (3 semanas, 37°C, 400 rpm). Uma planta de cada regenerante transformado foi transferida para a estufa.

Complementação do fenótipo suscetível em batata Transformantes primários foram testados para resistência contra P. infestam como descrito no Exemplo 1. Apenas o construto genético hospedando RGC2-blb foi capaz de complementar o fenótipo suscetível. 15 de 18 transformantes primários contendo RGC2-blb foram resistentes (Tabela 3) enquanto que todos os transformantes primários contendo RGCl-blb, RGC2-blb e RGCS-blb foram completamente suscetíveis a P. infestans. Os transformantes de RGC2-blb resistentes mostraram fenótipos de resistência semelhantes ao da planta parental resistente S. bulbocastanum (Figura 5). RGC2-blb foi portanto designado como o gene Rpi-blb, cuja seqüência de DNA é proporcionada na Figura 6.

Transformação de tomate suscetível Sementes de linhagem de tomate suscetível Moneymaker foram lavadas com etanol a 70% para dissolver o revestimento da semente e foram enxaguadas com água estéril. Subseqüentemente, as sementes foram esterilizadas na superfície em hipoclorito de sódio a 1,5% por 15 minutos, enxaguadas três vezes em água estéril e colocadas em recipientes contendo 140 mL de meio MS de pH 6,0 (Murashige e Skoog, 1962 Physiol. Plant. 15,473-497) suplementado com sacarose a 10 g/L (MS 10) e 160 mL de vermiculita. As sementes foram deixadas germinarem por 8 dias a 25°C e sob luz de 0,5 W/m2.

Explantes de cotilédone de oito dias foram pré-cultivados por 24 horas em placas de Petri contendo uma camada alimentadora de duas semanas de idade de células de tabaco em suspensão plaqueadas sobre meio de co-cultivo (MS30 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch (Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Países Baixos), tampão MES a 0,5 g/L e ágar Daichin a 8 g/L).

Culturas noturnas de A. iuinefuciens foram centrifugadas e a pelota foi ressuspensa em meio de suspensão celular (MS30 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch, tampão MES a 0,5 g/L, pH 5,8) contendo acetosiringona a 200 μΜ para uma O.D.60o final de 0,25. Os explantes foram então infectados com cultura noturna diluída de cepa UIA 143 de A. tumefaciens (Farrand et al., 1989 J. of Bacteriology 171,5314-5321) contendo o plasmídeo auxiliar pCH32 (Hamilton et al., 1996 PNAS 93,9975-9979) e pRGC2-blb por 25 minutos, secadas sobre papel de filtro estéril e co-cultivadas por 48 horas sobre placas de camada alimentadora original. Condições de cultivo foram como descrito acima.

Após o co-cultivo, os explantes de cotilédones foram transferidos para placas de Petri com meio indutor de rebento seletivo (MS pH 5,8 suplementado com glicose a 10 g/L, incluindo vitaminas Nitsch, tampão MES a 0,5 g/L, gel de ágar a 5 g/L, zeatina ribosídeo a 2 mg/L, carbenicilina a 400 mg/L, canamicina a 100 mg/L, IAA a 0,1 mg/L) e cultivadas a 25°C com luz a 3-5 W/m . Os explantes foram sub-cultivados a cada 3 semanas sobre meio fresco. Rebentos emergente foram dissecados do caule subjacente e transferidos para recipientes com meio indutor de raiz seletivo (MS 10 pH 5,8 suplementado com vitaminas Nitsch, tampão MES a 0,5 g/L, gel de ágar a 5 g/L, IBA a 0,25 mg/L, carbenicilina a 200 mg/L e canamicina a 100 mg/L) Complementação de fenótipo suscetível em tomate Para investigar se Rpi-blb podería complementar o fenótipo suscetível em tomate, transformantes primários de Moneymaker hospedando o construto de gene Rpi-blb foram inicialmente infectados com isolados de P. infestans IP0655-2A e IP0428 derivados de batata. Sete de nove transformantes primários foram resistentes (Tabela 3). Em vista da observação de que os isolados de P. infestans de batata testados foram menos virulentos sobre tomate do que sobre batata, os transformantes primários também foram testados som um isolado do P. infestans sslotads do plantas do tomate de jardim doméstico suscetíveis. Embora este isolado fosse significativamente mais virulento sobre Moneymaker do que sobre aqueles previamente testados, todos os 7 transformantes primários permaneceram resistentes. Estes resultados ilustram a efetividade potencial do gene Rpi-blb não apenas contra isolados complexos derivados de batata mas também contra aqueles especializados sobre tomate.

Análise molecular de transformantes primários Análise de RT-PCR

Com o objetivo de produzir cDNA, uma mistura de 19 pL contendo 1 pg de total ou poliA RNA, cada dNTP a 0,25 mM, Tris-HCl a 50 mM pH 8,3, KC1 a 75 mM, MgCl2 a 3 mM, DTT a 10 mM e 530 ng de iniciador oligo d(T), GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)18 foi desnaturada (1 min 83°C). Subseqüentemente, a mistura foi colocada a 42°C e 1 pL de transcriptase reversa (transcriptase reversa M-MLV, Promega Benelux b. v., Leiden, Países Baixos) foi adicionado. Após 60 min, a mistura foi aquecida por 1 min a 99°C e transferida para gelo. 2 pL de cDNA foram usados para PCR padrão.

Amplificação rápida de extremidades de cDNA

As extremidades 3' e 5' de cDNA de Rpi-blb foram determinadas por amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE) usando o GeneRacer kit (Invitrogen®, Países Baixos). 3' RACE foi realizada com os iniciadores GSP1 (5'-GAGGAATCCATCTCCCAGAG) e GSP2 (5'-GTGCTTGAAGAGATGATAATTCACGAG) em combinação com o iniciador 3' GeneRacer® e GeneRace® iniciador 3' aninhado. 5' RACE foi realizada sobre cDNA sintetizado com o iniciador GSP3 (5'-GTCCATC TCACCAAGTAGTGG) usando os iniciadores GSP4 (5'-GAAATGCT CAGTAACTCTCTGG) e GSP5 (5'-GGAGGACTGAAAGGTGTTGG) em combinação rnm o GeneRacci® iniciador 3' e o GeneRacer® iniciador 5' aninhado (Figura 7).

EXEMPLO 6: ESTRUTURA DO GENE Rpi-blb E DA PROTEÍNA CORRESPONDENTE O tamanho e a estrutura do gene Rpi-blb foram determinados pela comparação da seqüência genômica derivada do inserto de pRGC2-blb com fragmentos de cDNA gerados por amplificação rápida 5' e 3' de extremidades de cDNA. RACE identificou fragmentos de cDNA específicos de Rpi-blb 5' e 3' de uma única espécie, respectivamente, sugerindo que o clone genômico codifica um único transcrito específico de Rpi-blb. A seqüência codificadora do transcrito Rpi-blb é de 2913 nucleotídeos. É estimado que o transcrito Rpi-blb possui 3138 nucleotídeos (nt) e contém uma região não traduzida (UTR) 5' e 3' de 44 nt e 181 nt, respectivamente. O gene Rpi-blb contém um único intron de 678 nt começando 428 nt após o códon de iniciação ATG de tradução do gene (Figura 3C). A matriz de leitura aberta deduzida do gene Rpi-blb codifica um polipeptídeo predito de 970 aminoácidos com um peso molecular estimado de 110,3 kD (Figura 8). Vários motivos funcionais presentes nos genes R da classe NBS-LSS de genes R de planta são evidentes na proteína codificada que pode ser subdividida em 3 domínios (A, B e C; Figura 8). A parte N-terminal da proteína contém domínios em super-hélice potenciais, repetições héptadas nas quais os primeiro e quarto resíduos são geralmente hidrofóbicos (domínio A). Domínio B hospeda o NBS e outros motivos que constituem o domínio NB-ARC (ARC de Apaf-1, proteína R, e CED-4) de proteínas R e reguladores de morte celular em animais (van der Biezen e Jones, 1998). Este domínio inclui os motivos Ap-ATPase presentes nas proteínas de origem eucariótica e procariótica (Aravind et al., 1999 Trends Biochem. Sei. 24,47-53). A metade C-terminal de Rpi-blb compreende uma série de 19-20 LRRs irregulares (domínio C). As LRRs podem ser alinhadas de acordo çorn a seqüência dc cunsenso LxxLxxLxLxxC/N/SxxLxxLPxxa na qual x designa qualquer resíduo e "a" designa as posições de aminoácidos alifáticos, seguidos por uma região de comprimento variado. Este formato de repetição aproxima-se do consenso para LRRS citoplásmicas (Jones e Jones, 1997 Adv. Bot. Res. 24,89-167).

EXEMPLO 7: HOMÓLOGOS NATURAIS E VARIANTES ARTIFICIAIS DO GENE Rpi-blb Homólogos naturais Pesquisas de homologia por BLASTN com a sequência de DNA do gene Rpi-blb identificou numerosas seqüências com homologia significativa com segmentos curtos do gene Rpi-blb (Figura 9C). Nucleotídeos 549-1245 da seqüência codificadora do gene Rpi-blb compartilham identidade de seqüência de 81%-90% com os fragmentos NBS parciais do tomate (por exemplo, Q194, Q137, Q97, Q152, Q153; Pan et al., 2000 Genetics 155: 309- 22). Estas seqüências homólogas variam em comprimento entre 525 e 708 nucleotídeos e são fragmentos de PCR que foram identificados por varredura sistemática do genoma de tomate usando pares de iniciadores (degenerados) baseados em motivos NBS ubíquos (Pan et al., 2000 Genetics, 155: 309-22; Leister et al., 1996 Nat Genet. 14: 421-429). Outra região do gene Rpi-blb que compartilha homologia significativa com uma seqüência do estado da técnica compreende nucleotídeos 76-805 da seqüência codificadora. Esta seqüência de comprimento de 729 nt compartilha identidade de seqüência de 91% com um EST de tomate (número de acesso do banco de dados de EMBL: BG890602; Figura 9C). A seqüência do gene Rpi-blb a jusante do nucleotídeo 1245, compreendendo a região de LRR, não compartilha homologia significativa com qualquer seqüência do estado da técnica. Pesquisas de homologia por BLASTX com a seqüência codificadora do gene Rpi-blb revelaram que a homologia de seqüência de aminoácidos com vários genes do estado da técnica não excedeu identidade de seqüência rie 36% (Tabela 4). Θ meínor resultado de BLASTX foi obtido com um gene NBS-LRR derivado de Oryza sativa (identidade de seqüência de aminoácidos de 36,5%). Genes NBS-LRR compartilhando homologia de seqüência total de identidade de seqüência de aminoácidos de 27%-36% com Rpi-blb podem ser encontrados dentre outros em Arabidopsis thaliana, Phaseolus vulgar is, Lycopersicon esculentum (grupo de genes de Fusarium 12: Ori et al., 1997 Plant Cell, 9, 521-53; Simons et al., 1998 Plant Cell 10, 1055-1068), Zea mays, Hordeum vulgare e Lactuca sativa. Estudos filogenéticos das seqüências de aminoácidos deduzidas de Rpi-blb, RGCl-blb, RGCpS-blb, RGC4-blb e daquelas dos genes homólogos do estado da técnica (como definido por BLATX) derivadas de espécies diversas, usando o método Neighbour-Joining de Saitou e Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4, 406-425), mostram que os membros do grupo de genes Rpi-blb podem ser posicionados em um ramo separado (Figura 9).

Comparações de seqüências de quatro RGCs do grupo de genes Rpi-blb identificados no clone SPB4 de 8005-8 BAC mostram que homologia de seqüência dentro do grupo de genes Rpi-blb varia entre 70% e 81% em nível de aminoácido. A seqüência de aminoácidos deduzida de Rpi-blb compartilha a homologia total mais alta com RGC3-blb (identidade de seqüência de aminoácidos de 81%; Tabela 4). Quando os domínios diferentes são comparados está claro que as metades N-terminais das proteínas (domínios em super-hélice e NB-ARC) compartilham um grau mais alto de homologia (identidade de seqüência de aminoácidos de 91%) do que as metades C-terminais destas proteínas (LRRs, identidade de seqüência de aminoácidos de 71%). A terminação N das proteínas NBS-LRR influencia o requerimento de componentes de sinalização a jusante e é portanto considerada o domínio efetor putativo (Feyes e Parker, 2000 Trends Genet. 16: 449-55). A região de LRR C-terminal está implicada, por estudos genéticos, na especificidade de reconhecimento evocatório (Ellis et al., 2000 Trends Plant Sei. 5: 373-379, Dodas et al., 2001 Plant Cell 13: 163-78).

Comparação de quatro seqüências de aminoácidos revelou um total de 104 resíduos de aminoácido de Rpi-blb (Figura 10A). Estes estão localizados em sua maioria na região de LRR (80/104). Dentro da última região, estes resíduos específicos estão concentrados no subdomínio xxLxLxxxx de LRR. A frequência relativa destes resíduos de aminoácido específicos dentro deste subdomínio de LRR é maior do que duas vezes (29,3%) do que aquela observada no restante do domínio de LRR (12,3%). Os resíduos posicionados ao redor de dois resíduos de leucina conservados no xxLxLxxxx de consenso são considerados expostos a solvente e estão portanto provavelmente envolvidos na geração/manutenção da especificidade de reconhecimento da proteína de resistência.

Seqüências de homólogos adicionais do gene Rpi-blb podem ser obtidas pela triagem de bibliotecas de inserto ou de DNA genômico, isto é de bibliotecas de BAC com iniciadores baseados nas seqüências de assinatura do gene Rpi-blb. Triagem de várias bibliotecas de BAC de Solanum com conjuntos de iniciadores A e/ou B (Tabela 2 e Figura 7) identificou outros homólogos de Rpi-blb derivados de Solanum bulbocastanum (B149-blb), S. tuberosum (FSlO-tub e SH20-tub) e S. tarijense (T118-tar). Comparação de todas as 8 seqüências de proteína reduz o número de resíduo de aminoácido específicos de Rpi-blb para 51 (51/970; 5,25%) (Figura 10B). Estes em sua maior parte estão localizados na região de LRR (42/51; 82%). A freqüência relativa destes resíduos de aminoácido dentro do subdomínio xxLxLxxxx de LRR é 3,3 vezes maior do que aquela observada no restante do domínio de LRR (19,8% versus 5,7%, respectivamente). Estes dados sugerem claramente que a evolução da especificidade de resistência contra P. infestans dentro do grupo de genes Rpi-blb tem evoluído principalmente por meio de deslocamentos nos resíduos específicos de Rpi-blb LRR.

Inclusão de homólogos de Rpi-blb adicionais nas análises de árvore filogenética descritas acima, usando o método de Neighbour-Joining de Saitou and Nei (1987 Molecular Biology and Evolution 4,406-425), justifica adicionalmente a análise da árvore filogenética como um método para definir as seqüências homólogas de Rpi-blb (Figura 9B). Qualquer produto de gene R funcional que compartilhe identidade de seqüência de pelo menos 70% em nível de aminoácido terminará no mesmo ramo que o dos produtos de gene do grupo de genes Rpi-blb e poderá portanto ser definido como sendo um homólogo de Rpi-blb.

Variantes artificiais Trocas de domínio entre os homólogos diferentes podem ser feitas para verificar o papel das diferentes seqüências em resistência contra P. infestans. A enzima de restrição Nsil por exemplo, que reconhece a seqüência ATGCAT de DNA presente no motivo MHD conservado pode ser usada para trocar o domínio completo de LRR de Rpi-blb por aquele de RGCl-blb ou de RGC3-blb usando técnicas conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte. Variantes quiméricas do gene Rpi-blb foram feitas as quais codificam a metade N-terminal de Rpi-blb e a metade C-terminal de RGCl-blb ou de RGC3-blb e vice-versa, isto é, a metade N-terminal de RGCl-blb ou de RGC3-blb e a metade C-terminal de Rpi-blb (Figura 11). Estas variantes foram transformadas no genótipo de batata suscetível Impala e testadas para a resistência contra P. infestans. Genes RGC3-blb quiméricos contendo o domínio de LRR de Rpi-blb foram resistentes a P. infestans indicando que a especificidade do gene Rpi-blb é codificada por esta parte do gene.

Tabela 1. Visão geral da suscetibilidade a P. infestans em espécimes diferentes de S. bulbocastanum Espécime de S. bulbocastanum # # # % CGN________BGRC_______PI______Plantas R V Suscetibilidade Grupo a 17692 8005 275193 11 10 1 9 A

8006 275194 16 15 1 6 A 17693 8008 275198 19 18 0 5 17687 7997 2435Ô3 35 25 4 14 B

17688 7999 255518 19 19 0_________0_____________C a As letras a, b e c representam origens geográficas relativas mostradas na Figura 1.

Tabela 2. Visão geral de marcadores usados para mapeamento de Rpi-blb Marcador Orientaçãoa Seqüênciab Temperatura Enzima de (°C) de restriçãoc _________________________________anelamento________ TG513 F CGTAAACGCACCAAAAGCAG 58 a.s.

R GATTCAAG CC AGGAACCGAG TG330 F CAGCTGCCACAGCTCAAGC 56 Taql R TACCTACATGTACAGTACTGC CT88 F GGCAGAAGAGCTAGGAAGAG 57 Mbol R ATGGCGTGATACAATCCGAG F TTCAAGAGCTTGAAG AC AT AACA 60 a.s.

R ATGGCGTGATACAATCCGAG

CT64 F ACTAGAGGATAGATTCTTGG 56 CfoI

R CTGGATGCCTTTCTCTATGT B139R F GATCAGAAGTGCCTTGAACC 56 Taql R CAAGGAGCTTGGTCAGCAG SPB33L F ATTGCACAGGAGCAGATCTG 59 Hinfl R TGTAAGAGAGCAAGAGGCAC

SPB42L F AGAGCAGTCTTGAAGGTTGG 58 CfoI

R GATGGT AACT AAGCCTCAGG BI49R F GAC AGATTT CT CAT A AACCTGC 58 Msel/Xbal R AATCGTGCATCACTAGAGCG RGC1-4 F TGTGGAGTAAGAGAGGAAGG 62 Sspl/Msel R TCAGCTGAGCAGTGTGTGG A F AT GGCT GAAGCTTT C ATT C A AGTT CT G 60 R TCAC ACCGCTTGATCAGTT GT GGAC B F TRCATGAYCTMATCCATGATTTGC 60 ______________R_____GMAATTTTGTGCCAGTCTTCTCC___________________________ a Orientação do iniciador, F: direto; R: reverso. b Seqüências de iniciador de acordo com os códigos IUB c a.s.: específica para alelo Tabela 3. Complementação de suscetibilidade ao míldio em batata e tomate.

Genótipoa Plantas contendo Plantas R/plantas contendo ___________________________RGA/transform antes__________RGA___________ IMP(RGCl-blb) 15/17b 0ΤΪ5 8/9d 0/8 IMP(RGC2-blb) 6/3 lc 6/6 12/14d 9/12 IMP(RGC3-blb) 0/6c 5/5d 0/5 IMP(RGC4-blb) 18/19b 0/18 l/12c 0/1 IMP (vetor) 8/8b 0/8 9/10d 0/9 MM(RGC2-blb)___________________9/1 ld__________________7/9___________ a Transformantes primários obtidos da transformação dos genótipos de batata e de tomate suscetíveis Impala (IMP) e Moneymaker (MM), respectivamente, com construtos de T-BNA wiiícndG os candidates para gene Rpi blk\ RCC1 blb, RGC2-blb, RGC3=hlh nn RGC4-blb. Cepas AGL0b, LBA4404C, ou UIA143d de Agrobacterium tumefaciens foram usadas para a transformação. Resistência foi testada em ensaios de folha destacada utilizando os isolados complexos IP0655A e ΓΡ0428-2.

Tabela 4: Comparação de homologia de seqüências de aminoácido e de nucleotídeos a Identidade de seqüência percentual de aminoácidos (aa) e de nucleotídeos (nt) b Comparações separadas foram feitas para as metades N-terminal (N) e C-terminal (C) das seqüências de proteína. A borda entre as duas metades é o sítio de restrição Nsil conservado na seqüência de DNA (posição 1417 da seqüência codificadora Rpi-blb).

Claims (9)

1. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de ácido nucleico como representada na SEQ ID NO: 48 ligada de modo operativo às sequências promotora e terminadora heterólogas.

2. Uso de um ácido nucleico compreendendo: (i) uma sequência de ácido nucleico como representada na SEQ ID NO: 48, ou de um vetor como definido na reivindicação I, ou de uma célula compreendendo o dito ácido nucleico ou dito vetor, caracterizado pelo fato de ser em um método para proporcionar uma planta ou sua prole com resistência contra uma infecção de üomíceto.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito oomiceto é Phyíophthora infestans,

4. Uso de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a dita planta é S. iuherosum.

5. Método para proporcionar uma planta ou sua prole com resistência pelo menos parcial contra uma infecção de oomiceto, caracterizado pelo fato de compreender proporcionar a dita planta ou sua paite com um ácido nucleico que compreende: (i) uma sequência de ácido nucleico como representada na SEQ ID NO: 48, ou com um vetor como definido na reivindicação 1 ou com uma célula que compreende o dito ácido nucleico ou o dito vetor,

6. Método para selecionar uma planta ou um material de planta ou sua prole para sua suscetibilidade ou resistência a uma infecção de oomiceto, caracterizado pelo fato de compreender o teste de pelo menos parte da dita planta ou do dito material de planta ou de sua prole para a presença ou a ausência de um ácido nucleico que compreende: (i) uma sequência de ácido nucleico como representada na SEQ ID NO: 48.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender o contato de pelo menos parte da dita planta ou do dito material de planta ou de sua prole com uma molécula de ligação direcionada ao dito ácido nucleico e a determinação da ligação da dita molécula na dita parte.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito oomiceto é Phytophthora infestans.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a dita planta é S. tuberosum.