PT1431304E - Beta-l-2'-desoxi-nucleosidos para o tratamento da hepatite b - Google Patents

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PT1431304E
PT1431304E PT4075926T PT04075926T PT1431304E PT 1431304 E PT1431304 E PT 1431304E PT 4075926 T PT4075926 T PT 4075926T PT 04075926 T PT04075926 T PT 04075926T PT 1431304 E PT1431304 E PT 1431304E
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Gilles Gosselin
Jean-Louis Imbach
Martin L Bryant
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Novartis Ag
Université Montpellier Ii L
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Description

DESCRIÇÃO "BETA-L-2'-DESOXI-NÚCLEOSIDOS PARA O TRATAMENTO DA HEPATITE B"
Esta invenção situa-se na área de compostos para utilização em métodos para o tratamento do virus da hepatite B (também referido como "VHB") que inclui a administração a um hospedeiro dela necessitado, só ou em associação, de uma quantidade eficaz de um ou mais dos compostos activos aqui descritos, ou de um pró-fármaco ou sal farmaceuticamente aceitável de um destes compostos. 0 VHB é a segunda causa de cancro humano logo a seguir ao tabaco. 0 mecanismo pelo qual o VHB induz o cancro é desconhecido, embora esteja postulado que pode desencadear directamente o desenvolvimento do tumor, ou desencadear indirectamente o desenvolvimento do tumor através de inflamação crónica, cirrose e regeneração celular associada à infecção. 0 virus da hepatite B atingiu níveis epidémicos em todo o mundo. Após um período de incubação de dois a seis meses, em que o hospedeiro desconhece a infecção, a infecção por VHB pode levar a hepatite aguda e lesões no fígado, que causam dor abdominal, icterícia e níveis sanguíneos elevados de certas enzimas. 0 VHB pode causar hepatite fulminante, uma forma da doença que progride rapidamente, frequentemente fatal, na qual são destruídas extensas secções do fíqado.
Os doentes tipicamente recuperam da hepatite aquda. Nalquns doentes, no entanto, persistem no sanque níveis elevados do antiqénio virai durante um período extenso ou indefinido, causando uma infecção crónica. As infecções crónicas podem levar à hepatite crónica persistente. Os doentes infectados com o VHB crónico persistente são mais comuns nos países em desenvolvimento. Nos meados de 1991, havia aproximadamente 225 milhões de portadores crónicos do VHB só na Ásia e, a nível mundial, quase 300 milhões de portadores. A hepatite crónica persistente pode causar fadiga, cirrose do fígado e carcinoma hepatocelular, um cancro primário do fígado.
Nos países industrializados ocidentais, os grupos de alto risco para a infecção com o VHB incluem os que estão em contacto com portadores do VHB ou com amostras do seu sangue. A epidemiologia do VHB é muito semelhante à da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), o que explica porque é que a infecção pelo VHB é comum entre os doentes com SIDA ou complexo relacionado com a SIDA. No entanto, o VHB é mais contagioso do que o VIH.
No entanto, mais recentemente, também foram produzidas vacinas através da engenharia genética e são largamente utilizadas actualmente. Infelizmente, as vacinas não podem ajudar os que já estão infectados com o VHB. Os tratamentos diários com α-interferão, uma proteína produzida por engenharia genética, também se mostraram promissores, mas esta terapêutica só é bem sucedida em cerca de um terço dos doentes tratados. Além disso, o interferão não pode ser administrado oralmente.
Foram identificados vários nucleosidos sintéticos que apresentam actividade contra o VHB. 0 (-)enantiómero de BCH-189, conhecido como 3TC, reivindicado na patente U.S. 5539116 de Liotta et al., foi aprovado pela U.S. Food and Drug Administration para o tratamento da hepatite B. Ver também EPA 0494119 Al apresentado por BioChem Pharma, Inc. O cis-2-hidroximetil-5-(5-fluorocitosin-l-il) - 1.3- oxatiolano ("FTC") apresenta actividade contra o VHB. Ver WO 92/15308; Furman et al., "The Anti-Hepatitis B Vírus Activities, Cytotoxicities, and Anabolic Profiles of the (-) and (+) Enantiomers of cis-5-Fluoro-l-[2-(Hydroxymethyl)- 1.3- oxathiolane-5-yl]-Cytosine", Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Dezembro 1992, páginas 2686-2692; e Cheng et al., Journal of Biological Chemistry, Volume 267(20), 13938-13942 (1992).
Von Janta-Lipinski et al. descrevem a utilização dos L-enantiómeros de 5'-trifosfatos de β-2'-desoxirri-bonucleosidos com 3'-flúor para a inibição das polimerases de hepatite B (J. Med. Chem., 1998, 41, 2040-2046). Especificamente, os 5'-trifosfatos de 3'-desoxi-3'-fluoro-β-L-timidina (β-L-FTTP) , 2',3'-didesoxi-3'-fluoro^-L- citidina (β-L-FdCTP) e 2',3'-didesoxi-3'-fluoro-p-L-5-metilcitidina (β-L-FMetCTP) foram descritos como inibidores eficazes das ADN polimerases do VHB. 0 WO 96/13512 de Genencor International, Inc. e Lipitek, Inc. descreve que certos L-ribofuranosil nucleosidos podem ser úteis para o tratamento de cancro e virus. Está especificamente descrita a utilização desta classe de compostos para o tratamento de cancro e VIH.
As patentes U.S. N°s 5565438, 5567688 e 5587362 (Chu et al.) descrevem a utilização de 2'-fluoro-5-metil-®-L-arabinofuranoliluridina (L-FMAU) para o tratamento da hepatite B e do virus Epstein Barr. A Universidade de Yale e a University of Georgia Research Foundation, Inc. descrevem a utilização de L-FddC ( β-L-5-fluoro-2',3'-didesoxicitidina) para o tratamento do virus da hepatite B no WO 92/18517.
Os nucleosidos sintéticos β-]1-2' -desoxicitidina ^-L-2'-dC), β-]1-2 ' -desoxitimidina (β-L-dT) e β-]1-2 ' -desoxiadenosina (β-]1-2' -dA) são conhecidos na técnica. Antonin Holy divulgou primeiro ο β-L-dC e ο β-L-dT em 1972, "Nucleic Acid Components and Their Analogs. CLIII. Preparation of 2'-deoxy-L-Ribonucleosides of the Pyrimidine Series", Collect. Czech. Chem. Commun. (1972), 37(12), 4072-87. Morris S. Zedeck et al. descreveram primeiro a β-L-dA para a inibição da síntese de enzimas induzidas em Pseudomonas testosteroni, Mol. Phys. (1967), 3(4), 386-95.
Certos 2'-desoxi-p-L-eritropentofuranonucleosidos são conhecidos por terem actividades antineoplásicas e antivirais seleccionadas. Verri et al. descrevem a utilização de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosidos como agentes antineoplásicos e como agentes anti-herpéticos (Mol. Pharmacol. (1997), 51(1), 132-138 e Biochem. J. (1997), 328(1), 317-20). Saneyoshi et al. demonstra a utilização dos 2'-desoxi-L-ribonucleosidos como inibidores da transcriptase inversa (I) para o controlo de retrovirus e para o tratamento da SIDA, Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP06293645 (1994) .
Giovanni et al. testaram 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosidos contra virus parcialmente da pseudo-raiva (PRV), Biochem. J. (1993), 294(2), 381-5.
As utilizações quimioterapêuticas de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosidos foram estudadas por Tyrsted et al. {Bíochím. Biophys. Acta (1968), 155(2), 619-22) e Bloch et al. (J. Med. Chem. (1967), 10(5), 908-12). A p-L-2'-desoxitimidina (β-L-dT) é conhecida na técnica como inibindo a timidina quinase (TK) do virus herpes simplex de tipo 1 (HSV-1) . Iotti et al., no WO 92/08727, descrevem que a β-L-dT inibe selectivamente a fosforilação da D-timidina pela TK do HSV-1, mas não pela TK humana. Spaldari et al. descreveram que a L-timidina é fosforilada pela timidina quinase do virus herpes simplex de tipo 1 e inibe o crescimento viral, J. Med. Chem. (1992), 35(22), 4214-20. À luz do facto de o virus da hepatite B ter atingido níveis epidémicos em todo o mundo e ter efeitos graves e frequentemente trágicos no doente infectado, permanece uma forte necessidade de proporcionar novos agentes farmacêuticos eficazes para tratar seres humanos infectados com o vírus, que tenham toxicidade reduzida para o hospedeiro.
Assim, é um objecto da presente invenção proporcionar compostos para utilização em métodos de tratamento de doentes humanos ou outros hospedeiros infectados com o vírus da hepatite B.
Sumário da Invenção
Formas de realização da presente invenção estão descritas nas reivindicações independentes anexas. Sub-formas de realização da presente invenção estão descritas nas reivindicações dependentes anexas.
Descreve-se compostos para utilização num método para o tratamento da infecção por hepatite B em seres humanos e outros animais hospedeiros que inclui a administração de uma quantidade eficaz de um 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido biologicamente activo (aqui referido alternativamente como um β-L-d-nucleosido ou um β- L-2'-d-nucleosido) ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceu-ticamente aceitável, administrado isoladamente ou em associação, opcionalmente num veículo farmaceuticamente aceitável. 0 termo 2'-desoxi, como utilizado nesta descrição, refere-se a um nucleosido que não tem substituinte na posição 2'.
Os 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosidos descritos, ou os pró-fármacos ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou formulações farmaceuticamente aceitáveis contendo estes compostos são úteis na prevenção e tratamento das infecções hepatite B e outras patologias relacionadas, como as patologias positivas a anticorpos anti-VHB e positivas a VHB, inflamação crónica do fígado causada pelo VHB, cirrose, hepatite aguda, hepatite fulminante, hepatite crónica persistente e fadiga. Estes compostos ou formulações também podem ser utilizados profilacticamente para prevenir ou retardar a progressão da doença clínica em indivíduos que sejam positivos a anticorpos anti-VHB ou ao antigénio do VBH ou que tenham sido expostos ao VHB.
Numa forma de realização da presente descrição, o derivado de 2'-desoxi-p-L-eritropentofuranonucleosido é um composto de fórmula:
em que R é seleccionado do grupo que consiste em H, alquilo de cadeia linear, ramificada ou cíclica, CO-alquilo, C0-arilo, CO-alcoxialquilo, CO-ariloxialquilo, arilo substituído com CO, alquilsulfonilo, arilsulfonilo, aralquil-sulfonilo, resíduo de aminoácido, mono, di ou trifosfato, ou um derivado de fosfato; e BASE é uma base purina ou pirimidina que pode estar opcionalmente substituída.
Noutra forma de realização, o derivado de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido é p-L-2'-desoxiade-nosina ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável, de fórmula:
em que R é H, mono, di ou trifosfato, acilo, ou alquilo, ou um derivado fosfato estabilizado (para formar um pró-fármaco de nucleotido estabilizado).
Noutra forma de realização, o derivado de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido é uma β-]1-2 '-de-soxicitidina ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável de fórmula:
em que R é H, mono, di ou trifosfato, acilo, ou alquilo, ou um derivado fosfato estabilizado (para formar um pró-fármaco de nucleótido estabilizado).
Noutra forma de realização, o derivado de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido é p-L-2'-desoxiuri-dina ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável de fórmula:
em que R é H, mono, di ou trifosfato, acilo, ou alquilo, ou um derivado fosfato estabilizado (para formar um pró-fármaco de nucleoiido estabilizado).
Noutra forma de realização, o derivado de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido é β-]1-2'-desoxiqua-nosina ou seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável de fórmula:
em que R é H, mono, di ou trifosfato, acilo, ou alquilo, ou um derivado fosfato estabilizado (para formar um pró-fármaco de nucleotido estabilizado).
Noutra forma de realização, o derivado de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido é p-L-2'-desoxi-inosina ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável de fórmula:
em que R é H, mono, di ou trifosfato, acilo, ou alquilo, ou um derivado fosfato estabilizado (para formar um pró-fármaco de nucleotido estabilizado).
Noutra forma de realização, o derivado de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido é β-L-timidina ou um seu sal ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável de fórmula:
em que R é H, mono, di ou tri fosfato, acilo, ou alquilo, ou um derivado fosfato estabilizado (para formar uma pró-droqa de nucleótidos estabilizado).
Noutra forma de realização, o beta 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido é administrado em alternância ou em associação com um ou mais outros 2 '-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosidos ou um ou mais outros compostos que apresentem actividade contra o vírus da hepatite B. Em geral, durante a terapêutica alternada, uma dosagem eficaz de cada agente é administrada em série, enquanto que na terapêutica de associação, é administrada conjuntamente uma dosagem eficaz de dois ou mais agentes. As dosagens vão depender das velocidades de absorção, inactivação, e excreção do fármaco bem como de outros factores conhecidos pelos peritos na técnica. Deve notar-se que os valores das dosagens também vão variar com a gravidade da patologia a ser aliviada. Deve ainda entender-se que para qualquer indivíduo em particular, os regimes e esquemas de dosagem específicos deverão ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e a avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições.
Noutra forma de realização, a descrição proporciona um método para o tratamento de seres humanos infectados com HBV que inclui a administração de uma quantidade para tratamento de HBV de um pró-fármaco dos derivados de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosidos descritos. Um pró-fármaco, como aqui utilizado, refere-se a um composto que é convertido no nucleosido por administração in vivo. Exemplos não limitativos incluem o sal farmaceuticamente aceitável (em alternativa referidos como "sais fisiologi-camente aceitáveis"), os derivados 5' e N4 (citidina) ou N6 (adenosina) acilados ou alquilados do composto activo, ou os 5'-fosfolípidos ou 5'-éter lípidos do composto activo.
Breve descrição das figuras A Figura 1 ilustra um processo geral para a obtenção de β-L-eritro-pentafuranonucleosidos (β-L-dN) utilizando L-ribose ou L-xilose como material de partida. A Figura 2 é um gráfico gue ilustra o metabolismo de L-dA, L-dC e L-dT em células Hep G2 humanas em termos de acumulação e decaimento. As células foram incubadas com 10 μΜ de composto. A Figura 3 é um gráfico gue ilustra o efeito antiviral de β-L-dA, β-L-dT e β-L-dC no modelo de hepatite crónica na marmota.
Descrição pormenorizada da invenção
Tal como agui utilizado, o termo "substancialmente na forma de um único isómero" ou "em forma isolada" refere-se a um 2'-desoxi^-L-eritro-pentofuranonucleosido gue está pelo menos aproximadamente 95% no estereoconfi-guração designada. Numa forma de realização preferida, o composto activo é administrado em pelo menos este nivel de pureza ao hospedeiro necessitado de terapêutica.
Tal como agui utilizado, o termo hepatite B e patologias relacionadas refere-se a hepatite B e patologias relacionadas, como as patologias positivas a anticorpos anti-VHB e positivas a VHB, inflamação crónica do figado causada pelo VHB, cirrose, hepatite aguda, hepatite fulminante, hepatite crónica persistente e fadiga. Os compostos para utilização num método de tratamento da infecção hepatite B da presente descrição inclui a utilização de derivados de 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido profi-lacticamente para prevenir ou retardar a progressão de doença clinica em indivíduos que sejam positivos aos anticorpos anti-VHB ou ao antigénio do HBV ou que tenham sido expostos ao VHB.
Tal como aqui utilizado, o termo alquilo, salvo indicação em contrário, refere-se a um hidrocarboneto saturado linear, ramificado, ou cíclico, primário, secundário ou terciário, tipicamente de Ci a Cis, preferencialmente de Ci a C6 e inclui especif icamente mas não está limitado a metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, isopro-pilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, isopentilo, amilo, t-pentilo, ciclopentilo e ciclo-hexilo.
Tal como aqui utilizado, o termo acilo refere-se à unidade de fórmula -C(0)R ', em que R' é alquilo; arilo, alcarilo, aralquilo, heteroaromático, alcoxialquilo incluindo metoximetilo; arilalquilo incluindo benzilo; ariloxialquilo como fenoximetilo; arilo incluindo fenilo opcionalmente substituído com halogéneo, Ci a C4 alquilo ou Ci a C4 alcoxi, ou o resíduo de um aminoácido. 0 termo acilo inclui especif icamente mas não está limitado a ace-tilo, propionilo, butirilo, pentanoílo, 3-metilbutirilo, hidrogenossuccinato, 3-clorobenzoato, benzoilo, acetilo, pivaloílo, mesilato, propionilo, valerilo, capróico, capri-lico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico e oleico.
Tal como aqui utilizado, o termo base de purina ou pirimidina inclui, mas não está limitado a, 6-alquil-purina e N6-alquilpurinas, N6-acilpurinas, N6-benzilpurina, 6-halogenopurina, N6-vinilpurina, N6-purina acetilénica, N6-acil purina, N6-hidroxialquil purina, N6-tioalquil purina, N2-alquilpurinas, N4-alquilpirimidinas, N4-acilpirimidinas, 4-benzilpirimidina, N4-halogenopirimidinas, N4-pirimidinas acetilénicas, 4-acilo e N4-acil pirimidinas, 4-hidroxial-quilpirimidinas, 4-tioalquilpirimidinas, timina, citosina, 6-azapirimidina, incluindo 6-azacitosina, 2- e/ou 4-merca-ptopirimidina, uracilo, C5-alquilpirimidinas, C5-benzilpi-rimidinas, C5-halogenopirimidinas, C5-vinilpirimidina, C5-pirimidina acetilénica, C5-acilpirimidina, C5-hidroxial-quilpurina, C5-amidopirimidina, C5-cianopirimidina, C5-nitropirimidina, C5-aminopirimidina, N2-alquilpurines, N2-alquil-6-tiopurinas, 5-azacitidinilo, 5-azauracililo, tri-azolopiridinilo, imidazolopiridinilo, pirrolo-pirimidinilo e pirazolopirimidinilo. Os grupos funcionais com oxigénio e azoto na base podem ser protegidos consoante necessário ou desejado. Os grupos protectores adequados são bem conhecidos pelos peritos na técnica, e incluem trimetilsililo, dimetilhexilsililo, t-butildimetilsililo e t-butildifenil-sililo, tritilo, grupos alquilo, grupos acilo como acetilo e propionilo, metanossulfonilo e p-toluenossulfonilo. 0 termo nucleosido biologicamente activo, como aqui utilizado, refere-se a um nucleosido que apresenta uma EC50 de 15 micromolar ou inferior quando testado em células 2.2.15 transfectadas com o virião da hepatite.
As bases preferidas incluem citosina, 5-fluoro-citosina, 5-bromocitosina, 5-iodocitosina, uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-iodo-uracilo, 5-metil-uracilo, timina, adenina, guanina, inosina, xantina, 2,6-diaminopurina, 6-aminopurina, 6-cloropurina e 2,6-diclo-ropurina, 6-bromopurina, 2,6-dibromopurina, 6-iodopurina, 2,6-di-iodopurina, 5-bromovinilcitosina, 5-bromovinilura-cilo, 5-bromoetenilcitosina, 5-bromoetenil-uracilo, 5-tri-fluorometileitosina, 5-trifluorometiluracilo. 0 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido pode ser proporcionado como um 5'-fosfolipido ou um 5'-éter lipidico, como descrito nas seguintes referências: Kucera, L. S., N. Lyer, E. Leake, A. Raben, Modest E. J., D. L. W., e C. Piantadosi. 1990. Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infections HIV-1 production and induce virus formation. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 6:491-501; Piantadosi, C., J. Marasco C. J., S. L. Morris-Natschke, K. L. Meyer, F. Gumus, J. R. Surles, K.S. Ishaq, L. S. Kucera, N. Lyer, C. A. Wallen, S. Piantadosi e E. J. Modest. 1991 - Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity. J. Med. Chem. 34:1408-1414; Hostetler, K. Y., D. D. Richman, D. A.
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Tal como agui utilizado, o termo sais ou complexos farmaceuticamente aceitáveis refere-se a sais ou complexos dos 2'-desoxi-p-L-eritropentofuranonucleosidos gue retêm a actividade biológica desejada do composto mãe e apresentam efeitos toxicológicos indesejados mínimos, se os houver. Exemplos não limitativos desses sais são (a) sais de adição de ácidos formados com ácidos inorgânicos (por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfú-rico, ácido fosfórico, ácido nítrico e outros semelhantes) e sais formados com ácidos orgânicos como ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido tânico, ácido palmóico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos naftalenossulfónicos, ácidos naftalenodissulfónicos e ácido poligalacturónico; (b) sais de adição de bases formados com catiões como sódio, potássio, zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio, sódio, potássio e outros semelhantes, ou com um catião orgânico formado a partir de N,N-dibenziletileno-diamina, amónio ou etilenodiamina; ou (c) combinações de (a) e (b); e.g., um sal tanato de zinco ou outros semelhantes. 0 termo pró-fármaco, como aqui utilizado, refere-se a um composto que é convertido no nucleosido por administração in vivo. Exemplos não limitativos são sais farmaceuticamente aceitáveis (alternativamente referidos como "sais fisiologicamente aceitáveis"), os derivados 5' e N4 ou N6 acilados ou alquilados do composto activo, e os derivados 5'-fosfolípido e 5'-éter lipídico do composto activo.
As modificações dos compostos activos, especifi-camente nas posições N4, N6 e 5'-0, podem afectar a biodisponibilidade e velocidade do metabolismo da espécie activa, proporcionando assim o controlo sobre a administração da espécie activa.
Uma forma de realização preferida da presente descrição é um método para o tratamento de infecções por VHB em seres humanos e outros animais hospedeiros, que inclui a administração de uma quantidade eficaz de um ou mais derivados de 2'-desoxi-p-L-eritropentofurano-nucleosi-dos seleccionados do grupo que consiste em p-L-2'-desoxi-adenosina, p-L-2'-desoxicitidina, p-L-2'-desoxicitidina, β-L-2'-desoxi-uridina, p-L-2'-desoxi-inodina e p-L-2'-deso-xitimidina, ou um seu pró-fármaco fisiologicamente aceitável, incluindo um fosfato, derivado 5' e/ou N6 alquilado ou acilado, ou um seu sal fisiologicamente aceitável, opcionalmente num veículo farmaceuticamente aceitável. Os compostos desta descrição têm actividade anti-VHB, ou são metabolizados a um composto ou compostos que apresentam actividade anti-VHB. Numa forma de realização preferida, o 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido é administrado substancialmente na forma de um único isómero, i.e., pelo menos aproximadamente 95% na estereoconfiguração designada.
Pró-fármacos nucleotidos
Qualquer dos nucleosidos aqui descritos pode ser administrado como um pró-fármaco de nucleotido estabilizado para aumentar a actividade, biodisponibilidade, estabilidade ou de outro modo alterar as propriedades do nucleosido. São conhecidos vários ligandos de pró-fármacos de nucleotidos. Em geral, a alquilação, acilação ou outra modificação lipófila do mono, di ou trifosfato do nucleosido vai aumentar a estabilidade do nucleotido. Exemplos de grupos substituintes que podem substituir um ou mais hidrogénios na unidade fosfato são alquilo, arilo, esteróides, hidratos de carbono, incluindo açúcares, 1,2-diacilglicerol e álcoois. Muitos estão descritos em R. Jones e N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1-17. Qualquer destes pode ser utilizado em combinação com os nucleosidos descritos para se obter um efeito desejado.
Numa forma de realização, o 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleoside é proporcionado como pró-fármaco lipófilo 5'-hidroxilo. Exemplos não limitativos de patentes U.S. que descrevem substituintes lipófilos adequados que podem ser covalentemente incorporados no nucleosido, preferencialmente na posição 5'-OH do nucleosido ou preparações lipófilas, incluem as patentes U.S. N°s 5149794 (22 de Setembro de 1992, Yatvin et al.); 5194654 (16 de Março de 1993, Hostetler et al.), 5223263 (29 de junho de 1993 Hostetler et al.) ; 5256641 (26 de Outubro de 1993, Yatvin et al.); 5411947 (2 de Maio de 1995, Hostetler et al.); 5463092 (31 de Outubro de 1995, Hostetler et al.); 5543389 (6 de Agosto de 1996, Yatvin et al.); 5543390 (6 de Agosto de 1966, Yatvin et al.) ; 5543391 (6 de Agosto de 1996, Yatvin et al.); e 5554728 (10 de Setembro de 1996; Basava et al.) .
Pedidos de patentes estrangeiras que descrevem substituintes lipófilos que podem ser ligados ao derivado 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosido da presente descrição, ou preparações lipófilas, incluem WO 89/02733, WO 90/00555 WO, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, 96/15132 W0, EP 0350287, EP 93917054.4 e WO 91/19721.
Exemplos não limitativos adicionais de 2'-desoxi-β-L-eritro-pentofuranonucleosidos são os que contêm substi-tuintes como descrito nas publicações seguintes. Esses 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofuranonucleosidos derivatizados podem ser utilizados para as indicações descritas no texto ou então como agentes antivirais, incluindo como agentes anti-VHB. Ho, D. H. W. (1973) Distribution of kinase and deaminase of Ιβ-D-arabinofuranosylcytosine in tissues of man and mouse. Cancer Res. 33, 2816-2820; Holy, A. (1993) Isopolar phosphorous-modified nucleotide analogues. In: De Clercq (Ed.), Advances in Antiviral Drug Design, Vol. I, JAI Press, páginas 179-231; Hong, C. I., Nechaev, A. e West, C. R. (1979a) Synthesis and antitumor activity of Ιβ-D-arabinofuranosylcytosine conjugates of cortisol and cortisone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 88, 1223-1229; Hong, C. I., Nechaev, A., Kirisits, A. J. Buchheit, D. J. e West, C. R. (1980) Nucleoside conjugates as potential antitumor agents. 3. Synthesis and antitumor activity of 1-(β-D-arabinofuranosyl) cytosine conjugates of corticos-teriods and selected lipophilic alcohols. J. Med. Chem. 28, 171-177; Hostetler, K. Y., Stuhmiller, L. M., Lenting, H. B. M. van den Bosch, H. e Richman, D. D. (1990) Synthesis and antiretroviral activity of phospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides. J. Biol.
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Terapêutica de associação ou de alternação
Foi reconhecido que podem emergir variantes de VHB resistentes ao fármaco após tratamento prolongado com um agente antiviral. A resistência ao fármaco ocorre, mais tipicamente, por mutação de um gene que codifica uma enzima utilizada no ciclo de vida virai e, mais tipicamente no caso do VHB, ADN polimerase. Recentemente, foi demonstrado que a eficácia de um fármaco contra a infecção por VHB pode ser prolongada, aumentada ou restabelecida por administração do composto em associação ou alternação com um segundo, e talvez um terceiro, composto antiviral que induz uma mutação diferente da causada pelo fármaco principal. Alternativamente, a farmacocinética, biodistribuição ou outro parâmetro do fármaco pode ser alterado por essa terapêutica de associação ou alternação. Em geral, a terapia de associação é tipicamente preferida relativamente à terapêutica de alternação porque induz múltiplos stresses simultâneos sobre o vírus. A actividade viral anti-hepatite B de p-L-2'-dA, P-L-2'-dC, p-L-2'-dU, p-L-2'-dG, p-L-2'-dT, β-L-dI, ou outros β-L-í'-nucleosidos aqui proporcionados, ou os pró-fármacos, fosfatos ou sais destes compostos, pode ser melhorada por administração de dois ou mais destes nucleosidos em associação ou em alternação. Alternativamente, por exemplo, um ou mais de p-L-2'-dA, p-L-2'-dC, P-L-2'-dU, p-L-2'-dG, p-L-2'-dT, β-L-dI, ou outros p-L-2'-nucleosidos aqui proporcionados podem ser administrados em associação ou em alternação com 3TC, FTC, L-FMAU, DAPD, famciclovir, penciclovir, BMS-200475, bis pom PMEA (adefo-vir, dipivoxil); lobucavir, ganciclovir, ou ribavirina.
Em qualquer das formas de realização aqui descritas, se o p-L-2'-nucleosido da presente descrição for administrado em associação ou alternação com um segundo nucleosido ou não nucleosido inibidor da transcriptase inversa que é fosforilado a uma forma activa, é preferido que um segundo composto seja fosforilado por uma enzima que é diferente daquela que fosforila in vivo o p-L-2'- nucleosido seleccionado da presente descrição. Exemplos de enzimas quinases são timidina quinase, citosina quinase, guanosina quinase, adenosina quinase, desoxicitidina quinase, 5'-nucleotidase e desoxiguanosina quinase.
Preparação dos compostos activos
Os derivados do 2'-desoxi-p-L-eritro-pentofurano-nucleosido da presente descrição são conhecidos na técnica e podem ser preparados de acordo com o método descrito por Holy, Collect. Czech. Chem. Commun. (1972), 37(12), 4072-87 e Mol. Phys. (1967), 3(4), 386-95.
Um processo geral para a obtenção de β-L-eritro-pentafuranonucleosidos (β-L-dN) está ilustrado na Figura 1, utilizando L-ribose ou L-xilose como material de partida.
Derivados mono, di e trifosfato dos nucleosidos activos podem ser preparados como descrito de acordo com os métodos publicados. O monofosfato pode ser preparado de acordo com o procedimento de Imai et al.r J. Org. Chem., 34(6), 1547-1550 (Junho de 1969). O difosfato pode ser preparado de acordo com o procedimento de Davisson et al., J. Org. Chem., 52(9), 1794-1801 (1987). O trifosfato pode ser preparado de acordo com o procedimento de Hoard et al., J. Am. Chem. Soc., 87(8), 1785-1788 (1965).
Protocolos experimentais
Os pontos de fusão foram determinados em tubos capilares abertos num aparelho Gallenkamp MFB M-595-010 e não estão corrigidos. Os espectros de absorção no UV foram registados num espectrofotómetro Uvikon 931 (KONTRON) em etanol. Os espectros de 1H NMR foram efectuados à temperatura ambiente em DMSO-de com um espectrómetro Bruker AC 250 ou 400. Os desvios químicos são dados em ppm, sendo o DMSO-cb regulado para 2,49 ppm como referência. Foram realizadas permuta com deutério, experiências de desacoplamento ou 2D-COSY de modo a confirmar a atribuição dos protões. As multiplicidades dos sinais são representadas por s (singleto), d (dupleto), dd (dupleto de dupletos), t (tripleto), q (quadrupleto), br (largo), m (multipleto). Todos os valores J são em Hz. Os espectros de massa FAB foram registados no modo de iões positivos (FAB>0) ou negativos (FAB<0) num espectrómetro de massa JEOL DX 300. A matriz era álcool 3-nitrobenzílico (NBA) ou uma mistura (50:50, v/v) de glicerol e tioglicerol (GT). As rotações específicas foram medidas num espectropolarímetro Perkin-Elmer (percurso óptico de 1 cm) e são expressas em unidades de 10-1 grau cm2 g_1. A análise elementar foi realizada pelo "Service de Microanalyses du CNRS, Division de Vernaison" (França) . As análises indicadas pelos símbolos dos elementos ou funções estavam dentro de ± 0,4% dos valores teóricos. A cromatografia em camada fina foi realizada em placas de alumínio pré-revestidas de gel de sílica 60 F254 (Merck, Art. 5554), sendo a visualização dos produtos realizada por absorvência de UV seguida por tratamento com ácido sulfúrico etanólico a 10% e aquecimento. A cromatografia em coluna foi realizada em gel de sílica 60 (Merck, Art. 9385) à pressão atmosférica.
Exemplo 1 Sintese estereoespecifica de 2'-desoxi-p-L-adenoslna
9-(3,5-Di-0-benzoil-p-L-xilofuranosil)adenina (3)
Uma solução de 9-(2-0-acetil-3,5-di-0-benzoil-p-L-xilofuranosil) adenina 2_ [Ref.: Gosselin, G.; Bergogne, M.-C.; Imbach, J.-L., "Synthesis and Antiviral Evaluation of β-L-Xylofuranosyl Nucleosides of the Five Naturally Occuring Nucleic Acid Bases", Journal of Heterocyclic Chemistry, 1993, 30 (Oct.-Nov.), 1229-1233] (8,30 g, 16,05
mmol) e hidrato de hidrazina a 98% (234 mL, 48,5 mmol) numa mistura de piridina/ácido acético glacial (4/1, v/v, 170 mL), foi agitada à temperatura ambiente durante 22 h. A reacção foi desactivada por adição de acetona (40 mL) e a agitação continuou durante uma hora adicional. A mistura reaccional foi reduzida para metade do seu volume, diluída com água (250 mL) e extraída com clorofórmio (2 x 150 mL). A camada orgânica foi lavada sucessivamente com uma solução aquosa saturada de NaHCCh (3 x 100 mL) e água (3 x 100 mL), seca, filtrada, concentrada e co-evaporada com tolueno e metanol. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (0-3% de MeOH em diclorometano) para dar 3 (5,2 g, 68%) precipitado de éter di- isopropílico: 1H NMR (DMSO-de) : δ 4,5-4,9 (m, 4H, H-2 ' , H- 4', H-5 ' e H-5"), 5,64 (t, 1H, H-3', J2-,3'= J3-,4-= 3,5 Hz), 6.3 (br s, 1H, OH-2 ' ) , 6,45 (d, 1H, H-l', Ji-,2-=4,6 Hz), 7.3 (br s, 2H, NH2-6) , 7,4-7,9 (m, 10H, 2 benzoílos) , 8,07 e 8,34 (2s, 2H, H-2 e H-8); ms: matriz G/T, (FAB+) m/z 476
[M+H]+, 136 [BH2]+, (FAB") m/z 474 [M-H] ", 134 [B] -; UV (etanol a 95%) : Xmax 257 nm (ε 16400), 230 nm (ε 29300), Xmin 246 nm (ε 14800); [cx]d20 -64 (c 1,07, CHCI3) . Análise calculada para C24H21N5O4 (M = 475,45): C, 60,43; H, 4,45; N, 14,73. Determinada: C, 60,41; H, 4,68; N, 14,27. 9-(3,5-Di-0-benzoil-2-desoxi-p-L-treo-pentofuranosil)- adenina (4) A uma solução do composto 3 (1,00 g, 2,11 mmol) em acetonitrilo seco (65 mL) foram adicionados 4- (dimetilamino)piridina (0,77 g, 6,32 mmol) e cloreto de fenoxitiocarbonilo (0,44 mL, 3,16 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. Após concentração, o resíduo foi dissolvido em diclorometano (50 mL) e lavado sucessivamente com água (2 x 30 mL) , solução aquosa de ácido clorídrico 0,5 N (30 mL) e água (3 x 30 mL). A camada orgânica foi seca, filtrada e concentrada até à secura. O intermediário tiocarbonilado em bruto foi directamente tratado com hidreto de tris-(trimetilsilil)-silano (0,78 mL, 5,23 mmol) e a,a'-azoisobutironitrilo (AIBN, 0,112 g, 0,69 mmol) em dioxano seco (17 mL) a refluxo durante 2 h. O solvente foi removido em vácuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (0-5% de MeOH em diclorometano) para dar £ (0,93 g, 96%) puro como uma espuma: 1H-NMR (DMSO-de) : δ 2,9-3,1 (m, 2H, H-2 ' e H-2"), 4,6-4,7 (m, 3H, H-4 ' , H-5' e H-5"), 5,8 (br s, 1H, H-3'), 6,43 (dd, 1H, H-l', Ji<,2<= 3,1 Hz,
Ji',2" = 7,6 Hz), 7,3 (br s, 2H, NH2-6), 7,4-7,9 (m, 10H, 2 benzoílos) , 8,05 e 8,33 (2s, 2H, H-2 e H-8); ms: matriz G/T, (FAB+) m/z 460 [M+H]+, 325 [S]+, 136 [BH2]+, (FAB -) m/z 458 [M-H] “, 134 [B]~; UV (etanol a 95%) : Xmax 261 nm (ε 14400), 231 nm (ε 26300), Àmin 249 nm (ε 12000) ; [a] D20 = -38 (c 1,04, DMSO). 6-N- (4-Monometoxitritil)-9-(3,5-di-0-benzoil-2-desoxi-p-L-treo-pentofuranosil)adenina (5). A uma solução do composto ^ (0,88 g, 1,92 mmol) em piridina seca (40 mL) foi adicionado cloreto de 4- monometoxitritilo (1,18 g, 3,84 mmol). A mistura foi agitada a 60°C durante 24 h. Após a adição do metanol (5 mL), a solução foi concentrada até à secura, o resíduo foi dissolvido em diclorometano (50 mL) e lavado sucessivamente com água (30 mL), solução aquosa saturada de NaHCCb (30 mL) e água (30 mL) . A camada orgânica foi seca, filtrada, concentrada e co-evaporada com tolueno para dar 5 puro (1,01 g, 72%) como uma espuma; 1H NMR (CDCI3) : δ 2,9-3,0 (m, 2H, H-2 ' e H-2"), 3,62 (s, 3H, OCH3) , 4,6-4,8 (m, 3H, H-4 ' , H-5' e H-5") , 5,85 (pt, 1H, H-3'), 6,44 (dd, 1H, H- 1', Ji',2'= 3,1 Hz, Ji',2" = 7,3 Hz), 6,9 (br s, 1H, NH-6) , 6,7-6,8 e 7,2-7,4 (2m, 24H, 2 benzoílos e MMTr) , 7,97 e 8,13 (2s, 2H, H-2 e H-8); ms: matriz G/T, (FAB+) m/z 732 [M+H]+, (FAB-) m/z 730 [M-H]-; UV (etanol a 95%) : Xmax 274 nm (ε 12100), 225 nm (ε 24200), Àmin 250 nm (ε 5900); [a] D20 = - 16 (c 1,12, DMSO). 6-N- (4-Monometoxitritil)-9-(2-desoxi-p-L-treo-pentofuranosil)adenina (6). O composto 5 (0,95 g, 1,30 mmol) foi tratado com uma solução (saturada a -10°C) de amónia metanólica (40 mL) , à temperatura ambiente de um dia para o outro. Após concentração, o resíduo foi dissolvido em diclorometano (60 mL) e lavado com água (30 mL). A camada aquosa foi extraída duas vezes com diclorometano (10 mL). A camada orgânica combinada foi seca, filtrada e concentrada. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (MeOH a 0,5% em diclorometano) para dar 6 puro (0,67 g, 98%) como uma espuma: 1H NMR (CDCI3) : δ 2,6-2,9 (m, 2H, H- 2' e H-2") , 3,5 (br s, 1H, OH-5'), 3,55 (s, 3H, OCH3) , 3,9-4,0 (m, 3H, H-4', H-5' e H-5"), 4,5-4,6 (m, 1H, H-3'), 6,03 (dd, 1H, H-l ' , Jr,2·= 4,0 Hz, Jr,2"= 8,8 Hz), 7,0 (br s, 1H, NH-6), 6,7-6,8 e 7,1-7,4 (2m, 14H, MMTr), 7,40 (d, 1H, OH-3', Jh,oh = 10,6 Hz), 7,80 e 7,99 (2s, 2H, H-2 e H-8); ms: matriz G/T, (FAB+) m/z 524 [M+H]+, 408 [BH2]+, (FAB-) m/z 1045 [2M-H]-, 522 [M-H]“, 406 [B]“; UV (etanol a 95%) : Xmax 275 nm (ε 12300), lmin 247 nm (ε 3600); [a]D20 = +28 (c 0,94, DMSO). 6-N- (4-Monometoxitritil)-9-(2-desoxi-5-0-(4-monometoxi- tritil) -β-L- treo-pentofuranosil) adenina (7^). O composto 6 (0,62 g, 1,24 mmol) em piridina seca (25 mL) foi tratado com cloreto de 4-monometoxitritilo (0,46 g, 1,49 mmol) à temperatura ambiente durante 16 h. Após a adição de metanol (5 mL), a mistura foi concentrada até à secura. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (60 mL) e lavado sucessivamente com água (40 mL) , uma solução aquosa saturada de NaHCCç (40 mL) e água (3 x 40 mL) . A camada orgânica foi seca, filtrada, concentrada e co-evaporada com tolueno e metanol. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (0-10% de MeOH em diclorometano) para dar 1_ (0,71 g, 72%) como uma espuma: 2Η NMR (DMSO-de) : δ 2,21 (d, 1H, H-2', J2g2" = 14,3 Hz), 2,6-2,7 (m, 1H, H-2"), 3,1-3,3 (2m, 2H, H-5' e H-5"), 3,64 e 3,65 (2s, 6H, 2 x OCH3) , 4,1-4,2 (m, 1H, H-4 ' ) , 4,2-4,3 (m, 1H, H-3 ' ) , 5,68 (d, 1H, OH-3', Jh,oh = 5,2 Hz), 6,24 (d, 1H, Η-1 ' , Ji',2" = 7,0 Hz), 6,7-6,8 e 7,1-7,3 (2m, 29H, MMTr e NH-6), 7,83 e 8,21 (2s, 2H, H-2 e H-8); ms: matriz G/T, (FAB+) m/z 796 [M+H]+, 408 [BH2]+, (FAB-) m/z 794 [M-H]-, 406 [B]~; UV (etanol a 95%) : Xmax 275 nm (ε 30900), Xmin 246 nm (ε 12800); [a] D20 = +14 (c 1,03, DMSO) . 6-N-(4-Monometoxitritil)-9-(3-0-benzoil-2-desoxi-5-0-(4-monometoxitritil)-β-L-eritro-pentofuranosil)adenina (8) .
Uma solução de azodicarboxilato de dietilo (0,38 mL, 2,49 mmol) em tetra-hidrofurano seco (20 mL) foi adicionada, gota a gota, a uma solução arrefecida (0°C) do nucleosido 1_ (0,66 g, 0,83 mmol) , trifenilfosfina (0,66 g, 2,49 mmol) e ácido benzóico (0,30 g, 2,49 mmol) em THF seco (20 mL) . A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 18 h e foi adicionado metanol (1 mL). Os solventes foram removidos a pressão reduzida e o material em bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de silica (0-5% de acetato de etilo em diclorometano) para dar o composto 8_ ligeiramente contaminado com óxido de trifenilfosfina. 6-N- (4-Monometoxitritil)-9-(2-desoxi-5-0- (4-monometoxi-tritil)-β-L-eritro-pentofuranosil)adenina (9). O composto £ foi tratado com uma solução (saturada a -10°C) de amónia metanólica (20 mL) , à temperatura ambiente durante 24 h, depois a mistura reaccional foi concentrada até à secura. O resíduo foi dissolvido em diclorometano (30 mL) e lavado com água (20 mL). A camada aquosa foi extraída com diclorometano (2 x 20 mL) e a fase orgânica combinada foi seca, filtrada e concentrada. O composto 9 puro (0,50 g, 76% a partir de 7) foi obtido como uma espuma após a purificação por cromatografia em coluna de gel de sílica (0-2% de MeOH em diclorometano): 1H NMR (DMSO-de) : δ 2,2-2,3 (m, 1H, H-2 ' ) , 2,8-2,9 (m, 1H, H-2"), 3,1-3,2 (m, 2H, H-5' e H-5"), 3,64 e 3,65 (2s, 6H, 2 x OCH3) , 3,97 (pq, 1H, H-4 ' ) , 4,4-4,5 (m, 1H, H-3 ' ) , 5,36 (d, 1H, OH-3', Jh,oh=4,5 Hz), 6,34 (t, 1H, H -1 ' , Ji',2,= Ji',2" = 6,4 Hz), 6,8-6,9 e 7,1-7,4 (2 m, 29H, 2 MMTr e NH-6) , 7,81 e 8,32 (2s, 2H, H-2 e H-8); ms: matriz G/T, (FAB+) m/z 796 [M+H]+, 408 [BH2]+, (FAB-) m/z 794 [M-H]“ , 406 [B]~; UV (etanol a 95%) : Xmax 276 nm (ε 42600), Àmin 248 nm (ε 23300); [a] D20 = +2 9 (c 1,05, DMSO) . 2'-Desoxi-p-L-adenosina (β-L-dA) O composto 9 (0,44 g, 0,56 mmol) foi tratado com uma solução aquosa de ácido acético a 80% (17 mL) à temperatura ambiente durante 5 h. A mistura foi concentrada até à secura, o resíduo foi dissolvido em água (20 mL) e lavado com éter dietílico (2 x 15 mL). A camada aquosa foi concentrada e co-evaporada com tolueno e metanol. A 2'-desoxi-p-L-adenosina (β-L-dA) desejada (0,12 g, 83%) foi obtida após purificação por cromatografia em coluna de gel de sílica (0-12% de MeOH em diclorometano) e filtração através de uma unidade Millex HV-4 (0,45 μ, Millipore): p.f. 193-194°C (cristalizado de água) (Lit. 184-185°C para o enantiómero L [Ref.: Robins, M. J.; Khwaja, T. A.;
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Procedures in Nucleic Acid Chemistry; Zorbach, W. W.,
Tipson, R. S., Eds.; J. Wiley and sons: New York, 1968; Vol 1, páginas 183-187]; 1H NMR (DMSO-de) : δ 2,2-2,3 e 2,6-2,7 (2m, 2H, H-2' e H-2"), 3,4-3,6 (2m, 2H, H-5' e H-5"), 3,86 (pq, 1H, H-4'), 4,3-4,4 (m, 1H, H-3'), 5,24 (t, 1H, OH-5',
Jh,oh = 5,8 Hz), 5,30 (d, 1H, OH-3', Jh,oh = 4,0 Hz), 6,32 (dd, 1H, H-l ' , Ji',2' = 6,2 Hz, Ji',2" = 7,8 Hz), 7,3 (br s, 2H, NH2-6) , 8,11 e 8,32 (2s, 2H, H-2 e H-8); ms: matriz G/T, (FAB+) m/z 252 [M+H]+, 136 [BH2]+, (FAB-) m/z 250 [M-H]“ , 134 [B]~; UV (etanol a 95%) : hmax 258 nm (ε 14300), Xmin 226 nm (ε 2100); [a]D20 = +25 (c 1,03, H20) , (Lit. [a]D20 = +23 (c 1,0, H2O) para o enantiómero L [Ref.: Robins, M. J.; Khwaja, T. A.; Robins, R. K., J. Org. Chem. 1970, 35, 636- 639] e [oo]d20 -25 (c 0,47, H2O) para o enantiómero D [Ref.:
Ness, R. K. em Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry; Zorbach, W. W., Tipson, R. S., Eds.; J. Wiley and sons: New York, 1968; Vol 1, páginas 183-187]; Análise Calculada para C10H13N5O3 + 1,5Η2θ (Μ 278,28): C, 43,16; Η, 5,80; Ν, 25,17. Determinada: C, 43,63; Η, 5,45; Ν, 25,33.
Exemplo 2 Sintese estereosselectiva de 2'-desoxi-β-L-adenosina (β-L-dA)
Precursor: L-ribose (Cultor Science Food, CAS [24259-59-4], lote RIB9711013).
Reagentes: Ácido sulfúrico 95-97% (Merck; ref. 1.00731.1000); cloreto de benzoílo (Fluke; ref. 12930); sulfato de sódio (Prolabo; ref. 28111.365)
Solventes: Metanol P.A. (Prolabo; ref. 20847.295); piridina 99% (Acros; ref. 131780025); Diclorometano P.A. (Merck; ref 1.06050.6025); ácido acético P.A. (Cario Erba; ref. 20104298); anidrido acético (Fluka; ref. 45830); etanol 95 (Prolabo; ref. 20823.293).
Referências: Recondo, E. F. e Rinderknecht, H., Eine neue, Einfache Synthese des l-O-Acetyl-2,3,5-Tri-0-p-D-Ribofuranosides, Helv. Chim. Acta, 1171-1173 (1959) .
Uma solução de L-ribose 140 (150 g, 1 mol) em metanol (2 litros) foi tratada com ácido sulfúrico (12 mL) e deixada a +4°C durante 12 h e depois neutralizada com piridina (180 mL) . A evaporação deu uma mistura α, β de ribofuranosidoss de metilo 141 como um xarope. Uma solução desta mistura anomérica em piridina (1,3 litros) foi tratada com cloreto de benzoílo (580 mL, 5 mol) com arrefecimento e agitação mecânica. A solução foi deixada à temperatura ambiente durante 12 h e depois vertida em gelo (cerca de 10 litros) com agitação contínua. A mistura (um óleo em água) foi filtrada numa camada de Celite. O óleo resultante da camada de Celite foi lavado com água (3x3 litros) e depois dissolvido com acetato de etilo (3 litros) . A fase orgânica foi lavada com uma solução de NaHCCç a 5% (2 litros) e água (2 litros) , seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada para dar 1-0-metil-2,3,5-tri-0-benzoil-a/p-L-ribofuranose 142 como um xarope espesso. 0 óleo foi dissolvido em anidrido acético (560 mL) e ácido acético (240 mL). A solução foi, após a adição gota a gota de ácido sulfúrico concentrado (80 mL) , mantida no frio (+4°C) com agitação mecânica durante 10 h. A solução foi então vertida em gelo (cerca de 10 litros) com agitação contínua. A mistura (composto oleoso em água) foi filtrada por uma camada de Celite. O sólido gomoso resultante na camada de Celite foi lavado com água (3x3 litros) e depois dissolvido em diclorometano (2,5 litros). A fase orgânica foi lavada com NaHCCA a 5% (1 litro) e água (2x2 litros), seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada para dar um sólido gomoso 143, que foi cristalizado de etanol 95 (rendimento de 225 g, 44%).
Análises para l-O-acetil-2,3,5-tri-0-benzoil-p~L-ribofuranose 143: P.f. 129-130°C (EtOH 95) (lit .(1) p.f. 130-131°C) XH NMR (200 MHz, CDC13) : δ 8, 09-7, 87 (m, 6H, HArom) , 7,62-7,31 (m, 9H, HArom) , 6,43 (s, 1H, Hi) , 5,91 (dd, 1H, H3, J3,4 = 6,7 Hz; J3,2 = 4,9 Hz), 5,79 (pd, 1H, H2, J2,3 = 4,9 Hz; Ji,2 < 1) 4,78 (m, 2H, H4 e H5) , 4,51 (dd, 1H, H5, J5,5 ' = 13,1 Hz, J5 ' , 4 = 5,5 Hz), 2,00 (s, 3H, CH3CO) ; (idêntica a l-O-acetil-2,3,5-tri-0-benzoil-p-D- ribofura-nose comercial).
Análise de massa (FAB+, GT) m/z 445 (M-OAc)+ Análise elementar C28H24O9. Calculada C 66, 66 H 4,79; determinada C H
Reacção 2:
Precursor: Adenina (Pharma-Waldhof; ref. 400134.001 lote 45276800).
Reagentes: Cloreto de estanho fumante (Fluka; ref. 96558); NfR/metanol (metanol saturado com NH3; ver página 5); sulfato de sódio (Prolabo; ref. 28111.365).
Solventes: Acetonitrilo (Riedel-de Haen; ref. 33019; destilado sobre CafR) ; clorofórmio puro (Acros; ref. 22706463); acetato de etilo puro (Cario erba; ref. 528299).
Referências: Saneyoshi, M. e Satoh, E., Synthetic Nucleosides and Nucleotides. XIII. Stannic Chloride Catalyzed Ribosylation of Several 6-Substituted Purines. Chem. Pharm. Bull., 27, 2518-2521 (1979).; Nakayama, C. e
Saneyoshi, M., Synthetic Nucleosides and Nucleotides. XX. Synthesis of Various l-p-Xylofuranosyl-5-Alkyluracils and Related Nucleosides. Nucleosides, Nucleotides, 1, 139-146 (1982).
Adenina (19,6 g, 144 mmol) foi suspensa em acetonitrilo (400 mL) com 1-O-acetil-2,3,5-tri-O-benzoil-β-L-ribofuranose 143 (60 g, 119 mmol) . A esta suspensão foi adicionado cloreto de estanho fumante (22 mL, 187 mmol). Após 12 h, a reacção foi concentrada até um volume reduzido (cerca de 100 mL) e adicionou-se hidrogenocarbonato de sódio (110 g) e água (120 mL) . O sólido branco resultante (sais de estanho) foi extraído com clorofórmio quente (5 x 200 mL) . Os extractos combinados foram filtrados numa camada de celite. A fase orgânica foi lavada com uma solução de NaHC03 a 5% e água, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada para dar o composto 144 (60 g, espuma incolor). A espuma foi tratada com metanol saturado com amónia (220 mL) num recipiente vedado à temperatura ambiente com agitação durante 4 dias. O solvente foi removido por evaporação a pressão reduzida e o pó resultante foi suspenso em acetato de etilo (400 mL) a refluxo durante 1 h. Após filtração, o pó foi recristalizado de água (220 mL) para dar L-adenosina 145 (24 g, cristais, 75%).
Análises para β-L-adenosina: p.f. 233-234°C (água) (lit. (4) p.f. 235°-238°C) XH NMR (200 MHz, DMSO-de) : δ 8,34 e 8,12 (2s, 2H, H2 e Ha), 7,37 (Is, 2H, NH2) , 5,86 (d, 1H, Hl', Ji-,2· 6,2
Hz), 5,43 (m, 2H, OH2' e OH5'), 5,19 (d, 1H, OH3·, J 3,7 Hz), 4,60 (m, H2·), 4,13 (m, 1H, H3·), 3,94 (m, 1H, H40 , 3, 69-3,49 (m, 2H, Hs'a e Hs'b) , idêntica à D-adenosina comercial).
Análise de massa (FAB+, GT) m/z 268 (M+H)+, 136 (BH2) +
Reacção 3:
Reagentes: l,3-Dicloro-l,l,3,3-tetraisopropil- dissiloxano (Fluka; ref. 36520); sulfato de sódio (Prolabo; ref. 28111.365) .
Solventes: Piridina 99% (Acros; ref. 131780025); Acetato de etilo puro (Cario erba; ref. 528299); Acetonitrilo (Riedel-de Haen; ref. 33019).
Referência: Robins, M. J. et ai., Nucleic Acid
Related Compounds. 42. A General Procedure for the Efficient Deoxygenation of Secondary Alcohols. Regiospecific and Stereoselective Conversion of Ribonucleosides to 2'-Deoxynucleosides. J. Am. Chem. Soc. 105, 4059-4065 (1983). A L-adenosina 145 (47,2 g, 177 mmol) suspensa em piridina (320 mL) adicionou-se 1,3-dicloro-l,1,3,3-tetraisopropildissiloxano (63 mL, 201 mmol) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 12 h. A piridina foi evaporada e o resíduo foi partilhado com acetato de etilo (1 litro) e uma solução de NaHC03 a 5% (600 mL) . A fase orgânica foi lavada com uma solução de HC1 0,5 N (2 x 500 mL) e água (500 mL) , seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada até à secura. O sólido resultante foi cristalizado de acetonitrilo para dar o composto 146 (81 g, 90%) .
Análises de 3',5'-O- (1,1,3,3-tetraisopropil-l,3-dissiloxanil)-β-L-adenosina 146: p.f. 97-98°C (acetonitrilo) (lit. (5) enantiómero D p.f. 98 °C) NMR (200 MHz, CDC13) : δ 8,28 e 7,95 (2s, 2H, H2 e H8), 5,96 (d, 1H, Ji-,2- 1,1 Hz), 5,63 (m, 2H, NH2) , 5,10 (dd, 1H, H3·, J3,4 7,6 Hz, J3,2 5,5 Hz), 4,57 (dd, 1H, H2·, J2',i' 1,2 Hz; J2',3' 7,6 Hz), 4,15-3,99 (m, 3H, H^, Hs'a e H5'b) , 3,31 (si, 1H, OH2') , 1,06 (m, 28H, protões isopropilo).
Análise de massa (FAB-, GT) m/z 508 (M-H)-, 134 (B)-; (FAB+, GT) m/z 510 (m+H) +, 136 (BH2) +
Reacção 4:
Reagentes: Dimetilaminopiridina 99% (Acros; ref. 1482702050); clorotionocarbonato de fenilo 99% (Acros; ref. 215490050); tris (trimetilsilil)silano "TTMSS" (Fluka; ref. 93411); α,α'-azoisobutironitrilo "AIBN" (Fluka, ref. 11630); sulfato de sódio (Prolabo; ref. 28111.365)
Solventes: Acetonitrilo (Riedel-de Haen; ref. 33019); acetato de etilo puro (Cario Erba; ref. 528299); dioxano P.A. (Merck; ref. 1.09671.1000); diclorometano (Merck; ref. 1.06050.6025); metanol (Cario Erba; ref 309002);
Referência: Robins, M. J., Wilson, J. S e Hansske, F., Nucleic Acid Related Compounds. 42. A General Procedure for the Efficient Deoxygenation of Secondary Alcohols. Regiospecific and Stereoselective Conversion of Ribonucleosides to 2'- Deoxynucleosides. J. Am. Chem. Soc., 105, 4059-4065 (1983).
Ao composto 146 (34 g, 67 mmol) foram adicionados acetonitrilo (280 mL) , DMAP (16,5 g, 135 mmol) e clorotionocarbonato de fenilo (10,2 mL, 73 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente, durante 12 h. O solvente foi evaporado e o resíduo foi partilhado entre acetato de etilo (400 mL) e uma solução de HC1 0,5 N (400 mL) . A camada orgânica foi lavada com uma solução de HC1 0,5 N (400 mL) e água (2 x 400 mL), seca sobre sulfato de sódio, filtrada e evaporada até à secura, para dar um intermediário como um sólido amarelo claro. O produto 147 em bruto foi dissolvido em dioxano (mL) e foram adicionados AIBN (3,3 g, 20 mmol) e TTMSS (33 mL, 107 mmol). A solução foi progressivamente aquecida até ao refluxo e agitada durante 2 h. A reacção foi concentrada até um óleo amarelo, que foi submetido a cromatografia (eluente diclorometano/ metanol 95/5) para dar o composto 148 (23 g, espuma incolor, 70%). Cristalizou-se uma aliquota de etanol/éter de petróleo.
Análises para 3',5'-O- (1,1,3,3-tetraisopropil-1,3-dissiloxanil)-2'-desoxi-p-L-adenosina 148: p.f. 110-111°C (EtOH/éter de petróleo) (Lit. (5) p.f. 113-114 °C (EtOH)) XH NMR (200 MHz, CDC13) : δ 8,33 e 8,03 (2s, 2H, H2 e Ha), 6,30 (dd, 1H, Hi·, J 2,85 Hz, J 7,06 Hz), 5,63 (si, 2H, NH2), 4,96 (m, 1H, H3·), 4,50 (m, 2H, H5'a e H5-b) , 2,68 (m, 2H, H2'a e H2-b) , 1,08 (m, 28H, protões isopropilo) .
Análise de massa (FAB+, GT) m/z 494 (M+H)+, 136 (BH2) +
Reacção 5:
Reagentes: Fluoreto de amónio (Fluka; ref. 09742); gel de sílica (Merck; ref 1.07734.2500)
Solventes: Metanol P.A. (Prolabo; ref. 20847.295); diclorometano P.A. (Merck; ref. 1.06050.6025); Etanol 95 (Prolabo; ref. 20823.293).
Referência: Zhang, W. e Robins, M. J., Removal of Silyl Protecting Groups from Hidroxyl Functions with Ammonium Fluoride in Methanol. Tetrahedron Lett., 33, 1177-1180 (192).
Uma solução de 3 ' ,5 '-O-(1,1,3,3-tetraisopropil-1,3-dissiloxanil)-2'-desoxi-L-adenosina 148 (32 g, 65 mmol) e fluoreto de amónio (32 g, mmol) em metanol foi agitada a refluxo durante 2 h. O gel de sílica foi adicionado e a mistura foi cuidadosamente evaporada para dar um pó branco. Este pó foi adicionado ao topo da coluna de sílica, que foi eluída com diclorometano/metanol 9/1. Foram combinadas as fracções apropriadas e evaporadas para dar um pó branco, que foi cristalizado de etanol 95 (12,1 g, 75%).
Análises para 2'-desoxi-p-L-adenosina 149: p.f. 189-190°C (EtOH 95) (idêntico ao da 2'-desoxi-D-adenosina comercial) χΗ NMR (200 MHz, DMSO-de) : δ 8,35 e 8,14 (2s, 2H,
H2 e Ha), 7,34 (si, 2H, NH2) , 6,35 (dd, 1H, Hi·, J 6,1 Hz, J 7,85 Hz), 5,33 (d, 1H, OH2·, J 4,0 Hz), 5,28 (dd, 1H, H3·, J 4,95 Hz; J 6,6 Hz), 4,42 (m, 1H, OH50, 3, 88 (m, 1H, H40, 3, 63-3,52 (m, 2H, H5'a e H5-b) , 2,71 (m, 1H, H2-a) , 2,28 (m, 1H, H2'b) (idêntico ao da 2 '-desoxi-D-adenosina comercial) (Xd +26° (c 0,5 água) (2 '-desoxi-D-adenosina comercial -25° (c 0,5 água)). UV λι-ftax 260 nm (ε 14100) (H2O) .
Análise de massa (FAB+, GT) m/z 252 (M+H)+, 136 (BH2) +
Exemplo 3 Síntese Estereoespecífica de 2'-desoxi-β-L-citidina
1-(3,5-Di-O-benzoil-p-L-xilofuranosil)uracilo (11)
Adicionou-se hidrato de hidrazina (1,4 mL, 28,7 mmol) a uma solução de 1-(2-0-acetil-3,5-di-0-benzoil-p-L- xilofuranosil)uracilo 1£ [Ref.: Gosselin, G.; Bergogne, M.-C.; Imbach, J.-L., "Synthesis and Antiviral Evaluation of β-L-Xylofuranosyl Nucleosides of the Five Naturally Occuring Nucleic Acid Bases", Journal of Heterocyclic Chemistry, 1993, 30 (Oct.-Nov.), 1229-1233] (4,79 g, 9,68 mmol) em piridina (60 mL) e ácido acético (15 mL) . A solução foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. Adicionou-se acetona (35 mL) e a mistura foi agitada durante 30 min. A mistura reaccional foi evaporada a pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica [eluente: gradiente por passos de metanol (0-4%) em diclorometano para dar 11 (3,0 g, 68%), que foi cristalizado de ciclo- hexano/diclorometano: p.f. 111-114°C; 1H NMR (DMSO-ch) : δ 11,35 (br s, 1H, NH) , 7,9-7,4 (m, 11H, 2 C6H5CO, H-6), 6,38 (d, 1H, OH-2 ' , Joh-2' 4,2 Hz), 5,77 (d, 1H, H-l’, Ji._2. 1,9
Hz), 5,55 (d, 1H, H-5, Js-6 8 Hz), 5,54 (dd, 1H, H-3', J3'-2· 3,9 Hz e J31 -41 1,8 Hz), 4,8 (m, 1H, H-4 ' ) , 4,7 (m, 2H, H-5' e H-5"), 4,3 (m, 1H, H-2'); MS: FAB>0 (matriz GT) m/z 453 (M+H)+, 105 (C6H5CO)+; FABC0 (matriz GT) m/z 451 (M-H) “, 121 (C6H5C02)", 111 (B)“; Análise calculada para C23H2oN208·H20: C, 58,09; H, 4,76; N, 5,96. Determinada: C, 57,71; H, 4,42; N, 5,70. 1-(3,5-Di-0-benzoil-p-L-arabinofuranosil)uracilo (12) A uma solução de 1-(3,5-di-0-benzoil-p-L-xilofu-ranosil) uracilo 11^ (8 g, 17,7 mL) numa mistura de benzeno-DMSO anidro (265 mL, 6:4, v/v) adicionou-se piridina anidra (1,4 mL) , diciclo-hexilcarbodiimida (10,9 g, 53 mmol) e ácido dicloroacético (0,75 mL) . A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 4 h, depois diluída com acetato de etilo (400 mL) e foi adicionada uma solução de ácido oxálico (4,8 g, 53 mmol) em metanol (14 mL). Após ter sido agitada durante 1 h, a solução foi filtrada. O filtrado foi lavado com uma solução de NaCl saturada (2x500 mL), solução de NaHC03 a 3% (2x500 mL). A fase orgânica foi seca sobre Na2S04 e depois evaporada a pressão reduzida. O resíduo resultante foi então solubilizado numa mistura de EtOH absoluto-benzeno (140 mL, 2:1, v/v). A esta solução a 0 °C adicionou-se NaBfU (0,96 g, 26,5 mmol). Após ter sido agitada durante 1 h, a solução foi diluída com acetato de etilo (400 mL), depois filtrada. O filtrado foi lavado com uma solução saturada de NaCl (400 mL) e água (400 mL) . A fase orgânica foi seca sobre Na2S04 e depois evaporada a pressão reduzida. O material em bruto resultante foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica [eluente: gradiente por passos de metanol (0-3%) em diclorometano, para dar 12_ (5,3 g, 66%), que foi cristalizado de acetonitrilo: p.f. 182-183°C; 1H NMR (DMSO-de) : δ 11,35 (br s, 1H, NH) , 8,0-7,5 (m, 11H, 2 C6H5CO, H-6), 6,23 (br s, 1H, OH-2 ' ) , 6,15 (d, 1H, H-l', Ji<-2< 4 Hz), 5,54 (d, 1H, H-5, J5-6 8,1 Hz), 5,37 (t, 1H, H-3', J3--2' J3'-4- 2,6 Hz), 4,7-4,6 (m, 2H, H-5' e H-5"), 4,5 (m, 1H, H-4'), 4,4 (m, 1H, H-2 ' ) ; MS: FAB>0 (matriz GT) m/z 453 (M+H) +, 341 (S)+, 113 (BH2)+, 105 (C6H5CO)+; FABC0 (matriz GT) m/z 451 (M-H)~, 121 (C6H5CO2) “, 111 (B)~; Análise calculada para C23H20N2O8: C, 61,06; H, 4,46; N, 6,19. Determinada: C, 60,83; H, 4,34; N, 6,25. 1-(3,5-Di-0-benzoil-2-desoxi-p-L-eritro-pentofuranosil)uracilo (13) A uma solução de 1-(3,5-di-0-benzoil-p-L- ara-binofuranosil)uracilo 1£ (5,2 g, 11,4 mmol) em 1,2- dicloroetano anidro (120 mL) adicionou-se cloreto de fenoxitiocarbonilo (4,7 mL, 34,3 mL) e 4-(dimetil- amino)piridina (DMAP, 12,5 g, 102,6 mmol). A solução resultante foi agitada à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon durante lhe depois evaporada a pressão reduzida. 0 resíduo foi dissolvido em diclorometano (300 mL) e a solução orgânica foi sucessivamente lavada com solução de ácido clorídrico 0,2 N gelada (3 x 200 mL) e água (2 x 200 mL) , seca sobre Na2SC>4 e depois evaporada a pressão reduzida. O material em bruto foi co-evaporado várias vezes com dioxano anidro e dissolvido neste solvente (110 mL). À solução resultante foram adicionados, sob atmosfera de árgon, hidreto de tris-(trimetilsilil)silano (4,2 mL, 13,7 mmol) e a,a'-azoisobutironitrilo (AIBN, 0,6 g, 3,76 mmol). A mistura reaccional foi aquecida e agitada a 100°C durante 1 h sob atmosfera de árgon, depois arrefecida à temperatura ambiente e evaporada a pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica [eluente: gradiente por passos de metanol (0-5%)] para dar 13 (2,78 g, 56%), que foi cristalizado de EtOH: p.f. 223- 2 2 5 ° C; H-NMR (DMSO-cte) : δ 11,4 (br s, 1H, NH) , 8,0-7,5 (m, 11H, 2 C6H5CO, H-6), 6,28 (t, 1H, H-l', J 7 Hz), 5,5 (m, 2H, H-l' e H-5), 4,6-4,4 (m, 3H, H-5' e H-5"), 2,6 (m, 2H, H-2 ' e H-2") ; EM: FAB>0 (matriz GT) m/z 437 (M+H)+, 3325 (S)+; FABCO (matriz GT) m/z 435 (M-H)-, 111 (B)-; Análise calculada para C23H20N2O7: C, 63, 30; H, 4,62; N, 6,42. Determinada: C, 62,98; H, 4,79; N, 6,40. 2'-Desoxi-p-L-citidina (β-L-dC)
Adicionou-se reagente de Lawesson (1,72 g, 4,26 mmol) sob atmosfera de árgon a uma solução de l-(3,5-di-0-benzoil-2-desoxi-p-L-eritro-pentofuranosil) uracilo 13 (2,66 g, 6,1 mmol) em 1,2-dicloroetano anidro (120 mL) e a mistura reaccional foi agitada a refluxo durante 2 h. 0 solvente foi então evaporado a pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de silica [eluente: gradiente por passos de acetato de etilo (0-8%) em diclorometano] para dar o intermediário 4-tio como uma espuma amarela. Uma solução deste intermediário tio (1,5 g, 3,31 mmol) em amónia metanólica (previamente saturada a -10°C e bem vedada) (50 mL) foi aquecida a 100°C numa bomba de aço inoxidável durante 3 h e depois arrefecida a 0°C. A solução foi evaporada a pressão reduzida. O material em bruto resultante foi purificado por cromatografia em coluna de gel de silica [eluente: gradiente por passos de metanol (0-20%) em diclorometano]. Finalmente obteve-se as fracções apropriadas, filtradas através de uma unidade Millex HV-4 (0,45 ym, Millipore) e evaporadas a pressão reduzida para dar a 2'-desoxi-p-L-citidina (β-L-dC) desejada como uma espuma (0,6 g, 80%), que foi cristalizada de EtOH absoluto: p.f. 198-199°C; XH NMR (DMSO-de) : δ 7,77 (d, 1H, H-6, J6-s 7,4 Hz), 7,10 (br d, 2H, NH-2) , 6,13 (t, 1H, H-l', J = 6,7 Hz), 5,69 (d, 1H, H-5, J5-6 = 7,4 Hz), 5,19 (d, 1H, OH-3',
Joe-3' = 4,1 Hz), 4,96 (t, 1H, OH-5’, J0H-5' = Joh-s- = 5,2 Hz), 4,1 (m, 1H, H-3 1 ) , 3,75 (m, 1H, H-4 ' ) , 3,5 (m, 2H, H-5' e H-5") , 2,0 (m, 1H, H-2 ' ) , 1,9 (m, 1H, H-2"); MS: FAB>0 (matriz GT) m/z 228 (M+H)+, 112 (BH2)+; FAB<0 (matriz GT) m/z 226 (M-H)-; [a] 20D = -69 (c 0,52, DMSO) [ [a] 20D = +76 (c 0,55, DMSO) para urn sal cloridrato do D-enantidmero disponível comercialmente]. Análise calculada para C9H13N3O4: C, 47,57; H, 5,77; N, 18,49. Determinada: C, 47,35; H, 5,68; N, 18,29.
Exemplo 4 Sintese estereoselectiva de 2'-desoxi-β-L-citidina (β-L-dC)
2-Amino-p-L-arabinofurano[1',2':4,5]oxazolina (1)
Uma mistura de L-arabinose (170 g, 1,13 mol) , cianamida (100 g, 2,38 mol), metanol (300 mL) e NH4OH 6 M (50 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 3 dias e depois mantida a -10 °C de um dia para o outro. O produto foi recolhido com sucção, lavado sucessivamente com metanol e éter e seco em vácuo. Rendimento, 130 g (66%) do composto 1 analiticamente puro, p.f. 170-172°C; 1H NMR (DMSO-ch) : δ ppm 6,35 (br s, 2H, NH2) , 5,15 (d, 1H, H-1, J = 5, 6 Hz), 5,45 (br s, 1H, OH-3), 4,70 (br s, 1H, OH-5), 4,55 (d, 1H, H-2, J = 5,6 Hz), 4,00 (br s, 1H, H-3), 3,65 (m, 1H, H-4), 3,25 (m, 2H, H- 5, H-5').
Reagentes: L-arabinose: Fluka, >99,5%, ref. 10839 Cianamida: Fluka, >98%, ref. 28330 O2,2'- anidro-p-L-uridina (2)
Uma solução do composto 1 (98,8 g, 0,57 mol) e propiolato de metilo (98 mL) em etanol aguoso a 50% (740 mL) foi aguecida a refluxo durante 5 h, depois arrefecida e concentrada a pressão reduzida até metade do volume original. Após precipitação com acetona (600 mL) , o produto foi recolhido com sucção, lavado com etanol e éter e seco. As águas mães foram parcialmente concentradas, sendo o concentrado precipitado com acetona (1000 mL) , o sólido recolhido com sucção e lavado com acetona e éter para dar outra colheita de produto. Rendimento global, 80 g (62%) do composto 2, p.f. 236-240°C; ΧΗ NMR (DMSO-de) : δ ppm 7,87 (d, 1H, H- 6, J 7,4 Hz), 6,35 (d, 1H, H-1', J = 5,7 Hz), 5,95 (d, 1H, H- 5, J = 7,4 Hz), 5,90 (d, 1H, OH-3'), 5,20 (d, 1H, H-2', J = 5,7 Hz), 5,00 (m, 1H, OH-3'), 4,44 (br s, 1H, H-3'), 4,05 (m, 1H, H-4' ) , 3,25 (m, 2H, H-5, H-5').
Reagente:
Propiolato de metilo: Fluka, >97%, ref. 81863 3' , 5 '-Di-O-benzoil-O2,2'-anidro-p-L-uridina (3) A uma solução do composto 2 (71,1 g, 0,31 mol) em piridina anidra (1200 mL) adicionou-se cloreto de benzoílo (80,4 mL) a 0°C e sob atmosfera de árgon. A mistura reaccional foi agitada à temperatura ambiente durante 5 h com exclusão da humidade atmosférica e desactivada por adição de etanol. Os solventes foram evaporados a pressão reduzida e o resíduo resultante foi co-evaporado com tolueno e etanol absoluto. A mistura em bruto foi então diluída com etanol e o precipitado foi recolhido com sucção, lavado sucessivamente com etanol e éter, e seco. Rendimento, 129 g (95,8%) do composto 3, p.f. 254°C; 1H NMR (DMSO-de) : δ ppm 8,1-7,4 (m, 11H, CeHsCO, H- 6), 6,50 (d, 1H, H-l ' , J = 5,7 Hz), 5,90 (d, 1H, H- 5, J = 7,5 Hz), 5,80 (d, 1H, H-2 ' , J = 5,8 Hz), 5,70 (d, 1H, H- 3'), 4,90 (m, 1H, H-4 ' ) , 4,35 (m, 2H, H-5, H-5') .
Reagente:
Cloreto de benzoilo: Fluka, p.a., ref. 12930 3',5'-Di-O-benzoil-2'-cloro-2'-desoxi-p-L-uridina (4) A uma solução do composto 3 (60,3 g, 0,139 mol) em dimetilformamida (460 mL) adicionou-se, a 0°C, uma solução de HC1/DMF 3,2 N (208 mL, preparada in situ por adição de 47,2 mL de cloreto de acetilo a 0°C a uma solução de 27,3 mL de metanol e 133,5 mL de dimetilf ormamida) . A mistura reaccional foi agitada a 100°C durante 1 h com exclusão da humidade atmosférica, arrefecida e vertida em água (4000 mL) . O precipitado do composto 4 foi recolhido com sucção, lavado com água e recristalizado de etanol. Os cristais foram recolhidos, lavados com etanol e éter frios e secos a pressão reduzida. Rendimento, 60,6 g (92,6%) do composto A, p.f. 164-165°C; 1H NMR (DMSO-ch) : δ ppm 8,7 (br s, 1H, NH) , 8,1-7,3 (m, 11H, CeHsCO, H- 6), 6,15 (d, 1H, H-1', J = 4,8 Hz), 5,5 (m, 2H, H-5, H-2' ) , 4,65 (m, 4H, H-3', H-4 ' , H-5', H-5") .
Reagente:
Cloreto de acetilo: Fluka, p.a., ref. 00990 3',5'-Di-O-benzoil-2'-desoxi-p-L-uridina (5)
Uma mistura do composto ^ (60,28 g, 0,128 mol), hidreto de tri-n-butilestanho (95 mL) e azabisisobutiro- nitrilo (0,568 g) em tolueno seco (720 mL) foi aquecida a refluxo com agitação durante 5 h e arrefecida. O sólido foi recolhido com sucção e lavado com tolueno e éter de petróleo frios. O filtrado foi concentrado a pressão reduzida e diluído com éter de petróleo para depositar uma colheita adicional do composto 5. Rendimento, 54,28 g (97,2%) do composto 5, p.f. 220-221°C; 1H NMR (CDCI3) : δ ppm 8,91 (br s, 1H, N H) , 8,1-7,5 (m, 11H, CeHsCO e H- 6), 6,43 (q, 1H, Η-1', Ji',2' = 5,7 Hz e Ji',2" = 8,3 Hz), 5,7-5,6 (m, 2H, H-3' e H- 5), 4,8-4,6 (m, 3H, H- 5', H- 5" e H- 4"), 2,8-2,7 (m, 1H, H-2') , 2,4-2,3 (m, 1H, H-2").
Reagentes:
Hidreto de tri-n-butilestanho: Fluka, >98%, ref. 90915 Azabisisobutironitrilo: Fluka, >98%, ref. 11630 3',5'-Di-O-benzoil-2'-desoxi-p-L-4-tio-uridina (6)
Uma solução do composto 5 (69 g, 0,158 mol) e reagente de Lawesson (74 g) em cloreto de metileno anidro (3900 mL) foi aquecida a refluxo sob atmosfera de árgon de um dia para o outro. Após evaporação do solvente, o resíduo em bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica [eluente: gradiente de metanol (0-2%) em cloreto de metileno] para dar composto 6 puro (73 g) em rendimento quantitativo; 1H NMR (CDCI3) : δ ppm 9,5 (br s, 1H, NH) , 8,1-7,4 (m, 10H, CeHsCO) , 7,32 (d, 1H, H- 6, J = 7,7 Hz), 6,30 (dd, 1H, H-1', J = 5,6 Hz e J = 8,2 Hz), 6,22 (d, 1H, Η- 5, J = 7,7 Hz), 5,6 (m, 1H, H- 3'), 4,7 (m, 2H, 77-5', 77-5"), 4,5 (m, 1H, 77-4'), 2,8 (m, 1H, 77- 2'), 2,3 (m, 1H, 77-2") .
Reagente:
Reagente de Lawesson: Fluka, >98%, ref. 61750 2'-Desoxi-p-L-citosina
Uma solução do composto 6 (7,3 g, 0,016 mol) em metanol saturado com amoníaco (73 mL) foi aquecida a 100°C num cilindro de aço inoxidável durante 3 h. Após arrefecer cuidadosamente, o solvente foi evaporado a pressão reduzida. Uma solução aquosa do resíduo foi lavada com acetato de etilo e evaporada até à secura. Esse procedimento foi realizado noutras 9 amostras (cada de 7,3 g) do composto _6 (quantidade total de 6 = 73 g) . Os 10 resíduos foram combinados, diluídos com etanol absoluto e arrefecidos para dar 1_ como cristais. Os vestígios de benzamida foram eliminados dos cristais de 6 por um procedimento de extracção sólido-líquido (a refluxo em acetato de etilo durante 1 h) . Rendimento, 28,75 g (78,6%) do composto 6; p.f. 141-145°C; 1H NMR (DMSO): δ ppm 8,22 e 8,00 (2 br s, 2H, N H2) , 7,98 (d, 1H, H-6, J = 7,59 Hz), 6,12 (t, 1H, 77- 1', J = 6,5 Hz e J = 7,6 Hz), 5,89 (d, 1H, 77-5, J = 7,59
Hz), 5,3 (br s, 1H, 077-3'), 5,1 (br s, 1H, OH- 5'), 4,2 (m, 1H, H- 3'), 3,80 (q, 1H, H- 4', J = 3,6 Hz e J = 6,9 Hz), 3,6-3,5 (m, 2H, H-5', H-5"), 2,2-2,0 (m, 2H, H-2', H-2") ; FABCO, (GT) m/e 226 (M-H)“, 110 (B)“; FAB>0 (GT) 228 (M+H)+, 112 (B+2H) +; [a] D20 -56, 48 (c = 1,08 em DMSO) ; UV (pH 7) Xmax = 270 nm (ε = 10000) .
Reagente:
Amónia metanólica: previamente saturada a -5°C, bem vedada e mantida num congelador.
Exemplo 5 Síntese estereosselectiva de 2'-desoxi-β-L-timidina (β-L-dT)
3',5'-Di-O-benzoil-2'-desoxi-5-iodo^-L-uridina (7)
Uma mistura do composto 5 (105,8 g, 0,242 mol) , iodo (76,8 g) , CAN (66,4 g) e acetonitrilo (2550 mL) foi agitada a 80°C durante 3 h, depois a mistura reaccional foi
arrefecida à temperatura ambiente, levando à cristalização do composto 1_ (86,6 g, 63,5%); m.p. 192-194°C; 1H NMR (DMSO) : δ ppm 8,34 (s, 1H, NH) , 8,2-7,2 (m, 11H, 2 CgHsCO, H- 6), 6,31 (q, 1H, H-1', J = 5,5 Hz e J = 8,7 Hz), 5,5 (m, 1H, H-3'), 4,7 (m, 2H, H-5', H-5"), 4,5 (m, 1H, H-4 ' ) , 2,7 (m, 1H, H-2'), 2,3 (m, 1H, H-2"'); FABCO, (GT) m/e 561 (ΜΗ)-, 237 (B)-; FAB>0 (GT) 563 (M+H)+; [a] D20 -39, 05 (c = 1,05 em DMSO); UV (EtOH 95) Umax = 281 nm (ε = 9000), umin = 254 nm (ε = 4000), Umax = 229 nm (ε = 31000); Análise
Calculada para C23H19IN2O7: C, 49,13 H, 3,41 N, 4,98 I, 22,57. Determinada: C, 49,31 H, 3,53 N, 5,05 I, 22,36.
Reagentes:
Iodo: Fluka, 99,8%, ref. 57650
Nitrato de amónio e cério (CAN): Aldrich, >98,5%, ref. 21,547-3 3',5'-Di-O-benzoil-2'-desoxi-3-N-toluil-p-L-timidina (9) A uma solução do composto 1_ (86,6 g, 0,154 mol) em piridina anidra (1530 mL) contendo N-etildiisopropilamina (53,6 mL) adicionou-se em porções, a 0°C, cloreto de p-toluilo (40,6 mL) . A mistura reaccional foi agitada durante 2 h à temperatura ambiente, depois foi adicionada água para parar a reacção e a mistura reaccional foi extraída com cloreto de metileno. A fase orgânica foi lavada com água, seca sobre sulfato de sódio e evaporada até à secura para dar 3 ' , 5 ' -di-O-benzoil-2 ' -desoxi-3-ΛΤ- toluil-5-iodo-p-L-uridina (£) em bruto que pode ser utilizada no passo seguinte sem purificação adicional.
Uma solução da mistura em bruto £, acetato de paládio (3,44 g) , trifenilfosfina (8,0 g) em N-metilpirrolidinona (1375 mL) com trietilamina (4,3 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 45 min. Em seguida, adicionou-se tetrametilestanho (42,4 mL) gota a gota, a 0°C em atmosfera de árgon. Após agitação a 100-110°C de um dia para o outro, a mistura reaccional foi vertida em água e extraída com éter dietílico. A solução orgânica foi seca sobre sulfato de sódio e concentrada a pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica [eluente: gradiente por passos de acetato de etilo (0-10%) em tolueno] para dar o composto 9 como uma espuma (42,3 g, 48,3% para os 2 passos). 1H NMR (DMSO): δ ppm 8,3-7,2 (m, 15H, 2 C6H5CO, 1 CH3C6H4CO, H-6) , 6,29 (t, 1H, H-1', J = 7,0 Hz), 5,7 (m, 1H, H- 3'), 4,7-4,5 (m, 3H, H-5', H-5", H-4'), 2,7-2,6 (m, 2H, H-2' , H-2") ; FABCO, (GT) m/e 567 (M-H)-, 449 (M-CH3C6H4CO) ", 243 (B)“, 121 (C6H5COO)-; FAB>0 (GT) 1137 (2M+H)+, 569 (M+H)+, 325 (M-B)", 245 (B+2H)+, 119 (CH3C6H5CO)+ .
Reagentes:
Cloreto de p-toluilo, Aldrich, 98%, ref. 10,663-1 Di-isopropiletilamina: Aldrich,>99,5%, ref. 38,764-9 N-metilpirrolidinona: Aldrich,>99%, ref. 44,377-8 Acetato de paládio: Aldrich,>99,98%, ref. 37,987-5 Trifenilfosfina: Fluka,>97%, ref. 93092 Tetrametilestanho: Aldrich,>99%, ref. 14,647-1 2'-Desoxi-p-L-timidina
Uma solução do composto 9 (42,3 g, 0,074 mol) em metanol saturado com amoníaco (1850 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante dois dias. Após a evaporação do solvente, o resíduo foi diluído com água e lavado várias vezes com acetato de etilo. A camada aguosa foi separada, evaporada a pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica [eluente: gradiente por passos de metanol (0-10%) em cloreto de metileno] para dar 2'-desoxi-p-L-timidina (11,62 g, 64,8%), gue foi cristalizada de etanol; p.f. 185-188°C; 1H NMR (DMSO) : δ ppm 11,3 (s, 1H, N H) , 7,70 (s, 1H, H- 6), 6,2 (pt, 1H, Η-1'), 5,24 (d, 1H, OH-3', J = 4,2 Hz), 5,08 (t, 1H, OH- 5 ' , J = 5,1 Hz), 4,2 (m, 1H, H- 3'), 3,7 (m, 1H, H- 4'), 3,5-3,6 (m, 2H, H-5', H-5"), 2,1-2,0 (m, 2H, H-2 ' , H-2"); FABC0, (GT) m/e 483 (2M-H)-, 349 (M+T-H)-, 241 (M-H) “, 125 (B)-; FAB>0 (GT) 243 (M+H) +, 127 (B+2H)+; )+; [a] D20 13,0 (c = 1,0 em DMSO); UV (pH 1) J max 267 nm (ε = 9700), J min 234 nm (ε = 2 0 0 0).
Reagente:
Amónia metanólica: previamente saturada a -5°C, bem vedada e armazenada num congelador.
Exemplo 6 Sintese estereoselectiva de 2'-desoxi-β-L-inosina (β-L-dI) A β-L-dI foi sintetizada por desaminação da 2'-desoxi-p-L-adenosina (β-L-dA), seguindo um procedimento previamente descrito na série 9-D-glucopiranosilo (Ref: I.
Iwai, T. Nishimura e B. Shimizu, Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, W. W. Aorbach and R.S. Tipson, eds, John Wiley & Sons, Inc. New York, vol. 1, páginas 135-138 (1968)).
Assim, uma solução de β-L-dA (200 mg) numa mistura de ácido acético (0,61 mL) e água (19 mL) foi aquecida com nitrito de sódio (495 mg) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A solução foi então evaporada até à secura a pressão reduzida. Uma solução aquosa do resíduo foi aplicada numa coluna de resina de permuta iónica IR-120 (H+) e a coluna foi eluída com água. As fracções apropriadas foram recolhidas e evaporadas até à secura para dar β-L-dI pura que foi cristalizada de metanol (106 mg, 53% de rendimento não optimizado) : p.f. 209°-211°C; UV (H2O) , Àmax = 247 nm; íH-NMR (DMSO-de) 8,32 e 8,07 (2s, 1H cada, H-2 e H-8), 6,32 (pt, 1H, H-l; J = 6,7 Hz), 4,4 (m, 1H, H-3'), 3,9 (m, 1H, H-4'), 3,7-3,4 (m, 2H parcialmente ocultado por HOD, H-5', 5"), 2,6 e 2,3 (2m, 1H cada, H-2' e H-2"); espectro de massa (maduro, glicerol-tioglicerol, 1:1, v/v), FAB>0: 253 (m+H)+, 137 (base + 2H)+; FAB<0: 251 (m-H) “, 135 (base)-; [a] d20 = +19, 3 (— c 0,88, H20) .
Actividade anti-VHB dos compostos activos A aptidão dos compostos activos para inibir ο crescimento do virus em culturas de células 2.2.15 (células HepG2 transformadas com o virião da hepatite) pode ser avaliada como descrito em pormenor adiante.
Foi descrito um sumário e descrição do ensaio para efeitos anti-virais neste sistema de cultura e a análise do ADN do VHB (Korba e Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217). As avaliações antivirais são realizadas em duas passagens separadas das células. Todos os poços, em todas as placas, são semeados com a mesma densidade e ao mesmo tempo.
Devido às variações inerentes nos níveis de ambos ADN do VHB intracelular e extracelular, só depressões superiores a 3,5 vezes (para o ADN do virião do VHB) ou 3,0 vezes (para intermediários na replicação do ADN do VHB) dos níveis médios para estas formas de ADN do VHB em células não tratadas, são consideradas como sendo estatisticamente significativas (P<0,05) . Os níveis de ADN do VHB integrado em cada preparação de ADN celular (que permanece constante numa base por célula nestas experiências) são utilizados para calcular os níveis das formas intracelulares de ADN do VHB, garantindo assim que iguais quantidades de ADN celular são comparadas entre amostras separadas.
Os valores típicos para o ADN do virião do VHB em células não tratadas estão na gama de 50 a 150 pg/mL de meio de cultura (média de aproximadamente 7 6 pg/mL) . Os intermediários da replicação de ADN do VHB intracelular em células não tratadas estão na gama de 50 a 100 yg/pg de ADN celular (média de aproximadamente 74 pg/yg de ADN celular). Em geral, as depressões dos níveis de ADN intracelular do VHB devidas ao tratamento com compostos anti-virais são menos pronunciadas e ocorrem mais lentamente do que as depressões dos níveis do ADN do virião do VHB (Korba e Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217). O modo pelo qual são realizadas as análises de hibridação para estas experiências resulta numa equivalência de aproximadamente 1,0 pg de ADN intracelular do VHB para 2-3 cópias genómicas por célula e 1,0 pg/mL de ADN extracelular do VHB para 3 x 105 partículas virais/mL.
Exemplo 7
Foi testada a aptidão dos derivados trifosfato de β-L-dA, β-L-dC, β-L-dU, β-L-í ' -dG, β-L-dI e β-L-dT para inibir a hepatite B. A Tabela 1 descreve as actividades inibidoras comparativas dos trifosfatos de β-L-dT (β-L-dT-TP) , β-L-dC (β-L- dC-TP), β-L-dU (β-L-dU-TP) e β-L-dA (β-L-dA-TP) da ADN polimerase do vírus da hepatite de marmota (WHV) e ADN polimerases α, β e γ humanas.
Tabela 1
Exemplo 8 A actividade anti-vírus da hepatite B de β-L-dA, β-L-dC, β-L-dU, β-Β-2'-dG e β-L-dT foi testada em células Hep G-2 (2.2.15) transfectadas. A Tabela 2 ilustra o efeito de β-L-dA, β-L-dC, β- L-dU e β-L-dT contra a replicação do virus da hepatite B em células Hep G-2 (2.2.15) transfectadas.
Tabela 2
Exemplo 9 0 efeito de β-L-dA, β-L-dC e β-L-dT em associação no crescimento da hepatite B foi determinado em células 2.2.15. Os resultados estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 3
Cada associação produziu actividade anti-VHB que era sinérgica. Além disso, a associação de L-dA + L-dC + L-dT também foi sinérgica neste modelo.
Exemplo 10
Determinou-se a inibição da replicação da hepatite B em células 2.2.15 por β-L-dA e β-L-dC, sós ou em associação. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4
Exemplo 11
Foi determinada a eficácia de L-dA, L-dT e L-dC contra a infecção por hepadnavírus em marmotas (Marmota monax) cronicamente infectadas com o virus da hepatite de marmota (WHV). Este modelo animal da infecção por VHB é amplamente aceite e provou ser útil para a avaliação de agentes antivirais direccionados contra o VHB.
Protocolo:
Grupos experimentais (n = 3 animais/grupo de fármaco, n = 4 animais/controlo)
Grupo 1 controlo veiculo
Grupo 2 lamivudina (3TC) (10 mg/kg/dia)
Grupos 3-6 L-dA (0,01, 0,1, 1,0, 10 mg/kg/dia)
Grupos 7-10 L-dT (0,01, 0,1, 1,0, 10 mg/kg/dia)
Grupos 11-14 L-dC (0,01, 0,1, 1,0, 10 mg/kg/dia)
Os fármacos foram administrados por sonda oral uma vez por dia e foram recolhidas amostras de sangue nos dias 0, 1, 3, 7, 14, 21, 28 e nos dias pós-tratamento +1, + 3, +7, +14, +28 e +56. A avaliação da actividade e toxicidade foi baseada na redução do ADN do WHV no soro; transferência por gota, PCR quantitativa.
Os resultados estão ilustrados na Figura 3 e na
Tabela 5.
Tabela 5
Os dados mostram que a L-dA, L-dT e L-dC são altamente activas neste modelo in vivo. Em primeiro lugar, a carga virai é reduzida para níveis indetectáveis (L-dT) ou aproximadamente indetectáveis (L-dA, L-dC). Em segundo lugar, a L-dA, L-dT e L-dC são apresentadas como sendo mais activas do que a 3TC (lamivudina) neste modelo. Em terceiro lugar, a repercussão virai não é detectada durante pelo menos duas semanas depois de ser retirada a L-dT. Em quarto lugar, as curvas de resposta à dose sugerem que um aumento modesto da dose de L-dA e L-dC mostraria actividade antiviral semelhante à da L-dT. Em quinto lugar, todos os animais que receberam os fármacos aumentaram de peso e não foi detectada qualquer toxicidade relacionada com o fármaco.
Toxicidade dos compostos
As análises da toxicidade foram realizadas para avaliar se quaisquer efeitos antivirais observados são devidos a um efeito geral na viabilidade celular. 0 método utilizado é a medição do efeito de β-L-dA, β-L-dC e β-L-dT no crescimento celular, em ensaios clorogénicos com medula óssea humana em comparação com a lamuvidina. Os resultados estão apresentados na Tabela 6.
Tabela 6
Preparação de composições farmacêuticas
Os seres humanos que sofrem de qualquer das doenças aqui descritas, incluindo hepatite B, podem ser tratados por administração ao doente de uma quantidade eficaz de um fi-L-2'-desoxi^-L-eritro-pentofurano-nucleo- sido, por exemplo p-L-2'-desoxiadenosina, p-L-2'-desoxici-tidina, p-L-2'-desoxi-uridina, p-L-2'-desoxiguanosina ou β-L-2'-desoxitimidina ou um seu pró-fármaco ou sal farmaceuticamente aceitável na presença de um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Os materiais activos podem ser administrados por qualquer via apropriada, por exemplo, oralmente, parentericamente, intravenosamente, intradermicamente, subcutaneamente ou topicamente, em forma liquida ou sólida. 0 composto activo está incluído no veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável numa quantidade suficiente para administrar a um doente uma quantidade terapeuticamente eficaz de composto para inibir a replicação viral in vivo, sem causar efeitos tóxicos graves no doente tratado. Por "quantidade inibidora" significa-se uma quantidade do ingrediente activo suficiente para exercer um efeito inibidor determinado, por exemplo, por um ensaio como os aqui descritos.
Uma dose preferida do composto para todas as patologias acima mencionadas vai estar na gama de cerca de 1 a 50 mg/kg, preferencialmente 1 a 20 mg/kg, de peso corporal por dia, mais geralmente 0,1 a cerca de 100 mg por quilograma de peso corporal de quem recebe por dia. A gama de dosagem eficaz do prá-fármaco farmaceuticamente aceitável pode ser calculada com base no peso do nucleosido mãe a ser administrado. Se o próprio pró-fármaco apresenta actividade, a dosagem eficaz pode ser estimada como acima utilizando o peso do pró-fármaco, ou por outros meios conhecidos pelos peritos na técnica. 0 composto é convenientemente administrado em qualquer forma de dosaqem unitária adequada, incluindo mas não limitada a uma contendo 7 a 3000 mg, preferencialmente 70 a 1400 mg de ingrediente activo por forma de dosagem unitária. Uma dosagem oral de 50-1000 mg é normalmente conveniente.
Idealmente, o ingrediente activo deve ser administrado para se obter concentrações plasmáticas máximas do composto activo de cerca de 0,2 a 70 μΜ, preferencialmente cerca de 1,0 a 10 μΜ. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pela injecção intravenosa de uma solução com 0,1 a 5% do ingrediente activo, opcionalmente em soro fisiológico, ou administrada como um bolus do ingrediente activo. A concentração de composto activo na composição do fármaco vai depender da absorção, inactivação e velocidades de excreção do fármaco, bem como de outros factores conhecidos pelos peritos na técnica. Deve notar-se que os valores de dosagem também vão variar com a gravidade da patologia a ser aliviada. Deve ainda entender-se que para qualquer indivíduo em particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e com a avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as gamas de concentrações aqui apresentadas são apenas exemplificativas e não têm a intenção de limitar o âmbito ou a prática da composição reivindicada. 0 ingrediente activo pode ser administrado de uma só vez, ou pode ser dividido num número de doses mais pequenas para serem administradas a intervalos de tempo variáveis.
Um modo de administração preferido do composto activo é por via oral. As composições orais geralmente vão incluir um diluente inerte ou um veiculo comestível. Podem ser inseridos em cápsulas de gelatina ou submetidos a compressão em comprimidos. Para efeito da administração terapêutica oral, o composto activo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos, tro-ciscos ou cápsulas. Agentes aglutinantes farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição.
Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e outros semelhantes podem conter qualquer dos seguintes ingredientes ou compostos de uma natureza semelhante: um aglutinante como celulose microcristalina, goma tragacanta ou gelatina; um excipiente como amido ou lactose, um agente desintegrante como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante como dióxido de silício coloidal; um agente edulcorante como sacarose ou sacarina; ou um agente aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranja. Quando a forma de dosagem unitária é uma cápsula, pode conter, além do material do tipo acima referido, um veículo líquido tal como um óleo gordo. Além disso, as formas de dosagem unitárias podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar, goma-laca ou outros agentes entéricos. 0 composto pode ser administrado como um componente de um elixir, suspensão, xarope, hóstia, pastilha elástica ou outros semelhantes. Um xarope pode conter, para além dos compostos activos, sacarose como um agente edulcorante e certos conservantes, corantes e pigmentos e aromatizantes. 0 composto ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável ou os seus sais também podem ser misturados com outros materiais activos que não prejudicam a acção desejada, ou com materiais que suplementam a acção desejada, como antibióticos, antifúngicos, anti-inflama-tórios, inibidores de proteases, ou outros agentes antivi-rais nucleosidos ou não nucleosidos. As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmi-ca, subcutânea ou tópica podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril como água para injecção, soro fisiológico, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metilparabenos; anti-oxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetraacético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parentérica pode ser inserida em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.
Se administrada intravenosamente, os veiculos preferidos são soro fisiológico ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS).
Numa forma de realização preferida, os compostos activos são preparados com veiculos que vão proteger o composto contra a eliminação rápida do organismo, como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, como etileno-acetato de vinilo, polianidridos, ácido poliglicó-lico, colagénio, poliortoésteres e ácido polilacético. Os métodos para a preparação dessas formulações serão evidentes para os especialistas na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente na Alza Corporation.
As suspensões lipossomais (incluindo lipossomas orientados para as células infectadas com anticorpos monoclonais para antigénios virais) são também preferidas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos pelos peritos na técnica, por exemplo, como descrito na patente U.S. N° 4522811. Por exemplo, as formulações lipossomais podem ser preparadas por dissolução do(s) lípido(s) apropriado(s) (como estearoil-fosfatidil-etanolamina, estearoil-fosfati-dil-colina, aracadoil-fosfatidil-colina e colesterol) num solvente inorgânico que é depois evaporado, deixando para atrás uma película fina de lípido seco na superfície do recipiente. É então introduzida no recipiente uma solução aquosa do composto activo ou dos seus derivados monofos-fato, difosfato e/ou trifosfato. 0 recipiente é depois rodado manualmente para libertar o material lípidico livre das paredes do recipiente e para dispersar os agregados lipidicos, formando assim a suspensão lipossomal.
Esta invenção foi descrita com referência às suas formas de realização preferidas. As variações e modificações da invenção serão evidentes para os peritos na técnica a partir da descrição pormenorizada anterior da invenção. Pretende-se que todas essas variações e modificações estejam incluídas na medida em que estiverem dentro do âmbito das reivindicações.
Lisboa, 2 de março de 2015

Claims (17)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de β-L-timidina de fórmula:
    ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de uma infecção pela hepatite B num ser humano.
  2. 2. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 1, em que o composto ou sal é
  3. 3. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 1, em que o composto ou sal é um sal f armaceuticamente aceitável.
  4. 4. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o composto ou sal se destina a ser administrado a um ser humano por via oral.
  5. 5. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o composto ou sal se destina a ser administrado numa forma de dosaqem unitária.
  6. 6. Composto ou sal de acordo com a reivindicação 5, em que a forma de dosaqem unitária está numa dosaqem oral de 50-1000 mq.
  7. 7. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5, em que o composto ou sal se destina a ser administrado como um comprimido oral.
  8. 8. Composto ou sal de acordo de acordo com a reivindicação 7, em que o comprimido compreende celulose microcristalina, goma tragacanta, gelatina, amido, lactose, ácido algínico, Primogel, amido de milho, estearato de magnésio, Sterotes, dióxido de silício coloidal, sacarose, sacarina, hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranj a.
  9. 9. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o composto ou sal se destina a ser administrado numa dose de 1 a 20 mg/kg de peso corporal por dia.
  10. 10. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o composto ou sal se destina a ser administrado num nível de pelo menos 95% da estereoconfiguração designada.
  11. 11. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o ser humano tem uma infecção crónica persistente pelo virus da hepatite B.
  12. 12. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que o ser humano tem uma infecção crónica pelo virus da hepatite B.
  13. 13. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que o ser humano tem uma infecção crónica do fígado causada pelo vírus da hepatite B.
  14. 14. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que o ser humano tem cirrose, hepatite aguda, hepatite fulminante, hepatite persistente crónica ou fadiga.
  15. 15. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que o ser humano é positivo a anticorpos anti-VHB ou positivo a VHB.
  16. 16. Composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o composto ou sal se destina a ser administrado ao ser humano numa quantidade terapeuticamente eficaz para inibir a replicação viral in vi vo.
  17. 17. Utilização de um composto ou sal de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma infecção por hepatite B num ser humano, em que o tratamento opcionalmente tem a(s) característica (s) de qualquer das reivindicações 4 a 16. Lisboa, 2 de março de 2015
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