PT1383526E - Terapia de imunização para o tratamento de aterosclerose - Google Patents
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Description
1
DESCRIÇÃO "TERAPIA DE IMUNIZAÇÃO PARA O TRATAMENTO DE ATEROSCLEROSE" Área técnica A presente invenção refere-se a um anticorpo purificado ou produzido de modo recombinante contra um fragmento da apolipoproteína B com a sequência para utilização em medicina, e respectivas composições.
Também são descritos aqui péptidos novos, em particular péptidos a serem utilizados para terapia de imunização para o tratamento de aterosclerose, e para 0 desenvolvimento de ELISA à base de péptidos com a finalidade de determinar respostas imunológicas contra lipoproteinas de baixa densidade oxidadas e diagnóstico da presença ou ausência de aterosclerose.
Também são aqui descritas, mas não explicitamente reivindicadas: 1) A utilização de qualquer um dos péptidos listados na tabela 1, isoladamente ou em combinação, nativos ou modificados por MDA, preferivelmente em conjunto com um transportador e adjuvante adequados, como imunoterapia ou "vacina anti-aterosclerose" para a prevenção e tratamento de doença cardiovascular isquémica. 2) A utilização dos mesmos péptidos em ELISA para a detecção de anticorpos relacionados com risco aumentado ou decrescido de desenvolvimento de doenças cardiovasculares isquémicas. 2
Contexto A aterosclerose é uma doença crónica que causa um espessamento da camada mais interna (a intima) de artérias de grande e média dimensão. Diminui o fluxo sanguíneo e pode causar isquemia e destruição de tecidos em órgãos fornecidos pelo vaso afectado. A aterosclerose é a principal causa de doença cardiovascular, incluindo enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral e doença de artéria periférica. É a principal causa de morte no mundo ocidental e prevê-se que se torne na principal causa de morte em todo o mundo num período de duas décadas. A doença é iniciada pela acumulação de lipoproteínas, principalmente lipoproteína de baixa densidade (LDL), na matriz extracelular do vaso. Estas partículas de LDL agregam-se e sofrem modificação oxidativa. A LDL oxidada é tóxica e causa lesões vasculares. A aterosclerose representa, em muitos aspectos, uma resposta a esta lesão, incluindo inflamação e fibrose.
Em 1989, Palinski e colaboradores identificaram autoanticorpos em circulação contra LDL oxidada em humanos. Esta observação sugeriu que a aterosclerose pode ser uma doença autoimune causada por reacções imunológicas contra lipoproteínas oxidadas. Nesta altura, vários laboratórios começaram a procurar associações entre títulos de anticorpos contra LDL oxidada e doença cardiovascular. No entanto, o cenário que emergiu destes estudos estava longe de ser claro. Existiam anticorpos contra um grande número de epítopos diferentes em LDL oxidada, mas a estrutura destes epítopos era desconhecida. Assim, o termo "anticorpos para LDL oxidada" referia-se a uma mistura desconhecida de diferentes anticorpos e não a um anticorpo 3 específico. Anticorpos IgM independentes de células T eram mais frequentes do que anticorpos igG dependentes de células T.
Anticorpos contra a LDL oxidada estavam presentes em pacientes com doença cardiovascular e em controlos saudáveis. Apesar de alguns estudos iniciais terem relatado associações entre títulos de anticorpos para LDL oxidada e doença cardiovascular, outros foram incapazes de encontrar tais associações. Uma fragilidade importante destes estudos foi o facto dos testes de ELISA utilizados para determinar títulos de anticorpos terem empregado partículas de LDL oxidada como ligando. A composição da LDL é diferente em indivíduos diferentes, é difícil controlar e avaliar o grau de modificação oxidativa e não é possível determinar níveis de anticorpos contra os diferentes epítopos nas partículas de LDL oxidada. Em certa extensão, devido a problemas técnicos, tem sido difícil avaliar o papel de respostas de anticorpos contra LDL oxidada utilizando as técnicas disponíveis até à data; todavia, não é possível criar componentes de uma vacina bem definidos e reprodutíveis se for pretendido utilizar partículas de LDL oxidada intacta.
Outro modo de investigar a possibilidade de reacções autoimunes contra LDL oxidada na parede vascular desempenharem um papel-chave no desenvolvimento de aterosclerose consiste em imunizar animais contra a sua própria LDL oxidada. A ideia por detrás desta abordagem é que, se reacções autoimunes contra LDL oxidada forem reforçadas utilizando técnicas clássicas de imunização, isto originará inflamação vascular aumentada e progressão de aterosclerose. Para testar esta hipótese, coelhos foram imunizados com LDL oxidada homóloga e depois induziu-se 4 aterosclerose alimentando os animais com uma dieta rica em colesterol durante 3 meses.
No entanto, em contraste com a hipótese original, a imunização com LDL oxidada teve um efeito protector, reduzindo a aterosclerose em cerca de 50%. Também se obtiveram resultados semelhantes num estudo subsequente em que a dieta rica em colesterol foi combinada com lesão por balão vascular, para produzir um desenvolvimento mais agressivo de placas. Em paralelo com os nossos estudos, vários laboratórios diferentes relataram observações semelhantes. Considerados em conjunto, os dados disponíveis demonstram claramente que existem reacções imunológicas que protegem contra o desenvolvimento de aterosclerose e que estas envolvem autoimunidade contra LDL oxidada.
Estas observações também sugerem a possibilidade de desenvolver uma terapia imunológica ou "vacina" para o tratamento de doença cardiovascular à base de aterosclerose no homem. Uma abordagem para fazê-lo consistiria em imunizar um indivíduo com a sua própria LDL depois de ter sido oxidada por exposição, por exemplo, a cobre. No entanto, esta abordagem é complicada pelo facto de não se conhecer qual a estrutura na LDL oxidada que é responsável por induzir a imunidade protectora e se a LDL oxidada também poderá conter epítopos que podem dar origem a reacções imunológicas adversas. A identificação de epítopos na LDL oxidada é importante por vários motivos.
Em primeiro lugar, é provável que um ou vários destes epítopos sejam responsáveis pela activação da resposta 5 imunológica antiaterogénica observada em animais imunizados com LDL oxidada. Em consequência, péptidos que contêm estes epítopos podem representar uma possibilidade para o desenvolvimento de uma terapia imunológica de "vacina para a aterosclerose" no homem. Além disso, podem ser utilizados para o tratamento terapêutico de aterosclerose desenvolvida no homem.
Em segundo lugar, péptidos que contêm os epítopos identificados podem ser utilizados para desenvolver ELISAs capazes de detectar anticorpos contra uma estrutura específica na LDL oxidada. Esses ELISAs seriam mais precisos e fiáveis do que os presentemente disponíveis utilizando partículas de LDL oxidada como antigene. Também permitiriam analisar respostas imunológicas contra diferentes epítopos na LDL oxidada associados a doença cardiovascular. A patente US 5,972,890 refere-se a uma utilização de péptidos para diagnosticar aterosclerose. A técnica apresentada na referida patente US é, em princípio, uma forma de diagnóstico radiofísico. Uma sequência peptídica é etiquetada de forma radioactiva e é injectada na corrente sanguínea. Se esta sequência peptídica for idêntica a sequências presentes na apolipoproteína B, ligar-se-á ao tecido onde há receptores presentes para a apolipoproteína B. Em vasos, isto consiste maioritariamente em placa aterosclerótica. A concentração de radioactividade na parede do vaso pode então ser determinada, por exemplo, por uma câmara gama. Assim, a técnica é um método de diagnóstico radiofísico com base no facto de sequências peptídicas etiquetadas de forma radioactiva se ligarem aos seus receptores de tecidos normais presentes em placa 6 aterosclerótica e serem detectadas utilizando uma análise de radioactividade externa. É um método de análise directa para identificar placa aterosclerótica. Requer que sejam administrados compostos radioactivos ao paciente. A técnica descrita aqui baseia-se em princípios e métodos muito diferentes e refere-se a fragmentos da apolipoproteina B para imunização contra doença cardiovascular, bem como um método para diagnosticar reacções imunológicas contra sequências peptídicas da apolipoproteina B. Por sua vez, foi mostrado que essas reacções imunológicas estão aumentadas em indivíduos com aterosclerose desenvolvida. A técnica baseia-se em acoplar sequências peptídicas à base de cavidades poliméricas. Quando se adiciona uma amostra de sangue, aos péptidos ligar-se-ão anticorpos que são específicos para estas sequências. Depois determina-se a quantidade de anticorpos ligados utilizando um método/técnica imunológica. Assim, em contraste com a técnica da referida patente US, isto não é um método de determinação directa para identificar e localizar placa aterosclerótica, mas determina uma resposta imunológica que exibe um grau elevado de covariação com a extensão da aterosclerose.
Assim, o princípio básico da técnica descrita aqui é bastante diferente do da referida patente US. 0 último depende da ligação de sequências peptídicas aos receptores normais das lipoproteínas presentes em tecido aterosclerótico, ao passo que o primeiro se baseia na descoberta de reacções imunológicas contra sequências peptídicas e determinação de anticorpos para estas sequências peptídicas. 7
Estudos publicados (Palinski et al., 1995, e George et al., 1998) mostraram que a imunização contra LDL oxidada reduz o desenvolvimento de aterosclerose. Isto indicaria que reacções imunológicas contra LDL oxidada em geral têm um efeito protector. Todavia, os resultados apresentados aqui mostraram surpreendentemente que nem sempre é este o caso. Por exemplo, imunização utilizando uma mistura de péptidos # 10, 45, 154, 199 e 240 originou um aumento do desenvolvimento de aterosclerose. Imunização utilizando outras sequências peptídicas, por exemplo, as sequências peptídicas # 1 e 30 até 34 não tem um efeito total no desenvolvimento de aterosclerose. Os resultados são surpreendentes porque proporcionam base para o facto de reacções imunológicas contra LDL oxidada poderem proteger contra o desenvolvimento, contribuir para o desenvolvimento de aterosclerose e não terem nenhum efeito, dependendo das estruturas na LDL oxidada para as quais são dirigidas. Estas descobertas permitem desenvolver métodos de imunização que isolam a activação de reacções imunológicas protectoras. Além disso, mostram que a imunização utilizando LDL oxidada intacta pode ter um efeito prejudicial se as partículas utilizadas contiverem um nível elevado de estruturas que dão origem a reacções imunológicas aterogénicas. A patente W098/42751 refere-se a uma molécula que tem uma sequência polipeptídica conjugada a MDA e que inibe a captação pelo receptor da LDL de elevada afinidade da LDL, ou respectiva forma parcialmente modificada. A patente W098/56938 refere-se a materiais e métodos para o transporte e distribuição in vivo de ácidos nucleicos, em particular a utilização de lipoproteínas (incluindo lipoproteínas de baixa densidade: "LDL") e/ou apo-lipoproteinas para a ligação de um transporte de ácidos nucleicos. Adicionalmente, refere-se à utilização de lipoproteínas na detecção precoce de cancro e/ou cancro metastático e/ou arteriosclerose. A patente W099/18986 refere-se a um método de tratamento de aterosclerose num sujeito, que compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de uma substância capaz de se ligar à região amino-terminal da apolipoproteína B, desse modo tratando a aterosclerose. A patente W099/08109 refere-se à utilização de um painel de anticorpos monoclonais de ratinho, que se ligam a partículas de LDL oxidada, para determinar a presença de LDL oxidada no soro e plasma. Assim, isto é totalmente diferente da técnica descrita aqui que envolve um método para determinar anticorpos contra LDL oxidada. A patente US 4,970,144 refere-se a um método para preparar anticorpos por intermédio de imunização utilizando sequências peptídicas, cujos anticorpos podem ser utilizados para a determinação de apolipoproteínas utilizando ELISA. Assim, isto é ainda mais diferente da técnica descrita aqui. A patente US 5,861,276 descreve um anticorpo recombinante para a forma normal da apolipoproteína B. Este anticorpo é utilizado para determinar a presença de apolipoproteína B normal no plasma e soro e para tratar aterosclerose por diminuição da quantidade de partículas de LDL normal na circulação. 9
Assim, na presente invenção é descrita a utilização de anticorpos para tratar aterosclerose, como definido nas reivindicações. No entanto, contrariamente à patente US 5,861,276, estes anticorpos são dirigidos para estruturas presentes em partículas de LDL oxidada, e não para a partícula normal de LDL. A vantagem é que se trata da LDL oxidada, que supostamente dá origem ao desenvolvimento de aterosclerose. A utilização de anticorpos dirigidos para estruturas específicas da LDL oxidada não é descrita na referida patente US.
Resumo da invenção A presente invenção refere-se a um anticorpo purificado ou produzido de modo recombinante contra um fragmento da apolipoproteína B com a sequência "SEJGLEe&CGFEPTLEALFQSC para utilização em medicina, e respectivas composições.
Crê-se que a oxidação de lipoproteínas, principalmente LDL, na parede arterial é um factor importante no desenvolvimento de aterosclerose. Os produtos gerados durante a oxidação da LDL são tóxicos para células vasculares, causam inflamação e iniciam a formação de placas. Epítopos na LDL oxidada são reconhecidos pelo sistema imunológico e dão origem à formação de anticorpos. Experiências com animais mostraram que algumas destas respostas imunológicas têm um efeito protector contra aterosclerose. Em geral, os anticorpos são dirigidos quase exclusivamente contra estruturas à base de péptidos. Utilizando uma biblioteca de polipéptidos abrangendo a sequência completa da única proteína presente na LDL, apolipoproteína B, foram identificados os epítopos na LDL oxidada que dão origem à formação de anticorpos no homem. 10
Estes péptidos-epítopos podem ser utilizados para desenvolver ELISAs com a finalidade de estudar associações entre respostas imunológicas contra LDL oxidada e doença cardiovascular e para desenvolver uma imunoterapia ou "vacina" anti-aterosclerose para a prevenção e tratamento de doença cardiovascular isquémica.
Descrição pormenorizada da invenção A presente invenção é definida nas reivindicações adjuntas, com referência aos exemplos adjuntos.
Foi realizada uma caracterização molecular dos epitopos na LDL oxidada que dão origem a respostas imunológicas dependentes de anticorpos no homem. A abordagem utilizada tira partido do facto de reacções imunológicas serem dirigidas quase exclusivamente contra sequências peptídicas com 5-6 aminoácidos de comprimento. A LDL só contém uma proteína, a apolipoproteína B com 4563 aminoácidos de comprimento. Durante a oxidação, a apolipoproteína B é fragmentada e adutos de aldeído são acoplados a aminoácidos com carga positiva, em particular lisina. Isto significa que sequências peptídicas normalmente não expostas devido à estrutura tridimensional da apolipoproteína B se tornam acessíveis a células imunológicas e/ou que sequências peptídicas normalmente expostas se tornam imunogénicas devido a haptenização com aldeídos.
Foi assim determinado que os péptidos seguintes, nativos ou derivados de MDA, possuem eficiência como produtores de uma resposta imunológica, estes péptidos são: 11
FLDTVYGN CS TH FTVKTRKG PQCSTHILQWLKRVHANPLL VI SI PRLQAEARSEILAHWS
KLVKEALKE SQLPTVMDFRK LKFVT QAEGAKQTEATMTFK DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ SLTSTSDLQSGIIKNTASLK TASLKYENYELTLKSDTNGK DMTFS KGNALLRSEYQADYE M KVKIIRTIDQMQN SELQWP
IALDDAKIN FN EKLSQLQTY KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
EE EMLENVSLVCPKDATRFK GSTS Η H LVS RKSISAALEH K IENIDFN ΚΞ GSSTASWIQNV
IREVTQRLN GE IQALELPQK EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
H TFLIYITELU<KLQSTTVM
LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
CTGDEDYTYKIKRVIGN MGQ
GNMGQTMEQLTPELKSSILK
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IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
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ΤΥΙΞ DWWTLAAKN LTD FAE Q
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ALLVP P E T E EAKQVLFLD TV IEIGLEGKGFEPTLEALFGK SGASMKLTTNGRFREHNAKF NLIGDFEVAEKINAFRAKVH GH SVLTAKGM ALFGE GKAEF FKSSVITLN TN AE LFNQSDI FPDLGQEVALNANTKNQKIR,]3em COmo o péptido não produtor de anticorpos ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS ou um sítio activo de um ou mais destes péptidos. 12
Formas de realização preferidas da invenção serão agora descritas a titulo de exemplos não limitativos referindo-nos às figuras adjuntas.
Materiais e métodos
Para determinar quais as partes da apolipoproteína B que se tornam imunogénicas em resultado da oxidação da LDL produziu-se uma biblioteca de polipéptidos consistindo em péptidos com 20 aminoácidos de comprimento abrangendo a sequência completa da apolipoproteína B humana. Estes péptidos foram produzidos com uma sobreposição de 5 aminoácidos, para abranger todas as sequências em pontos de quebra. Os péptidos foram utilizados no estado nativo, ou após incorporação em lipossomas fosfolipídicos, após oxidação por exposição a cobre ou após modificação por malona desaldeído (MDA), para imitar as diferentes modificações dos aminoácidos que podem ocorrer durante a oxidação da LDL. Péptidos
Os 302 péptidos correspondentes à sequência de aminoácidos completa da apolipoproteína B humana foram sintetizados (Euro-Diagnostica AB, Malmõ, Suécia, e KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Dinamarca) e utilizados em ELISA. Uma fracção de cada péptido sintético foi modificada por MDA 0,5 M (Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suécia) durante 3 horas a 37°C, e na presença de lipossomas por MDA 0,5 M durante 3 horas a 37°C, ou por CuCl2 5 μΜ (Sigma) durante 18 horas a 37°C. Os péptidos modificados por MDA foram dialisados contra PBS que continha EDTA 1 mM, com várias mudas, durante 18 horas a 4°C. Testou-se a modificação dos péptidos em géis de poliacrilamida desnaturada (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), adequados 13 para a separação de péptidos. Os péptidos foram numerados 1 - 302, começando na extremidade N-terminal da proteína.
Podem utilizar-se outros aldeídos para preparar derivados, como hidroxinonenal e outros.
Lipossomas
Uma mistura de fosfatidilcolina do ovo (EPC) (Sigma) e fosfatidilserina (PS) (Sigma) numa solução de clorofórmio, a uma razão molar 9:1 e a uma concentração de 3 mM de fosfolípido (PL), foi evaporada num recipiente de vidro sob uma corrente suave de árgon. Em seguida, o recipiente foi colocado sob vácuo durante 3 horas. Adicionou-se ao filme seco de EPC/PS uma solução que continha péptido 0,10 mM (5 mL) em tampão HEPES 10 mM esterilizado por filtração pH 7,4, NaCl 145 mM e azida de sódio 0,003% e o sistema foi incubado durante 15 minutos a 50°C. A mistura foi suavemente submetida a vórtice durante cerca de 5 minutos à temperatura ambiente, depois foi colocada num banho de água gelada e foi sonicada com 7,5 mícrones de amplitude durante 3x3 minutos (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Medlab, Suécia) com interrupções de 1 minuto. A mistura PL-péptido, nativo ou modificado por MDA 0,5 M durante 3 horas a 37°C ou CuCl2 5 mM durante 18 horas a 37°C, foi armazenada sob árgon em frascos de vidro a 4°C envoltos em folha de alumínio e utilizados num período de 1 semana. A mistura modificada por MDA foi dialisada contra PBS que continha EDTA 1 mM, com várias mudas, durante 18 horas a 4°C antes do armazenamento. Testou-se a modificação da mistura em géis de poliacrilamida desnaturada (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, Suécia), adequados para a separação de péptidos.
Amostras de plasma 14
Recolheram-se e reuniram-se amostras de plasma de 10 pacientes com doença cardiovascular (AHP) e 50 amostras de plasma, 25 mulheres e 25 homens, de dadores de sangue normais (NHP) . As duas reuniões foram separadas em aliquotas e armazenadas a -80°C.
ELISA Péptidos sintéticos, nativos ou modificados, diluídos em PBS pH 7,4 (20 μρ/πΛ) , na presença ou ausência de lipossomas, foram absorvidos em cavidades de placas de microtítulo (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) numa incubação durante a noite a 4°C. Como referência, processou-se em cada placa um dos péptidos (P6). Após lavagem com PBS que continha Tween-20 0, 05% (PBS-T) , as placas revestidas foram bloqueadas com SuperBlock em TBS (Pierce, Rockford, IL) durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma incubação de plasma humano reunido, AHP ou NHP, diluído 1/100 em TBS-Tween-20 0,05% (TBS-T) durante 2 horas à temperatura ambiente e depois durante a noite a 4°C. Após enxaguamento, detectou-se a deposição de autoanticorpos dirigidos para os péptidos utilizando anticorpos IgG ou IgM de coelho anti-humanos biotinilados (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) apropriadamente diluídos em TBS-T. Após outra incubação durante 2 horas à temperatura ambiente, lavaram-se as placas e detectaram-se os anticorpos biotinilados ligados por estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (Sigma), incubada durante 2 horas à temperatura ambiente. A reacção de cor foi desenvolvida utilizando um estojo de substrato de fosfatase (Pierce) e mediu-se a absorvância a 405 nm após 1 hora de incubação à temperatura ambiente. Os valores da absorvância dos diferentes péptidos foram divididos pelo valor da absorvância de P6 e comparados. 15
As sequências da apolipoproteína B que foram reconhecidas por anticorpos em plasma humano estão apresentadas como Id. Seq. 1-37 na figura adjunta. Tanto AHP como NHP continham anticorpos para um grande número de péptidos diferentes. Identificaram-se anticorpos contra péptidos nativos e modificados. Em geral, os títulos de anticorpos para péptidos modificados por MDA foram mais elevados ou iguais aos do péptido nativo correspondente. A comparação entre péptidos nativos, modificados por MDA, oxidados com cobre revelou um grau elevado de correlação, e os títulos mais elevados de anticorpos foram detectados utilizando péptidos modificados por MDA. A utilização de péptidos incorporados em lipossomas não originou níveis aumentados de anticorpos. Os anticorpos da subclasse IgM foram mais comuns do que anticorpos do subtipo IgG.
Os péptidos contra os quais se detectaram os níveis mais elevados de anticorpos foram divididos em seis grupos com características comuns (Tabela 1): (A) Níveis elevados de anticorpos IgG para péptidos modificados por MDA (n=3). (B) Níveis elevados de anticorpos IgM, mas sem diferenças entre péptidos nativos e modificados por MDA (n=9). (C) Níveis elevados de anticorpos IgG, mas sem diferenças entre péptidos nativos e modificados por MDA (n=2) . (D) Níveis elevados de anticorpos IgG para péptidos modificados por MDA e pelo menos duas vezes a quantidade de anticorpos na reunião NHP em comparação com a reunião AHP (n=5). 16 (E) Níveis elevados de anticorpos IgM para péptidos modificados por MDA e pelo menos duas vezes a quantidade de anticorpos na reunião NHP em comparação com a reunião AHP (n=ll). (F) Níveis elevados de anticorpos IgG, mas sem diferenças entre péptidos intactos e modificados por MDA, mas pelo menos duas vezes a quantidade de anticorpos na reunião AHP em comparação com a reunião NHP (n=7). (G) Nenhum nível de anticorpos IgG ou IgM.
Tabela 1
A. IgG elevado, diferença MDA P 11. RDTWG^CSIHRWRKS
P 25. ^OGSTHlLOWLKBVHÂ^PLL P 74. VISiWiOAEÃRSeLAH^
B. IgM elevado, sem diferençai MDA P 40. KLYK£ALK.ESQLPTVltôDFRi&.
P 68. LKFVTOAE^AKQTEATlíTFK
P 94. D^RHKFlDSNIKF^iWEK p 9 3.
P 100. RL^GíSSNtRFNSSYlOíaTNO P 102. SLTS1H)LQ8GIÍICNTAStK: P 103. TASlKYiNVaTUCSDTNaí
p 105. DyfFFSKQ^I&LLRSEYQ&DYE
P 177. MKVKI iRTIDQMQNSELOWP
C. IgG elevado, sem diferença MDA
P 143. IALOOAK! N FH EKLSQLQTY
P 210 . KTIKQSFOL.SV'KAQ¥KKNKH
17 D. NHS/AHP, IgG-a.k > 2, diterença MNA PI . SEEMIEMVSLVGPKDATRFK P 12 9. QS7SHHLVSRKSBAALEHK P 148. ENSOF^KSSSSTASWIQ^V P 16 2. IREVTQRiNGEIQALELPQK P 252 . EtfDVlTKYSQPEDSUPFFE E. NHS/AHP, IgM-ak > 2, diderença MDA P 301 . H7FUVn'EL0KKIQSlTVM P 30. LLDiANYUMSQIODDGTGDE P 31 . CTGDEDYWKiKRVSSWIGQ P 32, a^GQTOSQlPPteiKSSSlK P 33 . SSikkCyOSTKPSLMiQKAA P 34, fâKAAÈQAiRkMEPKOKDQE P 100. RUNGSmRFNâSYlQGTNQ P 107. SLNSHQLELNADl.STDKSN P 14 9. WiQNVDTKYQ! RK3SQBCLQ P 16 9 . TYiSDWWrTLAAKPCTDFAEQ P 236. EATiQ;R5¥SL.WE:HSTK:RHLQ F. NHS/AHP, IgG-ak < 0,5, sem diferença MDA P 10 , ALLVPPETEEftKQVLRSTV P 45, tE!GLEGKGFEPTLEAL.FfâK P 111. S fâ AS Μ K L 'ΠΤϋ G B FR E H ^ AKf P 15 4, NUODFe/AEKiííAFRAKVH P 199. fâHSVLTAKSMALFGEGkAEF P 222 . FKSSYiTU^RAELFNQSDi P 240 . FPOLSQEyAiLNANFKNCjKIR Ρ 2 .
ATRFKHLRKYTYNYQAC^SS 18
Estas 38 sequências peptídicas representam alvos para reacções imunológicas que podem ser importantes para o desenvolvimento de aterosclerose e doenças cardiovasculares isquémicas. Em consequência, estes péptidos podem ser utilizados para desenvolver ELISAs para determinar as associações entre níveis de anticorpos contra sequências definidas de aminoácidos modificados por MDA na apolipoproteína B e o risco de desenvolvimento de doença cardiovascular.
Estes péptidos também representam possíveis mediadores da imunidade protectora observada em animais experimentais imunizados com LDL oxidada, e podem ser utilizados para a realização de testes no desenvolvimento suplementar de uma terapia de imunização ou "vacina" contra aterosclerose.
Assim, foram identificadas 38 sequências diferentes da proteína apolipoproteína B humana que dão origem a respostas imunológicas significativas no homem. É provável que estes epítopos representem o que foi previamente descrito como anticorpos para LDL oxidada. Uma vez que a maior parte das respostas imunológicas é dirigida contra sequências peptídicas e a apolipoproteína B é a única proteína da LDL, a abordagem utilizada neste projecto deve conseguir identificar os epítopos específicos para essencialmente todos os anticorpos contra partículas de LDL oxidada. Foi descrito que uma família de anticorpos específicos para fosfolípidos, incluindo anticorpos contra a cardiolipina, reage com LDL oxidada, mas a especificidade e o papel destes anticorpos ainda não foram completamente caracterizados. 19
Em muitos casos, os títulos de anticorpos foram mais elevados para polipéptidos modificados por MDA do que para sequências nativas. Quando se detectaram anticorpos contra uma sequência modificada por MDA, estavam quase sempre associados à presença de anticorpos contra a sequência nativa. Uma explicação provável para este facto é que a resposta imunológica contra uma sequência de aminoácidos modificada por MDA na apolipoproteína B (em que a modificação por MDA ocorre em resultado da oxidação da LDL) conduz a uma quebra de tolerância contra a sequência nativa. Para outras sequências não se observaram diferenças nos títulos de anticorpos contra sequências modificadas por MDA ou nativas. Isto sugere que as reacções imunológicas são dirigidas contra as sequências nativas. Não deve ocorrer nenhuma resposta imunológica contra sequências de aminoácidos em proteínas normalmente expostas ao sistema imunológico. Na partícula de LDL nativa, grandes partes da proteína apolipoproteína B estão escondidas na camada f osf olipídica da LDL e, em consequência, não estão acessíveis ao sistema imunológico. Durante a oxidação da LDL, a cadeia de aminoácidos da apolipoproteína B é fragmentada, conduzindo a alterações da estrutura tridimensional. É provável que isto conduza a exposição de sequências peptídicas normalmente não acessíveis ao sistema imunológico e a geração de anticorpos contra estas sequências, que podem explicar a presença observada de anticorpos contra sequências da apolipoproteína B nativa. Alternativamente, a verdadeira resposta imunológica dá-se contra sequências modificadas por MDA, mas a reactividade cruzada com sequências nativas é tão grande que não é possível demonstrar diferenças na ligação.
Tabela 2. 20
Associações entre anticorpos para diferentes péptidos e aterosclerose na artéria carótida avaliada como espessura da íntima/média em 78 sujeitos (26 sujeitos que posteriormente desenvolveram enfarte do miocárdio, 26 controlos saudáveis e 26 indivíduos de alto risco sem doença).
[Péptido to G IqM ..................... Hativo modificado MDA Hativo modificado MDA 1 301 4 I 10 + 4 11 44· 4 1 25 * 44 444 1 30 44 1 31 44 i 32 | I 33 4 [34 4 45 44 444 74 ++ + 4 44 99 100 4 4+ 102 ' B { 103 4 η #5 Ο j 129 «+ 44+ 143 44 4 148 4 154 444 44 162 * 44 m i 210 * 240 ... i .......................- 44 +, r > 0,2 < 0,3, p =< 0,05; ++, r > 0,3 < 0,4, p = 0,01; + + + , r > 0,4, p =< 0,01, cinzento, níveis de anticorpos para péptidos aumentados significativamente no grupo que sofre de enfarte do miocárdio.
Num estudo piloto investigou-se a possibilidade de os ELISAs baseados nestes péptidos (nativos ou modificados por MD A) poderem ser utilizados para determinar associações entre reacções imunológicas contra epítopos definidos na LDL oxidada e presença e/ou risco de desenvolvimento de 21 doença cardiovascular. 0 estudo foi realizado em sujeitos participantes no Malmõ Diet Câncer Study, um estudo baseado na população para o qual foram recrutados mais de 30 000 indivíduos entre 1989 e 1993. Determinaram-se níveis de anticorpos contra 24 dos 38 péptidos listados na Tabela 1 em amostras de plasma de referência de 26 sujeitos que desenvolveram enfarte agudo do miocárdio durante o período de pós-observação e 26 controlos saudáveis correspondentes quanto à idade, sexo e hábitos de fumar. Também se incluiu um grupo adicional de 26 sujeitos, correspondentes quanto à idade, sexo e hábitos de fumar, mas com níveis de colesterol LDL superiores a 5,0 mmol/L, para estudar níveis de anticorpos num grupo de alto risco que não desenvolveu doença cardiovascular.
Para 19 dos 24 péptidos analisados identificaram-se correlações significativas entre os níveis de anticorpos IgM contra péptidos modificados por MDA e a gravidade de aterosclerose na artéria carótida (espessura da íntima/média) , avaliado por investigação com ultra-sons da artéria carótida comum, isto é, quanto mais elevados os níveis de anticorpos mais aterosclerose (Tabela 2). Para muitos destes péptidos também se observaram correlações significativas entre os níveis de anticorpos para péptidos nativos e a espessura da íntima/média da carótida. Apenas 4 péptidos exibiram uma correlação significativa entre anticorpos IgG e espessura da íntima/média da carótida. Estas observações sugerem que ELISA utilizando estes péptidos modificados por MDA (isoladamente ou em combinação) pode ser utilizado para identificar sujeitos com aterosclerose aumentada. 22
Quatro dos péptidos testados não só estavam associados a presença aumentada de aterosclerose mas também estavam significativamente elevados no grupo de sujeitos que mais tarde sofreram enfarte do miocárdio (Tabela 2). Apresentam-se na Fig. 7 dados para um destes péptidos (péptido 240) . Estas observações também demonstram que ELISA à base de péptidos também pode ser utilizado para identificar sujeitos com um risco acrescido de desenvolverem enfarte do miocárdio.
Também se notaram aumentos significativos dos níveis de anticorpos IgG para os péptidos nativos 103, 162 e 199, bem como 102 modificado por MDA no grupo que mais tarde sofreu enfarte do miocárdio. No entanto, os anticorpos IgG contra estes péptidos não estavam significativamente associados à presença de aterosclerose na artéria carótida.
Uma observação particularmente interessante relativamente aos anticorpos contra o péptido 210 modificado por MDA foi que se observaram níveis significativamente mais elevados de anticorpos IgM nos controlos saudáveis e no grupo de alto risco (colesterol LDL superior a 5,0 mmol/L) do que no grupo que desenvolveu enfarte do miocárdio. Em conformidade, anticorpos contra o péptido 210 modificado por MDA podem representar um marcador para indivíduos com um risco decrescido de desenvolver doença cardiovascular.
Foi agora demonstrado que a imunização com sequências peptídicas da apo B-100 nativas e modificadas por MDA origina inibição de aterosclerose em animais experimentais (Nordin Fredrikson, Soderberg et al., Chyu et al.). Os mecanismos pelos quais operam estas respostas imunológicas 23 ateroprotectoras ainda não foram completamente elucidados. No entanto, uma possibilidade provável é que o efeito ateroprotector seja mediado por anticorpos gerados contra estas sequências peptídicas. Por exemplo, estes anticorpos podem facilitar a remoção de partículas LDL danificadas de modo oxidativo por receptores Fc de macrófagos.
Receptores de remoção de macrófagos só reconhecem LDL com extensos danos oxidativos (9). Estudos recentes identificaram a existência de LDL oxidada em circulação (10, 11). Estas partículas têm danos oxidativos que são apenas mínimos e não são reconhecidas por receptores de remoção. A ligação de anticorpos a estas partículas de LDL oxidada em circulação pode ajudar a removê-las da circulação antes de se acumularem no tecido vascular (12). Vários estudos defenderam um papel para anticorpos na protecção contra aterosclerose. A reconstituição de células B inibe o desenvolvimento de aterosclerose em ratinhos nulos para apo E esplenectomizados (13), bem como formação de neo-íntima após lesão da carótida em ratinhos RAG-1 (observações não publicadas do nosso laboratório). Além disso, foi mostrado que injecções repetidas de imunoglobulinas reduzem aterosclerose em ratinhos nulos para apo E (6).
Como discutido acima, anticorpos contra sequências peptídicas modificadas por MDA na apo B-100 podem ser gerados por imunização activa utilizando péptidos sintéticos. Este procedimento requer 2-3 semanas antes de se obter um efeito completo na produção de anticorpos. 24
Nalgumas situações poderá ser necessário um efeito mais rápido. Um exemplo pode ser placas ateroscleróticas instáveis nas quais é provável que a LDL oxidada contribua para inflamação, toxicidade celular e risco de ruptura das placas. Nestas circunstâncias, uma imunização passiva por injecção de anticorpos purificados ou produzidos de modo recombinante contra sequências nativas e modificadas por MDA poderá ter um efeito mais rápido.
Outra situação em que uma injecção passiva por injecção de anticorpos purificados ou produzidos de modo recombinante pode ser eficaz é doença cardíaca coronária em indivíduos mais idosos. Os nossos estudos mostraram que ocorre um decréscimo de anticorpos contra sequências peptídicas da apo B com o aumento da idade no homem e que está associado a um aumento do nível no plasma de LDL oxidada (Nordin Fredrikson, Hedblad et al.). Isto pode sugerir uma senescência das células imunológicas responsáveis pela produção de anticorpos contra antigenes na LDL oxidada e resultar numa remoção deficiente da circulação de partículas de LDL danificadas de modo oxidativo. Em conformidade, estes sujeitos beneficiariam mais de uma imunização passiva por injecção de anticorpos purificados ou produzidos de modo recombinante do que de uma imunização activa com sequências peptídicas da apo B-100 .
Os péptidos nativos sintéticos (Euro-Diagnostica AB, Malmõ, Suécia) utilizados no que se segue foram os péptidos 1, 2 e 301 da biblioteca de polipéptidos rastreada inicialmente. 25
Verificou-se que o péptido 1 (sequência de aminoácidos: ÊMLÊNmVCTOATRFK, n=10) e 0 péptido 301 (sequência de aminoácidos: HTFLmmLKKLQSTmi, n=10) têm uma resposta de anticorpos IqG ou IqM mais elevada à forma modificada por MDA do que ao péptido nativo, respectivamente, e ambos os títulos são mais elevados no sujeito saudável. Escolheram-se estes péptidos com base na hipótese de que a resposta de anticorpos a estes péptidos poderá ser protectora contra aterosclerose. O péptido 2 (sequência de aminoácidos: ^TRfKHlBKfTTNY€M.QiÍSS, n=10) não induziu resposta de anticorpos no rastreio inicial de anticorpos; assim, foi escolhido como péptido de controlo. Os ratinhos que receberam Alum serviram de controlo (n=9).
Ratinhos apo E (-/-) receberam uma imunização primária subcutânea às 6-7 semanas de idade, seguida de um reforço intraperitoneal 3 semanas mais tarde. Os ratinhos foram alimentados com uma dieta rica em colesterol desde o início da imunização, que continuou até ao sacrifício com a idade de 25 semanas. Na altura do sacrifício não se registaram diferenças significativas do peso do corpo entre 4 grupos de ratinhos. Nem houve diferenças estatisticamente significativas no colesterol no soro, medidas utilizando um estojo comercialmente disponível (Sigma). Os seus níveis médios de colesterol no soro foram todos superiores a 715 mg/dL.
Mediu-se a área da aorta descendente abrangida por placa aterosclerót ica numa preparação en face após coloração com vermelho de óleo 0. Em comparação com o grupo de controlo, os ratinhos imunizados com os péptidos N° 2 e 26 Ν° 301 tinham aterosclerose substancialmente reduzida (Figura 2) . A imunização com o Péptido N° 1 não produziu uma redução significativa de aterosclerose em comparação com o controlo. Em contraste com a aorta descendente, a extensão de aterosclerose na raiz aórtica e arco aórtico não diferiu entre os 4 grupos experimentais (Figura 3). Não se observaram diferenças entre 4 grupos em termos da dimensão da placa do seio aórtico ou o seu teor de lipidos (Tabela A) . As dimensões médias das placas nos arcos aórticos de 4 grupos de ratinhos não foram diferentes. No entanto, a avaliação en face de dimensões de placas da aorta torácica e abdominal descendente por coloração com vermelho de óleo 0 revelou que o grupo de controlo e grupo com péptido N° 1 tinham quantidades semelhantes de placa aterosclerótica na aorta, ao passo que os grupos dos péptidos N° 2 e N° 9 tinham uma carga aterosclerótica significativamente reduzida na aorta (Tabela A) . A observação de que a imunização com péptidos não afectou a dimensão da placa do seio aórtico ou arco aórtico mas reduziu a placa aórtica descendente é intrigante e sugere que a imunização com péptidos poderá reduzir a formação de novas placas mas não afecta a progressão de placas.
Também se testou se a imunização com péptidos modula o fenótipo de placas ateroscleróticas. Secções congeladas de placas do seio aórtico foram coradas de forma imuno-histoquímica com anticorpo para monócitos/macrófagos (MOMA-2, Serotec). Concordando com as descobertas da observação en face, o péptido N° 2 reduziu significativamente a infiltração de macrófagos nas placas (Figura 1) . A coloração com Trichrome revelou um teor médio de colagénio 27 de 40,0 ± 7,7% nas placas do seio aórtico do grupo do péptido 2, ao passo que o teor médio de colagénio no grupo de controlo de alum, grupo do péptido 1 e grupo do péptido 9 foi 32,3 ± 5,3%, 35,6 ± 8,5% e 29,4 ± 9,6%, respectivamente.
Determinou-se a resposta de anticorpos contra péptidos imunizados em cada grupo. O titulo de anticorpos após a imunização aumentou 6,1 ± 3,1 vezes no grupo do péptido 1, 2,4 ± 1,0 vezes no grupo do péptido 2 e 1,8 + 0,6 vezes no grupo do péptido 9, ao passo que o grupo de alum exibiu um aumento de 3,9 ± 2,7 vezes do titulo de anticorpos contra o péptido 1, aumento de 2,0 ± 0,5 vezes contra o péptido 2 e aumento de 2,0 ± 0,9 vezes contra o péptido 9. É surpreendente o aumento paralelo do titulo de anticorpos contra péptidos imunizados tanto no grupo imunizado como no grupo tratado com alum. Isto pode significar as seguintes possibilidades: (1) mecanismo(s) diferente(s) de resposta imunológica humoral (como resposta imunológica celular) podem estar envolvidos na modulação de aterosclerose, ou (2) este aumento de anticorpos foi uma resposta "by-stander" a hipercolesterolemia com o tempo.
Apesar de não haver nenhum mecanismo especulativo claro para explicar por que motivo a imunização com péptidos reduziu aterosclerose e/ou modula o fenótipo de placas, a novidade desta invenção é o conceito de utilizar péptidos da LDL como imunogene e a sua exequibilidade como estratégia de imunomodulação. Esta estratégia de imunização à base de péptidos modula placas ateroscleróticas. Tinha sido mostrado que a imunização utilizando oxLDL homóloga ou LDL nativa como antigene reduz a dimensão de placas1-3; no entanto, a disponibilidade, produção, contaminação 28 infecciosa e segurança da LDL humana homóloga tornam esta abordagem pouco atractiva para aplicação clínica. Demonstra-se aqui que a imunoterapia à base de péptidos é exequível, apesar dos nossos resultados finais diferirem da nossa hipótese inicial, segundo a qual a imunização utilizando péptidos com respostas mais elevadas de anticorpos IgM ou IgG em sujeitos normais pode proteger animais experimentais de desenvolverem placas ateroscleróticas avançadas. É surpreendente descobrir que a imunização utilizando o péptido N° 2 protegeu animais de desenvolverem novas lesões ateroscleróticas na aorta descendente e reduziu a infiltração de macrófagos e um teor mais elevado de colagénio em placas, pois este péptido não induziu nenhuma resposta de anticorpos do rastreio humano inicial. Isto pode dever-se a (a) o péptido N° 2 pode ser uma parte da estrutura da proteína apo-B-100 humana que não estava exposta ao sistema imunológico humano; assim, não foram gerados nem detectados anticorpos em reuniões de soro humano saudável; (b) a sequência de aminoácidos do péptido N° 2 é estranha para ratinhos; em consequência, ratinhos desenvolveram uma resposta imunológica contra este péptido, que modula a formação de novas lesões ateroscleróticas e o seu fenótipo. 0 efeito da imunização com LDL homóloga na dimensão de placas variou quando se avaliaram dimensões de placas em diferentes porções da árvore aórtica. Por exemplo, Ameli et ai. mostraram, no coelho hipercolesterolémico, que a imunização com LDL nativa originou uma redução da formação de placas na aorta1, ao passo que Freigang et al. mostraram ocorrer redução da dimensão de placas no seio aórtico mas 29 não na aorta2. Considerando em conjunto as suas descobertas e as presentes, especulou-se que a imunização com péptidos modula não só dimensões de placas mas também a composição de placas. 0 efeito de redução de placas só se observou na aorta descendente. É conhecido que ratinhos apo E (-/-) desenvolvem lesões ateroscleróticas em várias fases da evolução num único animal, especialmente quando alimentados com uma dieta rica em colesterol. 0 aparecimento inicial de lesão aterosclerótica no animal jovem deu-se no seio aórtico6,7 e, passadas 15 semanas a uma dieta rica em gorduras e rica em colesterol, as lesões no seio aórtico eram placas avançadas, ao passo que a fase inicial de aterosclerose estava presente na aorta descendente6. Uma vez que o decurso temporal da maturação e desenvolvimento de placas na aorta descendente é tardio em comparação com o do seio aórtico, a descoberta de que a imunização reduziu dimensões de lesões na aorta descendente mas não no seio aórtico sugeriu que a imunização afectou a fase inicial da formação de aterosclerose. É possível que, à medida que o animal envelheceu e na presença de um nível supra-fisiológico de colesterol no soro, o efeito de redução de placas da imunização seja ultrapassado pelo efeito tóxico de hipercolesterolemia. Também é possível que placas do seio aórtico amadureçam mais rapidamente e que o sacrifício às 25 semanas seja demasiado tardio para se detectar qualquer diferença na dimensão das placas. Apesar da dimensão da lesão não ter sido modulada na placa do seio aórtico, a imunização com péptido modulou as composições das placas. A presente concepção experimental impediu o estudo da composição das placas na sua fase de desenvolvimento inicial na aorta descendente. 30
As descobertas experimentais salientam a exequibilidade de utilizar sequências peptídicas de apo B-100 associada a LDL como imunogenes para uma nova abordagem destinada a prevenir aterosclerose e/ou a modular favoravelmente o fenótipo de placas apesar de hiperlipidemia grave. Esta estratégia de imunização à base de péptidos é potencialmente vantajosa comparativamente à utilização de oxLDL homóloga ou LDL nativa como antigene, pois essa estratégia pode eliminar a necessidade de isolamento e preparação de LDL homóloga e seus riscos concomitantes de contaminação. O efeito de redução de placas da imunização com os Péptidos N° 2 e 301 só foi observado na aorta descendente. Estas descobertas são consistentes com relatos anteriores, onde também foi mostrado que outras intervenções terapêuticas têm maior efeito na aorta descendente em comparação com o arco aórtico14-17, presumivelmente porque se desenvolvem lesões mais rapidamente na raiz e no arco aórticos do que na aorta descendente, criando assim uma janela de oportunidade mais pequena para intervenção14,15,16'18'19. Uma vez que o decurso temporal da maturação e desenvolvimento de placas na aorta descendente é tardio em comparação com o do seio aórtico e do arco aórtico, a descoberta de que a imunização reduziu dimensões de lesões na aorta descendente mas não no seio nem no arco aórticos sugere que a imunização previne preferencialmente a fase inicial da formação de aterosclerose. É possível que, à medida que o animal envelheceu e na presença de um nível supra-fisiológico de colesterol no soro, o efeito de redução de placas da imunização seja ultrapassado pelo efeito tóxico de hipercolesterolemia grave. Apesar da dimensão das lesões não ter sido modulada no seio ou arco aórticos, a imunização com o Péptido N° 2 modulou a composição de 31 placas numa direcção favorável, criando um fenótipo de placas mais estáveis com infiltração reduzida de macrófagos e teor aumentado de colagénio. Em resumo, é demonstrada uma nova abordagem imunomoduladora à base de péptidos para inibição de aterosclerose no modelo murino.
Em resumo, é demonstrada uma nova abordagem imunomoduladora à base de péptidos na modulação de placas ateroscleróticas. Apesar da alteração da formação de aterosclerose no nosso modelo ter sido apenas modesta, ainda assim esta imunização à base de péptidos pode proporcionar uma ferramenta alternativa no estudo, prevenção ou tratamento de aterosclerose. Métodos
Preparação de péptidos. Prepararam-se péptidos utilizando o estojo Imject® SuperCarrie® EDC (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante com pequenas modificações. Misturou-se 1 mg de péptido em 500 μΕ de tampão de conjugação com 2 mg de transportador em 200 μΙ; de água desionizada. Em seguida, esta mistura foi incubada com 1 mg de reagente de conjugação (EDC, l-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida HC1) à temperatura ambiente durante 2 horas. Este sistema foi então dialisado contra solução de fosfato de sódio 0,083 M, cloreto de sódio 0,9 M pH 7,2 durante a noite a 4°C. O conjugado dialisado foi diluído com tampão de purificação de combinação seca Imject para um volume final de 1,5 mL. Utilizou-se alum como imunoadjuvante, tendo sido misturado com o conjugado de péptido com uma diluição 1:1 em volume. A quantidade de péptido em cada imunização foi 33 μρ/100 μΕ por injecção. 32
Protocolo de animais. Ratinhos apo E (-/-) da Jackson Laboratories (Bar Harbor, Me) receberam uma imunização primária subcutânea às 6-7 semanas de idade, seguida de um reforço intraperitoneal 3 semanas mais tarde. Os ratinhos foram alimentados com uma dieta rica em colesterol desde o inicio da imunização, que continuou até ao sacrificio com a idade de 25 semanas. Recolheram-se amostras de sangue 2 semanas após o reforço e na altura do sacrificio. Ratinhos que receberam Alum serviram de controlo. 0 protocolo experimental foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee do Cedars-Sinai medicai Center. Todos os ratinhos foram alojados em instalações para animais validadas pela American Association of Accreditation of Laboratory Animal Care, foram mantidos num ciclo de 12 horas de dia/noite e tiveram acesso livre a água e alimentos. Na altura do sacrificio, os ratinhos foram anestesiados por inalação de Enflurano. Obteve-se plasma por hemorragia retro-orbital antes do sacrificio.
Recolha e seccionamento de tecidos. Para avaliar o efeito da imunização com péptidos na formação de aterosclerose avaliou-se a dimensão das placas no seio aórtico, arco aórtico e aorta torácica e abdominal descendente. Depois do coração e da árvore aórtica terem sido submetidos a perfusão com solução salina normal à pressão fisiológica, o coração e a aorta próxima foram excisados, embutidos em composto OCT (Tissue-Tek) e seccionados no estado congelado. Recolheram-se secções em série de 6 μιη de espessura desde o aparecimento de pelo menos 2 válvulas aórticas até ao desaparecimento das abas das válvulas aórticas, para a avaliação de placas no seio aórtico. Tipicamente colocaram-se numa lâmina 3 secções consecutivas, recolheu-se um total de 25-30 lâminas de um 33 ratinho e cada quinta lâmina foi agrupada para coloração. A aorta ascendente e arcos aórticos até à artéria subclávia esquerda também foram seccionados e processados de modo semelhante. A aorta torácica e abdominal descendente foi processada separadamente para avaliação en face da formação de placas após coloração com vermelho de óleo 0. Preparação en face da aorta torácica e abdominal descendente.
Albumina de ovo de galinha (Sigma), numa concentração de 0,8 g/mL de água, foi misturada 1:1 com glicerol. Adicionou-se azida de sódio para perfazer uma concentração final de azida de sódio 0,2%. Depois de se ter limpo a aorta torácica e abdominal descendente de tecido envolvente e gordura, o segmento da aorta desde a artéria subclávia esquerda até ao nivel da artéria renal foi então cuidadosamente removido para fixação durante a noite em Histochoice (Amresco). A aorta foi depois cuidadosamente aberta longitudinalmente e colocada, com o lado luminal para cima, numa lâmina revestida de fresco com solução de albumina de ovo. Depois da solução de albumina ter secado, a aorta foi corada com Vermelho de óleo 0, para avaliar a extensão da aterosclerose com histomorfometria auxiliada por computador.
Imuno-histoquimica e Histomorfometria. As secções do seio aórtico foram coradas de forma imuno-histoquimica com anticorpo MOMA-2 (Serotec) utilizando um protocolo comum. Realizou-se coloração com Trichrome, para avaliar o teor de colagénio, e coloração com vermelho de óleo 0, para a dimensão das placas e teor de lípidos, utilizando um protocolo comum de coloração. Efectuou-se análise morfométrica auxiliada por computador para avaliar a histomorfometria como descrito previamente8. 34
Medição do título de anticorpos. Desenvolveu—se um ELISA para medir a resposta de anticorpos após a imunização com péptido. Mediu-se o título de anticorpos contra o péptido imunizado utilizando sangue recolhido às 2 semanas após o reforço e na altura do sacrifício. Também se determinou a resposta de anticorpos contra 3 péptidos no grupo de Alum nos mesmos instantes. Em resumo, péptidos sintéticos nativos diluídos em PBS pH 7,4 (20 μρ/πΛ) foram absorvidos em cavidades de placas de microtítulo (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) numa incubação durante a noite a 4°C. Após lavagem com PBS que continha Tween-20 0,05% (PBS-T), as placas revestidas foram bloqueadas com SuperBlock em TBS (Pierce) durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma incubação de soro de ratinho diluído 1/50 em TBS-Tween-20 0,05% (TBS-T) durante 2 horas à temperatura ambiente e depois durante a noite a 4°C. Após enxaguamento, detectou-se a deposição de anticorpos dirigidos para os péptidos utilizando anticorpos Ig de coelho anti-ratinho biotinilados (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) apropriadamente diluídos em TBS-T. Após outra incubação durante 2 horas à temperatura ambiente, lavaram-se as placas e detectaram-se os anticorpos biotinilados ligados por estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (Sigma), incubada durante 2 horas à temperatura ambiente. Utilizando um estojo de substrato de fosfatase (Pierce) desenvolveu-se a reacção colorida e mediu-se a absorvância a 405 nm após 1 hora de incubação à temperatura ambiente. Calcularam-se valores médios depois de subtraído o fundo.
Outros modelos de ensaio também são obviamente aplicáveis, como qualquer imunoensaio que detecte um anticorpo, como um imunoensaio radioactivo, coloração "Western" e coloração "Southern", bem como detecção de 35 anticorpos ligados a péptidos, eléctrodos de enzimas e outros métodos de análise.
Estatística
Os dados estão apresentados em média ± Padrão. 0 método estatístico utilizado está listado no texto, tabela ou legenda de figura. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Tabela A Dimensão de placas no seio aórtico e seu teor de lípidos, dimensão de placas no arco aórtico e percentagem de placas na aorta descendente.
Dimensão total das placas no seio aórtico {rnrrn Are,:· vermelho de óleo (+) {% de placas no seio aórtico) Dimensão das placas no arco aórtico (iTim2) % de placas na aorta (prep. plana) AI um 0,49+0,13 21,7±4,4 0,057±0,040 20±4,7 Péptido .1 0,48+0,14 32,0±8,1 0,054+0,027 17+4,3 Péptido 2 0,52±0,I2 23,8±3,o 0,078+0,022 6,3 + 1,9 s Pépt ido .i 01 0,46 + 0, .1 & 2 3, 8 ± 4, .1 0,050+0,024 8,9+2,2* * Significa tivarnente difer ente do grupo de Aluis. Utilizou -se ANOVA seguida cio teste cie Tukev- Krataer para a , i n á 1 i s e e s t a t í s 11 ca,
Outros dados relativos ao efeito da imunização com sequências peptídicas da apolipoproteína B-100 na aterosclerose em ratinhos "knockout" para apo E estão apresentados abaixo na Tabela B. 36
Tabela B
Efeito da imunização com sequências peptídicas da apolipoproteína B-100 na aterosclerose em ratinhos "knockout" para apo E. Imunizações utilizando misturas de várias sequências peptídicas Ete.itg na. aterosclerose na aorta 1. Sequências peptídicas 143 e 210 ... Q Ç. s. O f Ό o 2 . Sequências peptídicas 11/ 15 e 74 -59,6% *3 Sequências peptídicas 129, 148 e 167 -56,8% 4. Sequências peptídicas 99, 100, 102, 103 e 105 -40,1 % ·.· Λ Sequências peptídicas 30, 31, 32, 33 e 3 4 + 6, 6% 6 * Sequências peptídicas .10, 45, 154, 193 e 2 40 +17,8%
Imunizações utilizando uma única sequência peptídica 1. Sequência peptídica 2 -67,7% 2 . Sequência peptídica 210 -57,9% '0 „ Sequência peptídica 301 -55,2% 4. Sequência peptídica 45 -47,4% b. Sequência peptídica 74 -31,0% 6. Sequência peptídica 1 — IR ã 2-J. J, ‘IO 7- Sequência peptídica 240 *v 'tf A administração dos péptidos é normalmente efectuada por injecção, como injecção subcutânea, injecção intravenosa, injecção intramuscular ou injecção intraperitoneal. Uma primeira dosagem de imunização pode ser 1 até 100 mg por paciente, dependendo do peso do corpo, idade e outras condições físicas e médicas. Em situações particulares também é possível uma administração local de uma solução contendo um ou mais dos péptidos via cateter nos vasos coronários. Também podem ser contempladas preparações orais, apesar de ser necessário tomar 37 precauções particulares para admitir absorção na corrente sanguínea. Uma dosagem de injecção pode conter 0,5 até 99,5% por peso de um ou mais dos fragmentos ou péptidos aqui descritos.
Os péptidos são normalmente administrados ligados a albumina do soro bovino cationizada e utilizando como adjuvante hidróxido de alumínio. Também podem utilizar-se outros adjuvantes conhecidos na área.
Soluções para administração dos péptidos não devem conter EDTA nem antioxidantes.
Os péptidos também podem ser utilizados como agentes terapêuticos em pacientes que já sofrem de uma aterosclerose. Assim, qualquer via de administração adequada pode ser utilizada para adicionar um ou mais dos fragmentos ou péptidos descritos aqui.
Estudos iniciais centraram-se em determinar qual o tipo de modificações oxidativas de péptidos conducentes ao reconhecimento por anticorpos no plasma humano. Estes estudos foram realizados utilizando os péptidos 1-5 e 297-302. Durante a oxidação da LDL, ácidos gordos poli-insaturados em fosfolípidos e ésteres de colesterilo sofrem peroxidação conducente à formação de produtos de decomposição altamente reactivos, como malondesaldeído (MDA) . Em seguida, o MDA pode formar adutos covalentes na apo B-100 com resíduos lisina e histidina, tornando-os altamente imunogénicos. A oxidação da LDL também origina a fragmentação da apo B-100, que pode conduzir à exposição de sequências peptídicas normalmente não acessíveis ao sistema imunológico. Nestas experiências utilizaram-se péptidos no 38 seu estado nativo, após modificação por MDA ou após incorporação em lipossomas fosfolipidicos, seguido de oxidação por cobre ou modificação por MDA. Identificaram-se anticorpos IgM contra péptidos nativos, MDA e oxidados em lipossomas, em que os títulos de anticorpos foram péptido-MDA > péptidos em lipossomas modificados por MDA > péptido oxidado em lipossomas > péptido nativo. A realização de testes de especificidade demonstrou que a ligação de anticorpos a péptidos modificados por MDA sofria competição pela MDA-LDL e LDL oxidada com cobre.
Seguidamente realizámos um rastreio da biblioteca completa de péptidos utilizando plasma reunido derivado de sujeitos de controlo saudáveis e péptidos nativos e modificados por MDA como antigenes. Identificaram-se anticorpos para um grande número de sítios na apo B-100. Utilizando duas vezes a absorvância do controlo de fundo como limite do título positivo, detectaram-se anticorpos contra 102 dos 302 péptidos que constituem a sequência completa da apo B-100. A ligação de IgM foi substancialmente mais abundante do que a de IgG. Em geral, a ligação foi mais elevada para sequências peptídicas modificadas por MDA do que para a sequência nativa correspondente, mas observou-se uma correlação notável entre as duas. A ligação a sequências nativas e modificadas por MDA sofreu competição por adição de LDL modificada por MDA e LDL oxidada com cobre, mas não pela LDL nativa. Estas observações sugerem que respostas imunológicas contra sequências peptídicas modificadas por MDA na apo B-100 originam reactividade cruzada contra sequências nativas. A incapacidade da LDL nativa para competir com a ligação de anticorpos a sequências peptídicas nativas da apo B-100 é intrigante, mas poderá indicar que estas sequências só 39 ficam expostas após a degradação proteolítica da apo B-100 que ocorre em resultado da oxidação da LDL. Tanto partes hidrófilas como hidrófobas da molécula foram reconhecidas por anticorpos. Realizou-se um segundo rastreio da biblioteca de péptidos da apo B-100 utilizando plasma reunido de sujeitos com sinais clínicos de doença cardíaca coronária (CHD, enfarte agudo do miocárdio (AMI) e angina instável; n=10). Anticorpos em plasma CHD reunido ligaram-se às mesmas sequências e com a mesma distribuição global de anticorpos no plasma de controlo saudável. No entanto, títulos de anticorpos para vários péptidos (# 1, 30-34, 100, 107, 148, 149, 162, 169, 236, 252 e 301) foram pelo menos duas vezes tão elevados como no plasma de controlo em comparação com plasma de sujeitos com CHD, ao passo que títulos contra alguns péptidos (# 10, 45, 111, 154, 199, 222 e 240) foram mais elevados no plasma de pacientes com CHD em comparação com controlos. Depois realizámos um estudo clínico de expectação para investigar se níveis de anticorpos contra sequências peptídicas modificadas por MDA na apo B-100 seriam uma previsão do risco de desenvolvimento de CHD. Utilizando uma concepção de casos-controlos encaixados seleccionámos 78 sujeitos com eventos coronários (AMI ou morte devido a CHD) e 149 controlos do Malmõ Diet Câncer Study. Nem os casos nem os indivíduos de controlo tinham um historial de MI ou acidente vascular cerebral prévio. O tempo mediano desde a inclusão até ao evento coronário agudo foi 2,8 anos (gama 0,1 - 5,9 anos) entre os casos. Determinaram-se níveis de anticorpos em amostras de plasma de referência suplementadas com antioxidantes. Utilizando a espessura da íntima-média (IMT) da carótida, avaliada por ultra-sonografia na referência, também analisámos associações entre níveis de anticorpos e grau de doença vascular existente. Estudámos 8 sequências 40 peptídicas modificadas por MDA que nos estudos de rastreio iniciais estavam associadas a níveis elevados de anticorpos no plasma (# 74, 102 e 210) e/ou a diferenças acentuadas entre reuniões de plasma de controlo e com CHD (# 32, 45, 129, 162 e 240). Verificou-se que os controlos têm níveis mais elevados de IgM contra o péptido MDA 74 (0,258, gama 0 - 1,123 unidades de absorvância versus 0,178, gama 0 -0,732 unidades de absorvância, p < 0,05), quanto ao restante não se observaram diferenças em níveis de anticorpos entre casos e controlos. Observaram-se associações entre a IMT e IgM contra os péptidos-MDA # 102, 129 e 162 (r = 0,233, 0,232 e 0,234, respectivamente, p < 0,05) em casos e entre IMT e o péptido-MDA 45 (r = 0,18, p < 0,05) em controlos. Observaram-se correlações fracas entre anticorpos para o péptido MDA 12 9 e o colesterol total e de LDL (r = 0,19 e r = 0,19, p < 0,01, respectivamente), quanto ao restante, os níveis de anticorpos para péptidos não exibiram associações com o colesterol total no plasma, colesterol LDL, colesterol HDL ou triglicéridos no plasma. Houve covariações fortes entre os níveis de anticorpos para os diferentes péptidos (valores r variaram desde 0,6 até 0,9). A única excepção consistiu em anticorpos contra o péptido-MDA 74, que estavam fracamente ou não estavam de todo relacionados com anticorpos contra os outros péptidos.
Os anticorpos contra todas as sequências exceptuando o péptido-MDA 74 estavam inversamente associados à idade entre os casos (valores r que variaram desde -0,38 até -0,58, p < 0,010,001), mas não nos controlos. Em contraste, os níveis no plasma de LDL oxidada aumentaram com a idade. Mais uma vez, esta associação foi mais forte nos casos do que nos controlos. Para investigar se as associações entre 41 respostas imunológicas contra sequências peptídicas modificadas por MDA e doença cardiovascular eram diferentes em diferentes grupos de idades, realizou-se uma análise de subgrupos nos casos e controlos abaixo e acima da idade mediana (61 anos). No grupo de idades menores, os casos exibiram níveis aumentados de anticorpos contra os péptidos 32 e 45 e níveis decrescidos de anticorpos contra o péptido 74 em comparação com os controlos, ao passo que não se observaram diferenças no grupo de idades maiores. Anticorpos contra todas as sequências peptídicas MDA, exceptuando o péptido 74, estavam significativamente associados à IMT no grupo de idades menores, mas não nos mais velhos (Tabela).
Estes estudos identificam algumas sequências modificadas por MDA na apo B-100 que são reconhecidas por anticorpos humanos. A modificação por MDA da apo B-100 ocorre devido a oxidação da LDL, indicando que estes anticorpos pertencem à família de auto-anticorpos para LDL oxidada previamente descrita. Esta noção também é suportada pela observação de que a ligação de anticorpos a péptidos da apo B-100 modificados por MDA sofre competição por adição de LDL oxidada. Juntamente com os fosfolípidos oxidados identificados por Hõrkkõ et al., é provável que estas sequências peptídicas modificadas por MDA constituam a grande maioria de estruturas antigénicas na LDL oxidada. De modo semelhante aos anticorpos anti-fosfolípidos da LDL oxidada, os anticorpos contra sequências da apo B-100 modificadas por MDA eram do tipo IgM. Isto pode sugerir que também os últimos anticorpos pertencem à família de anticorpos naturais T 15. Aos anticorpos T 15 foi atribuído um papel importante na defesa inicial independente de células T contra infecções bacterianas, bem como na remoção 42 de células apoptóticas. Ainda não foi determinado se os anticorpos para péptidos-MDA descritos aqui têm funções semelhantes. Também se identificaram anticorpos contra um grande número de sequências da apo B-100 nativas. No entanto, a covariação notável entre anticorpos para sequências nativas e modificadas por MDA sugere que também estes anticorpos são formados em resposta à oxidação da LDL. Também é possível que anticorpos contra uma sequência peptídica modificada por MDA reajam de forma cruzada com a sequência nativa correspondente. Se anticorpos contra sequências nativas da apo B-100 também se ligarem a partículas de LDL nativas, é provável que isto tenha grande influência no metabolismo da LDL. Contudo, a descoberta de que a LDL nativa não compete com a ligação de anticorpos a sequências nativas da apo B-100, bem como a ausência de correlação entre anticorpos contra sequências nativas da apo B-100 e níveis de colesterol LDL são contrárias à existência desses fenómenos.
Os anticorpos contra sequências peptídicas modificadas por MDA diminuíram progressivamente com a idade nos casos, mas não nos controlos. Exceptuando o péptido-MDA 74, anticorpos IgM contra péptidos-MDA estavam significativamente associados à IMT da carótida no grupo de idades menores (inferiores a 62 anos), mas não no grupo de idades maiores. Estas descobertas sugerem que ocorrem alterações significativas nas interacções entre o sistema imunológico e a parede vascular aterosclerótica entre os 50 e os 70 anos de idade. Uma possibilidade é que, nos indivíduos mais novos, o processo de doença aterosclerótica esteja numa fase mais activa, com um envolvimento predominante de células imunológicas. Outra possibilidade é que os níveis decrescidos de anticorpos contra sequências 43 peptídicas modificadas por MDA em sujeitos mais idosos reflictam uma senescência das células imunológicas envolvidas em aterosclerose. Foi proposto que uma função enfraquecida de células imunológicas devido a imunossenescência contribui para uma susceptibilidade aumentada a infecção e cancro na população mais idosa. É interessante notar que a imunossenescência é inibida por antioxidantes, indicando envolvimento de "stress" oxidativo. É provável que células imunológicas que interagem com epítopos na LDL oxidada estejam particularmente expostas a "stress" oxidativo. Uma vez que a LDL oxidada já está presente em artérias em idades muito pequenas, estas respostas imunológicas estão continuamente a ser provocadas durante várias décadas, o que pode contribuir suplementarmente para o desenvolvimento de imunossenescência.
Verificou-se que anticorpos acrescidos contra dois sitios na apo B-100 prevêem o risco de enfarte do miocárdio e morte coronária em sujeitos com menos de 62 anos de idade. Anticorpos contra estes sitios exibiram um nível elevado de covariação, sugerindo que foram produzidos em respostas aos mesmos processos patofisiológicos subjacentes. 0 facto do tempo mediano desde a amostragem de sangue até ao evento coronário ter sido apenas 2,8 anos torna estes anticorpos particularmente interessantes como marcadores de risco acrescido de CHD. Níveis de anticorpos contra sequências peptídicas da apo B-100 modificadas por MDA não exibiram associações com outros factores de risco de CHD, como hiperlipidemia, hipertensão e diabetes, sugerindo que são marcadores independentes de risco de CHD. Os casos de CHD do presente estudo não eram indivíduos de extremamente alto risco e, neste aspecto, são 44 representativos do paciente com CHD comum. A descoberta de que IgM contra sequências da apo B-100 modificadas por MDA prevê risco de curto prazo para o desenvolvimento de eventos coronários agudos em indivíduos que não teriam sido identificados como sendo de alto risco pelo rastreio de factores de risco estabelecidos sugere que pode tornar-se num instrumento útil na identificação de indivíduos com necessidade de tratamento preventivo agressivo. Contudo, são necessários estudos de expectação consideravelmente maiores com análise multivariada antes de se poder estabelecer completamente o valor clínico da determinação de anticorpos contra sequências peptídicas modificadas por MDA da apo B-100. Outra limitação do presente estudo clínico é que apenas analisámos anticorpos contra um pequeno número dos sítios antigénicos da apo B-100, e que títulos de anticorpos contra outros sítios poderão ser marcadores ainda melhores de risco cardiovascular.
Em sujeitos com idade inferior a 60 anos, anticorpos contra um grande número de sítios modificados por MDA na apo B-100 estavam correlacionados com a extensão de doença vascular existente, avaliado pela IMT da carótida. Anticorpos IgM estavam mais intimamente associados à IMT da carótida do que anticorpos IgG. Apesar da IMT da carótida ter limitações óbvias como medida da carga aterosclerótica global, estas observações ainda sugerem que a determinação de IgM contra sequências modificadas por MDA na apo B-100 pode ser um método para avaliar a gravidade de aterosclerose existente. Estas observações também concordam com vários estudos prévios que relataram associações entre doença coronária e da artéria carótida e anticorpos IgM contra LDL oxidada. 45
Anticorpos contra o péptido 74 diferiram de anticorpos contra outros péptidos da apo B-100 em muitos aspectos. Foram mais elevados em controlos do que em casos, não diminuíram com a idade e não estavam associados à extensão de doença da carótida. Em conformidade, anticorpos contra esta sequência peptidica representam candidatos interessantes para uma resposta imunológica ateroprotectora.
Uma questão importante é o motivo por que ocorrem estas associações. Claramente demonstram que respostas imunológicas contra sitios da apo B-100 modificados por MDA estão de algum modo envolvidas no processo da doença aterosclerótica. Uma vez que níveis elevados de anticorpos estão associados a aterosclerose mais grave e risco aumentado de desenvolvimento de eventos coronários agudos, uma possibilidade óbvia é que estas respostas imunológicas promovem a aterogénese. Estudos que demonstram que respostas imunológicas contra proteínas de choque térmico, como HSP 65, são aterogénicas proporcionam algum suporte para esta noção. Todavia, estudos em animais experimentais mostraram um efeito ateroprotector da imunização com LDL oxidada. A reconstituição de células B de ratinhos nulos para apo E esplenectomizados origina um decréscimo de aterosclerose. Também foi observada aterosclerose reduzida em ratinhos nulos para apo E que receberam injecções repetidas de imunoglobulina. As presentes observações não argumentam necessariamente contra um papel ateroprotector de respostas imunológicas contra LDL oxidada. Estas respostas imunológicas são activadas por processos pró-aterogénicos, como oxidação da LDL. Em conformidade, também é provável que sejam proporcionais à gravidade do processo de doença, e podem servir de marcadores da gravidade da 46 doença e risco de CHD sem contribuírem para a progressão da doença. A descoberta de que a imunização de ratinhos nulos para apo E com sequências peptídicas da apo B-100 inibe o desenvolvimento de aterosclerose, relatada em dois artigos adjuntos, demonstra que provavelmente será este o caso. De facto, o resultado mais importante do presente estudo poderá bem ser a identificação de estruturas que poderão ser utilizadas como componentes de uma vacina contra aterosclerose. A observação de que o decréscimo de anticorpos contra sequências peptídicas modificadas por MDA na apo B-10 0 que ocorre com a idade é acompanhado de um aumento dos níveis no plasma de LDL oxidada sugere que uma remoção acrescida de LDL minimamente oxidada da circulação pode ser um mecanismo pelo qual estes anticorpos podem proteger contra aterosclerose. Métodos
População do estudo
Os sujeitos do estudo, nascidos entre 1926-45, pertencem ao coorte do estudo "Diet and Câncer (MDC)" de Malmõ. Cinquenta por cento, escolhidos aleatoriamente, dos que entraram no estudo de MDC entre Novembro de 1991 e Fevereiro de 1994 foram convidados a participar num estudo sobre a epidemiologia da doença da artéria carótida. Foram relatadas rotinas para a verificação da informação sobre morbidez e mortalidade após o exame de saúde, bem como a definição de factores de risco tradicionais. Identificaram-se oitenta e cinco casos de eventos cardíacos coronários agudos, isto é, MI fatal ou não fatal ou mortes devido a doença cardíaca coronária (CHD). Os participantes com um historial de enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral (n=6) não foram elegíveis para o presente estudo. 47
Para cada caso, dois controlos sem historial de enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral foram individualmente emparelhados quanto à idade, sexo, hábitos de fumar, presença de hipertensão, mês de participação no exame de rastreio e duração da pós-observação. Por motivos logísticos (não estavam disponíveis amostras de sangue em quantidade suficiente para avaliação dos péptidos), apenas um controlo estava disponível para sete casos e nenhum controlo para um caso. Este caso foi excluído da análise. Assim, a população do estudo consiste em 227 sujeitos, 78 casos e 149 controlos, com idades 49-67 (mediana 61) anos na referência.
Análises laboratoriais
Após jejum durante a noite recolheram-se amostras de sangue para determinar os valores no soro do colesterol total, triglicéridos, colesterol HDL, colesterol LDL e glucose no sangue total. Calculou-se o colesterol LDL em mmol/L de acordo com a fórmula de Friedewald. A LDL oxidada foi medida por ELISA (Mercordia).
Vasculografia por ultra-sons no modo B
Utilizou-se um sistema de Tomografia Computorizada Acuson 128 (Acuson, Mountain View, Califórnia) com um transdutor de MHz para a avaliação de placas da carótida na artéria carótida direita, como descrito previamente.
Desenvolvimento de ELISAs contra sequências peptídicas da apo B-100
Os 302 péptidos correspondentes à sequência de aminoácidos completa da apolipoproteína B humana foram 48 sintetizados (Euro-Diagnostica AB, Malmõ, Suécia, e KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Dinamarca) e utilizados em ELISA. Uma fracção de cada péptido sintético foi modificada por MDA 0,5 M (Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suécia) durante 3 horas a 37°C, na presença de lipossomas por MDA 0,5 M durante 3 horas a 37°C, ou por CuCl2 5 mM (Sigma) durante 18 horas a 37°C. Os péptidos modificados por MDA foram dialisados contra PBS que continha EDTA 1 mM, com várias mudas, durante 18 horas a 4°C. Testou-se a modificação dos péptidos em géis de poliacrilamida desnaturada (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), adequados para a separação de péptidos.
Uma mistura de fosfatidilcolina do ovo (EPC) (Sigma) e fosfatidilserina (PS) (Sigma) numa solução de clorofórmio, a uma razão molar 9:1 e a uma concentração de 3 mM de fosfolipido (PL), foi evaporada num recipiente de vidro sob uma corrente suave de árgon. Em seguida, o recipiente foi colocado sob vácuo durante 3 horas. Adicionou-se ao filme seco de EPC/PS uma solução que continha péptido 0,10 mM (5 mL) em tampão HEPES 10 mM esterilizado por filtração pH 7,4, NaCl 145 mM e azida de sódio 0, 003% e o sistema foi incubado durante 15 minutos a 50°C. A mistura foi suavemente submetida a vórtice durante cerca de 5 minutos à temperatura ambiente, depois foi colocada num banho de água gelada e foi sonicada com 7,5 mícrones de amplitude durante 3x3 minutos (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Medlab, Suécia) com interrupções de 1 minuto. A mistura PL-péptido, nativo ou modificado por MDA 0,5 M durante 3 horas a 37°C ou CuCl2 5 mM durante 18 horas a 37°C, foi armazenada sob árgon em frascos de vidro a 4°C envoltos em folha de alumínio e utilizada num período de 1 semana. A mistura modificada por MDA foi dialisada contra PBS que continha 49 EDTA 1 mM, com várias mudas, durante 18 horas a 4°C antes do armazenamento. Testou-se a modificação da mistura em géis de poliacrilamida desnaturada (Bio-Rad Laboratories AB; Sundbyberg, SE) , adequados para a separação de péptidos. Péptidos sintéticos nativos ou modificados diluidos em PBS pH 7,4 (20 μρ/ηϋΐι) , na presença ou ausência de lipossomas, foram absorvidos em cavidades de placas de microtitulo (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) numa incubação durante a noite a 4°C. Como referência,
processou-se em cada placa um dos péptidos (Ρβ) . Após lavagem com PBS que continha Tween-20 0,05% (PBS-T), as placas revestidas foram bloqueadas com SuperBlock em TBS (Pierce, Rockford, IL) durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma incubação de plasma humano reunido, diluído 1/100 em TBS-Tween-20 0,05% (TBS-T), durante 2 horas à temperatura ambiente e depois durante a noite a 4°C. Após enxaguamento, detectou-se a deposição de autoanticorpos dirigidos para os péptidos utilizando anticorpos IgG ou IgM de coelho anti-humanos biotinilados (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) apropriadamente diluidos em TBS-T. Após outra incubação durante 2 horas à temperatura ambiente, lavaram-se as placas e detectaram-se os anticorpos biotinilados ligados por estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina (Sigma), incubada durante 2 horas à temperatura ambiente. A reacção de cor foi desenvolvida utilizando um estojo de substrato de fosfatase (Pierce) e mediu-se a absorvância a 405 nm após 1 hora de incubação à temperatura ambiente. Os valores da absorvância dos diferentes péptidos foram divididos pelo valor da absorvância de P6 e comparados. 50
Estatística
Utilizou-se SPSS para as análises estatísticas. Os resultados estão apresentados em mediana e gama e em proporções quando apropriado. Utilizaram-se diagramas caixa de bigodes e gráficos de dispersão para ilustrar a relação entre a idade e péptidos seleccionados entre casos e controlos correspondentes. Também se utilizaram gráficos correspondentes para ilustrar a relação entre a idade e péptidos seleccionados, casos e controlos, respectivamente, abaixo e acima da idade mediana (61 anos) na referência e separadamente para casos e controlos abaixo da idade mediana. Nos casos e controlos, separadamente, calcularam-se coeficientes de correlação parcial, ajustados quanto à idade e sexo, entre péptidos seleccionados e níveis de lípidos no sangue e IMT da carótida comum. Também se calcularam coeficientes de correlação parcial ajustados quanto à idade e sexo entre a IMT da carótida comum e péptidos seleccionados em casos e controlos abaixo e acima da idade mediana. Utilizou-se um teste t de amostras independentes para avaliar variáveis contínuas distribuídas normalmente e um teste de Qui-quadrado para proporções entre casos e controlos. Utilizou-se um teste não paramétrico (Mann-Whitney) para avaliar variáveis contínuas distribuídas não normalmente entre casos e controlos. Todos os valores p eram de duas caudas. 51
Tabela
Coeficie nte de coi: rela çào ajustado quanno a r dade e sexo para diferent es pépt idos MDA de referência e espessura da intima--médr a da srté :ria oarótid a c.c mum entre casos i na is novos G 19-61 anos) e vais velh .0 8 (6 2 - 6 7 anos ;) c ors enfarte d o miocárdio e seus contr o 1 o s c°rr espo ndentes ersparelh .ados quanto à idade, sexo, hábitos de fum Lar e !··> -í T-,r.\ :.rt en são. PÉPTTDO CASOS : na is OONT ROLOS Idades CAbOu muis CONTROLOS Idads í s 49-61 anos, n - 116 62-67 anos, n - 111 TGM MDA P A 0,235t -0,101 MDA 4 D 0,366$ -0,030 MDA 74 0,17S 0, 063 MDA 1 í) 2 0,235$ -0,039 MDA 129 (\ O O fv d -0,009 MDA 162 0,2451 0, 001 MDA 210 0, 254 0, 013 MDA 2 4 0 0,284$ 0, 006 IGG MDA 215 0,119 -0,059 P < 0,Q2 ; $/x0, 01
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LEGENDAS DAS FIGURAS
As Figuras 1-6 mostram a resposta de anticorpos aos diferentes péptidos preparados de acordo com os métodos descritos aqui.
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 1 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
FUDTVYG N CSTH FTVKTRKG
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 2 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
PQGSTHILGWIKRVH AN PLL
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 3 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B
Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
VIS IPRLQAEAR SF11AH WS
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 4 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B
Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
KtVKEÃt KESQL PTVMD FRK
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 5 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos
Filamentação: Simples Topologia: Linear
LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 6
Fonte: Fragmento da apolipoproteina B
Comprimento: 20
Tipo: péptido aminoácidos
Filamentação: Simples
Topologia: Linear
DGSLRHKFLDSNÊKFSHVEK
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 7 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
KGTYG LSGQ RDP NTGBLNGE
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 8 Fonte: Fragmento
apolipoproteina B
Comprimento: 20
Tipo: péptido aminoácidos
Filamentação: Simples
Topologia: Linear
RLNGESMLRFNSSYLQGTNQ 56
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 9 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear SLT3TSDLQSGIÍKNTASLK.
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 10 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
TASLKYENYELTLKSDTNGK
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 11 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
DMTFSKQNALLRSEYQADYE
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 12 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
MKVKÍIRTIDQMQ NSELGWP
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 13 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
fALDOAKtNFNEKLSQLGTY 57
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 14 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
KTTKaSFDISVKAQYKKNKH
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 15
Fonte: Fragmento da apolipoproteina B
Comprimento: 20
Tipo: péptido aminoácidos
Filamentação: Simples
Topologia: Linear
E EEMLEMVSL V CPKDATRFK
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 16 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
GSTSHHLVS RKSUSAALEH K
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 17 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
lÊNIDFNKSSSSTASWIQNV
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 18 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples 58
Topologia: Linear
^eVTQRLNGEIOALaPQK
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 19 Fonte: Fragmento da apolipoproteína B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear eVPVLIXYSQPÊOSUPFFÊ
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 20 Fonte: Fragmento da apolipoproteína B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
HTFLÍm ELLKKLGSTTVM
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 21
Fonte: Fragmento da apolipoproteína B
Comprimento: 20
Tipo: péptido aminoácidos
Filamentação: Simples
Topologia: Linear
LLD1AN YLMEQI GDDdG DE
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 22 Fonte: Fragmento da apolipoproteína B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
CTG DEDYTY KIKRV1GN&K3Q
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 23 Fonte: Fragmento da apolipoproteína B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos 59
Filamentaçao: Simples Topologia: Linear
G NMQQTM EQ LTPE LKSSILK
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 24 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
SSiLKCVQSTKPSLM IQKAA
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 25 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
ÍQKAA1QALRKMEPKDKDQE
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 26
Fonte: Fragmento da apolipoproteina B
Comprimento: 20
Tipo: péptido aminoácidos
Filamentação: Simples
Topologia: Linear
RING ESN LRFNSS YtQGTN Q
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 27 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
SLNSHGLELNAOIL6TDKÍN
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 28 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 60
Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
WKSNVOTKYQ! RIQIQEKLQ
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 29 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
TfISDVWTLAAKNLTDFAEQ
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 30 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
E ATLQ RI YSLWEHSTKN HLQ
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 31 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
ALLVF PETEEAKOVtFlDTV
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 32 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
IEIOLEÔKQ f EPTt ÊAtFQK
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 33 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B 61
Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
SG ASMKLTTNG RFRE H NÂKF
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 34 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
MLIG DFEVAEKIMAFRAKVH
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 35
Fonte: Fragmento da apolipoproteina B
Comprimento: 20
Tipo: péptido aminoácidos
Filamentação: Simples
Topologia: Linear
G HSVLTAKGMALFG EG KAE F
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 36 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
FKSSVnUNTMAELFNQSDI
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 37 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
FPDLGQ EVALNANTK.MGK.tR 62
Listagem de sequências: ID SEQ NO: 38 Fonte: Fragmento da apolipoproteina B Comprimento: 20 Tipo: péptido aminoácidos Filamentação: Simples Topologia: Linear
ATRFKHLRKYTYNYQAQS
Lisboa, 19 de Fevereiro de 2009
Claims (9)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo purificado ou produzido de modo recombinante contra um fragmento da apo-lipoproteína B, em que o fragmento é efâLESKSFEPTL&ALras (id SEQ NO: 32) .
2. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 1, em que o fragmento é nativo ou está em forma oxidada.
3. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 2, em que o fragmento é um derivado aldeído.
4. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 3, em que o fragmento é modificado utilizando malondialdeído ou hidroxinonenal.
5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 3 ou 4, em que o fragmento é um hapteno de um aldeído.
6. Anticorpo de acordo com a Reivindicação 2, em que o fragmento foi oxidado utilizando cobre.
7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o fragmento está presente numa combinação com lipossomas fosfolipídicos.
8. Preparação farmacêutica para o tratamento profiláctico ou terapêutico de um mamífero, incluindo um ser humano, contra doenças cardiovasculares isquémicas, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo purificado ou produzido de modo recombinante de qualquer uma das Reivindicações 1 até 7. 2
9. Anti 1 at ;orpo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 5 7 para utilização em medicina. Lisboa, 9 de Fevereiro de 2009
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