JP2011063598A - アテローム性動脈硬化症の治療のためのペプチドに基づいた免疫治療、及び酸化した低密度リポ蛋白質に対する免疫応答の測定のためのペプチドベースのアッセーの開発 - Google Patents
アテローム性動脈硬化症の治療のためのペプチドに基づいた免疫治療、及び酸化した低密度リポ蛋白質に対する免疫応答の測定のためのペプチドベースのアッセーの開発 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明はアポリポタンパク質B断片、特に、虚血性心疾患に対する免疫源としてのまたは治療的な性質を有し、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay))の一またはそれ以上の前記ペプチドを使用して、虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の存在または不存在を分析するヒトを含む哺乳類の免疫感作または治療のための定義されたペプチドに関する。
【選択図】なし
Description
l)表1に列挙した、天然型または変性したペプチドを単独でまたは組み合わせて、好ましくは適当な担体および助剤と共に、虚血性の予防および治療用のための免疫療法としてまたは抗アテローム性動脈硬化症「ワクチン」として使用すること
2)心疾患
3)虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の検出用のELISAにおける該ペプチドの使用。
まず、これらのエピトープのうちの1つあるいはいくつかのものは、酸化LDLで免疫感作した動物中で観察される抗アテローム発生免疫応答を活性化する原因となると考えられる。従って、これらのエピトープを含むペプチドは、ヒトの免疫治療あるいは「アテローム性動脈硬化症ワクチン」の開発の可能性を表わすかもしれない。さらに、それらは、ヒトにおいて進展したアテローム性動脈硬化症の治療のために使用することができる。
血管壁におけるリポタンパク質、主としてLDLの酸化は、アテローム性動脈硬化症の進展において重要な要素であると考えられる。LDLの酸化中に生じた生成物は、血管細胞にとって有毒であり、炎症を引き起こし、プラーク形成を開始する。酸化LDL中のエピトープは免疫系によって認識され、抗体産生を生じさせる。動物実験により、これらの免疫応答のうちのいくつかがアテローム性動脈硬化症に対する保護効果を持っていることが示された。抗体は、通常、ペプチドに基づいた構造をほとんど排他的に指向する。LDL、アポリポタンパクB中に存在する唯一の蛋白質の完全な配列をカバーするポリペプチドライブラリーを使用して、ヒトにおいて抗体産生を生じさせる酸化LDL中のエピトープが同定された。これらのペプチドエピトープは酸化LDLと心疾患に対する免疫応答の関連を研究し、かつ虚血性心疾患の予防および治療のための免疫療法または抗アテローム性動脈硬化症「ワクチン」を開発するためのELISAを開発するために使用することができる。
酸化LDL中のエピトープの分子特性は、ヒトにおいて抗体依存性の免疫応答を生じさることが実証された。使用されたアプローチは、免疫応答が5−6のアミノ酸長のペプチド配列を殆ど排他的に指向するという事実の利点を利用する。LDLは唯一の蛋白質、4563アミノ酸長のアポリポタンパクBのみを含む。酸化の間、アポリポタンパクBは断片化され、アルデヒド付加物が正に帯電したアミノ酸、特にリジンに結合する。これは、アポリポタンパクBの三次元構造のために通常は露出していないペプチド配列が免疫細胞にアクセス可能になるか、および/またはその通常露出しているペプチド配列がアルデヒドとのハプテン化により免疫原性となることを意味する。
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GSTSHHLVSRKSISAALEHK
IENIDFNKSGSSTASWIQNV
IREVTQRLNGEIQALELPQK
EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
HTFLIYITELLKKLQSTTVM
LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
GNMGQTMEQLTPELKSSILK
SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
SLNSHGLELNADILGTDKIN
WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
SGASMKLTTNGRFREHNAKF
NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
FKSSVITLNTNAELFNQSDI
FPDLGQEVALNANTKNQKIR、並びに非抗体産生ペプチド
ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS
またはこれらのペプチドの一またはそれ以上の活性部位である。
LDL酸化の結果免疫原性になるアポリポプロテインBの部分を調べるために、ヒトアポリポプロテインBの全配列をカバーする20アミノ酸の長さのペプチドからなるポリペプチドライブラリーを形成した。これらのペプチドは、全ての配列をカバーするために破断点で5アミノ酸の重複を有するように製造した。ペプチドは、そのままの状態で、またはリン脂質リポソーム挿入した後、銅に接触させて酸化した後またはLDL酸化中に生じ得るアミノ酸の異なる変性を模したマロンジアルデヒド(MDA)変性の後に使用した。
ヒトアポリポプロテインBの全アミノ酸配列に相当する302ペプチドを合成し(ユーロ−ダイアグノスティカ アクチボラゲット、マルモ、スウェーデンおよびケイアイ ロス ペターソン エイエス(KI Ross Petersen AS)、ホーホルム(Horholm)、デンマーク)、ELISAで使用した。各合成ペプチドのフラクションを、0.5MのMDA(シグマ−アルドリッチ スウェーデン アクチボラゲット(Sigma-Aldrich Sweden AB)、ストックホルム、スウェーデン)で37℃で3時間、そしてリポソームの存在下で、0.5MのMDAにより37℃で3時間または5μMのCuCl2(シグマ)により37℃で18時間変性させた。MDAで変性させたペプチドはいくつかの変更をした1mMのEDTAを含むPBSで、4℃で18時間透析した。これらのペプチドの変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル(バイオ−ラッド ラボラトリーズ(Bio-Rad Laboratories)、ハーキュリーズ(Hercules)、カリフォルニア(CA)で試験した。ペプチドは、該タンパク質のN末端から出発して、1−302の番号を付された。
クロロホルム中、モル比9:1の卵ホスファチジルコリン(EPC)(シグマ)およびホスファチジルセリン(PS)(シグマ)と3mM濃度のリン脂質(PL)の混合物を、ガラス容器中、緩やかなアルゴン流の下で蒸発させた。その後、該容器を3時間真空下に置いた。滅菌濾過した10mMのHEPES緩衝液pH7.4中、0.10mMペプチド(5ml)、145mMのNaClおよび0.003%のアジ化ナトリウムを含有する溶液をEPC/PS乾燥フィルムに添加し、50℃で15分間インキュベートした。この混合物を室温で約5分間穏やかにボルテックスミキサーで混合し、その後、氷冷浴中に入れ、1分間の間隙をおいて7.5アンプリチュードミクロンで3分間で3回超音波処理した(ソニープレップ(Sonyprep)150 MSE サンヨー(Sanyo)、タムロ−メドラブ(Tamro-Medlab)、スウェーデン)。天然のまたは0.5MのMDAにより37℃で3時間もしくは5mMのCuCl2により37℃で18時間変性したPLペプチド混合物を、アルミホイルで封をしたガラスバイアルに4℃、アルゴン下で保存し、1週間以内に使用した。このMDA変性混合物を、貯蔵前に、いくつかの変化を加えた1mMのEDTAを含有するPBSで、4℃で18時間透析した。該混合物の変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル(バイオ−ラッド ラボラトリーズ エイエス(Bio-Rad Laboratories AB)、サンドバイバーグ(Sundbyberg)、スウェーデン)で試験した。
心疾患の患者(AHP)10人および健常な血液ドナー(NHP)50人(女性25人、男性25人)からの血漿サンプルを集めプールした。二つのプールを分割し、−80℃で貯蔵した。
リポソームの存在下または不存在下でPBS、pH7.4(20μg/ml)で希釈した天然のまたは変性した合成ペプチドを、マイクロタイタープレートウェル(ヌンク マキシソープ(Nunc Maxisorp)、ヌンク(Nunc)、ロスキルド(Roskilde)、デンマーク)に吸着させ、4℃で一晩インキュベートした。参考用として、ペプチドの一つ(P6)を、各プレートに流した。0.05%Tween−20を含有するPBS(PBS−T)で洗浄した後、コーティングされたプレートを、TBS中のスーパーブロック(SuperBlock)(ピアース(Pierce)、ロックフォード(Rockford)、イリノイ(ILで室温で5分間ブロックし、続いて、TBS−0.05%Tween−20(TBS−T)で希釈されたプールされたヒト血漿、AHPまたはNHPを室温で2時間、その後4℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、該ペプチドに対する自己抗体の付着を、TBS−Tで適当に希釈したビオチニル化ウサギ抗ヒトIgGまたはIgM抗体(ダコ エイ/エス(DakoA/S)、グロストラップ(Glostrup)、デンマーク)を用いることにより検出した。さらに室温で2時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、結合したビオチニル化抗体をアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン(シグマ)で検出し、室温で2時間インキュベートした。着色反応を、ホスファターゼ基質キット(ピアース)を用いて展開し、室温で1時間インキュベートした後、405nmの吸収を測定した。異なるペプチドの吸収値をP6の吸収値で分け、比較した。
(A)MDA変性ペプチドに対する高レベルのIgG抗体(n=3)
(B)高レベルのIgM抗体であるが、天然型およびMDA変性ペプチドに差はなかった(n=9)
(C)高レベルのIgG抗体であるが、天然型およびMDA変性ペプチドに差はなかった(n=2)
(D)MDA変性ペプチドに対する高レベルのIgG抗体、AHP−プールに比べて、NHP−プールにおいて少なくとも2倍高い(n=5)
(E)MDA変性ペプチドに対する高いレベルのIgM抗体、AHP−プールに比べて、NHP−プールにおいて少なくとも2倍高い(n=11)
(F)高レベルのIgG抗体であるが、無傷のおよびMDA変性ペプチドの差はなく、AHPプール中の抗体はNHPプールと比較して少なくとも2倍である(n=7)
(G)IgGまたはIgM抗体がない
A. 高レベルIgG、MDA−差
P 11. FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
P 25. PQCSTHILQWLKRVHANPLL
P 74. VISIPRLQAEARSEILAHWS
B. 高レベルIgM、MDA−差なし
P 40. KLVKEALKESQLPTVMDFRK
P 68. LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
P 94. DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK
P 99. KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
P 102. SLTSTSDLQSGIIKNTASLK
P 103. TASLKYENYELTLKSDTNGK
P 105. DMTFSKQNALLRSEYQADYE
P 177. MKVKIIRTIDQMQNSELQWP
C. 高レベルIgG、MDA 差なし
P 143. IALDDAKINFNEKLSQLQTY
P 210. KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
D. NHS/AHP、IgG−ak>2、MDA−差
P 1. EEEMLENVSLVCPKDATRFK
P 129. GSTSHHLVSRKSISAALEHK
P 148. IENIDFNKSGSSTASWIQNV
P 162. IREVTQRLNGEIQALELPQK
P 252. EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
E. NHS/AHP、IgM−ak>2、MDA−差
P 301. HTFLIYITELLKKLQSTTVM
P 30. LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
P 31. CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
P 32. GNMGQTMEQLTPELKSSILK
P 33. SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
P 34. IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
P 107. SLNSHGLELNADILGTDKIN
P 149. WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
P 169. TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
P 236. EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
F. NHS/AHP、IgG−ak<0.5、MDA−差なし
P 10. ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
P 45. IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
P 111. SGASMKLTTNGRFREHNAKF
P 154. NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
P 199. GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
P 222. FKSSVITLNTNAELFNQSDI
P 240. FPDLGQEVALNANTKNQKIR
G.
P 2. ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS
78人の被験者(後天的に進展した心筋梗塞、26の健常対照群(healthy controls)および26の疾病はないが高リスクの個体)における異なるペプチドと内膜/中膜の厚さとして評価した頸動脈におけるアテローム動脈硬化症との相関
+、r>0.2<0.3、p=<0.05;++、r>0.3<0.4、p=0.01;+++、r>0.4、p=<0.001、灰色、心筋梗塞に罹患した群で顕著に増加したペプチド抗体レベル
(1)体液の免疫応答(細胞の免疫応答のような)以外のメカニズムは、アテローム性動脈硬化症を調整することに関与し得る;あるいは、(2)この抗体の増加は経時的コレステロール過剰血症に対するバイ−ストランダー(by-stander)反応であった。
ペプチドの調製
ペプチドは、イムジェクト(Imject)(登録商標)スーパーキャリヤ(SuperCarrier)(登録商標)EDCキット(ピアース、ロックフォード、イリノイ)を用い、製造者の指示に従い、小さな変更を加えて製造した。結合バッファー500μl中のペプチド1gを200μlの脱イオン水中の2mgの担体と混合した。その後、この混合物を1mgの結合試薬(EDC、1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドHCl)と共に室温で2時間インキュベートした。その後、0.083Mリン酸ナトリウム、0.9Mの塩化ナトリウムpH7.2溶液で4℃で一晩透析した。この透析結合物を、Imject乾燥配合生成バッファーで希釈し、最終容量を1.5mlとした。免疫アジュバントとしてミョウバンを用い、容量比1:1でペプチド結合物と混合した。各免疫感作におけるペプチドの量は、注射一回あたり33μg/100μlであった。
ジャクソン ラボラトリーズ(Jackson Laboratories)(バー ハーバー(Bar Habor))、メイン(Me)からのアポE(−/−)マウスに、6〜7週齢で皮下投与による第一回の免疫感作を行い、続いて3週後に腹腔内ブースターを行った。免疫感作開始時からマウスに高コレステロール食を与え、25週齢で屠殺するまで続けた。2週間後、屠殺時に血液サンプルを集めた。ミョウバンを投与したマウスをコントロールとした。実験プロトコルは、セダーズ−シナイ メディカル センターの動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)に認可された。全てのマウスを米国認定動物管理研究所(American Association of Accreditation of Laboratories Animal Care)に委託した動物施設内に入れ、12時間の昼夜サイクルで飼育し、水および餌を制限せずに与えた。屠殺時にマウスにエンフルレンの吸入による麻酔をかけた。屠殺前に血漿をレトロオービタルブリード(retro-orbital bleeding)により採取した。
アテローム動脈硬化の形成に対するペプチド免疫感作の効果を評価するために、大動脈洞、大動脈弓および下行胸部および腹部大動脈のプラークの大きさを評価した。心臓および大動脈枝(tree)に生理学的な圧力で規定の食塩水をかけた後、心臓および近位の大動脈を取り出し、OCT化合物(ティシュー−テック(Tissue-Tek))に埋め込み、冷凍した。連続的な6μmの厚切片を少なくとも2つの大動脈弁の外観から集め、大動脈洞プラーク評価用の大動脈弁の一片を消失させた。典型的には、連続する3つの切片が1枚のスライド上に置き、合計25−30枚のスライドを一匹のマウスから集めた。また、スライド五枚目毎に染色のためにグループ分けした。また、左鎮骨下動脈までの上行大動脈および大動脈弓も同様に切片にし、処理した。胸部および腹部の下行大動脈を、オイルレッドO染色の後にプラークの組成のen face評価のために別々に処理した。
8g/mlの水中濃度の鶏卵アルブミン(シグマ)を、グリセリンと1:1で混合した。アジ化ナトリウムを添加し、アジ化ナトリウムの最終濃度を0.2%とした。胸部および腹部の大動脈から周辺の組織および脂肪を除去して清浄にした後、左側の腎臓部の動脈から鎮骨下動脈までの大動脈切片を、ヒストチョイス(Histochoice)(アムレスコ(Amresco))内で一晩定着させるために注意深く除去した。その後、大動脈は注意深く縦に開き、卵アルブミン溶液新たに被覆されたスライド上にルミナールと共にサイドアップで置いた。アルブミン溶液が乾燥したら、大動脈をオイルレッドOで染色し、コンピューター補助組織学でアテローム性動脈硬化症の範囲を評価した。
大動脈洞からの切片を、標準のプロトコルを使用して、MOMA−2抗体(セロテック)で免疫組織化学的に染色した。コラーゲンの量およびプラークの大きさおよび脂質含有量についてのオイルレッドO染色を評価するためのトリクロム染色を、標準の染色プロトコルを用いて行った。コンピューター補助形態分析を、前記のように組織構造を評価するために行った8。
ペプチド免疫感作の後の抗体応答を測定するために、ELISAを開発した。免疫化したペプチドに対する抗体力価を、ブースターの2週間後、屠殺時に集めた血液を使用して測定した。3つのペプチドに対する抗体応答を、同じタイミングのミョウバングループにおいて測定した。PBS pH 7.4(20μg/ml)で希釈した天然型の合成ペプチドを、マイクロタイタープレートウェル(ヌンク マキシソープ、ヌンク、ロスキルド、デンマーク)に吸着させ、4℃で一晩インキュベートした。0.050%のTween−20を含有するPBSで洗浄した後、コーティングしたプレートを、TBS中のスーパーブロック(ピアース)で室温で5分間ブロックし、その後、室温で2時間、TBS−0.05%Tween−20(TBS−T)中、1/50に希釈したマウス血清を室温で2時間、その後4℃で一晩インキュベートした。すすいだ後、ペプチドを指向する抗体の付着物を、TBS−Tの中で適切に薄められた、該ペプチドを指向する抗体の付着物を、TBS−Tで適切に希釈したビオチニル化ウサギ抗マウスIg抗体(ダコ エイ/エス(Dako A/S)、グロストラップ(Glostrup)、デンマーク)を使用して検出した。さらに2時間インキュベートした後、該プレートを洗浄し、結合したビオチニル化抗体をアルカリフォスファターゼ結合ストレプトアビジン(シグマ)によって検出し、室温で2時間でインキュベートした。ホスファターゼ基質キット(ピアース)を用いて着色反応を展開した。405nmにおける吸光度を、室温で1時間のインキュベートの後に測定した。バックグランドを差し引いた後、平均値を計算した。
データは平均値±Std.として示される。使用される統計方法は、本文、表または図に挙げた。P<0.05の時、統計的に有意であるとした。
*ミョウバングループとの有意差。統計分析にはANOVA、続いてターキー−クラマー(Tukey-Kramer)試験を使用した。
アポEノックアウトマウスにおけるアテローム性動脈硬化症のアポリポプロテインB−100ペプチド配列による免疫感作の効果
大動脈におけるアテローム性動脈硬化症に対する効果
1. ペプチド配列 143および210 −64.6%
2. ペプチド配列 11、25および74 −59.6%
3. ペプチド配列 129、148および167 −56.8%
4. ペプチド配列 99、100、102、103および105 −40.1%
5. ペプチド配列 30、31、32、33および34 +6.6%
6. ペプチド配列 10、45、154、199および240 +17.8%
1. ペプチド配列 2 −67.7%
2. ペプチド配列 210 −57.9%
3. ペプチド配列 301 −55.2%
4. ペプチド配列 45 −47.4%
5. ペプチド配列 74 −31.0%
6. ペプチド配列 1 −15.4%
7. ペプチド配列 240 0%
ペプチドは、アテローム性動脈硬化症に既に罹患している患者に治療剤として使用されてもよい。従って、本発明の断片またはペプチドの一種類またはそれ以上を加えるために、いかなる適切な投与経路を使用してもよい。
研究人口
研究対象、1926−45の間の、マルモ(Malmo)「ダイエット アンド キャンサー(Diet and Cancer)(MDC)」研究集団に属するボー(borr)。1991年11月と1994年2月の間のMDC研究に入った人間の任意の50%に、頚動脈の疫学に関する研究に参加することを依頼した。健康診断に続いて、動脈疾病、罹患率および致死率についての情報の確認用ルーチン、並びに伝統的な危険因子の定義が報告された。
一晩絶食した血液サンプルを、総コレステロール、トリグリセリド、HDLコレステロール、LDLコレステロールおよび全血グルコースの血清値の測定のために採取した。LDLコレステロールは、フライドウォルド(Friedewald)式によりmmol/Lに計算した。酸化LDLは、ELISA(マーコーディア(Mercordia))によって測定した。Bモード超音波バスキュログラフィー(vasculography)MHZ変換器を備えたアキューソン128コンピュータ断層撮影法システム(アキューソン(Acuson)、マウンテンビュー(Mountain View)、カリフォルニア)を、前記のような右頚動脈の中で頚動脈プラークの評価に使用した。
全ヒトアポリポプロテインBアミノ酸配列に相当する302個のペプチドを合成し(ユーロ−ダイアグノスティカ アクチボラゲット、マルモ、スウェーデンおよびケイアイ ロス ペターソン エイエス、ホーホルム、デンマーク)、ELISAで使用した。各合成ペプチドのフラクションを0.5MのMDA(シグマ−アルドリッチ スウェーデン アクチボラゲット、ストックホルム、スウェーデン)、0.5MのMDAにより37℃で3時間、およびリポソームの存在下で0.5MのMDAにより37℃で3時間または5mMのCuCl2(シグマ)により37℃で18時間変性した。MDA変性ペプチドを、いくつかの変更をした1mMのEDTAを含有するPBSで4℃で18時間透析した。該ペプチドの変性を、ペプチドの分離に適する変性ポリアクリルアミドゲル(バイオ−ラッド ラボラトリーズ、ハーキュリーズ、カリフォルニア)で試験した。
SPSSを統計分析のために使用した。適切な場合、結果は平均値と範囲として、および比率として示される。ボックスプロット(Boxplot)とスキャッタープロット(scatterplots)を、症例および対応するコントロール中の年齢と選択されたペプチドの関係を説明するために使用した。対応するグラフも、年齢と選択されたペプチドの関係を、症例およびコントロールについて、基線の平均年齢(61才)未満または以上で、また別に平均年齢未満の症例およびコントロールについて例証するために使用した。症例とコントロールでは、別々に、年齢と性別のために調整された部分的な相関係数が、選択されたペプチドおよび血液脂質レベルと共通の頚動脈のIMTの間で計算された。年齢および性別で調節した部分的な相関係数は、平均年齢以下およびそれ以上で症例およびコントロールにおける共通の頚動脈のIMTと選択されたペプチドの間で計算された。独立のサンプルt−検定は通常分配された連続変数を評価するために、カイ二乗検定は症例とコントロールの比率を評価するために使用された。非パラメーター検定(マン−ホイットニー)は症例とコントロールの間の非通常分配された連続変数を評価するために使用された。p−値はすべて両側(two-tail)である。
心筋梗塞のある若い患者(49−61才)および高齢の患者(62−67才)における、および年齢、性別、喫煙および高血圧症を一致させたそれらの対応するコントロールにおける、年齢および性別で合わせた異なる基線MDAペプチドおよび共通の頚動脈内膜中膜厚さのための相関係数
ペプチド 49−61才の症例およびコントロール 62−67才の症例およびコントロール
n=116 n=111
IGM
MDA 32 0.235t -0.101
MDA 45 0.366$ -0.030
MDA 74 0.178 0.063
MDA 102 0.255$ -0.039
MDA 129 0.330$ -0.009
MDA 162 0.2451 0.001
MDA 210 0.254 0.013
MDA 240 0.284$ 0.006
IGG
MDA215 0.119 -0.059
p<0.05;$/xO.O1
本発明は、ヒトを含む哺乳類の免疫感作または治療のためのアポリポタンパク質B断片であって、虚血性心疾患に対する免疫源としてのまたは治療的な性質を有し、虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関する抗体の存在または不存在を分析するアポリポタンパク質B断片に関する。
該断片がアルデヒドのハプテンであり得る。
該断片がマロンジアルデヒドまたはヒドロキシノネナールを用いて変性され得る。
FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
PQCSTHILQWLKRVHANPLL
VISIPRLQAEARSEILAHWS
KLVKEALKESQLPTVMDFRK
LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK
KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
SLTSTSDLQSGIIKNTASLK
TASLKYENYELTLKSDTNGK
DMTFSKQNALLRSEYQADYE
MKVKIIRTIDQMQNSELQWP
IALDDAKINFNEKLSQLQTY
KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
EEEMLENVSLVCPKDATRFK
GSTSHHLVSRKSISAALEHK
IENIDFNKSGSSTASWIQNV
IREVTQRLNGEIQALELPQK
EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
HTFLIYITELLKKLQSTTVM
LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
GNMGQTMEQLTPELKSSILK
SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
SLNSHGLELNADILGTDKIN
WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
SGASMKLTTNGRFREHNAKF
NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
FKSSVITLNTNAELFNQSDI
FPDLGQEVALNANTKNQKIR
ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS
またはこれらのペプチドの一またはそれ以上の活性部位にも関する。
HTFLIYITELLKKLQSTTVM
ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
PQCSTHILQWLKRVHANPLL
LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
GNMGQTMEQLTPELKSSILK
SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
VISIPRLQAEARSEILAHWS
KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
SLTSTSDLQSGlIKNTASLK
TASLKYENYELTLKSDTNGK
DMTFSKQNALLRSEYQADYE
GSTSHHLVSRKSISAALEHK
IALDDAKINFNEKLSQLQTY
IENIDFNKSGSSTASWIQNV
NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
IREVTQRLNGEIQALELPQK
GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
FPDLGQEVALNANTKNQKIR
ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS
またはこれらのペプチドの1種類またはそれ以上の活性部位にも関する。
前記ペプチドは天然型であり得る。
前記ペプチドは酸化型であり得る。
前記ペプチドは銅を用いて酸化されていてもよい。
前記ペプチドはリン脂質リポソームとの組み合わせで存在し得る。
前記ペプチドはマロンジアルデヒド(MDA)誘導体型であり得る。
前記ペプチドはヒドロキシノネナール誘導体型であり得る。
該使用において、免疫投与量が前記断片/ペプチド1〜100mgであり得る。
該医薬組成物において、前記断片/ペプチドがカチオン化ウシ血清アルブミンに結合して存在し得て、助剤として水酸化アルミニウムが使用され得る。
該医薬組成物において、前記組成物が注射用組成物として存在し得る。
本発明は、1種類またはそれ以上の前記天然型および/またはMDA変性配列に対する精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体の治療有効量を含む虚血性心疾患に対するヒトを含むほ乳類の免疫感作のためのワクチンにも関する。
該ワクチンにおいて、前記免疫感作のための断片/ペプチドがカチオン化ウシ血清アルブミンに結合して存在してもよく、助剤として水酸化アルミニウムが使用され得る。
該方法において、病態が、高齢者における、酸化LDLが炎症、細胞毒性およびプラーク破壊の危険性に寄与していると考えられる不安定なアテロームプラーク、並びに冠動脈心疾患の1またはそれ以上であり得る。
該方法において、前記アッセーがイムノアッセーであり得る。
該方法において、前記イムノアッセーがELISA、RIA、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティングであり得る。
Claims (14)
- 下記の配列:
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
を有するペプチド、そのエピトープ、酸化型、またはアルデヒドまたはマロンジアルデヒド誘導体。 - 前記ペプチドが天然型である請求項1記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
- 前記ペプチドが前記アルデヒド誘導体のハプテンである請求項1記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
- 前記ペプチドが酸化型であり、前記ペプチドが銅を用いて酸化されている酸化型を含む請求項1記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
- 前記ペプチドがマロンジアルデヒド(MDA)誘導体の形態またはヒドロキシノネナール誘導体の形態である請求項1記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
- 前記ペプチドがリン脂質リポソームと組み合わせられる請求項1〜5いずれか1項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
- 請求項1〜6いずれか1項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体に対する精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
- 医薬品に使用するための、請求項1〜6いずれか1項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項7記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
- 所望によりアジュバントを組み合わせて、アテローム性動脈硬化症または虚血性心疾患(冠動脈心疾患、心筋梗塞、脳卒中、および/または周辺の動脈疾患を含み得る)の免疫療法または治療法に使用するための請求項1〜6いずれか1項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項7記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体。
- アテローム性動脈硬化症および/または虚血性心疾患の進展の危険の増加または減少に関連する抗体の存在または不存在の分析に使用する請求項1〜6いずれか1項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体。
- 所望により1種類またはそれ以上の薬理学的に無害の充填剤、および/またはアジュバントを組み合わせて、1種類またはそれ以上の請求項1〜6いずれか1項記載のペプチド、エピトープまたは誘導体、または請求項7記載の精製された、または遺伝子組換えで生産された抗体を治療有効量含有する医薬組成物。
- 前記組成物がアテローム性動脈硬化症または虚血性心疾患(冠動脈心疾患、心筋梗塞、脳卒中、および/または周辺の動脈疾患を含み得る)に対するヒトを含むほ乳類の予防的治療および/または治療方法用であって、前記組成物は注射可能な形態である請求項11記載の医薬組成物。
- 所望によりアジュバントを組み合わせて、1種類またはそれ以上の請求項1〜6いずれか1項記載のペプチド、エピトープ、誘導体を含む、アテローム性動脈硬化症に対するヒトを含むほ乳類の免疫感作に使用するワクチン。
- 免疫投与量が前記ペプチド1〜100mgである請求項13記載のワクチン。
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