ES2317999T3 - Terapia de inmunizacion para el tratamiento de la ateroesclerosis. - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo purificado o producido de manera recombinante contra un fragmento de la apolipoproteína B, en donde el fragmento es IEIGLEGKGFEPTLEALFGK (SEQ. ID NO. 32).
Description
Terapia de inmunización para el tratamiento de
la ateroesclerosis
La presente invención se refiere a un anticuerpo
purificado o producido de manera recombinante contra un fragmento
de la apolipoproteína B que tiene la secuencia
"IEIGLEGKGFEPTLEALFGK" para el uso en medicina, y a
composiciones del mismo.
También se describen en la presente memoria
nuevos péptidos, en particular péptidos para ser usados para terapia
de inmunización para el tratamiento de la aterosclerosis, y para el
desarrollo de ELISA basado en péptidos para la determinación de la
respuesta inmunitaria contra la lipoproteína de baja densidad
oxidada y la diagnosis de la presencia o ausencia de
aterosclerosis.
También se describen en la presente memoria,
pero no se reivindicación de manera explícita:
- 1)
- El uso de cualquiera de los péptidos enumerados en la tabla 1, solos o en combinación, nativos o modificados con MDA, preferiblemente junto con un vehículo y adyuvante adecuado, como inmunoterapia o "vacuna" antiaterosclerosis para la prevención y el tratamiento de la enfermedad cardiovascular isquémica.
- 2)
- El uso de los mismos péptidos en ELISA para la detección de anticuerpos relacionados con el riesgo aumentado o disminuido de desarrollo de enfermedades cardiovasculares isquémicas.
La aterosclerosis es una enfermedad crónica que
causa un espesamiento de la capa más interna (la íntima) de
arterias grandes y de tamaño medio. Disminuye el flujo sanguíneo y
puede causar isquemia y destrucción tisular en órganos provistos
por el vaso afectado. La aterosclerosis es la principal causa de
enfermedad cardiovascular, que incluye el infarto de miocardio, el
ictus y la enfermedad de las arterias periféricas. Es la causa
principal de muerte en el mundo occidental y se ha predicho que
llegará a ser la causa principal de muerte en el mundo entero
dentro de dos décadas.
La enfermedad es iniciada por la acumulación de
lipoproteínas, principalmente lipoproteína de baja densidad (LDL),
en la matriz extracelular del vaso. Estas partículas de LDL se
agregan y sufren una modificación oxidativa. La LDL oxidada es
tóxica y causa lesión vascular. La aterosclerosis representa en
muchos aspectos una respuesta a esta lesión, que incluye
inflamación y fibrosis.
En 1989, Palinski y colaboradores identificaron
anticuerpos circulantes contra la LDL oxidada en seres humanos.
Esta observación sugirió que la aterosclerosis puede ser una
enfermedad autoinmune causada por reacciones inmuniutarias contra
lipoproteínas oxidadas. En este tiempo, varios laboratorios
empezaron a buscar asociaciones entre los títulos de anticuerpos
contra la LDL oxidada y la enfermedad cardiovascular. Sin embargo,
la imagen que surgió de estos estudios estaba lejos de ser clara.
Existían anticuerpos contra un gran número de diferentes epitopos
en la LDL oxidada, pero la estructura de estos epitopos era
desconocida. El término "anticuerpos de la LDL oxidada" se
refería por tanto a una mezcla desconocida de diferentes anticuerpos
más que a un anticuerpo específico. Los anticuerpos IgM
independientes de las células T eran más frecuentes que los
anticuerpos IgG dependientes de las células T.
Los anticuerpos contra la LDL oxidada estaban
presentes tanto en pacientes con enfermedad cardiovascular como en
controles sanos. Aunque algunos estudios anteriores reportaron
asociaciones entre los títulos de anticuerpos y la enfermedad
cardiovascular, otros fueron incapaces de encontrar tales
asociaciones. Un punto débil principal de estos estudios era que
los ensayos ELISA usados para determinar los títulos de anticuerpos
usaban partículas de LDL oxidada como ligando. La composición de la
LDL es diferente en individuos diferentes, el grado de modificación
oxidativa es difícil tanto de controlar como de evaluar, y los
niveles de anticuerpos contra los diferentes epitopos en las
partículas de LDL oxidada no pueden ser determinados. Hasta cierto
punto, debido a los problemas técnicos, ha sido difícil evaluar el
papel de las respuestas de los anticuerpos contra la LDL oxidada
usando las técnicas disponibles hasta ahora, pero, sin embargo, no
es posible crear componentes bien definidos y reproducibles de una
vacuna si se deben usar partículas de LDL oxidada intactas.
Otro modo de investigar la posibilidad de que
las reacciones autoinmunes contra la LDL oxidada en la pared
vascular jueguen un papel clave en el desarrollo de la
aterosclerosis es inmunizar animales contra su propia LDL oxidada.
La idea detrás de este método es que si las reacciones autoinmunes
contra la LDL oxidada son reforzadas usando técnicas de
inmunización clásicas, esto daría como resultado una inflamación
vascular aumentada y progresiva de aterosclerosis. Para ensayar
esta hipótesis, se inmunizaron conejos con LDL oxidada homóloga y
después se indujo aterosclerosis alimentando los animales con una
dieta alta en colesterol durante 3 meses.
Sin embargo, en contraste con la hipótesis
original, la inmunización con LDL oxidada tuvo un efecto protector,
reduciendo la aterosclerosis aproximadamente un 50%. También se
obtuvieron resultados similares en un estudio posterior en el que
la dieta alta en colesterol se combinó con una lesión vascular
mediante un globo para producir un desarrollo de la placa más
agresivo. En paralelo con los estudios de los autores de la
invención, diversos otros laboratorios reportaron observaciones
similares. Tomados en conjunto, los datos disponibles demuestran
claramente que existen reacciones inmunitarias que protegen contra
el desarrollo de la aterosclerosis, y que éstas implican
autoinmunidad contra la LDL oxidada.
Estas observaciones también sugieren la
posibilidad de desarrollar una terapia inmunitaria o "vacuna"
para el tratamiento en el hombre de la enfermedad cardiovascular
basada en la arteriosclerosis. Un método para hacer esto sería
inmunizar un individuo con su propia LDL después de que haya sido
oxidada por exposición a, por ejemplo, cobre. Sin embargo, este
método se complica por el hecho de que no se sabe qué estructura en
la LDL oxidada es la responsable de inducir la inmunidad protectora
y si la LDL oxidada puede contener también epitopos que puedan dar
lugar a reacciones inmunitarias adversas.
La identificación de epitopos en la LDL oxidada
es importante por varias aspectos:
Primero, es probable que uno o varios de estos
epitopos sean responsables de activar la respuesta inmunitaria
antiaterogénica observada en animales inmunizados con LDL oxidada.
Los péptidos que contienen estos epitopos pueden por tanto
representar una posibilidad para el desarrollo de una terapia
inmunitaria de "vacuna de la aterosclerosis" en el hombre.
Además, se pueden usar para el tratamiento terapéutico de la
aterosclerosis desarrollada en el hombre.
En segundo lugar, los péptidos que contienen los
epitopos identificados se pueden usar para desarrollar ELISAs
capaces de detectar anticuerpos contra estructuras específicas en la
LDL oxidada. Tales ELISAs serían más precisos y fiables que los
disponibles en la actualidad, que usan partículas de LDL oxidada
como antígeno. También permitirían los análisis de respuestas
inmunitarias contra diferentes epitopos en la LDL oxidada asociados
con la enfermedad cardiovascular.
La patente de EE.UU. 5.972.890 se refiere a un
uso de péptidos para diagnosticar la aterosclerosis. La técnica
presentada en dicha patente de EE.UU. es, en principio, una forma de
diagnosis radiofísica. Una secuencia peptídica se marca
radiactivamente y se inyecta en la corriente sanguínea. Si esta
secuencia peptídica fuera idéntica a secuencias presentes en la
apolipoproteína B, se unirá al tejido donde hay receptores para la
apolipoproteína B presentes. En los vasos este es, sobre todo, la
placa aterosclerótica. La concentración de radioactividad en la
pared del vaso se puede determinar, p.ej., por medio de una cámara
gamma. La técnica es, por tanto, un método de diagnóstico
radiofísico basado en que las secuencias peptídicas marcadas
radiactivamente se unirán a sus receptores de tejido normal
presentes en la placa aterosclerótica, y se detectan usando un
análisis de radioactividad externo. Es un método de análisis
directo para identificar la placa aterosclerótica. Requiere la
administración al paciente de compuestos radioactivos.
La técnica descrita en la presente memoria está
basada en principios y métodos muy diferentes, y se refiere a
fragmentos de apolipoproteína B para la inmunización contra la
enfermedad cardiovascular, así como a un método para diagnosticar
reacciones inmunitarias contra secuencias peptídicas de la
apo-lipoproteína B. Tales reacciones inmunitarias
han mostrado a su vez que aumentan en individuos que tienen una
aterosclerosis desarrollada. La técnica se basa en adherir
secuencias peptídicas en el fondo de pocillos poliméricos. Cuando se
añade una muestra de sangre, los péptidos se unirán a anticuerpos,
que son específicos para estas secuencias. La cantidad de
anticuerpos unidos se determina después usando un método/técnica
inmunológica. En contraste con la técnica de dicha patente de
EE.UU., este no es, por tanto, un método de determinación directa
para identificar y localizar la placa aterosclerótica, pero
determina una respuesta inmunológica, la cual muestra un alto grado
de covariación con la extensión de la
aterosclerosis.
aterosclerosis.
El principio básico de la técnica descrita en la
presente memoria es, por tanto, muy diferente del de dicha patente
de EE.UU. Esta última depende de la unión de secuencias peptídicas a
los receptores normales de las lipoproteínas presentes en el tejido
aterosclerótico, mientras que la primera se basa en el
descubrimiento de reacciones inmunitarias contra secuencias
peptídicas y la determinación de anticuerpos para estas secuencias
peptídicas.
Estudios publicados (Palinski et al.,
1995, y George et al., 1998) han mostrado que la inmunización
contra la LDL oxidada reduce el desarrollo de la aterosclerosis.
Esto indicaría que las reacciones inmunitarias contra la LDL
oxidada tienen en general un efecto protector. Los resultados dados
en la presente memoria han mostrado sorprendentemente, sin embargo,
que este no es siempre el caso. P.ej., la inmunización usando una
mezcla de los péptidos nos. 10, 45, 154, 199 y 240 dio lugar a un
aumento del desarrollo de la aterosclerosis. La inmunización usando
otras secuencias peptídicas, p.ej., las secuencias peptídicas nos. 1
y 30 a 34, carece de un efecto total sobre el desarrollo de la
aterosclerosis. Los resultados son sorprendentes porque proporcionan
una base para el hecho de que las reacciones inmunitarias contra la
LDL oxidada pueden proteger contra el desarrollo, contribuir al
desarrollo de la aterosclerosis, y no tener ningún efecto en
absoluto, dependiendo de a qué estructuras en la LDL oxidada están
dirigidas. Estos hallazgos hacen posible desarrollar métodos de
inmunización que aíslan la activación de reacciones inmunitarias
protectoras. Además, muestran que la inmunización usando LDL
oxidada intacta podría tener un efecto perjudicial si las partículas
usadas contienen un nivel alto de estructuras que den lugar a
reacciones inmunitarias aterogénicas.
La solicitud de patente internacional WO98/42751
se refiere a una molécula que tiene una secuencia polipeptídica
conjugada con MDA, y que inhibe la absorción por parte del receptor
de LDL de alta afinidad de LDL o una forma parcialmente modificada
de la misma.
La solicitud de patente internacional WO98/56938
se refiere a materiales y métodos para el transporte y entrega
in vivo de ácidos nucleicos, en particular, el uso de
lipoproteínas (incluyendo lipoproteínas de baja densidad:
"LDL") y/o apo-lipoproteínas para la unión y
transporte de ácidos nucleicos. Además, se refiere al uso de
lipoproteínas en la detección temprana de cáncer y/o cáncer
metastático y/o arteriosclerosis.
La solicitud de patente internacional WO99/18986
se refiere a un método de tratamiento de la aterosclerosis en un
paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz
de una sustancia capaz de unirse a la región aminoterminal de la
apolipoproteína B, tratando de este modo la aterosclerosis.
La solicitud de patente internacional WO99/08109
se refiere al uso de un panel de anticuerpos monoclonales de ratón
que se unen a partículas de LDL oxidada para determinar la presencia
de LDL oxidada en suero y plasma. Esto es por tanto totalmente
diferente de la técnica descrita en la presente memoria, que implica
un método para determinar anticuerpos contra la LDL oxidada.
La patente de EE.UU. 4.970.144 se refiere a un
método para preparar anticuerpos por medio de una inmunización
usando secuencias peptídicas, anticuerpos que se pueden usar para la
determinación de apolipoproteínas usando ELISA. Esto es algo, por
tanto, aún más diferente de la técnica descrita en la presente
memoria.
La patente de EE.UU. 5.861.276 describe un
anticuerpo recombinante para la forma normal de la apolipoproteína
B. Este anticuerpo se usa para determinar la presencia de
apolipoproteína B normal en plasma y suero, y para tratar la
aterosclerosis disminuyendo la cantidad de partículas de LDL normal
en la circulación.
Por tanto, en la presente invención se describe
el uso de anticuerpos para tratar la aterosclerosis como se define
en las reivindicaciones. Sin embargo, al contrario que la patente de
EE.UU. 5.861.276, estos anticuerpos están dirigidos a estructuras
presentes en partículas de LDL oxidada, y no a la partícula normal
de LDL. La ventaja es que es la LDL oxidada, la cual se supone que
da lugar al desarrollo de aterosclerosis. El uso de anticuerpos
dirigidos a estructuras que son específicas a la LDL oxidada no se
describe en dicha patente de EE.UU.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
purificado o producido de manera recombinante contra un fragmento
de la apolipoproteína B que tiene la secuencia
"IEIGLEGKGFEPTLEALFGK" para el uso en medicina, y a
composiciones del mismo.
Se cree que la oxidación de lipoproteínas,
principalmente LDL, en la pared arterial, es un factor importante
en el desarrollo de la aterosclerosis. Los productos generados
durante la oxidación de la LDL son tóxicos para las células
vasculares, causan inflamación e inician la formación de la placa.
Los epitopos en la LDL oxidada son reconocidos por el sistema
inmunitario y dan lugar a la formación de anticuerpos. Experimentos
con animales han mostrado que algunas de estas respuestas
inmunitarias tienen un efecto protector contra la aterosclerosis.
Los anticuerpos, de manera general, se dirigen casi exclusivamente
contra estructuras basadas en péptidos. Usando una librería
polipeptídica que cubre la secuencia completa de la única proteína
presente en la LDL, la apolipoproteína B, se han identificado los
epitopos en la LDL oxidada que dan lugar a la formación de
anticuerpos en el hombre. Estos epitopos peptídicos se pueden usar
para desarrollar ELISAs para estudiar las asociaciones entre las
respuestas inmunitarias contra la LDL oxidada y la enfermedad
cardiovascular, y para desarrollar una inmunoterapia o
"vacuna" para la aterosclerosis para la prevención y el
tratamiento de la enfermedad cardiovascular isquémica.
La presente invención se define en las
reivindicaciones acompañantes, con referencia a los ejemplos
acompañantes.
Se ha realizado una caracterización molecular de
los epitopos en la LDL oxidada que dan lugar a respuestas
inmunitarias dependientes de anticuerpos en el hombre. El método
usado aprovecha el hecho de que las reacciones inmunitarias están
dirigidas casi exclusivamente contra secuencias peptídicas de
5-6 aminoácidos de longitud. La LDL sólo contiene
una proteína, la apolipoproteína B de 4563 aminoácidos de longitud.
Durante la oxidación, la apolipoproteína B se fragmenta y se
acoplan aductos de aldehído a aminoácidos cargados positivamente, en
particular, lisina. Esto significa que las secuencias peptídicas no
expuestas normalmente debido a la estructura tridimensional de la
apolipoproteína B se hacen accesibles a las células inmunitarias y/o
que las secuencias peptídicas normalmente expuestas se hacen
inmunogénicas debido a la haptenización con aldehídos.
Se ha determinado de este modo que los
siguientes péptidos, nativos o derivados de MDA, poseen tal eficacia
como productores de una respuesta inmunitaria, estos péptidos
son:
o un sitio activo de uno o más de estos
péptidos.
Las realizaciones preferidas de la invención se
describirán ahora por medio de ejemplos no limitantes, con
referencia a las figuras acompañantes.
Para determinar qué partes de la apolipoproteína
B se hacen inmunogénicas como resultado de la oxidación de la LDL,
se produjo una librería polipeptídica que consistía en péptidos de
20 aminoácidos de longitud que cubrían la secuencia completa de la
apolipoproteína B humana. Los péptidos se produjeron con un
solapamiento de 5 aminoácidos para cubrir todas las secuencias en
los puntos de ruptura. Los péptidos se usaron en estado nativo, o
después de su incorporación en liposomas fosfolipídicos, después de
la oxidación por exposición a cobre o después de la modificación
con dialdehído malónico (MDA) para imitar las diferentes
modificaciones de los aminoácidos que se pueden producir durante la
oxidación de la LDL.
Los 302 péptidos correspondientes a la secuencia
de aminoácidos entera de la apolipoproteína B humana fueron
sintetizados (Euro-Diagnostica AB, Malmö, Suecia, y
KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Dinamarca) y usados en ELISA. Una
fracción de cada péptido sintético se modificó con MDA 0,5 M
(Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suecia)
durante 3 h a 37ºC y en presencia de liposomas con MDA 0,5 M durante
3 h a 37ºC o con CuCl_{2} 5 \muM (Sigma) durante 18 h a 37ºC.
Los péptidos modificados con MDA fueron dializados contra PBS que
contenía AEDT 1 mM con varios cambios durante 18 h a 4ºC. La
modificación de los péptidos fue probada en geles de poliacrilamida
desnaturalizados (Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA), adecuados para la separación de péptidos. Los péptidos fueron
numerados de 1 a 302 empezando en el extremo
N-terminal de la proteína.
Se pueden usar otros aldehídos para preparar
derivados, tales como hidroxinonenal y otros.
Una mezcla de fosfatidilcolina de huevo (EPC)
(Sigma) y fosfatidilserina (PS) (Sigma) en una disolución en
cloroformo a una relación molar de 9:1 y una concentración de
fosfolípido (PL) de 3 mM fue evaporada en un recipiente de vidrio
bajo una corriente de argón suave. Después se puso el recipiente a
vacío durante 3 horas. Una disolución que contenía 0,10 mM de
péptido (5 ml) en tampón HEPES 10 mM filtrado de manera estéril, pH
7,4, NaCl 145 mM y azida de sodio al 0,003%, se añadió a la película
seca de EPC/PS y se incubó durante 15 min a 50ºC. Se centrifugó
suavemente la mezcla en un vórtex durante aproximadamente 5 min a
temperatura ambiente, y después se puso en un baño de hielo y se
sonicó con 7,5 micrómetros de amplitud durante 3 x 3 min (Sonyprep
150 MSE Sanyo, Tamro-Medlab, Suecia) con
interrupciones de 1 min. La mezcla PL-péptido,
nativo o modificado con MDA 0,5 M durante 3 h a 37ºC ó CuCl_{2} 5
mM durante 18 h a 37ºC, se almacenó en atmósfera de argón en viales
de vidrio a 4ºC envueltos en papel de aluminio y se usó antes de 1
semana. La mezcla modificada con MDA fue dializada contra PBS que
contenía AEDT 1 mM con varios cambios durante 18 h a 4ºC antes de su
almacenamiento. La modificación de la mezcla se ensayó en geles de
poliacrilamida desnaturalizados (Bio-Rad
laboratories AB, Sundbyberg, Suecia), adecuados para la separación
de péptidos.
Se recogieron y reunieron muestras de plasma de
10 pacientes con enfermedad cardiovascular (AHP) y 50 muestras de
plasma, 25 de mujeres y 25 de hombres, de donantes de sangre normal
(NHP). Se hicieron alícuotas de los dos grupos y se almacenaron a
-80ºC.
Péptidos sintéticos nativos o modificados
diluidos en PBS, pH 7,4, (20 \mug/ml), en presencia o ausencia de
liposomas, se absorbieron en pocillos de placas de microtitulación
(Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca), en una incubación
durante una noche a 4ºC. Como referencia, uno de los péptidos (P6)
fue ensayado en cada placa. Después de lavar con PBS que contenía
Tween-20 al 0,05% (PBS-T), las
placas revestidas fueron bloqueadas con SuperBlock en TBS (Pierce,
Rockford, IL) durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de una
incubación de plasma humano reunido, AHP (Plasma Humano
Antihemofílico) o NHP (Plasma Humano Normal), diluido a 1/100 en
TBS-Tween-20 al 0,05%
(TBS-T) durante 2 h a temperatura ambiente y después
durante una noche a 4ºC. Después de aclarar, la deposición de
autoanticuerpos dirigidos a los péptidos fue detectada usando
anticuerpos IgG ó IgM antihumanos de conejo biotinilados (Dako A/S,
Glostrup, Dinamarca) diluidos apropiadamente en
TBS-T. Después de otra incubación durante 2 h a
temperatura ambiente, se lavaron las placas y los anticuerpos
biotinilados unidos fueron detectados por estreptavidina conjugada
con fosfatasa alcalina (Sigma), incubada durante 2 h a temperatura
ambiente. La reacción de color fue desarrollada usando un kit de
sustrato de fosfatasa (Pierce) y se midió la absorbancia a 405 nm
después de 1 h de incubación a temperatura ambiente. Los valores de
absorbancia de los diferentes péptidos fueron divididos con el
valor de la absorbancia del P6 y comparados.
Las secuencias en la apolipoproteína B que
fueron reconocidas por los anticuerpos en el plasma humano se
muestran como Seq. Id 1-37 en la figura
acompañante. Tanto el AHP como el NHP contenían anticuerpos para un
gran número de diferentes péptidos. Los anticuerpos contra péptidos
tanto nativos como modificados fueron identificados. De manera
general, los títulos de anticuerpos para péptidos modificados con
MDA fueron más altos o iguales al del péptido nativo
correspondiente. La comparación entre péptidos nativos, modificados
con MDA, oxidados con cobre mostró un alto grado de correlación, y
mostró que se detectaron los títulos de anticuerpos más altos
usando péptidos modificados con MDA. El uso de péptidos incorporados
en liposomas no dio como resultado niveles aumentados de
anticuerpos. Los anticuerpos de la subclase IgM fueron más comunes
que los anticuerpos del subtipo IgG.
Los péptidos contra los cuales se detectaron los
niveles de anticuerpos más altos se podrían dividir en seis grupos
con características comunes (Tabla 1):
- (A)
- Altos niveles de anticuerpos IgG para péptidos modificados con MDA (n=3).
- (B)
- Altos niveles de anticuerpos IgM, pero sin diferencia entre péptidos nativos y modificados con MDA (n=9).
- (C)
- Altos niveles de anticuerpos IgG, pero sin diferencia entre péptidos nativos y modificados con MDA (n=2).
- (D)
- Altos niveles de anticuerpos IgG para péptidos modificados con MDA y al menos dos veces tantos anticuerpos en el grupo de NHP comparado con el grupo de AHP (n=5)
- (E)
- Altos niveles de anticuerpos IgM para péptidos modificados con MDA y al menos dos veces tantos anticuerpos en el grupo de NHP comparado con el grupo de AHP (n=11).
- (F)
- Altos niveles de anticuerpos IgG, pero sin diferencia entre péptidos intactos y modificados con MDA pero al menos dos veces tantos anticuerpos en el grupo de NHP comparado con el grupo de AHP (n=7).
- (G)
- Ningún nivel de anticuerpos IgG o IgM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- A. IgG alto, diferencia MDA
- \quad
- P 11. FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
- \quad
- P 25. PQCSTHILQWLKRVHANPLL
- \quad
- P 74. VISIPRLQAEARSEILAHWS
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- B. IgM alto, sin diferencia MDA
- \quad
- P 40. KLVKEALKESQLPTVMDFRK
- \quad
- P 68. LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
- \quad
- P 94. DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK
- \quad
- P 99. KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
- \quad
- P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
- \quad
- P 102. SLTSTSDLQSGIIKNTASLK
- \quad
- P 103. TASLKYENYELTLKSDTNGK
- \quad
- P 105. DMTFSKQNALLRSEYQADYE
- \quad
- P 177. MKVKIIRTIDQMQNSELQWP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- C. IgG alto, sin diferencia MDA
- \quad
- P 143. IALDDAKINFNEKLSQLQTY
- \quad
- P 210. KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- D. NHS/AHP, IgG-ak > 2, diferencia MDA
- \quad
- P 1. EEEMLENVSLVCPKDATRFK
- \quad
- P 129. GSTSHHLVSRKSISAALEHK
- \quad
- P 148. IENIDFNKSGSSTASWIQNV
- \quad
- P 162. IREVTQRLNGEIQALELPQK
- \quad
- P 252. EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- E. NHS/AHP, IgM-ak > 2, diferencia MDA
- \quad
- P 301. HTFLIYITELLKKLQSTTVM
- \quad
- P 30. LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
- \quad
- P 31. CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
- \quad
- P 32. GNMGQTMEQLTPELKSSILK
- \quad
- P 33. SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
- \quad
- P 34. IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
- \quad
- P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
- \quad
- P 107. SLNSHGLELNADILGTDKIN
- \quad
- P 149. WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
- \quad
- P 169. TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
- \quad
- P 236. EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- F. NHS/AHP, IgG-ak < 0,5, sin diferencia MDA
- \quad
- P 10. ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
- \quad
- P 45. IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
- \quad
- P 111. SGASMKLTTNGRFREHNAKF
- \quad
- P 154. NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
- \quad
- P 199. GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
- \quad
- P 222. FKSSVITLNTNAELFNQSDI
- \quad
- P 240. FPDLGQEVALNANTKNQKIR
\vskip1.000000\baselineskip
- \quad
- G.
- \quad
- P 2. ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS
\newpage
Todas estas 38 secuencias peptídicas representan
dianas para reacciones inmunitarias que pueden ser de importancia
para el desarrollo de la aterosclerosis y las enfermedades
cardiovasculares isquémicas. Estos péptidos se pueden usar, por
tanto, para desarrollar ELISAs que determinen las asociaciones entre
los niveles de anticuerpos contra secuencias definidas de
aminoácidos modificados con MDA en la apolipoproteína B y el riesgo
de desarrollo de enfermedad cardiovascular.
Estos péptidos también representan posibles
mediadores de la inmunidad protectora observada en animales
experimentales inmunizados con LDL oxidada, y se pueden usar para
el ensayo en el desarrollo futuro de una terapia de inmunización o
"vacuna" contra la aterosclerosis.
Por tanto, se han identificado 38 secuencias
diferentes en la apolipoproteína B humana, que dan lugar a
respuestas inmunitarias significativas en el hombre. Es probable
que estos epitopos representen lo que se ha descrito anteriormente
como anticuerpos para la LDL oxidada. Dado que la mayoría de las
respuestas inmunitarias están dirigidas contra secuencias
peptídicas y la apolipoproteína B es la única proteína en la LDL, el
método usado en este proyecto debe ser capaz de identificar los
epitopos específicos para esencialmente todos los anticuerpos
contra las partículas de LDL oxidada. Se ha descrito que una familia
de anticuerpos fosfolipídicos específicos que incluye anticuerpos
contra la cardiolipina reacciona con la LDL oxidada, pero la
especificidad y el papel de estos anticuerpos quedan por ser
caracterizados completamente.
En muchos casos, los títulos de anticuerpos
fueron más altos para polipéptidos modificados con MDA que para
secuencias nativas. Si se detectaron anticuerpos contra una
secuencia modificada con MDA, esto estuvo casi siempre asociado con
la presencia de anticuerpos contra la secuencia nativa. Una
explicación probable para esto es que la respuesta inmunitaria
contra una secuencia de aminoácidos modificada con MDA en la
apolipoproteína B (produciéndose la modificación con MDA como
resultado de la oxidación de la LDL) conduce a una ruptura de la
tolerancia contra la secuencia nativa. Para otras secuencias no hubo
diferencia en los títulos de anticuerpos contra secuencias
modificadas con MDA o nativas. Esto sugeriría que las reacciones
inmunitarias están dirigidas contra las secuencias nativas. No
debería haber respuesta inmunitaria contra secuencias de aminoácidos
en proteínas expuestas normalmente al sistema inmunitario. En la
partícula de LDL nativa, gran parte de la apolipoproteína B está
oculta en la capa fosfolipídica de la LDL, y por tanto no es
accesible para el sistema inmunitario. Durante la oxidación de la
LDL, la cadena de aminoácidos de la apolipoproteína B se fragmenta,
conduciendo a cambios en la estructura tridimensional. Esto es
probable que conduzca a la exposición de secuencias peptídicas
normalmente no accesibles para el sistema inmunitario, y a la
generación de anticuerpos contra estas secuencias, lo que puede
explicar la presencia de anticuerpos contra secuencias de
apolipoproteína B nativa observada. Alternativamente, la respuesta
inmunitaria real es contra secuencias modificadas con MDA, pero la
reactividad cruzada con secuencias nativas es tan grande que no se
puede demostrar una diferencia en la unión.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
La posibilidad de que los ELISAs basados en
estos péptidos (nativos o modificados con MDA) se puedan usar para
determinar las asociaciones entre la reacción inmunitaria contra
epitopos definidos en la LDL oxidada y la presencia y/o riesgo de
desarrollo de enfermedad cardiovascular fue investigada en un
estudio piloto. El estudio se realizó en pacientes que participaban
en el estudio Malmö Diet Cancer, un estudio basado en la población
en el que más de 30.000 individuos fueron reclutados entre 1989 y
1993. Los niveles de anticuerpos contra 24 de los 38 péptidos
enumerados en la Tabla 1 se determinaron en muestras de plasma de
línea de base de 26 pacientes que desarrollaron un infarto de
miocardio agudo durante el periodo de seguimiento y 26 controles
sanos emparejados por edad, género y hábito de fumar. También se
incluyó un grupo adicional de 26 pacientes, emparejados por edad,
género y hábito de fumar, pero todos con niveles de colesterol LDL
por encima de 5,0 mmol/l, para estudiar los niveles de anticuerpos
en un grupo de alto riesgo que no había desarrollado enfermedad
cardiovascular.
Para 19 de los 24 péptidos analizados, se
identificaron correlaciones significativas entre los niveles de
anticuerpos IgM contra péptidos modificados con MDA y la gravedad de
la aterosclerosis en la arteria carótida, es decir, cuanto más
altos los niveles de anticuerpos más aterosclerosis (Tabla 2). Para
muchos de estos péptidos también existieron correlaciones
significativas entre los niveles de anticuerpos para péptidos
nativos y el grosor de la íntima/media de la carótida. Sólo 4
péptidos mostraron una correlación significativa entre los
anticuerpos IgG y el grosor de la íntima/media de la carótida. Estas
observaciones sugieren que se puede usar un ELISA que use estos
péptidos modificados con MDA (solos o en combinación) para
identificar pacientes con aterosclerosis aumentada.
Cuatro de los péptidos ensayados no sólo estaban
asociados con la presencia aumentada de aterosclerosis sino que
también estaban significativamente elevados en el grupo de pacientes
que más tarde sufrieron un infarto de miocardio (Tabla 2). Los
datos para uno de estos péptidos (péptido 240) se muestran en la
Fig. 7. Estas observaciones también demuestran que se puede usar
también un ELISA basado en péptidos para identificar pacientes con
un riesgo incrementado de desarrollar infarto de miocardio.
Hubo también incrementos significativos en los
niveles de anticuerpos IgG para los péptidos nativos 103, 162 y
199, así como el 102 modificado con MDA en el grupo que más tarde
sufrió un infarto de miocardio. Sin embargo, los anticuerpos IgG
contra estos péptidos no estaban asociados significativamente con la
presencia de aterosclerosis en la arteria carótida.
Se hizo una observación particularmente
interesante con los anticuerpos contra el péptido 210 modificado con
MDA, para el cual hubo niveles significativamente más altos de
anticuerpos IgM en los controles sanos y el grupo de alto riesgo
(colesterol LDL por encima de 5,0 mmol/l) que en el grupo que
desarrolló un infarto de miocardio. Por consiguiente, los
anticuerpos contra el péptido 210 modificado con MDA pueden
representar un marcador para individuos con un riesgo disminuido de
desarrollar una enfermedad cardiovascular.
Se ha demostrado ahora que la inmunización con
secuencias peptídicas de apo B-100 modificadas con
MDA da como resultado una inhibición de la aterosclerosis en
animales experimentales (Nordin Fredrikson, Söderberg et al,
Chyu et al). Los mecanismos a través de los cuales funcionan
estas respuestas ateroprotectoras quedan por ser elucidados
completamente. Sin embargo, una posibilidad probable es que el
efecto autoprotector sea mediado por anticuerpos generados contra
estas secuencias peptídicas. Estos anticuerpos podrían, por ejemplo,
facilitar la eliminación de partículas de LDL dañadas
oxidativamente, por parte de los receptores Fc de los
macrófagos.
Los receptores limpiadores de los macrófagos
sólo reconocen LDL con daño oxidativo extenso (9). Estudios
recientes han identificado la existencia de LDL oxidada circulante
(10, 11). Estas partículas tienen sólo un daño oxidativo mínimo y
no son reconocidas por los receptores limpiadores. La unión de
anticuerpos a estas partículas de LDL oxidada circulantes puede
ayudar a retirarlas de la circulación antes de que se acumulen en el
tejido vascular (12).
Varios estudios han apoyado un papel para los
anticuerpos en la protección contra la aterosclerosis. La
reconstitución de las células B inhibe el desarrollo de
aterosclerosis en ratones esplenoctomizados nulos en apo E (13) así
como la formación de neoíntima después de una lesión en la carótida
en ratones RAG-1 (observaciones no publicadas del
laboratorio de los autores de la invención). Además, se ha mostrado
que inyecciones repetidas de inmunoglobulinas reducen la
aterosclerosis en ratones nulos en apo E (6).
Como se discutió anteriormente, los anticuerpos
contra secuencias peptídicas modificadas con MDA en la apo
B-100 pueden ser generados por inmunización activa
usando péptidos sintéticos. Este procedimiento requiere
2-3 semanas antes de que se obtenga un efecto
completo sobre la producción de anticuerpos.
En algunas situaciones se puede necesitar un
efecto más rápido. Un ejemplo pueden ser las placas ateroscleróticas
inestables en las que es probable que la LDL oxidada contribuya a
inflamación, a toxicidad para las células y a riesgo de ruptura de
la placa. Bajo estas circunstancias, una inmunización pasiva por
inyección de anticuerpos purificados, o producidos de manera
recombinante, contra secuencias nativas y modificadas con MDA puede
tener un efecto más rápido.
Otra situación en la que puede ser eficaz una
inmunización pasiva por inyección de anticuerpos purificados, o
producidos de manera recombinante, es la enfermedad cardiaca
coronaria en individuos de mayor edad. Los estudios de los autores
de la invención han mostrado que se produce una disminución en los
anticuerpos contra las secuencias peptídicas de la apo B al
aumentar la edad en el hombre, y está asociada con un aumento en el
nivel en plasma de LDL oxidada (Nordin Fredrikson, Hedblad et
al). Esto puede sugerir una senescencia de las células
inmunitarias responsables de la producción de anticuerpos contra
antígenos en la LDL oxidada, y da como resultado una retirada
defectuosa de partículas de LDL dañadas oxidativamente de la
circulación. Por consiguiente, estos pacientes se beneficiarían más
de una inmunización pasiva por inyección de anticuerpos
purificados, o producidos de manera recombinante, que de una
inmunización activa con secuencias peptídicas de apo
B-100.
Los péptidos nativos sintéticos
(Euro-Diagnostica AB, Malmö, Suecia) usados en lo
que sigue fueron los péptidos 1, 2 y 301 de la librería
polipeptídica cribada inicialmente.
Se encontró que el péptido 1 (secuencia de
aminoácidos: EEEMLENVSLVCPKDATRFK, n=10) y el péptido 301 (secuencia
de aminoácidos: HTFLIYITELLKKLQSTTVM, n=10) tenían una respuesta de
anticuerpos IgG ó IgM más alta a la forma modificada con MDA que al
péptido nativo, respectivamente, y ambos títulos son más altos en un
paciente sano. Estos péptidos se eligieron en base a la suposición
de que la respuesta de anticuerpos a estos péptidos pudiera ser
protectora contra la aterosclerosis.
El péptido 2 (secuencia de aminoácidos:
ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS, n=10) no provocó respuesta de anticuerpos en
el cribado de anticuerpos inicial, por lo tanto fue elegido como
péptido de control. Ratones que recibieron alumbre sirvieron como
control (n=9).
Ratones apo E (-/-) recibieron una inmunización
primaria subcutánea a las 6-7 semanas de edad,
seguido de una dosis de refuerzo adicional intraperitoneal 3
semanas más tarde. Los ratones fueron alimentados con una dieta
alta en colesterol desde el comienzo de la inmunización y continuada
hasta su sacrificio a la edad de 25 semanas. En el momento del
sacrificio, no hubo diferencia significativa en el peso corporal
entre los 4 grupos de ratones. Ni hubo diferencia estadísticamente
significativa en el colesterol en suero medido usando un kit
disponible en el mercado (Sigma). Sus niveles medios de colesterol
en suero estuvieron todos por encima 715 mg/dl.
El área de la aorta descendente cubierta por la
placa aterosclerótica se midió en una preparación a la vista
después de una tinción con rojo aceite O. En comparación con el
grupo de control, los ratones inmunizados con el péptido Nº 2 y Nº
301 tuvieron una aterosclerosis sustancialmente reducida (Figura 2).
La inmunización con el Péptido Nº 1 no produjo una reducción
significativa en la aterosclerosis en comparación con el control.
En contraste con la aorta descendente, la extensión de la
aterosclerosis en la raíz aórtica y el arco aórtico no difirió
entre los 4 grupos experimentales (Figura 3).
No hubo diferencia entre los 4 grupos en
términos de tamaño de la placa en el seno aórtico o su contenido
lipídico (Tabla A). Los tamaños medios de la placa en los arcos
aórticos de los 4 grupos de ratones no fueron diferentes. Sin
embargo, una evaluación a la vista de los tamaños de la placa de la
aorta torácica y abdominal descendente mediante tinción con rojo
aceite O reveló que el grupo de control y el grupo del péptido nº 1
tenían una cantidad similar de placa aterosclerótica en la aorta,
mientras que los grupos del péptido Nº 2 y Nº 9 tenían una carga
aterosclerótica significativamente reducida en la aorta (Tabla A).
La observación de que la inmunización peptídica no afectó al tamaño
de la placa del seno aórtico o del arco aórtico pero redujo la
placa aórtica descendente es interesante, y sugiere que la
inmunización peptídica podría reducir la formación de placa nueva
pero no afecta a la progresión de las placas.
Se ensayó además si la inmunización peptídica
modula el fenotipo de las placas ateroscleróticas. Se tiñeron
inmunohistoquímicamente secciones congeladas de placas de seno
aórtico con anticuerpo de monocito/macrófago
(MOMA-2, Serotec). En concordancia con los hallazgos
de la observación a la vista, el péptido Nº 2 redujo
significativamente la infiltración de macrófagos en las placas
(Figura 1). Una tinción con tricromo reveló un contenido de
colágeno medio de 40,0\pm7,7% en las placas del seno aórtico del
grupo del péptido 2; mientras que el contenido de colágeno medio en
el grupo control del alumbre, el grupo del péptido 1 y el grupo del
péptido 9 fue 32,3\pm5,3%, 35,6\pm8,5% y 29,4\pm9,6%,
respectivamente.
Se determinó la respuesta de anticuerpos contra
péptido inmunizado en cada grupo. El título de anticuerpos después
de la inmunización aumentó 6,1\pm3,1 veces en el grupo del péptido
1, 2,4\pm1,0 veces en el grupo del péptido 2 y 1,8\pm0,6 veces
en el grupo del péptido 9; mientras que el grupo del alumbre tuvo un
aumento de 3,9\pm2,7 veces del título de anticuerpos contra el
péptido 1, un aumento de 2,0\pm0,5 veces contra el péptido 2 y un
aumento de 2,0\pm0,9 veces contra el péptido 9. Es sorprendente el
aumento paralelo del título de anticuerpos contra los péptidos
inmunizados tanto en el grupo inmunizado como en el tratado con
alumbre. Esto puede significar las siguientes posibilidades: (1)
puede(n) estar implicado(s) un(os)
mecanismo(s) distinto(s) a la respuesta inmunitaria
humoral (tal como respuesta inmunitaria celular) en la modulación de
la aterosclerosis; ó (2) este aumento de anticuerpo fue una
respuesta circunstante a la hipercolesterolemia con el tiempo.
Aunque no hay un mecanismo especulativo claro
para explicar porqué la inmunización peptídica reduce la
aterosclerosis y/o modula el fenotipo de la placa, la novedad de
esta invención es el concepto de usar péptidos de LDL como
inmunógeno y su factibilidad como estrategia de inmunomodulación.
Esta estrategia de inmunización basada en péptidos modula las
placas ateroscleróticas. Se había mostrado que la inmunización
usando oxLDL homóloga o LDL nativa reduce el tamaño de la
placa^{1-3}, sin embargo, la disponibilidad,
producción, contaminación infecciosa y seguridad de la LDL homóloga
humana hace a este método poco atractivo para su aplicación clínica.
Aquí se demuestra que la inmunoterapia basada en péptidos es
factible, aunque los resultados finales de los autores de la
invención difieren de sus hipótesis iniciales en que la inmunización
usando péptidos con una respuesta de anticuerpos IgM ó IgG más alta
en pacientes normales puede proteger a animales experimentales del
desarrollo de placas ateroscleróticas avanzadas.
Es sorprendente encontrar que la inmunización
usando el péptido Nº 2 protegió al animal de desarrollar nuevas
lesiones ateroscleróticas en la aorta descendente y redujo la
infiltración de macrófagos y produjo un contenido de colágeno más
alto en las placas, dado que este péptido no provocó ninguna
respuesta de anticuerpos de un cribado humano inicial. Puede ser
porque (a) el péptido Nº 2 puede ser una parte de la estructura de
la proteína apo-B-100 humana que no
estuvo expuesta al sistema inmunitario humano. Por lo tanto, no se
generó ni detectó anticuerpo en conjuntos de suero humano sano; (b)
la secuencia de aminoácidos del péptido Nº 2 es extraña para los
ratones, por tanto los ratones desarrollaron una respuesta
inmunitaria contra este péptido, que modula la formación de nuevas
lesiones ateroscleróticas y su fenotipo.
El efecto de la inmunización de LDL homólogo
sobre el tamaño de la placa varió cuando se evaluaron los tamaños
de las placas en diferentes partes del árbol aórtico. Por ejemplo,
Amelli et al mostraron en el conejo hipercolesterolémico que
la inmunización de LDL nativo dio como resultado una reducción de la
formación de la placa en la aorta^{1}, mientras que Freigang
et al. mostraron la reducción del tamaño de la placa en el
seno aórtico pero no en la aorta^{2}. Tomando sus hallazgos y los
presentes de manera conjunta, se especuló que la inmunización de
péptidos modula no sólo los tamaños de la placa sino también la
composición de la placa. El efecto de reducción de la placa se
observó sólo en la aorta descendente. Se sabe que los ratones apo E
(-/-) desarrollan lesiones ateroscleróticas en diversas fases de la
evolución del animal, especialmente cuando son alimentados con una
dieta de alto contenido en colesterol. La aparición inicial de la
lesión aterosclerótica en el animal joven fue en el seno
aórtico^{6,7} y, después de 15 semanas con una dieta de alto
contenido en grasas y en colesterol, las lesiones en el seno
aórtico fueron placas avanzadas; mientras que la fase más temprana
de la aterosclerosis estuvo presente en la aorta descendente^{6}.
Dado que el curso temporal de la maduración de la placa y el
desarrollo en la aorta descendente es tardío comparado con el del
seno aórtico, el hallazgo de que la inmunización redujo los tamaños
de la lesión en la aorta descendente pero no en el seno aórtico
sugirió que la inmunización afecta a la fase temprana de la
formación de aterosclerosis. Es posible que según envejezca el
animal y en presencia de un nivel suprafisiológico de colesterol en
suero el efecto reductor de la placa de la inmunización sea
superado por el efecto tóxico de la hipercolesterolemia. También es
posible que las placas del seno aórtico maduren más rápido y el
sacrificio a las 25 semanas sea demasiado tardío para detectar
ninguna diferencia en el tamaño de la placa. Aunque el tamaño de la
lesión no fue modulado en la placa del seno aórtico, la inmunización
peptídica sí moduló las composiciones de la placa. El presente
diseño experimental impidió estudiar la composición de las placas
en su fase más temprana de desarrollo en la aorta descendente.
Los hallazgos experimentales subrayan la
factibilidad de usar secuencias peptídicas de apo
B-100 asociadas a la LDL como inmunógenos para un
nuevo método para prevenir la aterosclerosis y/o modular
favorablemente el fenotipo de la placa a pesar de una
hiperlipidemia severa. Esta estrategia de inmunización basada en
péptidos es potencialmente ventajosa sobre el uso de oxLDL homóloga
o LDL nativa como antígeno porque tal estrategia podría eliminar la
necesidad de aislamiento y preparación de LDL homóloga y sus
acompañantes riesgos de contaminación. El efecto reductor de la
placa de la inmunización con el Péptido Nº 2 y 301 se observó sólo
en la aorta descendente. Estos hallazgos son consistentes con
informes previos en los que se ha mostrado también que otras
intervenciones terapéuticas tienen un mayor efecto sobre la aorta
descendente comparado con el arco aórtico^{14-17},
presumiblemente porque las lesiones se desarrollan más rápidamente
en la raíz aórtica y el arco que en la aorta descendente, creando
así una ventana más pequeña de oportunidad para la
intervención^{14, 15, 16, 18, 19}. Dado que el curso temporal de
la maduración y el desarrollo de la placa en la aorta descendente es
tardío comparado con el del seno aórtico y el arco aórtico, el
hallazgo de que la inmunización redujo los tamaños de la lesión en
la aorta descendente pero no en el seno ni en el arco aórtico
sugiere que la inmunización impide de manera preferente la fase
temprana de la formación de aterosclerosis. Es posible que según
envejezca el animal, y en presencia de un nivel suprafisiológico de
colesterol en suero, el efecto reductor de la placa de la
inmunización sea superado por el efecto tóxico de la
hipercolesterolemia severa. Aunque el tamaño de la lesión no fue
modulado en el seno ni en el arco aórtico, la inmunización con el
Péptido Nº 2 sí moduló la composición de la placa en una dirección
favorable, creando un fenotipo de la placa más estable, con una
infiltración de macrófagos reducida y un contenido en colágeno
aumentado. En resumen, se demuestra un nuevo método
inmunomodulatorio basado en péptidos para la inhibición de la
aterosclerosis en el modelo murino.
En resumen, se demuestra un nuevo método
inmunomodulatorio basado en péptidos en la modulación de las placas
ateroscleróticas. Aunque el cambio en la formación de aterosclerosis
en el modelo de los autores de la invención fue sólo modesto, sin
embargo esta inmunización basada en péptidos puede proporcionar una
herramienta alternativa en el estudio, prevención o tratamiento de
la aterosclerosis.
Preparación de péptidos. Los péptidos se
prepararon usando el kit Imject® SuperCarrier® EDC (Pierce,
Rockford, IL) según las instrucciones del fabricante, con
modificaciones menores. Se mezcló un mg de péptido en 500 \mul de
tampón de conjugación con 2 mg de vehículo en \mul de agua
desionizada. Después esta mezcla se incubó con 1 mg de reactivo de
conjugación (EDC,
1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]
carbodiimida HCl) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después,
esto se dializó contra una disolución de fosfato de sodio 0,083 M,
cloruro de sodio 0,9 M, pH 7,2, durante una noche a 4ºC. El
conjugado dializado se diluyó con tampón de purificación en mezcla
seca Imject hasta un volumen final de 1,5 ml. Se usó alumbre como
inmunoadyuvante y se mezcló con el péptido conjugado con dilución
1:1 en volumen. La cantidad de péptido en cada inmunización fue 33
\mug/100 \mul por inyección.
Protocolo del animal. Ratones apo E (-/-)
de los Jackson Laboratories (Bar Harbor, Me) recibieron una
inmunización primaria subcutánea a las 6-7 semanas
de edad, seguido de una dosis adicional de refuerzo 3 semanas más
tarde. Los ratones fueron alimentados con una dieta alta en
colesterol desde el comienzo de la inmunización y continuada hasta
su sacrificio a la edad de 25 semanas. Se recogieron muestras de
sangre 2 semanas después de la dosis de refuerzo y en el momento
del sacrificio. Ratones que recibieron alumbre sirvieron como
control. El protocolo experimental estaba aprobado por el
Institutional Animal Care and Use Comittee de
Cedars-Sinai Medical Center. Todos los ratones
fueron alojados en una instalación para animales acreditada por la
American Association of Accreditation of Laboratory Animal Care y
fueron mantenidos en un ciclo día/noche de 12 horas, y tuvieron
acceso no restringido a agua y comida. En el momento del sacrificio,
los ratones fueron anestesiados por inhalación de Enflurano. Se
obtuvo plasma por sangrado retroorbital antes del sacrificio.
Recolección y seccionado de tejidos. Para
evaluar el efecto de la inmunización peptídica sobre la formación
de aterosclerosis, se evaluó el tamaño de la placa en el seno
aórtico, el arco aórtico y la aorta torácica y abdominal
descendente. Después de perfundir el corazón y el árbol aórtico con
suero salino normal a presión fisiológica, se extirpó el corazón y
la aorta proximal, y se introdujeron en compuesto OCT
(Tissue-Tek) y se seccionaron en estado congelado.
Se recogieron secciones seriadas de 6 \mum de grosor desde la
aparición de al menos 2 válvulas aórticas hasta la desaparición de
las valvas de la válvula aórtica, para la evaluación de la placa
del seno aórtico. Por regla general, se pusieron 3 secciones
consecutivas en un portaobjetos y se recogieron un total de
25-30 portaobjetos de un ratón, y cada quinto
portaobjetos fue agrupado para tinción. También se seccionaron y
procesaron de manera similar la aorta ascendente y los arcos
aórticos hasta la arteria subclavia izquierda. Las aortas torácica
y abdominal descendentes fueron procesadas por separado para una
evaluación a la vista de la formación de la placa después de una
tinción con rojo aceite O.
Se mezcló a 1:1 albúmina de huevo de pollo
(Sigma) en una concentración de 0,8 g/ml de agua con glicerol. Se
añadió azida de sodio para hacer una concentración final de azida de
sodio de 0,2%. Después de limpiar de tejido circundante y grasa las
aortas torácica y abdominal descendentes, se retiró cuidadosamente
el segmento de aorta desde la arteria subclavia izquierda hasta el
nivel de la arteria renal para su fijación durante una noche en
Histochoice (Amresco). Después, se abrió cuidadosamente la aorta de
manera longitudinal y se puso con el lado luminal hacia arriba
sobre un portaobjetos recientemente recubierto con la solución de
albúmina de huevo. Después de secarse la solución de albúmina, se
tiñó la aorta con rojo aceite O para evaluar la extensión de la
aterosclerosis con histomorfometría asistida por ordenador.
Inmunohistoquímica e histomorfometría.
Las secciones del seno aórtico se tiñeron inmunohistoquímicamente
con anticuerpo MOMA-2 (Serotec) usando un protocolo
estándar. Se hizo una tinción con tricromo para evaluar el
contenido en colágeno, y con rojo aceite O para el tamaño de la
placa y el contenido en lípidos, usando un protocolo de tinción
estándar. Se realizó un análisis morfométrico asistido por ordenador
para evaluar la histomorfometría como se describió previamente
^{8}.
Medición del título de anticuerpos. Para
medir la respuesta de anticuerpos después de la inmunización
peptídica, se desarrolló un ELISA. El título de anticuerpos contra
el péptido inmunizado se midió usando sangre recogida a las 2
semanas después de la dosis de refuerzo y en el sacrificio. También
se determinó la respuesta de anticuerpos contra 3 péptidos en el
grupo del alumbre en los mismos puntos de tiempo. En resumen,
péptidos sintéticos nativos diluidos en PBS, pH 7,4 (20 \mug/ml)
fueron absorbidos en pocillos de placas de microtitulación (Nunc
MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) en una incubación durante una
noche a 4ºC. Después de lavar con PBS que contenía
Tween-20 al 0,05% (PBS-T), las
placas revestidas fueron bloqueadas con SuperBlock en TBS (Pierce)
durante 5 min a temperatura ambiente seguido de una incubación del
suero de los ratones diluido a 1/50 en
TBS-Tween-20 al 0,05%
(TBS-T) durante 2 h a temperatura ambiente y después
durante una noche a 4ºC. Después de aclarar, la deposición de
anticuerpos dirigidos a los péptidos fue detectada usando
anticuerpos Ig de conejo anti-ratón biotinilados
(Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) apropiadamente diluidos en
TBS-T. Después de otra incubación durante 2 h a
temperatura ambiente, se lavaron las placas y los anticuerpos
biotinilados unidos fueron detectados por estreptavidina conjugada
con fosfatasa alcalina (Sigma), incubada durante 2 h a temperatura
ambiente. Usando el kit de sustrato de fosfatasa (Pierce) se
desarrolló la reacción de color y se midió la absorbancia a 405 nm
después de 1 h de incubación a temperatura ambiente. Se calcularon
los valores medios después de restar el fondo.
Son aplicables también, por supuesto, otros
modelos de ensayo, tales como un inmunoensayo que detecta un
anticuerpo, tal como inmunoensayo radiactivo, Western blotting y
Southern blotting, así como la detección de anticuerpos unidos a
péptidos, electrodos enzimáticos y otros métodos para el
análisis.
Los datos se presentan como media \pm
desviación estándar. El método estadístico usado se enumera bien en
el texto, la tabla o la leyenda de la figura. Una p < 0,05 se
consideró como estadísticamente significativa.
Se dan datos adicionales sobre el efecto de la
inmunización con secuencias peptídicas de la apolipoproteína
B-100 sobre la aterosclerosis en la Tabla B a
continuación.
Inmunizaciones usando mezclas de varias
secuencias peptídicas
Inmunizaciones usando una sola
secuencia
peptídica
La administración de los péptidos se lleva a
cabo normalmente por inyección, tal como inyección subcutánea,
inyección intravenosa, inyección intramuscular o inyección
intraperitoneal. Una primera dosificación de inmunización puede ser
de 1 a 100 mg por paciente, dependiendo del peso corporal, la edad,
y otras condiciones físicas y médicas. En situaciones particulares,
también es posible una administración local de una solución que
contenga uno o más de los péptidos, mediante catéter a los vasos
coronarios. También pueden estar contempladas las preparaciones
orales, aunque se deben tomar precauciones particulares para admitir
la absorción en la corriente sanguínea. Una dosificación de
inyección puede contener de 0,5 a 99,5% en peso de uno o más de los
fragmentos o péptidos descritos en la presente memoria.
Los péptidos se administran normalmente unidos a
albúmina de suero bovino cationizado, y usando hidróxido de
aluminio como adyuvante. Se pueden usar también otros adyuvantes
conocidos en la técnica.
Las soluciones para la administración de los
péptidos no deberán contener AEDT ni antioxidantes.
Los péptidos también se pueden usar como agentes
terapéuticos en pacientes que ya padecen una aterosclerosis. Así,
se puede usar cualquier ruta de administración para añadir uno o más
de los fragmentos o péptidos descritos en la presente memoria.
Los estudios iniciales se centraron en
determinar qué tipo de modificaciones oxidativas de los péptidos
conducían al reconocimiento por parte de los anticuerpos presentes
en el plasma humano. Estos estudios se hicieron usando los péptidos
1-5 y 297-302. Durante la oxidación
de la LDL, los ácidos grasos poliinsaturados en los fosfolípidos y
ésteres de colesterilo sufren una peroxidación que conduce a la
formación de productos de ruptura altamente reactivos, tales como
dialdehído malónico (MDA). Después, el MDA puede formar aductos
covalentes con residuos de lisina e histidina en la apo
B-100, haciéndolos altamente inmunogénicos. La
oxidación de la LDL también da como resultado la fragmentación de
la apo B-100, que puede conducir a la exposición de
secuencias peptídicas no accesibles normalmente para el sistema
inmunitario. En estos experimentos, los péptidos se usaron en su
estado nativo, después de la modificación con MDA o después de la
incorporación a liposomas fosfolipídicos seguido de oxidación con
cobre o modificación con MDA. Se identificaron anticuerpos IgM
contra los péptidos nativos, con MDA u oxidados en liposomas, con
títulos de anticuerpos MDA-péptido>péptido en
liposoma modificado con MDA>péptido oxidado en
liposoma>péptido nativo. Ensayos específicos demostraron que la
unión de los anticuerpos a péptidos modificados con MDA estaba
competida tanto por MDA-LDL como LDL oxidada con
cobre.
Después, los autores de la invención realizaron
un cribado de la librería de péptidos completa usando plasma
reunido derivado de pacientes de control sanos y péptidos nativos y
modificados con MDA como antígenos. Se identificaron anticuerpos
para un gran número de sitios en la apo B-100.
Usando dos veces la absorbancia del control de fondo como corte de
título positivo, se detectaron anticuerpos contra 102 de los 302
péptidos que constituían la secuencia de la apo
B-100 completa. La unión de los IgM fue
sustancialmente más abundante que la de los IgG. De manera general,
la unión fue más alta para las secuencias peptídicas modificadas con
MDA que para la secuencia nativa correspondiente, pero hubo una
sorprendente correlación entre las dos. La unión a secuencias tanto
nativas como modificadas con MDA estuvo competida por la adición de
LDL modificada con MDA y LDL oxidada con cobre, pero no por LDL
nativa. Estas observaciones sugieren que las respuestas inmunitarias
contra las secuencias peptídicas modificadas con MDA en la apo
B-100 dan como resultado una reactividad cruzada
contra secuencias nativas. La incapacidad de la LDL nativa de
competir por la unión de anticuerpos a secuencias peptídicas de apo
B-100 nativas es intrigante, pero puede indicar que
estas secuencias sólo llegan a estar expuestas después de la
degradación proteolítica de la apo B-100 que se
produce como resultado de la oxidación de la LDL. Partes tanto
hidrófilas como hidrófobas de la molécula fueron reconocidas por los
anticuerpos. Se realizó un segundo cribado de la librería de
péptidos de la apo B-100 usando plasma reunido de
pacientes con signos clínicos de enfermedad cardiaca coronaria
(ECC), infarto de miocardio agudo (IMA) y angina inestable; n=10).
Los anticuerpos en el plasma ECC reunido se unieron a las mismas
secuencias y con la misma distribución global que para los
anticuerpos en el plasma de control sano. Sin embargo, los títulos
de anticuerpos para varios péptidos (nos. 1, 30-34,
100, 107, 148, 149, 162, 169, 236, 252 y 301) fueron al menos dos
veces tan altos como en el plasma de control comparado con el
plasma de pacientes de ECC, mientras que los títulos contra algunos
péptidos (nos. 10, 45, 111, 154, 199, 222 y 240) fueron más altos en
el plasma de pacientes de ECC comparado con los controles. Después,
los autores de la invención realizaron un estudio clínico
prospectivo para investigar si los niveles de anticuerpos contra
secuencias peptídicas modificadas con MDA en la apo
B-100 predicen el riesgo de desarrollo de ECC.
Usando un diseño de casos y controles anidados, los autores de la
invención seleccionaron 78 pacientes con sucesos coronarios (IMA o
muerte debida a ECC) y 149 controles del Malmö Diet Cancer Study.
Ni los casos ni los individuos de control tenían una historia de IM
o ictus previa. La mediana de tiempo desde la inclusión hasta el
suceso coronario agudo fue 2,8 años (intervalo
0,1-5,9 años) entre los casos. Los niveles de
anticuerpo se determinaron en muestras de plasma de línea de base
suplementadas con antioxidantes. Usando el grosor de la
íntima-media (GIM) de la carótida evaluado por
ultrasonografía en la línea de base, los autores de la invención
analizaron también las asociaciones entre los niveles de anticuerpos
y el grado de enfermedad vascular existente. Los autores de la
invención estudiaron 8 secuencias peptídicas modificadas con MDA
que, en los estudios de cribado iniciales, estaban asociadas con
altos niveles de anticuerpos en plasma (nos. 74, 102 y 210) y/o
diferencias marcadas entre los grupos de plasma ECC y de control
(nos. 32, 45, 129, 162 y 240). Se encontró que los controles tenían
niveles de IgM más altos contra el péptido MDA 74 (0,258, intervalo
0-1,123 unidades de absorbancia frente a 0,178,
intervalo 0-0,732 unidades de absorbancia,
p<0,05), por lo demás no hubo diferencias en los niveles de
anticuerpos entre los casos y los controles. Se observaron las
asociaciones entre el GIM y los IgM contra los péptidos MDA nos.
102, 129 y 162 (r=0,233, 0,232 y 0,234, respectivamente, p<0,05)
en los casos y entre el GIM y el péptido MDA 45 (r=0,18, p<0,05)
en los controles. Se observaron correlaciones débiles entre los
anticuerpos para el péptido MDA 129 y el colesterol total y LDL
(r=0,19 y r=0,19, p<0,01, respectivamente), por lo demás los
niveles de anticuerpos para los péptidos no mostraron asociaciones
con el colesterol total en plasma, colesterol LDL, colesterol HDL o
triglicéridos en plasma. Hubo fuertes covariaciones entre los
niveles de anticuerpos para los diferentes péptidos (valores r que
oscilan de 0,6 a 0,9). La única excepción fueron los anticuerpos
contra el péptido MDA 74, que estuvieron débilmente o no
relacionados en absoluto con los anticuerpos contra los otros
péptidos.
Los anticuerpos contra todas las secuencias
excepto el péptido MDA 74 estuvieron inversamente asociados con la
edad entre los casos (valores r que oscilan de -0,38 a -0,58,
p<0,010,001), pero no en los controles. Los niveles en plasma de
LDL oxidada, en contraste, aumentaron con la edad. De nuevo, esta
asociación fue más fuerte en los casos que en los controles. Para
investigar si las asociaciones entre las respuestas inmunitarias
contra secuencias peptídicas modificadas con MDA y la enfermedad
cardiovascular eran diferentes en grupos de edades diferentes, se
realizó un análisis de subgrupos en los casos y los controles por
debajo y por encima de la mediana de edad (61 años). En el grupo de
edad más joven, los casos tenían niveles incrementados de
anticuerpos contra los péptidos 32 y 45, y niveles disminuidos de
anticuerpos contra el péptido 74 comparado con los controles,
mientras que no se vieron diferencias en el grupo de edad más mayor.
Los anticuerpos contra todas las secuencias peptídicas MDA, excepto
el péptido 74, estaban significativamente asociados con el GIM en
el grupo de edad más joven, pero no en el más mayor (Tabla).
Estos estudios identifican varias secuencias
modificadas con MDA en la apo B-100 que son
reconocidas por anticuerpos humanos. La modificación con MDA de la
apo B-100 se produce como resultado de la oxidación
de la LDL, indicando que estos anticuerpos pertenecen a la familia
de autoanticuerpos de la LDL oxidada descrita previamente. Esta
noción también es apoyada por la observación de que la unión de los
anticuerpos a péptidos de la apo B-100 modificados
con MDA es competida por la adición de LDL oxidada. Junto con los
fosfolípidos oxidados identificados por Hörkö et al, es
probable que estas secuencias peptídicas modificadas con MDA
constituyan la gran mayoría de estructuras antigénicas en la LDL
oxidada. En similitud con los anticuerpos antifosfolípidos de LDL
oxidada, los anticuerpos contra las secuencias de apo
B-100 modificadas con MDA fueron de tipo IgM. Esto
puede sugerir que también estos últimos anticuerpos pertenecen a la
familia de anticuerpos naturales T 15. A los anticuerpos T 15 se
les ha atribuido un papel importante en la defensa temprana,
independiente de las células T, contra las infecciones bacterianas,
así como en la eliminación de células apoptópicas. Queda por
determinar si los anticuerpos de los péptidos MDA aquí descritos
tienen funciones similares. También fueron identificados anticuerpos
contra un gran número de secuencias de apo B-100
nativas. Sin embargo, la sorprendente covariación entre los
anticuerpos para secuencias nativas y modificadas con MDA sugiere
que también estos anticuerpos se forman en respuesta a la oxidación
de la LDL. También es posible que los anticuerpos contra una
secuencia peptídica modificada con MDA reaccionen de manera cruzada
con la correspondiente secuencia nativa. Si los anticuerpos contra
secuencias de apo B-100 nativas se unen también a
partículas de LDL nativas, es probable que esto tenga una
influencia principal sobre el metabolismo de la LDL. Sin embargo, el
hallazgo de que la LDL nativa no compite con la unión de
anticuerpos a secuencias de apo B-100 nativas, así
como la falta de correlación entre los anticuerpos contra
secuencias de apo B-100 nativas y los niveles de
colesterol LDL están en contra de la existencia de tal
fenómeno.
Los anticuerpos contra secuencias peptídicas
modificadas con MDA disminuyeron progresivamente con la edad en los
casos, pero no en los controles. Con la excepción del péptido MDA
74, los anticuerpos IgM contra péptidos MDA estuvieron
significativamente asociados con el GIM de la carótida en el grupo
de edad más joven (por debajo de 62 años), pero no en el grupo de
edad más mayor. Estos hallazgos sugieren que tienen lugar cambios
significativos en las interacciones entre el sistema inmunitario y
la pared vascular aterosclerótica entre las edades de 50 y 70 años.
Una posibilidad es que, en individuos más jóvenes, el proceso de la
enfermedad aterosclerótica está en una fase más activa, con una
implicación más destacada de las células inmunitarias. Otra
posibilidad es que los niveles disminuidos de anticuerpos contra
secuencias peptídicas modificadas con MDA en pacientes más mayores
reflejan una senescencia de las células inmunitarias implicadas en
la aterosclerosis. Se ha propuesto que una función dañada de las
células inmunitarias debido a la inmunosenescencia contribuye a una
susceptibilidad incrementada a las infecciones y al cáncer en la
población más mayor. De manera interesante, la inmunosenescencia es
inhibida por antioxidantes, lo que indica una implicación de la
tensión oxidativa. Es probable que las células inmunitarias que
interactúan con epitopos en la LDL oxidada estén particularmente
expuestas a la tensión oxidativa. Dado que la LDL oxidada está
presente en las arterias ya a edad muy temprana, estas respuestas
inmunitarias están siendo continuamente desafiadas durante varias
décadas, lo que puede contribuir adicionalmente a un desarrollo de
inmunosenes-
cencia.
cencia.
Se encontró que un aumento de anticuerpos contra
dos sitios en la apo B-100 predicen el riesgo de
infarto de miocardio y muerte coronaria en pacientes por debajo de
62 años de edad. Los anticuerpos contra estos sitios mostraron un
alto nivel de covariación, sugiriendo que fueron producidos en
respuesta a los mismos procesos patofisiológicos subyacentes. El
hecho de que la mediana de tiempo desde la toma de muestra de sangre
hasta el suceso coronario fuera sólo 2,8 años hace a estos
anticuerpos particularmente interesantes como marcadores para el
riesgo incrementado de ECC. Los niveles de anticuerpos contra
secuencias peptídicas de apo B-100 modificadas con
MDA no mostró asociaciones con otros factores de riesgo de ECC tales
como hiperlipidemia, hipertensión y diabetes, sugiriendo que son
marcadores independientes del riesgo de ECC. Los casos de ECC en el
presente estudio no fueron individuos de riesgo extremadamente
alto, y a este respecto, representativos del paciente de ECC común.
El hallazgo de que los IgM contra secuencias peptídicas de apo
B-100 modificadas con MDA predice el riesgo a corto
plazo de desarrollo de sucesos coronarios agudos en individuos que
no habrían sido identificados como de alto riesgo por cribado de
los factores de riesgo establecidos sugiere que puede llegar a ser
un instrumento útil en la identificación de individuos necesitados
de un tratamiento preventivo agresivo. No obstante, se requieren
estudios prospectivos considerablemente mayores, con análisis
multivariados, antes de que se pueda establecer completamente el
valor clínico de la determinación de anticuerpos contra secuencias
peptídicas de apo B-100 modificadas con MDA. Otra
limitación del presente estudio clínico es que los autores del mismo
sólo han analizado anticuerpos contra un pequeño número de los
sitios antigénicos en la apo B-100, y que los
títulos de anticuerpos contra otros sitios podrían ser marcadores
incluso mejores del riesgo cardiovascular.
En pacientes por debajo de 60 años, los
anticuerpos contra un gran número de sitios modificados con MDA en
la apo B-100 estaban correlacionados con la
extensión de la enfermedad vascular existente, evaluada por el GIM
de la carótida. Los anticuerpos IgM estaban más estrechamente
asociados con el GIM de la carótida que los anticuerpos IgG. Aunque
el GIM de la carótida tiene limitaciones obvias como medida de la
carga aterosclerótica general, estas observaciones sugieren no
obstante que la determinación de los IgM contra secuencias
modificadas con MDA en la apo B-100 puede ser un
método para evaluar la gravedad de la aterosclerosis existente.
Estas observaciones también están en línea con varios estudios
previos que han informado sobre asociaciones entre la enfermedad de
la arteria coronaria y carótida y anticuerpos IgM contra la LDL
oxidada.
Los anticuerpos contra el péptido 74 difirieron
de otros anticuerpos de los péptidos de la apo B-100
en muchos respectos. Fueron más altos en los controles que en los
casos, no disminuyeron con la edad y no estaban asociados con la
extensión de la enfermedad de la carótida. Por consiguiente, los
anticuerpos contra esta secuencia peptídica representan candidatos
interesantes para una respuesta inmunitaria ateroprotectora.
Una cuestión importante es por qué se producen
estas asociaciones. Estas demuestran claramente que las respuestas
inmunitarias contra sitios de la apo B-100
modificados con MDA están implicadas de algún modo en el proceso de
la enfermedad aterosclerótica. Dado que los niveles altos de
anticuerpos están asociados con la aterosclerosis más grave y con
un riesgo incrementado de desarrollo de sucesos coronarios agudos,
una posibilidad obvia es que estas respuestas inmunitarias
promuevan la aterogénesis. Estudios que demuestran que las
respuestas inmunitarias contra proteínas de choque térmico, tales
como la HSP 65, son aterogéricas proporcionan algún apoyo para esta
noción. Sin embargo, estudios experimentales con animales han
mostrado un efecto ateroprotector de la inmunización de la LDL
oxidada. La reconstitución de células B de ratones nulos en apo E
esplenoctomizados da como resultado una disminución de la
aterosclerosis. También se ha observado una reducción de la
aterosclerosis en ratones nulos en apo E a los que se les dieron
inyecciones repetidas de inmunoglobulina. Las presentes
observaciones no necesariamente discuten el papel ateroprotector de
las respuestas inmunitarias contra la LDL oxidada. Estas respuestas
inmunitarias son activadas por procesos proaterogénicos tales como
la oxidación de la LDL. Por consiguiente, también es probable que
estén en proporción a la gravedad del proceso de la enfermedad, y
podrían servir como marcadores de la gravedad de la enfermedad y el
riesgo de ECC sin contribuir a la progresión de la enfermedad. El
hallazgo de que la inmunización de ratones nulos en apo E con
secuencias peptídicas de la apo B-100 inhibe el
desarrollo de aterosclerosis, reportado en dos papeles acompañantes,
demuestra que este es probablemente el caso. De hecho, el resultado
más importante del presente estudio bien puede ser la identificación
de estructuras que se podrían usar como componentes de una vacuna
contra la aterosclerosis. La observación de que la disminución en
anticuerpos contra secuencias peptídicas modificadas con MDA en la
apo B-100 que se produce con la edad es acompañada
por un aumento en los niveles en plasma de LDL oxidada sugiere que
una retirada incrementada de la circulación de LDL mínimamente
oxidada puede ser un mecanismo por el cual estos anticuerpos
podrían proteger contra la aterosclerosis.
Los pacientes de estudio, nacidos entre
1926-45, pertenecen a la cohorte del estudio "Diet
and Cancer (MDC)" de Malmö. Un 50% al azar de aquellos que
entraron en el estudio MDC entre noviembre de 1991 y febrero de 1994
fueron invitados a tomar parte en un estudio sobre la epidemiología
de la enfermedad de la arteria carótida. Se han reportado rutinas
para el establecimiento de información sobre la morbilidad y
mortalidad después del examen de salud, así como para la definición
de factores de riesgo tradicionales.
Se identificaron ochenta y cinco casos de
sucesos de enfermedad cardiaca coronaria aguda, es decir, IM fatal
o no fatal, o muertes debidas a enfermedad cardiaca coronaria (ECC).
Los participantes que tenían una historia de infarto de miocardio o
ictus (n=6) no fueron elegibles para el presente estudio. Para cada
caso, dos controles sin historia de infarto de miocardio o ictus
fueron emparejados individualmente en cuanto a edad, sexo, hábitos
de fumar, presencia de hipertensión y mes de participación en el
examen de cribado y duración del seguimiento. Debido a razones
logísticas (las muestras de sangre no estuvieron disponibles en
cantidad suficiente para la evaluación de péptidos) sólo un control
estuvo disponible para siete casos y ningún control para un caso.
Este caso fue excluido del análisis. Así, la población del estudio
consiste en 227 pacientes, 785 casos y 149 controles, de
49-67 (mediana 61) años en la línea de base.
Después de una noche de ayuno, se extrajeron
muestras de sangre para la determinación de los valores en suero de
colesterol total, triglicéridos, colesterol HDL, colesterol LDL y
glucosa en sangre total. El colesterol LDL en mmol/l se calculó
según la fórmula de Friedewald. La LDL oxidada se midió por ELISA
(Mercordia).
Se usó un Sistema de Tomografía Computerizada
Acuson 128 (Acuson, Mountain View, California) con un transductor
de MHz para la evaluación de placas carotidales en la arteria
carótida derecha como se describe previamente.
Se sintetizaron los 302 péptidos
correspondientes a la secuencia de aminoácidos de la apolipoproteína
B humana entera (Euro-Diagnostica AB, Malmö,
Suecia, y KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Dinamarca) y se usaron en
ELISA. Se modificó una fracción de cada péptido sintético con MDA
0,5 M (Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suecia)
durante 3 h a 37ºC y en presencia de liposomas con MDA 0,5 M durante
3 h a 37ºC o con CuCl_{2} 5 mM (Sigma) durante 18 h a 37ºC. Los
péptidos modificados con MDA fueron dializados contra PBS que
contenía AEDT 1 mM con varios cambios durante 18 h a 4ºC. La
modificación de los péptidos fue ensayada en geles de poliacrilamida
desnaturalizados (BioRad Laboratories, Hercules, CA), adecuados
para la separación de péptidos.
Una mezcla de fosfatidilcolina de huevo (EPC)
(Sigma) y fosfatidilserina (PS) (Sigma) en una disolución en
cloroformo a una relación molar de 9:1 y una concentración de
fosfolípido (PL) de 3 mM fue evaporada en un recipiente de vidrio
bajo una corriente de argón suave. Después, se puso a vacío el
recipiente durante 3 horas. Se añadió una disolución que contenía
péptido 0,10 mM (5 ml) en tampón HEPES 10 mM filtrado en condiciones
estériles, pH 7,4, NaCl 145 mM y azida de sodio al 0,03% a la
película seca de EPC/PS, y se incubó durante 15 min a 50ºC. La
mezcla se centrifugó suavemente en un vórtex durante aproximadamente
5 min a temperatura ambiente y después se puso en un baño de hielo
y se sonicó con 7,5 micrómetros de amplitud durante 3 x 3 min
(Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Medlab, Suecia) con
interrupciones de 1 min. La mezcla PL-péptido,
nativo o modificado con MDA 0,5 M durante 3 h a 37ºC o CuCl_{2} 5
mM durante 18 h a 37ºC, se almacenó en atmósfera de argón en viales
de vidrio a 4ºC envueltos en papel de aluminio, y se usó antes de 1
semana. La mezcla modificada con MDA fue dializada contra PBS que
contenía AEDT 1 mM con varios cambios durante 18 h a 4ºC antes de su
almacenamiento. La modificación de la mezcla fue ensayada en geles
de poliacrilamida desnaturalizados (BioRad Laboratories AB,
Sundyberg, SE), adecuados para la separación de péptidos.
Péptidos sintéticos nativos o modificados
diluidos en PBS, pH 7,4 (20 leg/ml), en presencia o ausencia de
liposomas, fueron absorbidos en pocillos de placas de
microtitulación (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskide, Dinamarca) en una
incubación durante una noche a 4ºC. Como referencia, uno de los
péptidos (P6) fue ensayado en cada placa. Después de lavar con PBS
que contenía Tween-20 al 0,05%
(PBS-T) las placas revestidas fueron bloqueadas con
SuperBlock en TBS (Pierce, Rockfold, IL) durante 5 min a temperatura
ambiente, seguido de una incubación de plasma humano reunido,
diluido a 1/100 en TBS-Tween-20 al
0,05% (TBS-T) durante 2 h a temperatura ambiente y
después durante una noche a 4ºC. Después de aclarar, la deposición
de autoanticuerpos dirigidos a los péptidos fue detectada usando
anticuerpos IgG ó IgM antihumanos de conejo biotinilados (Dako A/S,
Glostrup, Dinamarca) diluidos apropiadamente en
TBS-T. Después de otra incubación durante 2 h a
temperatura ambiente, se lavaron las placas y los anticuerpos
biotinilados unidos fueron detectados por estreptavidina conjugada
con fosfatasa alcalina (Sigma), incubada durante 2 h a temperatura
ambiente. La reacción de color fue desarrollada usando un kit de
substrato de fosfatasa (Pierce) y se midió la absorbancia a 405 nm
después de 1 h de incubación a temperatura ambiente. Los valores de
absorbancia de los diferentes péptidos fueron divididos con el valor
de absorbancia del P6 y comparados.
Se usó SPSS para los análisis estadísticos. Los
resultados se presentan como mediana y rango, y como proporciones
cuando sea apropiado. Se usaron gráficos de cajas y gráficos de
dispersión hasta ilustrar la relación entre la edad y los péptidos
seleccionados entre los casos y los correspondientes controles.
También se usaron los gráficos correspondientes para ilustrar la
relación entre la edad y los péptidos seleccionados, los casos y
controles, respectivamente, por debajo y por encima de la mediana de
edad (61 años) en la línea de base y por separado para casos y
controles por debajo de la mediana de edad. En los casos y
controles, por separado, se computaron los coeficientes de
correlación parcial, ajustados para edad y sexo, entre los péptidos
seleccionados y los niveles de lípidos en sangre y los GIM de la
carótida comunes. También se computaron los coeficientes de
correlación parcial ajustados en edad y sexo entre los GIM de la
carótida comunes y los péptidos seleccionados en casos y controles
por debajo y por encima de la mediana de edad. Se usó un test t de
muestras independientes para evaluar variables continuas
distribuidas normalmente y un test Chi-cuadrado para
las proporciones entre casos y controles. Se usó un test no
paramétrico (Mann-Whitney) para evaluar variables
continuas distribuidas no normalmente entre casos y controles.
Todos los valores son de dos colas.
Coeficiente de correlación ajustado a edad y
sexo para diferentes péptidos MDA de línea de base y grosor de la
íntima-media de la arteria carótida común entre los
casos más jóvenes (49-61 años) y más mayores
(62-67 años) con infarto de miocardio y sus
correspondientes controles emparejados por edad, sexo, hábito de
fumar e hipertensión.
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(1994).
Las Figuras 1-6 muestran la
respuesta de anticuerpos a los diferentes péptidos preparados de
acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria.
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 1 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 2 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 3 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 4 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 5 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 6 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 7 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 8 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 9 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 10 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 11 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
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\hskip0.5cm
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 12 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 13 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
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\hskip0.5cm
\vskip1.000000\baselineskip
| Lista de secuencia: Seq. ID NO 14 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 15 |
| Fuente: Fragmento de apolipoproteína B |
| Longitud: 20 |
| Tipo: péptido de aminoácidos |
| Hebra: Simple |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 16 |
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| Hebra: Simple |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 17 |
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| Hebra: Simple |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 18 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 22 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 23 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 26 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 27 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 28 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 33 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 34 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 36 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 37 |
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| Lista de secuencia: Seq. ID NO 38 |
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| Hebra: Simple |
| Topología: Lineal |
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\hskip0.5cm
Claims (9)
1. Un anticuerpo purificado o producido de
manera recombinante contra un fragmento de la apolipoproteína B, en
donde el fragmento es IEIGLEGKGFEPTLEALFGK (SEQ. ID NO. 32).
2. Anticuerpo según la reivindicación 1, en
donde el fragmento es nativo o en forma oxidada.
3. Anticuerpo según la reivindicación 2, en
donde el fragmento es un derivado de aldehído.
4. Anticuerpo según la reivindicación 3, en
donde el fragmento se modifica usando dialdehído malónico o
hidroxinonenal.
5. Anticuerpo según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 ó 4, en donde el fragmento es un hapteno de un
aldehído.
6. Anticuerpo según la reivindicación 2, en
donde el fragmento ha sido oxidado usando cobre.
7. Anticuerpo según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en donde el fragmento está presente en
una combinación con liposomas fosfolipídicos.
8. Preparación farmacéutica para el tratamiento
profiláctico o terapéutico de un mamífero, incluyendo un ser
humano, contra las enfermedades cardiovasculares isquémicas, que
comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo
purificado o producido de manera recombinante de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un anticuerpo según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7 para uso en medicina.
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