PL217858B1 - Fragment apolipoproteiny B lub jego miejsce aktywne, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i szczepionka, zastosowanie tego fragmentu, szczepionka zawierająca przeciwciało przeciwko temu fragmentowi, sposób diagnozowania in vitro oraz zastosowanie tego przeciwciała - Google Patents
Fragment apolipoproteiny B lub jego miejsce aktywne, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i szczepionka, zastosowanie tego fragmentu, szczepionka zawierająca przeciwciało przeciwko temu fragmentowi, sposób diagnozowania in vitro oraz zastosowanie tego przeciwciałaInfo
- Publication number
- PL217858B1 PL217858B1 PL391615A PL39161502A PL217858B1 PL 217858 B1 PL217858 B1 PL 217858B1 PL 391615 A PL391615 A PL 391615A PL 39161502 A PL39161502 A PL 39161502A PL 217858 B1 PL217858 B1 PL 217858B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- fragment
- peptide
- mda
- antibodies
- antibody
- Prior art date
Links
- 230000003053 immunization Effects 0.000 title claims abstract description 71
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title description 40
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 title description 5
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 title description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 title description 3
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 title 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 87
- 101710095342 Apolipoprotein B Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract description 62
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 17
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 11
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical group O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 84
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 claims description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 15
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 14
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 11
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 10
- STRVVRPNBAHXRJ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxynon-2-enal Chemical compound CCCCCCC=C(O)C=O STRVVRPNBAHXRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims description 7
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 2
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 claims description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 2
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 240
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 87
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 64
- 108010071584 oxidized low density lipoprotein Proteins 0.000 description 61
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 54
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 45
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 45
- 108010008150 Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 32
- 102000006991 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 32
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 28
- 238000011161 development Methods 0.000 description 25
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 25
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 21
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 19
- 210000003291 sinus of valsalva Anatomy 0.000 description 18
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 17
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 16
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 210000002376 aorta thoracic Anatomy 0.000 description 13
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 12
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 12
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 12
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 11
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 description 11
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 10
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 10
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 102000013918 Apolipoproteins E Human genes 0.000 description 8
- 108010025628 Apolipoproteins E Proteins 0.000 description 8
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 238000008214 LDL Cholesterol Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- DAZBILQQVFBVPE-XKKUQSFHSA-N (2s)-4-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-4-amino-2-[[2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-1-[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s,3r)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexan Chemical class C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CCC1 DAZBILQQVFBVPE-XKKUQSFHSA-N 0.000 description 6
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 6
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 6
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 6
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 5
- 208000014882 Carotid artery disease Diseases 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000889953 Homo sapiens Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 5
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 230000000879 anti-atherosclerotic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N Oil red O Chemical compound Cc1ccc(C)c(c1)N=Nc1cc(C)c(cc1C)N=Nc1c(O)ccc2ccccc12 NPGIHFRTRXVWOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 4
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 102000052249 human APOB Human genes 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000037876 carotid Atherosclerosis Diseases 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001765 aortic valve Anatomy 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 108010011990 peptide 74 Proteins 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 210000003270 subclavian artery Anatomy 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001488 Aggression Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018616 Apolipoproteins B Human genes 0.000 description 1
- 108010027006 Apolipoproteins B Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000010867 Carotid Artery injury Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 102000011965 Lipoprotein Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010061306 Lipoprotein Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 102000001183 RAG-1 Human genes 0.000 description 1
- 108060006897 RAG1 Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000016571 aggressive behavior Effects 0.000 description 1
- 208000012761 aggressive behavior Diseases 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000000489 anti-atherogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003627 anti-cholesterol Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 230000036523 atherogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000923 atherogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000364 effect on atherosclerosis Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- JPGQOUSTVILISH-UHFFFAOYSA-N enflurane Chemical compound FC(F)OC(F)(F)C(F)Cl JPGQOUSTVILISH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000305 enflurane Drugs 0.000 description 1
- 210000002745 epiphysis Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000260 hypercholesteremic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000001571 immunoadjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000010832 independent-sample T-test Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 210000002254 renal artery Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102000014452 scavenger receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010078070 scavenger receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/775—Apolipopeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest fragment apolipoproteiny B lub jego miejsce aktywne, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i szczepionka, zastosowanie tego fragmentu, szczepionka zawierająca przeciwciało przeciwko temu fragmentowi, sposób diagnozowania in vitro oraz zastosowanie tego przeciwciała.
Niniejszy wynalazek oparty jest na peptydzie, który może być stosowany w terapii immunizacyjnej przeciwko miażdżycy, czy też testach immunologicznych do określania odpowiedzi przeciwko utlenionej lipoproteinie niskiej gęstości i diagnozowania obecności lub nieobecności miażdżycy.
W niniejszym opisie opisane zostało w szczególności:
1) zastosowanie dowolnego z peptydów wymienionych w tabeli 1, pojedynczo lub w kombinacji, natywnych lub modyfikowanych MDA, korzystnie razem z odpowiednim nośnikiem i adiuwantem jako immunoterapia lub „przeciwmiażdżycowa szczepionka” do zapobiegania i leczenia niedokrwiennej choroby krążenia (sercowo-naczyniowej)
2) zastosowanie tych samych peptydów w ELISA do wykrywania przeciwciał związanych ze zwiększonym lub obniżonym ryzykiem rozwoju niedokrwiennej choroby krążenia.
Miażdżyca tętnic jest chorobą przewlekłą, która powoduje zgrubienie błony wewnętrznej dużych i średniej wielkości naczyń krwionośnych. Obniża ona przepływ krwi i może powodować niedotlenienie i uszkodzenie tkanek w narządach odżywianych przez dotknięte naczynie. Miażdżyca jest główną przyczyną schorzeń układu krążenia, włączając zawał mięśnia sercowego, udar i chorobę obwodowych naczyń krwionośnych. Jest ona główną przyczyną zgonów w krajach zachodnich i przewiduje się, że stanie się główną przyczyną zgonów na całym świecie w ciągu dwóch dziesięcioleci.
Choroba rozpoczyna się od nagromadzenia lipoprotein, głównie lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) w macierzy zewnątrzkomórkowej naczynia. Te cząstki LDL agregują i przechodzą modyfikację utleniającą. Utleniony LDL jest toksyczny i powoduje uszkodzenie naczyń. Miażdżyca tętnic w wielu aspektach reprezentuje odpowiedź na to uszkodzenie, łącznie z zapaleniem i zwłóknieniem.
W 1989 Palinski i współpracownicy zidentyfikowali u człowieka krążące autoprzeciwciała przeciwko utlenionemu LDL. Obserwacja ta sugerowała, że miażdżyca może być chorobą autoimmunizacyjną, powodowaną przez reakcje immunologiczne przeciwko utlenionym lipoproteinom. W tym czasie kilka laboratoriów rozpoczęło poszukiwanie związku pomiędzy mianem przeciwciał przeciwko utlenionemu LDL, a chorobą układu krążenia. Jednakże, obraz, który powstał na podstawie tych badań był niejasny. Istniały przeciwciała przeciwko dużej liczbie różnych epitopów w utlenionym LDL, ale struktura tych epitopów była nieznana. Określenie „przeciwciała przeciwko utlenionemu LDL” odnosi się zatem raczej do nieznanej mieszaniny różnych przeciwciał, niż do jednego specyficznego przeciwciała. Przeciwciała IgM niezależne od komórek T były częstsze niż przeciwciała IgG zależne od komórek T.
Przeciwciała przeciwko utlenionemu LDL były obecne zarówno u pacjentów z chorobą układu krążenia, jak i u kontrolnych zdrowych. Chociaż niektóre wczesne badania stwierdzały związek pomiędzy mianami przeciwciał przeciwko utlenionemu LDL, a chorobą układu krążenia, inne nie były w stanie znaleźć takich związków. Podstawową wadą tych badań było to, że testy ELISA stosowane do oznaczenia miana przeciwciał jako ligand wykorzystywały cząstki utlenionego LDL. Skład LDL jest różny u różnych osób, stopień modyfikacji utleniającej jest trudny zarówno do kontroli, jak i oceny i poziom przeciwciał przeciwko różnym epitopom w cząstkach utlenionego LDL nie może zostać określony. Do pewnego stopnia, z powodu problemów technicznych, było trudno ocenić rolę odpowiedzi humoralnej przeciwko utlenionemu LDL z użyciem dotychczas dostępnych technik, jednakże, nie jest możliwe stworzenie dobrze określonych i powtarzalnych składników szczepionki, jeśli ktoś używałby całych cząstek utlenionego LDL.
Innym sposobem zbadania możliwości, że reakcje autoimmunologiczne przeciwko utlenionemu LDL w ścianie naczynia odgrywają rolę w rozwoju miażdżycy, jest immunizacja zwierząt przeciwko ich własnemu utlenionemu LDL. Założenie tego podejścia jest takie, że jeśli reakcje autoimmunizacyjne przeciw utlenionemu LDL zostają wzmocnione przy użyciu klasycznych technik immunizacyjnych, spowodowałoby to nasilone zapalenie naczyń i postęp miażdżycy. Dla sprawdzenia tej hipotezy, króliki zostały immunizowane homologicznym utlenionym LDL, a następnie wywoływano u nich miażdżycę przez karmienie zwierząt wysoko-cholesterolową dietą przez 3 miesiące.
Jednakże, wbrew początkowej hipotezie, immunizacja utlenionym LDL miała ochronny skutek, obniżając miażdżycę o około 50%. Podobne rezultaty otrzymano również w następnym badaniu, w którym wysoko-cholesterolowa dieta została połączona z uszkodzeniem naczyń balonikiem w celu
PL 217 858 B1 spowodowania bardziej agresywnego rozwoju płytek. Równocześnie z naszymi badaniami, szereg innych laboratoriów ogłosiło podobne spostrzeżenia. Uwzględniane łącznie dostępne dane, jasno wykazują, że istnieją reakcje immunologiczne, które chronią przed rozwojem miażdżycy i że wiążą się one z reakcją autoimmunizacyjną przeciwko utlenionemu LDL.
Te obserwacje również sugerują możliwość rozwoju terapii immunologicznej lub „szczepionki” do leczenia u człowieka choroby układu krążenia spowodowanej miażdżycą. Jednym z podejść, aby to osiągnąć, byłaby immunizacja osoby jej własnym LDL, po tym, jak był on utleniany przez wystawienie na działanie, na przykład, miedzi. Jednakże, to podejście jest skomplikowane przez fakt, że nie wiadomo, jaka struktura w utlenionym LDL jest odpowiedzialna za indukcję ochronnej odpowiedzi immunologicznej i czy utleniony LDL również nie zawiera epitopów, które mogą wywołać niepożądane reakcje immunologiczne.
Identyfikacja epitopów w utlenionym LDL jest istotna z szeregu powodów:
Po pierwsze, prawdopodobnie jeden lub większa liczba tych epitopów jest odpowiedzialna za aktywację odpowiedzi immunologicznej przeciwko anty-aterogennej odpowiedzi immunologicznej zaobserwowanej u zwierząt immunizowanych utlenionym LDL. Peptydy zawierające te epitopy mogą zatem reprezentować możliwość rozwoju terapii immunologicznej lub „szczepionki przeciwmiażdżycowej” u człowieka. Ponadto, mogą one być użyte do terapeutycznego leczenia miażdżycy rozwiniętej u człowieka.
Po drugie, peptydy zawierające zidentyfikowane epitopy mogą być używane do opracowania testów ELISA zdolnych do wykrywania przeciwciał przeciwko specyficznej strukturze w utlenionym LDL. Taki test ELISA byłby dokładniejszy i bardziej wiarygodny, niż te obecnie dostępne wykorzystujące cząstki utlenionego LDL jako antygen. Umożliwiłoby to również analizę odpowiedzi immunologicznych przeciwko różnym epitopom w utlenionym LDL związanym z chorobą układu krążenia.
Opis patentowy USA nr 5,972,890 dotyczy zastosowania peptydów do diagnozowania miażdżycy. Metoda przedstawiana we wspomnianym opisie patentowym USA jest w zasadzie postacią diagnostyki radiofizycznej. Sekwencja peptydowa jest wyznakowana radioaktywnie i wstrzyknięta do krwiobiegu. Jeśli sekwencja ta jest identyczna z sekwencjami obecnymi w apolipoproteinie B, zwiąże się ona z tkanką, gdzie znajdują się receptory dla apolipoproteiny B. W naczyniach jest to przede wszystkim płytka miażdżycowa. Skupienie radioaktywności w ścianie naczynia może być następnie stwierdzone, np. z użyciem kamery gamma. Sposób jest zatem radiofizyczną metodą diagnostyczną opartą na tym, że radioaktywnie wyznakowane sekwencje peptydowe będą związane z ich prawidłowymi receptorami tkankowymi obecnymi w płytce miażdżycowej i są wykrywane z użyciem zewnętrznej analizy radioaktywności. Jest to metoda analizy bezpośredniej identyfikacji płytki miażdżycowej. Wymaga podania pacjentowi składników radioaktywnych.
Opisany niniejszym sposób jest oparty na zupełnie innych zasadach i metodach. Opisane poniżej fragmenty apolipoproteiny B można stosować do immunizacji przeciwko chorobie układu krążenia, jak również w sposobie diagnozowania reakcji immunologicznych przeciwko sekwencjom peptydowym apolipoproteiny B. Takie reakcje immunologiczne z kolei okazały się wzmożone u osób cierpiących na zaawansowaną miażdżycę. Opisany tu sposób jest oparty na wiązaniu sekwencji peptydowych na dnie studzienek polimerowych. Gdy dodana zostaje próbka krwi, peptydy będą wiązać przeciwciała, które są specyficzne wobec tych sekwencji. Ilość związanych przeciwciał jest następnie określana z użyciem metody/techniki immunologicznej. W przeciwieństwie do techniki opisanej we wspomnianym powyżej opisie patentowym USA, nie jest to zatem metoda bezpośredniego oznaczenia do identyfikacji i lokalizacji płytki miażdżycowej, ale metoda określająca odpowiedź immunologiczną, która wykazuje wysoki stopień korelacji z rozległością miażdżycy.
Podstawowa zasada opisana niniejszym jest zatem zupełnie inna od tej we wspomnianym opisie patentowym. Ta ostatnia zależy od wiązania sekwencji peptydowych z prawidłowymi receptorami lipoprotein obecnymi w tkance miażdżycowej, podczas gdy ta pierwsza jest oparta na ujawnieniu reakcji immunologicznych przeciwko sekwencjom peptydowym i oznaczeniu przeciwciał przeciwko tym sekwencjom peptydowym.
Opublikowane badania (Palinski i wsp., 1995, i George i wsp., 1998) wykazały, że immunizacja przeciwko utlenionemu LDL hamuje rozwój miażdżycy. To wskazywałoby, że reakcje immunologiczne przeciwko utlenionemu LDL na ogół mają ochronny skutek. Jednakże przedstawione tu wyniki niespodziewanie wykazały, że nie jest tak zawsze. Np. immunizacja z użyciem mieszaniny peptydów nr 10, 45, 154, 199, i 240 dała początek nasilonemu rozwojowi miażdżycy. Immunizacja z użyciem innych sekwencji peptydowych, np. sekwencji peptydowych nr 1, i 30 do 34 zupełnie nie miała wpływu na
PL 217 858 B1 rozwój miażdżycy. Wyniki te są zaskakujące, ponieważ stanowią podstawę stwierdzenia, że reakcje immunologiczne przeciwko utlenionemu LDL mogą chronić przed rozwojem, przyczyniać się do rozwoju miażdżycy i nie mieć żadnego wpływu, w zależności tego, przeciwko którym strukturom w utlenionym LDL są skierowane. Te ujawnienia umożliwiają rozwijanie sposobów immunizacyjnych, które selektywnie aktywują ochronne reakcje immunologiczne. Ponadto, pokazują one, że immunizacja z użyciem całego utlenionego LDL może mieć szkodliwy skutek, jeśli używane cząstki zawierają wysoki poziom struktur, które zapoczątkowują aterogenne reakcje immunologiczne.
WO 99/08109 dotyczy zastosowania panelu monoklonalnych mysich przeciwciał, które wiążą się z cząstkami utlenionego LDL w celu określenia obecności utlenionego LDL w surowicy i osoczu. Zatem przedstawiony tam sposób jest zupełnie inny od sposobu opisanego niniejszym, w którym oznaczane są przeciwciała przeciwko utlenionemu LDL.
Opis patentowy USA nr 4,970,144 dotyczy sposobu przygotowania przeciwciał metodami immunizacji z użyciem sekwencji peptydowych, które to przeciwciała mogą być zastosowane do oznaczenia apolipoprotein z wykorzystaniem ELISA. Jest to zatem coś jeszcze bardziej odmiennego od techniki opisanej niniejszym.
Opis patentowy USA nr 5,861,276 opisuje przeciwciało rekombinacyjne przeciwko normalnej postaci apolipoproteiny B. Przeciwciało to jest używane do stwierdzenia obecności normalnej apolipoproteiny B w osoczu i surowicy, i do leczenia miażdżycy przez obniżenie ilości cząstek normalnego LDL w krążeniu.
Niniejszym opisane jest zastosowanie przeciwciał do leczenia miażdżycy tętnic. Jednakże, w przeciwieństwie do opisu patentowego USA nr 5,861,276 przeciwciała te są skierowane przeciwko strukturom obecnym w cząstkach utlenionego LDL, a nie prawidłowej cząstki LDL. Zaletą jest to, że jest to utleniony LDL, który uważa się za początek rozwóju miażdżycy. Zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko strukturom będącym specyficznymi dla utlenionego LDL nie jest opisane we wspomnianym patencie USA.
Utlenienie lipoprotein, głównie LDL, w ścianie naczynia krwionośnego uważa się za istotny czynnik w rozwoju miażdżycy. Produkty wytworzone podczas utleniania LDL są toksyczne dla komórek naczyń, powodują zapalenie i zapoczątkowują formowanie się blaszek. Epitopy w utlenionym LDL są rozpoznawane przez układ immunologiczny i powodują powstawanie przeciwciał. Doświadczenia na zwierzętach wykazały, że niektóre z tych odpowiedzi immunologicznych mają ochronne działanie przed miażdżycą. Przeciwciała są na ogół niemal wyłącznie skierowane przeciwko strukturom związanym z peptydami. Wykorzystując bibliotekę peptydową pokrywającą całkowitą sekwencję jedynego białka obecnego w LDL, apolipoproteiny B, w utlenionym LDL zostały zidentyfikowane epitopy, które wywołują wytwarzanie przeciwciał u człowieka. Te epitopy peptydowe mogą być używane do opracowania ELlSA do badania związków pomiędzy odpowiedziami immunologicznymi przeciwko utlenionemu LDL, a chorobą układu krążenia i do opracowania immunoterapii lub „szczepionki” przeciwmiażdżycowej do zapobiegania i leczenia niedokrwiennej chorobie układu krążenia.
Przedmiotem wynalazku jest zatem fragment apolipoproteiny B, w postaci natywnej lub aldehydowej pochodnej, o sekwencji KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH (SEQ ID NO: 14), albo jego miejsce aktywne, wykazujący właściwości immunogenne lub lecznicze wobec niedokrwiennych chorób układu krążenia, który to fragment jest przeznaczony do:
a) immunizacji ssaków, w tym ludzi, przeciwko niedokrwiennym chorobom układu krążenia; lub
b) leczenia ssaków, w tym ludzi, z niedokrwiennymi chorobami układu krążenia; i/lub
c) diagnozowania obecności lub braku przeciwciał związanych ze zwiększonym lub obniżonym ryzykiem rozwoju niedokrwiennych chorób układu krążenia.
W korzystnej postaci wykonania fragment według wynalazku jest haptenem aldehydu, a korzystniej jest modyfikowany z użyciem dialdehydu malonowego (MDA) lub hydroksynonenalu.
W innej korzystnej postaci wykonania fragment według wynalazku jest w postaci natywnej. Alternatywnie fragment według wynalazku jest w postaci utlenionej, a korzystniej został utleniony z użyciem miedzi.
Fragment apolipoproteiny B jest korzystnie obecny w kombinacji z liposomami fosfolipidowymi.
Korzystnie fragment według wynalazku jest w postaci pochodnej dialdehydu malonowego (MDA) lub w postaci pochodnej hydroksynonenalowej.
W innym aspekcie wynalazek dostarcza zastosowania fragmentu apolipoproteiny B według wynalazku, w postaci natywnej lub jako pochodnej MDA lub hydroksynonenalowej do wytwarzania komPL 217 858 B1 pozycji farmaceutycznych do immunoterapii lub terapii niedokrwiennych chorób układu krążenia. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku korzystna dawka immunizująca wynosi 1 do 100 mg fragmentu.
W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej skuteczną terapeutycznie ilość fragmentu apolipoproteiny B według wynalazku, ewentualnie w kombinacji z jednym lub więcej nieszkodliwych farmaceutycznie wypełniaczy i/lub adiuwantów. Korzystnie fragment apolipoproteiny B w kompozycji według wynalazku występuje w połączeniu z kationizowaną albuminą surowicy wołu, a wodorotlenek glinu jest stosowany jako adiuwant.
Najkorzystniej kompozycja farmaceutyczna według wynalazku stanowi kompozycję do wstrzyknięć.
Wynalazek dostarcza ponadto szczepionki do immunizacji ssaków, w tym ludzi, przeciwko niedokrwiennym chorobom układu krążenia, zawierającej fragment apolipoproteiny B według wynalazku, ewentualnie w kombinacji z adiuwantem. Korzystnie fragment apolipoproteiny B do immunizacji w szczepionce według wynalazku występuje w połączeniu z kationizowaną albuminą surowicy wołu, a wodorotlenk glinu jest stosowany jako adiuwant.
W kolejnym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu in vitro diagnozowania obecności lub braku przeciwciał związanych ze zwiększonym lub obniżonym ryzykiem rozwoju chorób niedokrwiennych układu krążenia, w którym wykorzystuje się w teście fragment apolipoproteiny B według wynalazku. W korzystnej postaci wykonania, testem w sposobie według wynalazku jest test immunologiczny, a korzystniej test wybrany spośród ELISA, RIA, Western blotu, lub hybrydyzacji Southerna.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto oczyszczone lub rekombinacyjnie wytworzone przeciwciało przeciwko fragmentowi apolipoproteiny B o sekwencji KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH (SEQ ID NO:14) do zastosowania w profilaktycznym lub terapeutycznym traktowaniu ssaka, w tym człowieka, w niedokrwiennych chorobach układu krążenia. Korzystnie przeciwciało jest skierowane przeciwko fragmentowi apolipoproteiny B w postaci natywnej lub utlenionej, korzystniej przeciwko pochodnej aldehydowej, a najkorzystniej przeciwko fragmentowi modyfikowanemu z użyciem dialdehydu malonowego lub hydroksynonenalu. Ponadto korzystnie, przeciwciało według wynalazku jest przeciwko fragmentowi apolipoproteiny B w postaci haptenu aldehydu. Korzystnie fragment apolipoproteiny B, wobec którego zostało wytworzone przeciwciało został utleniony z użyciem miedzi, a korzystniej jest obecny w kombinacji z liposomami fosfolipidowymi.
W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy szczepionki do immunizacji ssaków, w tym ludzi, przeciwko niedokrwiennym chorobom układu krążenia, która zawiera skuteczną terapeutycznie ilość oczyszczonego lub wytwarzanego rekombinacyjnie przeciwciała przeciwko natywnemu i/lub modyfikowanemu MDA fragmentowi apolipoproteiny B według wynalazku.
Twórcy niniejszego wynalazku opracowali molekularną charakterystykę epitopów w utlenionym LDL, które wywołują zależne od przeciwciał odpowiedzi immunologiczne u człowieka. Użyte podejście korzysta z faktu, że reakcje immunologiczne prawie wyłącznie są skierowane przeciwko sekwencjom peptydowym o długości 5-6 aminokwasów. LDL zawiera tylko jedno białko, apolipoproteinę B o długości 4563 aminokwasów. Podczas utleniania, apolipoproteina B jest fragmentowana i addukty aldehydowe są przyłączane do dodatnio naładowanych aminokwasów, szczególnie lizyny. Oznacza to, że sekwencje peptydowe normalnie nie eksponowane ze względu na trzeciorzędową strukturę apolipoproteiny B stają się dostępne dla komórek układu immunologicznego i/lub normalnie eksponowane sekwencje peptydowe stają się immunogenne z powodu haptenizacji z aldehydami.
Niniejszym określono, że następujące peptydy, natywne lub pochodne MDA posiadają taką skuteczność, jak wywoływanie odpowiedzi immunologicznej. Tymi peptydami są:
FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
PQCSTHILQWLKRVHANPLL
VISIPRLQAEARSEILAHWS
KLVKEALKESQLPTVMDFRK
LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK
KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
PL 217 858 B1
SLTSTSDLQSGIIKNTASLK
TASLKYENYELTLKSDTNGK
DMTFSKQNALLRSEYQADYE
MKVKIIRTIDQMQNSELQWP lALDDAKINFNEKLSQLQTY
KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
EEEMLENVSLVCPKDATRFK
GSTSHHLVSRKSISAALEHK lENIDFNKSGSSTASWIQNV
IREVTQRLNGEIQALELPQK
EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
HTFLIYITELLKKLQSTTVM
LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
GNMGQTMEQLTPELKSSILK
SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
SLNSHGLELNADILGTDKIN
WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
SGASMKLTTNGRFREHNAKF
NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
FKSSVITLNTNAELFNQSDI
FPDLGQEVALNANTKNQKIR, jak również peptyd niewywołujący wytwarzania przeciwciał
ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS lub miejsce aktywne jednego lub więcej z tych peptydów.
Materiały i sposoby
W celu określenia, które części apolipoproteiny B stają się immunogenne w wyniku utleniania
LDL, została wytworzona biblioteka polipeptydowa, składająca się z peptydów długości 20 aminokwasów pokrywająca całą sekwencję ludzkiej apolipoproteiny B. Peptydy zostały wytworzone z 5-aminokwasowym obszarem nakładającym się, aby pokryć wszystkie sekwencje w punktach podziału. Peptydy były używane w stanie natywnym lub po włączeniu do liposomów fosfolipidowych, po utlenieniu przez ekspozycję na miedź lub po modyfikacji dialdehydem malonowym (MDA), w celu naśladowania różnych modyfikacji aminokwasów, które mogą występować podczas utleniania LDL.
Peptydy
Zostały zsyntetyzowane 302 peptydy odpowiadające całej sekwencji aminokwasowej ludzkiej apolipoproteiny B (Euro-Diagnostica AB, Malmo, Sweden i KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Denmark) i użyte w ELISA. Część każdego syntetycznego peptydu została zmodyfikowana 0,5 M MDA przez 3 godz. w 37°C lub przez 5 μΜ CuCl2 (Sigma) przez 18 h w 37°C. Peptydy modyfikowane MDA były dializowane wobec PBS zawierającego 1 mM EDTA z kilkoma zmianami przez 18 godz. w 4°C.
Modyfikacja peptydów została sprawdzona w denaturujących żelach poliakrylamidowych (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, CA), odpowiednich do rozdziału peptydów.
Peptydy zostały ponumerowane 1-302 rozpoczynając od N-końcowego końca białka. Inne aldehydy mogą zostać użyte do przygotowywania pochodnych, takich jak hydroksynonenal i inne.
PL 217 858 B1
Liposomy
Mieszanina fosfatydylocholiny jaja (EPC) (Sigma) i fosfatydyloseryny (PS) (Sigma) w chloroformie w proporcji molarnej 9:1 i stężeniu 3 mM fosfolipidu (PL) została odparowana w szklanym pojemniku pod łagodnym strumieniem argonu. Pojemnik został następnie umieszczony w próżni na 3 godz. Roztwór zawierający 0,10 mM peptyd (5 ml) w sterylnym filtrowanym 10 mM buforze HEPES pH 7,4, 145 mM NaCl i 0,003 % azydku sodu został dodany do wysuszonej błonki EPC/PS i inkubowany przez 15 min w 50°C. Mieszanina była łagodnie wstrząsana przez około 5 min. w temperaturze pokojowej i umieszczona w lodowatej łaźni wodnej i sonikowana przy amplitudzie 7,5 mikronów przez 3x3 min. (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Medlab, Sweden) z przerwami 1 min. Mieszanina PL-peptyd, natywny lub modyfikowany 0,5 M MDA przez 3 godz. w 37°C lub 5 mM CuCl2 przez 18 h w 37°C, była przechowywana pod argonem w szklanych fiolkach w 4°C owiniętych folią aluminiową i zużywana w ciągu 1 tygodnia. Mieszanina modyfikowana MDA była dializowana wobec PBS zawierającego 1 mM EDTA z kilkoma zmianami przez 18 godz. w 4°C przed przechowywaniem. Modyfikacja mieszaniny została sprawdzona w denaturujących żelach poliakrylamidowych (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), odpowiednich do rozdziału peptydów.
Próbki osocza
Próbki osocza od 10 pacjentów z chorobą układu krążenia (AHP) i 50 próbek surowicy, od 25 kobiet i 25 mężczyzn, zdrowych dawców krwi (NHP) zostały zebrane i połączone. Obie połączone próbki zostały podzielone na porcje i przechowywane w -80°C.
ELISA
Natywne lub modyfikowane syntetyczne peptydy rozcieńczone w PBS pH 7,4 (20 μg/ml), w obecności lub nieobecności liposomów, były absorbowane w studzienkach płytek mikrotitracyjnych (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Denmark) podczas całonocnej inkubacji w 4°C. Jako odnośnik, jeden z peptydów (P6) był umieszczony na każdej płytce. Po płukaniu PBS zawierającym 0,05% Tween-20 (PBS-T), opłaszczone płytki były blokowane SuperBlock w TBS (Pierce, Rockford, IL) przez 5 min., po czym inkubowane z 20 połączonymi próbkami ludzkiego osocza, AHP lub NHP, rozcieńczonymi 1/100 w TBS - 0,05% Tween-20 (TBS-T) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i następnie przez noc w 4°C. Po płukaniu, wiązanie się auto-przeciwciał skierowanych przeciwko peptydom było wykrywane przez użycie biotynylowanych króliczych przeciwciał przeciwko ludzkim IgG lub IgM (Dako A/S, Glostrup, Denmark) odpowiednio rozcieńczonych w TBS. Po kolejnej inkubacji przez 2 godz. w temperaturze pokojowej płytki były płukane i związane biotynylowane przeciwciała były wykrywane przez alkaliczną fosfatazę koniugowaną z streptawidyną (Sigma), inkubowane przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Reakcja barwna była wywoływana przez użycie zestawu substratu fosfatazy (Pierce) i absorbancja przy 405 nm była mierzona po 1 godz. inkubacji w temperaturze pokojowej. Wartości absorbancji dla różnych peptydów były dzielone przez wartość absorbancji dla P6 i porównywane.
Sekwencje w apoliporoteinie B, które były rozpoznawane przez przeciwciała ludzkiej surowicy zostały pokazane jako SEK NR ID. 1-37 na towarzyszącym rysunku. Zarówno AHP jak i NHP zawierały przeciwciała przeciwko licznym różnym peptydom. Zostały zidentyfikowane przeciwciała przeciwko zarówno natywnym jak i modyfikowanym peptydom. Ogólnie, miana przeciwciał przeciwko peptydom modyfikowanym MDA były wyższe lub takie same jak te przeciwko odpowiadającemu peptydowi natywnemu. Porównanie pomiędzy natywnym, modyfikowanym MDA, utlenianym przez miedź peptydem wykazało wysoki stopień korelacji oraz, że najwyższe miana przeciwciał były wykrywane w przypadku peptydów modyfikowanych MDA. Użycie peptydów włączonych do liposomów nie spowodowało wzrostu poziomów przeciwciał. Przeciwciała podklasy IgM były bardziej powszechne niż przeciwciała podtypu IgG.
Peptydy, przeciwko którym wykryto najwyższe miana przeciwciał, mogą być podzielone na sześć grup o wspólnej charakterystyce:
(A) wysoki poziom przeciwciał IgG przeciwko peptydom modyfikowanym przez MDA (n=3).
(B) wysoki poziom przeciwciał IgM, ale bez różnicy pomiędzy natywnymi i modyfikowanymi przez MDA peptydami (n=9).
(C) wysoki poziom przeciwciał IgG, ale bez różnicy pomiędzy natywnymi i modyfikowanymi przez MDA peptydami (n=2).
(D) wysoki poziom przeciwciał IgG przeciwko peptydom modyfikowanym przez MDA i przynajmniej dwukrotnie więcej przeciwciał w połączonej próbce NHP niż w połączonej próbce AHP (n=5).
PL 217 858 B1 (E) wysoki poziom przeciwciał IgM przeciwko peptydom modyfikowanym przez MDA i przynajmniej dwukrotnie więcej przeciwciał w połączonej próbce NHP niż w połączonej próbce AHP (n=11).
(F) wysoki poziom przeciwciał IgG, ale bez różnicy pomiędzy niemodyfikowanymi i modyfikowanymi przez MDA peptydami, ale przynajmniej dwukrotnie więcej przeciwciał w połączonej próbce NHP niż w połączonej próbce AHP (n=7).
(G) Brak przeciwciał IgG lub IgM.
T a b e l a 1
A. Wysokie IgG, różnica dla MDA
P 11. FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
P 25. PQCSTHILQWLKRVHANPLL
P 74. VISIPRLQAEARSEILAHWS
B. Wysokie IgM, bez różnicy dla MDA
P 40. KLVKEALKESQLPTVMDFRK
P 68. LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
P 94. DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK
P 99. KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
P 102. SLTSTSDLQSGIIKNTASLK
P 103. TASLKYENYELTLKSDTNGK
P 105. DMTFSKQNALLRSEYQADYE
P 177. MKVKIIRTIDQMQNSELQWP
C. Wysokie IgG, bez różnicy dla MDA
P 143. IALDDAKINFNEKLSQLQTY
P 210. KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
D. NHS/AHP, IgG-ak > 2, różnica dla MDA
P 1. EEEMLENVSLVCPKDATRFK
P 129. GSTSHHLVSRKSISAALEHK
P 148. lENIDFNKSGSSTASWIQNV
P 162. 1REVTQRLNGEIQALELPQK
P 252. EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
E. NHS/AHP, IgM-ak > 2, różnica dla MDA
P 301. HTFLIYITELLKKLQSTTVM
P 30. LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
P 31. CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
P 32. GNMGQTMEQLTPELKSSILK
P 33. SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
P 34. IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
P 107. SLNSHGLELNADILGTDKIN
P 149. WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
P 169. TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
P 236. EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
F. NHS/AHP, IgG-ak < 0,5, bez różnicy dla MDA
P 10. ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
P 45. IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
P 111. SGASMKLTTNGRFREHNAKF
P 154. NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
P 199. GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
P 222. FKSSVITLNTNAELFNQSDI
P 240. FPDLGQEVALNANTKNQKIR
G.
P 2. ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS
Wszystkie z tych 38 sekwencji peptydowych stanowią cele działania reakcji immunologicznych, które mogą mieć znaczenie dla rozwoju miażdżycy i niedokrwiennej choroby układu krążenia. Peptydy te mogą zatem być wykorzystywane do opracowania ELISA do ustalenia związków pomiędzy pozioPL 217 858 B1 mami przeciwciał przeciwko określonym sekwencjom aminokwasów modyfikowanych MDA w apolipoproteinie B, a ryzykiem rozwoju choroby układu krążenia.
Te peptydy również reprezentują prawdopodobne czynniki pośredniczące w ochronnej reakcji immunologicznej, obserwowanej u zwierząt doświadczalnych, immunizowanych utlenionym LDL i mogą być używane do badania podczas dalszego opracowywania terapii immunizacyjnej lub „szczepionki” przeciwko miażdżycy.
Zatem, zostało zidentyfikowanych 38 różnych sekwencji w białku ludzkiej apolipoproteiny B, które wywołują znaczące odpowiedzi immunologiczne u człowieka. Te epitopy prawdopodobnie reprezentują to, co poprzednio było opisywane jako przeciwciała przeciwko utlenionemu LDL. Ponieważ większość odpowiedzi immunologicznych jest skierowana przeciwko sekwencjom peptydowym i apolipoproteina B jest jedynym białkiem w LDL, podejście wykorzystane w tym projekcie powinno być w stanie zidentyfikować specyficzne epitopy dla zasadniczo wszystkich przeciwciał przeciwko cząstkom utlenionego LDL. Rodzina przeciwciał specyficznych wobec fosfolipidów, obejmująca przeciwciała przeciwko kardiolipinie została opisana jako reagująca z utlenionym LDL, ale specyficzność i znaczenie tych przeciwciał pozostaje do pełnego scharakteryzowania.
W wielu przypadkach miana przeciwciał były wyższe dla peptydów modyfikowanych MDA, niż dla sekwencji natywnych. Jeżeli były wykrywane przeciwciała przeciwko sekwencji modyfikowanej MDA, to było to prawie zawsze związane z obecnością, przeciwciał przeciwko sekwencji natywnej. Prawdopodobne wyjaśnienie tego jest takie, że odpowiedź immunologiczna przeciwko sekwencji aminokwasowej modyfikowanej MDA w apolipoproteinie B (modyfikacja MDA następująca w wyniku utleniania LDL) prowadzi do przełamania tolerancji wobec sekwencji natywnej. Dla innych sekwencji nie występowała różnica w mianach przeciwciał przeciwko sekwencjom modyfikowanym MDA i natywnym. To sugerowałoby, że reakcje immunologiczne są skierowane przeciwko natywnym sekwencjom. Nie powinno być odpowiedzi immunologicznej przeciwko sekwencjom aminokwasowym w białku normalnie dostępnym dla układu immunologicznego. W natywnych cząstkach LDL duże części apolipoproteiny B są schowane w warstwie fosfolipidów LDL i w ten sposób niedostępne dla układu immunologicznego. Podczas utleniania LDL łańcuch aminokwasowy apolipoproteiny B ulega fragmentacji, powodując zmiany w strukturze trzeciorzędowej. To prawdopodobnie prowadzi do ekspozycji sekwencji peptydowych normalnie niedostępnych dla układu immunologicznego i do wytworzenia przeciwciał przeciwko tym sekwencjom, co może tłumaczyć obserwowaną obecność przeciwciał przeciwko natywnym sekwencjom apolipoproteiny B. Alternatywnie, właściwa odpowiedź immunologiczna występuje przeciwko sekwencjom modyfikowanym MDA, ale reakcja krzyżowa z sekwencjami natywnymi jest tak silna, że nie można wykazać żadnej różnicy w wiązaniu.
T a b e l a 2
Związki pomiędzy przeciwciałami przeciwko różnym peptydom, a miażdżycą w tętnicy szyjnej oceniane jako grubość błony wewnętrznej/środkowej u 78 badanych (26 badanych, u których później wystąpiła choroba niedokrwienna mięśnia sercowego, 26 zdrowych kontrolnych i 26 osób o wysokim ryzyku bez choroby)
| Peptyd | IgG | IgM | |||
| Natywny | Modyfikowany MDA | Natywny | Modyfikowany MDA | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 301 | + | ||||
| 10 | + | + | |||
| 11 | ++ | + | |||
| 25 | + | + | ++ | +++ | |
| 30 | ++ | ||||
| 31 | ++ | + | |||
| 32 | + | ||||
| 33 | + |
PL 217 858 B1 cd. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 34 | + | ||||
| 45 | ++ | ++ | +++ | ||
| 74 | ++ | + | + | ++ | |
| 99 | |||||
| 100 | + | ++ | |||
| 102 | + | ||||
| 103 | + | ||||
| 105 | |||||
| 129 | ++ | +++ | |||
| 143 | + | + | ++ | + | |
| 148 | + | ||||
| 154 | +++ | ++ | |||
| 162 | + | ++ | |||
| 199 | |||||
| 210 | + | ||||
| 240 | ++ | + |
+, r>0,2<0,3, p=<0,05;
++, r>0,3<0,4, p=0,01;
+++, r>0,4, p=<0,001;
szary, poziomy przeciwciał przeciwko peptydom znacząco podniesione w grupie cierpiących na niedotlenienie mięśnia sercowego.
W badaniu pilotażowym zbadano możliwość, czy test ELISA w oparciu o te peptydy (natywne lub modyfikowane MDA) może być wykorzystywany do określenia związków pomiędzy reakcją immunologiczną przeciwko określonym epitopom w utlenionym LDL a obecnością i/lub ryzykiem rozwoju choroby układu krążenia. Badanie przeprowadzono na osobach uczestniczących w badaniu Malmo Diet Cancer, badaniu populacyjnym, w którym brało udział ponad 30 000 osób pomiędzy 1989 a 1993 rokiem. Poziomy przeciwciał przeciwko 24 z 38 peptydów wymienionych w Tabeli 1 zostały zbadane na poziomie podstawowym w próbkach osocza od 26 osób, u których wystąpiło ostre niedotlenienie mięśnia sercowego w okresie objętym badaniem i 26 zdrowych osób kontrolnych dopasowanych pod względem wieku, płci i palenia. Dodatkowa grupa 26 osób dopasowanych pod względem wieku, płci i palenia, ale wszystkich z poziomami cholesterolowego LDL powyżej 5,0 mmol/l została również włączona do badania poziomów przeciwciał w grupie wysokiego ryzyka, gdzie nie wystąpiła choroba układu krążenia.
Dla 19 z 24 analizowanych peptydów, stwierdzono znaczące korelacje pomiędzy poziomami przeciwciał IgM przeciwko peptydom modyfikowanym MDA i zaawansowaniem miażdżycy w tętnicy szyjnej (grubość błona wewnętrzna/środkowa) mierzonym w badaniu ultrasonograficznym rozgałęzienia tętnicy szyjnej, tzn. im wyższe poziomy przeciwciał, tym silniejsza miażdżyca (Tabela 2). Dla wielu z tych peptydów wystąpiły również znaczące korelacje pomiędzy poziomami przeciwciał przeciwko natywnym peptydom a grubością błony wewnętrznej/środkowej w tętnicy szyjnej. Tylko dla 4 peptydów wystąpiła znacząca korelacja pomiędzy przeciwciałami IgG a grubością błony wewnętrznej/środkowej w tętnicy szyjnej. Te obserwacje sugerują, że ELISA z użyciem tych peptydów modyfikowanych MDA (pojedynczo lub w kombinacji) może być wykorzystywane do identyfikowania osób z nasiloną miażdżycą.
Cztery z badanych peptydów były nie tylko związane z nasiloną obecnością miażdżycy, ale były również znacząco podniesione w grupie osób, które później cierpiały na niedotlenienie mięśnia sercowego (Tabela 2). Dane dla jednego z tych peptydów (peptyd 240) przedstawiono na Fig. 7.
PL 217 858 B1
Te obserwacje również wskazują, że test ELISA wykorzystujący peptydy może być również stosowany do identyfikacji osób ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia niedotlenienia mięśnia sercowego.
Wystąpił również znaczący wzrost w poziomach przeciwciał IgG przeciwko natywnym peptydom 103, 162 i 199, jak również 102 modyfikowanemu MDA w grupie, która później cierpiała na niedotlenienie mięśnia sercowego. Jednakże, przeciwciała IgG przeciwko tym peptydom nie były znacząco związane z obecnością miażdżycy w tętnicy szyjnej.
Szczególnie interesującą obserwację dokonano dla przeciwciał przeciwko peptydowi 210 modyfikowanemu MDA, dla którego występowały znacząco wyższe poziomy przeciwciał IgM u zdrowych osób kontrolnych i w grupie wysokiego ryzyka (poziom cholesterolowego LDL powyżej 5,0 mmol/l) niż w grupie, u której wystąpiło niedotlenienie mięśnia sercowego. Zgodnie z tym, przeciwciała przeciwko peptydowi 210 modyfikowanemu MDA mogą reprezentować znacznik dla osób o obniżonym ryzyku rozwoju choroby układu krążenia.
Wykazano obecnie, że immunizacja natywnymi lub modyfikowanymi MDA sekwencjami peptydowymi apo B-100 powoduje zahamowanie miażdżycy u zwierząt doświadczalnych (Nordin Fredrikson, Soderberg i wsp., Chyu i wsp.). Mechanizmy, które kierują tymi ochronnymi reakcjami immunologicznymi pozostają do wyjaśnienia. Jednakże, jedną prawdopodobną możliwością jest to, że efekt ateroochrony odbywa się za pośrednictwem przeciwciał wytworzonych przeciwko tym sekwencjom peptydowym. Te przeciwciała mogłyby, na przykład, ułatwiać usuwanie uszkodzonych przez utlenienie cząstek LDL przez receptory Fe makrofagów.
Receptory zmiatające makrofagów rozpoznają wyłącznie silnie uszkodzony przez utlenienie LDL (9). W niedawnych badaniach stwierdzono istnienie krążącego utlenionego LDL (10,11). Te cząstki są tylko minimalnie uszkodzone przez utlenianie i nie są rozpoznawane przez receptory zmiatające. Wiązanie przeciwciał do tych krążących cząstek utlenionego LDL może wspomóc usuwanie ich z krążenia zanim nagromadzą się one w tkance naczyń (12).
Wiele badań potwierdziło rolę przeciwciał w ochronie przed miażdżycą. Odtworzenie komórek B hamuje rozwój miażdżycy u myszy apo E null pozbawionych śledziony (13), jak również tworzenie nowej błony wewnętrznej po uszkodzeniu tętnicy szyjnej u myszy RAG-1 (niepublikowane obserwacje z naszego laboratorium). Ponadto, wykazano, że powtarzane wstrzyknięcia immunoglobulin obniżają miażdżycę u myszy apo E null (6).
Jak omówiono powyżej, przeciwciała przeciwko sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA w apo B-100 mogą zostać wytworzone przez aktywną immunizację z użyciem syntetycznych peptydów. Ta procedura wymaga 2-3 tygodni, zanim zostanie osiągnięty pełen efekt wytwarzania przeciwciał.
W pewnych sytuacjach może być potrzebny szybszy efekt. Jednym przykładem mogą być niestabilne płytki miażdżycowe, w których utleniony LDL prawdopodobnie przyczynia się do zapalenia, toksyczności wobec komórek i ryzyka oderwania płytki. W takich warunkach, bierna immunizacja przez wstrzyknięcie oczyszczonych lub wytworzonych rekombinacyjnie przeciwciał przeciwko sekwencjom natywnym i modyfikowanym MDA może odnieść szybszy skutek.
Inną sytuacją, w której bierna immunizacja przez wstrzyknięcie oczyszczonych lub wytworzonych rekombinacyjnie przeciwciał może być skuteczna, jest choroba wieńcowa serca u osób starszych. Nasze badania wykazały, że obniżenie przeciwciał przeciwko sekwencjom peptydowym apo B występuje wraz z postępującym wiekiem u człowieka i jest związane ze wzrostem poziomu utlenionego LDL w osoczu (Nordin-Fredrikson, Hedblad i wsp.). To może sugerować starzenie się komórek układu immunologicznego odpowiedzialnych za wytwarzanie przeciwciał przeciwko antygenom w utlenionym LDL i powodować niepełne usuwanie uszkodzonych przez utlenianie cząstek LDL z krążenia. Zgodnie z tym, te osoby skorzystałyby bardziej z biernej immunizacji przez wstrzyknięcie oczyszczonych lub wytworzonych rekombinacyjnie przeciwciał niż z aktywnej immunizacji sekwencjami peptydowymi apo B-100.
Syntetyczne natywne peptydy (Euro-Diagnostica AB, Malmo, Sweden), używane następnie, były peptydami 1, 2 i 301 z początkowo przeszukiwanej biblioteki peptydów. Peptyd 1 (sekwencja aminokwasowa: EEEMLENVSLVCPKDATRFK, n=10) i peptyd 301 (sekwencja aminokwasowa: HTFLIYITELLKKLQSTTVM, n=10) wywoływały silniejszą odpowiedź przeciwciał, odpowiednio, IgG lub IgM przeciwko peptydom modyfikowanym MDA niż natywnym, i dla obu miana były wyższe u osób zdrowych. Te peptydy zostały wybrane w oparciu o założenie, że odpowiedź przeciwciał na te peptydy może działać ochronnie przeciwko miażdżycy.
PL 217 858 B1
Peptyd 2 (sekwencja aminokwasowa: ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS, n=10) nie wywołał odpowiedzi przeciwciał w początkowym badaniu przesiewowym przeciwciał, zatem został wybrany jako peptyd kontrolny. Myszy otrzymujące alum służyły jako kontrola (n=9).
Myszy Apo E (-/-) otrzymały podskórnie pierwotną immunizację w wieku 6-7 tygodni, następnie dootrzewnowo dawkę przypominającą 3 tygodnie później. Myszy żywiono wysoko-cholesterolową dietą od początku immunizacji, trwającą do zabicia w wieku 25 tygodni. W momencie zabijania, nie występowały znaczące różnice wagi pomiędzy 4 grupami myszy. Nie występowała również znacząca statystycznie różnica w cholesterolu osocza, oznaczonego z użyciem dostępnego na rynku zestawu (Sigma). Średnie poziomy cholesterolu osocza były wszystkie powyżej 715 mg/dl.
Obszar tętnicy zstępującej pokryty płytką miażdżycową został zmierzony w preparacie en face po barwieniu oil red O. W porównaniu z grupą kontrolną, myszy immunizowane peptydem nr 2 i nr 301 miały znacząco obniżoną miażdżycę (Fig. 2). Immunizacja peptydem 1 nie spowodowała znaczącego obniżenia miażdżycy w porównaniu z kontrolą. W przeciwieństwie do tętnicy zstępującej, rozległość miażdżycy nasady aorty i luku aorty nie różniła się pomiędzy 4 grupami eksperymentalnymi (Fig. 3).
Nie wystąpiły różnice pomiędzy 4 grupami w zakresie rozmiaru płytek zatoki aorty lub jej składu lipidowego (Tabela A). Średnia wielkość płytek w łukach aorty w 4 grupach myszy nie różniła się. Jednakże, ocena en face rozmiarów płytek ze zstępującej tętnicy tułowiowej i tętnicy brzusznej przez barwienie oil red O wykazała, że grupa kontrolna i grupa peptydu 1 miały podobną ilość płytek miażdżycowych w tętnicy, podczas gdy grupy peptydu nr 2 i nr 9 miały znacząco obniżone zmiany miażdżycowe w tętnicy (Tabela A). Obserwacja, że immunizacja peptydem nie wpływa na rozmiar płytki miażdżycowej zatoki aorty i łuku aorty, ale zmniejszyła płytkę tętnicy zstępującej, jest zastanawiająca i sugeruje, że immunizacja peptydowa może obniżać tworzenie nowej płytki, ale nie wpływa na rozwój płytki.
Dalej badano, czy immunizacja peptydem wpływa na fenotyp płytek miażdżycowych. Zamrożone skrawki z płytek zatoki aorty były barwione immunohistochemicznie przeciwciałem monocyt/makrofag (MOMA-2, Serotec). Zgodnie ze spostrzeżeniami z obserwacji en face, peptyd nr 2 znacząco obniżał infiltrację makrofagów do płytek (Fig. 1). Trójkolorowe barwienie wykazało średnią zawartość kolagenu 40,0±7,7% w płytkach zatoki aorty w grupie peptydu 2; podczas gdy średnia zawartość kolagenu w grupie kontrolnej z alunem, grupie peptydu 1 i grupie peptydu 9 wynosiła odpowiednio 32,3±5,3%, 35,6±8,5% i 29,4±9,6%. Określono odpowiedź przeciwciał przeciwko immunizującemu peptydowi w każdej grupie. Miano przeciwciał po immunizacji wzrosło 6,1±3,1-krotnie w grupie peptydu 1, 2,4±1,0-krotnie w grupie peptydu 2 i 1,8±0,6-krotnie w grupie peptydu 9; podczas gdy grupa z alunem wykazała a 3,9±2,7-krotny wzrost miana przeciwciał przeciwko peptydowi 1, 2,0±0,5- krotny wzrost przeciwko peptydowi 2 i 2,0±0,9-krotny wzrost przeciwko peptydowi 9. Zaskakujący jest równoczesny wzrost miana przeciwciał przeciwko immunizującym peptydom zarówno w grupie immunizowanej jak i poddanej działaniu alunu. Może to oznaczać następujące możliwości: (1) mechanizm(y) inny(e) niż immunologiczna odpowiedź humoralna (taka jak immunologiczna odpowiedź komórkowa) może być zaangażowany(e) w modulację miażdżycy; lub (2) wzrost przeciwciał jest odpowiedzią osobnika na hipercholesterolemię w czasie.
Chociaż nie ma jasnego przypuszczalnego mechanizmu wyjaśniającego, dlaczego immunizacja peptydami redukuje miażdżycę i/lub moduluje fenotyp płytek, nowość rozwiązania polega na zastosowaniu peptydów LDL jako immunogenu i możliwości jego wykorzystania w podejściu immunomodulującym. Immunizacja oparta na peptydach moduluje płytki miażdżycowe. Immunizacja z użyciem homologicznego oxLDL lub natywnego LDL jako antygenu okazała się obniżać rozmiar płytek1-3, jednakże, dostępność, wytwarzanie, zakaźne zanieczyszczenie i bezpieczeństwo homologicznego ludzkiego LDL czyni to podejście nieatrakcyjnym do zastosowania klinicznego. Niniejszym zostało wykazane, że immunoterapia oparta na peptydach jest możliwa do zastosowania, chociaż nasze ostateczne wyniki różnią się od naszej początkowej hipotezy, że immunizacja z użyciem peptydów z wysoką odpowiedzią przeciwciał IgG lub IgM u normalnych osobników może chronić zwierzęta doświadczalne przed rozwojem zaawansowanych płytek miażdżycowych.
Jest zaskakujące, że immunizacja z użyciem peptydu nr 2 chroniła zwierzęta przed rozwojem nowych uszkodzeń miażdżycowych w tętnicy zstępującej i obniżała infiltrację makrofagów, ponieważ ten peptyd nie wywoływał żadnej odpowiedzi przeciwciał w początkowym badaniu przesiewowym u człowieka. Może tak być ponieważ: (a) peptyd nr 2 może być częścią struktury ludzkiego białka apo B-100, która nie jest eksponowana wobec ludzkiego układu immunologicznego. Zatem, żadne przeciwciała nie są wytwarzane ani wykrywane w połączonych próbkach surowic zdrowych ludzi;
PL 217 858 B1 (b) sekwencja aminokwasowa peptydu nr 2 jest obca dla myszy, zatem u myszy dochodzi do rozwoju odpowiedzi immunologicznej przeciwko temu peptydowi, co moduluje tworzenie nowych uszkodzeń miażdżycowych i ich fenotyp.
Wpływ immunizacji homologicznym LDL na rozmiar płytek miażdżycowych różnił się, gdy rozmiary płytek były oceniane w różnych częściach pnia aorty. Na przykład, Amell i wsp. wykazali, że u królika z hipercholesterolemią immunizacja natywnym LDL spowodowała zmniejszenie tworzenia się płytek w aorcie1, podczas gdy Freigang i wsp. wykazali zmniejszenie rozmiaru płytek w zatoce aorty, ale nie w aorcie2. Uwzględniając łącznie ich obserwacje oraz te tu przedstawione, przypuszczano, że immunizacja peptydami wpływa nie tylko na wielkość płytek, ale również skład płytki. Efekt redukcji płytek zaobserwowano tylko w tętnicy zstępującej. Wiadomo, że u myszy Apo E (-/-) rozwijają się w pojedynczym zwierzęciu uszkodzenia miażdżycowe w różnych stadiach rozwoju, zwłaszcza, gdy są żywione wysoko-cholesterolową dietą. Początkowe pojawienie się uszkodzenia miażdżycowego u młodego zwierzęcia występowało w zatoce aorty6-7 i po 15 tygodniach na wysoko-cholesterolowej diecie uszkodzenia w zatoce aorty były zaawansowanymi płytkami; podczas gdy wcześniejsze stadium miażdżycy występowało w tętnicy zstepującej6. Ponieważ czasowy przebieg dojrzewania płytek i rozwoju w tętnicy zstępującej jest późny w porównaniu z tym w zatoce aorty, obserwacja, że immunizacja zmniejszyła rozmiary uszkodzeń w tętnicy zstępującej, lecz nie w zatoce aorty, sugerowała, że immunizacja wpływa na wczesne stadium rozwoju miażdżycy. Jest możliwe, że gdy zwierzę starzało się i w obecności cholesterolu w osoczu na poziomie powyżej fizjologicznego, zmniejszający płytki efekt immunizacji jest przezwyciężony przez toksyczny efekt hipercholesterolemii. Jest również możliwe, że płytki w zatoce aorty dojrzewają szybciej i zabicie w wieku 25 tygodni następuje za późno, aby wykryć jakąkolwiek różnicę w rozmiarze płytek. Chociaż wielkość uszkodzeń nie zmieniała się dla płytek w zatoce aorty, immunizacja peptydami wpłynęła na skład płytki. Obecne założenia doświadczenia zapobiegły badaniu składu płytek w ich wcześniejszym stadium rozwoju w tętnicy zstępującej.
Wyniki doświadczeń podkreślają przydatność wykorzystywania sekwencji peptydowych związanych z LDL apo B-100 jako immunogenów w nowym podejściu do zapobiegania miażdżycy i/lub korzystnego modyfikowania fenotypu płytek mimo silnej hiperlipidemii. Ta strategia immunizacji, oparta na peptydach, jest potencjalnie korzystniejsza od wykorzystania homologicznego oxLDL lub natywnego LDL jako antygenu, ponieważ taka strategia mogłaby eliminować konieczność izolacji i przygotowywania homologicznego LDL i wynikającego ryzyka zanieczyszczeń. Efekt redukcji płytek wskutek immunizacji peptydem nr 2 i 301 był obserwowany tylko w tętnicy zstępującej. Te obserwacje są zgodne z poprzednimi doniesieniami, gdzie wykazano, że inne interwencje terapeutyczne wywierały silniejszy efekt na tętnicę zstępującą w porównaniu z łukiem aorty14-17 prawdopodobnie dlatego, że uszkodzenia rozwijają się szybciej w nasadzie i w łuku aorty niż w tętnicy zstępującej, w ten sposób stwarzając węższy zakres szansy dla interwencji14,15,16,18,19. Ponieważ czasowy przebieg dojrzewania i rozwoju płytki w tętnicy zstępującej jest późny w porównaniu z zatoką aorty i łukiem aorty, stwierdzenie, że immunizacja zmniejszyła wielkość uszkodzeń w tętnicy zstępującej, lecz nie w zatoce i łuku aorty, sugeruje, że immunizacja przede wszystkim zapobiega wczesnemu etapowi tworzenia miażdżycy. Jest możliwe, że gdy zwierzę starzało się, i w obecności ponad fizjologicznego poziomu cholesterolu w surowicy, efekt immunizacji redukujący płytki zostaje przezwyciężony przez toksyczny efekt silnej hypercholesterolemii. Chociaż wielkość uszkodzeń nie uległa zmianie w zatoce lub łuku aorty, immunizacja peptydem nr 2 zmieniła skład płytki w korzystnym kierunku, tworząc bardziej stabilny fenotyp płytki ze zmniejszoną infiltracją makro fagów i zwiększoną zawartością kolagenu. Podsumowując, zostało przedstawione nowe, oparte na peptydach, immunomodulacyjne podejście do hamowania miażdżycy w modelu mysim.
Podsumowując, zostało przedstawione nowe podejście immunomodulacyjne w oparciu o peptydy do modulowania płytek miażdżycowych. Chociaż zmiana w tworzeniu miażdżycy w naszym modelu była tylko umiarkowana, jednak ta immunizacja oparta o peptydy może dostarczyć alternatywnego narzędzia, zapobiegając lub lecząc miażdżycę.
Metody
Przygotowanie peptydów. Peptydy zostały przygotowane z zastosowaniem zestawu Imject® SuperCarrier® EDC (Pierce, Rockford, IL) zgodnie z instrukcją producenta z niewielką modyfikacją.
Jeden mg peptydu w 500 μΐ buforu koniugującego zmieszano z 2 mg nośnika w 200 μΐ dejonizowanej wody. Mieszaninę następnie inkubowano z 1 mg odczynnika koniugującego (EDC, 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodiimid HCl) w temperaturze pokojowej przez 2 godz. Następnie dializowano
PL 217 858 B1 wobec roztworu 0,083 M fosforanu sodu, 0,9 M chlorku sodu pH 7,2 przez noc w 4°C. Dializowany koniugat rozcieńczono buforem do oczyszczania Imject dry blend do końcowej objętości 1,5 ml.
Jako immunoadiuwantu używano alum i mieszano go z koniugatem peptydowym rozcieńczeniu 1:1 objętościowo. Ilość peptydu w każdej immunizacji wynosiła 33 μg/100 μΐ na wstrzyknięcie.
Protokół postępowania ze zwierzętami. Myszy Apo E (-/-)z Jackson Laboratories (Bar Harbor, Me) otrzymały pierwszą immunizację podskórnie w wieku 6-7 tygodni, następnie dawkę przypominającą 3 tygodnie później. Myszy żywiono wysoko-cholesterolową dietą od początku immunizacji i kontynuowano do zabicia w wieku 25 tygodni. Próbki krwi zebrano 2 tygodnie po dawce przypominającej i w czasie zabicia. Myszy otrzymujące alum służyły jako kontrola. Protokół eksperymentalny został zatwierdzony przez Institutional Animal Care i Use Committee of Cedars-Sinai Medical Center. Wszystkie myszy przebywały w zwierzętarni zaaprobowanej przez American Association of Accreditation of Laboratory Animal Care i utrzymywane w cyklu 12 godzinnego dnia/nocy i miały nieograniczony dostęp do wody i jedzenia. W momencie zabijania myszy były uśpione przez wdychanie enfluranu. Osocze otrzymano przez wykrwawianie retro-orbitalne przez zabiciem.
Pozyskiwanie tkanek i prowadzenie sekcji. Aby ocenić efekt immunizacji peptydami na tworzenie miażdżycy, oceniano wielkość płytek w zatoce aorty, łuku aorty oraz tętnicy zstępującej tułowiowej i brzusznej. Po przepłukaniu serca i pnia aorty solą fizjologiczną po ciśnieniem fizjologicznym, serce i aorta proksymalna zostały wycięte i zatopione w związku OCT (Tissue-Tek) i poddane sekcji zamrożone. Do oceny płytek łuku aorty zebrano kolejne przekroje o grubości 6 μm od pojawienia się przynajmniej 2 zastawek aortalnych do zniknięcia płatków zastawek aortalnych. Typowo, 3 kolejne przekroje znajdowały się na jednym szkiełku i od jednej myszy zbierano łącznie 25-30 szkiełek i co piąte szkiełko grupowano do barwienia. Z tętnicy wstępującej i łuków aorty aż do lewej tętnicy podobojczykowej również przygotowywano przekroje i przetwarzano podobnie. Zstępująca tułowiowa i brzuszna tętnica były przetwarzane oddzielnie w celu dokonania oceny en face tworzenia płytek po wybarwieniu czerwienią O. Preparat en face zstępującej tułowiowej i brzusznej tętnicy Albumina jaja kurzego (Sigma) w stężeniu 0,8 g/ml wody mieszano 1:1 z glicerolem. Dodawano azydku sodu do uzyskania końcowego stężenia 0,2% azydku sodu.
Po oczyszczeniu tętnicy zstępującej tułowiowej i brzusznej z otaczającej tkanki i tłuszczu, część tętnicy z lewej arterii podobojczykowej do poziomu tętnicy nerkowej została starannie usunięta do całonocnego utrwalenia w Histochoice (Amresco). Tętnicę następnie starannie rozcięto wzdłuż i umieszczono stroną wewnętrzną do góry na szkiełku świeżo pokrytym roztworem albuminy jaja. Aby dokonać oceny rozległości miażdżycy przez histomorfometrię wspomaganą komputerowo, po wyschnięciu roztworu albuminy, tętnicę wybarwiono barwnikiem oil red O.
Immunihistochemia i histomorfometria. Przekroje z łuku aorty barwiono histochemicznie przeciwciałem MOMA-2 (Serotec) z użyciem standardowego protokołu. Przeprowadzono barwienie trójkolorowe, aby ocenić zawartość kolagenu i barwienie barwnikiem oil red O z użyciem standardowego protokołu barwienia w celu określenia rozmiaru płytek i zawartości lipidów. Wspomagana komputerowo analiza morfometryczna została przeprowadzona do oceny histomorfometrii jak opisano poprzednio8.
Oznaczenie miana przeciwciał. Aby zmierzyć powstawanie przeciwciał po immunizacji peptydem, opracowano test ELISA. Przeciwciało przeciwko immunizującemu peptydowi oznaczano używając krwi uzyskanej po 2 tygodniach po dawce przypominającej i przy zabiciu. Wytwarzanie przeciwciał przeciwko 3 peptydom oznaczono również w grupie Alum w tych samych okresach czasu. W skrócie, natywne syntetyczne peptydy rozcieńczone w PBS pH 7,4 (20 μg/ml) adsorbowano w studzienkach płytek mikrotitracyjnych (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Denmark) podczas całonocnej inkubacji w 4°C. Po wypłukaniu PBS zawierającym 0,05% Tween-20 (PBS-T) opłaszczone płytki blokowano SuperBlock w TBS (Pierce) przez 5 min. w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano z mysią surowicą rozcieńczoną 1/50 w TBS-0,05% Tween-20 (TBS-T) przez 2 godz. w temperaturze pokojowej i następnie przez noc w 4°C. Po przepłukaniu, osadzanie przeciwciał skierowanych przeciwko peptydom wykrywano używając biotynylowanych króliczych przeciwciał przeciwko mysim Ig (Dako A/S, Glostrup, Denmark) odpowiednio rozcieńczonych w TBS-T. Po kolejnej inkubacji przez 2 godz. w temperaturze pokojowej, płytki przemywano i związane biotynylowane przeciwciała wykrywano streptawidyną koniugowaną z alkaliczną fosfatazą (Sigma), inkubując przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Reakcję barwną wywoływano używając zestawu z substratem fosfatazy (Pierce) i mierzono absorbancję przy 405 nm po 1 godz. inkubacji w temperaturze pokojowej. Średnie wartości obliczano po odjęciu tła.
PL 217 858 B1
Można oczywiście zastosować inne modele oznaczeń, jak każde oznaczenie immunologiczne wykrywające przeciwciało, takie jak radioaktywne oznaczenie immunologiczne, blot typu Western i hybrydyzację Southerna, jak również wykrywanie przeciwciał związanych z peptydami, elektrodami enzymatycznymi i inne metody analizy.
Statystyka
Dane są przedstawione jako średnia ± std. Metoda statystyczna jest wymieniona albo w tekście, tabeli lub w legendzie na figurze. P < 0,05 jest uważane za istotne statystycznie
T a b e l a A
Wielkość płytek w zatoce aorty i ich zawartość lipidów, wielkość płytek w łuku aorty i odsetek płytek w tętnicy zstępującej
| Całkowita wielkość płytek w zatoce aorty (mm2) | Obszar (+) czerwieni O (% płytek w zatoce aorty) | Wielkość płytek w łuku aorty (mm2) | % płytek w tętnicy (prep. płaski) | |
| Alum | 0,49±0,13 | 21,7±4,4 | 0,057±0,040 | 20±4,7 |
| Peptyd 1 | 0,48±0,14 | 32,0±8,1 | 0,054±0,027 | 17±4,3 |
| Peptyd 2 | 0,52±0,12 | 23,9±3,5 | 0,078±0,022 | 6,3±1,9* |
| Peptyd 301 | 0,46±0,16 | 23,8±4,1 | 0,050±0,024 | 8,9±2,2* |
* znacząco różne od grupy Alum. ANOVA, a następnie test Tukey-Kramer został użyty do analizy statystycznej.
Dalsze dane dotyczące wpływu immunizacji sekwencjami peptydowymi apolipoproteiny B-100 na miażdżycę w myszach z nokautem apo E przedstawiono poniżej w Tabeli B.
T a b e l a B
Wpływ immunizacji sekwencjami peptydowymi apolipoproteiny B-100 na miażdżycę w myszach z nokautem apo E
Immunizacje z zastosowaniem mieszanin szeregu sekwencji peptydowych
Wpływ na miażdżycę w aorcie
| 1. | Sekwencje peptydowe 143 i 210 | -64,6% |
| 2. | Sekwencje peptydowe 11, 25 i 74 | -59,6% |
| 3. | Sekwencje peptydowe 129, 148 i 167 | -56,8% |
| 4. | Sekwencje peptydowe 99, 100, 102, 103 i 105 | -40,1% |
| 5. | Sekwencje peptydowe 30, 31, 32, 33 i 34 | + 6,6% |
| 6. | Sekwencje peptydowe 10, 45, 154, 199 i 240 | +17,8% |
Immunizacje z zastosowaniem pojedynczej sekwencji peptydowej
| 1. | Sekwencja peptydowa 2 | -67,7% |
| 2. | Sekwencja peptydowa 210 | -57,9% |
| 3. | Sekwencja peptydowa 301 | -55,2% |
| 4. | Sekwencja peptydowa 45 | -47,4% |
| 5. | Sekwencja peptydowa 74 | -31,0% |
| 6. | Sekwencja peptydowa 1 | -15,4% |
| 7. | Sekwencja peptydowa 240 | 0% |
Podanie peptydów zazwyczaj prowadzono przez wstrzyknięcie, takie jak wstrzyknięcie podskórne, wstrzyknięcie dożylne lub wstrzyknięcie dootrzewnowe.
Pierwsza dawka immunizująca może wynosić 1 do 100 mg na pacjenta w zależności od wagi ciała, wieku i innych warunków fizycznych i medycznych. W szczególnych sytuacjach miejscowe podanie roztworu zawierającego jeden lub więcej peptydów przez cewnik do naczyń wieńcowych jest również możliwe. Można rozważać również preparaty doustne, chociaż trzeba uwzględnić szczególne warunki, aby umożliwić absorpcję do krwiobiegu. Dawka do wstrzyknięcia może wagowo zawierać 0,5 do 99,5% jednego lub więcej fragmentów lub peptydów opisanych niniejszym.
Peptydy są zazwyczaj podawane jako przyłączone do kationowanej albuminy osocza wołu i używając wodorotlenku glinu jako adiuwanta. Inne adiuwanty znane specjalistom również mogą być używane.
PL 217 858 B1
Roztwory do podawania peptydów nie będą zawierać żadnego EDTA ani przeciwutleniaczy.
Peptydy mogą być również używane jako czynniki terapeutyczne u pacjentów już cierpiących na miażdżycę. Zatem, każda odpowiednia droga podania może być wykorzystana dla dodania jednego lub więcej fragmentów lub peptydów.
Początkowe badania skupiały się na określeniu, który typ modyfikacji oksydacyjnych peptydów prowadził do rozpoznawania przez przeciwciała w ludzkim osoczu. Te badania prowadzono wykorzystując peptydy 1-5 i 297-302. Podczas utleniania LDL, wielonienasycone kwasy tłuszczowe w fosfolipidach i estrach cholesterolu ulegają peroksydacji powodując tworzenie silnie reaktywnych produktów rozpadu, takich jak dialdehyd malonowy (MDA). MDA może następnie tworzyć kowalencyjne addukty z resztami lizyny i histydyny w apo B-100, czyniąc je silnie immunogennymi. Utlenianie LDL powoduje również fragmentację apo B-100, co może prowadzić do ekspozycji sekwencji peptydowych zazwyczaj niedostępnych dla układu immunologicznego. W tych doświadczeniach peptydów używano w ich postaci natywnej, po modyfikacji MDA lub po włączeniu do liposomów fosfolipidowych, a następnie utlenianiu miedzią lub modyfikacji MDA. Oznaczano przeciwciała IgM przeciwko peptydom natywnym, MDA- i utlenianym w liposomach, uzyskując miano przeciwciał: peptyd modyfikowany MDA > peptydy modyfikowane MDA w liposomach > peptyd utleniany w liposomach > peptyd natywny. Badanie specyficzności wykazało, że wiązanie przeciwciał do peptydów modyfikowanych MDA było współzawodniczące z zarówno MDA-LDL jak i LDL utlenianym miedzią.
Następnie przeprowadziliśmy badanie przesiewowe całkowitej biblioteki peptydowej z użyciem połączonego osocza pochodzącego ze zdrowych osobników kontrolnych i peptydów natywnych i modyfikowanych MDA jako antygenów. Zidentyfikowano przeciwciała do dużej ilości miejsc w apo B-100. Używając dwukrotnej absorbancji kontrolnego tła jako wartości odcinającej próbek dodatnich, przeciwciała zostały wykryte przeciwko 102 z 302 peptydów tworzących całkowitą sekwencję apo B-100. Wiązanie IgM występowało znacząco częściej niż dla IgG. Ogólnie, wiązanie było wyższe dla sekwencji peptydów modyfikowanych MDA niż dla odpowiadających peptydów natywnych, ale istniała uderzająca korelacja między obydwoma. Występowało współzawodnictwo wiązania zarówno sekwencji natywnych jak i modyfikowanych MDA przy dodawaniu LDL modyfikowanego MDA i LDL utlenianego miedzią, lecz nie natywnego LDL. Te obserwacje sugerują, że odpowiedzi immunologiczne przeciwko sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA w apo B-100 powodują reakcję krzyżową przeciwko natywnym sekwencjom. Niezdolność natywnego LDL do współzawodniczenia w wiązaniu przeciwciał jest zagadkowa, lecz może wskazywać, że te sekwencje stają się eksponowane dopiero po proteolitycznej degradacji apo B-100, która następuje jako skutek utleniania LDL. Zarówno hydrofilowe jak i hydrofobowe części cząsteczki były rozpoznawane przez przeciwciała. Drugie badanie przeglądowe biblioteki peptydowej apo B-100 zostało przeprowadzone z użyciem połączonego osocza od osób z klinicznymi objawami choroby wieńcowej serca (CHD), ostrego niedotlenienia mięśnia sercowego (AMI) i niewyrównanej dusznicy bolesnej (n=10). Przeciwciała w połączonym osoczu CHD wiązały się do tych samych sekwencji i z tą samą ogólną dystrybucją jak dla przeciwciał w zdrowym kontrolnym osoczu. Jednakże, miana przeciwciał przeciwko szeregowi peptydów (nr 1, 30-34, 100, 107, 148, 149, 162, 169, 236, 252 i 301) były przynajmniej dwukrotnie wyższe w kontrolnym osoczu w porównaniu z osoczem z osób z CHD, podczas gdy miana przeciwko kilku peptydom (nr 10, 45, 111. 154, 199, 222 i 240) były wyższe w osoczu pacjentów z CHD w porównaniu z kontrolnymi. Następnie przeprowadziliśmy prospektywne badanie kliniczne, aby stwierdzić czy poziomy przeciwciał przeciwko sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA w apo B-100 określają ryzyko dla rozwoju CHD. Używając metody „nested case control” (tj. badanie kliniczno-kontrolne zagnieżdżone) wybraliśmy 78 osób ze zaburzeniami wieńcowymi (AMI lub zgon spowodowany CHD) i 149 osób kontrolnych z badania Malmo Diet Cancer. Ani u osób z zaburzeniami, ani kontrolnych nie odnotowano uprzednio MI lub udaru. Średni czas pomiędzy przypadkami od włączenia do ostrego zaburzenia wieńcowego wynosił 2,8 roku (zakres 0,1-5,9 lat). Poziom przeciwciał został określony w podstawowych próbkach osocza z dodanymi przeciwutleniaczami. Używając grubości błony wewnętrznej/środkowej (IMT) tętnicy szyjnej według pomiaru ultrasonograficznego jako wartości podstawowej, przeprowadziliśmy również analizę związków pomiędzy poziomami przeciwciał, a stopniem istniejącej choroby naczyniowej. Zbadaliśmy 8 sekwencji peptydowych modyfikowanych MDA, które w początkowych badaniach przeglądowych były związane z wysokimi poziomami przeciwciał w osoczu (nr 74, 102 i 210) i/lub znacznymi różnicami pomiędzy połączonymi osoczami kontrolnymi a CHD (# 32, 45, 129, 162 i 240). Stwierdzono, że kontrole mają wyższe poziomy IgM przeciwko peptydowi 74 modyfikowanemu MDA (0,258, zakres 0-1,123 jednostek absorbancji wobec 0,178, zakres 0-0,732 jednostek absorbancji, p<0,05),
PL 217 858 B1 w pozostałych przypadkach nie było różnic poziomów przeciwciał pomiędzy osobami z zaburzeniami a kontrolnymi. Związki pomiędzy IMT a IgM przeciwko peptydom modyfikowanym MDA nr 102, 129, i 162 (r = 0,233, 0,232, i 0,234, odpowiednio, p<0,05) zaobserwowano u osób z zaburzeniami oraz pomiędzy IMT a peptydem 45 modyfikowanym MDA (r=0,18, p<0,05) w kontrolach. Słabe korelacje zaobserwowano pomiędzy przeciwciałami przeciwko peptydowi 129 modyfikowanemu MDA a cholesterolem całkowitym i LDL (r=0,19 i r=0,19, p<0,01, odpowiednio), w pozostałych przypadkach poziomy przeciwciał przeciwko peptydom nie wykazywały związków z całkowitym cholesterolem osocza, cholesterolem LDL, cholesterolem HDL lub trójglicerydami osocza. Wystąpiły silne współzależności pomiędzy poziomami przeciwciał przeciwko różnym peptydom (wartości r w zakresie od 0,6 do 0,9). Jedynym wyjątkiem były przeciwciała przeciwko peptydowi 74 modyfikowanemu MDA, które słabo lub wcale nie były związane z przeciwciałami przeciwko innym peptydom.
Przeciwciała przeciwko wszystkim sekwencjom z wyjątkiem peptydu 74 modyfikowanego MDA były odwrotnie proporcjonalne do wieku u osób z zaburzeniami (wartości r w zakresie od -0,38 do -0,58, p<0,010 0.001), ale nie u kontrolnych. Poziomy utlenionego LDL w osoczu, przeciwnie, rosły wraz z wiekiem. Ponownie, ten związek był silniejszy u osób z zaburzeniami niż u kontrolnych. Aby stwierdzić, czy związki pomiędzy odpowiedziami immunologicznymi przeciwko sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA a chorobą układu krążenia były różne w różnych grupach wiekowych, została przeprowadzona analiza na podgrupach osób z zaburzeniami i kontrolnych poniżej i powyżej średniego wieku (61 lat). W młodszej grupie wiekowej, osoby z zaburzeniami miały podwyższone poziomy przeciwciał przeciwko peptydom 32 i 45 i obniżone poziomy przeciwciał przeciwko peptydowi 74 w porównaniu z kontrolnymi, podczas gdy nie zaobserwowano różnic w starszej grupie wiekowej. Przeciwciała przeciwko wszystkim sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA, z wyjątkiem peptydu 74, były znacząco związane z IMT w młodszej grupie wiekowej, ale nie w starszej (Tabela).
Te badania zidentyfikowały szereg sekwencji modyfikowanych MDA w apo B-100, które są rozpoznawane przez ludzkie przeciwciała. Modyfikacja MDA apo B-100 następuje wskutek utleniania LDL, wskazując, że te przeciwciała należą do rodziny poprzednio opisanych auto-przeciwciał przeciwko utlenionemu LDL. To spostrzeżenie jest również potwierdzone przez obserwację, że zachodzi współzawodniczenie wiązania się przeciwciała z peptydami apo B-100 modyfikowanymi MDA przez dodanie utlenionego LDL. Razem z utlenionymi fosfolipidami zidentyfikowanymi przez Horkko i wsp., te sekwencje peptydowe modyfikowane MDA prawdopodobnie tworzą dużą większość struktur antygenowych u utlenionym LDL. Podobnie do przeciwciał przeciwko fosfolipidom utlenionego LDL, przeciwciała przeciwko sekwencjom apo B-100 modyfikowanym MDA były typu IgM. To może sugerować, że również te ostatnie przeciwciała należą do rodziny T15 naturalnych przeciwciał. Przeciwciałom T15 przypisano ważną rolę we wczesnej, niezależnej od komórek T, obronie przed zakażeniami bakteryjnymi jak również w usuwaniu komórek apoptotycznych. Pozostaje do ustalenia, czy przeciwciała przeciwko peptydom modyfikowanym MDA opisane tutaj mają podobne funkcje. Zidentyfikowano również przeciwciała przeciwko dużej ilości natywnych sekwencji apo B-100. Jednakże, uderzająca współzależność pomiędzy przeciwciałami przeciwko sekwencjom natywnym i modyfikowanym MDA sugeruje, że również te przeciwciała są wytwarzane w odpowiedzi na utlenianie LDL. Jest również możliwe, że przeciwciała przeciwko sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA reagują krzyżowo z odpowiadającą natywną sekwencją. Jeżeli przeciwciała przeciwko natywnym sekwencjom apo B-100 wiążą się również z natywnymi cząstkami LDL, jest prawdopodobne, że mają zasadniczy wpływ na metabolizm LDL. Jednakże, odkrycie, że natywny LDL nie współzawodniczy w wiązaniu przeciwciała z natywnymi sekwencjami apo B-100, jak również brak związku pomiędzy przeciwciałami przeciwko natywnym sekwencjom apo B-100 i poziomami cholesterolu LDL przeczy istnieniu takiego zjawiska.
Przeciwciał przeciwko sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA ubywało stopniowo z wiekiem u osób z zaburzeniami, ale nie u kontrolnych. Z wyjątkiem peptydu 74 modyfikowanego MDA, przeciwciała IgM przeciwko peptydom modyfikowanym MDA były znacząco związane z ITM tętnicy szyjnej w młodszej grupie wiekowej (poniżej 62 lat), ale nie w starszej grupie wiekowej. Te odkrycia sugerują, że mają miejsce znaczące zmiany w oddziaływaniach pomiędzy układem immunologicznym a ścianą naczyń z miażdżycą pomiędzy wiekiem 50 i 70 lat. Jedną możliwością jest taka, że u osób młodszych proces miażdżycowy znajduje się na bardziej aktywnym etapie z bardziej znaczącym zaangażowaniem komórek układu immunologicznego. Inna możliwość jest taka, że obniżone poziomy przeciwciał przeciwko sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA u osób starszych stanowią odbicie starzenia się komórek układu immunologicznego, zaangażowanych w miażdżycę. Zaburzona funkcja komórek układu immunologicznego spowodowana starzeniem immunologicznym
PL 217 858 B1 została zaproponowana jako przyczyniająca się do zwiększonej podatności na zakażenia i nowotwory w starszej populacji. Interesujące jest, że starzenie immunologiczne jest hamowane przez przeciwutleniacze wskazując na wpływ stresu oksydacyjnego. Komórki układu immunologicznego, które oddziaływują z epitopami w utlenionym LDL są prawdopodobnie szczególnie narażone na stres oksydacyjny. Ponieważ utleniony LDL jest obecny w tętnicach już w bardzo wczesnym wieku, te odpowiedzi immunologiczne są stale pobudzane przez kilkadziesiąt dziesięcioleci, co może dodatkowo przyczyniać się do postępu starzenia immunologicznego.
Stwierdzono, że zwiększone przeciwciała przeciwko dwóm miejscom w apo B-100 są związane z ryzykiem niedotlenienia mięśnia sercowego i zgonu z powodu choroby wieńcowej u osób w wieku poniżej 62 lat. Przeciwciała przeciwko tym miejscom wykazywały wysoki poziom współzależności, sugerując, że są one wytwarzane w odpowiedzi na ten sam patofizjologiczny. Fakt, że średni czas od pobrania krwi do zaburzenia wieńcowego wynosił tylko 2,8 roku czyni te przeciwciała szczególnie interesującymi jako znaczniki zwiększonego ryzyka CHD. Poziomy przeciwciał przeciwko sekwencjom peptydowym apo B-100 modyfikowanym MDA nie wykazywały związków z innymi czynnikami ryzyka CHD, takimi jak hiperlipidemia, nadciśnienie i cukrzyca, sugerując, że są one niezależnymi znacznikami ryzyka CHD. Przypadki CHD w niniejszym badaniu nie były osobami o bardzo wysokim ryzyku i w tym aspekcie reprezentatywnymi jako typowi pacjenci z CHD. Stwierdzenie, że IgM przeciwko sekwencjom apo B-100 modyfikowanym MDA określają krótkoterminowe ryzyko wystąpienia ostrych zaburzeń wieńcowych u jednostek, które nie zostałyby zidentyfikowane jako wysokiego ryzyka przez badanie przeglądowe ustalonych czynników ryzyka, sugeruje, że może ono stać się użytecznym narzędziem dla identyfikacji jednostek potrzebujących agresywnego leczenia zapobiegawczego. Jednakże, znacznie większe badania prospektywne z analizą danych wielowymiarowych są konieczne zanim w pełni zostanie ustalona kliniczna wartość mierzenia przeciwciał przeciwko sekwencjom peptydowym apo B-100 modyfikowanym MDA. Innym ograniczeniem niniejszego badania klinicznego jest to, że przeanalizowaliśmy tylko przeciwciała przeciwko małej ilości miejsc antygenowych w apo B-100, i że inne miejsca mogą być nawet lepszymi znacznikami ryzyka choroby naczyniowej.
U osób w wieku poniżej 60 lat przeciwciała przeciwko dużej ilości miejsc modyfikowanych MDA w apo B-100 były skorelowane z rozległością istniejącej choroby naczyń, jak ocenione przez IMT tętnicy szyjnej. Przeciwciała IgM były bardziej związane z IMT tętnicy szyjnej niż przeciwciała IgG. Chociaż IMT tętnicy szyjnej ma oczywiste ograniczenia jako pomiar ogólnego zaburzenia miażdżycowego, te obserwacje nadal sugerują, że zmierzenie IgM przeciwko sekwencjom modyfikowanym MDA w apo B-100 może być jedną z metod oceny zaawansowania istniejącej miażdżycy. Te obserwacje są również zgodne z szeregiem poprzednich badań, które stwierdziły związki pomiędzy chorobą naczyń wieńcowych i szyjnych a przeciwciałami przeciwko utlenionemu LDL.
Przeciwciała przeciwko peptydowi 74 różniły się od innych przeciwciał przeciwko apo B-100 pod wieloma względami. Były wyższe u osób kontrolnych niż z zaburzeniami, nie ubywało ich z wiekiem i nie były związane z zakresem choroby w tętnicy szyjnej. Zgodnie z tym przeciwciała przeciwko tej sekwencji peptydowej stanowią interesujących kandydatów wobec odpowiedzi immunologicznej chroniącej naczynia.
Ważnym pytaniem jest, dlaczego występują te związki. Jasno wykazują one, że odpowiedzi immunologiczne przeciwko miejscom w modyfikowanej MDA apo B-100 w jakiś sposób są zaangażowane w proces choroby miażdżycowej. Ponieważ wysokie poziomy przeciwciał są związane z poważniejszą miażdżycą i zwiększonym ryzykiem wystąpienia ostrych zaburzeń wieńcowych, jedną oczywistą możliwością jest taka, że te odpowiedzi immunologiczne powodują rozwój miażdżycy. Badania wykazujące, że odpowiedzi immunologiczne przeciwko białkom szoku cieplnego, takim ja HSP 65, sprzyjają rozwojowi miażdżycy, dostarczają pewnego poparcia dla tego poglądu. Jednakże, badania doświadczalne na zwierzętach wykazały ochronny efekt przeciwmiażdżycowy immunizacji utlenionym LDL. Odtworzenie komórek B u myszy apo E null pozbawionych śledziony powoduje cofnięcie się miażdżycy. Obniżenie miażdżycy zaobserwowano również u myszy apo E null otrzymujących powtarzane wstrzyknięcia immunoglobulin. Niniejsze ujawnienia niekoniecznie są w sprzeczności z ochronną przeciwmiażdżycową rolą odpowiedzi immunologicznych przeciwko utlenionemu LDL. Te odpowiedzi immunologiczne są pobudzane przez procesy sprzyjające miażdżycy takie jak utlenianie LDL. Zgodnie z tym, jest prawdopodobne, że będą w proporcji do ciężkości procesu chorobowego i mogłyby służyć jako znaczniki ciężkości choroby i ryzyka CHD bez przyczyniania się do postępów choroby. Stwierdzenie, że immunizacja myszy apo E null sekwencjami peptydowymi apo B-100 hamuje rozwój miażdżycy, opisane w dwóch towarzyszących publikacjach, wykazuje, że prawdopodobnie tak jest.
PL 217 858 B1
Rzeczywiście, najważniejszym wynikiem niniejszego badania może być identyfikacja struktur, które mogłyby być użyte jako składniki szczepionki przeciwko miażdżycy. Obserwacja, że obniżeniu przeciwciał przeciwko sekwencjom peptydowym modyfikowanym MDA w apo B-100, które następuje z wiekiem, towarzyszy wzrost poziomów utlenionego LDL w osoczu, sugeruje, że zwiększone usuwanie minimalnie utlenionego LDL z krążenia może być jednym z mechanizmów, przez które te przeciwciała mogłyby chronić przed miażdżycą.
Metody
Badanie populacyjne
Osoby objęte badaniem, urodzone pomiędzy 1926-45, należą do grupy badanej MaImo „Diet and Cancer (MDC)”. Losowo 50% tych, którzy wzięli udział w badaniu pomiędzy listopadem 1991 i lutym 1994 zostało zaproszonych do wzięcia udziału w badaniu epidemiologii choroby tętnicy szyjnej. Schematy zapewnienia informacji o zachorowalności i śmiertelności następującej po badaniu zdrowia, jak również określenie tradycyjnych czynników ryzyka, zostały zgłoszone.
Zostało zidentyfikowanych osiemdziesiąt pięć przypadków ostrych zaburzeń wieńcowych serca, tzn. śmiertelnych lub nie MI lub zgonów spowodowanych chorobą wieńcową serca (CHD). Uczestnicy, którzy poprzednio mieli niedotlenienie mięśnia sercowego lub zawał (n=6) nie zostali zakwalifikowani do niniejszego badania. W każdym przypadku indywidualnie zostały dobrane dwie osoby kontrolne pasujące pod względem wieku, płci, zwyczajów palenia, obecności nadciśnienia i miesiąca wzięcia udziału w badaniu przesiewowym i okresu dalszej obserwacji. Ze względu logistycznego (próbki krwi nie były dostępne w dostatecznej ilości dla pomiaru peptydów) tylko jedna kontrola była dostępna dla siedmiu przypadków i brak było kontroli dla jednego przypadku. Ten przypadek został wykluczony z badania. Zatem, badanie populacyjne obejmowało 227 osób, 78 z zaburzeniami i 149 kontrolnych, w wieku 49-67 (średnia 61) lat jako poziom podstawowy.
Analizy laboratoryjne
Po całonocnym poście pobierano próbki krwi w celu określenia poziomów całkowitego cholesterolu, trójglicerydów, cholesterolu HDL, cholesterolu LDL w osoczu i całkowitej glukozy krwi. Cholesterol LDL w nmol/l został wyliczony zgodnie ze wzorem Friedewald. Utleniony LDL został zmierzony w ELISA (Mercordia).
Ultrasonograficzne badanie naczyniowe w B-mode
System tomografii komputerowej Acuson 128 (Acuson, Mountain View, California) z przekaźnikiem MHz został wykorzystany do zbadania płytek szyjnych w prawej tętnicy szyjnej, jak opisano poprzednio.
Opracowanie testu ELISA przeciwko sekwencjom peptydowym apo B-100
Zsyntetyzowano 302 peptydy odpowiadające całej sekwencji aminokwasowej ludzkiej apolipoproteiny B (Euro-Diagnostica AB, Malmo, Sweden i KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Denmark) i wykorzystano w ELISA. Część każdego syntetycznego peptydu została zmodyfikowana 0,5 M MDA (Sigma-Aldrich Sweden AB, Stockholm, Sweden) przez 3h w 37°C lub przez 5 mM CuCl2 (Sigma) przez 18 godz. w 37°C. Peptydy modyfikowane MDA były dializowane wobec PBS zawierającego 1 mM EDTA zmienianego kilka razy przez 18 godz. w 4°C. Modyfikacja peptydów została sprawdzona w denaturujących żelach poliakrylamidowych (BioRad Laboratories, Hercules, CA), odpowiednich dla rozdziału peptydów.
Mieszanina fosfatydylocholiny jaja (EPC) (Sigma) i fosfatydyloseryny (PS) (Sigma) w roztworze chloroformowym w proporcji molarnej 9:1 i stężeniu 3 mM fosfolipidu (PL) została odparowana w szklanym pojemniku pod łagodnym strumieniem argonu. Pojemnik został następnie umieszczony w próżni na 3 godz. Roztwór zawierający 0,10 mM peptyd (5 ml) w sterylnym filtrowanym 10 mM buforze HEPES pH 7,4, 145 mM NaCl i 0,003% azydku sodu został dodany do wysuszonej błonki EPC/PS i inkubowany przez 15 min w 50°C. Mieszanina była łagodnie wstrząsana przez około 5 min. w temperaturze pokojowej i umieszczona w lodowatej łaźni wodnej i sonikowana przy amplitudzie 7,5 mikronów przez 3x3 min. (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Medlab, Sweden) z przerwami 1 min. Mieszanina PL-peptyd, natywny lub modyfikowany 0,5 M MDA przez 3 godz. w 37°C lub 5 mM CuCl2 przez 18 h w 37°C, była przechowywana pod argonem w szklanych fiolkach w 4°C owiniętych folią aluminiową i zużywana w ciągu 1 tygodnia. Mieszanina modyfikowana MDA była dializowana wobec PBS zawierającego 1 mM EDTA z kilkoma zmianami przez 18 godz. w 4°C przez przechowywaniem. Modyfikacja mieszaniny została sprawdzona w denaturujących żelach poliakrylamidowych (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, SE), odpowiednich do rozdziału peptydów.
PL 217 858 B1
Natywne lub modyfikowane syntetyczne peptydy rozcieńczone w PBS pH 7,4 (20 μg/ml), w obecności lub nieobecności liposomów, były absorbowane w studzienkach płytek mikrotitracyjnych (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Denmark) podczas całonocnej inkubacji w 4°C. Jako odnośnik, jeden z peptydów (P6) był umieszczony na każdej płytce. Po płukaniu PBS-em zawierającym 0,05% Tween-20 (PBS-T), opłaszczone płytki były blokowane SuperBlock w TBS (Pierce, Rockford, IL) przez 5 min. w temperaturze pokojowej i następnie przez noc w 4°C. Po płukaniu, wiązanie się autoprzeciwciał skierowanych przeciwko peptydom było wykrywane przez użycie biotynylowanych króliczych przeciwciał przeciwko ludzkim IgG lub IgM (Dako A/S, Glostrup, Denmark) odpowiednio rozcieńczonych w TBS. Po kolejnej inkubacji przez 2 godz. w temperaturze pokojowej płytki były płukane i związane biotynylowane przeciwciała były wykrywane przez alkaliczną fosfatazę koniugowaną z streptawidyną (Sigma), inkubowane przez 2 godz. w temperaturze pokojowej. Reakcja barwna była wywoływana przez użycie zestawu substratu fosfatazy (Pierce) i absorbancja przy 405 nm była mierzona po 1 godz. inkubacji w temperaturze pokojowej. Wartości absorbancji dla różnych peptydów były dzielone przez wartość absorbancji dla P6 i porównywane.
Statystyka
Do analiz statystycznych stosowano SPSS. Wyniki są przedstawione jako średnia i zakres i jako proporcje, gdy jest to odpowiednie. Wykres skrzynkowy i wykres rozproszony zostały wykorzystane dla zobrazowania związku między wiekiem a wybranymi peptydami wśród przypadków i odpowiadających kontroli. Odpowiadające grafy zostały również wykorzystane dla zobrazowania związku między wiekiem a wybranymi peptydami, przypadki i kontrole, odpowiednio, powyżej i poniżej średniej wieku (61 rok) w poziomie podstawowym i oddzielnie dla przypadków i kontroli poniżej średniej wieku. Dla przypadków i kontroli, oddzielnie, częściowe współczynniki korelacji, skorygowane dla wieku i płci, zostały wyliczone pomiędzy wybranymi peptydami i poziomami lipidów we krwi i pospolitym IMT tętnicy szyjnej. Współczynniki korelacji skorygowane dla wieku i płci zostały również wyliczone pomiędzy pospolitym IMT tętnicy szyjnej i wybranymi peptydami dla przypadków i kontroli powyżej i poniżej średniej wieku. Niezależny test t próbki został wykorzystany do oceny rozkładu normalnego ciągłych zmiennych i test Chi-kwadrat dla proporcji pomiędzy przypadkami i kontrolami. Test nieparametryczny (Mann-Whitney) został wykorzystany do oceny ciągłych zmiennych bez rozkładu normalnego pomiędzy przypadkami i kontrolami. Wszystkie wartości p są obustronne.
T a b e l a
Współczynnik korelacji skorygowany dla wieku i płci dla różnych poziomów podstawowych MDA i średniej grubości błony wewnętrznej-środkowej tętnicy szyjnej wśród młodszych (49-61 lat) i starszych (62-67 lat) przypadków z niedotlenieniem mięśnia sercowego i odpowiadających im kontroli dobranych pod względem wieku, płci, palenia i nadciśnienia
| Peptyd | Przypadki plus Kontrole w wieku 49-61 lat, n=116 | Przypadki plus Kontrole w wieku 62-67 lat, n=111 |
| IgM | ||
| MDA 32 | 0,235t | -0,101 |
| MDA 45 | 0,366$ | -0,030 |
| MDA 74 | 0,178 | 0,063 |
| MDA 102 | 0,255$ | -0,039 |
| MDA 129 | 0,330$ | -0,009 |
| MDA 162 | 0,2451 | 0,001 |
| MDA 210 | 0,254 | 0,013 |
| MDA 240 | 0,284$ | 0,006 |
| IgG | ||
| MDA 215 | 0,119 | -0,059 |
p< 0,05; $/x0,01
PL 217 858 B1
Literatura
1. Ameli S. i wsp. Effect of immunization with homologous LDL i oxidized LDL on early atherosclerosis in hypercholesterolemic rabbits. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16, 1074-1079 (1996);
2. Freigang S., Horkko S., Miller E., Witztum J.L. i Palinski W. Immunization of LDL receptordeficient mice with homologous malondialdehyde-modified i native LDL reduces progression of atherosclerosis by mechanisms other than induction of high titiers of antibodies to oxidative neoepitopes. Arterioscler Thromb Vasc BioL 18, 1972-1982 (1998);
3. George J. i wsp. Hyperimmunization of apo-E-deficient mice with homologous malondialdehyde low-density lipoprotein suppresses early atherogenesis. Atherosclerosis 138, 147-152 (1998);
4. Alving C.R. i wsp. Immunization with cholesterol-rich liposomes induces anticholesterol antibodies i reduces diet-induced hypercholesterolemia i plaque formation. J. Lab. Clin. Med. 127 ,40-49 (1996);
5. Zhou X., Caligiuri G., Hamsten A., LefVert A.K. i Hansson G.K. LDL immunization induces T-cell-dependent antibody formation i protection against atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 108-114 (2001);
6. Nakashima Y., Plump A.S., Raines E.W., Breslow J.L. i Ross R. Apo-E-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb 14, 133-140 (1994);
7. Reddick R.L., Zhang S.H. i Maeda N. Atherosclerosis in mice lacking apo E. Evaluation of Iesional development i progression. Arterioscler Thromb 14, 141-147 (1994);
8. Shah P.K. i wsp. Effects of recombinant apolipoprotein A-I(Milano) on aortic atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice. Circulation 97, 780-785 (1998);
9. Glass, C.K. i Witztum, J.L. Atherosclerosis. The road ahead. Cell 104, 503-16. (2001);
10. Holvoet, P., Vanhaecke, J., Janssens, S., Van de Werf, F. i Collen, D. Oxidized LDL i malondialdehyde-modified LDL in patients with acute coronary syndromes i stable coronary artery disease. Circulation 98, 1487-94 (1998);
11. Ehara, S. i wsp. Elevated levels of oxidized low density lipoprotein show a positive relationship with the severity of acute coronary syndromes. Circlation 103, 1955-60 (2001);
12. Krych-Goldbe rg , M. i Atkinson, J.P. Structure-function relationships of complement receptor type 1. Immunol Rev 180, 112-22 (2001);
13. Nicoletti, A., Caligiuri, G., Paulsson, G. & Hansson, G.K. Functionality of specific immunity in atherosclerosis. Am Heart J 138, S438-43 (1999);
14. Chobanian, A.V., Haudenschild, C.C., Nickerson, C. i Drago, R. Antiatherogenic effect of captopril in the Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit. Hypertension 15, 327-31 (1990);
15. Inoue, I. i wsp. Macrophage colony stimulating factor prevents the progression of atherosclerosis in Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits. Atherosclerosis 93, 245-54 (1992);
16. Bourassa, P.A., Milos, P.M., Gaynor, B.J., Breslow, J.L. & Aiello, R.J. Estrogen reduces atherosclerotic lesion development in apolipoprotein E-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 93, 10022-7 (1996);
17. Sparrow, C.P. i wsp. Simvastatin has anti-inflammatory i antiatherosclerotic activities independent of plasma cholesterol lowering. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21, 115-21 (2001);
18. Nakashima, Y., Plump, A.S., Raines, E.W., Breslow, J.L. & Ross, R. ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arterioscler Thromb 14, 133-40 (1994);
19. Palinski, W. i wsp. ApoE-deficient mice are a model of lipoprotein oxidation in atherogenesis. Demonstration of oxidation-specific epitopes in lesions and high titers of autoantibodies to malondialdehyde-lysine in serum. Arterioscler Thromb 14, 605-16. (1994).
PL 217 858 B1
Lista sekwencji: SEK NR ID 1 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
Lista sekwencji: SEK NR ID 2 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa PQCSTHILQWLKRVHANPLL
Lista sekwencji: SEK NR ID 3 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa VISIPRLQAEARSEILABWS
Lista sekwencji: SEK NR ID 4 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa KLVKEALKESQLPTVMDFRK
Lista sekwencji: SEK NR ID 5 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
Lista sekwencji: SEK NR ID 6 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza
PL 217 858 B1
Topologia: Liniowa
DGSLRHKJFLDSNIKFSHYEK
Lista sekwencji: SEK NR ID 7 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
Lista sekwencji: SEK NR ID 8 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić; Pojedyncza Topologia; Liniowa RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
Lista sekwencji: SEK NR ID 9 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
SLTSTSDLQSGIIKNTASLK Lista sekwencji: SEK NR ID 10 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
TASLKYENYELTLKSDTNGK
Lista sekwencji: SEK NR ID 11 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa DMTFSKQNALLRSEYQADYE
Lista sekwencji: SEK NR ID 12 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu
PL 217 858 B1
Nić: Pojedyncza
Topologia: Liniowa
MKVKIIRTIDQMQNSELQWP
Lisia sekwencji: SEK NR ID 13 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa IALDDAK1NFNEKLSQLQTY
Lista sekwencji: SEK NR ID 14 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
Lista sekwencji: SEK NR ID 15 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić; Pojedyncza Topologia: Liniowa
EEEMLEN VSL VCPKDA TRFK
Lista sekwencji: SEK NR ID 16 Źródło; Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
GSTSHHLVSRKSISAALEHK
Lista sekwencji: SEK NR ID 17 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
IENIDFNKSGSSTASWIQNV
Lista sekwencji; gEKNR ID 18 Źródło: Fragment apolipoproteiny B
PL 217 858 B1
Długość: 20
Rodzaj; aminokwasy peptydu Nie: Pojedyncza Topologia: Liniowa
IREVTQRLNGEIQALELPQK Lista sekwencji: SER NR ID 19 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
Lista sekwencji: SEK NR ID 20 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topołogia: Liniowa HTFLIYITELLKKLQSTTVM
Lista sekwencji: SEK NR ID 21 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
LLDIANYLMEQ1QDDCTGDE
Lista sekwencji: SEK NR ID 22 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
Lista sekwencji: SEK NR ID 23 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa GNMGQTMEQLTPELKSSILK Lista sekwencji: SEK NR ID 24
PL 217 858 B1
Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa SS1LKCVQSTKPSLMIQKAA
Lista sekwencji: SEK NR ID 25 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa IQKAAIQALRKMEPKDKDQE
Lista sekwencji: SEK NR ID 26 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa RLNGESNŁRFNSSYLQGTNQ
Lista sekwencji: SEK NR ID 27 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
SLNSHGLELNADILGTDKIN Lista sekwencji: SEK NR ID 28 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa WIQNVDTKYQIRIQ1QEKLQ
Lista sekwencji: SEK NR ID 29 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
PL 217 858 B1
Lista sekwencji; SEK NR TD 30 Źródło; Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić; Pojedyncza Topologia: Liniowa EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
Lista sekwencji: SEK NR ID 31 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj; aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
Lista sekwencji: SEK NR ID 32 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia; Liniowa
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
Lista sekwencji: SEK NR ID 33 Źródło; Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
SGASMKLITNGRFREHNAKF
Lista sekwencji: SEK NR ID 34 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
Lista sekwencji: SEK NR ID 35 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
PL 217 858 B1
CHS VLTAKGMALFGEGKAEF
Lista sekwencji: SEK NR ID 36 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydn Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa
FKSSVITLNTNAELFNQSD1
Lista sekwencji: SEK NR ID 37 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj: aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia: Liniowa FPDLGQEVALNANTKNQKIR
Lista sekwencji: SEK NR ID 38 Źródło: Fragment apolipoproteiny B Długość: 20
Rodzaj; aminokwasy peptydu Nić: Pojedyncza Topologia; Liniowa ATRFKHLRKYTYNYQAQS
Claims (27)
1. Fragment apolipoproteiny B, w postaci natywnej lub aldehydowej pochodnej, o sekwencji KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH (SEK. NR ID: 14), albo jego miejsce aktywne, wykazujący właściwości immunogenne lub lecznicze wobec niedokrwiennych chorób układu krążenia, który to fragment jest przeznaczony do:
a) immunizacji ssaków, w tym ludzi, przeciwko niedokrwiennym chorobom układu krążenia; lub
b) leczenia ssaków, w tym ludzi, z niedokrwiennymi chorobami układu krążenia; i/lub
c) diagnozowania obecności lub braku przeciwciał związanych ze zwiększonym lub obniżonym ryzykiem rozwoju niedokrwiennych chorób układu krążenia.
2. Fragment według zastrz. 1, znamienny tym, że jest haptenem aldehydu.
3. Fragment według zastrz. 2, znamienny tym, że jest modyfikowany z użyciem dialdehydu malonowego (MDA) lub hydroksynonenalu.
4. Fragment według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci natywnej.
5. Fragment według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci utlenionej.
6. Fragment według zastrz. 5, znamienny tym, że został utleniony z użyciem miedzi.
7. Fragment według zastrz. 1, znamienny tym, że jest obecny w kombinacji z liposomami fosfolipidowymi.
8. Fragment według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci pochodnej dialdehydu malonowego (MDA).
9. Fragment według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci pochodnej hydroksynonenalowej.
10. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera skuteczną terapeutycznie ilość fragmentu określonego w jednym z zastrz. 1 do 9, ewentualnie w kombinacji z jednym lub więcej nieszkodliwych farmaceutycznie wypełniaczy i/lub adiuwantów.
11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 10, znamienna tym, że fragment jest obecny jako połączony z kationizowaną albuminą surowicy wołu, a wodorotlenek glinu jest stosowany jako adiuwant.
12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 11, znamienna tym, że stanowi kompozycję do wstrzyknięć.
13. Szczepionka do immunizacji ssaków, w tym ludzi, przeciwko niedokrwiennym chorobom układu krążenia, znamienna tym, że zawiera fragment określony w jednym z zastrz. 1 do 9, ewentualnie w kombinacji z adiuwantem.
14. Szczepionka do immunizacji według zastrz. 13, znamienna tym, że fragment do immunizacji jest obecny jako połączony z kationizowaną albuminą surowicy wołu, a wodorotlenek glinu jest stosowany jako adiuwant.
15. Zastosowanie fragmentu określonego w jednym z zastrz. 1 do 9, w postaci natywnej lub jako pochodnej MDA lub hydroksynonenalowej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych do immunoterapii lub terapii niedokrwiennych chorób układu krążenia.
16. Zastosowanie według zastrz. 15, znamienne tym, że dawka immunizująca wynosi 1 do 100 mg fragmentu.
17. Szczepionka do immunizacji ssaków, w tym ludzi, przeciwko niedokrwiennym chorobom układu krążenia, znamienna tym, że zawiera skuteczną terapeutycznie ilość oczyszczonego lub wytwarzanego rekombinacyjnie przeciwciała przeciwko natywnemu i/lub modyfikowanemu MDA fragmentowi określonemu w jednym z zastrz. 1-9.
18. Sposób in vitro diagnozowania obecności lub braku przeciwciał związanych ze zwiększonym lub obniżonym ryzykiem rozwoju chorób niedokrwiennych układu krążenia, znamienny tym, że wykorzystuje w teście fragment określony w jednym z zastrz. 1-9.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że testem jest test immunologiczny.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że testem immunologicznym jest ELISA, RIA, Western blot lub hybrydyzacja Southerna.
21. Oczyszczone lub rekombinacyjnie wytworzone przeciwciało przeciwko fragmentowi apolipoproteiny B o sekwencji KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH (SEK. NR ID: 14), znamienne tym, że jest do zastosowania w profilaktycznym lub terapeutycznym traktowaniu ssaka, w tym człowieka, w niedokrwiennych chorobach układu krążenia.
PL 217 858 B1
22. Przeciwciało do zastosowania według zastrz. 21, znamienne tym, że fragment jest w postaci natywnej lub utlenionej.
23. Przeciwciało do zastosowania według zastrz. 22, znamienne tym, że fragment jest pochodną aldehydową.
24. Przeciwciało do zastosowania według zastrz. 23, znamienne tym, że fragment jest modyfikowany z użyciem dialdehydu malonowego lub hydroksynonenalu.
25. Przeciwciało do zastosowania według zastrz. 23 albo 24, znamienne tym, że fragment jest haptenem aldehydu.
26. Przeciwciało do zastosowania według zastrz. 22, znamienne tym, że fragment został utleniony z użyciem miedzi.
27. Przeciwciało do zastosowania według jednego z zastrz. 21-26, znamienne tym, że fragment jest obecny w kombinacji z liposomami fosfolipidowymi.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0101232A SE0101232D0 (sv) | 2001-04-05 | 2001-04-05 | Peptide-based immunization therapy for treatment of atherosclerosis and development of peptide-based elisa for determination of immune responses against oxidized low density liprotein |
| SE0103754A SE0103754L (sv) | 2001-04-05 | 2001-11-09 | Peptider från apolipoprotein B, användning därav immunisering, diagnosmetod eller terapeutisk behandling av ischemiska kardiovaskulära sjukdomar, samt farmaceutisk komposition och vaccin innehållande sådan peptid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL217858B1 true PL217858B1 (pl) | 2014-08-29 |
Family
ID=26655437
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL385189A PL215401B1 (pl) | 2001-04-05 | 2002-04-05 | Fragment apolipoproteiny B lub jego miejsce aktywne, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna i szczepionka, zastosowanie tego fragmentu , szczepionka zawierajaca przeciwcialo przeciwko temu fragmentowi, sposób diagnozowania in vitro oraz zastosowanie tego przeciwciala |
| PL02367301A PL367301A1 (pl) | 2001-04-05 | 2002-04-05 | Terapia immunizacyjna w oparciu o peptydy do leczenia miażdżycy oraz test w oparciu o peptydy do określania odpowiedzi odpornościowej przeciwko utlenionym lipoproteinom o niskiej gęstości |
| PL400308A PL400308A1 (pl) | 2001-04-05 | 2002-04-05 | Terapia immunizacyjna w oparciu o peptydy do leczenia miazdzycy oraz w oparciu o peptydy do okreslania odpowiedzi odpornosci przeciwko utlenionym lipoproteinom o niskiej gestosci |
| PL391615A PL217858B1 (pl) | 2001-04-05 | 2002-04-05 | Fragment apolipoproteiny B lub jego miejsce aktywne, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i szczepionka, zastosowanie tego fragmentu, szczepionka zawierająca przeciwciało przeciwko temu fragmentowi, sposób diagnozowania in vitro oraz zastosowanie tego przeciwciała |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL385189A PL215401B1 (pl) | 2001-04-05 | 2002-04-05 | Fragment apolipoproteiny B lub jego miejsce aktywne, zawierajaca go kompozycja farmaceutyczna i szczepionka, zastosowanie tego fragmentu , szczepionka zawierajaca przeciwcialo przeciwko temu fragmentowi, sposób diagnozowania in vitro oraz zastosowanie tego przeciwciala |
| PL02367301A PL367301A1 (pl) | 2001-04-05 | 2002-04-05 | Terapia immunizacyjna w oparciu o peptydy do leczenia miażdżycy oraz test w oparciu o peptydy do określania odpowiedzi odpornościowej przeciwko utlenionym lipoproteinom o niskiej gęstości |
| PL400308A PL400308A1 (pl) | 2001-04-05 | 2002-04-05 | Terapia immunizacyjna w oparciu o peptydy do leczenia miazdzycy oraz w oparciu o peptydy do okreslania odpowiedzi odpornosci przeciwko utlenionym lipoproteinom o niskiej gestosci |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (42) | EP2289925A1 (pl) |
| JP (6) | JP2004529143A (pl) |
| CN (4) | CN101486766A (pl) |
| AT (2) | ATE510851T1 (pl) |
| AU (1) | AU2002246484B8 (pl) |
| BR (1) | BR0208685A (pl) |
| CA (3) | CA2827167A1 (pl) |
| CY (1) | CY1108817T1 (pl) |
| DE (1) | DE60230029D1 (pl) |
| DK (3) | DK2295464T3 (pl) |
| EE (2) | EE200300487A (pl) |
| ES (2) | ES2317999T3 (pl) |
| IL (4) | IL158285A0 (pl) |
| PL (4) | PL215401B1 (pl) |
| PT (1) | PT1383526E (pl) |
| RU (1) | RU2296582C2 (pl) |
| SE (1) | SE0103754L (pl) |
| WO (1) | WO2002080954A1 (pl) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030105003A1 (en) | 2001-04-05 | 2003-06-05 | Jan Nilsson | Peptide-based immunization therapy for treatment of atherosclerosis and development of peptide-based assay for determination of immune responses against oxidized low density lipoprotein |
| SE0103754L (sv) * | 2001-04-05 | 2002-10-06 | Forskarpatent I Syd Ab | Peptider från apolipoprotein B, användning därav immunisering, diagnosmetod eller terapeutisk behandling av ischemiska kardiovaskulära sjukdomar, samt farmaceutisk komposition och vaccin innehållande sådan peptid |
| IL161110A0 (en) | 2001-09-28 | 2004-08-31 | Esperion Therapeutics Inc | Prevention and treatment of restenosis by local admistration of drug |
| AU2003267905B2 (en) * | 2002-10-04 | 2009-02-05 | Biolnvent International Ab | Peptide-based passive immunization therapy for treatment of atherosclerosis |
| SE0302312D0 (sv) | 2002-10-04 | 2003-08-27 | Forskarpatent I Syd Ab | Peptide-based passive immunization therapy for treatment of atherosclerosis |
| SE0302422D0 (sv) | 2003-09-11 | 2003-09-11 | Forskarpatent I Syd Ab | Peptide-based immunization therapy for treatment of atherosclerosis |
| SE0400683D0 (sv) * | 2004-03-19 | 2004-03-19 | Forskarpatent I Syd Ab | Use of modified extracellular matrix proteins in diagnosis and treatment of a atherosclerosis |
| WO2005097206A2 (en) | 2004-04-06 | 2005-10-20 | Cedars-Sinai Medical Center | Prevention and treatment of vascular disease with recombinant adeno-associated virus vectors encoding apolipoprotein a-i and apolipoprotein a-i milano |
| CN1968965B (zh) | 2004-04-15 | 2015-12-16 | 阿瑟拉生物技术公司 | 磷酸胆碱偶联物和相应抗体 |
| EP1676602A1 (en) | 2005-01-04 | 2006-07-05 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Continuous administration of epitopes derived from protein present in atherosclerotic plaque for the treatment of atherosclerosis |
| GB0517878D0 (en) | 2005-09-02 | 2005-10-12 | Bioinvent Int Ab | Immunotherapeutic treatment |
| WO2008080030A2 (en) * | 2006-12-22 | 2008-07-03 | Abbott Laboratories | Cardiovascular autoimmune disease panel and methods of using same |
| WO2008104194A1 (en) * | 2007-02-28 | 2008-09-04 | Bioinvent International Ab | Oxidized ldl and antibodies thereto for the treatment of atheroscleroti c plaques |
| PE20090188A1 (es) | 2007-03-15 | 2009-03-20 | Novartis Ag | Compuestos heterociclicos como moduladores de la senda de hedgehog |
| EP2538222B1 (en) * | 2007-11-05 | 2021-08-25 | Nordic Bioscience A/S | Biochemical markers for CVD risk assessment |
| US20100041663A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-02-18 | Novartis Ag | Organic Compounds as Smo Inhibitors |
| WO2010018870A1 (ja) * | 2008-08-15 | 2010-02-18 | 藤倉化成株式会社 | 動脈硬化診断用ポリペプチドマーカー、及び該マーカー等を用いる動脈硬化の検出方法、並びに動脈硬化診断用キット |
| AU2010319323B2 (en) | 2009-11-14 | 2015-01-15 | Cardiovax, Llc | Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis |
| US8506964B2 (en) | 2010-02-05 | 2013-08-13 | Cardiovax, Llc | Fusion proteins and related compositions, methods and systems for treatment and/or prevention of atherosclerosis |
| WO2012024309A2 (en) | 2010-08-18 | 2012-02-23 | Cedars-Sinai Medical Center | Atherosclerosis inhibition via modulation of monocyte-macrophage phenotype using apo a-i milano gene transfer |
| WO2012065135A2 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | Cedars-Sinai Medical Center | Immunomodulatory compositions, methods and systems comprising immunogenic fragments of apob100 |
| AU2011325946A1 (en) | 2010-11-12 | 2013-05-30 | Cedars-Sinai Medical Center | Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of aneurysms |
| CA2817543A1 (en) * | 2010-11-12 | 2012-06-07 | Cedars-Sinai Medical Center | Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of hypertension |
| EP2741770A4 (en) | 2011-08-09 | 2014-12-31 | Athera Biotechnologies Ab | ANTIBODIES FOR BINDING TO PHOSPHORYLCHOLINE (PC) AND / OR PC CONJUGATE |
| AR087485A1 (es) | 2011-08-09 | 2014-03-26 | Athera Biotechnologies Ab | Anticuerpos de union a fosforilcolina (pc) y/o conjugados de pc |
| RU2495048C1 (ru) * | 2012-04-18 | 2013-10-10 | Андрей Валентинович Исаев | Пептид, обладающий антиатеросклеротическим действием и композиция для профилактики и лечения атеросклероза сосудов |
| US10087234B2 (en) | 2012-11-06 | 2018-10-02 | Les Hopitaux Universitaires De Geneve | Mimetic peptides |
| CN103520713B (zh) * | 2013-10-16 | 2015-10-28 | 西北农林科技大学 | 一种ApoB100酵母重组疫苗及其制备方法和应用 |
| CN103860470A (zh) * | 2014-03-05 | 2014-06-18 | 贵州中泰生物科技有限公司 | 一种口服高密度脂蛋白脂质体的制备方法 |
| CN105315364B (zh) * | 2014-06-17 | 2018-09-18 | 广州文瑞生物科技有限公司 | 胶原蛋白vi疫苗预防动脉粥样硬化 |
| WO2016187250A1 (en) * | 2015-05-19 | 2016-11-24 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Human apob100 epitopes, methods and uses for modulating inflammatory responses, and treating adverse cardiovascular events, disease and atherosclerosis |
| US10858422B2 (en) | 2016-05-31 | 2020-12-08 | Abcentra, Llc | Methods for treating systemic lupus erythematosus with an anti-apolipoprotein B antibody |
| CN108478817B (zh) * | 2018-03-16 | 2020-10-27 | 北京大学 | 一种动脉粥样硬化检测试剂及其制备方法 |
| CA3101767A1 (en) | 2018-05-29 | 2019-12-05 | Abcentra, Llc | Compositions and methods for treatment of psoriasis |
| CA3129373A1 (en) | 2018-05-29 | 2019-12-05 | Abcentra, Llc | Compositions and methods for treatment of rheumatoid arthritis and accelerated atherosclerosis |
Family Cites Families (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4970144A (en) | 1984-12-31 | 1990-11-13 | International Genetic Engineering | Peptide fragments of human apolipoprotein, type-specific antibodies and methods of use |
| US5972890A (en) | 1988-05-02 | 1999-10-26 | New England Deaconess Hospital Corporation | Synthetic peptides for arterial imaging |
| WO1993018067A1 (en) * | 1992-03-06 | 1993-09-16 | Abbott Laboratories | Immunocapture assay for direct quantitation of specific lipoprotein cholesterol levels |
| WO1994000592A1 (en) * | 1992-06-26 | 1994-01-06 | Exocell, Inc. | Monoclonal antibodies against glycated low density lipoprotein |
| EP0671926B1 (en) * | 1992-08-11 | 2002-11-13 | President And Fellows Of Harvard College | Immunomodulatory peptides |
| KR0185334B1 (ko) | 1995-11-02 | 1999-04-01 | 김은영 | 인간 혈장 아포지단백질 비-100에 결합하는 생쥐 항체를 암호하는 씨디엔에이 |
| GB9609702D0 (en) * | 1996-05-09 | 1996-07-10 | Royal Free Hosp School Med | Anticoagulant peptides |
| GB9620153D0 (en) * | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Univ Strathclyde | Non-naturally occurring lipoprotein particle |
| GB9705831D0 (en) * | 1997-03-20 | 1997-05-07 | Univ Leicester | Oxidised ldl |
| US6635623B1 (en) * | 1997-06-13 | 2003-10-21 | Baylor College Of Medicine | Lipoproteins as nucleic acid vectors |
| US6225070B1 (en) | 1997-08-07 | 2001-05-01 | The Regents Of The University Of California | Antibodies to oxidation-specific epitopes on lipoprotein and methods for their use in detecting, monitoring and inhibiting the growth of atheroma |
| US6156315A (en) * | 1997-10-10 | 2000-12-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting the binding of low density lipoprotein to blood vessel matrix |
| EP0911344B1 (en) * | 1997-10-15 | 2004-03-03 | Fujirebio Inc. | Anti-Apo-B-48 monoclonal antibody, hybridoma, and methods of use |
| EP1062512A4 (en) * | 1998-03-10 | 2001-12-12 | Univ California | METHODS AND TOOLS USED TO IDENTIFY COMPOUNDS THAT MODULATE ATHEROSCLEROSIS BY ALTERATION OF THE LDL-PROTEOGLYCANE BINDING |
| WO2000002920A1 (en) * | 1998-07-13 | 2000-01-20 | University Of Otago | Inhibition of lipoprotein formation |
| IL126447A (en) * | 1998-10-04 | 2004-09-27 | Vascular Biogenics Ltd | An immune preparation that confers tolerance in oral administration and its use in the prevention and / or treatment of atherosclerosis |
| ATE506615T1 (de) * | 1999-10-26 | 2011-05-15 | Univ California | Reagenzien und verfahren für diagnose, 'imaging' und behandlung von atherosklerotischen krankheiten |
| GB2373500B (en) * | 2000-02-04 | 2004-12-15 | Aeomica Inc | Methods and apparatus for predicting, confirming, and displaying functional information derived from genomic sequence |
| IL151355A0 (en) * | 2000-03-03 | 2003-04-10 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine for the treatment of artherosclerosis |
| SE0000855D0 (sv) * | 2000-03-15 | 2000-03-15 | Karolinska Innovations Ab | Antigenic composition useful as a vaccine against atherosclerosis |
| GB0017641D0 (en) * | 2000-07-18 | 2000-09-06 | Medigene Oy | Peptides and their use |
| EP1186299A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-13 | Universitair Medisch Centrum Utrecht | The diagnosis, prevention, and/or succesful treatment of atherosclerosis, infectious diseases, and disturbances in the immune system |
| AU2002243382A1 (en) * | 2000-10-25 | 2002-06-24 | Vincent Agnello | Method of inhibiting infection by HCV, other flaviviridae viruses, and any other virus that complexes to low density lipoprotein or to very low density lipoprotein in blood preventing viral entry into a cell |
| AU2002241603A1 (en) * | 2000-11-10 | 2002-06-03 | University Of Utah Research Foundation | Carrier system for specific artery wall gene delivery |
| SE0103754L (sv) * | 2001-04-05 | 2002-10-06 | Forskarpatent I Syd Ab | Peptider från apolipoprotein B, användning därav immunisering, diagnosmetod eller terapeutisk behandling av ischemiska kardiovaskulära sjukdomar, samt farmaceutisk komposition och vaccin innehållande sådan peptid |
| US7241861B2 (en) * | 2001-05-15 | 2007-07-10 | Japan Immunoresearch Laboratories Co., Ltd. | High density lipoprotein-reactive peptides |
| EP1469887A4 (en) * | 2001-07-20 | 2006-01-11 | Eidgenoess Tech Hochschule | COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE AS BIOACTIVE AGENTS OF SULFATED AND SULFONATED AMINO ACIDS |
-
2001
- 2001-11-09 SE SE0103754A patent/SE0103754L/xx not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-04-05 BR BR0208685-9A patent/BR0208685A/pt not_active Application Discontinuation
- 2002-04-05 EE EEP200300487A patent/EE200300487A/xx unknown
- 2002-04-05 RU RU2003132443/15A patent/RU2296582C2/ru active
- 2002-04-05 AT AT08151489T patent/ATE510851T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-04-05 EP EP10181167A patent/EP2289925A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10181196A patent/EP2289928A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP08158141A patent/EP2147928A3/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 PL PL385189A patent/PL215401B1/pl unknown
- 2002-04-05 EP EP10181203A patent/EP2289929A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 PL PL02367301A patent/PL367301A1/pl unknown
- 2002-04-05 EP EP10180026A patent/EP2295457A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 JP JP2002578993A patent/JP2004529143A/ja not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180091A patent/EP2305706A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10181273A patent/EP2289935A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 PL PL400308A patent/PL400308A1/pl unknown
- 2002-04-05 CA CA2827167A patent/CA2827167A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-05 EP EP10181217A patent/EP2289931A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180835A patent/EP2289922A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 CN CNA2009100095655A patent/CN101486766A/zh active Pending
- 2002-04-05 EP EP10181227A patent/EP2289932A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180099A patent/EP2295458A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10181173A patent/EP2289926A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP07119130A patent/EP1918300A3/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180826A patent/EP2289920A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 DK DK10181267.5T patent/DK2295464T3/en active
- 2002-04-05 EP EP10180156A patent/EP2295459A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10181213A patent/EP2289930A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10181267.5A patent/EP2295464B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 EP EP10181253.5A patent/EP2289934B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 EP EP08151489A patent/EP2006301B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 EP EP10180193A patent/EP2289917A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 DK DK02714667T patent/DK1383526T3/da active
- 2002-04-05 IL IL15828502A patent/IL158285A0/xx unknown
- 2002-04-05 EP EP10180172A patent/EP2289915A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180168A patent/EP2295461A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 ES ES02714667T patent/ES2317999T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 EP EP10180845A patent/EP2289924A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EE EEP200700052A patent/EE200700052A/xx unknown
- 2002-04-05 CN CN201210322795.9A patent/CN103122031B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 EP EP10180188A patent/EP2289916A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10181188A patent/EP2289927A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP08167531A patent/EP2147929A3/en not_active Ceased
- 2002-04-05 ES ES10181267.5T patent/ES2546293T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 AT AT02714667T patent/ATE415423T1/de active
- 2002-04-05 EP EP02714667A patent/EP1383526B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 PL PL391615A patent/PL217858B1/pl unknown
- 2002-04-05 CN CN028089405A patent/CN1505525B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-05 EP EP10181245A patent/EP2289933A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180115A patent/EP2305707A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10181263A patent/EP2295463A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180162.9A patent/EP2295460B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 DK DK08151489.5T patent/DK2006301T3/da active
- 2002-04-05 EP EP10180109A patent/EP2289913A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 DE DE60230029T patent/DE60230029D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 EP EP10180184A patent/EP2295462A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 PT PT02714667T patent/PT1383526E/pt unknown
- 2002-04-05 WO PCT/SE2002/000679 patent/WO2002080954A1/en active Application Filing
- 2002-04-05 EP EP10180106A patent/EP2289912A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180838A patent/EP2289923A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180176A patent/EP2305708A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 CA CA2606839A patent/CA2606839C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 AU AU2002246484A patent/AU2002246484B8/en not_active Expired
- 2002-04-05 EP EP10180199A patent/EP2289918A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 CN CN2007101953989A patent/CN101284874B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-05 EP EP08167533A patent/EP2147930A3/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP08167532A patent/EP2147680A3/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180828A patent/EP2289921A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180823A patent/EP2289919A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 EP EP10180111A patent/EP2289914A1/en not_active Withdrawn
- 2002-04-05 CA CA2443223A patent/CA2443223C/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-10-07 IL IL158285A patent/IL158285A/en active IP Right Grant
-
2007
- 2007-12-20 IL IL188286A patent/IL188286A0/en unknown
-
2008
- 2008-01-25 JP JP2008015545A patent/JP2008169215A/ja not_active Withdrawn
- 2008-11-18 IL IL195356A patent/IL195356A0/en unknown
-
2009
- 2009-02-24 CY CY20091100202T patent/CY1108817T1/el unknown
- 2009-06-02 JP JP2009133383A patent/JP5270456B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-10-26 JP JP2010239478A patent/JP5300820B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2010-10-26 JP JP2010239477A patent/JP5300819B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-02-25 JP JP2013034312A patent/JP5613890B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7544360B2 (en) | Peptide epitopes of apolipoprotein B | |
| EP1383526B1 (en) | Immunization therapy for treatment of atherosclerosis |