ES2546293T3 - Terapia de inmunización basada en péptidos para el tratamiento de aterosclerosis que fija ApoB como objetivo - Google Patents
Terapia de inmunización basada en péptidos para el tratamiento de aterosclerosis que fija ApoB como objetivo Download PDFInfo
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Abstract
El péptido KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH (SEQ ID Nº: 14), un epítopo contenido en el péptido, una forma oxidada del mismo o un derivado de aldehído o malon-dialdehído del mismo.
Description
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Los péptidos contra los que se detectaron los niveles más elevados de anticuerpos podrían ser divididos en seis grupos con características comunes (Tabla 1):
- (A)
- Altos niveles de anticuerpos IgG contra péptidos modificados con MDA (n = 3).
- (B)
- Altos niveles de anticuerpos IgM, pero sin diferencia entre los péptidos nativos y los modificados con MDA (n = 9).
- (C)
- Altos niveles de anticuerpos IgG, pero sin diferencia entre los péptidos nativos y los modificados con MDA (n = 2).
- (D)
- Altos niveles de anticuerpos IgG contra péptidos modificados con MDA y por lo menos el doble de anticuerpos en la agrupación de NHP, en comparación con la agrupación de AHP (n = 5).
- (E)
- Altos niveles de anticuerpos IgM contra péptidos modificados con MDA y por lo menos el doble de anticuerpos en la agrupación de NHP, en comparación con la agrupación de AHP (n = 11).
- (F)
- Altos niveles de anticuerpos IgG, pero sin diferencia entre péptidos intactos y modificados con MDA, pero al menos el doble de anticuerpos en la agrupación de AHP, en comparación con la agrupación de NHP (n = 7).
- (G)
- Ningún nivel de anticuerpos IgG o IgM.
Tabla 1
P 11. FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG P 25. PQCSTHILQWLKRVHANPLL P 74. VISIPRLQAEARSEILAHWS
P 40. KLVKEALKESQLPTVMDFRK P 68. LKFVTQAEGAKQTEATMTFK P 94. DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK P 99. KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ P 102. SLTSTSDLQSGIIKNTASLK P 103. TASLKYENYELTLKSDTNGK P 105. DMTFSKQNALLRSEYQADYE P 177. MKVKIIRTIDQMQNSELQWP
P 143. IALDDAKINFNEKLSQLQTY P 210. KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
P1. EEEMLENVSLVCPKDATRFK P 129. GSTSHHLVSRKSISAALEHK P 148. IENIDFNKSGSSTASWIQNV P 162. IREVTQRLNGEIQALELPQK
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P 252. EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE
P 301. HTFLIYITELLKKLQSTTVM P 30. LLDIANYLMEQIQDDCTGDE P 31. CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ P 32. GNMGQTMEQLTPELKSSILK P 33. SSILKCVQSTKPSLMIQKAA P 34. IQKAAIQALRKMEPKDKDQE P 100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ P 107. SLNSHGLELNADILGTDKIN P 149. WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ P 169. TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ P 236. EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
P 10. ALLVPPETEEAKQVLFLDTV P 45. IEIGLEGKGFEPTLEALFGK P 111. SGASMKLTTNGRFREHNAKF P 154. NLIGDFEVAEKINAFRAKVH P 199. GHSVLTAKGMALFGEGKAEF P 222. FKSSVITLNTNAELFNQSDI P 240. FPDLGQEVALNANTKNQKIR
G.
P 2. ATRFKHLRKYTYNYEAESSS
Todas estas 38 secuencias de péptidos representan dianas para reacciones inmunitarias que pueden ser de importancia para el desarrollo de la aterosclerosis y enfermedades cardiovasculares isquémicas. Estos péptidos pueden utilizarse, por lo tanto, para desarrollar ELISAs para determinar la asociación entre los niveles de anticuerpos contra secuencias definidas de aminoácidos modificados con MDA en la apolipoproteína B y el riesgo del desarrollo de la enfermedad cardiovascular.
Estos péptidos también representan posibles mediadores de la inmunidad protectora observada en animales experimentales inmunizados con LDL oxidada y pueden utilizarse para el ensayo de un desarrollo adicional de una terapia de inmunización o "vacuna" contra la aterosclerosis.
Por lo tanto, en la proteína apolipoproteína B humana se han identificado 38 secuencias diferentes que dan lugar a respuestas inmunitarias significativas en el hombre. Estos epítopos son susceptibles de representar lo que previamente se ha descrito como anticuerpos contra LDL oxidada. Dado que la mayoría de las respuestas inmunitarias están dirigidas contra secuencias de péptidos y la apolipoproteína B es la única proteína en LDL, el enfoque utilizado en este proyecto debería ser capaz de identificar los epítopos específicos para esencialmente todos los anticuerpos contra partículas de LDL oxidada. Se ha descrito que una familia de anticuerpos específicos para fosfolípidos que incluyen anticuerpos contra cardiolipina reacciona con LDL oxidada, pero la especificidad y el
40 papel de estos anticuerpos aún no se han caracterizado completamente.
En muchos casos, los títulos de anticuerpos eran mayores a polipéptidos modificados con MDA que para secuencias nativas. Si se detectaron anticuerpos contra una secuencia modificada con MDA esto se asociaba casi siempre con la presencia de anticuerpos contra la secuencia nativa. Una explicación probable de esto es que la respuesta
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Otra situación en la que una inmunización pasiva por inyección de anticuerpos purificados, o producidos de manera recombinante puede ser eficaz es la cardiopatía coronaria en individuos de edad. Estudios de los autores de la invención han demostrado que una disminución en anticuerpos contra secuencias de péptidos de apo B se produce al aumentar la edad en el hombre y se asocia con un aumento en el nivel en plasma de LDL oxidada (Nordin Fredrikson, Hedblad et al). Esto puede sugerir una senescencia de las células inmunes responsables de la producción de anticuerpos contra antígenos en las LDL oxidadas, y el resultado en un aclaramiento defectuoso de partículas LDL dañadas por oxidación de la circulación. Por consiguiente, estos sujetos se beneficiarían más de una inmunización pasiva mediante la inyección de anticuerpos purificados o producidos de forma recombinante que de una inmunización activa con secuencias de péptidos de apo B-100.
Péptidos nativos sintéticos (Euro-Diagnostica AB, Malmö, Suecia) utilizados en lo que sigue eran péptido 1, 2 y 301 del banco de polipéptidos rastreado inicialmente. Se encontró que el péptido 1 (secuencia de aminoácidos: EEEMLENVSLVCPKDATRFK, n = 10) y el péptido 301 (secuencia de aminoácidos: HTFLIYITELLKKLQSTTVM, n = 10) tienen una mayor respuesta de anticuerpos IgG o IgM a la forma modificada con MDA de péptido nativo, respectivamente, y ambos títulos son más altos en sujetos sanos. Estos péptidos se eligieron en base a la suposición de que la respuesta de anticuerpos a estos péptidos podría ser protectora contra la aterosclerosis. El péptido 2 (secuencia de aminoácidos: ATRFKHLRKYTYNYEAESSS, n = 10) no provocó respuesta de anticuerpos en el rastreo inicial de anticuerpos, por lo que se eligió como péptido control. Los ratones que recibieron alumbre sirvieron como control (n = 9).
Ratones apo E (-/ -) recibieron una inmunización primaria subcutánea a las 6-7 semanas de edad, seguida por un refuerzo intra-peritoneal 3 semanas más tarde. Los ratones fueron alimentados con dieta alta en colesterol desde el comienzo de la inmunización y continuó hasta su sacrificio a la edad de 25 semanas. En el momento del sacrificio, no hubo diferencia significativa en el peso corporal entre los 4 grupos de ratones. Tampoco hubo diferencia estadísticamente significativa en el colesterol sérico según se mide utilizando un kit comercialmente disponible (Sigma). Sus niveles medios de colesterol en suero eran todos por encima de 715 mg/dl.
El área de la aorta descendente cubierta por la placa aterosclerótica se midió en una preparación “en face” después de la tinción con aceite rojo O. En comparación con el grupo control, los ratones inmunizados con los péptidos Nº 2 y Nº 301 habían reducido sustancialmente la aterosclerosis. La inmunización con el Péptido Nº 1 no produjo una reducción significativa en la aterosclerosis en comparación con el control. En contraposición a la aorta descendente, la extensión de la aterosclerosis en la raíz aórtica y el arco aórtico no difirió entre los 4 grupos experimentales.
No hubo diferencias entre los 4 grupos en términos de tamaño de la placa del seno aórtico o de su contenido en lípidos (Tabla A). Tamaños de placa medios en los arcos aórticos de 4 grupos de ratones no eran diferentes. Sin embargo, la evaluación “en face” de tamaños de la placa descendente torácica y la aorta abdominal mediante tinción con aceite rojo O reveló que el grupo control y el grupo de Péptido Nº 1 tenían una cantidad similar de placa aterosclerótica en la aorta, mientras que los grupos de péptidos Nº 2 y Nº 301 tenían una carga aterosclerótica significativamente reducida en la aorta (Tabla A). La observación de que la inmunización de péptidos no afectó al seno aórtico o al tamaño del arco de la placa aórtica, pero una placa aórtica descendente reducida es intrigante y sugiere que la inmunización de péptidos podría reducir la formación de placa nueva, pero no afecta a la progresión de las placas.
Se sometió a ensayo, además, si la inmunización de péptidos modula el fenotipo de las placas ateroscleróticas. Secciones congeladas de placas de los senos aórticos fueron teñidas inmunohistoquímicamente con anticuerpos de monocitos/macrófagos (MOMA-2, Serotec). En concordancia con los resultados de una observación “en face”, el péptido Nº 2 redujo significativamente la infiltración de macrófagos en las placas. La tinción con tricromo reveló un contenido medio en colágeno de 40,0 ± 7,7% en las placas de los senos aórticos del grupo de péptido 2; mientras que un contenido medio de colágeno en el grupo control alumbre, el grupo de péptido 1 y péptido 301 eran 32,3 ± 5,3%, 35,6 ± 8,5% y 29,4 ± 9,6%, respectivamente.
Se determinó la respuesta de anticuerpos contra péptido inmunizado en cada uno de los grupos. El título de anticuerpos después de la inmunización aumentó 6,1 ± 3,1 veces en el grupo de péptido 1, 2,4 ± 1,0 veces en el grupo de péptido 2 y 1,8 ± 0,6 veces en el grupo de péptido 301; mientras que el grupo de alumbre tuvo un incremento de 3,9 ± 2,7 veces del título de anticuerpos contra el péptido 1, 2,0 ± 0,5 veces mayor contra el péptido 2 y 2,0 ± 0,9 veces mayor contra el péptido 301. Es sorprendente que el incremento paralelo del título de anticuerpos contra péptidos inmunizados tanto en el grupo inmunizado como en el tratado con alumbre. Esto puede significar las siguientes posibilidades: (1) mecanismo(s) que no sean la respuesta inmune humoral (tal como la respuesta inmune celular) pueden estar implicados en la modulación de la aterosclerosis; o (2) este incremento de anticuerpo fue una respuesta espectadora a la hipercolesterolemia con el tiempo.
Aunque no hay un mecanismo especulativo claro para explicar por qué la inmunización peptídica reducía la arterioesclerosis y/o modula el fenotipo de placa, la novedad de esta invención es el concepto de utilizar péptidos de LDL como inmunógeno y su factibilidad como una estrategia de inmunomodulación. Esta estrategia de inmunización basada en péptidos modula las placas ateroscleróticas. La inmunización utilizando oxLDL homóloga o LDL nativa como antígeno ha demostrado reducir el tamaño de la placa1-3, sin embargo, la disponibilidad, producción,
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tampón de conjugación se mezcló con 2 mg de soporte en 200 µl de agua desionizada. Esta mezcla se incubó después con 1 mg de reactivo de conjugación (EDC, 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida HCl) a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuación, esto se dializó frente a fosfato de sodio 0,083 M, disolución 0,9 M de cloruro de sodio pH 7,2 durante la noche a 4°C. El conjugado dializado se diluyó con tampón de purificación en mezcla seca Imject hasta un volumen final de 1,5 ml. Se utilizó alumbre como inmunoadyuvante y se mezcló con el conjugado de péptido en la dilución 1:1 en volumen. La cantidad de péptido en cada una de las inmunizaciones fue de 33 µg/100 µl por inyección.
Protocolo animal. Ratones apo E (-/ -) de Jackson Laboratories (Bar Harbor, Me) recibieron una inmunización primaria subcutánea a las 6-7 semanas de edad, seguido por un refuerzo intraperitoneal 3 semanas más tarde. Los ratones fueron alimentados con dieta alta en colesterol desde el comienzo de la inmunización y se continuó hasta el sacrificio a la edad de 25 semanas. Muestras de sangre se recogieron 2 semanas después del refuerzo y en el momento del sacrificio. Los ratones que recibieron alumbre sirvieron como control. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional del Cedars-Sinai Medical Center. Todos los ratones fueron alojados en una instalación para animales acreditada por la Asociación Americana de Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio y se mantienen en un ciclo día/noche de 12 horas y tenían acceso ilimitado a agua y alimentos.
En el momento del sacrificio, los ratones fueron anestesiados por inhalación de enflurano. El plasma se obtuvo por sangrado retro-orbital antes del sacrificio.
Recolección de tejido y seccionamiento. Para evaluar el efecto de la inmunización del péptido sobre la formación de la aterosclerosis, se evaluó el tamaño de la placa en el seno aórtico, arco aórtico y aorta torácica y abdominal descendente. Después de perfundir el corazón y el árbol aórtico con solución salina normal a presión fisiológica, el corazón y la aorta proximal fueron extirpados y embebidos en compuesto OCT (Tissue-Tek) y se seccionaron congelados. Se recogieron secciones de 6 µm de espesor en serie desde la aparición de al menos 2 válvulas aórticas a la desaparición de las valvas de la válvula aórtica para la evaluación de la placa del seno aórtico. Típicamente 3 secciones consecutivas se dispusieron en un portaobjetos y se recogió un total de 25-30 portaobjetos de un ratón y cada quinto portaobjetos se agrupó para la tinción. La aorta ascendente y los arcos aórticos hasta la arteria subclavia izquierda también se seccionaron y se procesan de manera similar. La aorta torácica y abdominal descendente se procesaron por separado para la evaluación “en face” de la formación de placa después de la tinción con aceite rojo O.
Preparación En face de la aorta torácica y abdominal descendente. Albúmina de huevo de pollo (Sigma) en una concentración de 0,8 g/ml de agua se mezcló en la relación 1:1 con glicerol. Se añadió azida de sodio para dar una concentración final de azida de sodio de 0,2%. Después de limpiar de tejido y grasa circundante la aorta torácica y abdominal descendente, el segmento de la aorta desde la arteria subclavia izquierda hasta el nivel de la arteria renal se retiró cuidadosamente a continuación para la fijación durante la noche en Histochoice (Amresco). La aorta fue luego abierta longitudinalmente con cuidado y se colocó con el portaobjeto luminal sobre un portaobjetos recién recubierto con solución de albúmina de huevo. Después de secarse la solución de albúmina, la aorta se tiñó con aceite rojo O para evaluar el grado de aterosclerosis con histomorfometría asistida por ordenador.
Inmunohistoquímica e Histomorfometría. Las secciones de los senos aórticos fueron teñidas inmunohistoquímicamente con anticuerpo MOMA-2 (Serotec) utilizando el protocolo estándar. La tinción con tricromo para evaluar el contenido de colágeno y la tinción con aceite rojo O para el tamaño de la placa y el contenido de lípidos se realizaron utilizando un protocolo de tinción estándar. Se realizó un análisis morfométrico asistido por ordenador para evaluar la histomorfometría según se ha descrito previamente.8
Medición del título de anticuerpos. Para medir la respuesta de anticuerpos después de la inmunización con péptido, se desarrolló un ELISA. El título de anticuerpos contra el péptido inmunizado se midió utilizando sangre recogida a las 2 semanas después del refuerzo y en el sacrificio. La respuesta de anticuerpos contra 3 péptidos también se determinó en el grupo de alumbre en los mismos instantes. En síntesis, péptidos sintéticos nativos diluidos en PBS pH 7,4 (20 µg/ml) fueron absorbidos a pocillos de placas de microtitulación (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) en una incubación durante la noche a 4°C. Después de lavar con PBS que contenía Tween-20 al 0,05% (PBS-T) las placas recubiertas se bloquearon con SuperBlock en TBS (Pierce) durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de una incubación de suero de ratón diluido en la relación 1/50 en TBS-Tween-20 al 0,05% (TBS-T) durante 2 h a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4°C. Después de aclarar, se detectó la deposición de anticuerpos dirigidos a los péptidos utilizando anticuerpos de conejo biotinilado anti-Ig de ratón (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) apropiadamente diluidos en TBS-T. Después de otra incubación durante 2 h a temperatura ambiente las placas se lavaron y los anticuerpos biotinilados unidos se detectaron mediante estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma) y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. El uso de un kit de sustrato de fosfatasa (Pierce) desarrolló la reacción de color y la absorbancia a 405 nm se midió después de 1 h de incubación a temperatura ambiente. Se calcularon los valores medios después de sustraer el fondo.
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Los sujetos del estudio, nacidos entre 1926 y 1945, pertenecen al cohorte del estudio de “Malmö Diet and Cancer (MDC)". Un 50% aleatorio de los que entraron en el estudio MDC entre noviembre de 1991 y febrero de 1994 fueron invitados a participar en un estudio sobre la epidemiología de la enfermedad de la arteria carótida. Se han reseñado rutinas para la comprobación de la información sobre morbilidad y mortalidad tras el examen de la salud, así como la definición de los factores de riesgo tradicionales.
Se identificaron ochenta y cinco casos de eventos cardiacos coronarios agudos, es decir, MI fatal o no fatal o muerte por enfermedad coronaria (CHD). Los participantes que tenían un historial de infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular (n = 6) no eran elegibles para el presente estudio. Para cada uno de los casos dos controles sin historial de infarto de miocardio o accidente cerebrovascular se emparejaron individualmente por edad, sexo, hábito de fumar, la presencia de hipertensión y mes de participación en el examen de rastreo y duración del seguimiento. Debido a razones de logística (no estaban disponibles muestras de sangre en cantidad suficiente para la evaluación de los péptidos) sólo control estaba disponible para siete casos y no hay controles para un caso. Este caso se excluyó del análisis. Así, la población de estudio consiste en 227 sujetos, 78 casos y 149 controles, de edades de 49-67 años (mediana 61) en la línea base.
Análisis de laboratorio
Después de ayunar durante la noche, se tomaron muestras de sangre para la determinación de los valores séricos de colesterol total, triglicéridos, colesterol HDL, colesterol LDL y glucosa en sangre entera. El colesterol LDL en mmol/L se calculó según la fórmula de Friedewald. La LDL oxidada se midió mediante ELISA (Mercordia).
Vasculografía por ultrasonidos en modo B
Se utilizó un sistema de tomografía computarizada Acuson 128 (Acuson, Mountain View, California) con un transductor MHz para la evaluación de las placas carotideas en la arteria carótida derecha tal como se describió previamente.
Desarrollo de ELISAs contra secuencias de péptidos de apo B-100
Se sintetizaron los 302 péptidos correspondientes a toda la secuencia de aminoácidos de la apolipoproteína B humana (Euro-Diagnostica AB, Malmö, Suecia y KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Dinamarca) y se utilizaron en un ELISA. Una fracción de cada uno de los péptidos sintéticos se modificó mediante MDA 0,5 M (Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suecia) durante 3 h a 37°C y en presencia de liposomas mediante MDA 0,5 M durante 3 h a 37°C o mediante CUCl2 5 mM (Sigma) durante 18 h a 37°C. Los péptidos modificados con MDA fueron dializados contra PBS que contenía EDTA 1 mM con varios cambios durante 18 h a 4°C. La modificación de los péptidos se ensayó en geles de poliacrilamida desnaturalizados (BioRad Laboratories, Hercules, CA), adecuados para la separación de péptidos.
Una mezcla de fosfatidilcolina de huevo (EPC) (Sigma) y fosfatidilserina (PS) (Sigma) en una solución de cloroformo a una relación molar de 9:1 y una concentración de 3 mM de fosfolípidos (PL) se evaporó en un recipiente de vidrio bajo una corriente de argón suave. El recipiente se colocó después bajo vacío durante 3 horas. Una disolución que contiene péptido 0,10 mM (5 ml) en tampón HEPES 10 mM pH 7,4, filtrado en condiciones estériles, NaCl 145 mM y azida de sodio al 0,003% se añadió a la película secada de EPC/PS y se incubó durante 15 min a 50°C. La mezcla fue suavemente sometida a un vórtice durante aproximadamente 5 min a temperatura ambiente y luego se colocó en un baño de agua enfriada con hielo y se trató con ultrasonidos con 7,5 micras de amplitud durante 3 x 3 min (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Medlab, Suecia) con interrupciones de 1 min. La mezcla de PL-péptido, nativa o modificada con MDA 0,5 M durante 3 h a 37°C o CuCl2 5 mM durante 18 h a 37°C, se almacenó bajo argón en viales de vidrio a 4°C envueltos en papel de aluminio y se utilizó en el espacio de 1 semana. La mezcla modificada con MDA fue dializada contra PBS que contenía EDTA 1 mM con varios cambios durante 18 h a 4°C antes de su almacenamiento. La modificación de la mezcla se sometió a ensayo en geles de poliacrilamida desnaturalizada (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, SE), adecuados para la separación de péptidos.
Péptidos sintéticos nativos o modificados diluidos en PBS pH 7,4 (20 leg/ml), en presencia o ausencia de liposomas, se absorbieron a pocillos de placas de microtitulación (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) en una incubación durante la noche a 4°C. Como referencia, uno de los péptidos (P6) se ejecutó en cada una de las placas. Después de lavar con PBS que contenía Tween-20 al 0,05% (PBS-T) las placas recubiertas se bloquearon con SuperBlock en TBS (Pierce, Rockford, IL) durante 5 min a temperatura ambiente, seguido de una incubación de plasma humano agrupado, AHP o NHP, diluido 1/100 en TBS-Tween-20 al 0,05% (TBS-T) durante 2 h a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4°C. Después de aclarar, la deposición de auto-anticuerpos dirigidos contra los péptidos se detectó mediante el uso de anticuerpos IgG o IgM anti-humanos de conejo biotinilados (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) apropiadamente diluidos en TBS-T. Después de otra incubación durante 2 h a temperatura ambiente, las placas se lavaron y los anticuerpos biotinilados unidos se detectaron mediante estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma) y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. La reacción de color se desarrolló utilizando el kit de sustrato de fosfatasa (Pierce) y la absorbancia a 405 nm se midió después de 1 h de incubación a temperatura ambiente. Los valores de absorbancia de los diferentes péptidos fueron divididos por el valor de absorbancia de P6 y se compararon.
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-
imagen1
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