BRPI0216049B1 - "terapia de imunização à base de peptídeo para tratamento de arteriosclerose" - Google Patents
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Abstract
terapia de inunizaçao à base de peptídio para tratanento de arteriosclerose e desenvolvimento de ensaio a base de peptídio para determinaçao de respostas inunes contra lipoproteina oxidada de baixa densidade. a presente invenção se refere a fragmentos de apoliproteina b, em particular a peptídios definidos dos mesmos, para imunização ou tratamento terapêutico de mamíferos, incluindo seres humanos, contra doenças cardiovasculares isquêmicas, assim como para diagnosticar a presença ou ausência de anticorpos correlacionados ao aumento ou redução de risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares isquêmicas, usando um ou mais dos peptídios em um ensaio elisa (enzyme linked iminuno sorbent assay).
Description
(54) Título: TERAPIA DE IMUNIZAÇÃO À BASE DE PEPTÍDEO PARA TRATAMENTO DE ARTERIOSCLEROSE (51) lnt.CI.: A61K 38/00 (30) Prioridade Unionista: 05/04/2001 SE 0101232-7, 09/11/2001 SE 0103754-8 (73) Titular(es): CARDIOVAX, LLC (72) Inventor(es): NILSSON, JAN; SHAH, PREDIMAN, K.
1/50
TERAPIA DE IMUNIZAÇÃO À BASE DE PEPTÍDIO PARA TRATAMENTO DE ARTERIOSCLEROSE
PEDIDO DIVIDIDO DE PIO2O8685-9 DE 05/04/2002
Campo Técnico [0001] A presente invenção se refere a novos peptídios, em particular, a peptídios a serem usados na terapia de imunização para o tratamento de arteriosclerose, e para desenvolvimento do ensaio ELISA à base de peptídio, para determinação de resposta imune contra lipoproteína oxidada de baixa densidade e diagnóstico da presença ou ausência de arteriosclerose.
[0002] Em particular, a invenção inclui:
1) Uso de quaisquer dos peptídios listados na Tabela 1, individualmente ou em combinação, nativos ou modificados por MDA, preferencialmente junto com um veículo adequado e um coadjuvante, como uma imunoterapia ou vacina anti-arteriosclerose, para prevenção e tratamento de doença cardiovascular isquêmica; e
2) Uso dos mesmos peptídios em ensaio ELISA para detecção de anticorpos correlacionado ao aumento ou diminuição do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares isquêmicas.
Fundamentos da Invenção [0003] A arteriosclerose é uma doença crônica que provoca um espessamento da camada mais interna (a íntima) de artérias de grande e médio tamanho. Essa doença diminui o fluxo de sangue e pode causar isquemia e destruição do tecido em órgãos supridos pelo vaso afetado. A arteriosclerose é a principal causa de doença cardiovascular, incluindo o infarto do miocárdio, derrame e doença arterial periférica. É a causa principal de morte no mundo ocidental, sendo
2/50 prevista de se tornar a principal causa de morte no mundo inteiro dentro de duas décadas.
[0004] A doença é iniciada pelo acúmulo de lipoproteínas, principalmente as lipoproteínas de baixa densidade (LDL) sigla em Inglês de: Low-Density Lipoprotein - na matriz extracelular do vaso. Essas partículas de LDL se agregam e se submetem à modificação oxidante. A LDL oxidada é tóxica e provoca danos vasculares. A arteriosclerose representa em muitos aspectos uma resposta a esses danos, incluindo inflamação e fibrose.
[0005] Em 1989, Palinski e colaboradores identificaram anticorpos de circulação contra a LDL oxidada em seres humanos. Essa observação sugeriu que a arteriosclerose pode ser uma doença autoimune, causada por reações imunes contra lipoproteínas oxidadas. No presente momento, diversos laboratórios iniciaram pesquisa de associação entre titulações de anticorpos contra LDL oxidada e doenças cardiovasculares. Entretanto, o panorama que emergiu desses estudos foi bastante obscuro. Os anticorpos existiram contra um grande número de diferentes epitopos na LDL oxidada, mas a estrutura desses epitopos foi desconhecida. O termo anticorpos de LDL oxidada, assim, se referiu a uma mistura desconhecida de diferentes anticorpos, ao invés de se referir a um anticorpo específico. Os anticorpos IgM independentes da célula T foram mais frequentes que os anticorpos IgG dependentes da célula T.
[0006] Anticorpos contra LDL oxidada estiveram presentes em pacientes com doenças cardiovasculares e em pacientes referidos como controles saudáveis. Embora algumas pesquisas anteriores tenham relatado associações entre titulações de anticorpo de LDL oxidada e doenças cardiovasculares, outras pesquisas foram incapazes de descobrir tais associações. Uma deficiência nessas pesquisas foi o fato de que os testes ELISA usados para determinar titulações de anticorpos usaram
3/50 partículas de LDL oxidada como ligando. A composição de LDL é diferente em indivíduos diferentes, o grau de modificação oxidante é difícil para o controle e exame e os níveis de anticorpos contra os diferentes epítopos nas partículas de LDL oxidadas pode não ser determinado. Em algum grau, devido a problemas técnicos, tem sido difícil avaliar o papel das respostas do anticorpo contra a LDL oxidada usando as técnicas disponíveis até então, mas, no entanto, não será possível se criar componentes bem definidos e reproduzíveis de uma vacina, se forem utilizadas partículas de LDL oxidadas intactas.
[0007] Outra maneira de se investigar a possibilidade de que as reações autoimunes contra a LDL oxidada na parede vascular desempenham um papel fundamental no desenvolvimento de arteriosclerose, é imunizar animais contra sua própria LDL oxidada. A idéia que fundamenta tal abordagem é que se reações autoimunes contra a LDL oxidada forem reforçadas usando técnicas clásssicas de imunização, isso irá resultar em aumento de inflamação vascular e progressão da arteriosclerose. Para testar essa hipótese, foram imunizados coelhos com uma homóloga LDL oxidada e depois a arteriosclerose foi induzida mediante alimentação dos animais com um regime de alto teor de colesterol durante 3 meses.
[0008] No entanto, ao contrário da hipótese original, a imunização com LDL oxidada apresentou um efeito protetor, reduzindo a arteriosclerose em cerca de 50%. Resultados similares foram também obtidos em uma pesquisa subseqüente, na qual o regime de alto teor de colesterol foi combinado com danos ao balão vascular, de modo a produzir um desenvolvimento de placa mais agressivo. Em paralelo com pesquisas dos presentes inventores, diversos outros laboratórios relataram observações similares. Quando tomados em conjunto os dados disponíveis claramente demonstram que
4/50 existem reações imunes que protegem contra o desenvolvimento da arteriosclerose e que as mesmas envolvem autoimunidade contra a LDL oxidada.
[0009] Essas observações também sugerem a possibilidade do desenvolvimento de terapia imune ou vacina para o doença cardiovascular baseada em tratamento de arteriosclerose em seres humanos. Uma abordagem para concretização disso seria imunizar um indivíduo com sua própria LDL após a mesma ter sido oxidada mediante exposição, por exemplo, a cobre. No entanto, essa abordagem é complicada pelo fato de que não se conhece qual a estrutura na LDL oxidada que é responsável para indução da imunidade protetora e se a LDL oxidada também pode conter epítopos que podem proporcionar o surgimento de reações imunes adversas.
[0010] A identificação dos epítopos na LDL oxidada é importante por diversos aspectos.
[0011] Em primeiro lugar, um ou diversos desses epítopos são provavelmente responsáveis pela ativação da resposta imune aterogênica observada em animais imunizados com LDL oxidada. Os peptídios contendo esses epítopos, podem, portanto, representar uma possibilidade para o desenvolvimento de uma terapia imune ou vacina de arteriosclerose em seres humanos. Além disso, tais peptídios podem ser usados para o tratamento terapêutico de arteriosclerose desenvolvida em seres humanos.
[0012] Em segundo lugar, os peptídios contendo os epítopos identificados podem ser usados para desenvolver ensaios de ELISA capazes de detectar anticorpos contra estrutura específica em LDL oxidada. Tais ensaios de ELISA seriam mais precisos e confiáveis que os ensaios atualmente disponíveis, usando partículas de LDL oxidada como antígeno. Isso também permitiría a análise de respostas imunes contra diferentes epítopos na LDL oxidada, associada com doenças
LDL oxidada associada
5/50 cardiovasculares.
[0013] A Patente U.S. No. 5.972.890 se refere ao uso de peptídios para diagnóstico de arteriosclerose. A técnica apresentada na dita patente, em princípio, é uma forma de diagnóstico radiofísico. Uma seqüência de peptídios é radioativamente rotulada e é injetada dentro da corrente sanguínea. Se essa seqüência de peptídio for idêntica às seqüências presentes na apoliproteína B, a mesma será ligada ao tecido, onde existem receptores presentes para a apoliproteína B. Nos vasos sanguíneos, isso representa, acima de tudo, uma placa arteriosclerótica. A concentração de radioatividade na parede do vaso pode então ser determinada, por exemplo, por meio de uma câmera gama. A técnica é assim um método de diagnóstico radiofísico, baseado naquelas seqüências de peptídios radioativamente rotuladas, que se ligarão aos seus receptores normais de tecidos presentes na placa arteriosclerótica e que serão detectados usando uma análise de radioatividade externa. É um método de análise direta para identificação de placa arteriosclerótica. Este método requer que o paciente receba compostos radiativos.
[0014] A técnica da presente invenção é baseada em diversos e diferentes princípios e métodos. De acordo com a reivindicação 1, a invenção se refere a fragmentos de apoliproteína B para imunização contra doenças cardiovasculares, assim como um método para diagnóstico de reações imuno contra seqüências de peptídios de apoliproteína B. Tais reações imuno, por sua vez, mostraram um grau de aumento em indivíduos tendo a arteriosclerose desenvolvida. A presente técnica é baseada na inclusão de seqüências de peptídios na base de poços de polímero. Quando uma amostra de sangue é adicionada aos peptídios, irá se ligar a anticorpos, que são específicos para essas seqüências. A quantidade de anticorpos ligada é depois
6/50 determinada usando um método e/ou técnica imunológica. Ao contrário das técnicas da dita Patente U.S., esta não é, portanto, uma técncia de determinação direta para identificação e localização da placa arteriosclerótica, porém, determina uma resposta imunológica, que mostra um alto grau de co-variação com a extensão da arteriosclerose. [0015] O princípio básico da presente invenção é, portanto, bastante diferente do princípio da mencionada Patente. O princípio desta última depende da ligação das seqüências de peptídios aos receptores normais das lipoproteínas presentes no tecido arteriosclerótico, enquanto o princípio da invenção é baseado na descoberta de reações imunes contra seqüências de peptídios e determinação de anticorpos para essas seqüências de peptídios.
[0016] Pesquisas publicadas (Palinski e outros, 1995; e George e outros, 1998) mostraram que a imunização contra a LDL oxidada reduz o desenvolvimento da arteriosclerose. Isso seria uma indicação de que as reações imuno contra a LDL oxidada, em geral, possuem um efeito protetor. Os resultados aqui fornecidos, entretanto, de forma surpreendente, mostraram que isso nem sempre acontece, por exemplo, uma imunização usando uma mistura de peptídios #10, 45, 154, 199 e 240 proporcionou o surgimento de um aumento de desenvolvimento de arteriosclerose. Os resultados são surpreendentes pelo fato de fundamentar que as reações imuno contra a LDL oxidada podem proteger contra o desenvolvimento de arteriosclerose, contribuir para o desenvolvimento da arteriosclerose e, absolutamente, sem qualquer efeito, depender de quais estruturas na LDL oxidada, as mesmas são dirigidos. Essas descobertas tornam possível o desenvolvimento de métodos de imunização, que isolam a ativação de reações imuno protetoras. Além disso, elas mostram que a imunização usando LDL oxidada intacta poderia apresentar um efeito prejudicial se as partículas utilizadas
7/50 contivessem um alto nível de estruturas que proporcionasse o surgimento de reações imuno aterogênicas.
[0017] O documento de patente WO 99/08109 se refere ao uso de um painel de anticorpos monoclonais de camundongo, que se ligam a partículas de LDL oxidada a fim de determinar a presença de LDL oxidada no soro e plasma. Isso, portanto, é totalmente diferente da presente invenção, em que é divulgado um método para determinação de anticorpos contra LDL oxidada.
[0018] A Patente U.S. No. 4.970.144 se refere a um método para preparação de anticorpos por meio de imunização, usando seqüências de peptídios, cujos anticorpos podem ser usados para a determinação de apoliproteínas, mediante uso de ensaio ELISA. Isso, portanto, é algo bastante diferente da presente invenção.
[0019] A Patente U.S. No. 5.861.276 descreve um anticorpo recombinante para a forma normal de apoliproteína B. Esse anticorpo é usado para determinar a presença da apoliproteína normal B no plasma e soro e para tratamento da arteriosclerose mediante redução da quantidade de partículas da LDL normal na circulação sangüínea.
[0020] Portanto, é descrito na presente invenção, o uso de anticorpos para o tratamento de arteriosclerose. No entanto, ao contrário da Patente U.S. No. 5.861.276, esses anticorpos são dirigidos a estruturas presentes nas partículas da LDL oxidada e não nas partículas normais da LDL. A vantagem é que é a LDL oxidada que é suposta de proporcionar o surgimento do desenvolvimento de arteriosclerose. O uso de anticorpos dirigido a estruturas que são específicas à LDL oxidada não é descrito nessa mencionada Patente.
Sumário da Invenção [0021] A oxidação de lipoproteínas, principalmente da LDL na parede arterial, é acreditada como sendo um importante fator
8/50 no desenvolvimento da arteriosclerose. Os produtos gerados durante a oxidação da LDL são tóxicos às células vasculares, provocam inflamação e iniciam a formação de placa. Os epítopos na LDL oxidada são reconhecidos pelo sistema imune e proporcionam o surgimento da formação de anticorpos. Os experimentos com animais têm mostrado que algumas dessas respostas imunes apresentam um efeito protetor contra a arteriosclerose. Os anticorpos são geralmente e quase que exclusivamente dirigidos contra estruturas baseadas em peptídios. Usando uma biblioteca de polipetídio que cobre a completa seqüência da única proteína presente na LDL, a apoliproteína B, os epítopos foram identificados na LDL oxidada, o que proporcionou o surgimento da formação de anticorpos em seres humanos. Esses peptídios-epítopos podem ser usados para o desenvolvimento de ensaios ELISA, para pesquisar associações entre respostas imunes contra a LDL oxidada e doenças cardiovasculares e para o desenvolvimento de uma imunoterapia ou vacina anti-arteriosclerose, para prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares isquêmicas.
Descrição Detalhada da Invenção [0022] Uma caracterização molecular de epítopos na LDL oxidada foi realizada, proporcionando o surgimento de respostas imunes dependentes de anticorpos em seres humanos. A abordagem usada tira vantagem do fato de que as reações imunes quase que exclusivamente são dirigidas contra seqüências de peptídio de 5-6 aminoácidos de extensão. A LDL contém apenas uma proteína, a apoliproteína B, de 4563 aminoácidos de extensão. Durante a oxidação, a apoliproteína B é fragmentada e adutos de aldeídos são acoplados a aminoácidos carregados positivamente, em particular, a lisina. Isso significa que as seqüências de peptídios não normalmente expostas devido à estrutura tridimensional da
9/50 apoliproteína B, tornam possível imunizar as células e/ou que as seqüências de peptídios normalmente expostas se tornam imunogênicas devido à haptenização com aldeídos.
[0023] Dessa forma, foi determinado que os seguintes peptídios, nativos ou derivados de MDA, apresentam eficiência como produtores de respostas imunes. Tais peptídios são:
| SEQ | ID | NO: | 1 | FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG |
| SEQ | ID | NO: | 2 | PQCSTHILQWLKRVHANPLL |
| SEQ | ID | NO: | 3 | VISIPRLQAEARSEILAHWS |
| SEQ | ID | NO: | 4 | KLVKEALKESQLPTVMDFRK |
| SEQ | ID | NO: | 5 | LKFVTQAEGAKQTEATMTFK |
| SEQ | ID | NO: | 6 | DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK |
| SEQ | ID | NO: | 7 | KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE |
| SEQ | ID | NO: | 8 | RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ |
| SEQ | ID | NO: | 9 | SLTSTSDLQSGIIKNTASLK |
| SEQ | ID | NO: | 10 | TASLKYENYELTLKSDTNGK |
| SEQ | ID | NO: | 11 | DMTFSKQNALLRSEYQADYE |
| SEQ | ID | NO: | 12 | MKVKIIRTIDQMQNS E LQWP |
| SEQ | ID | NO: | 13 | IALDDAKINFNEKLSQLQTY |
| SEQ | ID | NO: | 14 | KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH |
| SEQ | ID | NO: | 15 | EEEMLENVSLVCPKDATRFK |
| SEQ | ID | NO: | 16 | GSTSHHLVSRKSISAALEHK |
| SEQ | ID | NO: | 17 | IENIDFNKSGSSTASWIQNV |
| SEQ | ID | NO: | 18 | IREVTQRLNGEIQALELPQK |
| SEQ | ID | NO: | 19 | EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE |
| SEQ | ID | NO: | 20 | HTFLIYITELLKKLQSTTVM |
| SEQ | ID | NO: | 21 | LLDIANYLMEQIQDDCTGDE |
| SEQ | ID | NO: | 22 | CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ |
| SEQ | ID | NO: | 23 | GNMGQTMEQLT PELKS SILK |
| SEQ | ID | NO: | 24 | SSILKCVQSTKPSLMIQKAA |
| SEQ | ID | NO: | 25 | IQKAAIQALRKMEPKDKDQE |
| SEQ | ID | NO: | 26 | RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ |
| SEQ | ID | NO: | 27 | SLNSHGLELNADILGTDKIN |
10/50
| SEQ | ID | NO: | 28 |
| SEQ | ID | NO: | 29 |
| SEQ | ID | NO: | 30 |
| SEQ | ID | NO: | 31 |
| SEQ | ID | NO: | 32 |
| SEQ | ID | NO: | 33 |
| SEQ | ID | NO: | 34 |
| SEQ | ID | NO: | 35 |
| SEQ | ID | NO: | 36 |
| SEQ | ID | NO: | 37 |
| peptídio não | |||
| SEQ | ID | NO: | 38 |
WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ
ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
SGASMKLTTNGRFREHNAKF
NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
FKSSVITLNTNAELFNQSDI
FPDLGQEVALNANTKNQKIR, assim como o ío produtor de anticorpo
ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS ou um sítio ativo de um ou mais desses peptídios.
Materiais e Métodos [0024] Para determinar quais partes da apoliproteína B se tornam imunogênicas como resultado da oxidação da LDL, foi produzida uma biblioteca de polipetídios consistindo de peptídios de 20 aminoácidos de extensão, cobrindo a completa seqüência de apoliproteína B humana. Os peptídios foram usados com uma sobreposição de 5 aminoácidos para cobrir todas as seqüências nos pontos de quebra. Os peptídios foram usados em seu estado nativo ou após incorporação nos lipossomos de fosfolipídios, após oxidação mediante exposição a cobre ou após modificação por malono-dealdeído (em Inglês: MDA: malone dealdhyde), para se assemelhar a diferentes modificações dos aminoácidos que podem ocorrer durante a oxidação da LDL.
Peptídios [0025] Os 302 peptídios correspondentes à inteira seqüência de aminoácido da apoliproteína B humana foram sintetizados (Euro-Diagnostica AB, Malmõ, Suécia e KJ Ross Petersen AS, Horsholm, Dinamarca) e usados no ensaio ELISA. Uma fração de cada peptídio sintético foi modificada por MDA 0,5M (Sigma11/50
Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suécia) durante 3 horas a uma temperatura de 37°C, e na presença de lipossomos por MDA 0,5M, durante 3 horas à temperatura de 37°C ou por CuCl2 5μΜ (Sigma), durante 18 horas sob temperatura de 37°C. Os peptídios modificados por MDA foram dializados contra PBS contendo EDTA lmM, com diversas modificações para 18 horas à temperatura de 4°C. A modificação dos peptídios foi testada em géis de poliacrilamida desnaturada (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), adequados para separação dos peptídios. Os peptídios foram numerados de 1-302 na extremidade do terminal de N da proteína.
[0026] Outros aldeídos podem ser usados para preparação dos derivados, tais como, hidróxinonenal e outros.
Lipossomos [0027] Uma mistura de fosfatidilcolina de ovo (EPC) (Sigma) e fosfatidilserina (PS) (Sigma) em uma clorofórmio, com uma proporção molar de concentração de fosfolipídio 3mM (PL) foi evaporada em um recipiente de vidro sob uma corrente suave de argônio. O recipiente foi depois colocado sob vácuo durante 3 horas. Uma solução contendo peptidio 0,10 mM (5 ml) em um tampão de HEPES 10 mM filtrado e estéril, com pH de 7,4, NaCl 145 mM e 0,003% de azida de sódio, foi adicionada ao filme seco de EPC/PS e incubada durante 15 minutos a uma temperatura de 50°C. A mistura foi suavemente agitada durante cerca de 5 minutos à temperatura ambiente e depois colocada em um banho de água resfriado em gelo e sonicada com 7,5 microns de amplitude por 3 vezes durante 3 minutos (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Mediab, Suécia), com interrupções de 1 minuto. A mistura de PL-peptídio, nativa ou modificada por MDA 0,5mM durante 3 horas à temperatura de 37°C, ou por CuCl2 5mM durante 18 horas à temperatura de 37°C, foi armazenada sob atmosfera de argônio em frascos de vidro sob a temperatura solução de 9:1 e uma
12/50 de 4°C, embrulhados em folha de alumínio e usadas dentro de semana. A mistura modificada por MDA foi dializada contra PBS contendo EDTA lmM, com diversas modificações durante 18 horas à temperatura de 4°C, antes do armazenamento. A modificação da mistura foi testada em géis de poliacrilamida desnaturada (Bio-Rad Laboratories AB, Sundbyberg, Suécia) , adequados para separação dos peptídios.
Amostras de Plasma [0028] Amostras de plasma de 10 pacientes com doença cardiovascular (AHP) e 50 amostras de plasma, 25 de mulheres e 25 de homens, de doadores de sangue normais (NHP) foram coletadas e agrupadas. Os dois grupos foram separados em frações e armazenados à temperatura de -80°C.
Ensaio ELISA [0029] Peptídios nativos ou sintéticos modificados, diluídos em PBS, pH de 7,4 (20 gg/ml) , na presença ou ausência de lipossomos, foram absorvidos em poços de placa de microtitulação (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) em um procedimento de incubação durante a noite, sob temperatura de 4°C. Como referência, um dos peptídios (P6) foi processado em cada placa. Após lavagem com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T), as placas revestidas foram bloqueadas com SuperBlock em TBS (Pierce, Rockford, IL) , durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de incubação do plasma humano agrupado, AHP ou NHP, diluído na proporção de 1/100 em TBS/0,05% de Tween-20 (TBS/T), durante horas à temperatura ambiente e depois durante a noite à temperatura de 4°C. Após lavagem, foi detectada a deposição de auto-anticorpos dirigida aos peptídios, mediante uso de anticorpos de IgG ou IgM anti-humanos de coelho biotinilados (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca), apropriadamente diluídos em TBS-T. Após outro procedimento de incubação por 2 horas à temperatura ambiente, as placas foram lavadas e os
13/50 anticorpos biotinilados ligados foram detectados por estreptavidina conjugada a fosfatase alcalina (Sigma), e incubados por 2 horas à temperatura ambiente. A reação colorida foi desenvolvida mediante uso de um kit de substrato de fosfatase (Pierce) e a absorvência em 405 nm foi medida após 1 hora de incubação à temperatura ambiente. Os valores de absorvência dos diferentes peptídios foram divididos pelo valor de absorvência de (P6) e comparados. [0030] As seqüências na apoliproteína B que foram reconhecidas pelos anticorpos no plasma humano são mostradas como SEQ. ID 1-37 no desenho anexo. As amostras nãosaudáveis (AHP) e a amostras saudáveis (NHP)continham anticorpos em um grande número de diferentes peptídios. Os peptídios anticorpos contra os peptídios nativos e modificados foram identificados. Geralmente, os títulos de anticorpo para os peptídios modificados por MDA foram superiores ou iguais àqueles do correspondente peptídio nativo. A comparação entre peptídio nativo, peptídio modificado por MDA e peptídio oxidado por cobre mostrou um alto grau de correlação e que os títulos de anticorpo mais altos foram detectados usando peptídios modificados por MDA. O uso de peptídios incorporados dentro dos lipossomos não resultou em aumento dos níveis de anticorpo. Os anticorpos da subclasse IgM foram mais comuns que os anticorpos do subtipo IgG.
[0031] Os peptídios contra os quais os níveis de anticorpo mais altos foram detectados puderam ser divididos em seis grupos com características comuns (Tabela 1):
(A) Altos níveis de anticorpos IgG para os peptídios modificados por MDA (n = 3);
(B) Altos níveis de anticorpos IgM, mas nenhuma diferença entre os peptídios nativos e peptídios modificados por MDA (n = 9) ;
(C) Altos níveis de anticorpos IgG, mas nenhuma
14/50 [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] diferença entre os peptídios nativos e os peptídios modificados por MDA (n = 2);
(D) Altos níveis de anticorpos IgG para os peptídios modificados por MDA e pelo menos duas vezes mais anticorpos no grupo de NHP, quando comparado ao grupo de AHP (n = 5);
(E) Altos níveis de anticorpos IgM para os peptídios modificados por MDA e pelo menos duas vezes mais anticorpos no grupo de NHP, quando comparado ao grupo de AHP (n = 11);
(F) Altos níveis de anticorpos IgG, mas nenhuma diferença entre os peptídios intactos e peptídios modificados por MDA, mas, pelo menos, duas vezes mais anticorpos no grupo de AHP, quando comparado ao grupo de NHP (n = 7);
(G) Nenhum nível de anticorpos IgG ou IgM.
Tabela 1 (A) Alto IgG, diferença por MDA
Pll. FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG
P25.PQCSTHILQWLKRVHANPLL
P74. VISIPRLQAEARSEILAHWS (B) Alto IgM, nenhuma diferença por MDA P40. KLVKEALKESQLPTVMDFRK
P68. LKFVTQAEGAKQTEATMTFK
P94. DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK
P99. KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE
P100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
P102. SLTSTSDLQSGIIKNTASLK
P103. TASLKYENYELTLKSDTNGK
P105. DMTFSKQNALLRSEYQADYE
P177. MKVKIIRTIDQMQNSELQWP (C) Alto IgG, nenhuma diferença por MDA PI4 3. IALDDAKINFNEKLSQLQTY
P210.KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH
15/50 [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] (D) NHS/AHP, IgG-ak > 2, diferença por MDA
PI. EEEMLENVSLVCPKDATRFK
P129. GSTSHHLVSRKSISAALEHK
P148. IENIDFNKSGSSTASWIQNV
PI62. IREVTQRLNGEIQALELPQK
P252. EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE (E) NHS/AHP, IgM-ak > 2, diferença por MDA
P301. HTFLIYITELLKKLQSTTVM
P30. LLDIANYLMEQIQDDCTGDE
P31. CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ
P32. GNMGQTMEQLTPELKSSILK
P33. SSILKCVQSTKPSLMIQKAA
P34. I QKAAI QALRKME PKDKDQE
P100. RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ
P107. SLNSHGLELNADILGTDKIN
P149. WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ
P169. TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ
P2 3 6. EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ (F) NHS/AHP, IgG-ak < 0,5, nenhuma diferença por MDA
P10. ALLVPPETEEAKQVLFLDTV
P45. IEIGLEGKGFEPTLEALFGK
Plll. SGASMKLTTNGRFREHNAKF
P154. NLIGDFEVAEKINAFRAKVH
PI9 9. GHSVLTAKGMALFGEGKAEF
P222. FKSSVITLNTNAELFNQSDI
P2 4 0. FPDLGQEVALNANTKNQKIR (G)
P2. ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS [0078] Todas essas 38 seqüências de peptídios representam alvos para reações imunes que podem ser de importância para o desenvolvimento de arteriosclerose e doenças cardiovasculares isquêmicas. Esses peptídios podem, portanto, ser usados para desenvolvimento de ensaio ELISA, para determinar as associações entre os níveis de anticorpos
16/50 contra seqüências definidas de aminoácidos modificados por MDA na apoliproteína B e o risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares.
[0079] Esses peptídios também representam possíveis mediadores da imunidade protetora observada em animais experimentais imunizados com LDL oxidada e podem ser usados para teste em posterior desenvolvimento de uma terapia de imunização ou vacina contra arteriosclerose.
[0080] Assim, 38 diferentes seqüências na apoliproteína B humana foram identificadas, o que proporcionou o surgimento de significativas respostas imunes no ser humano. Esses epítopos provavelmente devem representar o que previamente foi descrito como anticorpos para a LDL oxidada. Uma vez que a maioria das respostas imunes são dirigidas contra seqüências de peptídios, e a apoliproteína B é a única proteína na LDL, a abordagem usada nesse projeto deve ser capaz de identificar os epítopos específicos para essencialmente todos os anticorpos contra as partículas de LDL oxidadas. Uma família de anticorpos específicos de fosfolipídios, incluindo os anticorpos contra a cardiolipina, foi descrita para reagir com a LDL oxidada, mas a especificidade e o papel desses anticorpos permanece como sendo totalmente caracterizados.
[0081] Em muitos casos, os títulos de anticorpos foram superiores para os polipeptídios modificados por MDA do que para as seqüências de nativos. Se foram detectados anticorpos contra uma seqüência modificada por MDA, isso foi quase sempreassociado com a presença d eanticorpos contra a seqüência nativa. Uma explanação provável para isso é que a resposta imune contra uma seqüência de aminoácidos modificada por MDA na apoliproteína B (a modificação por MDA ocorrendo como resultado da oxidação da LDL) leva a uma quebra de tolerância contra a seqüência nativa. Para outras seqüências, não ocorreu diferença nos títulos dos anticorpos
17/50 contra as seqüências nativas modificadas por MDA. Isso poderia sugerir que as reações imunes são dirigidas contra as seqüências nativas. Não deveria ocorrer nenhuma resposta imune contra seqüências de aminoácidos em proteína normalmente exposta ao sistema imune. Na partícula de LDL nativa, grandes partes de apoliproteína B são escondidas na camada de fosfolipídio da LDL e, portanto, nâo sâo acessíveis para o sistema imune. Durante a oxidação da LDL, a cadeia de aminoácido da apoliproteína B é fragmentada, proporcionando mudanças na estrutura tridimensional·. Isso provavelmente leva à exposição de seqüências de peptídios normalmente não acessíveis para o sistema imune e à geração de anticorpos contra essas seqüências, o que pode explicar a presença de anticorpos contra as seqüências de apoliproteína B nativa observadas. Alternativamente, a verdadeira resposta imune é contra as seqüências modificadas por MDA, mas, a reatividade cruzada com as seqüências nativas ê tão grande que nenhuma diferença na ligação pode ser demonstrada.
[0082] Tabela 2 [0083] Associações entre anticorpos para diferentes peptídios e arteriosclerose na artéria carótida, examinada como espessura média da íntima em 78 sujeitos (26 sujeitos desenvolveram posteriormente infarto do miocárdio, 26 funcionaram como controles saudáveis e 26 como indivíduos sem doenças mas de alto risco)
| Peptídio | IgG | IgM | ||
| Nativo | Modificado por MDA | Nativo | Modificado por MDA | |
| 301 | + | |||
| 10 | + | + | ||
| 11 | ++ | + | ||
| 25 | + | + | ++ | +++ |
| 30 | t · |
18/50
| 31 | ++ | ft(cinza) | ||
| 32 | ++(cinza) | |||
| 33 | + | |||
| 34 | +· | |||
| 45 | ++ | ++ | +++ | |
| 74 | ++ | + | + | ++ |
| 99 | ||||
| 100 | + | ++ | ||
| 102 | ++(cinza) | |||
| 103 | + | |||
| 105 | ||||
| 129 | ++ | +++ | ||
| 143 | + | + | ++ | + |
| 148 | +· | |||
| 154 | +++ | ++ | ||
| 162 | + | ++ | ||
| 199 | ||||
| 210 | + | |||
| 240 | ++ | ++(cinza) | ||
| Obs: +, r>0,2<0,3, p=<0,05; ++, r>0,3<0,4, p=0,0l; +++, r>Ü2 | ·, p=<0,001, cinza - níveis |
de anticorpo de peptídio significativamente aumentados no grupo que sofre de infarto de miocárdio, [0084] A possibilidade de que os ensaios ELISA baseados nesses peptídios (nativos ou modificados por MDA) possam ser usados para determinar associações entre reação imune contra epítopos definidos na LDL oxidada e a presença e/ou risco de desenvolvimento de doença cardiovascular, foi investigada em uma pesquisa piloto. A pesquisa foi realizada em sujeitos participantes da pesquisa do Malmõ Diet Câncer, que pesquisou uma população baseada em mais de 30.000 indivíduos, que foram recrutados entre 1989 e 1993. Os níveis de anticorpos contra 24 dos 38 peptídios listados na Tabela 1 foi determinado em amostras de plasma de linha de
19/50 base de 26 sujeitos que desenvolveram um infarto de miocárdio agudo durante o período de acompanhamento e 26 sujeitos saudáveis, nivelados por idade, sexo e uso de tabaco. Um grupo adicional de 26 sujeitos, nivelados por idade, sexo e uso de tabaco, mas todos com níveis de colesterol LDL acima de 5,0 mmol/L foi também incluído para pesquisar níveis de anticorpos em um grupo de alto risco que não tinha desenvolvido doença cardiovascular.
[0085] Para 19 dos 24 peptidios analisados, foram identificadas significantes correlações entre níveis do anticorpo IgM contra peptidios modificados por MDA e a gravidade da arteriosclerose na artéria carótida (espessura média da íntima) conforme exame feito por meio de pesquisa ultra-som da artéria carótida comum, isto é, quanto mais altos são os níveis de anticorpo, maior será o nível de arteriosclerose (Tabela 2). Para muitos desses peptidios também existiram significativas correlações entre níveis de anticorpo para os peptidios nativos e espessura média da íntima da carótida. Apenas 4 peptidios mostraram uma significativa correlação entre os anticorpos IgG e a espessura média da íntima da carótida. Essas observações sugerem que o ensaio de ELISA usando esses peptidios modificados por MDA (individualmente ou em combinação) podem ser usadas para identificar sujeitos com arteriosclerose aumentada.
[0086] Quatro dos peptidios testados não foram apenas associados com a presença aumentada de arteriosclerose mas também foram significativamente elevados no grupo de sujeitos que posteriormente sofreram de infarto do miocárdio (Tabela 2). Os dados para um desses peptidios (peptídio 240) são mostrados na figura 7. Essas observações também demonstram que o ensaio ELISA baseado no peptídio pode também ser usado para identificar sujeitos com um aumentado risco de desenvolver infarto do miocárdio.
20/50 [0087] Ocorreram também significativos aumentos nos níveis de anticorpo IgG para os peptídios nativos 103, 162 e 199, assim como para o peptídio 102 modificado por MDA no grupo gue posteriormente sofreu de infarto do miocárdio. No entanto, os anticorpos IgG contra esses peptídios não foram significativamente associados com a presença de arteriosclerose na artéria carótida.
[0088] Uma observação particularmente interessante foi feita com anticorpos contra o peptídio 210 modificado por MDA, para o gual ocorreram níveis significativamente superiores de anticorpos IgM nos controles saudáveis e no grupo de alto risco (colesterol de LDL acima de 5,0 mmol/L) do gue em relação ao grupo gue desenvolveu infarto do miocárdio. Consegüentemente, os anticorpos contra o peptídio 210 modificado por MDA podem representar um marcador para os indivíduos, com um reduzido risco de desenvolvimento de doença cardiovascular.
[0089] Foi agora demonstrado gue a imunização com as següências do peptídio apo B-100 nativo e modificado por MDA resultam numa inibição da arteriosclerose em animais experimentais (Nordin Fredrikson, Sóderberg e outros). O mecanismo através do gual essas respostas imunes ateroprotetoras operam, permanece para ser totalmente elucidado. No entanto, uma provável possibilidade é gue o efeito ateroprotetor é mediado por anticorpos gerados contra essas següências de peptídios. Esses anticorpos poderiam, por exemplo, facilitar a remoção de partículas de LDL danificadas por oxidação, por meio de receptores macrófagos Fc.
[0090] Os receptores següestradores de macrófago apenas reconhecem a LDL com danos oxidantes extensivos (9). Recentes pesquisas identificaram a existência de LDL oxidada circulante (10, 11). Essas partículas apresentam apenas um mínimo de danos oxidantes e não são reconhecidas pelos
21/50 receptores sequestradores. A ligação dos anticorpos a essas partículas de LDL oxidada circulante pode ajudar a remover as mesmas da circulação antes de se acumularem no tecido vascular (12).
[0091] Diversas pesquisas têm suportado uma função para os anticorpos na proteção contra a arteriosclerose. A reconstituição da célula B inibe o desenvolvimento da arteriosclerose em camundongos isentos de apo E que sofreram a retirada do baço (esplenectomizados) (13), assim como a formação da neo-íntima após danos ocorridos na carótida em camundongos RAG-1 (observações não-publicadas do laboratório dos presentes inventores). Além disso, foi mostrado que repetidas injeções de imunoglobulina reduz a arteriosclerose em camundongos isentos de apo E (6).
[0092] Conforme discutido acima, os anticorpos contra as seqüências de peptídios modificados por MDA na apo B-100 podem ser gerados através de imunização ativa usando peptídios sintéticos. Esse procedimento requer de 2-3 semanas antes de ser obtido um total efeito sobre a produção do anticorpo.
[0093] Em algumas situações pode ser necessário um efeito mais rápido. Um exemplo disso pode ser placas arterioscleróticas instáveis em que a LDL oxidada provavelmente contribui para ocorrência de inflamação, toxicidade da célula e risco de ruptura da placa. Sob tais circunstâncias, uma imunização passiva mediante injeção de anticorpos purificados ou produzidos de forma recombinante contra seqüências nativas e modificadas por MDA, pode apresentar um efeito mais rápido.
[0094] Outra situação em que uma imunização passiva mediante injeção de anticorpos purificados ou produzidos de forma recombinante pode ser efetiva é em doenças coronárias do coração em indivíduos mais idosos. As pesquisas dos presentes inventores demonstraram que uma redução nos
22/50 anticorpos contra as seqüências do peptídio apo B ocorre com o aumento da idade nos seres humanos, sendo associada com um aumento no nível do plasma de LDL oxidada (Nordin Fredrikson, Hedblad e outros). Isso pode sugerir um envelhecimento das células imunes responsáveis pela produção de anticorpos contra antígenos na LDL oxidada e resultar em uma desobstrução defeituosa das partículas de LDL oxidadas da circulação. Conseqüentemente, esses sujeitos seriam mais beneficiados de uma imunização passiva mediante injeção de anticorpos purificados ou produzidos de forma recombinante do que de uma imunização ativa com seqüências de peptídios apo B-100.
[0095] Os peptídios nativos sintéticos (Euro-Diagnostica AB, Malmõ, Suécia) usados a seguir foram os peptídios 1, 2 e 301, da biblioteca de polipeptídios selecionada inicialmente. O peptídio 1 (seqüência de aminoácidos: EEEMLENVSLVCPKDATRFK, n=10) e o peptídio 301 (seqüência de aminoácidos: HTFLIYITELLKKLQSTTVM, n=10) foram encontrados como tendo resposta de anticorpo IgG ou IgM superior à forma modificada por MDA do que o peptídio nativo, respectivamente, e ambos os títulos são superiores em sujeitos saudáveis. Esses peptídios foram escolhidos baseado na suposição de que a resposta de anticorpo a esses peptídios deve ser protetora contra a arteriosclerose. O peptídio 2 (seqüência de aminoácidos: ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS, n=10) não proporcionou nenhuma resposta de anticorpo na seleção inicial de anticorpo, conseqüentemente, o mesmo foi escolhido como peptídio de controle. Os camundongos que receberam Alum serviram como controle (n=9).
[0096] Camundongos com Apo E (-/-) receberam imunização primária subcutânea com 6-7 semanas de idade, seguido de um reforço intra-peritoneal 3 semanas mais tarde. Os camundongos foram alimentados com dieta de alto colesterol a partir do início da imunização e continuaram até serem
23/50 sacrificados na idade de 25 semanas. No momento em que foram sacrificados, não ocorreu nenhuma diferença significativa no peso do corpo entre os quatro grupos de camundongos. Também, não ocorreu nenhuma diferença estatisticamente significativa no colesterol do soro ao ser medido usando um kit comercialmente disponível (Sigma). A média dos níveis de colesterol no soro foi toda acima de 715 mg/dl.
[0097] A área da aorta descendente coberta pela placa arteriosclerótica foi medida em uma preparação en face, após manchamento com óleo vermelho O. Em comparação ao grupo de controle, os camundongos imunizados com os peptídios No. 2 e No. 301 apresentaram arteriosclerose substancialmente reduzida (figura 2) . A imunização com o peptídio No. 1 não produziu uma redução significativa na arteriosclerose em comparação ao grupo de controle. Ao contrário da aorta descendente, a extensão da arteriosclerose na raiz aórtica e no arco aórtico, não foi diferente entre os 4 grupos experimentais (figura 3).
[0098] Não ocorreu nenhuma diferença entre os 4 grupos em termos de tamanho de placa do canal aórtico ou de seu teor de lipídio (Tabela A) . A média dos tamanhos de placa nos arcos da aorta de 4 grupos de camundongos não foi diferente.Entretanto, a avaliação en face dos tamanhos de placa da aorta torácica e abdominal descendente mediante manchamento de óleo vermelho O, revelou que o grupo de controle e o grupo do peptídio No. 1 apresentaram quantidades similares de placas arterioscleróticas na aorta, enquanto os grupos dos peptídios No. 2 e No. 9 apresentaram uma carga arteriosclerótica significativamente reduzida na aorta (Tabela A) . A observação de que a imunização do peptídio não afetou o canal aórtico ou o tamanho de placa do arco aórtico, mas que reduziu a placa aórtica descendente é intrigante e sugere que a imunização do peptídio deve reduzir uma nova formação de placa, sem afetar a progressão
24/50 das placas.
[0099] Posteriormente, foi testado se a imunização do peptídio modula o fenótipo das placas arterioscleróticas. Seções congeladas de placas de canal aórtico foram manchadas de forma imunoistoquímica com anticorpo monócito/macrófago (MOMA-2, Serotec). Em concordância com as descobertas da observação en face, o peptídio No. 2 reduziu de forma significativa a infiltração de macrófago nas placas (Figura 1) . O manchamento de tricromo revelou uma média de teor de colágeno de 40,0 ± 7,7% nas placas do canal aórtico do grupo do peptídio No. 2; enquanto as médias de teor de colágeno no grupo de controle de alum, grupo do peptídio No. 1 e grupo do peptídio No. 9, foram, respectivamente, de 32,3 ± 5,3%, 35,6 ± 8,5% e 29,4 ± 9,6%.
[0100] A resposta do anticorpo contra o peptídio imunizado em cada grupo foi determinada. O título do anticorpo após a imunização aumentou de 6,1 ± 3,1 vezes no grupo do peptídio No. 1, de 2,4 ± 1,0 vez no grupo do peptídio No. 2 e de 1,8 ±9,6 vezes no grupo do peptídio No. 9; enquanto o grupo de alum teve um aumento de título de anticorpo de 3,9 ± 2,7 vezes contra o peptídio No. 1, de 2,0 ± 0,5 vezes contra o peptídio No. 2 e de 2,0 ± 0,9 vezes contra o peptídio No. 9. Foi surpreendente o aumento paralelo do título do anticorpo contra peptídios imunizados, tanto no grupo imunizado como no grupo tratado com alum. Isso pode significar as seguintes possibilidades: (1) mecanismo(s) diferentes da resposta imune humoral (tal como da resposta imune celular) pode(m) estar envolvido(s) na modulação da arteriosclerose; ou (2) esse aumento de anticorpo foi uma resposta próxima de ocorrência de hipercolesterolemia com o decorrer do tempo. [0101] Embora não haja um claro mecanismo especulativo para explicar porquê a imunização do peptídio reduziu a arteriosclerose e/ou modulou o fenótipo da placa, a novidade
25/50 da presente invenção é o conceito de utilizar peptídios de LDL como imunógenos e sua possibilidade como estratégia de imunomodulação. A estratégia de imunização baseada em peptídío modula as placas arterioscleróticas. A imunização usando oxLDL homóloga ou LDL nativa como antígeno foi demonstrada como redutora do tamanho1-3 de placa, entretanto, sua disponibilidade, produção, contaminação infecciosa e segurança da LDL homóloga humana faz essa abordagem nãoatrativa para aplicação clínica. Aqui é demonstrado que a imunoterapia baseada em peptídío é factível, embora os resultados finais obtidos pelos presentes inventores sejam diferentes de hipótese inicial, isto é, de que a imunização usando peptídios com resposta mais alta de anticorpo IgM ou IgG em sujeitos normais possa proteger animais em experimentos, do desenvolvimento de placas avançadas de arteriosclerose.
[0102] É surpreendente descobrir que a imunização usando o peptídío No. 2 protegeu o animal do desenvolvimento de novas lesões arterioscleróticas na aorta descendente e reduziu a infiltração de macrófago e um maior teor de colágeno nas placas, uma vez que esse peptídío não proporcionou qualquer resposta a partir da seleção inicial humana. Isso pode ser devido: (a) o peptídío No. 2 pode ser uma parte da estrutura da proteína humana apo-B-100, que não foi exposta ao sistema imuno humano. Em conseqüência, nenhum anticorpo foi gerado e detectado a partir dos grupos saudáveis de soro humano; (b) a seqüência de aminoácidos do peptídío No. 2 é estranha para os camundongos, portanto, os camundongos desenvolveram resposta imune contra esse peptídío, o que modula a formação de nova lesão arteriosclerótica e seu fenótipo.
[0103] O efeito da imunização da LDL homóloga sobre o tamanho da placa variou quando os tamanhos da placa foram avaliados em diferentes porções da árvore aórtica. Por exemplo, Amell e outros mostraram que a imunização da LDL
26/50 nativa de coelho hipercolesterolêmico resultou numa redução da formação de placa na aorta1, enquanto Freigang e outros mostraram a redução do tamanho de placa em canais aórticos, mas não na aorta2. Tomando essas descobertas e a da presente invenção juntas, foi especulado que a imunização de peptídio modula não apenas os tamanhos de placa, mas também a composição da placa. O efeito redutor da placa foi apenas observado na aorta descendente. Os camundongos com Apo E (/-) são conhecidos por desenvolver lesões arterioscleróticas em diversos estágios de evolução em um único animal, especialmente quando alimentado com dieta de alto teor de colesterol. O aspecto inicial da lesão arteriosclerótica em animal jovem se manifestou no canal aórtico6'7 e após 15 semanas com dieta de alto teor de gordura/alto teor de colesterol, as lesões no canal aórtico se manifestaram como placas avançadas; enquanto o estágio anterior da arteriosclerose se fez presente na aorta descendente6. Uma vez que o curso temporal da maturação de placa e desenvolvimento na aorta descendente é posterior, comparado àquele do canal aórtico, a descoberta de que a imunização reduziu os tamanhos de lesão na aorta descendente, mas não no canal aórtico, sugeriu que a imunização afeta o estágio anterior da formação de arteriosclerose. É possível que como animal envelhecido e na presença do nível suprafisiológico do colesterol do soro, o efeito redutor da placa da imunização seja superado pelo efeito tóxico da hipercolesterolemia. É também possível que as placas de canal aórtico amadureçam mais rápido e o sacrifício com 25 semanas seja demasiado tarde para detectar qualquer diferença no tamanho da placa. Embora o tamanho da lesão não tenha sido modulado na placa do canal aórtico, a imunização do peptídio modulou as composições da placa. O presente modelo experimental evitou estudas a composição das placas em seu estágio anterior de desenvolvimento na aorta
27/50 descendente .
[0104] As descobertas experimentais destacam a possibilidade de se utilizar seqüências de peptídios de LDL associadas à apo-B-100 como imunógenos para uma nova abordagem para evitar a arteriosclerose e/ou modular de modo favorável o fenótipo da placa, apesar da grave hiperlipidemia. Essa estratégia de imunização baseada em peptídio é potencialmente vantajosa em relação ao uso de oxLDL homóloga ou LDL nativa como antígeno, pelo fato de que tal estratégia pode eliminar a necessidade de isolamento e preparação da LDL homóloga e seus conseqüentes riscos de contaminação. O efeito redutor de placa da imunização com o peptídio No. 2 e peptídio No. 301 foi observado apenas na aorta descendente. Essas descobertas são consistentes com os relatórios anteriores, onde outras intervenções terapêuticas foram mostradas como tendo um maior efeito sobre a aorta descendente, comparado com o arco aórtico14-17, presumivelmente devido às lesões que se desenvolvem mais rapidamente na raiz aórtica e no arco aórtico do que na aorta descendente, criando, assim, uma pequena abertura de oportunidade para intervenção14,15,16,18,19. Uma vez que o curso temporal da maturação de placa e desenvolvimento na aorta descendente é posterior, comparado àquele do canal aórtico e do arco aórtico, a descoberta de que a imunização reduziu os tamanhos de lesão na aorta descendente, mas não no canal aórtico, sugere que a imunização evita preferencialmente o estágio anterior da formação de arteriosclerose. É possível que como animal envelhecido e na presença do nível suprafisiológico do colesterol do soro, o efeito redutor da placa da imunização seja superado pelo efeito tóxico da grave hipercolesterolemia. Embora o tamanho da lesão não tenha sido modulado no canal ou arco aórtico, a imunização com o peptídio No. 2 modulou a composição da placa numa direção favorável, criando um fenótipo de placa mais estável
28/50 com reduzida infiltração de macrófago e um aumentado teor de colágeno. Em resumo, é demonstrada uma nova abordagem imunomodulatória baseada em peptídio para inibição de arteriosclerose no modelo de murino (camundongos).
[0105] Em resumo, é demonstrada uma nova abordagem imunomodulatória baseada em peptídio, em placas arterioscleróticas moduladas. Embora a mudança na formação arteriosclerótica no modelo dos presentes inventores tenha sido apenas modesta, ainda assim, essa imunização baseada em peptídio pode proporcionar uma ferramenta alternativa para pesquisa, prevenção ou tratamento da arteriosclerose.
Métodos
Preparação do Peptídio [0106] Os peptídios foram preparados usando o kit Imject® SuperCarrier® EDO (Pierce, Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante, com mínimas modificações. Um miligrama (1 mg) do peptídio em 500 μΐ de tampão conjugado, foi misturada com 2 mg de veículo em 200 μΐ de água desionizada. A mistura foi depois incubada com 1 mg de reagente de conjugação (EDC, l-etil-3-[3dimetilaminopropil]-carbodiimida HCI), à temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, foi dializada contra fosfato de sódio 0,083 M, solução de cloreto de sódio 0,9 M, pH 7,2, durante a noite sob temperatura de 4°C. O produto dializado conjugado foi diluído com um tampão de purificação de mistura anidra Imject, para um volume final de 1,5 ml. Alum foi usado como imunocoadjuvante e misturado com o conjugado de peptídio, numa diluição de 1:1 em volume. A quantidade de peptídio em cada imunização foi de 33 μρ/100 μΐ, por injeção.
Protocolo do Animal
29/50 [0107] Camundongos com Apo E (-/-) do Jackson Laboratories (Bar Harbor, Me) receberam imunização primária subcutânea com 6-7 semanas de idade, seguido de um reforço intraperitoneal 3 semanas depois. Os camundongos foram alimentados com um regime de alto teor de colesterol a partir do início da imunização e continuaram até que fossem sacrificados com a idade de 25 semanas. Amostras de sangue foram coletadas 2 semanas após o reforço e no momento de serem sacrificados. Os camundongos que receberam alum serviram de controle. O protocolo experimental foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Cominittee of CedarsSinai Medicai Center. Todos os camundongos foram alojados em uma instalação apropriada de animal, aprovada pela American Association of Accreditation of Laboratory Animal Care e mantidos em um ciclo de dia/noite de 12 horas, tendo acesso irrestrito à água e alimento. No momento de serem sacrificados, os camundongos foram anestesiados mediante inalação com Enflurano. O plasma foi obtido mediante sangramento retro-orbutal antes do ato de sacrifício.
Coleta e Seccionamento do Tecido [0108] Para avaliar o efeito da imunização do peptídio em relação à formação de arteriosclerose, foi examinado o tamanho da placa no canal aórtico, no arco aórtico e na aorta descendente torácica e abdominal. Após o coração e a árvore aórtica terem sido borrifados com uma solução salina normal sob pressão fisiológica, o coração e a aorta mais próxima foram extirpados e embebidos no composto OCT (Tissue-Tek) e seccionados congelados. Uma série de seções de 6 qm de espessura foi coletada a partir do aparecimento de pelo menos 2 válvulas aórticas até o desaparecimento dos folíolos da válvula aórtica, para avaliação da placa do canal aórtico. Tipicamente, foram depositadas 3 seções consecutivas sobre uma lâmina e um total de 25-30 lâminas
30/50 foi coletado de um camundongo, e cada quinta lâmina foi agrupada para manchamento. A aorta descendente e os canais aórticos até a artéria subclaviana esquerda foram também secionados e processados de modo similar. A aorta torácica e abdominal descendente foi processada separadamente para avaliação en face da formação de placa, após manchamento com óleo vermelho O.
Preparação en face da aorta torácica e abdominal descendente [0109] Albumina de ovos de galinha (Sigma) numa concentração de 0,8 g/ml de água, foi misturada numa proporção de 1:1 com glicerol. Azida de sódio foi adicionada para proporcionar uma concentração final da mesma de 0,2%. Após a aorta torácica e abdominal descendente ser limpa do tecido e gordura envolventes, o segmento da aorta a partir da artéria subclaviana esquerda para o nível da artéria renal foi então cuidadosamente removido para fixação durante a noite em Histochoice (Amresco). A aorta foi depois cuidadosamente aberta longitudinalmente e colocada com o lado luminal em cima de uma lâmina recentemente revestida com uma solução de albumina de ovo. Após a solução de albumina se tornar seca, a aorta foi manchada com óleo vermelho O, para exame do grau de arteriosclerose, por meio de histomorfometria auxiliada por computador.
Imunoistoquímica e Histomorfometria [0110] As seções do canal aórtico foram manchadas de modo imunoistoquímico com o anticorpo MOMA-2 (Serotec) usando um protocolo padrão. Foram feitos manchas de tricromo para examinar o teor de colágeno e de óleo vermelho O para o tamanho da placa e teor de lipídio, usando um protocolo de manchamento padrão. A análise morfométrica auxiliada por computador foi executada para examinar a histomorfometria, conforme anteriormente descrito8.
31/50
Medição do Título do Anticorpo [0111] Para medir a resposta do anticorpo após a imunização do peptídio, foi desenvolvido um ensaio ELISA. O título do anticorpo contra o peptídio imunizado foi medido usando o sangue coletado 2 semanas após o reforço e no momento do ato de sacrifício. A resposta do anticorpo contra 3 peptidios foi também determinada no grupo do alum, nos mesmos pontos de tempo. Em resumo, peptidios sintéticos nativos diluídos em PBS, pH de 7,4 (20 gg/ml) foram absorvidos nos poços da placa de microtitulação (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) numa incubação durante a noite, à temperatura de 4°C. Após lavagem com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T) as placas revestidas foram bloqueadas com SuperBlock em TBS (Pierce) durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma incubação do soro do camundongo diluído numa proporção de 1/50 em TBS/0,05% Tween-20 (TBS-T) durante 2 horas à temperatura ambiente e depois durante a noite à temperatura de 4°C. Após lavagem, a deposição dos anticorpos dirigida aos peptidios foi detectada usando anticorpos antiIg de camundongo e de coelho biotinilados (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) apropriadamente diluídos em TBS-T. Após outra incubação por 2 horas à temperatura ambiente, as placas foram lavadas e os anticorpos biotinilados ligados foram detectados por meio de estreptavidina conjugada à fosfatse alcalina (Sigma) e temperatura ambiente. Usando fosfatase (Pierce), se desenvolveu a cor da reação e a absorvência em 405 nm foi medida após 1 hora de incubação à temperatura ambiente. Os valores médios foram calculados após os valores secundários serem subtraídos.
[0112] Outros modelos de ensaios, logicamente, são também aplicáveis, como qualquer imunoensaio que detecta um anticorpo, tal como imunoensaio radiativo, Western blotting incubadas por 2 horas à um kit de substrato de
32/50 e Southern blotting, assim como a detecção de anticorpos ligados a peptídios, eletrodos de enzima e outros métodos de análise.
Estatística [0113] Os dados são apresentados como média + Padrào (Std). O método estatístico usado é listado no texto, tabela ou legenda de figura. P < 0,05 foi considerado como estatisticamente significativo.
Tabela A [0114] Tamanho de placa no canal aórtico e seu teor de lipídio, tamanho de placa no arco aórtico e percentual da placa na aorta descendente.
| Tamanho total de placa no canal aórtico (mm2) | Área de Óleo vermelho O (+) (% de placa do canal aórtico) | Tamanho de placa do arco aórtico (mm2) | % de placa da aorta (pre- plana) | |
| Alum | 0,49 ± 0,13 | 21,7 + 4,4 | 0,057 ± 0,040 | 20 ± 4,7 |
| Peptídio I | 0,48 + 0,14 | 32,0 + 8,1 | 0,054 + 0,027 | 17 + 4,3 |
| Peptídio 2 | 0,52 ±0,12 | 23,9 ± 3,5 | 0,078 ± 0,022 | 6,3 ± 1,9* |
| Peptídio 301 | 0,46 ± 0,16 | 23,8 + 4,1 | 0,050 ± 0,024 | 8,9 ± 2,2* |
* Significativamente diferente do grupo do alum. Para análise estatística foi usado ANOVA seguido do teste de Tukey-Kramer.
[0115] Dados adicionais sobre o efeito da imunização com as seqüências de peptídio de apoliproteína B-100 sobre a arteriosclerose, em camundongos abatidos com apo E, são fornecidos abaixo na Tabela B.
Tabela B [0116] Efeito da imunização com as seqüências de peptídio de
33/50 apoliproteína B-100 sobre a arteriosclerose, em camundongos abatidos com apo E
Imunizações usando misturas de diversas seqüências de peptídios
| Efeito sobre a arteriosclerose na aorta | |
| 1. Seqüências de peptídios 143 e 210 | -64,6% |
| 2. Seqüências de peptídios 11,25 e 74 | -59,6% |
| 3. Seqüências de peptídios 129, 148 c 167 | -56,8% |
| 4, Seqüências de peptídios 99, 100, 102, 103 e 105 | -40,1% |
| 5. Seqüências de peptídios 30, 31, 32, 33 e 34 | +6,6% |
| 6. Seqüências de peptídios 10,45, 154, 199 e 240 | + 17,8% |
Imunizações usando uma única següência de peptídios
| Efeito sobre a arteriosclerose na aorta | |
| 1. Seqiiêneia de peptídio 2 | -67.7%» |
| 2. Seqüência de peptídio 210 | -57,9% |
| 3. Seqüência de peptídio 301 | -55,2% |
| 4. Seqüência dc peptídio 45 | -47,4% |
| 5. Seqüência de peptídio 74 | -31,0% |
| 6. Seqüência de peptídio 1 | -15,4% |
| 7. Seqüência de peptídio 240 | 0% |
[0117] A administração dos peptídios é normalmente realizada através de injeção, tal como, injeção subcutânea, injeção intravenosa, injeção intramuscular ou injeção intraperítoneal. Uma primeira dosagem de imunização pode ser de 1 a 100 mg por paciente, dependendo do peso, idade e outras condições físicas e médicas do paciente. Em situações particulares, é também possível uma administração local de uma solução contendo um ou mais dos peptídios via cateter aos vasos coronários. As preparações orais podem também ser
34/50 contempladas, embora precauções particulares devam ser tomadas para admitir a absorção dentro da corrente sangüínea. Uma dosagem de injeção pode conter de 0,5 a 99,5% em peso de um ou mais dos fragmentos ou peptídios da presente invenção.
[0118] Os peptídios são normalmente administrados numa forma ligada à albumina de soro bovino cationizada e usando hidróxido de alumínio como coadjuvante. Outros coadjuvantes conhecidos na técnica podem também ser usados.
[0119] As soluções para administração dos peptídios não deve conter EDTA ou antioxidantes.
[0120] Os peptídios podem também ser usados como agentes terapêuticos em pacientes que já sofrem de arteriosclerose. Assim, qualquer rota de administração adequada pode ser usada para adicionar um ou mais dos fragmentos ou peptídios da invenção.
[0121] Pesquisas iniciais foram focadas na determinação de qual tipo de modificação oxidante de peptídios levou ao reconhecimento por anticorpos no plasma humano. Essas pesquisas foram feitas usando os peptídios 1-5 e 297-302. Durante a oxidação da LDL, os ácidos graxos poliinsaturados em fosfolipídios e ésteres colesterílicos se submeteram à peroxidação, levando à formação de produtos de decomposição altamente reativos, tal como, malono-dealdeído (MDA). O MDA pode depois formar adutos covalentes com resíduos de lisina e histidina na apo B-100, tornando os mesmos altamente imunogênicos. A oxidação da LDL também resulta na fragmentação da apo B-100, o que pode levar à exposição das seqüências de peptídios não normalmente acessíveis ao sistema imune. Nesses experimentos, os peptídios foram usados em seu estado nativo, após a modificação por MDA ou após a incorporação dentro dos lipossomos de fosfolipídio, seguido pela oxidação com cobre ou modificação por MDA. Os anticorpos IgM foram identificados contra peptídios nativos,
35/50 oxidados por MDA e lipossomos, com títulos do anticorpo: peptídio-MDA > peptídios de lipossomo modificados por MDA > peptidio oxidado por lipossomo > peptidio nativo. O teste de especificidade demonstrou que a ligação dos anticorpos aos peptídios modificados por MDA foi concorrida por LDL modificada por MDA e LDL oxidada por cobre.
[0122] Em seguida, os presentes inventores executaram uma seleção da completa biblioteca de peptídios usando o plasma agrupado derivado de sujeitos saudáveis de controle e de peptídios nativos e modificados por MDA, como antígenos. Anticorpos em grande número de sítios na apo B-100 foram identificados. Usando duas vezes a absorvência do controle de segundo plano como interruptor de título positivo, os anticorpos foram detectados contra 102 dos 302 peptídios constituintes da completa seqüência de apo B-100. A aglutinação do IgM foi substancialmente mais abundante que do IgG. Em geral, a aglutinação foi maior para as seqüências de peptidio modificado por MDA do que para as correspondentes seqüências de peptídios nativos, mas ocorreu uma surpreendente correlação entre as duas. A aglutinação às seqüências de peptídios nativos e modificados por MDA foi completada pela adição de LDL modificada por MDA e LDL oxidada por cobre, mas não pela LDL nativa. Essas observações sugerem que as respostas imunes contra as seqüências de peptídios modificados por MDA na apo B-100 resultam numa reatividade cruzada contra as seqüências nativas. A incapacidade da LDL nativa em completar a ligação do anticorpo às seqüências de peptidio apo B-100 nativas, pode indicar que essas seqüências apenas se tornam expostas após a degradação proteolítica da apo B-100, que ocorre como resultado da oxidação da LDL. Ambas as partes hidrofílica e hidrofóbica da molécula foram reconhecidas pelos anticorpos. Uma segunda seleção da biblioteca de peptidio apo B-100 foi executada usando o plasma agrupado de sujeitos com sinais
36/50 clínicos de doença coronária do coração (CHD: em Inglês: Coronary Heart Disease), infarto agudo do miocárdio (AMI: em Inglês: Acute Myocardial Infarction) e angina instável; n = 10)). Os anticorpos no plasma agrupado da CHD, foram ligados às mesmas seqüências e com a mesma distribuição global dos anticorpos no plasma do controle saudável. Entretanto, os títulos dos anticorpos para diversos peptídios (#1, 30-34,
100, 107, 148, 149, 162, 169, 236, 252 e 301) foram pelo menos duas vezes tão altos como no plasma de controle, comparado ao plasma dos sujeitos com CHD, enquanto os títulos contra um número menor de peptídios (#10, 45, 111,
199, 222 e 240) foram maiores no plasma de pacientes com
CHD, quando comparado aos controles. Em seguida, os presentes inventores executaram uma pesquisa prospectiva clínica para investigar se os níveis de anticorpo contra as seqüências de peptídios modificados por MDA na apo B-100 pressupõem o risco de desenvolvimento de CHD. Usando um modelo de controle para os diversos casos, os presentes inventores selecionaram 78 sujeitos com eventos coronários (AMI ou morte devido à CHD) e 14 9 controles do Malmõ Diet Câncer Study. Tanto os casos de indivíduos como os casos de controle não apresentaram história de MI ou derrame anteriores. O tempo médio de inclusão para o evento coronário agudo foi de 2,8 anos (faixa de 0,1-5,9 anos) entre os casos. Os níveis de anticorpos foram determinados em amostras de plasma da linha base, suplementado com antioxidantes. Usando a espessura média da íntima da carótida (IMT: em Inglês: intima-media thickness) conforme examinado por ultra-sonografia na linha de base, os presentes inventores também analisaram associações entre níveis de anticorpos e o grau de doença vascular existente. Foram pesquisadas 8 seqüências de peptídios modificados por MDA, que na pesquisa de seleção inicial foram associados com altos níveis de anticorpo no plasma (#74, 12 e 210) e/ou
37/50 diferenças acentuadas entre os grupos de controle e de plasma de CHD (#32, 45, 129, 162 e 240) . Os grupos de controle foram encontrados como tendo maiores níveis de IgM contra o peptídio de MDA 74 (0,258, variação de 0-1,123 unidades de absorvência, versus 0,178, variação de 0-0,732 unidades de absorvência, p < 0,05), e, ao contrário, não ocorreram diferenças nos níveis de anticorpos entre os casos e os controles. Associações entre IMT e IgM contra peptídios de MDA, #102, 129 e 162 (r = 0,233, 0,232 e 0,234, respectivamente, p < 0,05) foram observadas nos casos e entre IMT e peptídio de MDA 45 (r = 0,18, p < 0,05) nos controles. Fracas correlações foram observadas entre os anticorpos para o peptídio de MDA 129 e colesterol total e de LDL (r = 0,19 e r = 0,19; p < 0,01, respectivamente), e, por outro lado, os níveis de anticorpos do peptídio não mostraram associações com o colesterol do plasma total, colesterol LDL, colesterol HDL ou triglicerídios do plasma. Ocorreram fortes correlações entre níveis de anticorpos para diferentes peptídios (valores de r variando de 0,6 a 0,9). A única exceção foi de anticorpos contra o peptídio de MDA 74, que foi fracamente ou de nenhum modo correlacionado aos anticorpos contra os outros peptídios.
[0123] Os anticorpos contra todas as seqüências, exceto a do peptídio de MDA 74, foram inversamente associados com a idade entre os casos (valores de r variando de -0,38 a 0,58; p < 0,01, 0,001), mas não nos controles. Os níveis de plasma da LDL oxidada, ao contrário, aumentaram com a idade. Novamente. Essa associação foi mais forte nos casos que nos controles. Para investigar se as associações entre respostas imunes contra seqüências de peptídios modificados por MDA e doença cardiovascular foram diferentes em diferentes grupos de idade, foi realizada uma análise de subgrupo nos casos e nos controles, abaixo e acima da média de idade (61 anos). Nos casos de grupo de idade mais jovem, ocorreu aumento nos
38/50 níveis de anticorpos contra os peptídios 32 e 45 e diminuição dos níveis de anticorpos contra o peptídio 74, ao ser comparado aos controles, enquanto nenhuma diferença foi observada no grupo de idade mais velha. Os anticorpos contra todas as seqüências de peptídios de MDA, exceto o peptídio 74, foram significativamente associados com IMT no grupo de idade mais jovem, mas não no grupo de idade mais velha (tabela).
[0124] Es sas pesquisas identificaram um número de seqüências modificadas por MDA na apo B-100 que é reconhecido pelos anticorpos humanos. A modificação por MDA da apo B-100 ocorre como resultado da oxidação da LDL, indicando que esses anticorpos pertencem à família dos autoanticorpos de LDL oxidada anteriormente descritos. Essa noção é também suportada pela observação de que a ligação ou aglutinação do anticorpo aos peptídios de apo B-100 modificados por MDA é rivalizada mediante adição de LDL oxidada. Junto com os fosfolipídios oxidados identificados por Hõrkkõ e outros, essas seqüências de peptídios modificadas por MDA são prováveis de constituir a grande maioria de estruturas antigênicas na LDL oxidada. Em similaridade com os anticorpos de antifosfolipídio de LDL oxidada, os anticorpos contra as seqüências de apo B-100 modificadas por MDA foram do tipo IgM. Isso pode sugerir que também estes últimos anticorpos pertençam à família de anticorpos naturais 15 T. Os anticorpos 15 T foram atribuídos de um importante papel no passado, a defesa independente da célula T contra infecções bacterianas, assim como a remoção de células apróticas. Permanece para ser determinado se os anticorpos de peptídio MDA aqui descritos possuem funções similares. Os anticorpos foram também identificados contra um grande número de seqüências apo B-100 nativas. No entanto, a próxima co-variação entre os anticorpos com as seqüências de apo B-100 nativas sugere também que esses anticorpos são
39/50 formados em resposta à oxidação da LDL. É também possível que os anticorpos contra a seqüência de peptídios modificada por MDA reaja de forma cruzada com a correspondente seqüência nativa. Se os anticorpos contra as seqüências de apo B-100 nativas se ligarem também às partículas de LDL nativas, isso provavelmente terá uma maior influência sobre o metabolismo da LDL. Entretanto, foi descoberto que a LDL nativa não rivaliza com a ligação do anticorpo às seqüências de apo B-100 nativas, assim como com a falta de correlação entre os anticorpos contra as seqüências de apo B-100 nativas e níveis de colesterol de LDL contra a existência de tal fenômeno.
[0125] Os anticorpos contra as seqüências de peptídios modificados por MDA diminuem progressivamente com a idade nos casos, mas não nos controles. Com exceção do peptídio 74 de MDA, os anticorpos IgM contra os peptídios de MDA foram significativamente associados com IMT da carótida nos grupos de idade mais jovem (abaixo de 62 anos), mas não nos grupos de idade mais velha. Essa descoberta sugere que significativas mudanças nas interações entre o sistema imune e a parede vascular arteriosclerótica ocorrem entre idades de 50 a 70 anos. Uma possibilidade é que nos indivíduos mais jovens, o processo de doença arteriosclerótica se encontre em um estágio mais ativo com um maior e acentuado envolvimento de células imunes. Outra possibilidade é que os reduzidos níveis de anticorpos contra as seqüências de peptídios modificados por MDA em sujeitos mais velhos reflete um envelhecimento das células imunes envolvidas na arteriosclerose. Uma função enfraquecida das células imunes devido à imunosenescência foi proposta para contribuir para um aumento de susceptibilidade à infecção e câncer na população mais velha. De modo interessante, a imunosenescência é inibida por meio de antioxidantes que indicam o envolvimento de esforço oxidante. As células
40/50 imunes que interagem com os epítopos na LDL oxidada são prováveis de serem particularmente expostas ao esforço oxidante. Uma vez que a LDL oxidada está presente nas artérias desde uma idade bastante cedo, essa resposta imune está sendo continuamente desafiada por diversas décadas, o que pode ainda contribuir para o desenvolvimento da imunosenescência.
[0126] O aumento de anticorpos contra dois sítios na apo B100 foi descoberto para prever o risco de infarto no miocárdio e morte coronária em sujeitos com idade abaixo de 62 anos. Os anticorpos contra esses sítios mostraram um alto nível de co-variação, sugerindo que os mesmos foram produzidos em resposta aos mesmos processos patofisiológicos essenciais. O fato de que o tempo médio de amostragem de sangue para o evento coronário foi de apenas 2,8 anos, torna esses anticorpos particularmente interessantes como marcadores para um aumento de risco de CHD. Os níveis de anticorpo contra seqüências de peptídío de apo B-100 modificados por MDA não mostraram associações com outros fatores de risco de CHD, tais como, hiperlipidemia, hipertensão e diabetes, sugerindo que os mesmos são marcadores independentes do risco de CHD. Os casos de CHD na presente pesquisa não foram de indivíduos extremamente de alto risco e, nesse contexto, foram representativos de paciente com CHD comum. A descoberta de que o IgM contra as seqüências de apo B-100 modificadas por MDA prevêem um risco de curto prazo para o desenvolvimento de eventos coronários agudos em indivíduos que não teriam sido identificados como de alto risco pela seleção de fatores de risco estabelecida, sugere que o mesmo possa se tornar um instrumento de utilidade na identificação de indivíduos com necessidade de tratamento preventivo agressivo. No entanto, pesquisas prospectivas consideravelmente maiores contendo análises múltiplas variadas são necessárias antes do valor clínico de
41/50 determinação de anticorpos contra as seqüências de peptídios apo B-100 modificados por MDA possa ser totalmente estabelecido. Outra limitação da presente pesquisa clínica é que os presentes inventores analisaram apenas os anticorpos contra um pequeno número de sítios antigênicos na apo B-100 e que os títulos de anticorpo contra outros sítios possam ser ainda melhores indicadores do risco cardiovascular.
[0127] Em sujeitos com idade abaixo de 60 anos, os anticorpos contra um grande número de sítios modificados por MDA na apo B-100 foram correlacionados com o grau da doença vascular existente, de acordo com o exame da espessura média da íntima (IMT) da carótida. Os anticorpos IgM foram mais proximamente associados com a IMT da carótida do que os anticorpos IgG. Embora a IMT da carótida tenha óbvias limitações como medida de carga arteriosclerótica geral, essas observações ainda sugerem que a determinação de IgM contra seqüências modificadas por MDA na apo B-100 possa ser um método de exame da gravidade da arteriosclerose existente. Essas observações se encontram também em linha com diversas pesquisas anteriores que relataram associações entre doença coronária e doença da artéria carótida e anticorpos IgM contra LDL oxidada.
[0128] Os anticorpos contra o peptídio 74 diferiram contra outros anticorpos do peptídio de apo B-100 em diversos aspectos. Eles foram superiores nos controles em relação aos casos, não diminuíram com a idade e não foram associados com o grau da doença da carótida. Conseqüentemente, os anticorpos contra essa seqüência de peptídios representam interessantes candidatos para uma resposta ateroprotetora imune.
[0129] Uma importante questão é o porquê dessas associações ocorrerem. Elas claramente demonstram que respostas imunes contra sítios de apo B-100 modificada por MDA de algum modo são envolvidas no processo de doença de arteriosclerose. Uma
42/50 vez que altos níveis de anticorpo são associados maior gravidade da arteriosclerose e aumento de risco para desenvolvimento de eventos coronários agudos, uma possibilidade óbvia é que essas respostas imunes promovam a aterogênese. Pesquisas demonstram que respostas imunes contra proteínas de choque térmico, tal como HSP 65, são aterogênicas, o que fornece algum suporte para essa noção. No entanto, pesquisas experimentais em animais têm mostrado um efeito ateroprotetor de imunização da LDL oxidada. A reconstituição da célula B de camundongos isentos de apo E, que sofreram retirada do baço, resulta numa diminuição da arteriosclerose. A arteriosclerose reduzida foi também observada em camundongos isentos de apo E, que receberam repetidas injeções de imunoglobulina. As presentes observações não necessariamente argúem contra um papel ateroprotetor de respostas imunes contra LDL oxidada. Essas respostas imunes são ativadas por meio de processos proaterogênicos, tal como a oxidação da LDL. Conseqüentemente, elas são também prováveis de se proporcionarem à gravidade de processos doentios e podem servir como indicadores de gravidade da doença e do risco de CHD sem contribuir para progressão da doença. A descoberta de que a imunização de camundongos isentos de apo E com seqüências de peptídios apo B-100 inibe o desenvolvimento de arteriosclerose, relatada em duas palestras referenciadas em anexo, demonstra que esta descoberta é provável de confirmar o caso. De fato, o mais importante resultado da presente pesquisa pode ser a identificação de estruturas que poderíam ser usadas como componentes de uma vacina contra a arteriosclerose. A observação de que a diminuição nos anticorpos contra as seqüências de peptídios modificados por MDA na apo B-100, que ocorre com o passar da idade, é acompanhada por um aumento nos níveis de plasma da LDL oxidada, sugere que um aumento de desobstrução de LDL, oxidada de forma mínima, da
43/50 circulação, pode ser um mecanismo pelo qual esses anticorpos possam proteger contra a arteriosclerose.
Métodos
População da Pesquisa [0130] Os participantes da pesquisa, nascidos entre 1926 e 1945, pertencem ao grupo de pesquisa do Malmõ Diet and Câncer (MDC). Um número aleatório de 50% daqueles que entraram no grupo do MDC entre Novembro de 1991 e Fevereiro de 1994 foi convidado a tomar parte em uma pesquisa sobre epidemiologia da doença da artéria carótida. As rotinas para apuração de informações sobre morbidade e mortalidade segundo o exame de saúde, assim como a definição de fatores de risco tradicionais,foram relatadas.
[0131] Oitenta e cinco casos de eventos coronários agudos do coração, isto é, MI ou morte fatal ou não-fatal devido à doença coronária do coração (CHD), foram identificados. Os participantes que já apresentavam uma história de infarto do miocárdio ou derrame (n=6) não foram selecionados para a presente pesquisa. Para cada caso, história de infarto do miocárdio individualmente nivelados quanto à idade, sexo, hábito de fumo, presença de hipertensão e mês de participação no exame de seleção e duração do acompanhamento. Devido à razões logísticas (amostras de sangue não foram disponíveis em suficiente quantidade para exame dos peptídios), apenas um controle foi disponível para sete casos e nenhum controle para um caso. Esse caso foi excluído da análise. Assim, a população da pesquisa consistiu de 227 sujeitos, 78 casos e 149 controles, com idade variando entre 49 e 67 anos (média de 61 anos) na linha de base.
dois controles sem ou derrame foram
Análise de Laboratório
44/50 [0132] Após período de jejum durante a noite, foram extraídas amostras de sangue para determinação de valores de soro de colesterol total, triglicerídios, colesterol HDL, colesterol LDL e completa glicose do sangue. O colesterol LDL em mmol/L foi calculado de acordo com a fórmula de Friedewald. A LDL oxidada foi medida mediante ensaio ELISA (Mercordia).
Vasculografia por Ultra-som do Modo-B [0133] Um sistema de tomografia computadorizado, modelo Acuson 128 (Acuson, Mountain View, Califórnia), com um transdutor de MHz, foi usado para exame das placas da carótida, na artéria carótida direita, conforme descrito anteriormente.
Desenvolvimento de Ensaios ELISA contra Seqüências de Peptídios apo B-100 [0134] Os 302 peptídios correspondentes à inteira seqüência de aminoácidos da apoliproteína B humana foram sintetizados (Euro-Diagnostica AB, Malmõ, Suécia, e KJ Petersen AS, Horsholm, Dinamarca) e usados no ensaio ELISA. Uma fração de cada peptídio sintético foi modificada por 0,5 M de MDA (Sigma-Aldrich Sweden AB, Estocolmo, Suécia) durante 3 horas à temperatura de 37°C e na presença de lipossomos por 0,5 M de MDA por 3 horas à temperatura de 37°C ou por 5 mM de CuCl2 (Sigma) por 18 horas à temperatura de 37°C. Os peptídios modificados por MDA foram submetidos à diálise contra PBS, contendo 1 mM de EDTA, com diversas modificações, durante 18 horas, à temperatura de 4°C. A modificação dos peptídios foi testada em géis de poliacrilamida desnaturada (BioRad Laboratories, Hercules,
| CA), adequados para | separação de peptídios. | |||
| [0135] Uma mistura | de fosfatidilcolina de | ovo | (EPC) (Sigma) | |
| e fosfatidilserina | (PS) (Sigma) em | uma | solução | de |
| clorofórmio, com | uma proporção molar | de | : 1 e | uma |
45/50 concentração de 3mM de fosfolipídio (PL), foi evaporada em um recipiente de vidro sob uma suave corrente de argônio. O recipiente foi depois colocado sob vácuo durante 3 horas. Uma solução contendo 0,10 mM de peptídio (5 ml) em 10 mM de um tampão de HEPES filtrado estéril, pH 7,4, 145 mM de NaCl e 0,003% de azida de sódio foi adicionada ao filme seco de EPC/OS e incubada durante 15 minutos à temperatura de 50°C. A mistura foi suavemente submetida ao turbilhonamento durante cerca de 5 minutos à temperatura ambiente e depois colocada em um banho de água resfriada em gelo e sonicada com amplitude de 7,5 mícrons por 3x3 minutos (Sonyprep 150 MSE Sanyo, Tamro-Mediab, Suécia), com interrupções de 1 minuto. A mistura de peptídio-PL, nativa ou modificada por MDA 0,5M, para 311, à temperatura de 37°C ou por CuCl2 5 mM por 18 horas à temperatura de 37°C, foi armazenada sob atmosfera de argônio em frascos de vidro à temperatura de 4°C, que foram embrulhados em folha de alumínio, e a mistura usada dentro de 1 semana. A mistura modificada por MDA foi submetida à diálise contra PBS contendo 1 mM de EDTA, com diversas modificações durante 18 horas, à temperatura de 4°C antes do armazenamento. A modificação da mistura foi testada em géis de poliacrilamida desnaturada (BioRad Laboratories AB, Sundbyberg, SE), adequados para separação de peptídios. [0136] Os peptídios sintéticos nativos ou modificados, diluídos em PBS, pH 7,4 (20 leg/ml), na presença ou ausência de lipossomos, foram absorvidos em poços de placa de microtitulação (Nunc MaxiSorp, Nunc, Roskilde, Dinamarca) em um procedimento de incubação durante a noite, à temperatura de 4°C. Como referência, um dos peptídios (P6) foi processado em cada placa. Após lavagem com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T), as placas revestidas foram bloqueadas com SuperBlock em TBS (Pierce, Rockford, IL) durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido por uma incubação de plasma agrupado humano, diluído na proporção de
46/50
1:100 em TBS-0,05% de Tween-20 (TBS-T), durante 2 horas à temperatura ambiente e depois durante a noite à temperatura de 4°C. Após lavagem, a deposição dos auto-anticorpos dirigida aos peptídios foi detectada usando anticorpos antiIgG ou IgM humanos e de coelho biotinilados (Dako A/S, Glostrup, Dinamarca) apropriadamente diluídos em TBS-T. Após outra incubação por 2 horas à temperatura ambiente, as placas foram lavadas e os anticorpos biotinilados ligados foram detectados por meio de estreptavidina conjugada à fosfatse alcalina (Sigma) e incubadas por 2 horas à temperatura ambiente. A reação colorida foi desenvolvida usando um kit de substrato de fosfatase (Pierce) , e a absorvência em 405 nm foi medida após 1 hora de incubação à temperatura ambiente. Os valores de absorvência dos diferentes peptídios foram divididos pelo valor de absorvência de (P6) e comparados.
Estatística [0137] O modelo SPSS foi usado para análises estatísticas. Os resultados são apresentados como média e faixa de variação e como proporção, quando apropriado. Gráficos com plotagens em compartimentos (Boxplots) e plotagens distribuídas (Scatterplots) são ainda usados para ilustrar a relação entre a idade e os peptídios selecionados dentre os casos e correspondentes controles. Gráficos correspondentes foram também usados para ilustrar a relação entre a idade e peptídios selecionados, casos e controles, respectivamente, abaixo e acima da idade média (61 anos), na linha base e separadamente para os casos e controles abaixo da idade média. Nos casos e controles, separadamente, coeficientes de correlação parcial ajustados quanto à idade e sexo foram computados entre os peptídios selecionados e níveis de lipídios no sangue e espessura média da íntima (IMT) comum da carótida. Os coeficientes de correlação
7/50 parcial ajustados quanto à idade e sexo foram também computados entre a IMT comum da carótida e peptídios selecionados nos casos e controles abaixo e acima da idade média. Um teste-t de amostra independente foi usado para estimar variáveis contínuas distribuídas normalmente e um teste do Qui quadrado para proporções entre casos e controles. O teste nâo-paramétrico (Mann-Whitney) foi usado para estimar variáveis continuas distribuídas nãonormalmente entre casos e controles. Todos os valores de p são de dois extremos.
Tabela [0138] Coeficiente de correlação ajustado quanto à idade e sexo para diferentes peptídios de MDA de linha base e espessura média da íntima da artéria carótida entre casos de sujeitos mais jovens (49-61 anos) e mais velhos (62-67 anos) com infarto do miocárdio e seus correspondentes controles equiparados por idade, sexo, hábito de fumo e hipertensão.
| Peptídio | Casos mais Controles | Casos mais Controles |
| (idade de 49-61 anos, | (idade de 62-67 anos, | |
| n=116) | n=lll) | |
| IgM | ||
| MDA 32 | 0,235t | -0,101 |
| MDA 4 5 | 0,366$ | -0,030 |
| MDA 7 4 | 0,178 | 0, 063 |
| MDA 102 | 0,255$ | -Õ,039 |
| MDA 129 | 0,330$ | -0,009 |
| MDA 162 | 0,2451 | 0,001 |
| MDA 210 | 0,254 | 0,013 |
| MDA 240 | 0,284$ | 0,006 |
| IgG | ||
| MDA 215 | 0,119 | -0,059 |
P < 0,05; $/x0,01
48/50
Legendas das Figuras [0139] As figuras 1 a 6 mostram respostas de anticorpo a diferentes peptídios preparados de acordo com a presente invenção.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [0140] 1. Ameli S et al. Effect of immunization with homologous LDL and oxidized LDL on early atherosclerosis inhypercholesterolemic rabbits. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 16,1074-1079 (1996) [0141] 2. Freigang S, Hõrkkõ S, Miller E,Witztum J. L. & Palinski W. Immunization of LDL receptor-deficient mice with homologousmalondialdehyde-modified and native LDL reduces progression ofatherosclerosis by mechanisms other than induction of high titiers of antibodies to oxidativeneoepitopes. Arterioscler Thromb Vasc Biol.
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Claims (3)
- REIVINDICAÇÕES1. Composição farmacêutica para tratamento profilático ou terapêutico de um mamífero, incluindo um ser humano, contra doenças cardiovasculares isquêmicas, caracterizada pelo fato de que a dita composição farmacêutica é compreendida de:uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo purificado ou recombinante produzido contra umB, o dito fragmento da sequência de aminoácidos fragmento da apolipoproteína apolipoproteína B tendo a KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH (SEQ ID NO: 14); - ao menos um adjuvante.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por o adjuvante ser o hidróxido de alumínio. 3. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 ou 2 caracterizada por ser inj etável. 4. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1 ou 2 caracterizada por ser oral. 6. Uso de um anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, na preparação de uma composição farmacêutica um mamífero, fato de que para tratamento profilático ou terapêutico de incluindo um ser humano, caracterizado pelo o dito uso se destina ao tratamento contra doenças cardiovasculares isquêmicas.τιPeptídios f/6Peptídio Abs/P6 Abs9/1Peptídios 1-100 modificados por MDA, anticorpos IgG - 2/ÉPeptídiosPeptídio Abs/P6 Abs >ZZ2 ! 5!Ό ιPeptídios 101-200 modificados por MDA, anticorpos IgG9/ZPeptídios
- 3 ΛPeptídio Abs/P6 AbsAPeptídios 201-302 modificados por MDA, anticorpos IgG9/£PeptídiosPeptídio Abs/P6 AbsPeptídios 1-100 modificados por MDA, anticorpos IgM οLMPeptídios f/6Peptídio Abs/P6 Abs ©>oo \O9/SPeptídios 101-200 modificados por MDA, anticorpos IgM-π t—4Ο0*Peptídios6/6Peptídio Abs/P6 Abs9/9Peptídios 201-302 modificados por MDA, anticorpos IgM
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