Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych izoflawonu o wartoscio¬ wych wlasciwosciach farmakologicznych.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku odpowiadaja ogólnemu wzorowi 1, w któ¬ rym R2 i R8 oznaczaja atom wodoru, R4 oznacza atom wodoru, R5 oznacza grupe alkilowa o wiecej niz dwóch atomach wegla.Sposób wytwarzania .nowyeh zwiazków o ogól¬ nym wzorze 1 polega na tym, ze poddaje sie de- hydratacji pochodna 2-hydroksyizoflawonu o ogól¬ nym wzoirze 2, w którym R2 i R8 maja wyzej po¬ dane znaczenie, a R6 oznacza grupe alkilowa lub wodór i nastepnie ewentualnie przeprowadza gru¬ pie R8 w grupe R5.Dehydratacje przeprowadza sie przez ogrzewa¬ nie lub poprzez proces cieplny w srodowisku kwasnym,, w polarnym rozpuszczalniku.W pierwszym etapie realizacji sposobu wedlug wynalazku moga ze zwiazków o ogólnym wzorze powstawac takie pochodne, w których podlstaw- nik R6 nie stanowi grupy R5 w ^produkcie konco^ "wym. W tych przypadkach mozna przeprowadzic grupe R6 w^grupe R5 za pomoca czesciowego lub calkowitego alkilowania mono, ewentualnie poU- nydroksyizoflawonów. Alkilowanie mozna korzyst¬ nie przeprowadzac przez reakcje wymiany z ha¬ logenkiem alkilu lub podstawionym / halogenkiem alkilu, siarczanem alkilu, olefina i •epoksydem w ten sposób, ze ogrzewa sie srodek alkilujacy w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak ketony, dwumetyloformamid, lub eter o wiekszej liczbie atomów wegla, z alkjlowanyni izoflawonem, w przypadku zwiazków chlorowcowych korzystnie w obecnosci srodka wiazacego kwas, na przyklad weglanu metalu alkalicznego, ewentualnie w przypadku bromku alkilu i chlorku alkilu ko¬ rzystnie w obecnosci dodanego jodku aUkilu.Zwiazki wyjsciowe o wzorze 2 sa zwiazkami io x znanymi, lecz w literaturze nie ma zadnej wzmian¬ ki nia temat ich dzialania farmaceutycznego lub regulujacego metabolizm.Zwiazki izoflawonowe, które mozna otrzymac sposobem wedlug wynalazku sa calkowicie wolne xi od dzialania estrogennego. Wyniki praeprowadzor nych badan w_tym kierunkoi upewniaja, ze dziar lanie na wzrost wagi ciala pewnych typów po¬ chodnych izoflawonu — przy równoczesnym zmniejszeniu lub calkowitym usunieciu dzialania estrogennego — ulega istotnemu wzmocnieniu, a dzialanie podnoszace wage ciala przewyzsza znacz¬ nie dzialanie zwiazków izoflawonowych o wyraz¬ nym dzialaniu estrogeninym.Ponadto odkryto szczególnie interesujace nowe dzialanie biologiczne, a mianowicie cteiajLanie pod¬ noszace wage ciala w obszarze nie opijanym do¬ tychczas w literaturze — w grupie zwiazków izo¬ flawonowych nie wywierajacych zadnego dziala¬ nia estrogennego. Prócz tego znaczna czesc zwiaz- ków wykazuje równiez dzialanie androgenne wol- 99 03099 030 3 ne od dzialan anatoksycznych, na podstawie re¬ tencji azotu i próby musculus levator lub po¬ miaru dzialania wzmacniajacego miesni szkiele¬ towych. Nalezy jeszcze podkreslic, ze pewne zwia¬ zki tej grupy wykazuja dzialanie podnoszace wa¬ ge ciala przewyzszajace dzialania znane dotych¬ czas, jednak stanowiace substancje w stosunku do organizmu zywego praktycznie nieszkodliwe (DL50 wieksza niz 5 g/kg wagi ciala) niezaleznie odl skladu paszy, dajace sie stosunkowo latwo i ekonomicznie wytwarzac w warunkach wielko¬ przemyslowych, stabilne, dajace sie nieogranicze- nie przechowywac, pozbawione smaku i zapachu.Okreslone czlony tej grupy zwiazków nadaja sie do stosowania w hodowli zwierzat, jak np. do zwiekszenia produkcji mleka, jak i welny, w ry¬ bactwie do podnoszenia, produkcyjnosci hodowli ryb, przy hodowli zwierzat futerkowych, w go¬ spodarce lesnej itd.Podane nizej testy farmakologiczne dotycza efektów dzialania zwiazków otrzymywanych spo¬ sobem wedlug wynalazku.Test efektu anabolicznego: Badanie przeprowa¬ dzono z kastrowanymi szczurami za pomoca te¬ stu musculus levator ani oraz testu vesicula se- minalis. Preparaty podawano doustnie w okresie» trzech tygodni. Testy wykonano za pomoca me¬ tody Eisenberga i Gordana (E. Eisenberg, G. S.J. Gordan, J, Pharmacol. 99, 38 (1950). Dodatko¬ wo oznaczono równiez wage wypreparowanej dia- fragmy zwierzat. Wedlug tych testów waga mu¬ sculus levator ani wzrosla 6 statyczna znamiennosc równa p 0,01, waga vesicula seminalis nie zwiek¬ szyla sie, podczas gdy waga wypreparowanej dia- fragmy zwierzat zwiekszyla sie o statyczna zna¬ miennosc równa p 0,05. Wyniki te potwierdzily posiadanie przez preparaty czynnika anabolizuja- cego wolnego od efektów androgennych. W cza¬ sie testów zwierzetom podawano ogólem 30 mg/kg substancji czynnej.Badanie retencji azotu przeprowadlzono równiez na szczurach. Przy systematycznym traktowaniu wydalanie azotu u badanych zwierzat zmniejszylo sie odpowiednio 20 i 30 dnia, przy statystycznej znamiennosci p 0,05. Wynik tych badan tak sa¬ mo wskazuje na efekt anaboliczny.Badania z metionina znaczona siarka radioak¬ tywna S-35 wykazaly, ze w efekcie traktowania aacliodzi zwiekszona inokorporcjta mfctioniny w tfeftnkach miesni badanych zwierzat.Efekt zwiekszajacy aktywnosc miesni badano za pomoca testu wymuszonego plywania u szczurów.Zwierzeta zmuszono do plywania w wodzie o tem¬ peraturze 29°C z ladunkiem 5 g/100 ig wagi cia¬ la. Zawartosc kaloryczna i ilosc podawanego po¬ karmu byla taka sarnia^ jak u zwierzat kontrol¬ nych.Róznica pomiedzy okresami wymuszonego ply¬ wania az do wyczerpania zwierzat kontrolnych oraz zwierzat traktowanych w ciagu 45 dhi i przy¬ muszonych do codziennego plywania wynosila 33 minuty (zwierzeta kontrolne poddano identyczne¬ mu traktowaniu-z wyjatkiem stosowania substan¬ cji czynnej), to jest okres plywania zwierzat kón- 4 trolnych wzrósl ze 166 minut do 196 minut, pod¬ czas gdy okres plywania zwierzat traktowanyoli wzrósl od 162 .minut do 225 minut. Doswiadcze¬ nia te przeprowadzono przy stosowaniu dziennych "dawek substancji czynnej w ilosci 5 mg/kg wagi ciala, W dalszych doswiadczeniach udalo sie uzyskac czesciowe zniesienie efektu antykatabolicznego kortizonu za pomoca zwiazków wytwarzanych sposobem wedJlug wynalazku przy stwierdzeniu,. ze identyczne dawki steroidów anabolizujacych. nie moga wywolac silniejszych efektów anaboli¬ zujacych, niz efekty zwiazków wytwarzanych spo¬ sobem wedlug wynalazku.Przy badaniu danych analizy wagi ciala stwier¬ dzono, ze zwiekszenie wagi tkanek miesni bylo stosunkowo wieksze niz zwiekszenie tkanki tlusz¬ czowej oraz, ze zawartosc tluszczu tkanki mies¬ niowej zmniejszyla sie, podczas gdy zawartosd protein wzrosla.Testy toksycznosci chronicznej potwierdzily pel¬ na nieszkodliwosc preparatu. W czasie 48-godzin- nego okresu obserwacji przy podawaniu doustnie dawek 4000 mg/kg wagi ciala lub podskórnie da¬ wek 3500 mg/kg wagi ciala ani jedna mysz nie zmarla. W testach na szczurach nie zaobserwowa¬ no idbstrzegalnych zmian w ciagu okresu 48 go¬ dzin ,po doustnym lub podskórnym podaniu da¬ wek 3500 mg/kg Wagi ciala. U psów nie zaobser¬ wowano zmian w ciagu tygodnia podawania da¬ wek 3500 mig/kg wagi ciala.Testy toksycznosci podchronicznej byly wyko¬ nane na szczurach. Przy podawaniu dziennych da¬ wek 200 mg/kg wagi ciala i 500 mg/kg wagi ciala doustnie nie mozna bylo zaobserwowac zmian po miesiacu okresu testowego.Podobne wyniki otrzymano w testach podchro nicznych przeprowadzonych na myszach.Jezeli chodzi o toksycznosc chroniczna, to do Chwili obecnej zakonczono trzymiesieczne testy toksycznosci chronicznej. Po podaniu dziennie da¬ wek 10O mg/kg wagi 'ciala i 10 mg/kg wagi ciala w ciagu trzech miesiecy samcom i samicom szczu¬ ra nie zaobserwowano dostrzegalnych zmian (ba¬ danie pelnej krwi, testy histologiczne i inne te¬ sty kliniczne).Podobnie negatywne wyniki uzyskano w tescie toksycznosci u psów po pierwszych trzech mie¬ siacach obserwacji (zastosowane tu dawki wyno¬ sily 20 mg/kg wagi ciala i 50 mg/kg wagi ciala}.Efekt estrogeniczny zwiazków badano za pomo¬ ca testu uterus! na infantylnych myszach po do¬ daniu doustnym i podskórnym. Nie zaobserwo¬ wano estrogenicznycn efektów tych zwiazków. P podawaniu dziennie 5 mg/kg wagi ciala prepara¬ tów kurczetom w ciagu 30 dni gruczoly wewnetrz¬ nego wydzielania zwierzat doswiadczalnych pod¬ dano dokladnym badaniom histologicznym. Nie zaobserwowano dostrzegalnych zmian.Efekt przyrostu wagi wywolany przez dawki 2 g/100 kg pokarmu u róznych rodzajów zwierzat byl nastepujacy: 8—15°/a u cielat 7—10% u bydla 40 45 50 55 6099 030 7—10% u wieprzy 8—20% u drobiu —20% u zajecy 8—12% u swinek morskich.Okresy podawania wahaly sie od 1 do 4 mie¬ siecy, zaleznie od rodzajów zwierzat i warunków hodowli. Traktowane zwierzeta nie otrzymywaly wiekszych ilosci pokarmu niz testy kontrolne pod¬ czas okresu traktowania. Ponadto w kilku przy¬ padkach mozna bylo uzyskac nieco oszczednosci w pokarmie calkiem niezaleznie od efektu przy¬ rostu wydajnosci wagi.W okresie traktowania zaobserwowano, ze do¬ swiadczalnie traktowane zwierzeta wykazywaly zwiekszona zywotnosc oraz, ze przyrost wagi byl glównie spowodowany przyrostem masy miesni.Bylo to szczególnie widoczne w doswiadczeniach z pasieniem prosiat, gdy w przypadku prosiat be¬ konowych udzial prosiat klasy A ubozszych w tluszcz byl znacznie wyzszy.Badanie przyrostu wagi u kurczat. Zastosowa¬ no zwiazek A = 7-izopropoksyizoflawon, wytwo¬ rzony sposobem wedlug wynalazku, w dawce 2 g/100 kg pokarmu. Otrzymane rezultaty zesta¬ wiono w nastepujacej tablicy: Przyrost wagi u kurczat 35 dnia (w °/o) Zwiazek A | Kontrola.Liczba kurczat 59 59 Waga poczatkowa dkg 11,55+0,99 11,55+0,88 Waga po 35 dniach dkg 103,29+9,11 98,34+9,45 Przyrost wagi 91,63+8,61 86,79+9,09 Przyrost wagi w % + 5V58 Dane biometryczne (w stosunku do wagi bezwzg lednej i wzrostu wagi Zwiazek A | Kontrola Liczba kurczat 59 59 Waga po 35 dniach —dkg 103,29+9,11 98,34+9,45 t 2,896 P <1% Przyrost wagi po dniach dkg 91,63+8,61 86,79 +9,09 t 2,981 P <1% Z danych liczbowych wynika, ze w przypadku 7-izopropoksyizoflawonu osiagnieto wzrost wagi wynoszacy 5,58% w stosunku do grupy kontrol¬ nej.Obliczenia biometryczne dJotyczace absolutnej wagi i przyrostów wagi daja w przypadku 7-izo- propoksyizoflawonju P < l°/o. U szczurów badano równiez osobno efekt wywierany na organy re¬ produkcyjne. Zdolnosc reprodukcji i licznosc mio¬ tów, w przypadku samców i samic traktowanych za pomoca skladnika aktywnego byly takie same, jak u zwierzat kontrolnych nietraktowanych..W badaniach na przyswajanie i wydalanie izo- flawonów znaczonych weglem radioaktywnym C-14 stwierdzono, ze przyswajanie jest dosc szyb¬ kie zarówno w przypadku podawania doustnego, jak i domiesniowego. Po podaniu doustnym polo¬ wa wprowadzonego skladnika byla wydzielona z moczem, podczas gdy druga polowa z kalem.W niektórych organach aktywnosc wykrywalna za pomoca radiografii wystepowala w 48 godzin po zakonczeniu traktowania.Wyniki badan anabolicznych pochodnych izofla- wonu.Zwierzeta kontrolne: kurczeta Sklad poczatkowej karmy ptactwa: kukury¬ dza = 60°/o, soja (45%-owa) 20%, maczka lucerny 2%, maczka rybna (65%-wa) 10%, drozdze 3,3%, fosforan wapniowy 0,6%, wapno 2,3%, sól kuchen- io na 0,3%, mieszanka witaminowa I 1,0%, mieszan¬ ka mineralna I 0,5%.Gwarantowana zawartosc: suchy skladnik: 86%, wartosc skrobiowa (kg/100 kg) 69,5, surowe bialko 19,5%, obliczone przyswajalne surowe bialko 17,1%.Sklad karmy dla wychowu ptactwa: kukurydza 50%, pszenica 14,9%, soja (45%-wa) 12,5% sru¬ towane orzechy laskowe 9%, maczka lucerny 2,0%, maczka rybna (65%-wa) 4,5%, maczka miesna (45%-wa) 3,0% fosforan wapniowy 1,0%, wapno 1,8%, sól kuchenna 0,3%, mieszanka witaminowa II 0,5%, mieszanka mineralna I 0,5%.Gwarantowana zawartosc: suchy skladnik 86%, wartosc skrobiowa (kg/100 kg) 69,5%, surowe bial¬ ko 19,5%. Obliczone przyswajalne bialko surowe 17,1%. 1 Sklad mieszanek witaminowych witamina A witamina D-3 witamina E witamina K-3 witamina B-l witamina B-2 witamina B-3 witamina B-6 witamina B-12 Niacyna 1 Chlorek choliny Bacitracyna Etoksy-metylo- -chinolina Furazolidon Ardinon Mieszanka witaminowa I 0,5«/o 2000000 IE 400000 IE 4000 IE 400 mg 400 mg 800 mg 1200 mg 400 mg mg 4000 mg 100000 mg 6000 mg 25000 mg 20000 mg — Mieszanka witaminowa U 0,5% 1200000 IE 300000 IE 2000 IE 400 mg 7 . 200 mg 700 mg 2000 mg 600 mg 4 mg 5000 mg 100000 mg 4000 mg 25000 mg — 25000 mg |99 030 1 Sklad mieszanek mineralnych I 1 Mangan Zelazo Cynk Miedz Jod Etoksy-metylo-chinolina zmieszana z 100000 g otrab 20000 mg 2000 mg 8000 mg 400 mg 150 mg 100 mig i ' Substancje czynna stosuje sie zarówno w kar¬ mie poczatkowej, jak i karmie do wychowu w postaci proszku w stezeniu 2 g/100 kg karmy.Domieszanie prowadzi sie dwustopniowo, w pierwszym stopniu stezenie wynosi 1000 ppm i w drugim 20 ppm. Po zmieszaniu zawartosc sub¬ stancji czynnej w celach kontrolnych sprawdza sie analitycznie.W toku badan kondycjonowano temperature i wilgotnosc powietrza. Czas badan wynosil 4—5 tygodni, a wage kurczat okreslano tygodniowo. W pierwszym tygodiniu zwierzeta otrzymywaly kar¬ me poczatkowa, w drugim tygodiniu karme po¬ czatkowa i karme do wychowu w stosunku 50 : 50, a od trzeciego tygodnia karme do wychowu. Wy¬ niki badan z kurczetami zestawiono w tablicy: 1S 8 sie zawartosc tlenu w wydychanym powietrzu, a zmniejsza sie róznica czastkowego stezenia tlenu w krwi tetniczej i zylnej. Ogólny stan pacjenta poprawia sie znacznie. Wynalazek wyjasniono bli¬ zej za pomoca ponizszych przykladów.Przyklad I. 1 g 7-izopropoksy-2-hydroksy- izoflawonu w mieszaninie metanolu i etanolu* w stosunku 1:1 ogrzewa sie do wrzenia z 5 ml 10°/« kwasu solnego w ciagu 1 godziny. Mieszanine reakcyjna oziebia sie i neutralizuje za pomoca 10l0/o lugu sodowego. Otrzymuje sie 7-izopropoksy- izoflawon o temperaturze topnienia 116°C, z wy¬ dajnoscia 82°/o.W analogiczny sposób otrzymuje sie: 7-in-propyloksyizoflawon o temperaturze topnienia 163°C, 7-in-amyloksyizoflawon o temperaturze topnienia 142°C. m Przyklad II. 1 g 7-izobutyloksy-2-hydro- ksyizoflawonu ogrzewa sie w ciagu 3—5 godzin w temperaturze 100—150°C. Po oziebieniu otrzy¬ muje sie 7-izobutoksyizoflawon o temperaturze topnienia 87—89°C, z wydajnoscia 80%.W analogiczny sposób otrzymuje sie: 7-(4-chlorobenzyloksy)-izoflawon o temperaturze topnienia 182—184°C, Zwiazek kontrolny 7-Etoksy-izoflawon 7-Izopropoksyizofla- won Kontrola 7-(2-Oktyloksy)-izo- flawon 7-Heksa'decyloksyizo- flawon Kontrola Liczba zwierzat sztuk Wiek zwie¬ rzat na po¬ czatku bada¬ nia dni 3 3 3 Czas ba¬ dania ty¬ godni 4 4 4 Waga po¬ czatkowa g 41 42 41 112 112 113 Waga kon¬ cowa prze¬ cietna g 353 374 343 1023 1020 1001 Zmiana wa¬ gi kontrola % +6 +9 — .+2,2 • +2,2 , — Wykorzysta¬ nie karmy % 95 93 — 98,5 I 98,6 —: Ponizsze wyniki badan klinicznych dotycza* dzia¬ lania 7-izopropok'syizofIawonu (zwiazek o wzorze i.l, w którym Ra, R8 i R4 oznaczaja atomy wodoru, a R5izopropyl). ^ 50 Substancje czynna podawano pacjentom w po¬ staci tabletek, zawierajacych 300 mg 7-izopropo- ksyizoilawonu, 3 razy dziennie po jednej tablet¬ ce. Po jednym miesiacu podawania zwiazek wy¬ leczyl rozmieknienie kosci oraz wtórne rozmiek- 55 nienie kosci spowodowane przedJluzonym podawa¬ niem srodków przeciwepileptycznych. 7-izopropoksyizoflawon jest uzyteczny w leczeniu chorób serca, w których symptomy i dolegliwo¬ sci byly spowodowane niedotlenieniem krwi. Popra- 60 wa ma miejsce po podawaniu tabletek pirzez 8— —10 dni przedluza sie na nastepne 8—10 dni po zaprzestaniu zazywania leku. U pacjentów cho¬ rych na Angina pectorjs zmniejsza spontaniczne zapotrzebowanie Nitrominy. Po leczeniu zwieksza 65 7-izopropoksyizoflawon 115—117°C. o temperaturze topnienia PL PL PL PL PL PL PL