PL220850B1 - Kopolimer dwublokowy, kompozycja zawierająca składnik aktywny i jej zastosowanie oraz sposób jej wytwarzania - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są nowe samoemulgujące kopolimery dwublokowe i nowe samoemulgujące kompozycje zawierające składnik aktywny i kopolimer dwublokowy, charakteryzujące się tym, że kopolimer dwublokowy jest ciekły w temperaturze poniżej 50°C, a kompozycja jest bezwodna i ciekła w temperaturze poniżej 50°C.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kopolimer dwublokowy, kompozycja zawierająca składnik aktywny i jej zastosowanie oraz sposób jej wytwarzania. Nowe kopolimery dwublokowe mają właściwości samoemulgujące. W związku z powyższym, kompozycje według wynalazku zawierające te kopolimery znajdują zastosowanie do podawania leków słabo rozpuszczalnych w wodzie.

Mikroemulsję można określić według Danielsson'a i Lindman'a (Colloid Surf., 33911981) jako optycznie izotropowy i termodynamicznie trwały, przezroczysty do półprzezroczystego (wymiar kropli fazy rozproszonej, zazwyczaj <140 nm) układ ciekły zawierający co najmniej trzy następujące składniki: woda (faza polarna), olej (faza niepolarna) i amfifilowy surfaktant, tj. surfaktant zawierający część hydrofilową i hydrofobową. W celu zwiększenia trwałości mikroemulsji można także dodać współsurfaktant. Cząsteczki surfaktantu, także cząsteczki współsurfaktantu, gdy występują, organizują się same na granicy faz olej/woda, tym samym stabilizując układ mikroemulsji. W przypadku mikroemulsji farmaceutycznych, układ zawiera kolejny składnik, tj. lek.

Z farmaceutycznego punktu widzenia, szczególnie mikroemulsje typu olej w wodzie mogą odgrywać rolę jako podłoża uwalniające lek. W tych mikroemulsjach typu olej w wodzie, faza olejowa stanowi fazę rozproszoną (wewnętrzną) i faza wodna stanowi fazę ciągłą (zewnętrzną). Wiele słabo rozpuszczalnych w wodzie cząsteczek leku można wprowadzać do niepolarnej, wewnętrznej fazy olejowej lub warstwy surfaktantu, tworzących granicę faz olej-woda. W ten sposób można zwiększyć rozpuszczalność leku w porównaniu z czystą wodą, a w konsekwencji także biodostępność leku. Mikroemulsje woda/olej, w których woda jest fazą wewnętrzną, a olej stanowi fazę zewnętrzną, są mniej korzystne dla podawania doustnego lub pozajelitowego, ponieważ faza olejowa jako faza ciągła, zewnętrzna może być przyczyną nieprzyjemnego smaku i mikroemulsje woda/olej są destabilizowane w znacznie większym stopniu kiedy są rozcieńczone przez fazę wodną (np. przy doustnym lub pozajelitowym podawaniu). Mikroemulsje farmaceutyczne są zazwyczaj przeznaczone dla doustnego, pozajelitowego i miejscowego podawania.

Samomikroemulgujące układy uwalniające lek (SMEDDS) mogą być opisane jako optycznie izotropowy układ oleju, surfaktantu i leku, który tworzy mikroemulsję typu olej/woda przy delikatnym zmieszaniu w obecności wody, np. w obecności płynów żołądkowo-jelitowych po podaniu doustnym. SMEDDS dla podania farmaceutycznego można więc rozważyć jako koncentrat, który jest szybko rozpraszany po wprowadzeniu do organizmu z wytworzeniem mikroemulsji typu olej w wodzie. Przykładem farmaceutycznych SMEDDS jest Neoral® (Novartis AG, Basel, Szwajcaria), który stanowi izotropową mieszankę składników takich jak surfaktant, trójgliceryd o łańcuchu średniej długości i cyklosporyna A.

Zamiast typowych cząsteczek surfaktantu, do tworzenia mikroemulsji można także stosować amfifilowe kopolimery dwublokowe. Amfifilowe kopolimery dwublokowe same organizują się na granicy olej/woda, tym samym część hydrofobowa kopolimerów zwraca się w kierunku fazy olejowej, podczas gdy część hydrofilowa zwraca się w kierunku fazy wodnej. W ten sposób amfifilowe kopolimery blokowe stabilizują układ mikroemulsji, porównywalnie do typowych surfaktantów. Zaletę kopolimerów dwublokowych w stosunku do typowych surfaktantów stanowi względna łatwość dostosowania właściwości fizykochemicznych.

Oprócz zastosowania w mikroemulsjach, amfifilowe kopolimery blokowe można także stosować w celu przygotowania wodnych roztworów micelarnych. Po wprowadzeniu do wody, kopolimery same asocjują z wytworzeniem miceli polimerycznych. Te micele polimeryczne można rozważać jako struktury składające się z jądra i otoczki, wewnętrzne jądro składa się z części hydrofobowej cząsteczki kopolimeru blokowego i otoczki lub korony, utworzonej przez część hydrofilową cząsteczki kopolimeru. Rozmaite leki o właściwościach hydrofobowych można wprowadzić do jądra miceli, umożliwiając im rozpuszczenie w środowisku wodnym. Można w ten sposób zwiększyć rozpuszczalność i biodostępność leków słabo rozpuszczalnych w wodzie.

Powstawanie roztworów wodnych miceli zawierających lek nie jest bezpośrednie. Zwykłe dodanie leku i amfifilowego kopolimeru blokowego do wody nie musi powodować powstawania miceli lub wprowadzenia leku w dużym stopniu do miceli. Do fizycznego zamknięcia leków w micelach polimerycznych na ogół stosuje się skomplikowane lub czasochłonne metody. Obejmują one:

a) mieszanie: lek dodaje się do wodnego roztworu amfifilowego kopolimeru blokowego i miesza się w dłuższym okresie czasu w celu wprowadzenia leku do miceli;

PL 220 850 B1

b) ogrzewanie: lek dodaje się do wodnego roztworu amfifilowego kopolimeru dwublokowego i miesza się przez pewien czas w podwyższonych temperaturach (np. 50 do 120°C). Roztwór później ochładza się do temperatury pokojowej, mieszając w celu wytworzenia roztworu micelarnego zawierającego lek;

c) działanie ultradźwiękami: lek można wprowadzić do miceli polimerycznych, poddając roztwór micelarny, do którego wprowadza się lek, działaniu ultradźwięków. Po działaniu ultradźwiękami, roztwór miesza się w temperaturze pokojowej, co prowadzi w efekcie do otrzymania roztworu micelarnego zawierającego lek;

d) odparowanie rozpuszczalnika: lek rozpuszcza się w lotnym organicznym rozpuszczalniku i dodaje się do wodnego roztworu amfifilowego kopolimeru blokowego. Organiczny rozpuszczalnik odparowuje się później poprzez mieszanie roztworu. Lek nie wprowadzony w ten sposób do miceli, można usunąć przez filtrację;

e) dializę: lek i kopolimer blokowy rozpuszcza się w organicznym rozpuszczalniku i mieszaninę później dializuje się wobec wody. Gdy organiczny rozpuszczalnik jest stopniowo zastępowany przez wodę, hydrofobowe części kopolimeru blokowego asocjują z wytworzeniem struktur micelarnych, wprowadzając tym samym lek do jąder. Gdy dializę prowadzi się jeszcze przez dłuższy okres, można zapewnić całkowite usunięcie organicznego rozpuszczalnika. Alternatywnie, wodę można także dodać kroplami do roztworu leku i amfifilowego kopolimeru blokowego w organicznym rozpuszczalniku. W celu usunięcia organicznego rozpuszczalnika, roztwór micelarny zawierający kopolimer i lek można na koniec zdializować wobec wody.

Obecnie stwierdzono, że w przypadku stosowania kompozycji według wynalazku, roztwory micelarne zawierające lek o zadowalającej zawartości leku można wytworzyć bez potrzeby ogrzewania lub ogrzewania we względnie niskiej temperaturze, tj. poniżej temperatury 50°C, bez potrzeby stosowania organicznych rozpuszczalników, skomplikowanych lub czasochłonnych sposobów wytwarzania. Jest to zadowalające z przemysłowego punktu widzenia. Polimery/kompozycje według wynalazku są samoemulgujące, oznacza to, że samorzutnie tworzą po łagodnym mieszaniu micele/micele zawierające lek, gdy dodaje się je do wodnego środowiska. Kompozycje według wynalazku można właściwie rozważać jako mikroemulsje polimeryczne, w szczególności jako koncentraty aktywnego składnika i kopolimeru dwublokowego, porównywalne do SMEDDS, jak opisano tu powyżej z tą różnicą, że funkcję oleju i surfaktantu obecnie łączy kopolimer dwublokowy.

Ponieważ polimery/kompozycje według wynalazku mogą zapewniać zwiększenie zawartości leku w roztworach micelarnych, można je stosować w celu zwiększenia rozpuszczalności, a zatem biodostępności słabo rozpuszczalnych w wodzie leków. Stanowi to ważną cechę z farmaceutycznego punktu widzenia. Wiele związków leczniczych, posiadających pożądane terapeutyczne właściwości, stosuje się nieefektywnie z uwagi na ich słabą rozpuszczalność w wodzie. Tak więc, np. w przypadku gdy takie związki podaje się doustnie, tylko mała część leku dostaje się do krwi podczas przejścia przez przewód żołądkowo-jelitowy. W rezultacie, aby osiągnąć odpowiednie wchłanianie leku konieczne może być stosowanie związku leczniczego w dużych dawkach, w celu przedłużenia okresu podawania leku lub częste podawanie związku leczniczego. Rzeczywiście, słaba rozpuszczalność, a zatem słaba biodostępność leku może być przyczyną zastosowania alternatywnego leku, który może dawać efekty niepożądane lub wymaga inwazyjnego sposobu podawania (np. drogą iniekcji lub wlewu), zamiast zastosowania słabo rozpuszczalnego leku.

Hagan i in. (Langmuir, 12, 2153-2161 (1996)), ujawniają kopolimery polilaktydu (PLA) i poli(glikolu etylenowego) (PEG). Kopolimery te opisuje się jako bezpośrednio dyspergujące w środowisku wodnym. Jednakże, w celu przygotowania klarownych wodnych dyspersji, kopolimery PEG-PLA rozpuszcza się w wodzie, a uzyskany układ kopolimer/woda utrzymuje się w temperaturze pokojowej przez kilka godzin, sporadycznie wytrząsając. Dwa leki modelowe wprowadza się do wymienionych roztworów micelarnych PEG-PLA przez dodanie organicznych roztworów tych leków do wodnych dyspersji lub przez sonikowanie dyspersji PEG-PLA/lek.

EP-B-0166596 opisuje kopolimery samodyspergujące. Kopolimery stają się samodyspergujące na drodze liofilizacji wodnych dyspersji tych kopolimerów. EP-B-0166596 także dotyczy produktu stały kopolimer/proszek zawierającego lek, który otrzymuje się metodą liofilizacji wodnej dyspersji samodyspergującego kopolimeru, otrzymanego jak opisano powyżej, i leku.

Zhang i in. (Int. J. Pharm. 132, 195-206 (1996)) opisują stałą matrycę taksol/poli(DL-laktyd-co-metoksy poli(glikol etylenowy) (PDLLA-MePEG) otrzymaną przez odparowanie roztworu taksolu i PDLLA-MePEG w acetonitrylu. W celu wytworzenia roztworu micelarnego zawierającego taksol,

PL 220 850 B1 wstępnie ogrzewano stałą matrycę taksol/PDLLA-MePEG, następnie dodano wodę w temperaturze około 60°C i mieszano z wytworzeniem klarownego roztworu micelarnego.

Matsuda i in. (Macromolecules (2000), 33, 795-800) ujawniają ciekłe biodegradowalne kopolimery ε-kaprolaktonu i węglanu trimetylenu wytworzone metodą polimeryzacji z otwarciem pierścienia zapoczątkowaną przez glikol trimetylenowy, trimetylopropan, pentaerytrytol lub diglicerol-poli(eter glikolu etylenowego). Wymienione kopolimery są później poddawane derywatyzacji z zastosowaniem kumaryny przy ich końcowej grupie hydroksylowej w celu wytworzenia fotoutwardzalnych, biodegradowalnych polimerów z zabezpieczoną na końcu kumaryną.

Zgłoszenie EP-B-0711794 dotyczy ciekłych, nadających się do wstrzykiwania kopolimerów do odtwarzania miękkiej tkanki i jej powiększania. Przedstawione przykładowe kopolimery syntetyzuje się stosując reakcję polimeryzacji z otwarciem pierścienia z ε-kaprolaktonem, L-laktydem, para-dioksanonem lub węglanem trlmetylenu zapoczątkowywaną z zastosowaniem glicerolu, 1-dodekanolu lub glikolu propylenowego.

Zgłoszenie EP-B-0411545 dotyczy kopolimerów bezładnych para-dioksanonu, laktydu i/lub glikolidu jako polimery pokrywających dla nici chirurgicznych. Przedstawione przykładowe kopolimery wytwarza się przez ogrzewanie inicjatorów, monomerów i katalizatorów przez pewien okres czasu. Jako inicjatory stosuje się glikol dietylenowy, mannitol, glicerol i kwas glikolowy.

Przedmiotem wynalazku jest kopolimer dwublokowy o wzorze A-B, w którym polimeryczny blok A oznacza liniowy, farmaceutycznie dopuszczalny eter monometylowy poli(glikolu etylenowego) o ciężarze cząsteczkowym poniżej 1000; a polimeryczny blok B stanowi polimer zawierający co najmniej dwa różne monomery, wybrane spośród takich jak ε-kaprolakton i węglan trimetylenu, charakteryzujący się tym, że kopolimer dwublokowy jest ciekły w temperaturze poniżej 50°C.

Korzystny jest kopolimer dwublokowy według wynalazku, w którym eter monometylowy poli(glikolu etylenowego) ma ciężar cząsteczkowy mieszczący się w zakresie >350 do <750.

Korzystny jest kopolimer dwublokowy według wynalazku, w którym eter monometylowy poli(glikolu etylenowego) ma ciężar cząsteczkowy równy 750.

Korzystny jest kopolimer dwublokowy według wynalazku, który ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 2000 do 10000, a zwłaszcza ciężar cząsteczkowy w zakresie od 2000 do 8000.

Szczególnie korzystny jest kopolimer dwublokowy według wynalazku, który ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 2500 do 7000.

Korzystny jest kopolimer dwublokowy według wynalazku, który jest ciekły w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37°C.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja zawierająca składnik aktywny, który stanowi terapeutycznie aktywną, trudno rozpuszczalną substancję organiczną lub nieorganiczną, która w czystej wodzie w temperaturze 21°C wymaga od 30, od 100, od 1000 lub od 10000 części wody do przeprowadzenia 1 części masowej substancji aktywnej do roztworu, i jeden lub wiele wyżej określonych kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B, która to kompozycja jest ciekła w temperaturze poniżej 50°C.

Korzystną odmianą jest wyżej określona kompozycja, która jest bezwodna.

Dalszym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzania wyżej określonej kompozycji, w postaci wodnego roztworu, który według wynalazku polega na tym, że składnik aktywny miesza się z jednym lub wieloma wyżej określonymi ciekłymi kopolimerami dwublokowymi o wzorze A-B, w temperaturze poniżej 50°C, a następnie mieszając dodaje się wodę w czasie co najwyżej 24 godzin.

Innym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzania wyżej określonej kompozycji, w postaci wodnego roztworu, który według wynalazku polega na tym, że

a) jeden lub wiele wyżej określonych kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B, miesza się z wodą w temperaturze poniżej 50°C, po czym

b) do wodnego polimerycznego roztworu otrzymanego w etapie a), podczas mieszania, dodaje się aktywny składnik, w czasie co najwyżej 24 godzin.

Dalszym aspektem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonej kompozycji do wytwarzania kapsułki lub roztworu do podawania drogą doustną ludziom lub zwierzętom wymagającym leczenia.

Innym aspektem wynalazku jest zastosowanie wyżej określonej kompozycji do wytwarzania roztworu do podawania pozajelitowego ludziom lub zwierzętom wymagającym leczenia.

A więc, przedmiotem wynalazku są kopolimery dwublokowe, składające się z liniowego hydrofilowego bloku polimeru i hydrofobowego bloku polimeru, przy czym wymienione kopolimery dwublokowe są ciekłe w temperaturze poniżej 50°C. Kopolimery mają właściwości samoemulgujące, samorzutnie tworzą roztwór micelarny w środowisku wodnym po łagodnym zmieszaniu. Nie ma potrzeby stoPL 220 850 B1 sowania surfaktantów, nadmiernego ogrzewania (wystarcza temperatura poniżej temperatury 50°C), organicznych rozpuszczalników, skomplikowanych lub czasochłonnych sposobów wytwarzania w celu przygotowania roztworów micelarnych. Także, wytwarzanie roztworów micelarnych zawierających lek z kopolimerów dwublokowych według wynalazku nie wymaga nadmiernego ogrzewania, organicznych rozpuszczalników, skomplikowanych lub czasochłonnych sposobów wytwarzania. Wynalazek dotyczy kopolimeru dwublokowego o wzorze A-B, w którym polimeryczny blok A oznacza liniowy farmaceutycznie dopuszczalny hydrofilowy polimer i polimeryczny blok B stanowi polimer zawierający monomery, wybrane spośród takich jak ε-kaprolakton i węglan trimetylenu lub ich mieszaniny charakteryzujące się tym, że kopolimer dwublokowy jest ciekły w temperaturze poniżej 50°C.

Polimer można rozważać jako cząsteczkę składającą się z kilku (co najmniej powyżej 2) powtarzających się jednostek monomerycznych. Ponieważ blok A, jak również blok B są polimerami, składają się z kilku jednostek monomerycznych połączonych ze sobą.

Polimeryczny blok B, jak opisano tu powyżej, składa się z monomerów takich jak ε-kaprolakton i węglan trimetylenu, przy czym ε-kaprolakton odpowiada 2-oksepanonowi, a węglan trimetylenu odpowiada 1,3-dioksan-2-onowi.

Ponieważ monomery hydrofobowego bloku polimeru B są połączone ze sobą wiązaniami estrowymi, polimeryczny blok B może być hydrolizowany w warunkach fizjologicznych, a zatem można rozważać go jako biodegradowalny. Zależnie od monomeru, polimeryczny blok B składa się z mieszaniny co najmniej dwóch różnych monomerów, których stosunek może zmieniać się od 99:1 do 1:99, najbardziej korzystny jest stosunek około 50:50.

Kopolimery te są ciekłe w temperaturze poniżej 50°C.

Polimer jest uważany za ciekły w temperaturze poniżej 50°C, gdy jego temperatura zeszklenia wynosi poniżej lub jest równa 50°C. Korzystne kopolimery według wynalazku są ciekłe w temperaturze ciała przedstawicieli gatunków, którym się je podaje, tj. 37°C dla zastosowania u ludzi. Polimer jest uważany za ciekły w temperaturze 37°C, gdy jego temperatura zeszklenia wynosi poniżej lub jest równa 37°C, korzystnie temperatura zeszklenia wynosi poniżej 37°C. Bardziej korzystne kopolimery według wynalazku są ciekłe w temperaturze pokojowej (20-25°C). Polimer uważa się za ciekły w temperaturze pokojowej, gdy jego temperatura zeszklenia wynosi poniżej lub jest równa temperaturze pokojowej, korzystnie temperatura zeszklenia wynosi poniżej temperatury pokojowej.

Niniejsze kopolimery dwublokowe można łatwo mieszać, np. po delikatnym zmieszaniu w wodnym środowisku samorzutnie powstają micele. Gdy polimery podaje się doustnie, mieszająco-przesuwające siły wywierane na nie przez przewód żołądkowo-jelitowy mogą wystarczać do powstania miceli in situ.

Chociaż niniejsze kopolimery charakteryzują się tym, że są ciekłe w temperaturze poniżej 50°C, podobne stałe kopolimery dwublokowe można stosować, o ile są samoemulgujące, umożliwiając przygotowanie roztworów micelarnych lub roztworów micelarnych zawierających lek bez konieczności stosowania surfaktantów, nadmiernego ogrzewania, organicznych rozpuszczalników, skomplikowanych lub czasochłonnych sposobów wytwarzania.

Gdy kopolimery lub bloki polimeru opisano jako liniowe, oznacza to, że kopolimery lub bloki polimeru składają się z prosto łańcuchowych (nierozgałęzionych) łańcuchów. Termin „liniowy” polimer/kopolimer jest dobrze znany w dziedzinie.

Korzystne rozwiązanie stanowi kopolimer dwublokowy, jak opisano powyżej, przy czym polimeryczny blok B zawiera monomery wybrane spośród takich jak ε-kaprolakton i węglan trimetylenu, w szczególności w stosunku około 50:50.

Hydrofilowy blok A polimeru stanowi eter monometylowy poli(glikolu etylenowego).

Interesujące rozwiązanie według wynalazku stanowi kopolimer dwublokowy o wzorze A-B, jak opisano powyżej, przy czym polimeryczny blok A stanowi poli(glikol etylenowy) lub jego pochodna, a zwłaszcza poli(glikol etylenowy) o wzorze R¹-(OCH2CH2)n-OH, w którym R¹ oznacza atom wodoru lub C1-20alkil, w szczególności C1-20alkil, a zwłaszcza C1-10alkil, szczególniej C1-4alkil i najszczególniej metyl; i n oznacza liczbę całkowitą większą niż 2, korzystnie 8 do 100, korzystniej 8 do 50, najkorzystniej 8 do 20. Najkorzystniejszy hydrofilowy polimer stanowi eter monometylowy poli(glikolu etylenowego).

Poli(glikol etylenowy) lub jego pochodną wybrano jako korzystny hydrofilowy polimeryczny blok A ze względu na jego biokompatybilność i nietoksyczność i szybkie usuwanie z organizmu.

PL 220 850 B1

Właściwości samoemulgujące niniejszych kopolimerów dwublokowych są bardziej wyraźne, gdy istnieje równowaga pomiędzy częścią hydrofilową i hydrofobową kopolimeru dwublokowego, dzięki czemu polimery można łatwiej mieszać stosując wodne środowisko.

Hydrofitowy polimeryczny blok A ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od >350 do <750, szczególnie poli(glikol etylenowy) lub jego pochodna o ciężarze cząsteczkowym w zakresie od >350 do <750, a w szczególności poli(glikol etylenowy) lub jego pochodna o masie cząsteczkowej 750. Korzystny jest eter metylowy poli(glikolu etylenowego) (także wskazany jako eter monometylowy poli(glikolu etylenowego)) o masie cząsteczkowej 550 lub 750. Najbardziej korzystny jest eter monometylowy poli(glikolu etylenowego) o masie cząsteczkowej 750.

Ponieważ polimery według wynalazku charakteryzują się tym, że są ciekłe w temperaturze poniżej 50°C, polimery o ograniczonej masie cząsteczkowej są korzystne. Szczególnym zainteresowaniem cieszą się kopolimery dwublokowe o wzorze A-B o masie cząsteczkowej w zakresie od 2000 do 100000, w szczególności o masie cząsteczkowej w zakresie od 2000 do 75000, a zwłaszcza o masie cząsteczkowej w zakresie od 2000 do 50000, szczególniej o masie cząsteczkowej w zakresie od 2000 do 25000, jeszcze szczególniej o masie cząsteczkowej w zakresie od 2000 do 20000, a zwłaszcza o masie cząsteczkowej w zakresie od 2000 do 15000, korzystnie o masie cząsteczkowej w zakresie od 2000 do 10000, korzystniej o masie cząsteczkowej w zakresie od 2000 do 8000, jeszcze korzystniej o masie cząsteczkowej w zakresie od 2500 do 7000.

Inny aspekt wynalazku dotyczy kompozycji zawierającej składnik aktywny i jeden lub więcej kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B, w którym polimeryczny blok A oznacza farmaceutycznie dopuszczalny hydrofilowy polimer i polimeryczny blok B stanowi polimer zawierający monomery, wybrane spośród takich jak ε-kaprolakton i węglan trimetylenu lub ich mieszaniny charakteryzujące się tym, że kopolimer dwublokowy jest ciekły w temperaturze poniżej 50°C i kompozycja jest ciekła w temperaturze poniżej 50°C. W szczególności, kompozycja jest bezwodna, to znaczy, że nie zawiera znacznych ilości wody lub roztworu wodnego. Tak więc, na ogół kompozycja korzystnie będzie w znacznym stopniu bezwodna, np. będzie zawierać do 3% masowych wody, korzystnie poniżej 1% masowych wody, i najkorzystniej poniżej 0,5% wody. Korzystnie, aktywny składnik nie jest kowalencyjnie związany z jednym lub więcej kopolimerów dwublokowych.

Przedmiotem wynalazku jest zwłaszcza kompozycja zawierająca farmaceutycznie aktywny składnik i jeden dowolny spośród kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B, opisanych tu powyżej. Korzystnie, kompozycja jest ciekła w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37°C.

„Ciekła kompozycja jest dobrze znana w dziedzinie.

Niniejsze kompozycje mogą zawierać, jak przedstawiono powyżej, jeden lub więcej kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B. Te kopolimery dwublokowe mogą być liniowe lub rozgałęzione. Tak więc, kompozycja zawierająca mieszaninę liniowych i rozgałęzionych kopolimerów dwublokowych także objęta jest zakresem wynalazku. Korzystnie, kopolimery dwublokowe występujące w niniejszych kompozycjach są liniowe.

W celu przygotowania kompozycji według wynalazku, aktywny składnik i jeden lub więcej kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B miesza się dokładnie, na przykład przez zwykłe zmieszanie. Korzystnie, aktywny składnik rozpuszcza się w ciekłym kopolimerze dwublokowym.

Chociaż niniejsze kompozycje charakteryzują się tym, że są ciekłe w temperaturze poniżej 50°C, nie wyłącza się podobnych stałych kompozycji, o ile są samoemulgujące, umożliwiając przygotowanie roztworów micelarnych zawierających lek bez konieczności stosowania surfaktantów, nadmiernego ogrzewania, organicznego rozpuszczalnika, skomplikowanych lub czasochłonnych sposobów wytwarzania.

Termin aktywny składnik obejmuje lek albo farmaceutycznie lub kosmetycznie aktywny składnik.

Przykłady aktywnych składników obejmują;

- leki przeciwbólowe i przeciwzapalne (leki należące do NLPZ, fentanyl, indometacyna, ibupr ofen, ketoprofen, nabumeton, paracetamol, piroksykam, tramadol, Inhibitory COX-2, takie jak celekoksyb i rofekoksyb);

- leki antyarytmiczne (prokainamid, chinidyna, werapamil);

- środki przeciwbakteryjne i przeciwpierwotniakowe (amoksycylina, ampicylina, penicylina benzatynowa, benzylopenicylina, cefaklor, cefadroksyl, cefprozyl, ester acetoksyetylowy cefuroksymu, cefaleksyn, chloramfenikol, chlorochina, cyprofloksacyna, clarytromycyna, kwas klawulanowy, klindamycyna, doksycyklina, erytromycyna, sól sodowa flukloksacyliny, halofantryna, izoniazyd, siarczan kanamycyny, linkomycyna, meflochina, minocyklina, sól sodowa nafcyliny, kwas nalidyksowy, neomyPL 220 850 B1 cyna, norfloksacyna, ofloksacyna, oksacylina, sól potasowa fenoksymetylopenicyliny, pirymetaminasulfadoksym, streptomycyna, N-[[(5S)-3-[4-(2,6-dihydro-2-metylopirolo[3,4-c]pirazol-5(4H)ylo)-3-fluorofenylo]-2-okso-5-oksazolidyny-lo]metylo]acetamid (Nazwa według klasyfikacji CA: 474016-05-2);

- antykoagulanty (warfaryna);

- antydepresanty (amitryptylina, amoksapina, butryptylina, klomipramina, dezypramina, dotiepina, doksepina, fluoksetyna, reboksetyna, aminaptine, selegilina, gepiron, imipramina, węglan litu, mianseryna, milnacypran, nortryptylina, paroksetyna, sertralina; 3-[2-[3,4-dihydrobenzofuro[3,2-c]pirydyn-2(1H)-ylo]etylo]-2-metylo-4H-pirydo[1,2-a]pirymidyn-4-on; 3-[[4-[(2E)-3-(4-fluorofenylo)-2-metylo-2-propenylo]-1-piperazynylo]metylo-3a,4-dihydro-7,8-dimetoksy-3H-[1]benzopirano[4,3-c]izoksazol[(3R,3aS)rel-(+)] (Nazwa według klasyfikacji CA: 452314-01-1);

- leki przeciwcukrzycowe (glibenklamid, metformina, (Z) 5-[[3-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-penta-metylo-2-naftalenylo)-4-(trifluorometoksy)fenylo]metyleno]-2,4-tiazolidynodion (Nazwa według klasyfikacji CA: 329215-18-1);

- leki antyepileptyczne (karbamazepina, klonazepam, etosuksimid, gabapentyna, lamotrygina, lewetiracetam, fenobarbiton, fenytoina, primidon, tiagabina, topiramat, valpromid, wigabatryna);

- środki przeciwgrzybiczne (amfoterycyna, klotrimazol, ekonazol, flukonazol, flucytozyna, grizeofulwina, itrakonazol, ketokonazol, azotan mikonazolu, nystatyna, terbinafina, worikonazol);

- leki antyhistaminowe (astemizol, cynaryzyna, cyproheptadyna, dekarboetoksyoratadyna, feksofenadyna, flunaryzyna, lewokabastyna, loratadyna, norastemizol, oksatomid, prometazyna, terfenadyna);

- leki przeciwnadciśnieniowe (kaptopril, enalapril, ketanseryna, lizynopril, minoksydyl, prazosyna, ramipril, rezerpina, terazosyna);

- środki przeciwmuskarynowe (siarczan atropiny, hjoscyna);

- środki antyneoplastyczne i antymetabolity (koordynacyjne związki platyny, takie jak cis platyna, karboplatyna lub oksaliplatyna; związki taksanu, takie jak paklitaksel lub docetaksel; inhibitory topoizomerazy I, takie jak związki kamptotecyny np. kamptotecyna-11 lub topotekan; inhibitory topoizomerazy II, takie jak przeciwnowotworowe pochodne podofilotoksyny np. etopozyd lub tenipozyd; przeciwnowotworowe alkaloidy Vinca, takie jak winblastyna, winkrystyna lub winorelbina; przeciwnowotworowe pochodne nukleozydowe, takie jak 5-fluorouracyl, gemcitabina lub capecitabine; środki alkilujące, takie jak iperyt azotowy lub nitrozomocznik np. cyklofosfamid, chlorambucyl, karmustyna lub lomustyna; przeciwnowotworowe pochodne antracyklinowe, takie jak daunorubicyna, doksorubicyna, idarubicyna lub mitoksantron; przeciwciała HER2, takie jak trastuzumab; antagoniści receptora estrogenowego lub selektywne modulatory receptora estrogenowego, takie jak tamoksifen, toremifen, droloksifen, fulwestrant lub raloksifen; inhibitory aromatazy, takie jak eksemestan, anastrozol, letrazol lub worozol; środki hamujące różnicowanie komórek, takie jak retinoidy, witamina D i środki blokujące metabolizm kwasu retinowego (RAMBA) np. akutan; inhibitory metylotransferazy DNA, takie jak azacytydyna; inhibitory kinazy np. flawoperidol, imatinib mezylan, gefitinib lub N3-[4-(amino sulfonylo)fenylo]-1-(2,6-difluorobenzoilo)-1H-1,2,4-triazolo-3,5-diamina (Nazwa według klasyfikacji CA: 443797-96-4); inhibitory farnezylotransferazy; inhibitory HDAC, takie jak krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, np. maślan, 4-fenylomaślan lub kwas walproinowy lub kwasy hydroksamowe np. suberoiloanilid kwasu hydroksamowego (SAHA), biarylohydroksamian A-161906, bicykliczne arylo-N-hydroksykarboksyamidy, pyroksamid, CG-1521, PXD-101, sulfonoamid kwasu hydroksamowego, LAQ-824, trichostatyna A (TSA), oksamflatyna, skryptaid, kwas m-karboksycynamonowy, kwas bishydroksamowy, lub trapoksyna - analog kwasu hydroksamowego lub cykliczne tetrapeptydy np. trapoxin, apidycyna lub depsypeptyd lub benzamidy np. MS-275 lub CI-994, lub depudecyna);

- leki przeciwmigrenowe (alnidytan, naratryptan, sumatryptan);

- leki stosowane w chorobie Parkinson'a (bromokryptyna mezylan, lewodopa, selegilina);

- leki antypsychotyczne, nasenne i uspakające (alprazolam, buspiron, chlordiazepoksyd, chlorpromazyna, clozapina, diazepam, flupentiksol, flufenazyna, flurazepam, 9-hydroksyrysperydon, lorazepam, mazapertyna, olanzapina, oksazepam, pimozyd, pipamperon, piracetam, promazyna, rysperydon, selfotel, serokwel, sertindol, sulpiryd, temazepam, tiotiksen, triazolam, trifluperidol, ziprasidon, zolpidem);

- środki stosowane w leczeniu udaru (lubeluzol, tlenek lubeluzolu, riluzol, aptyganel, eliprodil, remacemid);

- środki przeciwkaszlowe (dekstrometorfan, lewodropropizyna);

PL 220 850 B1

- środki przeciwwirusowe (acyklowir, ganciklowir, lovirid, tiwirapina, zydowudyna, lamiwudyna, zidowudyna + lamiwudyna, zidowudyna + larniwudyna + abaka wir, didanozyna, zalcitabina, stawu dyna, abaka wir, lopinawir, lopinawir + ritonawir, amprenawir, newirapina, efavirenz, delavirdyna, indinawir, nelfinawir, ritonawir, sachinawir, adefowir, hydroksymocznik, TMC 125, TMC 120, 4-[[4-[[4-(2-cyjanoetenylo)-2,6-dimetylofenylo]amino]-2-pirymidynylo]amino]benzonitryl);

- leki blokujące receptory beta-adrenergiczne (atenolol, karwedilol, metoprolol, nebiwolol, propanolol);

- środki działające inotropowo na mięsień sercowy (amrinon, digitoksyna, digoksyna, milrinon);

- kortykosteroidy (dipropionian beklometazon, betametazon, budezonid, deksametazon, hydrokortyzon, metyloprednizolon, prednizolon, prednizon, triamcynolon);

- środki dezynfekujące (chlorheksydyna);

- diuretyki (acetazolamid, frusemid, hydrochlorotiazyd, izosorbid);

- enzymy;

- olejki eteryczne (anetol, olejek anyżowy, olejek kminkowy, olejek kardamonowy, olejek cynamonowy chiński, cyneol, olejek cynamonowy, olejek goździkowy, olejek kolendry, olejek miętowy pozbawiony mentolu, olejek koprowy, olejek eukaliptusowy, eugenol, olejek imbirowy, olejek cytrynowy, olejek gorczycowy, olejek gorzkiej pomarańczy, olejek gałki muszkatołowej, olejek pomarańczy, olejek mięty pieprzowej, olejek szałwi, olejek mięty zielonej, terpineol, olejek tymiankowy);

- środki działające na układ żołądkowo-jelitowy (cymetydyna, cizapryd, klebopryd, difenoksylat, domperidon, famotydyna, lanzoprazol, loperamid, tlenek loperamidu, mesalazyna, metoklopramid, mozapryd, nizatydyna, norcizapryd, olsalazyna, omeprazol, pantoprazol, perprazol, prukalopryd, rabeprazol, ranitidyna, ridogrel, sulfasalazyna);

- środki hemostatyczne (kwas aminokapronowy);

- środki regulujące gospodarkę lipidową (atorwastatyna, lowostatyna, pravastatyna, probukol, simwastatyna);

- leki miejscowo znieczulające (benzokaina, lignokaina);

- opioidowe środki przeciwbólowe (buprenorfina, kodeina, dekstromoramid, dihydrokodeina, hydrokodon, oksykodon, morfina);

- leki parasympatykomimetyczne i przeciw demencji (AIT-082, eptastygmina, galantamina, metrifonat, milamelina, neostygmina, fizostygmina, tauryna, donepezil, riwastygmina, sabkomelina, talsaklidyna, ksanomelina, memantyna, lazabemid);

- peptydy i białka (przeciwciała, bekaplerminut, cyklosporyna, erytropoetyna, immunoglobuliny, insulina);

- hormony płciowe (estrogeny: sprzężone estrogeny, etynyloestradiol, mestranol, estradiol, estriol, estron; progestogeny; octan chlormadinonu, octan cyproteronu, 17-deacetylonorgestymat, dezogestrel, dienogest, dydrogesteron, dioctan etynodiolu, gestoden, 3-ketodezogestrel, lewonorgestrel, linestrenol, octan medroksyprogesteronu, megestrol, noretyndron, octan noretyndronu, noretysteron, octan noretysteronu, noretynodrel, norgestymat, norgestrel, norgestrienon, progesteron, octan chingestanolu);

- środki stymulujące, inhibitory fosfodiesterazy 5 (syldenafil; 3-(2,3-dihydro-5-benzofuranylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2-(2-pirydynylo)-9H-pirolo[3,4-b]chinolin-9-on, (3R) (Nazwa według klasyfikacji CA: 374927-41-0) lub jego sól monometanosulfonianowa; 3-(2,3-dihydro-5-benzofuranylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2-[5-(2-pirydynylo)-2-pirymidynylo]-9H-pirolo[3,4-b]chinolin-9-on, (3R) (Nazwa według klasyfikacji CA: 374927-06-7);

- środki rozszerzające naczynia (amlodypina, buflomedil, azotyn amylu, diltiazem, dipirydamol, triazotan glicerolu, diazotan izosorbidu, lidoflazyna, molsidomina, nicardypina, nifedypina, oxpentyfilina, pentaerytrytol tetraazotan);

ich N-tlenki, farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjnie z zasadami lub kwasami i ich stereochemicznie izomeryczne fo rm y.

Korzystnie, aktywny składnik zastosowany w kompozycjach według wynalazku może stanowić substancję organiczną lub nieorganiczną która jest nie więcej niż trudno rozpuszczalna, tj. który jest trudno rozpuszczalna, słabo rozpuszczalna, bardzo słabo rozpuszczalna, lub częściowo nierozpuszczalna w czystej wodzie w temperaturze 21°C (tj. wymaga od 30, od 100, od 1000 lub od 10000 części wody do przeprowadzenia 1 części masowej substancji aktywnej do roztworu).

Kompozycje według wynalazku można poddawać formulacji w różne farmaceutyczne postacie dawkowania do podawania.

PL 220 850 B1

Farmaceutyczna postać dawkowania zawiera kompozycję według wynalazku w terapeutycznie skutecznej ilości. Na przykład, niniejsze kompozycje można umieścić jako takie w odpowiednich kapsułkach, takich jak np. kapsułka żelatynowa. Kapsułka podawana doustnie rozpuszcza się w płynach żołądkowo-jelitowych i kompozycja zawierająca aktywny składnik i kopolimer dwublokowy tworzy roztwór micelarny zawierający lek po kontakcie z wodnym środowiskiem płynów żołądkowo-jelitowych i po łagodnym zmieszaniu w przewodzie żołądkowo-jelitowym. Niniejsze kompozycje można także umieścić w odpowiednim pojemniku, takim jak np. fiolka. Tuż przed podaniem, na przykład drogą pozajelitową lub doustną, kompozycję można rozcieńczyć odpowiednim rozcieńczalnikiem a następnie podać.

Jako kolejne odpowiednie postacie dawkowania, można wymienić wszystkie kompozycje stosowane zazwyczaj do podawania leków ogólnoustrojowo lub miejscowo.

W celu przygotowania farmaceutycznych postaci dawkowania, kompozycję według wynalazku, w skutecznej ilości, poddaje formulacji w farmaceutyczną postać dawkowania. Na przykład, kompozycje można łączyć w jednorodną mieszankę z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, które mogą mieć rozmaite postaci, zależnie od pożądanej postaci preparatu.

Pożądane są farmaceutyczne postacie dawkowania w odpowiednich jednostkowych postaciach dawkowania, szczególnie do podawania drogą doustną, doodbytniczą, transdermalną lub drogą iniekcji pozajelitowej. Np. do wytwarzania kompozycji doustnej postaci dawkowania, można stosować dowolny spośród zwykłych środków farmaceutycznych, takich jak np. woda, w przypadku ciekłych preparatów do podawania doustnego; lub stałe nośniki, takie jak skrobie, cukry, kaolin, rozcieńczalniki, środki poślizgowe, środki wiążące, środki rozsadzające itp. w przypadku proszków, pigułek, kapsułek i tabletek. Kapsułki lub doustne roztwory stanowią najkorzystniejsze doustne jednostkowe postacie dawkowania. Jak już wskazano powyżej, niniejsze kompozycje można także umieścić jako takie w kapsułkach.

W przypadku kompozycji parenteralnych, nośnik będzie zazwyczaj zawierać jałową wodę, co najmniej w dużej części, chociaż mogą występować inne składniki. Roztwory do wstrzykiwania można np. wytworzyć z zastosowaniem nośnika zawierającego roztwór soli, roztwór glukozy lub mieszaninę roztworu soli i glukozy.

Wynalazek także obejmuje, jak już wskazano powyżej, stałe lub ciekłe preparaty, które, zgodnie z zamiarem, przekształca się tuż przed użyciem, do postaci ciekłych lub rozcieńczonych preparatów.

W kompozycjach odpowiednich dla przezskórnego, transdermalnego podania, nośnik ewentualnie zawiera promotory wchłaniania i/lub odpowiedni środek zwilżający, ewentualnie połączony z odpowiednimi dodatkami w mniejszych proporcjach, o jakichkolwiek własnościach, które to dodatki nie będą wykazywać znaczącego działania szkodliwego na skórę. Wymienione dodatki mogą ułatwiać podawanie na skórę i/lub mogą ułatwiać wytwarzanie pożądanej kompozycji.

Kompozycje według wynalazku lub postacie dawkowania można także podawać drogą inhalacji lub wziewnie za pomocą metod i preparatów stosowanych w dziedzinie do podawania tą drogą. Tak więc, na ogół kompozycje lub postacie dawkowania można podawać do płuc w postaci roztworu. Każdy system rozwinięty dla dostarczania roztworów lub suchych proszków drogą inhalacji doustnej lub donosowej lub drogą wziewną jest odpowiedni dla podawania obecnych związków.

Postacie dawkowania można także stosować jako diagnostyczną postać dawkowania. Aktywny składnik niniejszych kompozycji może być znakowany i po podaniu może oddziaływać wzajemnie lub być wychwytywany przez określoną tkankę lub organ docelowy. Tym samym wzmacnia on obraz rentgenowski, rezonansu magnetycznego i ultradźwiękowy w tkance lub organie docelowym.

Zależnie od aktywnego składnika, niniejsze postacie dawkowania można także stosować jako preparaty kosmetyczne, na przykład, obejmują środki opóźniające starzenie, przeciwzmarszczkowe lub antyoksydacyjne. Można je także stosować jako środki przeciwsłoneczne.

Korzystnie, postacie dawkowania są odpowiednie dla doustnego, pozajelitowego lub przezskórnego podawanie, najkorzystniej doustnego lub pozajelitowego podawania.

Korzystnie, postać dawkowania stanowi wodny roztwór. Ponieważ kopolimery według wynalazku są samoemulgujące, wymieniony wodny roztwór można wytworzyć we względnie niskiej temperaturze, tj. poniżej temperatury 50°C, bez potrzeby stosowania organicznych rozpuszczalników, skomplikowanych lub czasochłonnych sposobów wytwarzania. Zatem, przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania wodnego roztworu zawierającego aktywny składnik i jeden lub więcej kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B, jak opisano tu powyżej, charakteryzujący się tym, że aktywny składnik miesza się z jednym lub więcej ciekłymi kopolimerami, tj. w temperaturze poniżej 50°C, doda10

PL 220 850 B1 je się następnie wodę i miesza się. Korzystnie, czas mieszania ograniczono do najwyżej 24 godzin. Także korzystne jest mieszanie aktywnego składnika z jednym lub więcej ciekłymi kopolimerami w temperaturze do 37°C, a najbardziej korzystne jest mieszanie w temperaturze pokojowej.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania wodnego roztworu zawierającego składnik aktywny i jeden lub więcej kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B, jak opisano tu powyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje etapy

a) mieszania jednego lub więcej kopolimerów z wodą w temperaturze poniżej 50°C, następnie

b) dodania aktywnego składnika do wodnego polimerycznego roztworu otrzymanego według punktu a), jednocześnie mieszając.

Korzystnie, czas mieszania ograniczono do najwyżej 24 godzin. Także korzystne jest mieszanie jednego lub więcej kopolimerów z wodą w temperaturze do 37°C, najbardziej korzystne jest mieszanie w temperaturze pokojowej.

Dokładne dawkowanie i częstość podawania zależy od użytego poszczególnego składnika aktywnego, pożądanego profilu uwalniania, poszczególnego stanu leczonego, zaawansowania leczonego stanu, wieku, masy i ogólnego fizycznego stanu poszczególnego pacjenta, jak również od innych leków przyjmowanych przez pacjenta, co jest dobrze znane w dziedzinie. Ponadto, oczywiste jest, że skuteczną dzienną dawkę można zmniejszyć lub zwiększyć zależnie od odpowiedzi leczonego pacjenta i/lub zależnie od oceny lekarza przepisującego postacie dawkowania według wynalazku.

Kompozycję według wynalazku może stosować do wytwarzania farmaceutycznej postaci dawkowania do podawania, zwłaszcza doustnego lub pozajelitowego ludziom lub zwierzętom wymagającym leczenia.

Kompozycję według wynalazku można stosować do wytwarzania farmaceutycznej postaci dawkowania, w szczególności do wytwarzania farmaceutycznej postaci dawkowania do zastosowania w metodzie leczenia lub metodzie diagnostycznej dla człowieka lub zwierzęcia (np. ssaka, gada lub ptaka), zwłaszcza dla doustnego lub pozajelitowego podawania ludziom lub zwierzętom wymagającym leczenia.

Tak więc, kompozycje według wynalazku znajdują zastosowanie w metodzie leczenia lub metodzie diagnostyki dla człowieka lub zwierzęcia (np. ssaka, gada lub ptaka), które to metody obejmują podawanie organizmowi terapeutycznie lub diagnostycznie skutecznej dawki kompozycji według wynalazku.

Postacią rynkową kompozycji według wynalazku jest opakowanie farmaceutyczne odpowiednie dla obrotu na rynku, obejmujące pojemnik, farmaceutyczną postać dawkowania opisaną powyżej, oraz informacje umieszczone na opakowaniu.

Wynalazek opisano szczegółowo w poniższych przykładach.

Wytwarzanie kopolimerów dwublokowych.

Kopolimery dwublokowe według wynalazku syntetyzowano metodą polimeryzacji z otwarciem pierścienia w obecności odpowiedniego katalizatora zgodnie ze sposobem opisanym w zgłoszeniu US 5653992 i zgłoszeniu US 5631015 (Bezwada i in.). Typowe katalizatory obejmują kaprylan cyny (II), tlenek antymonu, chlorek cyny, 2-etyloheksanonian cyny (II), tlenek dibutylocyny, izopropanolan glinu, izopropanolan itru, sód, potas, tert-butanolan potasu, tert-butanolan sodu itp. Korzystny katalizator stanowi kaprylan cyny II. Reakcję przeprowadza się w podwyższonej temperaturze w zakresie od 80°C do 180°C i czas reakcji może wynosić od kilku godzin do kilku dni, korzystnie pomiędzy 8 i 24 godzinami.

Wytwarzanie kopolimeru dwublokowego D1.1 (patrz tablica 1)

W kolbie reakcyjnej umieszczono 7,6 pmolowy roztwór kaprylanu cyny II w toluenie (0,33 M), 187,5 mmola węglanu trimetylenu (monomer), 187,5 mmola ε-kaprolaktonu (monomer) oraz eteru monometylowego PEG-550 (mmePEG550) (promotor) w stosunku molowym monomeru do promotora 13 do 1 i ogrzewano do temperatury 160°C przez 24 godziny. Po zakończeniu reakcji, polimer ogrzewano pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia nieprzereagowanego monomeru.

Charakterystyka kopolimerów dwublokowych

Skład polimeru i zawartość pozostałego monomeru zanalizowano metodą protonowego NMR. Tak więc, kopolimery rozpuszczono w półtoradeutero heksafluoroacetonie i deuterobenzenie lub deuterowanym chloroformie. Później określono widma z zastosowaniem spektrometru NMR Unity-Plus 400. Stosunek różnych monomerów w polimerze określa się przez całkowanie sygnału dla metylenu i metylu w zakresie 0 do 7,5 ppm i obliczając procent molowy każdego monomeru w polimerze ze

PL 220 850 B1 scałkowanej powierzchni pod sygnałem rezonansowym dla poszczególnych monomerów (forma spolimeryzowana i monomeryczna forma).

W celu określenia masy cząsteczkowej i polidyspersyjności polimerów stosowano chromatografię żelowopermeacyjną (GPC). Stosowano moduł rozdzielania Waters Alliance 2690 zaopatrzony w refraktometr Wyatt Optilab DSP, wielokątowy laserowy fotometr Dawn'a (Wyatt), oraz kolumny Waters Styragel HR 3-4. Do kalibracji, jako wzorzec stosowano polistyren. Jako rozpuszczalnik i fazę ruchomą w HPLC stosowano tetrahydrofuran lub heksafluoroizopropanol o stopniu czystości dla chromatografii.

Tablica 1 zawiera kopolimery dwublokowe wytworzone zgodnie ze sposobem opisanym powyżej. Wyniki wskazują, że synteza charakteryzuje się dobrą odtwarzalnością (patrz przykład D4.1, D4.3 i D4.4).

T a b l i c a 1: Właściwości fizykochemiczne kopolimerów dwublokowych (Wszystkie kopolimery są ciekłe w temperaturze poniżej 50°C)

Nazwa	Stosunek monomeru na początku polimeryzacji (mol/mol)	Stosunek monomeru w końcowym polimerze (mol/mol)	Czas reakcji (h)	Promotor	Mol. stos. Monomer/promotor	Mw	PD
D 1.1	CAP/TMC 50/50	50,1% CAP, 49,6% TMC	24	mmePEG 550	13 do 1	4641	2,1
D 1.2	CAP/TMC 50/50	49,3% CAP, 50,6% TMC	24	mmePEG 550	13 do 1	5504	1,92
D 1.3	CAP/TMC 50/50	49,3% CAP, 50,4% TMC	24	mmePEG 550	13 do 1	5507	1,43
D 1.4	CAP/TMC 50/50	48,9% CAP, 50,3% TMC	16	mmePEG 550	13 do 1	5045	1,77
D 1.5	CAP/TMC 50/50	49,0% CAP, 50,3% TMC	8	mmePEG 550	13 do 1	4926	1,90
D 1.6	CAP/TMC 50/50	49,1% CAP, 50,8% TMC	8	mmePEG 550	13 do 1	5046	1,79
D 2	CAP/TMC 50/50	48,5% CAP, 51,3% TMC	24	mmePEG 550	8 do 1	3285	1,82
D 4.1	CAP/TMC 50/50	49,8% CAP, 50,0% TMC	24	mmePEG 750	13,3 do 1	6162	1,97
D 4.2	CAP/TMC 50/50	48,9% CAP, 50,7% TMC	8	mmePEG 750	13,3 do 1	5274	1,79
D 4.3	CAP/TMC 50/50	49,3% CAP, 49,1% TMC	24	mmePEG 750	13,3 do 1	4815	1,91
D 4.4	CAP/TMC 50/50	49,1% CAP, 50,7% TMC	24	mmePEG 750	13,3 do 1	5249	1,76
D 5	CAP/TMC 50/50	49,0% CAP, 50,8% TMC	8	mmePEG 750/mmePEG 550 (1/3)	13,3 do 1	5075	1,80
D 6	CAP/TMC 50/50	48,6% CAP, 51% TMC	24	mmePEG 2000	13,3 do 1	6500	1,9

D = kopolimer dwublokowy; CAP = ε-kaprolakton; TMC = węglan trimetylenu; PEG = poli(glikol etylenowy); mmePEG = eter monometylowy poli(glikolu etylenowego); PD = polidyspersyjność; Mw = średnia masa cząsteczkowa; PD i Mw określono metodą

GPC. Stosunki monomerów w otrzymanym polimerze określono metodą ¹H-NMR.

Charakterystyka wodnych roztworów micelarnych kopolimerów dwublokowych

Zbadano wodne roztwory kopolimerów dwublokowych. Ponieważ kopolimery dwublokowe mają być stosowane ze względu na ich właściwości samoemulgujące, tj. ich zdolność do samorzutnego

PL 220 850 B1 tworzenia miceli w wodzie. Określono wymiary i kształt miceli, oraz krytyczne stężenie micelarne, tj. stężenie, przy którym tworzą się micele.

Wymiary miceli

Wymiary miceli w 100 mg/ml roztworach kopolimeru dwublokowego w wodzie określono metodą spektroskopii korelacji fotonów z zastosowaniem aparatu Coulter N4MD lub Malvern Autosizer 4700 w temperaturze 25°C.

Wyniki zebrano w tablicy 2. Wymiary samoagregujących struktur utworzonych przez dodanie wody do kopolimerów dwublokowych mieściły w zakresie 15 do 125 nm. Stwierdzono, że micele składające się z kopolimerów mających taki sam skład wyjściowy, lecz pochodzących z różnych serii (kopolimery D 4.1, D 4.3 i D 4.4, patrz tablica 1) mają bardzo podobne wymiary (zmienne pomiędzy 15 i 23 nm).

W celu określenia kształtu miceli, wykonano także badania za pomocą kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej (krio-TEM) (kopolimery D2 i D4.3). W tym celu wytworzono 10 mg/ml wodny roztwór polimeru. Umieszczono małą kropelkę roztworu na siatce stosowanej w TEM. Nadmiar roztworu usunięto za pomocą bibuły filtracyjnej w celu wytworzenia cienkiego filmu (< 100 nm). Próbkę następnie szybko zanurzono w kriogenicznym ciekłym etanie. Siatkę przeniesiono i umieszczono w ciekłym azocie na uchwycie krio-TEM, który umieszczono w aparacie TEM Philips CM12. Analizę przeprowadzono w temperaturze -172°C, przy napięciu 120 kV. Otrzymane w ten sposób zdjęcia wyraźnie ujawniały sferyczne struktury.

Określanie krytycznego stężenia micelarnego (CMC)

W celu określenia CMC kopolimerów dwublokowych, zmierzono napięcie powierzchniowe roztworów wodnych zawierających kopolimer dwublokowy w rosnących ilościach (10^-8 do 10^-3 g/ml) z zastosowaniem metody pierścieniowej (Du Noiiy tensometr) w temperaturze 37°C. Wartość napięcia powierzchniowego roztworów zmniejszała się ze wzrostem stężenia polimeru aż do osiągnięcia stałej wartości napięcia powierzchniowego, co wskazuje, że uzyskano CMC. CMC określono na przecięciu 2 linii regresji liniowej.

Wyniki zebrano w tablicy 2. Na podstawie tych wyników można wyciągnąć wniosek, że CMC jest dostatecznie niskie, aby zapewnić, jeśli na przykład podaje się doustnie 100 mg polimeru, stężenie w przewodzie żołądkowo-jelitowym na poziomie znacznie powyżej CMC kopolimeru, tak, aby polimer pozostał w formie micelarnej w przewodzie żołądkowo-jelitowym, co jest niezbędne dla zwiększenia rozpuszczalności podawanego jednocześnie leku słabo rozpuszczalnego w wodzie.

Trwałość miceli

W celu oceny zachowania się miceli niniejszych kopolimerów dwublokowych w płynie żołądkowym, wodne roztwory kopolimerów D 4.1 i D 4.2 zawierające rosnące ilości kopolimerów wytworzono w temperaturze 37°C przy pH 2 (pH ustalono stosując 0,1M roztwór HCl) i określono CMC.

CMC przy pH 2 i w temperaturze 37°C wynosiło 5.10^-5 g/ml dla D 4.1 i 4,1.10^-5 g/ml dla D 4.2. Te dane potwierdzają, że kopolimery mogą tworzyć micele w warunkach fizjologicznych.

Oceniono także wpływ stężenia jonowego na powstawanie miceli z polimerów D 1.6, D 4.2 i D 5. W roztworach 0,09%, 0,9% i 9% (masowo-objętościowych) NaCl polimery były w stanie wytworzyć micele. Określono także powstawanie miceli w 1% roztworze albumin, i w buforze FESSIF (bufor imitujący płyn jelitowy w stanie sytości) i buforze FASSIF (bufor imitujący płyn jelitowy w stanie głodu). Stwierdzono, że także w tych mediach polimery mogły wytworzyć micele. Bufory FESSIF i FASSIF są dobrze znane specjalistom.

Energia micelizacji

Użyte w kompozycjach kopolimery dwublokowe według wynalazku charakteryzują się właściwościami samoemulgującymi. W celu poparcia tego stwierdzenia, energię micelizacji oblicza się z krytycznego stężenia micelarnego w następujący sposób:

ΔG₀ = RT In X_Cmc

R = stała gazowa = 8,3143 J/K-mol

T = temperatura w °K

Xcmc = stężenie przy CMC we frakcji molowej

ΔG₀ = energia micelizacji w kJ/mol

Obliczone wartości energii micelizacji dla różnych kopolimerów zamieszczono w tablicy 2.

Ujemne wartości energii micelizacji wskazują, że micelizacja jest samorzutna (nie wymaga dodatkowej energii).

PL 220 850 B1

T a b l i c a 2: Fizykochemiczna charakterystyka wodnych roztworów kopolimerów dwublokowych

Polimer	Wymiar (nm)	CMC (metoda pierścieniowa) (g/ml)	Energia micelizacji (kJ/mol)
D 1.2	125	2,9· 10-5	-41,6
D 1.3	90	9,3· 10-5	-38,8
D 1.4	94	10'4	-38,2
D 1.5	92	5·10-4	-34
D 1.6	76	1,7·10-5	-43
D 2	31	6,3·10-5	-37,7
D 4.1	20	1,2·10-5	-42,9
D 4.2	20	1,3·10-5	-44,3
D 4.3	15	8,3·10-4	-32,7
D 4.4	23	1·10-5	-44,3
D 5	25	2,6·10-5	-41,7
D 6	85	5·10-5	-44,3

Badania rozpuszczalności słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w roztworach wodnych kopolimerów dwublokowych

Kompozycje według wynalazku są zdolne do wytworzenia roztworów micelarnych zawierających lek po dodaniu do wodnego środowiska. Określono zdolność obciążenia lekiem, zdolność do solubilizacji kompozycji według wynalazku.

Oceniono rozpuszczalność II klasy BCS (BioClassification System) związków modelowych w roztworach micelarnych: rysperydon, ketokonazol, hydrokortyzon, indometacyna, cyklosporyna, amfoterycyna B, TMC 120, TMC 125, 4-[[4-[[4-(2-cyjanoetenylo)-2,6-dimetylofenylo]amino-2-pirymidynylo]amino]benzonitryl, 3-[[4-[(2E)-3-(4-fluorofenylo)-2-metylo-2-propenylo]-1-piperazynylo]metylo]-3a,4-dihydro-7,8-dimetoksy-3H-[1]benzopirano[4,3-c]izoksazol [(3R,3aS)-rel-(+)] (Nazwa według klasyfikacji CA: 452314-01-1), N-[[(5S)-3-[4-(2,6-dihydro-2-metylopirolo[3,4-c]pirazol-5(4H)-ylo)-3-fluorofenylo]-2-okso-5-oksazolidynylo]metylo]acetamid (Nazwa według klasyfikacji CA: 474016-05-2), (Z) 5-[[3-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentametylo-2-naftalenylo)-4-(trifluorometoksy)fenylo]metyleno]-2,4-tiazolidynodion (Nazwa według klasyfikacji CA: 32921 5-18-1), N3-[4-(aminosulfonylo)fenylo]-1-(2,6-difluorobenzoilo)-1H-1,2,4-triazolo-3,5-diamina (Nazwa według klasyfikacji CA: 443797-96-4), monometanosulfonian 3-(2,3-dihydro-5-benzofuranylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2-(2-pirydynylo)-9H-pirolo[3,4-b]chinolin-9-onu, (3R); 3-(2,3-dihydro-5-benzofuranylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2-[5-(2-pirydynylo)-2-pirymidynylo]-9H-pirolo[3,4-b]chinolin-9-on, (3R) (Nazwa według klasyfikacji CA: 374927-06-7) wybrano jako związki modelowe.

Rozpuszczalność w wodzie tych leków przedstawiono w tablicy 3.

T a b l i c a 3: Rozpuszczalność w wodzie związków modelowych

Lek	Rozpuszczalność w wodzie* (mg/ml)
Rysperydon	0,060
Ketokonazol	0,010
Indometacyna	0,010
Hydrokortyzon	0,035
Cyklosporyna	0,001
Amfoterycyna B	0,0001

PL 220 850 B1 cd. tablicy 3

TMC 120 (4-[[4-[(21416-trimetylofenylo)amino]-2- -pirymidynylo]amino]benzonitryl	< 0,001
TMC 125 (4-[[6-amino-5-bromo-2-[(4- cyjanofenylo)amino]-4-pirymidynylo]oksy-3,5- -dimetylobenzonitryl)	< 0,001
4-[[4-[[4-(2-cyjanoetenylo0-2,6-dimetylofenylo]amino]--2-pirymidynylo]aminobenzonitryl	0,00002
3-[[4-[(2E)-3-(4-fluorofenylo0-2-metylo-2-propenylo]-1-piperazynylo]metylo-3a,4-dihydro-7,8-dimetoksy-3H-[1]benzopirano[4,3-c]izoksazol [(3R,3aS)-rel-(+)] (Nazwa według klasyfikacji CA: 452314-01-1)	0,003
N-[[(5S)-3-[4-(2,6-dihydro-2-metylopirolo[3,4-c]pirazol-5(4H)-ylo)-3-fluorofenylo]-2-okso-5-oksazolidyny lo]metylo]acetamid (Nazwa według klasyfikacji CA: 474016-05-2)	0,016
(Z) 5-[[3-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentametylo-2-naftalenylo)-4-(trifluorometoksy)fenylo]metyleno]-2,4-tiazolidynodion (Nazwa według klasyfikacji CA: 329215-18-1)	< 0,0005
N3-[4-(aminosulfonylo)fenylo]-1-(2,6-difluorobenzoilo)-1H-1,2,4-triazolo-3,5-diamina (Nazwa według klasyfikacji CA: 443797-96-4)	0,015
monometanosulfonian 3-(2,3-dihydro-5-benzofuranylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2-(2-pirydynylo)-9H-pirolo[3,4-b]chinolin-9-onu, (3R)	0,190
3-(2,3-dihydro-5-benzofuranylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2-[5-(2-pirydynylo)-2-pirymidynylo]-9H-pirolo[3,4-b]chinolin-9-on, (3R) (Nazwa według klasyfikacji CA: 374927-06-7)	< 0,001

* rozpuszczalność leku w wodzie zmierzono mieszając go w odpowiednich ilościach z wodą przez 24 godziny i zmierzono absorbancję roztworu metodą spektroskopii UV-VIS (Dane wyrażono jako średnie wartości z próbek w trzech powtórzeniach)

W celu pomiaru zdolności obciążenia lekiem dla ketokonazolu, rysperydonu, hydroksykortyzonu, indometacyny i cyklosporyny, mieszano lek w nadmiarze z kopolimerem w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, z zastosowaniem mieszadła magnetycznego. Następnie dodano wody aby osiągnąć stężenia polimeru 1, 3, 15, 10 lub 31,5% masowo-objętościowych (masa/objętość). Wodną mieszaninę lek-polimer mieszano przez 24 godziny. Zawiesinę przesączono następnie przez filtr membranowy 0,45 μm PVDF. Przesączony roztwór bezpośrednio rozcieńczono, aby umożliwić określanie stężenia leku.

Stężenie leku określono metodą spektroskopii UV-VIS (spektrometr UV-HP8453 KONTRON Uvikon 940, Hewlett Packard) wobec odnośnika zawierającego takie samo stężenie polimeru. Filtracja próbek zawierających kopolimer i lek poprzez filtr membranowy 0,45 μm PVDF (Milipore SLHV025LS) nie wywołała znaczącego zmniejszenia absorbancji.

Rozpuszczalność amfoteryczny B w 1 i 10% (masowo-objętościowych) wodnych roztworach polimeru D 4.1 określono następująco: 100 μl roztworu podstawowego amfoteryczny B (10 mg/ml w dimetylosulfotlenku) umieszczono w fiolce i rozpuszczalnik pozostawiono do odparowania. Dodano polimer (0,1 g odpowiednio 1 g) i mieszano przez 24 godziny. Dodano 10 ml ultra czystej wody w celu wytworzenia roztworu micelarnego i roztwór ten przesączono (0,45 μm). Ilość amfoteryczny B zmierzono spektrometrem UV HP8453 po rozcieńczeniu roztworów odpowiednim roztworem polimerycznym, aby otrzymać absorbancję pomiędzy 0,2 i 0,8.

Rozpuszczalność związków drugiego modelu w roztworach wodnych polimeru D 4.1 określono przez mieszanie związku modelowego bezpośrednio z roztworem polimerycznym przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Badane stężenia polimeru wynosiły 1, 5, 10 i 20% (masowoobjętościowych). Otrzymaną zawiesinę przesączono następnie przez filtr membranowy 0,45 μm

PL 220 850 B1

PVDF. Przesączony roztwór bezpośrednio rozcieńczono w celu umożliwienia określenia stężenia związku metodą spektroskopii UV. (Roztwór polimeru o takim samym stężeniu użyto jako odnośnik).

Rozpuszczalność rysperydonu, ketokonazolu, hydrokortyzonu, indometacyny, cyklosporyny i amfoterycyny B przedstawiono w tablicy 4A. Tablica 4B przedstawia wyniki otrzymane dla innych badanych związków.

T a b l i c a 4A: Rozpuszczalność rysperydonu, ketokonazolu, hydrokortyzonu, indometacyny, cyklosporyny i amfoterycyny B (mg/ml) w roztworach wodnych kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B. Rozpuszczalność określono w trzech powtórzeniach w temperaturze pokojowej

	Stężenia polimeru (% masowo-objętościowe)
ketokonazol	1%	3,15%	10%	31,5%
Polimer D 1.6	0,22	0,55	2,2	6,5
D 2	0,23	0,55	1,75	5,9
D 4.1	0,16	0,58	1,81	4,79
D 4.2	0,18	0,53	1,88	5,91
Rysperydon Polimer D 1.6	0,38	0,79	2,9
D 2	0,50	1,01	2,7	7,5
D 4.1	0,32	0,95	2,03	5,90
D 4.2	0,33	0,79	2,49	6,89
D 4.4	0,32	0,7	1,97
hydrokortyzon Polimer D 4.3	0,43	0,65	1,39
D 4.4	0,42	0,56	1,47
indometacyna Polimer D 4.3	0,36	1,23	3,7
cyklosporyna Polimer D 4.1	0,017	1,290	4,323
Amfoterycyna B Polimer D 4.1	0,02		0,04

T a b l i c a 4B: Rozpuszczalność badanych związków modelowych (mg/ml) w roztworach wodnych kopolimeru dwublokowego D 4.1. Rozpuszczalność określono w dwóch powtórzeniach w temperaturze pokojowej

Związek	Stężenia polimeru D 4.1 (% mas./obj)	Rozpuszczalność (mg/ml)
3-[[4-[(2E)-3-(4-fluorofenylo)-2-metylo-2-propenylo]-1piperazynylo]metylo]-3a,4-dihydro-7,8-dimetoksy-3H[1]benzopirano[4,3-c]izoksazol [(3R,3aS)-rel-(+)] (Nazwa według klasyfikacji CA: 452314-01-1)	1	0,200
5	1,010
10	1,880
20	3,860

PL 220 850 B1 cd. tablicy 4B

N-[(5S)-3-[4-(2,6-dihydro-2-metylopirolo[3,4-c]pirazol-5(4H)- ylo)-3-fluorofenylo]-2-okso-5-oksazolidynylo]metylo]acetamid (Nazwa według klasyfikacji CA:474016-05-2)	1	0,020
5	0,060
10	0,100
20	0,190
(Z) 5-[[3-(5,6,7,8-tetrahydro-3,5,5,8,8-pentametylo-2-naftalenylo)-4-(trifluorometoksy)fenylo]metyleno]-2,4- -tiazolidynodion (Nazwa według klasyfikacji CA: 329215-18-1)	1	0,034
5	0,130
10	0,350
20	0,580
N3-[4-(aminosulfonylo)fenylo]-1-(2,6-difluorobenzoilo)-1H- 1,2,4-triazolo-3,5-diamina (Nazwa według klasyfikacji CA: 443797-96-4)	1	0,530
5	2,710
10	5,760
20	13,890
Monometanosulfonian 3-(2,3-dihydro-5-benzofuranylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2-(2-pirydynylo)-9H-pirolo[3,4-b]chinolin9-onu, (3R)	1	4,370
5	9,830
10	12,380
20	13,950
3-(2,3-dihydro-5-benzofuranylo)-1,2,3,4-tetrahydro-2-[5-(2- -pirydynylo)-2-pirymidynylo]-9H-pirolo[3,4-b0chinolin-9-on, (3R) (Nazwa według klasyfikacji CA: 374927-06-7)	1	0,018
5	0,081
10	0,150
20	0,280
TMC125	1	0,06
5	0,3
10	0,52
20	0,87
4-[[4-[[4-(2-cyjanoetenylo)-2,6-dimetylofenylo]amino]-2- -pirymidynylo]amino]benzonitryl	1	0,12
5	0,12
10	0,23
20	0,44

Porównanie wartości przedstawionych w tablicy 4A i tablicy 4B z wartościami rozpuszczalności w wodzie (Tablica 3) wskazuje, że ko polimeryczne roztwory micelarne znacznie zwiększają rozpuszczalność w wodzie leków modelowych. Na przykład, rozpuszczalność hydrokortyzonu w roztworze zawierającym 1% kopolimeru D 4.3 wynosi 0,43 mg/ml podczas, gdy jego rozpuszczalność w wodzie wynosi 0,035 mg/ml. Oznacza to 12-krotne zwiększenie rozpuszczalności. Rozpuszczalność indomePL 220 850 B1 tacyny w 1% (masowo-objętościowych) wodnym roztworze polimeru wynosi D 4.3 wynosi 0,36 mg/ml. Jej rozpuszczalność w wodzie wynosi 0,01 mg/ml, a więc kopolimer zwiększył jej rozpuszczalność 36 razy.

Wyniki zebrane w tablicy 4A dla serii kopolimerów D 4 (D 4.1, D 4.3, D 4.4) wskazują na odtwarzalność zdolności solubilizacji tego samego polimeru otrzymanego w kolejnych seriach syntez.

Oceniono także wpływ stężenia polimeru na rozpuszczalność leków modelowych. Jak pokazano w tablicach 4A i 4B, rozpuszczalność prawie wszystkich leków rośnie liniowo ze wzrostem stężenia polimeru.

Tablice 4A i 4B także wskazują że rozsądne zawartości leku otrzymano bez zastosowania organicznych rozpuszczalników.

Zawartość leku (% masowy) obliczono następująco:

Masa rozpuszczoneao leku

-X-T-— -^xl0°

Masa polimeru

Zdolność zwiększania rozpuszczalności kopolimerów dwublokowych według wynalazku (jak opisano powyżej) w porównaniu z typowymi surfaktantami i środkami kompleksującymi, takimi jak Tween 20, Tween 80 i cyklodekstryna. Stwierdzono, że dla większości badanych związków, ilość leku solubilizowanego przez kopolimery według wynalazku była co najmniej dwa razy większa (zazwyczaj 20 do 50 razy większa) w porównaniu z ilością solubilizowaną przez typowe solubilizatory.

Ocena cytotoksyczności kopolimeru dwublokowego D 4.3 in vitro

Do stosowania do inkorporowania leków w zastosowaniach farmaceutycznych, kopolimery dwublokowe powinny być nietoksyczne.

Aby ocenić cytotoksyczność wobec nabłonka jelitowego, przeprowadzono klasyczny test MTT z zastosowaniem polimeru D 4.3 na monowarstwach Caco-2.

Test MTT opiera się na redukcji MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazoliowy) do niebieskiego formazanu przez enzym mitochondrialny, dehydrogenaza bursztynianowa w zdolnych do życia komórkach (Mosmann T, J Immunological Metody, 65, 55-63, 1983). 10⁴ komórki na studzienkę inkubowano w 96 studzienkach przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Później usunięto medium inkubacji i komórki następnie inkubowano przez 45 minut stosując 180 μl roztwór miceli w roztworze Krebs'a (0,1 g D 4.3/ml) w temperaturze 37°C. Po usunięciu roztworu dodano 180 μl świeżego medium (roztwór Krebs'a), jak również 25 μl MTT (1 g/l w PBS) do każdej studzienki. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C medium usunięto, dodano 25 μl bufor glicyny i następnie 100 μl sulfotlenki di metylu na studzienkę w celu rozpuszczenia niebieskiego formazanu i zmierzono absorbancję przy długości fali równej 490 nm. Test MTT także przeprowadzono w obecności negatywnej próby kontrolnej (medium) i pozytywnej próby kontrolnej (Brij 35).

Wyniki otrzymane dla roztworów zawierających kopolimer dwublokowy nie różniły się znacznie od negatywnej próby kontrolnej), wykazując, że kopolimer można rozważać jako nietoksyczny dla komórek Caco-2.

Test MTT przeprowadzono także z zastosowaniem miceli D 4.3 zawierających rysperydon lub ketokonazol, na leki niezwiązane i na inne kopolimery z tablicy 1. Otrzymane wyniki były podobne do opisanych powyżej.

Określanie biodostępności rysperydonu zawartego w kopolimerze D 4.3 in vivo.

Jako że, kompozycje według wynalazku można stosować do podawania doustnego lub pozajelitowego, sprawdzono czy doustnie podawane leki zawarte w kopolimerach według wynalazku mogą przejść poprzez barierę jelitową i barierę krew-mózg in vivo i dotrzeć do ich receptorów. W tym badaniu jako lek modelowy użyto rysperydonu, leku antypsychotycznego, który łączy się receptorami dopaminergicznymi D2. Receptory te są umieszczone głównie w korze skroniowej a dokładniej w prążkowniku i w gruczole przysadki mózgowej; prążkowie znajduje się po drugiej stronie bariery mózgowej. Test przeprowadzono z rysperydonem przenoszonym przez micele wytworzone z kopolimeru D 4.3. Podstawową zasadą użytej metody jest ilościowa ocena związania z receptorem metodą autora125 diografii z zastosowaniem radioliganda [¹²⁵I] (Langlois X, Te Riele P., Wintmolders C., Leysen J.E., Jurzak M, J Pharmacology and Exp Therapeutics, 299, 712-717, 2001).

Szczurom Wistar płci męskiej (~200 g) podano doustnie podłoża zawierające 2,5 mg/kg rysperydonu solubilizowanego w trzech różnych podłożach (0,625% objętościowo kwas winowy (jako odnośnik), kopolimer D 4.31% (masowo-objętościowych) roztwór w wodzie i D 4.3 10% (masowo-objętościowych) roztwór w wodzie). Zwierzęta uśmiercono przez dekapitację 2 godziny po podaniu.

PL 220 850 B1

Po dekapitacji, mózgi bezpośrednio usunięto z czaszki i szybko zamrożono w suchym lodzie (ochłodzony 2-metyloburan (-40°C)) przez około 2 minuty. Mózgi przechowywano w temperaturze -20°C przez co najmniej 24 godziny przed przeprowadzeniem sekcji.

Odcięto dwadzieścia czołowych części o grubości rzędu mikrometra z zastosowaniem kriomikrotomu Leica CM 3050 i umieszczono topiąc na przylegających szkiełkach mikroskopowych. Trzy sąsiadujące skrawki mózgowe od tego samego zwierzęcia umieszczono na jednym szkiełku. Do pomiaru całkowitego wiązania użyto dwa plastry mózgowe, a trzeci służył do oceny niespecyficznego wiązania. Części utrzymywano w temperaturze -20°C przez co najmniej 24 godziny przed inkubacją

125 z radioligandem ([¹²⁵I] iodosulpride, Amersham).

Wiązanie rysperydonu z receptorami D2 zmierzono w prążkowiu i gruczole przysadki mózgowej każdego szczura. Stosowano następującą ogólną procedurę: po rozmrożeniu, części osuszono w strumieniu zimnego powietrza. Nie przemyto części przed inkubacją po to, aby uniknąć dysocjacji kompleksu lek-receptor. Części mózgu i gruczołu przysadki mózgowej pobrane od zwierząt, którym podano lek i podłoże, inkubowano równolegle z radioligandem i rygorystycznie przestrzegano 10 minutowego czasu inkubacji. Po inkubacji, nadmiar radioliganda przemyto buforem oziębionym lodem, następnie szybko przepłukano zimną wodą destylowaną. Części następnie osuszono w strumieniu zimnego powietrza, umieszczono w światłoszczelnej kasecie zaopatrzonej w filmy Ektascan GRL (Kodak). Po ekspozycji, filmy wywołano w procesorze Kodak X-Omat.

Autoradiogramy określono ilościowo stosując MCID (MicroComputer Imaging Device), analizator obrazu Ml (Imaging research, St-Catharines, Ontario, Canada). Gęstości optyczne odniesiono do poziomów związanej radioaktywności po kalibracji analizatora obrazu z zastosowaniem jednostki gray, generowanej w wyniku wspólnej ekspozycji z przekrojami tkanek, dostępnych na rynku wzorców dla

125 polimerów ([¹²⁵I] Micro-scales, Amersham). Obliczono specyficzne wiązanie jako różnicę pomiędzy wiązaniem całkowitym i niespecyficznym. Znakowanie receptora ex vivo przez radioligand w częściach mózgowych zwierząt, którym podawano lek, wyrażono jako zawartość procentową znakowania receptora w odpowiedniej części mózgowej zwierząt, którym podawano podłoże. Ponieważ tylko niezwiązane receptory pozostają dostępne dla radioliganda, znakowanie receptora ex-vivo jest odwrotnie proporcjonalne do wiązania z receptorem przez lek podawany in vivo. Zawartości procentowe wiązania z receptorem leku podawanego zwierzęciu odpowiadają różnicy 100% i zawartości procentowej receptorów znakowanych u zwierzęcia.

W celu dotarcia do gruczołu przysadki mózgowej lek musi przekroczyć barierę jelitową i musi być przenoszony przez krew do gruczołu. Aby dotrzeć do prążkowia lek musi ponadto przejść barierę krew-mózg. Rysperydon podawano w podłożu odniesienia (kwas winowy) lub po solubilizacji w roztworze wodnym zawierającym 1% lub 10% kopolimeru D 4.3.

Otrzymane wyniki wskazywały, że rysperydon przenoszony przez roztwory kopolimeru lub przez roztwór odniesienia jest w stanie dotrzeć do receptorów D2 umieszczonych w gruczole przysadki mózgowej.

Aby dotrzeć do gruczołu przysadki mózgowej lek musi przekroczyć barierę jelitową i być przenoszony przez krew do gruczołu.

Otrzymane wyniki także wykazały, że rysperydon przenoszony przez roztwory kopolimeru lub roztwór odniesienia jest w stanie dotrzeć do receptorów D2 umieszczonych w prążkowiu. Aby dotrzeć do prążkowia lek musi przekroczyć barierę jelitową i ponadto musi przekroczyć barierę krew-mózg.

Wyniki te wskazują, że podawanie doustne rysperydonu w samoemulgującym kopolimerze D 4.3 nie wpływa na przejście tego leku przez barierę jelitową. Wykazują one także, że rysperydon, zawarty bądź nie w micelach, pokonał barierę krew-mózg i dotarł do receptorów.

Powyższe doświadczenie przedstawiono także w funkcji czasu dla roztworu odniesienia i dla 10% (masowo-objętościowych) wodnego roztworu D 4.3. Tak więc, zwierzęta uśmiercono przez dekapitację w 10 minucie, 30 minucie, 1 godzinie, 2 godzinie, 4 godzinie, 8 godzinie, 16 godzinie i 24 godzinie po podaniu preparatów rysperydonu. Oba preparaty wykazywały podobne wiązanie z receptorem D2 podczas pierwszych 8 godzin. W czasie trwania doświadczenia, określono zwykłe parametry farmakokinetyczne aktywnych metabolitów po podaniu doustnym dwóch roztworów rysperydonu metodą analizy LCMS próbek osocza. Stwierdzono, że AUC leku była niewiele większa, gdy lek solubilizowano w roztworze micelarnym według wynalazku. Dłuższy okres półtrwania i niższe Cmax, które określono dla roztworu micelarnego w porównaniu z roztworem odniesienia, sugerują, że micele polimeryczne mogą dostarczyć postać leku o przedłużonym uwalnianiu. Stwierdzenie to potwierdziło wyniki badania in vitro uwalniania rysperydonu z roztworu micelarnego według wynalazku. Badanie

PL 220 850 B1 uwalniania in vitro przeprowadzono dializując roztwór micelarny rysperydonu według wynalazku zawierający radioaktywny wobec wody i radioaktywność określono metodą zliczania z zastosowaniem ciekłej scyntylacji próbek pobranych z wody w funkcji czasu.

Wpływ inkorporowania amfoterycyny B w micelach według wynalazku na hemolizę spowodowaną przez lek.

Amfoterycyna B jest lekiem stosowanym w leczeniu grzybicy układowej. Jest ona słabo rozpuszczalna w wodzie jeśli była poddana formulacji z desoksycholanem (Fungizone®). Wiadomo, że amfoterycyna B indukuje hemolizę.

W celu określenia wpływu inkorporacji amfoterycyny B na hemolizę spowodowaną przez lek, porównano hemolizę spowodowaną przez lek w różnych stężeniach (0, 3, 6, 12, 18, 24 (pg/ml) poddany formulacji jako rozpuszczalny w wodzie preparat i inkorporowano w 10% roztworze micelarnym polimeru D 4.3. Próbki przygotowano następująco:

Preparat rozpuszczalny w wodzie: 50 mg Fungizone® (= amfoterycyna B 50 mg + desoksycholan sodu 41 mg + fosforan disodu i fosforan sodu 20,2 g) rozpuszczono w 10 ml wody do iniekcji (MiniFiasco®). Różne stężenia otrzymano przez rozcieńczenia tego roztworu izotonicznym PBS (pH 7,41).

Amfoterycyna B inkorporowana w 10% roztworze micelarnym polimeru D4.3. Roztwory przygotowano przez zmieszanie roztworu micelarnego wytworzonego w izotonicznym PBS przez jedną noc z amfoterycyną B (Sigma-Aldrich, badana hodowla komórkowa), którą otrzymano z roztworu dimetylosulfotlenku po odparowaniu.

Krwinki 3 szczurów otrzymano przez wkłucie dosercowe. Krew następnie odwirowano (2000 obrotów na minutę - 10 minut - 25°C) i usunięto supernatant. Krwinki rozcieńczono izotonicznym PBS aby otrzymać absorbancję pomiędzy 0,8 i 1 przy 100% hemolizie. 2,5 ml roztworu zawierającego krwinki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C po zmieszaniu z 2,5 ml różnych roztworów. Po odwirowaniu (2000 obrotów na minutę - 10 minut - 25°C), zmierzono absorbancję przy 576 nm. Wywołano całkowitą hemolizę wodnym roztworem hipoosmotycznym zawierającym 24 pg/ml Fungizone®. (Tasset i in. 1990). Procent hemolizy określono według następującego wzoru:

% hemolizy = 100 (abs-abs0)/(abs100-abs0) przy czym Abs = absorbancja próbki

Abs 100 = absorbancja przy 100% hemolizie

Abs 0 = absorbancja przy 0% hemolizie (Lavasanifar i in. 2002)

Stwierdzono, że gdy amfoterycyna jest zawarta w roztworze micelarnym, hemoliza była ograniczona do poniżej 5%, gdy stężenie amfoterycyny B wynosi do 12 pg/ml, podczas gdy Fungizone®, rozpuszczalny w wodzie preparat amfoterycyny B, wywoływał już 25% hemolizę przy stężeniu amfoterycyny B tak niskim jak 6 pg/ml. Tak więc, micelarna inkorporacja w micelach według wynalazku zmniejsza toksyczne działanie amfoterycyny B.

Na podstawie powyższych doświadczeń można wyciągnąć wniosek, że kompozycje według wynalazku stanowią obiecujące micelarne układy uwalniające substancję leczniczą dla słabo rozpuszczalnych w wodzie leków, szczególnie do podawania doustnego lub pozajelitowego. W porównaniu z istniejącymi kopolimerami dwublokowymi tworzącymi micele polimeryczne, niniejsze kopolimery mają zaletę samorzutnego tworzenia miceli w wodzie, micele te są trwałe w warunkach fizjologicznych. Nie jest wymagane nadmierne ogrzewanie i organiczne rozpuszczalniki, skomplikowane lub czasochłonne metody wytwarzania, aby wytworzyć micele lub wprowadzić do nich leki. CMC niniejszych kopolimerów jest dostatecznie niskie do stwierdzenia, że stężenie polimeru w przewodzie żołądkowo-jelitowym lub krwi pozostanie powyżej CMC po podaniu. Synteza kopolimerów jest odtwarzalna. Rozpuszczalność słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w roztworach wodnych niniejszych kopolimerów jest zwiększona w porównaniu z czystą wodą. Kopolimery są nietoksyczne dla komórek Caco-2. Doświadczenia z lekiem modelowym wykazały, że kopolimery nie mają znaczącego wpływu na biodostępność leku. Inkorporacja leku w micelach polimerycznych według wynalazku może zapewnić powolne, kontrolowane, przedłużone uwalnianie leku. Inkorporacja w niniejszych micelach może także zmniejszyć toksyczność inkorporowanego leku.

Claims (12)

1. I. Kopolimer dwublokowy o wzorze A-B, w którym polimeryczny blok A oznacza liniowy, farmaceutycznie dopuszczalny eter monometylowy poli(glikolu etylenowego) o ciężarze cząsteczkowym poniżej 1000; a polimeryczny blok B stanowi polimer zawierający co najmniej dwa różne monomery, wybrane spośród takich jak ε-kaprolakton i węglan trimetylenu, znamienny tym, że kopolimer dwublokowy jest ciekły w temperaturze poniżej 50°C.
2. 2. Kopolimer dwublokowy według zastrz. 1, znamienny tym, że eter monometylowy poli(glikolu etylenowego) ma ciężar cząsteczkowy mieszczący się w zakresie >350 do <750.
3. 3. Kopolimer dwublokowy według zastrz. 2, znamienny tym, że eter monometylowy poli(glikolu etylenowego) ma ciężar cząsteczkowy równy 750.
4. 4. Kopolimer dwublokowy według zastrz. 1-3, znamienny tym, że ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 2000 do 10000.
5. 5. Kopolimer dwublokowy według zastrz. 4, znamienny tym, że ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 2000 do 8000.
6. 6. Kopolimer dwublokowy według zastrz. 5, znamienny tym, że ma ciężar cząsteczkowy w zakresie od 2500 do 7000.
7. 7. Kopolimer dwublokowy według któregokolwiek z zastrz. 1-6, znamienny tym, że jest ciekły w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37°C.
8. 8. Kompozycja zawierająca składnik aktywny, który stanowi terapeutycznie aktywną, trudno rozpuszczalna substancję organiczną lub nieorganiczną, która w czystej wodzie w temperaturze 21°C wymaga od 30, od 100, od 1000 lub od 10000 części wody do przeprowadzenia 1 części masowej substancji aktywnej do roztworu, i jeden lub wiele kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B określonych w zastrz. 1-7, znamienna tym, że kompozycja jest ciekła w temperaturze poniżej 50°C.
9. 9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jest bezwodna.
10. 10. Sposób wytwarzania kompozycji jak określono zastrz. 8, w postaci wodnego roztworu, znamienny tym, że składnik aktywny miesza się z jednym lub wieloma ciekłymi kopolimerami dwublokowymi o wzorze A-B określonymi w zastrz. 1-7, w temperaturze poniżej 50°C, a następnie mieszając dodaje się wodę w czasie co najwyżej 24 godzin.

    II. Sposób wytwarzania kompozycji jak określono w zastrz. 8, w postaci wodnego roztworu, znamienny tym, że

    a) jeden lub wiele kopolimerów dwublokowych o wzorze A-B określonymi w zastrz. 1-7, miesza się z wodą w temperaturze poniżej 50°C, po czym

    b) do wodnego polimerycznego roztworu otrzymanego w etapie a), podczas mieszania, dodaje się aktywny składnik, w czasie co najwyżej 24 godzin.
11. 12. Zastosowanie kompozycji jak określono w zastrz. 8 albo 9 do wytwarzania kapsułki lub roztworu do podawania drogą doustną ludziom lub zwierzętom wymagającym leczenia.
12. 13. Zastosowanie kompozycji jak określono w zastrz. 8 albo 9 do wytwarzania roztworu do podawania pozajelitowego ludziom lub zwierzętom wymagającym leczenia.