PL199499B1 - Kompozycja o przedłużonym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem, jej sposób wytwarzania oraz zastosowanie, strzykawka wstępnie napełniona tą kompozycją oraz formulacje farmaceutyczne zawierające tę kompozycję - Google Patents

Abstract

Obecny wynalazek dotyczy kompozycji o przed lu zonym uwalnianiu, zeluj acej z opó znieniem, zawieraj acej a) biodegradowalny anionowy polisacharyd, b) srodek biologicznie czynny oraz c) co najmniej jeden zwi azany wielowarto sciowy jon metalu, która zgodnie z wynalazkiem cechuje si e tym, ze srodek biologicznie czynny zawiera protein e, a biodegradowalny anionowy polisacharyd jest es- trem alginianowym usieciowanym jonowo tworz ac nadaj acy si e do wstrzykiwania, biodegradowalny biokompatybilny hydro zel estru alginianowego. Korzystnie, biodegradowalny anionowy polisacharyd jest usieciowanym estrem alginianowym alkoholu jednowodorotlenowego. Wynalazek dotyczy tak ze sposobu wytwarzania powy zszej kompozycji, jej zastosowania do wytwarzania srodków do leczenia ró znorodnych stanów oraz formulacji farmaceutycznych zawieraj acych t e kompozycj e. Szczególnie korzystnie, kompozycja wed lug wynalazku oraz formulacje zawieraj ace kompozycj e wed lug wynalazku s a przed z zelowaniem wprowadzane do strzykawek i takie wst epnie nape lnione strzykawki s a równie z obj ete obecnym wynalazkiem. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Obecny wynalazek dotyczy kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóźnieniem, sposobu jej wytwarzania, jej zastosowania, strzykawki wstępnie napełnionej tą kompozycją oraz formulacji farmaceutycznych zawierających tę kompozycję. Kompozycja według wynalazku o powolnym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem zawiera biodegradowalny anionowy polisacharyd, środek biologicznie czynny oraz co najmniej jeden związany wielowartościowy jon metalu.

Stan techniki

Wraz z postępami w technologiach inżynierii genetycznej i komórkowej, dostępność protein rekombinacyjnych spowodowała rozwój wykorzystania protein jako środków leczniczych do zastosowań terapeutycznych. Wiele chorób lub stanów leczonych proteinami o działaniu farmaceutycznym wymaga stałych poziomów stężeń protein aby osiągnąć najbardziej skuteczny wynik terapeutyczny. Jednakże, w większości proteinowych środków farmaceutycznych, ze względu na generalnie krótkie okresy półtrwania biologicznego wymagane jest ich częste podawanie. Te powtarzane iniekcje są podawane w różnych odstępach czasowych, co prowadzi do fluktuacji poziomu leku, a jednocześnie stanowi znaczące fizyczne i finansowe obciążenie dla pacjentów. Ponieważ wiele stanów lepiej odpowiada na kontrolowane poziomy środka farmaceutycznego, istnieje potrzeba kontrolowanego uwalniania środka leczniczego i zapewnienia dłuższych okresów spójnego uwalniania. Takie środki lecznicze o powolnym uwalnianiu dałyby pacjentowi nie tylko lepsze wyniki profilaktyczne, terapeutyczne lub diagnostyczne, ale także obniżałyby częstotliwości iniekcji, jak również całkowite koszty.

Obecne próby utrzymywania poziomu leków u ludzi lub zwierząt pomiędzy dawkami objęły stosowanie polimerów biodegradowalnych jako matryc dla kontrolowania uwalniania środka leczniczego. Przykładowo, brytyjski opis patentowy nr 1,388,580 ujawnia zastosowanie hydrożeli do powolnego uwalniania insuliny. Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,789,550 ujawnia zastosowanie mikrokapsułek alginianowych pokrytych polilizyną do dostarczania proteiny przez otoczkowanie żywych komórek. W próbach dotyczących powolnego uwalniania wykorzystywano również anionowe lub kationowe kompozycje polimerowe otoczone polimerami jonowymi o przeciwnym ładunku do otoczkowania komórek zdolnych do wytwarzania kompozycji biologicznie aktywnych; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,744,933. Podobnie, ujawniono również wielowarstwowe powłoki z anionowych lub kationowych polimerów usieciowanych w charakterze środka do uzyskania kontrolowanego uwalniania; opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,690,682 oraz 4,789,516. Ponadto, dalsze próby ujawniają stosowanie samych alginianów lub alginianów powleczonych innymi polimerami biodegradowalnymi do kontrolowanego uwalniania kompozycji polipeptydowych lub ich osadów kationowych; opisy patentowe PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29664 i PCT WO 96/03116.

Powyższe próby nie dostarczyły jednak zadowalających środków zapewniających dostarczanie z powolnym uwalnianiem pożądanych proteinowych środków farmaceutycznych. Wiadomo ogólnie, że stosowanie pewnych polimerów biodegradowalnych, przykładowo ko-glikolidu polilaktydu, w warunkach in vivo, wykazuje wysokie początkowe uwalnianie środka leczniczego; Johnson, O. i wsp., Naturę Med., 2 (7): 795 (1996). Ponadto, wiadomo ogólnie, że proteiny stosowane z obecnymi formami preparatów o powolnym uwalnianiu mogą podlegać denaturacji i tracić swoją bioaktywność po wystawieniu na działanie czynników otoczkujących. Omawiane techniki preparatywne wykorzystują rozpuszczalniki organiczne, które mogą wykazywać szkodliwy wpływ na wybraną proteinę. W końcu, jak to jest omówione poniżej, zastosowanie samego alginianu nie zapewniło żądanego kontrolowanego uwalniania proteiny niezbędnego do osiągnięcia skutecznych wyników terapeutycznych.

Generalnie, alginiany są dobrze znanymi, występującymi naturalnie, polisacharydami anionowymi, złożonymi z połączonego w pozycji 1,4 kwasu β-D-mannuronowego i kwasu α-L-guluronowego; Smidsrod, O. i wsp., Trends in Biotechnol., 8: 71-78 (1990); Aslani, P. i wsp., J. Microencapsulation, 13 (5): 601-614 (1996). Typowo, skład alginianów waha się od 70% kwasu mannuronowego i 30% kwasu guluronowego, do 30% kwasu mannuronowego i 70% kwasu guluronowego; Smidsrod, jak wyżej. Kwas alginowy jest nierozpuszczalny w wodzie, podczas gdy sole utworzone z jonami jednowartościowymi takimi jak sód, potas i amon są rozpuszczalne w wodzie; McDowell, R.H., „Properties of Alginates” (London, Alginate Industries Ltd, 4th edition 1977). Wiadomo, że kationy wielowartościowe reagują z alginianami i samorzutnie tworzą żele.

Alginiany znalazły bardzo wiele różnorodnych zastosowań, między innymi jako dodatki do żywności, kleje, tabletki farmaceutyczne i materiały opatrunkowe do ran. Alginiany zalecano również

PL 199 499 B1 w technikach rozdzielania protein. Przykładowo, Gray, C. J. i wsp., w Biotechnology and Bioengineering, 31: 607-612 (1988) zatrzymywali insulinę w cynkowo/wapniowych żelach alginianowych w celu oddzielania insuliny od innych białek z surowic.

Również matryce alginianowe dokładnie opisano w zastosowaniu do układów dostarczania leku; patrz przykładowo opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,695,463, w którym ujawniono układ dostarczania w formie gumy do żucia opartej na alginianie oraz preparaty farmaceutyczne. Perełki alginianowe stosowano do kontrolowanego uwalniania różnych protein, takich jak receptor czynnika martwicy nowotworu w perełkach alginianu kationowego powlekanych polikationami; Wee, S. F., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 21: 730-731 (1994); transformujący czynnik wzrostu otoczkowany w perełkach alginianowych; Puolakkainen, P. A. i wsp., Gastroenterology 107: 13191326 (1994); czynniki angiogeniczne zatrzymane w perełkach alginianu wapnia; Downs, E. C. i wsp., J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albumina zatrzymana w mikrokapsułkach alginianowochitosanowych; Polk, A. i wsp., J. Pharmaceutical Sciences, 83(2): 178-185 (1994); perełki chitosanalginian wapnia pokryte polimerami; Okhamafe, A.O. i wsp., J. Microencapsul., 13(5): 497-508 (1996); hemoglobulina otoczkowana perełkami chitosan-alginian wapnia; Huguet, M. L. i wsp., J. Applied Polymer Science, 51: 1427-1432 (1994), Huguet, M. L. i wsp., Process Biochemistry, 31: 745-751 (1996) oraz interleukina-2 zamknięta w mikrosferach chitosanowo-alginianowych; Liu, L. S. i wsp., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995).

Układy stosujące perełki żelu alginianowego lub perełki żelu alginianu wapnia, do zatrzymywania protein mają wadę polegającą na braku jakiegokolwiek efektu powolnego uwalniania wskutek gwałtownego uwalniania proteiny z perełek alginianowych; Liu, L. i wsp., J. Control. Rel., 43: 65-74 (1997). Aby uniknąć takiego szybkiego uwalniania, w szeregu powyższych układach próbowano stosować powłoki polimerów polikationowych (przykładowo polilizyny, chitosanu), aby spowolnić uwalnianie proteiny z perełek alginianowych; patrz, przykładowo, Wheatley, M. A. i wsp., J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S. F. i wsp., jak wyżej; Liu, L. S. i wsp., jak wyżej; Wee, S.F. i wsp., Controlled Release Society, 22: 566-567 (1995) oraz Lim i wsp., jak wyżej.

Polikationy, takie jak polilizyna są dodatnio naładowanymi polielektrolitami, które oddziałują z ujemnie naładowanymi cząsteczkami alginianu tworząc kompleksy polielektrolitowe działające jako bariery dyfuzji na powierzchni perełek. Mogą występować następujące problemy związane ze stosowaniem polikationów: (1) preparaty takie mogą być cytotoksyczne z uwagi na polikationy; Huguet, M. L. i wsp., jak wyżej; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13: 269 (1992); Bergmann, P. i wsp., Clincial Science, 67: 35 (1984); (2) polikationy są podatne na utlenianie; (3) perełki z powłokami polikationowymi nie mają tendencji do rozpadu i wymywania i gromadzą się w organizmie; (4) takie preparaty wytwarza się poprzez pracochłonne procedury powlekania i obejmują wielowarstwowe polikationowe powłoki polilizynowe; Padol i wsp., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2: 216 (1986), oraz (5) oddziaływania jonowe między proteiną i polikationami mogą prowadzić do utraty aktywności protein lub powodować nietrwałość protein.

Francesco i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,336,668 (oraz przywoływane w nim odnośniki literaturowe) opisuje całkowite i częściowe estry kwasu alginowego wykonane w różnych procesach i wykazujące interesujące właściwości farmaceutyczne. Opisano, jak estry kwasu alginowego mogą być wykorzystane jako biodegradowalne materiały plastyczne do stosowania w chirurgii i medycynie; jako dodatki do szerokiego wachlarza materiałów polimerowych lub do wytwarzania różnych środków leczniczych. Potencjalnego zastosowania zestryfikowanych alginianów w preparatach o powolnym uwalnianiu nie omówiono, ani nie opisano hydrożeli z zestryfikowanych alginianów.

Nightlinger i wsp., Proceed. Inter. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22 738-739 (1995) opisują mikrosfery z zestryfikowanego kwasu hialuronowego (HA) wykazujące zdolność kontrolowanego uwalniania. Odnośniki literaturowe generalnie omawiają różne szybkości degradacji pochodnych HA i opisują jak ester „pęka” uwalniając alkohol i cząsteczki HA. Brak jest dyskusji, jak lub czy łańcuch główny HA sam rozpada się na jednostki polimerowe o mniejszym ciężarze cząsteczkowym.

Aby układ o powolnym dostarczaniu oparty na polisacharydzie był przydatny, polisacharyd musi być biodegradowalny do produktów nietoksycznych. Ustalono, że pewne alginianowe układy żelowe będąc skutecznymi w zapewnieniu powolnego uwalniania leku prowadzą do „wypuczenia” (lub buły) w miejscu iniekcji wskutek bardzo powolnego rozpraszania się żelu. W zastosowaniu terapeutycznym z użyciem małych dawek leku i przy nieczęstych iniekcjach może to nie być dużym problemem. Jednak w zastosowaniu terapeutycznym wymagającym wysokich dawek leku i częstszych iniekcji efekt

PL 199 499 B1 ten mógłby stanowić przeciwwskazanie. Należy opracować środki zwiększające szybkości rozchodzenia się żelu alginianowego z miejsca iniekcji.

Istnieje zatem nadal potrzeba opracowania preparatów farmaceutycznych, które osiągnęłyby dogodniejsze i skuteczniejsze parametry powolnego uwalniania do zastosowań klinicznych. Liczne proteiny rekombinacyjne lub naturalne mogłyby zyskać na stałym, długotrwałym uwalnianiu zapewniającym lepsze wyniki kliniczne.

Obecny wynalazek zapewnia takie rozwiązanie. Preparaty farmaceutyczne oparte na biodegradowalnych kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóźnieniem - według obecnego wynalazku, są zdolne zapewnić zwiększoną biodostępność, ochronę protein, zmniejszenie degradacji i powolne uwalnianie przy zwiększonej trwałości i skuteczności protein. Takie kompozycje według obecnego wynalazku zapewniają proste, szybkie i niekosztowne środki kontrolowanego uwalniania protein rekombinacyjnych w celu uzyskania skutecznych wyników profilaktycznych, terapeutycznych lub diagnostycznych.

Istota wynalazku

Kompozycja o przedłużonym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem, zawierająca:

a) biodegradowalny anionowy polisacharyd

b) środek biologicznie czynny oraz

c) co najmniej jeden związany wielowartościowy jon metalu, według wynalazku cechuje się tym, że środek biologicznie czynny zawiera proteinę, a biodegradowalny anionowy polisacharyd jest estrem alginianowym usieciowanym jonowo tworząc nadający się do wstrzykiwania, biodegradowalny biokompatybilny hydrożel estru alginianowego.

W kompozycji według wynalazku biodegradowalny anionowy polisacharyd jest korzystnie usieciowanym estrem alginianowym alkoholu jednowodorotlenowego.

W kompozycji według wynalazku związany wielowartościowy jon metalu jest korzystnie mieszaniną związanego i niezwiązanego wielowartościowego jonu metalu.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera ponadto co najmniej jedną zaróbkę dla stabilizowania biologicznie aktywnej proteiny lub anionowego polisacharydu.

W kompozycji wedł ug wynalazku zwią zany wielowartoś ciowy jon metalu jest jego solą wybraną z grupy obejmują cej octany, fosforany, mleczany, winiany, cytryniany, chlorki, wę glany lub jego wodorotlenkami. Korzystnie, jon metalu jest wybrany z grupy obejmującej: mangan, stront, żelazo, magnez, wapń, bar, miedź, glin oraz cynk. Najkorzystniej, jonem metalu jest wapń.

Kompozycja według wynalazku cechuje się zwiększoną biodostępnością.

W kompozycji według wynalazku proteina jest zawarta w stężeniu co najmniej 0,001 mg/ml.

Korzystnie, proteina jest wybrana z grupy obejmującej: czynniki hematopoetyczne, czynniki stymulowania kolonii, czynniki przeciw otyłości, czynniki wzrostu, czynniki troficzne i czynniki przeciwzapalne.

W szczególno ś ci, proteina jest korzystnie wybrana z grupy obejmują cej: leptynę , G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferony, erytropoetynę, KGF, insulinę oraz ich analogi lub pochodne.

W kompozycji według wynalazku środek biologicznie aktywny jest korzystnie skompleksowanym środkiem biologicznie aktywnym.

Korzystnie, skompleksowany środek biologicznie aktywny jest strąconą proteiną.

Szczególnie korzystną strąconą proteiną jest osad cynk-leptyna.

Wynalazek dotyczy także strzykawki wstępnie napełnionej kompozycją według wynalazku.

Wynalazek obejmuje także włączenie kompozycji według wynalazku do formulacji farmaceutycznej według wynalazku, zawierającej tę kompozycję o przedłużonym uwalnianiu, żelującą z opóźnieniem w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, rozcieńczalniku lub adjuwancie.

Korzystnie formulacja farmaceutyczna według wynalazku jest w strzykawce.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóźnieniem, polegającego na tym, że:

a) miesza się środek biologicznie aktywny i biodegradowalny anionowy polisacharyd z wytworzeniem pierwszej mieszaniny,

b) miesza się wskazaną pierwszą mieszaninę z co najmniej jednym związanym wielowartościowym jonem metalu z wytworzeniem drugiej mieszaniny,

PL 199 499 B1 przy czym środek biologicznie czynny zawiera proteinę, a biodegradowalny anionowy polisacharyd jest estrem alginianowym usieciowanym jonowo tworząc nadający się do wstrzykiwania, biodegradowalny biokompatybilny hydrożel estru alginianowego.

W sposobie według wynalazku związanym wielowartościowym jonem metalu jest korzystnie jego sól wybrana z grupy obejmującej octany, fosforany, mleczany, cytryniany, winiany, chlorki, węglany lub jego wodorotlenki. Korzystnie, metal jest wybrany z grupy obejmującej mangan, stront, żelazo, magnez, wapń, bar, miedź, glin oraz cynk. Najkorzystniej, jonem metalu jest wapń.

W sposobie wedł ug wynalazku proteina jest wybrana z grupy obejmują cej czynniki hematopoetyczne, czynniki stymulowania kolonii, czynniki przeciw otyłości, czynniki wzrostu, czynniki troficzne i czynniki przeciwzapalne.

Korzystnie, proteina jest wybrana z grupy obejmującej leptynę, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferony, erytropoetynę, KGF oraz ich analogi lub pochodne.

W sposobie według wynalazku ś rodek biologicznie aktywny jest korzystnie skompleksowanym środkiem biologicznie aktywnym.

W szczególności, skompleksowany środek biologicznie aktywny jest korzystnie strąconą proteiną.

Szczególnie korzystną strąconą proteiną jest osad cynk-leptyna.

Korzystnie, sposób według wynalazku obejmuje ponadto etap wyodrębniania kompozycji o przedł uż onym uwalnianiu.

Wynalazek rozciąga się również na kompozycję o przedłużonym uwalnianiu, żelującą z opóźnieniem, wytworzoną wyżej określonym sposobem według wynalazku.

Szczególnie korzystnie, kompozycja o przedłużonym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem według wynalazku jest przeznaczona do stosowania w sposobach leczenia.

Wynalazek dotyczy także zastosowania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóź nieniem wedł ug wynalazku, w której ś rodek biologicznie aktywny jest wystę pują c ą w naturze, rekombinacyjną, syntetyczną lub semisyntetyczną leptyną do wytwarzania środka leczniczego do leczenia zaburzenia wybranego z grupy obejmującej nadmierną wagę, cukrzycę, wysoki poziom lipidów we krwi, miażdżycę naczyń, płytkę miażdżycową, niewystarczającą masę tkanki beztłuszczowej, niewystarczającą wrażliwość na insulinę i udar, a także do zmniejszania lub zapobiegania tworzeniu kamieni żółciowych.

Wynalazek dotyczy także zastosowania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóź nieniem wedł ug wynalazku, w której ś rodek biologicznie aktywny jest wystę pują cym w naturze, rekombinacyjnym, syntetycznym lub semisyntetycznym G-CSF, do wytwarzania środka leczniczego do leczenia zaburzenia wybranego z grupy obejmującej niedobory komórek hematopoetycznych, infekcję i neutropenię.

Wynalazek dotyczy także zastosowania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóź nieniem wedł ug wynalazku, w której ś rodek biologicznie aktywny jest wystę pują cym w naturze, rekombinacyjnym, syntetycznym lub semisyntetycznym IL-1ra, do wytwarzania środka leczniczego do leczenia stanu zapalnego.

Obecny wynalazek powstał w wyniku badań opartych na wykorzystaniu hydrożeli niezmodyfikowanych alginianów (klasa polisacharydów anionowych) do powolnego uwalniania protein. Te hydrożele niezmodyfikowanych alginianów zawierające proteiny (patrz równoległe zgłoszenia patentowe w Stanach Zjednoczonych nr 08/857,913 oraz 08/912,902) tworzy się z opóź nieniem czasowym, napełniając materiałami strzykawkę i pozostawiając je do późniejszego zżelowania w tej samej strzykawce; stwierdzono, że te żele nadają się do iniekcji. Po pojedynczej, podskórnej iniekcji w modelach gryzoni stwierdzono wielodniowe utrzymywanie poziomu proteiny; jednak w miejscu iniekcji pozostaje wyczuwalne spęcznienie lub buła przez dłuższe okresy czasu z niewielką zmianą jej wielkości. To spęcznienie składa się z hydrożelu alginianowego wypełnionego wodą i wielkość tego spęcznienia jest funkcją objętości wstrzykniętego żelu. Także perełki żelowe pozostają w miejscu iniekcji.

Obecny wynalazek dotyczy zatem nowej klasy biodegradowalnych biokompatybilnych hydrożeli polisacharydowych, a mianowicie hydrożeli z estrów alginianowych, do powolnego uwalniania protein terapeutycznych. Nieoczekiwanie, hydrożele z estrów alginianowych oprócz wykazywania właściwości żelowania, przydatności do iniekcji oraz powolnego uwalniania niezmodyfikowanych alginianów nie pozostawiały spęcznienia w miejscu iniekcji, to znaczy hydrożele z estrów alginianowych są biodegradowalne lub ulegają rozpadowi bądź wypłukaniu i są stopniowo resorbowane do otaczających tkanek z nieznaczną reakcją w miejscu iniekcji.

PL 199 499 B1

Kompozycje według obecnego wynalazku zawierają estry alginianowe lub ich pochodne, jonowo usieciowane w hydrożelową (zawierającą wodę) matrycę zawierającą środek terapeutyczny taki jak proteina.

Obecny wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania biodegradowalnych kompozycji o powolnym uwalnianiu.

Obecny wynalazek dotyczy również zastosowania materiałów w postaci estrów alginianowych w mieszaninach ciekłych do opóźnionego żelowania w organizmie.

Obecny wynalazek dotyczy też kompozycji, w których hydrożele estrów alginianowych są w postaci perełek lub mikrosfer do powolnego uwalniania środków aktywnych, korzystnie protein terapeutycznych.

W jednym wykonaniu obecnego wynalazku hydrożele estrów alginianowych zapewniają kompozycje do stosowania w docelowych miejscach w organizmie pacjenta. Kompozycje te są przydatne: do zapobiegania lub hamowania tworzenia adhezji tkanek w następstwie operacji chirurgicznych i urazów; do uzupełnienia tkanek, w szczególności wypełniania tkanek miękkich i twardych; dla wypełniania ograniczonej przestrzeni materiałem resorbowalnym; jako „rusztowanie” dla wzrostu tkanek, a także w charakterze opatrunków na rany.

W innym wykonaniu hydroż ele estrów alginianowych dostarczają środka „urządzenia” zawierające środek aktywny do implantacji w organizmie, przy czym środek ten może być związany bądź niezwiązany z polimerem alginianowym.

W innym wykonaniu kompozycje hydroż eli estrów alginianowych wedł ug obecnego wynalazku zapewniają sposób poprawy biodostępności środka aktywnego w kompozycji.

Na koniec, kompozycje hydrożeli estrów alginianowych według obecnego wynalazku zapewniają ponadto sposób utrzymywania zasadniczo stałego w czasie poziomu we krwi pacjenta.

Szczegółowy opis wynalazku

Kompozycje

Polimery hydrofilowe zawierające alginiany i ich pochodne można otrzymać z różnych źródeł handlowych, naturalnych lub syntetycznych dobrze znanych w stanie techniki. Tak jak jest to dalej stosowane, określenie „polimer hydrofilowy” oznacza polimery rozpuszczalne w wodzie lub polimery o powinowactwie do absorbowania wody. Polimery hydrofilowe są dobrze znane biegł ym w sztuce. Obejmują one - lecz nie wyłącznie, polianiony, w tym anionowe polisacharydy takie, jak alginian, karboksymetyloamylozę, sole kwasu poliakrylowego, sole kwasu polimetakrylowego, kopolimer bezwodnika maleinowego z etylenem (pół-ester), karboksymetylocelulozę, siarczan dekstranu, heparynę, karboksymetylodekstran, karboksycelulozę, 2,3-dikarboksycelulozę, trikarboksycelulozę, karboksygumę arabską, karboksyl-karagenian, pektynę, karboksy-pektynę, karboksy-gumę tragakantową, karboksy-gumę ksantanową, polisiarczan pentosanu, karboksy-skrobię, karboksymetylochityno/chitosan, kurdlan, heksasiarczan inozytolu, siarczan b-cyklodekstryny, kwas hialuronowy, siarczan chondroityny-6, siarczan dermatanu, siarczan hepatyny, karboksymetylo skrobię, karagenian, poligalakturonian, karboksy-gumę guarową, polifosforan, kwas polialdehydokarboniowy, poli-1-hydroksy-1-sulfonianopropen-2, kwas kopolistyrenomaleinowy, agarozę, mezoglikan, sulfopropylenowane poliwinylowe alkohole, siarczan celulozy, siarczan protaminy, fosfo-gumę guarową, kwas poliglutaminowy, kwas poliasparginowy, kwasy poliaminowe, ich pochodne lub ich kombinacje. Biegły w sztuce rozpozna różne inne polimery hydrofilowe, mieszczące się w zakresie obecnego wynalazku.

Podobnie, związane wielowartościowe jony metali można otrzymać z różnych źródeł handlowych, naturalnych lub syntetycznych, które są dobrze znane w stanie techniki. W szczególności, jony metali mogą obejmować - lecz nie wyłącznie, jony glinu, baru, wapnia, żelaza, manganu, magnezu, strontu oraz cynku. Korzystnie, jonami metali są wapń i cynk lub ich sole, takie jak octan cynku, octan wapnia lub chlorki. Można również stosować rozpuszczalne w wodzie małe cząsteczki i sole, takie jak siarczan amonu, aceton, etanol i glicerynę.

Alkoholami z szeregu alifatycznego do stosowania jako składniki estryfikujące grupy karboksylowe kwasu alginowego według obecnego wynalazku są, przykładowo, alkohole o maksymalnie 34 atomach węgla, nasycone lub nienasycone, ewentualnie podstawione innymi wolnymi lub zmodyfikowanymi grupami funkcyjnymi takimi, jak grupy amino, hydroksy, aldehydo, keto, merkapto, karboksy lub ich grupami pochodnymi takimi, jak grupy węglowodorowo- lub diwęglowodorowo-aminowe (poniżej określenie „grupy węglowodorowe” należy rozumieć nie tylko jako obejmujące jednowartościowe reszty węglowodorowe takie, jak CnH2n+1, lecz także reszty dwuwartościowe lub trójwartościowe takie, jak „alkileny” -CnH2n lub „alkilideny” =CnH2n), eterowe lub estrowe, acetalowe lub ketalowe, tio-eterowe

PL 199 499 B1 lub tioestrowe i zestryfikowane grupy karboksy lub karbamidowe lub grypy karbamidowe podstawione jedną lub dwoma grupami hydroksylowymi, grupami nitrylowymi lub chlorowcami.

W powyższych grupach zawierających grupy węglowodorowe korzystnie są nimi niższe grupy alifatyczne, ewentualnie z heteroatomami takimi jak tlen, azot i siarka. Korzystne są alkohole podstawione jedną lub dwiema z podanych wyżej grup funkcyjnych.

Alkoholami z powyższej grupy do korzystnego stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem są alkohole o maksymalnie 12, a w szczególności o maksymalnie 6 atomach węgla i w których grupy węglowodorowe w wyżej wspomnianych grupach węglowodoro-aminowych, eterowych, estrowych, tioeterowych, tioestrowych, acetalowych i ketalowych stanowią grupy alkilowe o maksymalnie 4 atomach węgla, a także w estryfikowanych grupach karboksylowych lub podstawionych grupach karbamidowych, grupami węglowodorowymi są alkile o tej samej liczbie atomów węgla, a w których grupy aminowe lub karbamidowe mogą być grupami alkilenoaminowymi lub alkilenokarbamidowymi o maksymalnie 8 atomach węgla. Spośród alkoholi, przede wszystkim należy wspomnieć nasycone i nienasycone alkohole takie jak metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, n-butylowy, izobutylowy, tertbutylowy, amylowy, pentylowy, heksylowy, oktylowy, nonylowy i dodecylowy, wszystkie z powyższych o prostym łańcuchu takie jak n-oktylowy lub n-dodecylowy. Z alkoholi podstawionych z tej grupy mogą być wymienione dwuwartościowe alkohole takie, jak glikol etylenowy, glikol propylenowy lub glikol butylenowy, alkohole trójwartościowe takie jak gliceryna, aldehydo-alkohole takie jak alkohol tartronowy, alkohole karboksylowe takie jak kwasy laktynowe, przykładowo kwas α-oksypropionowy, kwas glikolowy, kwas jabłkowy, kwas winowy, kwas cytrynowy, aminoalkohole takie jak aminoetanol, aminopropanol, n-aminobutanol i dimetylowe i dietylowe pochodne ich grup aminowych, cholina, pirolidynyloetanol, piperydynyloetanol, piperazynyloetanol i odpowiednie pochodne alkoholu n-propylowego lub n-butylowego, monotioetylenoglikol lub jego alkilowe pochodne, przykładowo etylopochodne jego grupy merkapto.

Spośród wyższych nasyconych alkoholi alifatycznych szczególnie warto wymienić, przykładowo, alkohol cetylowy i mirystylowy, lecz szczególnie ważne dla celów obecnego wynalazku są wyższe, nienasycone alkohole z jednym lub dwoma podwójnymi wiązaniami, takie jak szczególnie te zawarte w wielu olejkach eterycznych wykazujące powinowactwo do terpenów takie jak cytronelol, geraniol, nerol, nerolidol, linalol, farnezol, fitol.

Spośród niższych nienasyconych alkoholi należy wziąć pod uwagę alkohol propargilowy.

Spośród alkoholi alifatycznych należy przede wszystkim wymienić alkohole o tylko jednej reszcie benzenowej i w których łańcuch alifatyczny ma najwyżej 4 atomy węgla, w których także reszta benzenowa może być podstawiona przez 1 do 3 grup metylowych lub hydroksylowych lub przez atomy chlorowca, zwłaszcza chlor, brom lub jod, i w których łańcuch alifatyczny może być podstawiony przez jedną lub więcej grup funkcyjnych wybranych z grupy obejmującej wolne grupy aminowe lub jedno- lub dimetylowe grupy lub przez grupy pirolidynowe lub grupy piperydynowe. Spośród tych alkoholi szczególnie korzystne są alkohol benzylowy i alkohol fenyloetylowy. Alkohole serii cykloalifatycznych lub alifatycznych-cykloalifatycznych mogą pochodzić z jedno- lub policyklicznych węglowodorów i mogą mieć najwyżej 34 atomy węgla. Z alkoholi pochodzących z cyklicznych węglowodorów jednopierścieniowych szczególnie należy wymienić alkohole o maksymalnie 12 atomach węgla, z pierścieniami zawierającymi korzystnie od 5 do 7 atomów węgla, ewentualnie podstawionymi, przykładowo przez od 1 do 3 niższych grup alkilowych, takich jak grupa metylowa, etylowa, propylowa lub izopropylowa. Szczególne alkohole z tej grupy to cykloheksanol, cykloheksanodiol, 1,2,3-cykloheksanotriol i 1,3,5-cykloheksanotriol (floroglucitol), inozytol, alkohole pochodne p-mentanu takie jak karwomentol mentol, α- i γ-terpineol 1-terpineol. alkohole znane jako „terpineol”, 1,4- i 1,8-terpin. Alkohole pochodzące od węglowodorów o skondensowanych pierścieniach to alkohole, przykładowo, z grup tujanu, pinanu, kampbanu, korzystnie tyjanol, wodzian sabinol-pinol, D- i L-borneol oraz D i L-izoborneol.

Włączone są także alkohole pochodzące z reakcji estryfikacji związków zawierających grupę epoksydową z alginianami (patrz, przykładowo, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 2,436,824 i opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 2,424,125).

Polianiony zawierające całkowitą lub częściową grupę estrową według obecnego wynalazku to w ogólnym przypadku polisacharydy kwasowe gdzie tlen glikozydowy jest przyłączony w pozycji β do węgla karbonylowego estru. Bez odwoływania się do żadnego szczególnego mechanizmu ten układ ugrupowań umożliwia rozpad łańcucha polimerowego przez mechanizm β-eliminacji który może występować w warunkach fizjologicznych.

PL 199 499 B1

Estry kwasu alginowego według obecnego wynalazku składają się z reszt kwasu mannuronowego (m-COOH lub anion m-COO) i reszt kwasu guluronowego (g-COOH lub anion g-COO) połączonych razem wiązaniami przez tlen eteru glikozydowego o następującym wzorze ogólnym (I)

- (M)n1 - (M')n2 - (G)n3 - (G')n4 - (A)n5 w którym:

M - oznacza resztę kwasu mannuronowego, m-COOH lub anion m-COO;

M' - oznacza resztę estru kwasu mannuronowego, m-COOR1;

G - oznacza resztę kwasu guluronowego, g-COOH lub anion g-COO;

G' - oznacza resztę estru kwasu guluronowego, g-COOR2;

A - oznacza inne niż g lub m jednostki ł a ń cucha takie, jak cukry, produkty utleniania cukrów lub alifatyczne, aromatyczne, alaromatyczne, cykloalifatyczne reszty, które mogą być podstawione i przerywane heteroatomami w ł a ń cuchu lub przy ko ń cach ł a ń cucha;

n1, n2, n3, n4 i n5 są liczbami wskazującymi przeciętną względną ilość włączonych jednostek;

R1 i R2 są niezależnie resztami alifatycznymi, aromatycznymi, aralifatycznymi, alaromatycznymi, cykloalifatycznymi które mogą być podstawione i przerwane przez heteroatomy, a także ich pochodne (przykładowo w których grupy hydroksylowe są acetylowane i przereagowane z izocyjanianami) i farmaceutycznie akceptowalne sole.

W estrach według obecnego wynalazku pożądane jest, by R1=R2 i oznaczały reszty alifatyczne lub alaromatyczne, a ponadto by iloczyn 100 (n2 + n4)/(n1 + n2 + n3 + n4) miał wartość od 1 do 99 mol%, korzystnie 5-50 mol%, bardziej korzystnie 6-30 mol%, jeszcze bardziej korzystnie 6-15 mol%, i najkorzystniej 7-12 mol%, zaś by iloczyn 100 n5/(n1 + n2 + n3 + n4 + n5) wynosił korzystnie mniej niż 10 mol%.

W częściowych estrach wedł ug wynalazku nie zestryfikowane grupy karboksylowe mogą być wolne lub mogą być przeprowadzone w sole. Zasady dla utworzenia tych soli wybiera się według ostatecznego końcowego zastosowania produktu. Sole nieorganiczne mogą być tworzone z metali alkalicznych takich jak potas i w szczególności sód oraz amoniak, bądź z metali ziem alkalicznych takich jak wapń lub magnez, lub też z glinu.

Szczególnie interesujące są sole z zasadami organicznymi zwłaszcza zasadami azotowymi, a zatem aminami alifatycznymi, aralifatycznymi, cykloalifatycznymi lub heterocyklicznymi. Te sole mogą być wyprowadzone z terapeutycznie dopuszczalnych amin lub nietoksycznych lecz terapeutycznie nieaktywnych amin, lub z amin o działaniu terapeutycznym. Jeśli chodzi o pierwszy typ, to korzystne są aminy alifatyczne, przykładowo mono-, di- oraz tri- alkiloaminy z grupami alkilowymi o maksimum 8 atomach węgla, lub aryloalkiloaminy o tej samej liczbie atomów w ęgla w części alifatycznej oraz w których aryl oznacza grupę benzenową ewentualnie podstawioną przez od 1 do 3 grup metylowych lub atomami chlorowca lub grupami hydroksylowymi. Zasady nieaktywne biologicznie dla tworzenia soli mogą być cykliczne, takie jak monocykliczne alkilenoaminy z pierścieniami o 4 do 6 atomach węgla, ewentualnie z umieszczonymi w pierścieniu heteroatomami wybranymi z grupy obejmującej azot, tlen i siarkę, takie jak piperazyna lub morfolina, lub mogą być podstawione, przykładowo, przez aminowe lub hydroksylowe grupy funkcyjne, takie jak aminoetanol, etylenodiamol, etylenodiamina, efedryna lub cholina.

Stopień i typ estryfikacji można kontrolować zgodnie z metodami syntezy znanymi w stanie techniki. Korzystnie, estry alginianowe są wytwarzane przez działanie na czwartorzędowe sole amoniowe kwasu alginowego typowymi środkami alkilującymi w aprotycznym rozpuszczalniku organicznym takim jak dimetylosulfotlenek. Uzyskane estry są korzystnie estrami alkoholi jednowartościowych takich jak niższe alkohole alkilowe, takie jak etylowy lub alkohole aryloalkilowe takie jak benzylowy lub ich mieszaninami. Można także tworzyć estry przez reakcję kwasu alginowego z oksyranem lub związkami zawierającymi grupę epoksydową, takimi jak tlenek etylenu lub propylenu.

Możliwe jest także wytworzenie czwartorzędowych soli amoniowych częściowych estrów, przykładowo soli tetraalkiloamoniowych o wyżej wymienionej liczbie atomów węgla i korzystnie soli tego typu, w których czwarta grupa alkilowa ma od 1 do 4 atomów węgla, jak przykładowo grupa metylowa.

Stopień estryfikacji (wyrażony w mol%) alginianu jest związany z żądaną szybkością znikania żelu w tkance pacjenta. Ta szybkość znikania żelu jest zasadniczo związana z żądaną szybkością uwalniania środka aktywnego z żelu przez okres 5 lat lub mniej, zwykle 2 dni do 270 dni, w szczególności 2 dni do 180, a zwłaszcza 2 do 90 dni. Stopień estryfikacji (DE) wynosi od 1 mol% do 99 mol%,

PL 199 499 B1 korzystnie od 5 do 50 mol%, bardziej korzystnie od 6 do 15 mol%, a bardziej korzystnie od 7 do 12 mol%.

Tak jak jest to stosowane w niniejszym tekście, określenie bufor lub roztwór buforowy dotyczy zastosowania kwasów nieorganicznych lub organicznych lub ich kombinacji do wytworzenia roztworu buforowego jaki jest znany w stanie techniki. Kwasy nieorganiczne w zakresie niniejszego wynalazku obejmują chlorowcowodory, (przykładowo kwas solny), kwas fosforowy, azotowy lub siarkowy. Inne kwasy nieorganiczne są dobrze znane biegłym w sztuce i są uwzględniane w obecnym rozwiązaniu. Kwasy organiczne w zakresie wynalazku obejmują alifatyczne kwasy karboksylowe i kwasy aromatyczne takie jak kwas mrówkowy, węglowy, octowy, propionowy, masłowy, walerianowy, kapronowy, akrylowy, malonowy, bursztynowy, glutarowy, adypinowy, maleinowy, fumarowy, glicynę lub kwas fenolosulfonowy. Inne kwasy organiczne są dobrze znane biegłym w sztuce.

Tak jak jest to stosowane w obecnym opisie, termin „środki biologiczne czynne” dotyczą protein rekombinacyjnych lub występujących naturalnie w organizmie zwierzęcym lub ludzkim, przydatnych do stosowania profilaktycznego, terapeutycznego lub diagnostycznego, jak również środków nie opartych na proteinach, takich jak małe cząsteczki. Środek aktywny biologicznie może być naturalny, syntetyczny, pół-syntetyczny lub mogą to być ich pochodne. Środki aktywne biologicznie według obecnego wynalazku muszą być zdolne do wytrącania. Rozpatruje się szeroki zakres środków biologicznie czynnych. Obejmują one, lecz nie wyłącznie: hormony, cytokiny, czynniki hematopoetyczne, czynniki wzrostu, czynniki przeciw otyłości, czynniki troficzne, czynniki przeciwzapalne oraz enzymy (patrz również opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,695,463 co do dalszych przykładów środków biologicznie czynnych). Biegły w sztuce łatwo będzie zdolny przystosować żądany środek biologicznie czynny do kompozycji według obecnego wynalazku.

Proteiny takie objęłyby, lecz nie wyłącznie: interferony (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,372,808; 5,541,293; 4,897,471 oraz 4,695,623 włączone jako odnośniki literaturowe do niniejszego opisu - łącznie z rysunkami), interleukiny (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,075,222 włączony jako odnośnik literaturowy do niniejszego opisu - łącznie z rysunkami), erytropoetyny (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,703,008; 5,441,868; 5,618,698; 5,547,933 oraz 5,621,080 włączone tu jako odnośniki literaturowe - łącznie z rysunkami), czynniki stymulowania kolonii granulocytów (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,810,643; 4,999,291; 5,581,476; 5,582,823 oraz publikacja PCT nr 94/17185 włączone tu jako odnośniki literaturowe - łącznie z rysunkami), czynnik komórki macierzystej (publikacje PCT nr 91/05795; 92/17505 oraz 95/17206 włączone jako odnośniki literaturowe do niniejszego opisu - łącznie z rysunkami), a takż e proteina OB (publikacje PCT nr 96/40912; 96/05309; 97/00128; 97/01010 oraz 97/06816 włączone jako odnośniki literaturowe do niniejszego opisu - łącznie z rysunkami). Ponadto środki biologicznie aktywne mogą także obejmować, lecz nie wyłącznie: produkty związane z przeciwotyłością, insulinę, gastrynę, prolaktynę, hormon adrenokortykotropowy (ACTH), hormon stymulujący tarczycę (TSH), hormon luteinizujący (LH), hormon stymulujący pęcherzyk (FSH), ludzką gonadotropinę kosmówkową (HCG), motylinę, interferony (alfa, beta, gamma), interleukiny (IL-1 do IL-12), czynnik martwicy nowotworu (TNF), proteinę wiążącą z czynnikiem martwicy nowotworu (TNF-bp), czynnik neurotroficzny pochodzący z mózgu (BDNF), czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (GDNF), czynnik neurotroficzny 3 (NT3), czynniki wzrostu fibroblastów (FGF), neurotroficzny czynnik wzrostu (NGF), czynniki wzrostu kości takie jak osteoprotegeryna (OPG), insulinopodobne czynniki wzrostu (IGFs), czynnik stymulujący kolonię makrofagów (M-CSF), czynnik stymulujący granulocytową kolonię makrofagów (GM-CSF), czynnik wzrostu pochodzący z megakeratynocytów (MGDF), trombopoetynę, czynnik wzrostu pochodzący z płytek (PGDF), czynniki wzrostu stymulujące kolonię (CSFs), proteinę morfogenetyczną kości (BMP), dysmutazę nadtlenkową (SOD), aktywator plazminogenu tkanki (TPA), urokinazę, streptokinazę oraz kallikreinę. Określenie „proteiny” stosowane w niniejszym zgłoszeniu obejmuje peptydy, polipeptydy, cząsteczki zgodne, ich analogi, pochodne i kombinacje.

Pochodne środków biologicznie aktywnych mogą. obejmować przyłączenie jednego lub więcej ugrupowań chemicznych do ugrupowania proteiny. Stwierdzono, że modyfikacja chemiczna środków biologicznie aktywnych dostarcza dodatkowych korzyści w pewnych okolicznościach, takich jak zwiększenie trwałości i czasu obiegu proteiny terapeutycznej oraz obniża immunogenność. Biegły w sztuce będzie mógł wybrać żądaną modyfikację chemiczną w oparciu o żądaną dawkę, czas obiegu, odporność na proteolizę, zastosowania terapeutyczne i inne względy.

Tak jak jest to stosowane w niniejszym opisie biodegradowalność dotyczy rozkładu ciężaru cząsteczkowego szczególnego polimeru na mniejszą liczbę jednostek w łańcuchu, to znaczy rozkładu

PL 199 499 B1 na jednostki o mniejszym ciężarze cząsteczkowym. Termin „żel biodegradowalny” wskazuje na zdolność rozpraszania żelu w otoczeniu stosowania, przy czym rozpraszanie jest zależne od rozkładu (zmniejszania ciężaru cząsteczkowego) zawartych polimerów prowadzącego do mniejszych jednostek w ł a ń cuchu polimerowym.

Kompleksy

Proteiny, ich analogi lub pochodne można podawać w postaci skompleksowanej z kompozycją wiążącą. Taka kompozycja wiążąca może wpływać na przedłużenie czasu obiegu proteiny, jej analoga lub pochodnej lub zwiększać aktywność środka biologicznie czynnego. Taka kompozycja może być proteiną (lub synonimicznie - peptydem), pochodną, analogiem lub kombinacją. Przykładowo, proteiną wiążącą dla proteiny OB jest receptor proteiny OB lub jego część, taka jak jego część rozpuszczalna. Inne proteiny wiążące można ustalić przez badanie proteiny OB lub wybranej proteiny, w surowicy, bądź przez empiryczny skrining na obecność wiązania. Takie wiązanie w typowym przypadku nie będzie ingerować w zdolność proteiny OB lub jej analoga lub pochodnej do wiązania się z endogennym receptorem proteiny OB i/lub wpływać na przetwarzanie sygnału. Ponadto, oprócz proteiny OB kompleksy wiążące będą także stosowalne w przypadku innych protein terapeutycznych zgodnie z obecnym wynalazkiem. Biegli w sztuce będą mogli ustalić odpowiednie proteiny wiążące do wykorzystania w obecnym wynalazku.

Podobnie, czynniki wytrącające stosowane do wytrącania środka biologicznie czynnego można uzyskać z różnych źródeł handlowych, naturalnych lub syntetycznych, które są dobrze znane według stanu techniki. Czynniki wytrącające obejmują, lecz nie wyłącznie: wielowartościowe jony metali lub ich sole takie jak octany, cytryniany, chlorki, węglany, wodorotlenki, szczawiany, winiany, lub ich wodorotlenki, kwasy lub polimery rozpuszczalne w wodzie. W szczególności, jony metali mogą obejmować, lecz nie wyłącznie: glin, bar, wapń, żelazo, mangan, magnez, stront oraz cynk. Korzystnie jonem metalu jest cynk lub jego sole, takie jak octany i chlorki. Można także stosować rozpuszczalne w wodzie małe cząsteczki i sole takie jak siarczan amonu, aceton, etanol i gliceryna.

Polimery rozpuszczalne w wodzie obejmują, lecz nie wyłącznie: glikol polietylenowy, kopolimery glikolu etylenowego/glikolu propylenowego, karboksymetylocelulozę, dekstran, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimery etylenu/bezwodnika maleinowego, poliaminokwasy, dekstran, poli-(n-winylopirolidon), glikol polietylenowy, homopolimery glikolu propylenowego, kopolimery tlenku polipropylenu/tlenku etylenu, polioksyetylowane alkohole wielowodorotlenowe, bursztynian alkoholu poliwinylowego, glicerynę, tlenki etylenu, tlenki propylenu, polksamery, kopolimery alkoksylowane, polianiony rozpuszczalne w wodzie i ich pochodne oraz kombinacje. Polimer rozpuszczalny w wodzie może mieć dowolny ciężar cząsteczkowy i może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. Przykładowo, korzystny ciężar cząsteczkowy glikolu polietylenowego zawiera się między 700 Da i 100 kDa dla łatwości posługiwania się i skuteczności wytrącania.

Można stosować inne wielkości i typy czynników strącających zależnie od żądanego profilu terapeutycznego (przykładowo, pożądanego czasu trwania przedłużonego uwalniania, efektów, jeśli mają wpływ na biologiczną aktywność, łatwości posługiwania się, stopnia lub braku antygenowości oraz innych znanych efektów pożądanego czynnika wytrącającego na proteinę terapeutyczną lub analog). Biegły w sztuce rozpozna inne czynniki strącające, które mieszczą się w zakresie obecnego wynalazku.

Ponadto, kompozycje według obecnego wynalazku mogą również obejmować dodatkowe zaróbki niezbędne dla stabilizowania środka biologicznie aktywnego i/lub polimeru hydrofilowego. Mogą one być zawarte w buforze i mogą one obejmować, lecz nie wyłącznie: konserwanty.

Kompozycje farmaceutyczne

Kompozycje farmaceutyczne o przedłużonym uwalnianiu według obecnego wynalazku mogą być podawane doustnie (przykładowo, kapsułki takie jak twarde kapsułki i miękkie kapsułki, preparaty stałe takie jak granulki, tabletki, pigułki, kołaczyki lub pastylki, opłatki, peletki, proszek lub formy zliofilizowane, preparaty ciekłe takie jak zawiesiny) i preparaty podawane nie doustnie (przykładowo, domięśniowe, podskórne, przezskórne, dootrzewne, IV - dożylne, IP - śródotrzewnowe, dotętnicze, dooponowe, wewnątrztorebkowe, śródoczodołowe, iniekcyjne, płucne, donosowe, doodbytnicze i domaciczne preparaty przezśluzówkowe).

Generalnie, niniejszy wynalazek obejmuje kompozycje farmaceutyczne o powolnym uwalnianiu obejmujące skuteczne ilości proteiny lub produktów pochodnych, łącznie z kompozycjami o powolnym uwalnianiu według wynalazku wraz z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozcieńczalnikami, konserwantami, solubilizatorami, emulgatorami, adjuwantami i/lub nośnikami niezbędnymi dla podawania. Patrz

PL 199 499 B1 publikacja PCT WO 97/01331, włączona do obecnego opisu jako odnośnik literaturowy. Optymalny preparat farmaceutyczny dla żądanego środka biologicznie czynnego będzie określony przez biegłego w sztuce zależnie od drogi podawania oraz żądanej dawki. Przykładowe kompozycje farmaceutyczne ujawniono w Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18^th Ed., Easton, PA, str. 1435-1712 (1990)).

Wskutek tiksotropowego charakteru preparatu o opóźnionym żelowaniu można stosować strzykawki do podawania podskórnego. Kompozycja może być poddawana żelowaniu w strzykawce z przeznaczeniem do późniejszej iniekcji. Żelowanie to można wykonać z opóźnieniem czasowym. Przebieg w czasie jest kontrolowany przez przemyślane dostosowanie ilości czynnika żelującego i donora protonu w mieszaninie, jeśli jest to konieczne. Taki preparat nadaje się do stosowania z późniejszym, ponownym zżelowaniem w organizmie po iniekcji. Określenie „tiksotropowy” tak jak jest ono stosowane w obecnym opisie dotyczy lepkości mieszaniny żelowej, która zmniejsza się pod wpływem ciśnienia, przykładowo wywieranego przez tłoczek strzykawki, w którym to punkcie mieszanina może wypływać przez igłę strzykawki i następnie powtórnie tworzyć żel w miejscu iniekcji.

Koncepcję opóźnionego żelowania można także wykorzystać przy napełnianiu strzykawki w przypadku, gdy kompozycja żelowa o przedłużonym uwalnianiu napełnia strzykawkę i we wstępnie ustalonym czasie żeluje w strzykawce, przykładowo od kilku minut do wielu godzin po napełnieniu. Dzięki temu unika się problemu napełniania strzykawki materiałem, który już uległ zżelowaniu. Tak wstępnie napełnione strzykawki można przechowywać w celu późniejszego wstrzyknięcia kompozycji do organizmu pacjenta.

Składniki, które mogą być potrzebne dla podawania obejmują rozcieńczalniki o różnej zawartości buforów (przykładowo, Tris-HCl, octan), pH i sile jonowej; dodatki takie jak środki powierzchniowo czynne i czynniki solubilizujące (przykładowo, Tween 80, HCO-60, Polisorbat 80), środki przeciwutleniające (przykładowo, kwas askorbinowy, glutation, metawodorosiarczyn sodu), dodatkowe polisacharydy (przykładowo, karboksymetyloceluloza, alginian sodu, hialuronian sodu, siarczan protaminy, glikol polietylenowy), konserwanty (przykładowo, Thimersol, alkohol benzylowy, metyloparaben, propyloparaben) oraz substancje budulcowe (przykładowo, laktoza, mannitol); włączenie materiału do preparatów w postaci cząstek związków polimerowych takich jak polimery lub kopolimery kwasu polimlekowego/poliglikolowego itp., lub w połączeniu z lipozomami. Kwas hialuronowy może być także stosowany jako składnik do podawania i może mieć on wpływ na sprzyjanie jeszcze bardziej przedłużonemu trwaniu w obiegu. Ponadto, kompozycje o powolnym uwalnianiu według obecnego wynalazku mogą być także dyspergowane przy użyciu olejów (przykładowo, oleju sezamowego, oleju kukurydzianego, oleju roślinnego) lub ich mieszaniny z fospolipidem (przykładowo z lecytyną) lub z trójglicerydami kwasów tłuszczowych o łańcuchu średniej długości (przykładowo, Miglyol 812), z wytworzeniem zawiesiny w oleju. Kompozycje według obecnego wynalazku mogą być także dyspergowane przy użyciu środków dyspergujących takich jak rozpuszczalne w wodzie polisacharydy (przykładowo mannitol, laktoza, glukoza, skrobie), kwas hialuronowy, glicyna, fibryna, kolagen i sole nieorganiczne (przykładowo chlorek sodu).

Ponadto, dla celów stosowania do podawania kompozycji o powolnym uwalnianiu według obecnego wynalazku są także rozpatrywane urządzenia mechaniczne zaprojektowane dla podawania do płuc produktów terapeutycznych włączając w to, lecz nie wyłącznie: nebulizatory, inhalatory z odmierzaniem dawki i inhalatory proszkowe, z których wszystkie znane są biegłym w sztuce.

Podawane składniki mogą wpływać na stan fizyczny, trwałość, szybkość uwalniania in vivo i szybkość klirensu in vivo niniejszych protein i pochodnych. Biegły w sztuce rozpozna odpowiednie składniki do podawania i/lub odpowiednie urządzenia mechaniczne do stosowania, zależnie od zastosowania terapeutycznego, drogi podawania, żądanej dawki, czasu obiegu, odporności na proteolizę, trwałości proteiny i innych uwarunkowań.

Metody stosowania

Terapeutyczne: Zastosowania terapeutyczne zależą, od zastosowanego środka biologicznie aktywnego. Biegły w sztuce będzie łatwo mógł zaadaptować żądany środek biologicznie aktywny do obecnego wynalazku, zgodnie z jego zamierzonymi zastosowaniami terapeutycznymi. Zastosowania terapeutyczne dla takich środków opisano bardziej szczegółowo w następujących publikacjach włączonych do obecnego opisu jako odnośniki literaturowe - łącznie z rysunkami. Zastosowania terapeutyczne obejmują, lecz nie są ograniczone do zastosowań protein takich jak interferony (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,372,808; 5,541,293; 4,897,471 oraz 4,695,623, włączone do obecnego opisu jako odnośniki literaturowe - łącznie z rysunkami), interleukiny (patrz opis paten12

PL 199 499 B1 towy Stanów Zjednoczonych Am. nr 5,075,222, włączony do obecnego opisu jako odnośnik literaturowy - łącznie z rysunkami), erytropoetyny (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych nr 4,703,008; 5,441,868; 5,618,698; 5,547,933 oraz 5,621,080, włączone do obecnego opisu jako odnośniki literaturowe - łącznie z rysunkami), czynniki stymulowania kolonii granulocytów (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Am. nr 4,999,291; 5,581,476; 5,582,823; 4,810,643 i publikacja PCT nr 94/17185, włączone do obecnego opisu jako odnośniki literaturowe - łącznie z rysunkami), czynnik komórki macierzystej (publikacje PCT nr 91/05795; 92/17505 i 95/17206, włączone do obecnego opisu jako odnośniki literaturowe - łącznie z rysunkami), oraz proteina OB (patrz publikacje PCT nr 96/40912, 96/05309; 97/00128; 97/01010 oraz 97/06816, włączone do obecnego opisu jako odnośniki literaturowe - łącznie z rysunkami).

Ponadto, zastosowania terapeutyczne kompozycji według obecnego wynalazku obejmują zastosowania czynników biologicznie aktywnych, włączając w to, lecz nie ograniczając się do produktów przeciw otyłości, insuliny, gastryny, prolaktyny, hormonu adrenokortykotropowego (ACTH), hormonu stymulowania tarczycy (TSH), hormonu luteinizującego (LH), hormonu stymulowania pęcherzyka (FSH), ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG), motyliny, interferonów (alfa, beta, gamma), interleukin (IL-1 do IL-12), czynnika martwicy nowotworu (TNF), proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (TNF-bp), czynnika neurotroficznego pochodzącego z mózgu (BDNF), czynnika neurotroficznego pochodzenia glejowego (GDNF), czynnika neurotroficznego 3 (NT3), czynników wzrostu fibroblastów (FGF), czynnika wzrostu neurotroficznego (NGF), czynników wzrostu kości takich jak osteoprotegeryna (OPG), czynników wzrostu insulinopodobnych (IGFs), czynnika stymulującego kolonie makrofagów (M-CSF), czynnika stymulującego kolonie makrofagów granulocytów (GM-CSF), czynnika wzrostu pochodzącego z megakeratynocytu (MGDF), trombopoetyny, czynnika wzrostu pochodzącego z płytek (PGDF), czynników wzrostu stymulującego kolonię (CSFs), proteiny morfogenetycznej kości (BMP), dysmutazy nadtlenkowej (SOD), aktywatora plazminogenu tkanki (TPA), urokinazy, streptokinazy i kalikreiny. Określenie „proteiny” tak jak jest stosowane w niniejszym tekście obejmuje peptydy, polipeptydy, cząsteczki zgodne, ich analogi, pochodne i kombinacje. Ponadto, niniejsze kompozycje mogą być stosowane do wytwarzania jednego lub więcej środków leczniczych dla leczenia lub polepszenia stanów, na które w zamierzeniu ma działać środek biologicznie aktywny.

Tytułem przykładu, zastosowania terapeutyczne w celu utleniania we krwi i obniżenia resorpcji kości lub osteoporozy można również osiągnąć przy braku utraty masy.

Terapie kombinowane: Obecne kompozycje i sposoby można stosować w połączeniu z innymi terapiami takimi jak zmiana diety i ćwiczenia, podawanie innych środków leczniczych - takie jak środki przydatne do leczenia cukrzycy (przykładowo insulina, i być może amylina), środki lecznicze obniżające cholesterol i ciśnienie krwi (takie jak te, które obniżają poziomy lipidów we krwi i inne środki naczyniowo-sercowe), środki lecznicze zwiększające aktywność (przykładowo amfetaminy), diuretyki (dla eliminacji płynów) i środki wstrzymujące apetyt. Takie podawanie może być równoczesne lub może następować kolejno in seriatim. Ponadto, niniejsze sposoby można stosować w połączeniu z procedurami chirurgicznymi, takimi jak chirurgia kosmetyczna przeznaczona do zmiany całościowego wyglądu ciała (przykładowo odciąganie tłuszczów lub chirurgie laserowe przeznaczone do obniżenia masy ciała lub chirurgie implantacyjne przeznaczone do zwiększenia masy ciała). Korzyści zdrowotne z operacji kardiologicznych takich jak operacja by-passów lub inne operacje przeznaczone do usunię cia szkodliwego stanu wywołanego przez zablokowanie naczyń krwionośnych przez osadzanie tłuszczu, takie jak płytki tętnicze, można zwiększyć przy równoczesnym stosowaniu niniejszych kompozycji i terapii. Sposoby eliminacji kamieni żółciowych takie jak metody ultradźwiękowe lub laserowe moż na również stosować bądź przed, podczas lub po stosowaniu niniejszych metod terapeutycznych. Ponadto, niniejsze sposoby można stosować jako dodatek do operacji i terapii w przypadku złamanych kości, uszkodzonych mięśni lub innych terapii, które można by poprawić przez zwiększenie beztłuszczowej masy ciała.

Dawkowanie

Biegły w sztuce będzie mógł ocenić skuteczne dawki przez podawanie i zaobserwowanie żądanego efektu terapeutycznego. Dawka preparatu o powolnym uwalnianiu jest ilością niezbędną do osiągnięcia skutecznego stężenia środka biologicznie aktywnego in vivo, przez dany okres. Dawka i korzystna częstotliwość podawania preparatów o powolnym uwalnianiu zmienia się wraz z typem środka biologicznie aktywnego, pożądanym czasem trwania uwalniania, rozpatrywaną chorobą, pożądaną częstotliwością podawania, cechami gatunkowymi leczonego zwierzęcia oraz innymi czynnikami.

PL 199 499 B1

Korzystnie, formulacja środka biologicznie czynnego będzie taka, żeby żądany efekt terapeutyczny był zapewniony przez dawkę między około 0,10 μg/kg/dzień i 100 mg/kg/dzień.

Skuteczne dawki można określić stosując narzędzia diagnostyczne w czasie. Tytułem przykładu, obecny wynalazek dostarcza dawki proteiny OB. Przykładowo, można najpierw zastosować środek diagnostyczny dla zmierzenia ilości proteiny OB we krwi (lub w osoczu lub w surowicy) by określić endogenne poziomy proteiny OB. Takie narzędzie diagnostyczne może być w postaci próby z przeciwciałem, takiej jak próby z sandwiczem przeciwciała. Ilość endogennej proteiny OB jest ilościowo określana na początku i wyznacza się linię bazową. Dawki terapeutyczne określa się w stosownie do przeprowadzanych oznaczeń ilościowych proteiny OB endogennej i egzogennej (to znaczy proteiny, jej analoga lub pochodnej znajdującej się w organizmie, bądź wytworzonej, bądź też podanej) w trakcie leczenia, w zależności od przebiegu terapii. Przykładowo, początkowo może być potrzebna stosunkowo wysoka dawka do zaobserwowania korzyści terapeutycznej, a następnie stosowane niższe dawki dla utrzymania korzyści terapeutycznych.

Materiały i metody

Materiały: Alginiany w postaci alginianu sodowego można uzyskać ze źródeł dobrze znanych w stanie techniki. Proteina OB i GCSF są z firmy Amgen Inc. Inne odczynniki chemiczne pochodzą ze źródeł dobrze znanych w stanie techniki.

Preparat cząstek/perełek hydrożelu alginianowego. Wytwarzanie cząstek i perełek hydrożelu alginianowego z dodatkiem i bez dodatku protein opisano szczegółowo w równolegle rozpatrywanym zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Am. nr 08/842,756, włączonym do obecnego opisu jako odnośnik literaturowy.

Preparat o opóźnionym żelowaniu. Wytwarzanie hydrożeli alginianowych o opóźnionym żelowaniu z dodatkiem i bez dodatku protein opisano szczegółowo w równolegle rozpatrywanych zgłoszenia patentowych Stanów Zjednoczonych Am. nr 08/857,913 oraz 08/912,902, z których każde jest włączone do obecnego opisu jako odnośnik literaturowy.

Poniższe przykłady podano w celu pełniejszego zilustrowania wynalazku, lecz nie należy ich rozumieć jako ograniczających zakres wynalazku. Ponadto, co się tyczy powyższego ujawnienia lub poniższych przykładów, biegły w sztuce będzie mógł wprowadzić do tego ujawnienia niezbędne zmiany dostosowując je dla potrzeb produkcji w większej skali.

P r z y k ł a d 1

Niniejszy przykład opisuje preparaty estrów alginianowych do stosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem.

Preparat A. Alginian tetrabutylamoniowy (TBA)

Żywicę kwasu sulfonowego (Bio-Rad, AG MP-50) przeprowadzono w formę soli tetrabutylamoniowej (TBA) przez działanie wodorotlenkiem tetrabutylamoniowym (Aldrich) stosując metodę wsadową w temperaturze pokojowej. Do roztworu 10 g soli sodowej kwasu alginowego w 800 ml wody destylowanej dodano 60 ml żywicy sulfonowej (Bio-Rad, AG MP-50) w postaci tetrabutylamoniowej. Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 0,5 godz. Żywicę usunięto przez odsączenie i przemyto wodą destylowaną. Alginian TBA wyodrębniono z przesączu przez liofilizację (wydajność 16.8 g) i potwierdzono przez ¹HNMR.

Preparat B. Częściowy ester etylowy kwasu alginowego, stopień estryfikacji (DE) = 30% mol..

Alginian TBA (6 g, 14,4 mmol jedn. TBA) rozpuszczono w 500 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w temperaturze pokojowej. Następnie dodano jodoetan (Aldrich, 673 mg, 4,3 mmol). Mieszaninę mieszano w 30°C przez 15 godz., a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej. Do tego roztworu powoli dodano roztwór 2 g NaCl w 20 mL wody, by całkowicie przeprowadzić TBA w sól sodową. Po mieszaniu przez 15-30 min, roztwór powoli wlano do 1500 mL octan etylu. Osad zebrano przez odsączenie i przemyto trzy razy układem aceton/woda (8:1 obj./obj.) i trzy razy acetonem, a następnie osuszono pod próżnią. Związek powtórnie rozpuszczono w wodzie destylowanej (~100 mL) i pH doprowadzono do ~6,5 stosując 0,2% NaHCO3 w 0°C. Roztwór następnie poddano dializie (Wartość graniczna MW 8000) przez noc względem wody destylowanej w 4°C, a następnie liofilizowano. Wydajność częściowego estru wynosi 2.8 g, a stopień estryfikacji. 30+/-1% (¹HNMR, maleimid jako wzorzec wewnętrzny).

Preparat C. Całkowity i częściowy ester etylowy kwasu alginowego, DE = 100%, 50%, 20%, 10% i 5%.

Wytwarzanie tych związków jest podobne do opisanego w Preparacie B oprócz tego, że ilość dodanego jodoetanu jest dobrana, by uzyskać żądany stopień estryfikacji.

PL 199 499 B1

Preparat D. Częściowe estry: propylowy, heksylowy, oktylowy i dodecylowy kwasu alginowego.

Wytwarzanie jest podobne do opisanego w Preparacie B i C powyżej, lecz podstawiając, odpowiednio, 1-jodopropan, 1-jodoheksan, 1-jodooktan lub 1-jodododekan w miejsce jodoetanu.

Preparat E. Częściowy ester benzylowy kwasu alginowego, DE = 30%.

Alginian TBA (2,5 g, 5,99 mmol jedn. TBA) rozpuszczono w ~200 mL DMSO w temperaturze pokojowej. Dodano bromek benzylu (Aldrich, 307 mg, 1,8 mmol) i jodek TBA (Aldrich, 30 mg). Mieszaninę mieszano w 30°C przez 15 godz., a następnie ochłodzono do temperatury pokojowej. Do tego roztworu powoli dodano roztwór 0,6 g NaCl w 10 mL wody, by całkowicie przekształcić TBA w sól sodową. Po mieszaniu przez 15-30 min, roztwór powoli wlano do 500 mL octanu etylu.

Osad zebrano przez odsączenie i przemyto trzy razy układem aceton/woda (8:1 obj./obj.) i trzy razy acetonem, następnie osuszono pod próżnią. Związek powtórnie rozpuszczono w wodzie destylowanej (~60 mL) i doprowadzono do pH ~6,5 stosując 0,2% NaHCO3 w 0°C, następnie poddano dializie (wartość graniczna MW 8000) przez noc względem wody destylowanej w 4°C. Wydajność częściowego estru wynosi 1,3 g, a stopień estryfikacji 30+/-1% (¹H NMR, maleimid jako wzorzec wewnętrzny).

Preparat F. Całkowity i częściowy ester benzylowy kwasu alginowego o różnym DE.

Wytwarzanie tych związków jest podobne do opisanego w Preparacie E oprócz tego, że dodawaną ilość bromku benzylu i jodku TBA dobrano tak, by uzyskać żądany stopień estryfikacji.

P r z y k ł a d 2

Niniejszy przykład dotyczy wytwarzania żelu estru alginianu etylu (DE = 15% mol. i 10% mol.) zawierającego lek proteinowy (Leptyna) i ilustruje uwalnianie in vitro z tego żelu.

Leptynę (100 mg/mL; 10 mM Tris HCl, pH 8,8; pH doprowadzone z 8,0 do 8,8 stosując 1M NaOH) i 6% ester etylowy alginianu (15% mol.,10 mM Tris HCl, pH 8,6) ochłodzono w kąpieli lodowej. Leptynę (0.5 mL) dodano do 6% estru etylowego alginianu (0,18 mL) i mieszaninę mieszano w kąpieli lodowej przez 10-15 min; końcowe pH wyniosło 8,6-8,8. Do tej mieszaniny dodano zawiesinę 1M CaCO₃ (16 μL) i uzyskaną zawiesinę dobrze wymieszano. Do tej zawiesiny kroplami dodano, mieszając, roztwór 0,1M ZnCl₂ (100 μL); następnie dodano wodę, by dopełnić objętość do 1 mL. Mieszaninę całkowicie wymieszano i trzymano w kąpieli lodowej przez 10-20 min. Następnie do tej mieszaniny wmieszano starannie roztwór 1,68 M δ-glukonolaktonu (Aldrich, 56 μL). Końcową mieszaninę (50 mg/mL leptyny, 1% ester etylowy alginianu; 0,1 mL) wylano do wnętrza naczynia Eppendorfa i pozostawiono przez noc w 4°C dla zżelowania. Po przechowaniu przez noc, przeprowadzono uwalnianie in vitro w 10 mM buforu histydynowego, pH 7,4. Zestalony żel o stopniu estryfikacji 15-% mol. daje minimalnie podwyższony poziom początkowy i względnie stałe uwalnianie leptyny wykazując 60% uwolnienia w 6 dni. Zestalony żel o stopniu estryfikacji 10% mol. daje minimalnie podwyższony poziom początkowy i względnie stałe uwalnianie leptyny wykazując 55% uwolnienia w 6 dni.

P r z y k ł a d 3

Niniejszy przykład dotyczy wytwarzania żelu estru heksylowego alginianu (DE = 15% mol. i 10% mol.) zawierającego lek proteinowy (Leptyna) i ilustruje powolne uwalnianie in vitro z tego żelu.

Przykład ten wykonano w podobny sposób jak opisano w Przykładzie 2 oprócz tego, że ester etylowy alginianu zastąpiono estrem heksylowym.

Żele estru heksylowego alginianu o stopniu estryfikacji 15% mol. i 10% mol. daje minimalnie podwyższony poziom początkowy oraz powolne uwalnianie (50% uwolnione w 6 dni).

P r z y k ł a d 4

Niniejszy przykład dotyczy wytwarzania żelu estru etylowego alginianu (DE = 15% mol.) zawierającego lek proteinowy (Zn-leptyna) i ilustruje powolne uwalnianie in vitro z tego żelu.

Do roztworu 4% (wag./obj.) estru etylowego alginianu (15% mol., 0,75 mL) dodano 1M Tris HCl pH 8,0 (7,5 μL), 0,5 M PIPES pH 6,8 (33 μL) i 0,1 M ZnCl₂ (8,5 μL). Mieszaninę dobrze wymieszano. Do tego roztworu dodano zawiesinę Zn-leptyna (100 mg/mL, 675 μL) i mieszaninę starannie wymieszano. Zawiesinę 1M CaCO₃ (24 μL) i roztworu 1,68 M d-glukonolaktonu (70 μL) zmieszano następnie starannie z tą mieszaniną. Końcową mieszaninę (0,1 mL) wylano do wnętrza naczynia Eppendorfa i pozostawiono przez noc w 4°C dla zżelowania. Po przechowaniu przez noc wykonano uwalnianie in vitro w 10 mM buforu histydynowego, pH 7.4. Ten zestalony żel estru etylowego alginianu o stopniu estryfikacji 15% mol daje minimalnie podwyższony poziom początkowy i powolne uwalnianie leptyny (65% uwolnione w 4 dni).

PL 199 499 B1

P r z y k ł a d 5

Niniejszy przykład podaje wytwarzanie żelu estru etylowego alginianu (DE = 30% mol.) zawierającego lek proteinowy (GCSF) i ilustruje powolne uwalnianie in vitro z tego żelu.

Do roztworu 2,39% estru etylowego alginianu (30% mol., 0,50 mL) dodano 0,1M bufor octanowy (pH 4,5, 100 μL), GCSF (104 gL, 48,2 mg/mL, HCl pH 3) i wodę destylowaną (246 mL). Mieszaninę dobrze wymieszano. Zawiesinę 1M CaHPO₄ (10 gL) i roztwór 1,68 M 5-glukonolaktonu (40 gL) starannie domieszano do tej mieszaniny. Końcową mieszaninę (0,2 mL) wylano do wnętrza naczynia Eppendorfa i pozostawiono przez noc w 4°C dla zżelowania. Po przechowaniu przez noc żelu wykonano uwalnianie in vitro w buforze 10 mM Tris, pH 7,5. Ten zestalony żel estru etylowego alginianu o stopniu estryfikacji 30% mol daje poziom początkowy niższy niż 5% i powolne uwalnianie (20% uwolnione w 1 dzień i 40% uwolnione w 2 dni).

P r z y k ł a d 6

Niniejszy przykład dotyczy wytwarzania żelu estru benzylowego alginianu (DE = 30% mol.) zawierającego lek proteinowy (GCSF) i ilustruje powolne uwalnianie in vitro z tego żelu.

Przykład ten wykonano w podobny sposób jak opisano w Przykładzie 5 z tą różnicą, że ester etylowy zastąpiony został przez ester benzylowy alginianu. Ester alginianu żeluje w ciągu przechowywania przez noc. Żel estru benzylowego alginianu o stopniu estryfikacji 30% daje poziom początkowy niższy niż 5% i powolne uwalnianie (40% uwolnione w 1 dzień oraz 80% uwolnione w 2 dni).

P r z y k ł a d 7

Przykład ten dotyczy wytwarzania perełek estru etylowego alginianu.

Perełki żelu wytwarzano przez dodawanie kroplami 2% roztworów estru alginianu do 100 mM roztworów chlorku wapnia (woda destylowana lub bufor 1M Tris HCl pH 7,0). Utworzone perełki przemyło wodą destylowaną lub buforem. Perełki wytwarzano utrzymując stopień estryfikacji 30% lub 50%.

P r z y k ł a d 8

Przykład ten ilustruje wytwarzanie perełek estru alginianowego zawierającego Leptynę.

Perełki wytwarzano przez dodawanie kroplami roztworu 25 mg/mL Leptyny w 2% estrze etylowym alginianu (Tris HCl, pH 8,7) do roztworu 100 mM chlorku wapnia i 25 mM chlorku cynku. Perełki wytwarzano utrzymując stopień estryfikacji 30%. Perełki wykazują powolne uwalnianie leptyny in vitro.

P r z y k ł a d 9

Przykład ten ilustruje zmniejszanie ciężaru cząsteczkowego (lub degradację) estrów alginianowych w buforach przy neutralnym fizjologicznym pH.

Estry alginianu (roztwór 1%) rozpuszczano w buforze fosforanowym (0,1 M fosforan sodu, pH 6,8) lub 0,1 M buforze Tris (pH 7,0) i inkubowano w 37°C. Zmniejszanie ciężaru cząsteczkowego jest oznaczane przez pomiar obniżenia lepkości roztworu (Brookfield, 25°C) w wybranych przedziałach czasowych.

Niezmodyfikowany alginian sodu okazał się stosunkowo trwały pod tym względem, że jego lepkość obniżyła się jedynie o 5% w ciągu 8 dni (bufor fosforanowy); jednak w przypadku estrów: etylowego i benzylowego kwasu alginowego (DE = 30%) lepkość spada o 35% w ciągu 8 dni w tym samym buforze. Wielkość degradacji estrów kwasu alginowego jest także zależna od stopnia estryfikacji, np. w przypadku estru etylowego o niższym stopniu estryfikacji (DE = 15%) lepkość obniża się o 25% w 8 dni. Zatem zmniejszanie ciężaru cząsteczkowego jest bezpośrednio zależne od stopnia estryfikacji.

P r z y k ł a d 10

Przykład ten ilustruje degradację (lub stopniowy zanik) in vivo hydrożeli estrów alginianowych bez proteiny i hydrożeli zawierających proteinę.

Żele estrów alginianowych wytwarzano w podobny sposób do opisanego w Przykładzie 3, lecz końcową mieszaninę umieszczano w strzykawce i pozostawiano do zżelowania w strzykawce w 4°C przez noc. Następnie podskórnie wstrzykiwano 100 gL żelu z tyłu szyi myszy (Charles River, samice 12-tygodniowe, BDF1, 20 g, 5 myszy na grupę) i miejsce okresowo badano chirurgicznie na różnych osobnikach z każdej grupy.

Przy stosowaniu materiału estru etylowego i benzylowego alginianu o stopniu DE = 30%, wyniki badania miejsca pojedynczej iniekcji pokazują, że hydrożele estrów alginianowych znikają w ciągu 2 tygodni. W przypadku stosowania żelu z estrem etylowym alginianu o DE = 15%, żele są wciąż obecne 30. i 61. dnia, lecz obserwuje się zmniejszoną wielkość. W przypadku stosowania estru etylowego alginianu o DE = 5%, żele są wciąż obecne 30. i 61. dnia przy małym obniżeniu wielkości. Stosując materiał z niepodstawionym alginianem sodu, żel pozostaje stosunkowo niezmieniony do 61 dnia.

PL 199 499 B1

Szybkość zaniku żeli z estrem alginianowym jest podobna w przypadku obecności proteiny oraz przy jej braku.

P r z y k ł a d 11

Przykład ten ilustruje dane utraty wagi u szczurów oraz dane farmakokinetyczne dla hydrożeli estru alginianowego zawierających leptynę.

Żele etylowego estru alginianowego wytwarzano w podobny sposób jak opisano w Przykładzie 4, lecz końcową mieszaninę wprowadzano do strzykawki i pozostawiono do zżelowania w strzykawce w 4°C przez noc. Szczurom podano jedną dużą dawkę 0 mg/kg (kontrolna) i 100 mg/kg, a następnie stężenia we krwi i utratę wagi monitorowano przez siedem dni.

Wyniki: ester etylowy alginianu o DE = 5% mol wykazuje stałe stężenie we krwi ~2000 ng/mL przez 3 dni, a następnie obniża się do 2~3 ng/mL przez następne 3-4 dni; ester etylowy alginianu o DE = 15% mol wykazuje stałe stężenie we krwi ~2000 ng/mL przez 2 dni, następnie obniża się do 2~3 ng/mL po 5 dniach; ester etylowy alginianu o DE = 30% mol wykazuje stężenie we krwi ~2000 ng/mL przez 1 dzień, i spada do 2~3 ng/mL po 4 dniach; stężenie we krwi zawiesiny Zn-leptyna osiąga maksimum po 12 godz., a następnie obniża się do 1-2 ng/mL po 6 dniach. Wszystkie zwierzęta wykazują utratę wagi pokazując, że kompleks Zn-leptyna jest aktywny. Wyniki także pokazują, że włączenie Zn-leptyny do żeli estru etylowego alginianu (DE = 5% mol. i 15% mol.) prawie podwaja (współczynnik 1,8-1,9) pole pod krzywą (AUC) kompleksu Zn-leptyna, sugerując podwojenie biodostępności; a zastosowanie żelu estru etylowego alginianu (DE=30% mol) wykazuje podobną biodostępność do Zn-leptyna, w oparciu o AUC.

Claims (32)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja o przedłużonym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem, zawierająca:

   a) biodegradowalny anionowy polisacharyd

   b) środek biologicznie czynny oraz

   c) co najmniej jeden związany wielowartościowy jon metalu, znamienna tym, że środek biologicznie czynny zawiera proteinę, a biodegradowalny anionowy polisacharyd jest estrem alginianowym usieciowanym jonowo tworząc nadający się do wstrzykiwania, biodegradowalny biokompatybilny hydrożel estru alginianowego.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że biodegradowalny anionowy polisacharyd jest usieciowanym estrem alginianowym alkoholu jednowodorotlenowego.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że związany wielowartościowy jon metalu jest mieszaniną związanego i niezwiązanego wielowartościowego jonu metalu.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienna tym, że zawiera ponadto co najmniej jedną zaróbkę dla stabilizowania biologicznie aktywnej proteiny lub anionowego polisacharydu.
5. 5. Kompozycja według zastrz. 1 albo 3, znamienna tym, że związany wielowartościowy jon metalu jest jego solą wybraną z grupy obejmującej octany, fosforany, mleczany, winiany, cytryniany, chlorki, węglany lub jego wodorotlenkami.
6. 6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że jon metalu jest wybrany z grupy obejmującej: mangan, stront, żelazo, magnez, wapń, bar, miedź, glin oraz cynk.
7. 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że jonem metalu jest wapń.
8. 8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że cechuje się zwiększoną biodostępnością.
9. 9. Kompozycja według zastrz. 1 albo 8, znamienna tym, że proteina jest zawarta w kompozycji w stężeniu co najmniej 0,001 mg/ml.
10. 10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że proteina jest wybrana z grupy obejmującej: czynniki hematopoetyczne, czynniki stymulowania kolonii, czynniki przeciw otyłości, czynniki wzrostu, czynniki troficzne i czynniki przeciwzapalne.
11. 11. Kompozycja według zastrz. 10, znamienna tym, że proteina jest wybrana z grupy obejmującej: leptynę, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferony, erytropoetynę, KGF, insulinę oraz ich analogi lub pochodne.
12. 12. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że środek biologicznie aktywny jest skompleksowanym środkiem biologicznie aktywnym.
13. 13. Kompozycja według zastrz. 12, znamienna tym, że skompleksowany środek biologicznie aktywny jest strąconą proteiną.

    PL 199 499 B1
14. 14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że strąconą proteiną jest osad cynk-leptyna.
15. 15. Wstępnie napełniona strzykawka zawierająca kompozycję jak określono w zastrz. 1 do 14.
16. 16. Formulacja farmaceutyczna zawierająca kompozycję o przedłużonym uwalnianiu, żelującą z opóźnieniem, jak określono w zastrz. 1 do 14 w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, rozcieńczalniku lub adjuwancie.
17. 17. Formulacja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że jest w strzykawce.
18. 18. Sposób wytwarzania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóźnieniem, znamienny tym, że:

    a) miesza się środek biologicznie aktywny i biodegradowalny anionowy polisacharyd z wytworzenie pierwszej mieszaniny,

    b) miesza się wskazaną pierwszą mieszaninę z co najmniej jednym związanym wielowartościowym jonem metalu z wytworzeniem drugiej mieszaniny, przy czym środek biologicznie czynny zawiera proteinę, a biodegradowalny anionowy polisacharyd jest estrem alginianowym usieciowanym jonowo tworząc nadający się do wstrzykiwania, biodegradowalny biokompatybilny hydrożel estru alginianowego.
19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że związanym wielowartościowym jonem metalu jest jego sól wybrana z grupy obejmującej octany, fosforany, mleczany, cytryniany, winiany, chlorki, węglany lub jego wodorotlenki.
20. 20. Sposób według zastrz. 18 albo 19, znamienny tym, że metal jest wybrany z grupy obejmującej mangan, stront, żelazo, magnez, wapń, bar, miedź, glin oraz cynk.
21. 21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że jonem metalu jest wapń.
22. 22. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że proteina jest wybrana z grupy obejmującej czynniki hematopoetyczne, czynniki stymulowania kolonii, czynniki przeciw otyłości, czynniki wzrostu, czynniki troficzne i czynniki przeciwzapalne.
23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że proteina jest wybrana z grupy obejmującej leptynę, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-1ra, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferony, erytropoetynę, KGF oraz ich analogi lub pochodne.
24. 24. Sposób według zastrz. 18 albo 22, albo 23, znamienny tym, że środek biologicznie aktywny jest skompleksowanym środkiem biologicznie aktywnym.
25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że skompleksowany środek biologicznie aktywny jest strąconą proteiną.
26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że strąconą proteiną jest osad cynk-leptyna.
27. 27. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że obejmuje ponadto etap wyodrębniania kompozycji o przedłużonym uwalnianiu.
28. 28. Kompozycja o przedłużonym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem, wytworzona sposobem jak określono w zastrz. 18.
29. 29. Kompozycja o przedłużonym uwalnianiu, żelująca z opóźnieniem jak określono w zastrz. 1 do stosowania w sposobach leczenia.
30. 30. Zastosowanie kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóźnieniem jak określono w zastrz. 1, w której środek biologicznie aktywny jest występującą w naturze, rekombinacyjną, syntetyczną lub semisyntetyczną leptyną do wytwarzania środka leczniczego do leczenia zaburzenia wybranego z grupy obejmującej nadmierną wagę, cukrzycę, wysoki poziom lipidów we krwi, miażdżycę naczyń, płytkę miażdżycową, niewystarczającą masę tkanki beztłuszczowej, niewystarczającą wrażliwość na insulinę i udar, a także do zmniejszania lub zapobiegania tworzeniu kamieni żółciowych.
31. 31. Zastosowanie kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóźnieniem jak określono w zastrz. 1, w której środek biologicznie aktywny jest występującym w naturze, rekombinacyjnym, syntetycznym lub semisyntetycznym G-CSF, do wytwarzania środka leczniczego do leczenia zaburzenia wybranego z grupy obejmującej niedobory komórek hematopoetycznych, infekcję i neutropenię,
32. 32. Zastosowanie kompozycji o przedłużonym uwalnianiu, żelującej z opóźnieniem jak określono w zastrz. 1, w której środek biologicznie aktywny jest występującym w naturze, rekombinacyjnym, syntetycznym lub semisyntetycznym IL-1ra, do wytwarzania środka leczniczego do leczenia stanu zapalnego.