CN1263472A - 缓释延迟凝胶剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用藻酸盐延迟凝胶的缓释制剂及其使用方法。

Description

缓释延迟凝胶剂

                  本发明领域本发明涉及使用藻酸盐延迟凝胶的缓释制剂和它们的方法。

                     背景

随着基因和细胞工程技术的发展，在蛋白质作为治疗应用的药物的用途方面重组蛋白质的可用性得到发展。以药用蛋白质治疗的许多疾病和状况需要持续的蛋白质水平来获得最有效的治疗结果。然而，如同大多数蛋白质药物一样，通常短的生物半寿期需要频繁给药。这些重复注射在多种间隔进行，其对于患者导致身体上明显波动的药物水平和造成经济负担。由于许多疾病对药物的控制水平有较好的反应，因而存在着药物的控制释放以提供更长期的连续释放的需求。这样的缓释药剂不仅提供给患者增强的预防、治疗或诊断作用而且也减少注射次数以及总体费用。

当前对人或动物在两次给药之间维持制药物水平的尝试包括使用生物降解聚合物作为控制药物释放的基质。例如，英国专利第1,388,580号公开了将水凝胶用于胰岛素的缓释。美国专利第4,789,550号公开了将聚赖氨酸包衣的藻酸盐微囊用于通过使活化细胞囊化(encapsulating)来传递蛋白质。缓释也尝试利用由相反电荷的离子聚合物包围的阴离子或阳离子聚合物的组合物，从而使能产生生物学活性组合物的细胞囊化。美国专利第4,744,933号。同样地，作为得到控制释放的方法也已经公开了阴离子或阳离子交叉聚合物的多层包衣。美国专利第4,690,682号和4,789,516号。另外，对于多肽组合物或者它的阳离子沉淀物的控制释放，进一步的尝试公开了单一的藻酸盐或者用其它生物降解聚合物包衣的藻酸盐的用途。PCT WO96/00081、PCT WO 95/29664和PCT WO 96/03 116。

然而，对于得到要求的蛋白质药剂缓释传递这些尝试只提供了欠缺的方法。众所周知，在体内条件下使用一定的生物可降解的聚合物如聚交酯co-乙交酯呈现出药剂释放的高初始破裂(bursts)。Johnson，O.等，Nature Med.，2/7：795(1996)。此外，众所周知，目前以缓释制剂形式使用的蛋白质能够在暴露于囊化剂时经历变性并且丧失它们的生物活性。这样的制剂使用能对蛋白质选择产生有害作用的有机溶剂。最后，如以下所讨论的那样，单独使用藻酸盐不提供对于有效的治疗结果必需的所要求的控制蛋白质释放。

一般地，藻酸盐是熟知的天然存在的、由1，4-连接的-β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸组成的阴离子多糖。Smidsrod，O.等，Trendsin Biotechnology，8：71-78(1990)；Aslani，P.等，J.Microencapsulation，13/5：601-614(1996)。藻酸盐通常从70％甘露糖醛酸和30％古洛糖醛酸变化至30％甘露糖醛酸和70％古洛糖醛酸。Smidsrod，同上。藻酸是不溶于水的，而用象钠、钾和铵单价离子形成的盐是溶于水的。McDowell，R.H.，“Properties of Alginates”(伦敦，Alginate IndustriesLtd.，第4版1977)。多价阳离子已知与藻酸盐反应来自发地形成凝胶。

藻酸盐具有广泛的应用如食品添加剂、胶粘剂、药用片剂、新细胞生长模板和伤口敷料。藻酸盐也被推荐用于蛋白分离技术。例如Gray，C.J.等，在Biotechnology and  Bioengineering，31：607-612(1988)中为了把胰岛素同其它血浆蛋白分离开来，以藻酸锌/钙凝胶捕集胰岛素。

藻酸盐基质已经很好地证明能用于药物传递系统，例如参见U.S.专利第4,695,463号公开的以藻酸盐为基质的咀嚼凝胶传递系统和药用制剂。藻酸盐珠已经用于多种蛋白的控制释放：如以多价阳离子包衣的阳离子-藻酸盐珠中的肿瘤坏死因子受体，Wee，S.F，Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.，21：730-31(1994)；以藻酸盐珠包囊化的转移生长因子，Puolakkainen，P.A.等，Gastroenterology，107：1319-1326(1994)；以藻酸钙珠捕集的血管生成因子、Downs，E.C.等，J.of Cellular Physiology，152：422-429(1992)；以藻酸脱乙酰壳多糖微囊捕集的白蛋白，Polk，A.等，J.Pharmaceutical Sciences，83/2：178-185(1994)，或者以聚合物包衣的脱乙酰壳多糖-藻酸钙珠，Okhamafe，A.O.等，J.Microencapsulation，13/5：497-508(1996)；用脱乙酰壳多糖-藻酸钙珠囊化的血红蛋白，Huguet，M.L.等，J.Applied PolymerScience，51：1427-1432(1994)，Huguet，M.L.等，Process Biochemistry，31：745-751(1996)；和用脱乙酰壳多糖-藻酸盐微球囊化的白细胞介素-2，Liu，L.S.等，Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，22：542-543(1995)。

使用藻酸盐凝胶珠或者藻酸盐/钙凝胶珠以捕集蛋白质的系统受到由于蛋白质从该藻酸盐珠迅速释放而缺乏任何缓释作用。Liu，L.等，J.Control.Rel.，43：65-74(1997)。为了避免这样的迅速释放，多种以上的系统尝试使用聚阳离子聚合物包衣(例如聚赖氨酸、脱乙酰壳多糖)来延迟蛋白质藻酸盐珠的释放。参见例如，Wheatley，M.A.等，J.Applied Polymer Science，43：2123-2135(1991)；Wee，S.F.等.同上；Liu，L.S.等.同上；Wee S.F.等，Controlled Release Society，22：566-567(1995)和Lim，等，同上。

聚阳离子如聚赖氨酸为带正电荷的聚电解质，它与带负电荷的藻酸盐分子相互作用以形成在珠表面担任扩散屏障(barries)的聚电解质烙合物。随着聚阳离子的使用产生了一些问题：(1)由于聚阳离子的存在，这样的制剂可能是细胞毒性的(Huguet，M.L.等，同上；Zimmermann，Ulrich，Electrophoresis，13：269(1992)；Bergmann，P.等，Clinical Science，67：35(1984))；(2)聚阳离子易于氧化；(3)用聚阳离子包衣的珠趋向于在体内不会受到侵蚀和聚集；(4)这样的制剂通过包括聚阳离子聚赖氨酸的多层包衣的麻烦的包衣方法来制备(Padol，等，Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater，2：216(1986)和(5)蛋白质和聚阳离子之间的离子相互作用能够导致蛋白质活性丧失或引起蛋白质的不稳定性。

除了上述系统以外，也存在着注射之后形成凝胶的或者为基于有机的和/或基于触变性的传递系统。注射后在体内形成凝胶的凝胶贮库能延缓所捕集药物的释放。这些将包括poloxamers胶凝作用感应的温度，(例如Pluronics^，U.S.专利第2,741,573号)。这些在冷的温度下为液体，但是在提高的温度如体温则形成凝胶。这些系统由于在环境温度条件下的多变性并且如果使用皮下注射的话尤其在解剖温度的多变性而难于控制。

至于基于有机的胶凝作用系统，这样的系统不适宜于在有机溶剂存在下或非生理条件下不稳定的脆弱的蛋白质药物。在油中的硬脂酸铝的触变性凝胶也已经用于延长青霉素的活性。Buckwalter，等，J.Am.Pharm Assoc.，137：472(1948)；Thompson，R.E.，AmericanJournal Clinical Nutrition，7：311(1959)；Thompson，Robert.E.，SustainedRelease of Parenteral Drugs，Bulletin of Parenteral Drug Assoc.，14：6-17，(1960)；Chen，Y.，Joumal of Parenteral Science & Tech.，35：106(1981)。在含有系统的这些类型的油存在下，蛋白质趋向于不稳定。

包括在体内控制胶凝作用延迟时间的缓释药物传递系统在本领域并不是众所周知的。然而，在植物组织培养、细胞的固定、微球的形成、杀昆虫剂的释放和食品工业的范围内，这些类型的延迟凝胶系统则是已知的。例如，作为使钙离子释放进入胶凝作用的溶液中的质子供体，藻酸盐已经用于不溶性钙络合物和δ-葡糖酸内酯。参见Draget，等，Appl Microbiol.Biotechnol，31：79-83(1989)。同样地，相似的系统通过乳化作用和内部胶凝作用已经用于藻酸盐珠的形成。使用在植物油中分散的藻酸盐来产生藻酸盐微球并且通过降低pH以从不溶性络合物中释放钙来开始凝胶化作用。参见Poncelet，D.等，Appl.Microbiol.Biotechnol，43：644-650(1995)。藻酸盐系统也被用来固定细胞。Burke，C.在Methods of Enzymology，135：175-189(1987)中公开了磷酸二钙和δ-葡糖酸内酯能用于延缓细胞胶凝作用的藻酸盐。U.S.专利第4,053,627号公开了在水溶液环境中控制杀昆虫剂释放的藻酸盐凝胶盘的使用。对于生物活性药物尤其是蛋白质的缓释来说，这些如上所提到的用途并未设计为在体内形成凝胶的贮库。

因此，需要开发对于临床应用而言可获得更好的缓释方法的延迟凝胶药用制剂。大量的重组或者天然蛋白质能通过延迟凝胶制剂从恒定长期释放受益，并且因此提供更有效的临床效果。

本发明提供了这样的进展。本发明延迟凝胶药用组合物能提供蛋白质保护、通过增加蛋白质的稳定性和效力来减少降解和缓慢溶解。而且，为了有效的预防、治疗或者诊断结果，本发明药用组合物能提供简单的、迅速的和廉价的控制重组蛋白质释放的方法。

                   本发明概述

本发明涉及使用藻酸盐延迟凝胶的缓释制剂和它们的方法。特别的，该缓释延迟凝胶的制剂包括带有生物活性药物的触变性藻酸盐凝胶。为了缓释传递而达到蛋白质保护、减少降解、增加所传递药物的稳定性和效力的目的，该方法提供了在藻酸盐延迟凝胶中产生高效率的和高负荷的生物活性药物的有利条件。此外，时控胶凝作用提供了更好地控制形成凝胶的性质和它的给药方法。

因此，本发明一方面提供了包括亲水性聚合物、生物活性药物和至少一种结合的多价金属离子的缓释延迟凝胶组合物。通过游离的钙水平即未结合的多价金属离子来控制胶凝作用的速率。该生物活性药物能够以络合的形式存在。络合分子和任何相关络合剂的形成为本领域技术人员所熟知。另外，以上组合物可进一步含有多价金属离子，其为结合和未结合的多价金属离子的混合物。由于这些延迟凝胶的时控性质，使这些混合物放入人体中能在注射后形成凝胶的部位。此外，由于该组合物在凝胶状态下的触变性性质，这些混合物能在处于凝胶状态时进行注射，例如，通过从注射器中压出，在人体中它们再次形成凝胶。

本发明的另一个方面提供了包括亲水性聚合物、生物活性药物、至少一种结合的多价金属离子并且进一步包括了至少一种可使结合的多价金属离子游离的质子供体的缓释延迟凝胶组合物。来自质子供体的质子的释放使得来自结合的多价金属离子的阳离子释放。

另一个方面提供了产生本发明的缓释延迟凝胶组合物的方法。一种方法包括使生物活性药物和亲水性聚合物与溶剂混合来形成第一种混合物并且使第一种混合物与至少一种结合的多价金属离子混合以形成第二种混合物的步骤。一种可以替代的方法包括使生物活性药物和亲水性聚合物与溶剂混合来形成第一种混合物；使第一种混合物与至少一种结合的多价金属离子混合来形成第二种混合物；和使第二种混合物与至少一种能释放结合的多价金属离子的质子供体混合的步骤。该结合的多价金属离子和质子供体也能一起加到第一种混合物中，或者该质子供体先于该结合的多价金属离子之前加到第一种混合物中。此外，也期待了分离该缓释延迟凝胶组合物的步骤。

正如这里所使用的，术语结合的多价金属离子指的是以盐或螯合物形式或离子络合物存在的多价金属离子。结合的多价金属离子能够包括结合的和未结合的多价金属离子的混合物。这包括如上所提到的使结合的多价金属离子释放出来成为未结合的多价金属离子。正如这里所使用的，术语能够释放出结合的多价金属离子的质子供体指的是强酸、弱酸、或者能够产生酸的物质，例如内酯或酯(通过水的水解)、或溶解不良的酸或缓慢溶解的酸如己二酸。

正如这里所使用的，术语溶剂指的是能够分散或溶解生物学活性药物、亲水性聚合物、多价金属离子、质子供体或选择的络合剂的基于水或非水的溶剂。这样的溶剂为本领域技术人员所熟知。通过本领域技术人员所熟知的方法，包括(但不局限于)倾入和搅拌、小滴加入、分散、喷雾或通过喷雾喷嘴、空气喷嘴、雾化和电子场混合能够进行以形成第一种混合物和第二种混合物的加料方法。用于本发明目的的术语分散意指液体、固体或气体的分散。正如这里所使用的，术语分离指的是本发明缓释延迟凝胶组合物的分离方法。这样的分离和纯化方法为本领域所熟知的。

另一方面，本发明提供了通过以上方法制备的缓释延迟凝胶组合物。进一步方面包括了在药学上可接受的载体或辅助剂中的以上组合物的延迟凝胶药用制剂。另外，该延迟凝胶组合物能够包含在注射器中。

再一方面，本发明提供了用含有所要求的生物活性药物的缓释延迟凝胶组合物治疗适应症的方法。

                本发明详细描述

组合物

包括藻酸盐和它的衍生物的亲水性聚合物能够从各种商业的、天然的或为本领域所熟知的合成来源得到。如在这里使用的术语亲水性聚合物指的是水溶性聚合物或者对于吸收水分具有亲和力的聚合物。亲水性聚合物为本领域技术人员所熟知。这些包括(但不局限于)聚阴离子，其包括阴离子化的多糖类如藻酸盐、吉兰、羧甲基直链淀粉、聚丙烯酸盐、聚甲基丙烯酸盐、亚乙基马来酐共聚物(半酯)、羧甲基纤维素、葡聚糖硫酸酯、肝素、羧甲基葡聚糖、羧基纤维素、2，3-二羧基纤维素、三羧基纤维素、羧基阿拉伯胶、羧基卡拉胶、羧基果胶、羧基西黄蓍胶、羧基黄原胶、戊聚糖多硫酸酯、羧基淀粉、羧甲基壳多糖/脱乙酰壳多糖、curdlan、肌醇六硫酸酯、β-环糊精硫酸酯、透明质酸、软骨素-6-硫酸酯、硫酸皮肤素、肝素硫酸酯、羧甲基淀粉、卡拉胶、多聚半乳糖醛酸酯、羧基瓜尔豆胶、多聚磷酸盐、多醛-碳酸、多-1-羟基-1-磺酸酯-丙烯-2、共聚苯乙烯马来酸、琼脂糖、内消旋聚糖、磺基丙醇化聚乙烯醇、纤维素硫酸酯、硫酸鱼精蛋白、磷瓜尔豆胶、聚谷氨酸、聚天门冬氨酸、聚氨基酸、它们的衍生物或结合物。本领域技术人员将意识到处在本发明范围内的其它多种亲水性聚合物。

同样地，结合多价金属离子能够从多种商业的、天然或为本领域所熟知的合成来源得到。本发明范围内结合的或多价螯合的多价金属离子包括(但不局限于)锰、锶、铁、镁、钙、钡、铜、铝或锌。金属离子能够从络合剂的溶解性的盐、乙酸盐、磷酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、氢氧化物、或者脂肪酸阴离子如它的油酸盐等而获得。本领域技术人员将意识到处在本发明范围内的其它多种结合的多价金属离子/络合物。结合的多价金属离子能够包括结合的和未结合的多价金属离子的混合物。

如在这里使用的，质子供体指的是能够产生酸的物质。质子供体能够释放结合的或多价螯合的多价金属离子。质子供体为本领域所熟知的并且包括(但不局限于)内酯如葡糖酸内酯、酯、缓冲剂和其它的慢溶解酸。正如在这里使用的，慢溶解酸指的是酸例如具有低的溶剂溶解性的固体酸。此外，慢溶解酸包括缓慢释放酸的装置或包衣材料。本领域范围内所熟知的酸包括乙酸、己二酸、枸橼酸、富马酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、磷酸和酒石酸。本领域技术人员将意识到处在本发明范围内的其它多种质子供体。

如在这里使用的，术语缓冲剂或缓冲溶液指的是使用无机酸或者有机酸或碱或其组合以制备本领域所熟知的缓冲液。这些也包括两性物质或氨基酸。本发明范围内的无机酸包括卤化氢(例如盐酸)、磷酸、硝酸或硫酸。其它无机酸为本领域技术人员所熟知的并在这里所期待。本发明范围内的有机酸包括脂肪羧酸和芳香酸如甲酸、碳酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、丙烯酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、马来酸、富马酸、甘氨酸或苯酚磺酸。其它有机酸为本领域技术人员所熟知。有机碱包括TRIS、吡啶、PIPES和HEPES。氨基酸缓冲剂包括甘氨酸和甘氨酸/磷酸混合物。

如在这里使用的，生物活性药物指的是重组或天然来源的蛋白质，无论人或动物，用于预防、治疗或诊断应用，以及基于非蛋白的药物如小分子的寡核苷酸和无机的或有机药物。该生物活性药物能是天然的、合成的、半合成的或其衍生物。此外，本发明的生物活性药物是可沉淀的。广泛的生物活性药物是所期待的。这些包括(但不局限于)激素、细胞因子、造血因子、生长因子、抗肥胖因子、营养因子、抗炎因子和酶(也参见对于有用的生物活性药物的附加实施例的U.S.专利第4,695,463号)。本领域技术人员将能易于适应所要求的本发明的组合物的生物活性药物。

这样的蛋白质包括(但不局限于)干扰素(参见U.S.专利第5,372,808号、第5,541,293号、第4,897,471号和第4,695,623号，其包括附图通过引用结合到本文中)、白细胞介素(参见U.S.专利第5,075,222号，包括附图通过引用结合到本文中)、促红细胞生成素(参见U.S.专利第4,703,008号、第5,441,868号、第5,618,698号、第5,547,933号和第5,621,080号，包括附图通过引用结合到本文中)、粒细胞集落刺激因子(参见U.S.专利第4,810,643号、第4,999,291号、第5,581,476号、第5,582,823号、和PCT申请第94/17185号，包括附图通过引用结合到本文中)、干细胞生长因子(参见PCT申请第91/05795号、第92/17505号和第95/17206号，包括附图通过引用结合到本文中)和OB蛋白(参见PCT申请第96/40912号、第96/05309号、第97/00128号、第97/01010号和第97/06816号，包括附图通过引用结合到本文中)。另外，生物活性药物也包括(但不局限于)抗肥胖相关产物、胰岛素、胃泌素、催乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促胃动素、干扰素(α、β、γ)、白细胞介素(IL-1至IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子-结合蛋白(TNF-bp)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、胶质衍生神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3(NT3)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经营养生长因子(NGF)、骨生长因子如osteoprotegerin(OPG)、胰岛素样生长因子(IGFs)、巨细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨核细胞衍生生长因子(MGDF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、血小板生成素、血小板衍生生长因子(PGDF)、集落刺激生长因子(CSFs)、骨形态发生蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶(SOD)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、尿激酶、链激酶和激肽释放酶。如在这里使用的，术语蛋白包括肽、多肽、共有分子、其类似物、衍生物或结合物。

生物活性药物的衍生物可包括使一个或多个化学部分附着到蛋白部分。在一定环境下已经发现生物活性药物的化学修饰提供附加的优势，如增加稳定性和治疗蛋白的循环时间并减少免疫原性。本领域技术人员将能够选择基于所要求的剂量、循环时间、蛋白水解耐受性、治疗用途和其它考虑的所要求的化学修饰。衍生物例如聚乙二醇和Fc融合蛋白是可取的。

络合物

生物活性药物可以络合的形式存在。这将包括沉淀的形式，构成的形式和同其它分子的缔合(association)。药物的这些络合形式能够减少药物从凝胶脱离的扩散速率并且因此维持该药物释放。这些络合的形式包括(但不局限于)与抗体、底物、受体、类脂、聚合物和沉淀剂络合的生物活性药物。

例如该生物活性药物、类似物或衍生物可络合为结合组合物给药。这样的结合组合物除了以上的好处以外也可具有延长药物、类似物或衍生物的循环时间或者增强生物活性药物的活性的作用。这样的组合物可为蛋白质(或者同义的肽)、衍生物、类似物或结合物或非蛋白药物。

通过例证，对于OB蛋白来说，结合蛋白为OB蛋白受体或它的部分，如它的可溶部分。其它结合蛋白可以通过检查OB蛋白或血浆中选择的蛋白、或对于结合的存在进行经验筛选来确定。这样的结合将典型地不干扰OB蛋白或类似物或衍生物去结合内源性OB蛋白受体的能力和/或影响信号传导。除了OB蛋白之外，结合络合物也将适合于本发明的其它治疗蛋白。那些本领域技术人员将能够确定用于本发明的适当结合蛋白。

同样地，用于使生物活性药物沉淀的沉淀剂能够从多种商业的、天然的或为本领域所熟知的合成来源得到。沉淀剂包括(但不局限于)多价金属离子或它们的盐如乙酸盐、枸橼酸盐、氯化物、碳酸盐、氢氧化物、草酸盐、酒石酸盐或它们的氢氧化物、酸、或水溶性聚合物。特别地，金属离子能够包括(但不局限于)铝、钡、钙、铁、锰、镁、锶和锌。优选地该金属离子为锌或它的盐，像乙酸盐氯化物盐。也能使用水溶性小分子和盐如硫酸铵、丙酮、乙醇和甘油。

至于水溶性聚合物，这些包括(但不局限于)聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羟乙基纤维素、直链淀粉、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸、葡聚糖、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化的多元醇、琥珀酸聚乙烯醇酯、甘油、环氧乙烷、环氧丙烷、poloxamers、烷氧基化共聚物、水溶性聚阴离子、它们的衍生物或组合物(combinations)。水溶性聚合物可具有任何的分子量，并且可为分枝的或非分枝的。例如，为了易于处理和沉淀效率，优选的聚乙二醇分子量为大约700Da和大约100kDa之间。

可以使用其它体积和类型的沉淀剂，这取决于所要求的治疗模式(例如所要求的缓释持续时间、作用、如果在生物活性方面任意的话、易于处理、抗原性的程度或缺乏和对于治疗蛋白或类似物所要求的沉淀剂的其它已知的作用)而定。本领域技术人员将意识到本发明范围内的其它沉淀剂。

此外，本发明组合物也可包括额外的使生物活性药物稳定所必须的赋形剂和/或亲水性聚合物。这些能够包含在缓冲液中，并且可包括(但不局限于)防腐剂。

药用组合物

本发明缓释药用组合物可通过口服(例如使在胃或肠进行胶凝作用的液体制剂)和非口服制剂(例如肌内、皮下、经皮、内脏、IV(静脉)、IP(腹膜内)、关节内、放在耳中、ICV(大脑室内)、IP(腹膜内)、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、注射、肺、鼻、直肠和子宫透膜制剂)给药。一般地，包含蛋白或衍化产物的有效量的缓释延迟凝胶药用组合物通过本发明理解为带有药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、辅助剂和/或需要用于给药的载体的本发明的缓释组合物。(参见通过引用结合到本文中的PCT 97/01331)。要求的生物活性药物的最佳药用制剂将被本领域技术人员依给药途径和要求的剂量来确定。示范性的药用组合物在Remington氏PharmaceuticalScience(Mack Publishing Co.，第18版，Easton，PA，pgs.1435-1712(1990))中公开。

由于延迟凝胶制剂的触变性，注射器可用于皮下给药。该组合物可在注射器内凝胶化然后注射。该胶凝作用以时间延迟方式实施。通过审慎的调节形成凝胶药物和质子供体(如果使用的话)的量以及该多价金属离子的粒子体积和混合物的温度来控制定时。这样的制剂用于注射后在体内随后的再胶凝作用。这里所使用的术语触变性指的是在压力下降低的凝胶混合物的粘度，例如在该混合物能流动的那点上，从注射器柱塞如通过注射针头然后在注射部位再形成凝胶。

延迟胶凝作用的概念也能应用于填充注射器，在那里缓释凝胶组合物填充在注射器内并且在预先设定的时间在注射器内形成凝胶，例如在填充后从几分钟至若干小时。这就避免了用已经凝胶化的材料填充注射器的问题。这些预先填充的注射器能够贮存，以便为了以后注射给患者。

需要给药的组分包括稀释剂或多种pH和离子强度的缓冲剂(例如Tris-HCl、乙酸盐)、添加剂如表面活性剂和增溶剂(例如吐温80、HCO-60、聚山梨醇脂80)、脂类、脂质体、抗氧剂(例如抗坏血酸、谷胱甘肽、偏酸式亚硫酸钠)、其它的多聚糖(例如羧甲基纤维素、藻酸钠、透明质酸钠、硫酸鱼精蛋白、聚乙二醇)、防腐剂(例如Thimersol、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)和增效物质(例如乳糖、甘露醇)；聚合化合物例如聚乙酸/聚乙醇酸聚合物或共聚物等颗粒制剂的材料的掺合，或者与脂质体结合。透明质酸(Hylauronic)也可用做给药的组分，并且这可具有更进一步促进循环中的缓释持续时间的作用。此外，本发明的缓释组合物也可以油(例如芝麻油、玉米油、植物)分散或为它与磷酯(例如卵磷脂)的混合物、或为中等链脂肪酸甘油三酯(例如Miglyol 812)来提供油状悬浮剂。本发明组合物也可以分散剂如水溶性多聚糖(例如甘露醇、乳糖、葡萄糖、淀粉)、透明质酸、甘氨酸、血纤维蛋白、胶原和无机盐(例如氯化钠)来分散。

此外，为了使治疗产品在肺部传递，也设计了用于本发明缓释组合物给药的机械装置包括(但不局限于)喷雾器、计量供给剂量的吸入器和粉剂吸入器，它们全都为本领域技术人员所熟悉。

给药组分可影响本发明蛋白和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。本领域技术人员将意识到依治疗用途、给药途径、所要求剂量、循环时间、对蛋白水解的抵抗、蛋白质稳定性和其它考虑而定来使用适当的给药成分和/或适当的机械装置。

使用方法

治疗剂治疗用途依所使用生物活性药物而定。就本发明来说对于它的预期的治疗用途，本领域技术人员将能够易于适应所要求的生物活性药物。在下列通过引用结合到本文中包括附图的公告中，更加详细地阐明了这样的药物的治疗用途。治疗用途包括(但不局限于)蛋白质像干扰素(参见U.S.专利第5,372,808号、第5,541,293号、第4,897,471号和第4,695,623号，包括附图，通过引用结合到本文中)、白细胞介素(参见U.S.专利第5,075,222号，包括附图，通过引用结合到本文中)、促红细胞生成素(参见U.S.专利第4,703,008号、第5,441,868号、第5,618,698号、第5,547,933号和第5,621,080号，包括附图，通过引用结合到本文中)、粒细胞集落刺激因子(参见U.S.专利第4,999,291号、第5,581,476号、第5,582,823号、第4,810,643号和PCT公告第94/17185号，包括附图，通过引用结合到本文中)、干细胞因子(PCT公告第91/05795号、第92/17505号和第95/17206号，包括附图，通过引用结合到本文中)和OB蛋白(参见PCT公告第96/40912号、第96/05309号、第97/00128号、第97/01010号和第97/06816号，包括附图，通过引用结合到本文中)的用途。

另外，本发明的治疗用途包括生物活性药物的用途，其包括(但不局限于)抗肥胖相关产物、胰岛素、胃泌素、催乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、促胃动素、干扰素(α、β、γ)、白细胞介素(IL-1至IL-12)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子-结合蛋白(TNF-bp)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、胶质衍生神经营养因子(GDNF)、神经营养因子3(NT3)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经营养生长因子(NGF)、骨生长因子如osteoprotegerin(OPG)、胰岛素样生长因子(IGFs)、巨细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨核细胞衍生生长因子(MGDF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、血小板生成素、血小板衍生生长因子(PGDF)、集落刺激生长因子(CSFs)、骨形态发生蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶(SOD)、组织纤溶酶原激活物(TPA)、尿激酶、链激酶和激肽释放酶。如在这里使用的术语蛋白质包括肽、多肽、共有序列分子、它们的类似物、衍生物或结合物。另外，本组合物也用于生产一种或多种用于治疗或改善预计使用该生物活性药物来治疗的疾病的药物制剂。

联合治疗。本发明组合物和方法可与其它疗法例如改变饮食和锻炼联合使用。其它药物制剂如那些用于治疗糖尿病的(例如胰岛素和可能的淀粉不溶素)、降低胆固醇和血压的制剂(例如那些降低血脂水平的制剂或其它心血管药物制剂)、活性增强制剂(例如安非他明)、利尿药(对于液体消除)和食欲抑制剂。如此给药可以是同时的或可以是依次的。此外，本发明方法可与外科手术方法联合使用，例如设计以改变人体的整个外表的整容手术(例如脂肪抽吸或设计来降低体重的激光手术、或者设计来增加体重外貌的植入手术)。可通过伴随使用本发明组合物和方法来增加心脏手术例如分流术手术或其它设计来缓解由通过脂肪沉积如动脉血小板造成血管阻塞引起的有害疾病的手术的健康好处。消除胆结石的方法例如超声或激光方法也可以在本治疗方法之前、之中或之后使用。此外，本发明方法可作为断骨、损坏肌肉或其它通过使瘦弱组织质量增加来改善的其它疗法的手术或治疗的辅助方法。

剂量

本领域技术人员将能够通过给药和观察所要求的治疗效果来确定有效剂量。该缓释制剂的剂量是对于给出的时间期间在体内必须达到生物活性药物的有效浓度的量。该缓释制剂的剂量和优选的给药次数随着生物活性药物的类型、所要求的释放持续时间、靶疾病、要求的给药次数、经受治疗的动物种类和其它因素而变化。优选地，该分子制剂在大约0.10ug/kg/天和100mg/kg/天之间将获得所要求的治疗效果。

该有效剂量可使用诊断工具随时间进行测量。通过实施例，本发明提供了OB蛋白的剂量。例如，测量OB蛋白在血中(血浆或血清)的量的诊断方法可首先用于测量OB蛋白的内源性水平。像这样的诊断工具可以抗体试验例如抗体三明治(间接荧光)试验的形式存在。最初量化内源性OB蛋白的量并且测量基线。由于内源性和外源性OB蛋白(即自身产生或给予的在体内发现的蛋白质、类似物或者衍生物)的量化贯穿治疗过程，所以治疗剂量得以确定。例如，最初可能需要相对高的剂量，直到观察到治疗效益，然后使用较低的剂量维持治疗效果。

材料和方法

材料.以藻酸盐形式存在的藻酸盐能够从来源中发现，或者通过本领域熟知的方法来制备。Leptin，GCSF和共有序列干扰素来自Amgen.Inc.(安进公司)，其它化学品来自本领域熟知的来源。

延迟凝胶制剂-导言。该延迟凝胶通过合并生物活性药物和阴离子聚合物(例如藻酸盐)、多价阳离子盐(例如CaCO₃)和质子供体(例如酸化的缓冲剂或缓慢释放或溶解的酸来源如δ-葡糖酸内酯)的混合物(如果使用的话)来制备。对于所有情况而言，阴离子聚合物、蛋白质和任何沉淀剂/赋形剂能够制备为一种混合物。通过把多价阳离子盐和质子来源(如果使用的话)加入该混合物中开始胶凝作用。将质子、多价金属离子加入到该聚合物生物活性药物混合物中，这种加入可以同时地或者分开地首先加入质子供体或者首先加入多价金属离子。对于缓冲剂诱导的胶凝作用来说，多价阳离子盐和质子来源可在胶凝作用进程中混合为含水的混悬液。在胶凝作用开始后，于胶凝作用发生前填充注射器(典型地5至10分钟)。对于在位(situ)胶凝作用在材料形成凝胶之前实施注射，或在材料形成凝胶之后实施注射。

蛋白-藻酸盐混合物。制备溶剂和沉淀剂/赋形剂的混合物(例如锌盐、缓冲剂等)。以迅速的连续过程，蛋白质(例如在10mM Tris-HCl中的Leptin，pH8)溶液和无菌藻酸盐(例如压热的10％溶液)迅速混合。当生物活性药物制备为细的悬浮液时(例如锌-Leptin典型地在10-15mg/mL下形成)，浓缩该悬浮液是需要的。

钙盐.钙盐可制备为在水中的细粉末的压热悬浮液(例如在水中9.1％CaCO₃)。

质子来源。对于缓冲剂诱导的凝胶，钙盐悬浮液能与缓冲剂例如1M Tris HCl，pH7.0或0.5M PIPES，pH6.7结合。

对于缓慢溶解或缓慢释放酸来源(δ-葡糖酸内酯)来说，在使用前不久的一个选择的时间(例如混合前1分钟)把给定重量的粉末溶解在水中。该酸来源和钙盐干燥的、无菌粉末的预先称重的混合物也能用来使该过程简化。

溶剂.该溶剂可为水溶性的、非水溶性的或它们的混合物。非水溶性溶剂的实例为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甘油、聚乙二醇、Pluronics^等。

胶凝作用.聚合物-药物混合物的胶凝作用能够通过加入钙盐开始。该混合物的温度和该盐的量和粒度能够用于控制胶凝作用的速率。如果额外使用质子供体的话，该混合物的胶凝作用能够通过加入1)钙盐和酸化缓冲剂悬浮液(分开或一起)，2)钙盐悬浮液随后加入新鲜的缓慢释放质子来源的溶液/悬浮液，或者反过来也是这样，或3)钙盐粉末和质子来源共同或分开加入来开始。在加入钙盐后，其它沉淀剂/赋形剂(例如锌盐、缓冲剂等)可加到该混合物中。在彻底和迅速混合后，在它形成凝胶前该凝胶混合物可抽入到注射器中。

凝胶负荷.一般地，负荷的蛋白质为已知的。未知的凝胶负荷可如下测定。

破裂方法.把大约0.1-0.2mL(精确称重)的凝胶投入到Eppendorf试管中，然后溶解在1mL的0.1M枸橼酸钠中。该混合物伴随温和的振荡在室温下孵育直到凝胶崩解(一般地为2小时至过夜)。在所生成的悬浮液以8Krpm离心2分钟(Eppendorf，5415C)后，测得该上清液的吸收在280nm。把任何残留的固体溶解在1mL的7M脲中；记录该溶液的吸收。从这些吸收可计算出每克凝胶中蛋白质的毫克数。

累积方法.这个方法与体外释放研究联合使用。统计在研究结束时从凝胶中包括破裂释放出来的蛋白质的量。详细地，参见有关体外释放研究的部分。

体外释放研究.该凝胶或者在Eppendorf管(“投入”样品)中或者从注射器中形成然后挤出至Eppendorf管(“挤出”样品)中。一般地，大约0.1-0.2mL(精确称重)的凝胶被投入或挤出。通过把缓冲液(10mM Tris HCl，对于leptin为pH8，对于GCSF为pH7.4)加入到每一个试管中并将它置于培养箱摇床(New Brunswick Scientific)，在37℃和100-200rpm下使释放开始。在选择的时间间隔，从培养箱中取出该样品。如果凝胶是完整的，取出上清液并离心(Eppendorf，8000rpm，2分钟)并且收集上清液。为了再开始释放，把任何固体悬浮于1mL新鲜的Tris缓冲剂中并且返回到最初的释放试管中。如果凝胶大量破裂，使该试管内容物离心，收集上清液并把固体重新悬浮于1mL缓冲剂中以再开始释放。该上清液“时间点”可需要进一步离心(8000-13,000rpm，8分钟)以使它们澄清来用于进行UV扫描。从该上清液的吸收测定所释放蛋白质的量。在采集最后的释放样品后，在珠中余下来的量通过Burst方法测定(上述)。所给定时间释放的百分率从释放的累积蛋白质来测定，其表达为在凝胶上最初所负荷的蛋白质(从凝胶的重量和其制剂的方法中已知)或者最后所释放的总蛋白质(包括最后枸橼酸-脲破裂)的部分。

体内研究.

小鼠体重降低。六到八周龄雌性C57/BLC品系小鼠从Charlesriver和Taconic Inc.得到。它们一般重20克。每一个剂量组由五只小鼠组成。注射方式为皮下。

大鼠PK研究.在该研究中使用雄性大鼠并且它们一般重250-300克。注射以相似于小鼠体重降低实验中所描述的方式实施。注射后在不同时间间隔通过导管收集采集的血样，并且该样品通过ELISA试验分析Leptin。

                      实施例

所提供下列实施例更加充分地阐明了本发明，但是并不构成对本发明范围的限制。此外，关于上面公开的或以下的实施例，本领域技术人员将能够对于大规模生产对该公开作出必要的修改。实施例1

该体内实施例显示在缓冲剂诱导的延迟凝胶中的leptin是活性的并且与leptin的溶液相比较呈现缓释作用。该实施例也阐明了在注射进入动物以后形成凝胶的系统。从筛分的小于75微米粒度的固体制备无菌碳酸钙悬浮液。把带有Tris pH7的预先混合液加到在藻酸盐(在10mM Tris中，pH8)的leptin中，以便于使这些成分的最终浓度为：2％藻酸盐(无菌过滤)、10mg/mL leptin、7mM Tris pH8、150mM TrispH7和24mM CaCO₃(假定完全溶解)。像这样的混合物在八至九分钟内即形成凝胶。当忽略leptin时，该胶凝作用时间稍长(10-12分钟)。这就允许有填充于注射器的时间。

把该延迟凝胶制剂(在尚未形成凝胶时)以100mg/kg/天隔天注射到一组小鼠中(相当于以50mg/kg给予2天)。第二组用leptin溶液(在Tris缓冲剂中10mg/mL)以每天50mg/kg注射，而第三组接受leptin溶液，以100mg/kg隔天注射。每天称重小鼠并且该体重变化以相当于小鼠最初体重的百分率表达。

以延迟凝胶给药的隔天剂量表给出每天注射leptin溶液的体重减轻几乎相同(8-9％)。比较起来，隔天给予leptin溶液显示较短期间内重量减轻更少(6％)。后一组在8天内回到它的基线体重，而其它组在10-11天恢复到它们的原来的体重。实施例2

该实施例显示缓冲剂介导的藻酸钙延迟凝胶的生成与未凝胶化的制剂相比较在体外能延长缓释过程。将碳酸钙悬浮液制备成为很细粉末的100mg/mL的悬浮液。把带有pH6.7的PIPES缓冲剂的预先混合液加入到在从浓缩的leptin溶液(当加入锌时，在Tris pH8的83mg/mL)生成的在藻酸盐(Tris在pH8时缓冲)中的leptin锌悬浮液中。取1mL这样的混合物投入10mL的烧杯中。所有成分的最终浓度为：2％藻酸盐(来自10％Keltone LVCR压热的溶液)、15mM Tris pH8、50mg/mL leptin、1mM ZnCl₂、10mM CaCO₃(假定完全溶解)和93mM PIPES pH6.7。在leptin不存在下，像这样的混合物在七分钟内即形成胶体。在过夜胶凝作用后，称重0.2g的凝胶片，并且放入到在37℃下的摇床上的闪烁小管内用于释放。把这种释放与不含有钙和PIPES(无藻酸钙凝胶)的相同制剂的释放作比较。当leptin锌藻酸盐变浓时，制剂(未形成凝胶)被释放。在5小时的时间点为75％，并且在随后～3天内逐渐释放至90％。然而，在藻酸钙延迟凝胶中的leptin锌呈现持久得多的释放，即在5小时为35％，在一天时为60％，然后在5天内更逐渐释放至70％。实施例3

该实施例显示δ-葡糖酸内酯介导的含有leptin的凝胶作为细的锌沉淀物，维持leptin的释放。把leptin(在Tris pH8中的～14mg/mL)加到pH6.7的PIPES溶液中，并且使之与ZnCl₂溶液立即混合，随后迅速加入藻酸盐溶液(10％压热的)以便于这些成分的最终浓度为：1.1mM ZnCl₂、2.2％藻酸盐、10mM Tris(pH8)和22mM PIPES(pH6.7)。通过离心使该混合物浓缩直到leptin的水平为46mg/mL。然后通过在CaCO₃悬浮液(细粉)中搅拌随后迅速加入δ-葡糖酸内酯溶液制备该凝胶混合物。这些成分的最终浓度为：2％藻酸盐、20mMPIPES、9mM Tris、1mM ZnCl₂、16mM CaCO₃(假定完全溶解)和79mMδ-葡糖酸内酯。在胶凝作用前把该混合物抽入注射器中，10分钟后在注射器中发生胶凝作用。过夜贮存(室温下3小时然后在4℃下放置)之后，把该凝胶注射进入小鼠体内，与缓冲剂对照组相比较监测体重的减轻。

leptin以50mg/kg/天注射五天即250mg/kg在凝胶中的大丸剂，并且与无leptin的溶液中的相同大丸剂进行比较。该无leptin的大丸剂在2-3天内仅显示最大值为4.4-4.8％的中等程度的体重减轻，并且在第5天开始增加体重。与之相比较，在2至4天内，凝胶中的leptin锌产生9％的体重减轻。在5天时，对于凝胶的体重减轻仍然在5％，并且当该实验在第7天结束时它保持在基线上方(保持体重减轻)。实施例4

该实施例显示如果藻酸盐-1eptin-锌混合物的蛋白质浓度足够高的话，该混合物在钙不存在下形成呈现缓释的凝胶。把leptin(在Tris pH8中～14mg/mL)加到缓冲液中，并且使之与ZnCl₂溶液立即混合，随后迅速加入藻酸盐溶液(压热10％)以至于这些成分最终浓度为：1.1mM ZnCl₂、1.1或2.2％藻酸盐、10mM Tris(pH8)和22mM PIPES pH6.7(如果存在的话)。通过离心使该混合物浓缩直到leptin固体达到所要求的浓度。～50mg/mL的制剂具有PIPES和2.2％藻酸盐。～100mg/mL的制剂不具有PIPES和具有1.1％藻酸盐。

对于实施例3的50mg/mL钙凝胶的这些成分的最终浓度为：2％藻酸盐、20mM PIPES、9mM Tris、1mM ZnCl₂、16mM CaCO₃(假定完全溶解)和79mMδ-葡糖酸内酯。对100mg/mL钙凝胶，除了这些成分的最终浓度为：1％藻酸盐、PIPES忽略不计、13mM CaCO₃和67mMδ-葡糖酸内酯之外，此制剂是相似的。

对于含有钙的凝胶，在胶凝作用前把该混合物抽入注射器中，10分钟后在注射器中发生胶凝作用。当在凝胶中不包括钙时，把Zn-leptin-藻酸盐混合物抽入注射器中并使之形成凝胶。似乎无钙的50mg/mL制剂不形成凝胶。过夜贮存(室温下3小时然后在4℃下放置)之后，把该凝胶注射进入小鼠体内，与缓冲剂对照组相比较监测体重减轻。

Leptin以50mg/kg/天注射五天即250mg/kg在凝胶中的大丸剂，实施例3的钙凝胶在2-4天内产生9％的体重减轻；在五天时对凝胶的体重减轻仍然在5％，并且当该实验在第七天结束时它保持在基线上方(保持体重减轻)。比较而言，在2至4天内无钙的50mg/mL制剂产生3％的体重减轻，然而在第5天体重减轻跌至0。相反，无钙的100mg/mL leptin制剂至少与有钙的100mg/mL leptin制剂一样有活性。对于无钙的峰体重减轻，100mg/mL凝胶在4天时为9％，对于有钙的峰体重减轻，100mg/mL凝胶在4天时也为6％。该两种制剂在第9天开始增加体重。实施例5

该实施例显示从藻酸盐延迟凝胶能够制备体外缓释leptin而在不首先形成细的leptin-锌沉淀物。在冰浴中使leptin(100mg/mL；10mMTris HCl，pH8.8；以1M NaOH把pH从8.0调整至8.8)和6％的藻酸盐(10mM Tris HCl，pH8.6)冷却。把leptin(0.5mL)加入到该6％的藻酸盐(0.18mL)中，并且在冰浴中搅拌该混合物10-15分钟；最终pH为8.6-8.8。向该混合物加入1M CaCO₃悬浮液(16mcL)，并且很好地搅拌该生成的悬浮液。在搅拌下向该悬浮液滴加0.1M ZnCl₂(100mcL)溶液；然后加入水使体积升至1mL。使该悬浮液混合物完全混合并在冰浴中保持10-20分钟。然后1.68M的δ-葡糖酸内酯(56mcL)溶液在彻底搅拌下加入到该混合物中。把0.1mL量的最终混合物(50mg/ml leptin，1％藻酸盐)投入到Eppendorf管中并在4℃下过夜。

过夜贮存后，以10mM组氨酸(pH7.4)介导体外释放。投入的凝胶呈现极少的破裂，并且在第6天时相当恒定的释放50％的leptin实施例6

该实施例显示δ-葡糖酸内酯介导的含有leptin的凝胶作为细的锌沉淀物，比在未形成凝胶的藻酸盐中的相同锌悬浮液产生更持久的leptin释放。含有leptin锌的凝胶如在实施例3中那样得以制备。以相同的方法，制备藻酸盐中未形成凝胶的leptin锌悬浮液，除了CaCO₃和δ-葡糖酸内酯被省略外。使用250mg/kg的大剂量注射给予小鼠，并且体重减轻实验如实施例3所描述的进行。在2-4天内未形成凝胶的悬浮液仅产生3％的体重减轻，而在相同的期间，形成了凝胶的悬浮液则产生9％的体重减轻。在第5天时，对于未形成凝胶的悬浮液而言，体重减轻回到基线，而在第7天当实验结束时，对于形成了凝胶的悬浮液而言，体重减轻还保持在基线的上方。实施例7

该实施例显示了在雄性大鼠的药物动力学/药效学研究中的零级释放动力学，证实了在实施例3中所描述的通过凝胶组合物传递的leptin的缓释和同时存在的持久作用(例如体重减轻)。该leptin浓度为47mg/mL，并且如实施例3中所描述的那样在注射器中预先形成凝胶。以0mg/kg(对照组)、50mg/kg、250mg/kg大丸剂的剂量给予大鼠，然后在6天内监测血液水平和体重减轻。不含凝胶的Leptin-锌沉淀物也以100mg/kg的剂量注射进入大鼠体内。

贯穿这个期间，高剂量Leptin凝胶组呈现稳定的～2000ng/mL血液水平，而低剂量Leptin凝胶组在4天内具有那个水平的～1/5。但是，无凝胶组的Leptin呈现了2300ng/mL的血液水平，其在12小时达峰，然后在相同时间内下降达100倍(factor)。对于高剂量Leptin凝胶组在相同期间内大鼠的体重稳定地下降(相对于溶媒对照组)。低剂量Leptin凝胶组的体重在将近5天内伴随相同的过程；在这一点上，低剂量组的Leptin血液水平下降。

该Leptin药物的生物利用度通过与Leptin凝胶制剂、无凝胶Leptin制剂和Leptin静脉给药的剂量正态化的曲线下面积相比较来评定。与生物利用度为63％的无凝胶Leptin制剂相比较，Leptin凝胶制剂的生物利用度为80％。实施例8

该实施例显示了来自延迟凝胶溶媒的G-CSF的体外缓释。“投入”和“挤出”材料得以举例说明。在pH3.4水中的G-CSF与浓缩的藻酸盐(10％)混合以形成模糊的、粘性的悬浮液。该混合物分别用16mM的CaCO₃和79mM的δ-葡糖酸内酯来形成凝胶。在胶凝作用前，该材料的等分试样或者投入试管中或者抽入注射器中。室温下1小时后，该凝胶在4℃下贮存(过夜)。在实施释放研究之前，把注射器中的凝胶挤进试管并且让它放置20分钟。然后加入释放缓冲剂。在3天的期间内挤进的凝胶呈现出GCSF释放，即在1小时为11％，在一天时为35％，在两天时为75％，在三天时为约90％。投入的凝胶在1小时释放22％，在一天时为80％，并且在两天时为94％。实施例9

该实施例证实了在没有加入质子供体的情况下，来自从钙盐(CaSO₄)制备的藻酸盐延迟凝胶的Leptin的体外缓释。把pH8的未缓冲的Leptin用于形成在2％藻酸盐中的锌-Leptin悬浮液。ZnCl₂和Leptin的最终浓度分别为1mM和55mg/mL。把CaSO₄的细粉末与锌-Leptin-藻酸盐悬浮液混合以使最终的混合物在CaSO₄中为10mM。该材料的等分试样在Eppendorf管壁上脱落。该混合物在4-5分钟内形成凝胶。

在室温下过夜贮存后，进行释放研究。来自该凝胶的蛋白质释放在1小时呈现低的破裂(≤5％)。在一天时释放11％的Leptin。对于以后的7天，Leptin逐渐释放，每天1.1％。实施例10

该实施例证实了在没有加入质子供体的情况下，来自从非水溶剂中的钙盐制备的藻酸盐延迟凝胶的Leptin的体外缓释。把Leptin的冻干粉末悬浮在干燥的二甲基亚砜中的2％藻酸盐中。把油酸钙的细粉末与藻酸盐-Leptin的悬浮液混合以使在钙中的最终混合物为10mM。使该材料的等分试样在试验试管壁上脱落。该混合物在此时间内形成凝胶。

在室温下过夜贮存后，进行释放研究。在下一个七天内来自该凝胶的蛋白质释放是逐渐的和持久的。实施例11

该实施例证实了如在实施例10中描述的，来自从钙盐制备的藻酸盐凝胶的Leptin的体内缓释。在250mg/kg下单次注射含有Leptin的凝胶后进行小鼠的体重减轻研究。几天内测量体重减轻。实施例12

该实施例证实了在没有加入质子供体的情况下，来自从非水溶剂中的钙盐制备的藻酸盐延迟凝胶的G-CSF的体外缓释。把G-CSF的冻干粉末悬浮在干燥的二甲基亚砜中的2％藻酸盐中。把油酸钙的细粉末与藻酸盐-G-CSF的悬浮液混合以使最终混合物在钙中的浓度为10mM。使该材料的等分试样在试验试管壁上脱落。该混合物在此时间内形成凝胶。

在室温下过夜贮存后，进行释放研究。蛋白质释放是逐渐的和持久的。实施例13

该实施例显示如在U.S.专利第4,695,623号(同上)中所公开的来自藻酸盐延迟凝胶的共有序列干扰素的体外缓释。把水、ZnCl₂、Tris缓冲剂和共有序列干扰素(在10mM Tris中，pH7.5)与藻酸盐溶液混合。然后再与CaCO₃和δ-葡糖酸内酯混合，以使这些组分的最终浓度为1mg/mL共有序列干扰素、10mM ZnCl₂、1％藻酸盐、20mMTris、10mM CaCO₃和40mMδ-葡糖酸内酯。该混合物在Eppendorf管壁上脱落(每一个试管0.4mL)，在室温下形成凝胶并且在4℃下贮存过夜。在贮存过夜之后，在10mL组氨酸缓冲液(pH7.4)中进行体外释放。所脱落的凝胶呈现小的初始的破裂-在1小时的释放百分率为3％，在一天时为14％。到第4天时已经释放70％。在5-6天时，该释放比率减缓至每天＜5％。实施例14

该实施例显示藻酸盐延迟凝胶能用于共有序列干扰素的缓释。藻酸盐共有序列干扰素延迟凝胶根据实施例13来制备，除了最终浓度如下外为：0.2mg/mL共有序列干扰素、10mM ZnCl₂、2％藻酸盐、20mM Tris、10mM CaCO₃和40mMδ-葡糖酸内酯。用相同的成份制备另一种制剂，除了共有序列干扰素最终浓度为1mg/mL外。该混合物以注射器抽取并且在2小时后形成凝胶。将0.2mg/mL的制剂以1mg/kg皮下注射，而1mg/mL的制剂以1mg/kg和5mg/kg给予雄性叙利亚仓鼠。通过心脏穿刺术采集血液并且鉴定共有序列干扰素以观察该药的缓释。

Claims (50)

1.缓释延迟凝胶组合物，包括：

a)亲水性聚合物；

b)生物活性药物；和

c)至少一种结合的多价金属离子。

2.权利要求1的缓释组合物进一步包括d)至少一种能够使结合的多价金属离子游离的质子供体。

3.权利要求1或2的缓释组合物，其中结合的多价金属离子为结合的和未结合的多价金属离子的混合物。

4.权利要求1或2的缓释组合物进一步包括使该生物活性药物或亲水性聚合物稳定的赋形剂。

5.权利要求1或2的组合物，其中所述结合的多价金属离子选自乙酸盐、磷酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、氯化物、硫酸盐、碳酸盐、氢氧化物、或其脂肪酸阴离子的盐。

6.权利要求5的组合物，其中所述金属离子选自锰、锶、铁、镁、钙、钡、铜、铝或锌。

7.权利要求6的组合物，其中所述金属离子为钙。

8.权利要求1或2的组合物，其中所述亲水性聚合物为聚阴离子。

9.权利要求1或2的组合物，其中所述亲水性聚合物为多糖。

10.权利要求9的组合物，其中所述多糖为酸性多糖。

11.权利要求10的组合物，其中所述多糖为藻酸盐。

12.权利要求11的组合物，其中所述藻酸盐含有至少30％的guluronic酸。

13.权利要求11的组合物，其中藻酸盐至少占0.05％(重量)。

14.权利要求1或2的组合物，其中所述生物活性药物包括蛋白质。

15.权利要求14的组合物，其中所述蛋白质至少为0.001mg/ml。

16.权利要求14的组合物，其中所述蛋白质选自造血因子、集落刺激因子、抗肥胖因子、生长因子、营养因子和抗炎因子。

17.权利要求14的组合物，其中所述蛋白质选自leptin、G-CSF、SCF、BDNF、GDNF、NT3、GM-CSF、IL-1ra、IL2、TNF-bp、MGDF、OPG、干扰素、促红细胞生成素、KGF、胰岛素和它们的类似物或衍生物。

18.权利要求1或2的组合物，其中所述生物活性药物为络合的生物活性药物。

19.权利要求18的组合物，其中所述络合的生物活性药物为沉淀的蛋白质。

20.权利要求19的组合物，其中所述沉淀的蛋白质为leptin锌沉淀物。

21.权利要求2的组合物，其中所述质子供体来自酸来源。

22.权利要求21的组合物，其中酸来源选自缓冲剂、酯、慢溶解的酸或内酯。

23.生产缓释延迟凝胶组合物的方法，包括下列步骤：

a)使生物活性药物与亲水性聚合物在溶剂中混合以形成第一个混合物；和

b)使第一个混合物与至少一种结合的多价金属离子混合以形成第二个混合物。

24.权利要求23的方法进一步包括步骤c)使第二个混合物与至少一种能够释放结合的多价金属离子的质子供体混合。

25.权利要求23或24的方法，其中所述结合的多价金属离子选自乙酸盐、磷酸盐、乳酸盐、枸橼酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、氯化物、碳酸盐、氢氧化物或其脂肪酸阴离子的盐。

26.权利要求25的方法，其中所述金属离子选自锰、锶、铁、镁、钙、钡、铜、铝或锌。

27.权利要求26的方法，其中所述金属离子为钙。

28.权利要求23或24的方法，其中所述亲水性聚合物为聚阴离子。

29.权利要求23或24的方法，其中所述亲水性聚合物为多糖。

30.权利要求29的方法，其中所述多糖为酸性多糖。

31.权利要求30的方法，其中所述多糖为藻酸盐。

32.权利要求31的方法，其中所述藻酸盐含有至少30％的guluronic酸。

33.权利要求31的方法，其中所述藻酸盐至少占0.05％(重量)。

34.权利要求23或24的方法，其中所述生物活性药物包括蛋白质。

35.权利要求34的方法，其中所述蛋白质至少为0.001mg/ml。

36.权利要求34的方法，其中所述蛋白质选自造血因子、集落刺激因子、抗肥胖因子、生长因子、营养因子和抗炎因子。

37.权利要求34的方法，其中所述蛋白质选自leptin、G-CSF、SCF、BDNF、GDNF、NT3、GM-CSF、IL-1ra、IL2、TNF-bp、MGDF、OPG、干扰素、促红细胞生成素、KGF或其类似物或衍生物。

38.权利要求23或24的方法，其中所述生物活性药物为络合的生物活性药物。

39.权利要求38的方法，其中所述络合的生物活性药物为沉淀的蛋白。

40.权利要求39的方法，其中所述沉淀的蛋白质为leptin锌沉淀物。

41.权利要求23或24的方法进一步包括分离该缓释组合物的步骤。

42.权利要求24的方法，其中所述质子供体来自酸来源。

43.权利要求42的方法，其中所述酸来源选自缓冲剂、酯、慢溶解的酸或内酯。

44.根据权利要求23、24或41的方法生产的缓释组合物。

45.权利要求1或2的包括在药学上可接受的载体、稀释剂或辅助剂中的缓释组合物的药用制剂。

46.权利要求45的药用制剂，其中该制剂在注射器中。

47.使用在药学上可接受的载体、稀释剂或辅助剂中的权利要求1或2的缓释组合物治疗适应症的方法

48.使用在药学上可接受的载体、稀释剂或辅助剂中的权利要求1或2的缓释组合物治疗选自体重过量、糖尿病、高血脂水平、动脉硬化、动脉蚀斑(artherial plaque)的疾病的方法，减少或预防胆结石形成、不足的肌肉组织重量、对于胰岛素敏感性不足和中风的方法，其中所述生物活性药物为leptin、它的类似物或衍生物。

49.使用在药学上可接受的载体、稀释剂或辅助剂中的权利要求1或2的缓释组合物，治疗选自造血细胞缺乏、感染和嗜中性白细胞减少的疾病的方法，其中所述生物活性药物为G-CSF、它的类似物或衍生物。

50.使用在药学上可接受的载体、稀释剂或辅助剂中的权利要求1或2的缓释组合物治疗炎症的方法，其中所述生物活性药物为IL-1ra、它的类似物或衍生物。