PT1079811E - Géis de alginato biodegradáveis com libertação prolongada - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "GÉIS DE ALGINATO BIODEGRADÁVEIS COM LIBERTAÇÃO PROLONGADA"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção presente diz respeito a formulações usando pérolas de gel de alginato biodegradáveis e/ou géis com libertação prolongada, e a métodos a esse efeito.

ESTADO DA TÉCNICA Á DATA DA INVENÇÃO

Com os progressos nas tecnologias de engenharia genética e de células, a disponibilidade de proteínas recombinantes tem gerado um aumento da utilização de proteínas como medicamentos para aplicações terapêuticas. Muitas das doenças que são tratadas com proteínas farmacêuticas necessitam de teores de proteína duráveis para se conseguir o resultado terapêutico mais eficaz. No entanto, tal como com a maior parte das proteínas farmacêuticas, a vida média biológica geralmente curta implica uma administração frequente. Estas injecções repetidas são administradas a diversos intervalos, com o resultado de se obterem teores medicamentosos flutuantes, e um fardo físico e monetário significativo para os pacientes. Uma vez que vários estados respondem melhor a teores controlados de um fármaco, existe uma necessidade de 2 assegurar a libertação controlada de um medicamento para proporcionar períodos mais longos de libertação consistente. Esses medicamentos com libertação prolongada proporcionariam ao paciente não só efeitos profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos mais importantes, mas também uma diminuição da frequência das injecções, bem como dos custos totais.

As tentativas correntes para se obterem teores duráveis de medicamentação entre doses, em seres humanos ou em animais, têm incluído a utilização de polímeros biodegradáveis como matrizes, para controlar a libertação dos medicamentos. Por exemplo, na Patente do Reino Unido N°. 1.388.580 descreve-se a utilização de hidrogéis para a libertação durável de insulina. Na Patente U. S. N°. 4.789.550 descreve-se a utilização de micro cápsulas de alginato revestidas com polilisina para veicular proteína encapsulando células vivas. Também se tem incluído nas tentativas de proporcionar uma libertação prolongada, composições poliméricas aniónicas ou catiónicas rodeadas por polímeros iónicos com a carga oposta, para encapsular células capazes de produzir composições biologicamente activas, na Patente U. S. N°. 4.744.933. De igual forma, também foram descritas camadas múltiplas de polímeros aniónicos ou catiónicos, formadores de ligações cruzadas, como meios de se obter uma libertação controlada, nas Patentes U. S. NoS. 4.690.682 e 4.789.516. Para além disto, Para além disto, noutras tentativas descreve-se a utilização de alginatos por si sós, ou de alginatos 3 revestidos com outros polímeros biodegradáveis, para a libertação controlada de composições de polipéptidos ou os seus precipitados catiónicos, nos PCT WO 96/00081, PCT WO 95/29.664 e PCT WO 96/03.116.

Na Patente Japonesa JP 1.005.460 descreve-se um método para a produção de material em gel para funcionar a prazo, usando goma gelana e um sal de metal alcalino terroso.

Na EP-A 719.548 descreve-se um método para gelificar polietilenoglicol líquido, à temperatura ambiente, com acetato de cálcio, para se obterem géis substancialmente translúcidos.

Estas tentativas, no entanto, têm proporcionado meios insuficientes para se obter a veiculação durável dos fármacos proteicos para que ela era pretendida. É sabido, em geral, que a utilização de determinados polímeros biodegradáveis, por exemplo co-glicólido de polilactido, sob condições in vivo, exibe picos iniciais de libertação do medicamento; Johnson, O. et al. , Nature Med., 2(7): 795 (1996). Para além disso, sabe-se em geral que as proteínas utilizadas com as formas correntes de preparações para libertação prolongada podem sofrer desnaturação e perder a sua actividade biológica quando são expostas aos seus agentes de encapsulação. Essas preparações recorrem a solventes orgânicos que podem ter efeitos nocivos sobre a proteína seleccionada. Por último, tal como se descreve 4 adiante, a utilização de alginato por si só não proporcionou a libertação controlada pretendida de proteína, que era necessária para se obterem os efeitos terapêuticos pretendidos.

Em geral, os alginatos são polissacáridos constituídos por ácido D-manurónico ligado em β-1,4 e ácido α-L-gulurónico; Smidsrod, 0. et al., Trends in Biotechnol., 8: 71-78 (1990); Aslani, P. et al., J. Microencapsulation, 13 (5): 601-614 (1996). Os alginatos têm uma composição que varia tipicamente entre 70 % de ácido raanurónico e 30 % de ácido gulurónico, e 3 0 % de ácido manurónico e 70 % de ácido gulurónico,· Smidsrod, acima. O ácido algínico é insolúvel em água, enquanto os seus sais, formados com iões monovalentes tais como sódio, potássio e amónio são solúveis em água; McDowell, R. H.,"Properties of Alginates" (London, Alginate Industries Ltd, 4a edição 1977).Sabe-se que os catiões polivalentes reagem com alginatos e formam espontaneamente géis.

Os alginatos têm uma grande diversidade de aplicações por exemplo como aditivos alimentares, adesivos, em comprimidos farmacêuticos e em pensos para feridas. Os alginatos também têm sido recomendados para técnicas de separação de proteínas. Por exemplo, veja-se, Gray, C. J. et al., em Biotechnology and Bioengineering, 31: 607-612 (1988), insulina armadilhada em géis de alginato de zinco/cálcio para a separação da insulina, de outras proteínas do soro. 5

Também estão bem documentadas as matrizes de alginato nos sistemas de veiculação de fármacos; veja-se, por exemplo, a Patente U. S. N° . 4.695.463, que descreve uma pastilha elástica baseada em alginato como sistema de veiculação de fármacos e preparações farmacêuticas. Têm sido utilizadas pérolas de alginato para a libertação controlada de diversas proteínas, tais como: receptor de factor de necrose tumoral em pérolas de alginato catiónico revestidas com policatiões, Wee, S. F, Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater., 21: 730-31 (1994); transformação de factor de crescimento encapsulado em pérolas de alginato, Puolakkainen, P. A. et al., Gastroenterology, 107: 1319-1326 (1994); factores angiogénicos armadilhados em pérolas de alginato de cálcio, Downs, E. C. et al. , J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albumina armadilhada em micro cápsulas de quitosana-alginato, Polk, A. et al., J. Pharmaceutical Sciences, 83(2) : 178-185 (1994); pérolas de alginato de cálcio - quitosana revestidas com polímeros, Okhamafe, A. 0. et al., J. Microencapsul., 13(5) : 497-508 (1996); hemoglobulina encapsulada em pérolas de alginato de cálcio - quitosana, Huguet, M. L. et al. , J. Applied Polymer Science, 51: 1427-1432 (1994), Huguet, M. L. et al., Process Biochemistry, 31: 745-751 (1996); e interleuquina-2 encapsulada em micro esferas de quitosana - alginato, Liu, L. S. et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995). 6 A Patente U. S. 5.700.848 descreve um método de se produzirem micro cápsulas que encapsulam materiais biológicos, e são revestidas com materiais poliméricos, incluindo, por exemplo, alginato polimerizável ou compósitos de alginato polimerizáveis, e PEG.

Os sistemas baseados em pérolas de gel de alginato, ou em pérolas de gel de alginato/cálcio, para armadilhar proteínas, sofrem de uma falta de quaisquer efeitos conducentes a uma libertação prolongada, devido à rápida libertação da proteína a partir das pérolas de alginato, Liu, L. et ai., J. Control. Rei., 43: 65-74 (1997) . Para impedir uma tal libertação rápida, uma série desses sistemas recorrem à utilização de revestimentos com polímeros policatiónicos (por exemplo, polilisina, quitosana), para protelar a libertação da proteína a partir das pérolas de alginato, veja-se por exemplo, Wheatley, M. A. et al., J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S. F. et al. acima; Liu, L. S. et al. acima; Wee, S. F. et al., Controlled Release Society, 22: 566-567 (1995) e Lim, et al. acima.

Os policatiões, tais como a polilisina, são polielectrólitos positivamente carregados que interactuam com as moléculas de alginato que têm carga negativa para formar complexos de polielectrólitos, os quais actuam como barreiras difusionais sobre a superfície das pérolas. Podem ocorrer problemas na utilização de policatiões, devidos sobretudo a: (1) essas formulações poderem ser citotóxicas 7 devido aos policatiões, Huguet, M. L. et al. , acima; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13: 269 (1992); Bergmann, P. et al., Clinicai Science, 67: 35 (1984); (2) os policatiões serem susceptíveis à oxidação; (3) as pérolas com revestimentos de policatiões serem de difícil erosão, e tenderem a acumular-se no corpo; (4) essas formulações serem feitas utilizando procedimentos trabalhosos de revestimento nos quais se incluem múltiplos revestimentos com o policatião polilisina, Padol, et al. , Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater, 2: 216 (1986), e (5) as interacções iõnicas entre a proteína e os policatiões poderem originar a perda da actividade da proteína, ou provocar instabilidade na proteína.

Francesco et al., Patente U. S. N° . 5.336.668 (e as referências citadas nesse documento) descrevem ésteres parciais e totais de ácido algínico, feitos por diferentes processos, e possuindo propriedades farmacêuticas interessantes. Descreve-se como se poderiam utilizar os ésteres de ácido algínico como materiais plásticos biodegradáveis para utilizações medicinais e cirúrgicas; como aditivos para uma larga gama de materiais poliméricos; ou a sua utilização na preparação de diversos medicamentos. Não é descrita a utilização potencial dos alginatos esterifiçados em formulações para libertação prolongada, nem são descritos hidrogéis de alginato esterifiçado.

Na EP-A 613.693 descreve-se um material solúvel em água para pensos de feridas, que inclui um éster 8 alginato de um álcool polihídrico Ci-C6, um humectante constituído por um ou mais álcoois polihídricos Ci-Ce, e opcionalmente água.

Tateshita, Kengo et al. , Biological Pharm. Bulletin, 16(4), páginas 420-424, (1993), descrevem pérolas de gel de alginato contendo o antagonista de cálcio, Nefedipina, e preparadas utilizando a formação de géis de alginato ou de alginato e PGA.

Nightlinger et al. , Proceed. Inter. Symp. Control. Rei. Bioact. Mater., 22: 738-739 (1995), descrevem micro esferas de ácido hialurónico (HA) esterificado tendo propriedades de libertação controlada. As referências dizem em geral respeito às diferentes taxas de degradação para os derivados de HA respectivos, w descrevem como o éster "sofre clivagem" para libertar as espécies alcoólicas e de HA. Não há qualquer descrição de como e se acontece uma clivagem do esqueleto do HA ele próprio, em unidades poliméricas de menor massa molecular.

Para um sistema de libertação prolongada baseado em polissacáridos seja útil, os polissacáridos têm que ser biodegradáveis a produtos não tóxicos. Descobriu-se que determinados sistemas de géis de alginato, embora eficazes para proporcionarem a libertação prolongada do fármaco, originam um "inchaço" (ou um nódulo) no local da injecção, devido â dissipação muito lenta do gel. Num quadro terapêutico envolvendo doses pequenas de fármaco e 9 injecções pouco frequentes, isto pode não constituir um problema de monta. No entanto, num quadro terapêutico que envolva doses elevadas de fãrmaco e injecções mais frequentes, este efeito pode ser proibitivo. Tem que se desenvolver uma metodologia para aumentar a taxa de dissipação do gel de alginato no local da injecção.

Existe portanto ainda uma necessidade de se desenvolverem formulações farmacêuticas que constituam um meio mais versátil e eficaz de proporcionar uma libertação prolongada, para aplicações medicinais. Muitas proteínas, naturais ou recombinantes, poderiam beneficiar de uma libertação prolongada a taxa constante, assim resultando propriedades clínicas mais eficazes. A invenção presente proporciona esses progressos. As composições farmacêuticas utilizando partículas de g3el de alginato ou géis da invenção presente são capazes de proporcionar uma maior biodisponibilidade, uma melhor protecção da proteína, uma menor degradação e também uma libertação lenta com maior estabilidade e potência da proteína. As composições farmacêuticas da invenção presente proporcionam um meio simples, rápido e barato de libertação controlada de proteína recombinante com resultados profiláticos, terapêuticos ou diagnósticos eficazes.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO A invenção presente provém de estudos utilizando 10 hidrogéis de alginato não modificado (uma classe dos polissacáridos aniónicos), para a libertação prolongada de proteínas. Estes hidrogéis de alginato não modificado contendo proteína (vejam-se os pedidos que aguardam aprovação em conjunto nos U. S., 08/857.913 e 08/912.902) são formados de um modo protelado no tempo, de tal forma que os materiais podem ser transferidos para uma seringa e deixados nessa mesma seringa para formarem mais tarde um gel; verifica-se que estes géis são injectáveis. Em modelos com roedores, após uma única injecção subcutânea, observam-se resultados que evidenciam libertação prolongada de proteína ao longo de muitos dias; no entanto, permanece um inchaço ou um nódulo perceptível no local da injecção, durante períodos longos após a injecção, sem alteração sensível da sua dimensão. Este inchaço é constituído por hidrogel de alginato cheio com água, e a dimensão do inchaço é uma função do volume de gel que foi injectado. Também permanecem no local as pérolas de gel. A invenção presente diz portanto respeito a uma nova classe de hidrogéis de polissacáridos biocompatíveis e biodegradáveis, os hidrogéis de ésteres de alginato, para a libertação prolongada de proteínas terapêuticas. Os hidrogéis de ésteres de alginato, inesperadamente, para além de possuírem as propriedades de formação de gel, de injectabilidade e de libertação prolongada dos alginatos não modificados, não deixavam inchaço no local da injecção --- isto é, os hidrogéis de ésteres de alginato são biodegradáveis ou sofrem erosão, e são gradualmente 11 reabsorvidos nos tecidos vizinhos, provocando pouca reacção no local da injecção.

As composições da invenção presente incluem ésteres de alginato ou os seus derivados, com ligações cruzadas iónicas numa matriz de hidrogel (contendo água), que contém uma proteína. A invenção presente diz também respeito a um método para se produzirem composições biodegradáveis com libertação prolongada. A invenção presente diz também respeito à utilização de materiais de ésteres de alginato em misturas líquidas, para a sua formação de gel a prazo, no corpo humano. A invenção presente diz também respeito a composições em que os hidrogéis de ésteres de alginato assumem a forma de pérolas ou de micro esferas, para a libertação prolongada de agentes activos, de preferência proteínas terapêuticas.

Numa concretização da invenção presente, os hidrogéis de ésteres de alginato proporcionam composições para aplicação em locais alvo, no corpo de um paciente.

Estas composições são úteis: para impedir ou inibir a formação de adesões no tecido após cirurgia ou 12 danos traumáticos; para suplementar tecidos e em especial para encher tecidos moles ou duros; para encher um espaço confinado com um material reabsorvível; como matriz para o crescimento de tecido; e como penso para feridas.

Noutra concretização, os hidrogéis de ésteres de alginato proporcionam um dispositivo contendo um agente activo, para implantação no corpo, em que o agente pode estar ligado ou não ligado ao polímero de alginato.

Noutra concretização, as composições de hidrogéis de ésteres de alginato da invenção presente proporcionam um método para se melhorar a biodisponibilidade do agente activo na composição.

Por último, os hidrogéis de ésteres de alginato da invenção presente proporcionam também um método para se obter um teor sanguíneo substancialmente constante, ao longo do tempo, no paciente.

De acordo com a invenção presente, proporciona-se uma composição de gel de libertação a prazo, contendo: a) um polissacãrido aniónico biodegradável; b) um agente biologicamente activo; e c) pelo menos um ião metálico polivalente ligado, em que o agente biologicamente activo inclua uma proteína e em que o polissacárido aniónico biodegradável referido seja um éster de alginato, que apresente ligações cruzadas para proporcionar um éster de hidrogel de alginato biodegradável e biocompatível. 13

De acordo com a invenção presente, proporciona-se também uma seringa previamente enchida, contendo uma composição de acordo com a invenção presente, uma formulação farmacêutica incluindo a composição de gel para libertação prolongada a prazo de acordo com a invenção presente num veículo, diluente ou adjuvante aceitável do ponto de vista farmacêutico, e uma composição para utilização num método de tratamento.

De acordo com a invenção presente, proporciona-se também um método para se produzir uma composição de gel para libertação prolongada a prazo, que inclui os passos de: a) se misturar um agente biologicamente activo com um polissacárido aniónico biodegradável para se formar uma primeira mistura; b)misturar-se com a primeira mistura referida acima, pelo menos um ião metálico polivalente ligado, para se formar uma segunda mistura, na qual o agente biologicamente activo inclui uma proteína e na qual o polissacárido aniónico biodegradável seja um éster de alginato que apresenta ligações cruzadas iónicas, para proporcionar um hidrogel de um éster de alginato biocompatível e biodegradável. A invenção presente também proporciona a utilização de uma composição para libertação prolongada, em que o agente biologicamente activo seja a leptina , um seu análogo ou derivado, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma patologia seleccionada de entre excesso 14 de peso, diabetes, teor lipidico elevado no sangue, esclerose arterial, placa arterial, para a diminuição de, ou para impedir que surjam, pedras na vesícula, no caso de massa insuficiente de tecido magro, de sensibilidade insuficiente à insulina, e na apoplexia. DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO Composições o amido

Podem obter-se polímeros hidrofílicos, incluindo os alginatos, e os seus derivados, a partir de diversas fontes comerciais, naturais ou sintéticas, bem conhecidas na técnica. Tal como se utiliza neste documento, a expressão polímero hidrofílico refere-se a polímeros solúveis em água ou a polímeros que tenham tendência para absorver água. Os polímeros hidrofílicos são bem conhecidos pelos especialistas da técnica. Incluem-se nos polímeros hidrofílicos, sem que se limitem a estes, os polianiões, incluindo os polissacáridos aniónicos tais como o alginato, a carboximetil amilose, os sais de ácido poliacrílico, os sais de ácido polimetacrílico, o copolímero de etileno com anidrido maleico (semi éster), a carboximetilcelulose, o sulfato de dextrana, a heparina, a carboximetil dextrana, a carboxicelulose, a 2,3-dicarboxicelulose, a tricarboxicelulose, a goma arábica carboxilada, a carragenana carboxilada, a pectina, a pectina carboxilada, a gomo da tragacanto carboxilada, a goma xantana carboxilada, o polissulfato de pentosana, 15 carboxilado, a carboximetilquitina/quitosana, a curdlana, o hexassulfato de inositol, o sulfato de β-ciclodextrina, o ácido hialurónico, o 6-sulfato de condroitina, o sulfato de dermatana, o sulfato de heparina, o carboximetilamido, a carragenana, o poligalacturonato, a goma de guar carboxilada, o polifosfato, o ácido polialdeído-carbónico, o poli-l-hidroxi-l-sulfonato-propeno-2, o copolímero de estireno com ácido maleico, a agarose, a mesoglicana, os álcoois polivinílicos sulfopropilados, o sulfato de celulose, o sulfato de protamina, a goma de guar fosfonada, o ácido poliglutâmico, o ácido poliaspártico, os poliaminoácidos, e derivados ou combinações destes compostos. Um especialista da técnica entenderá quais são os outros e vários polímeros hidrofílicos que se encontram abrangidos pela invenção presente.

De igual modo, podem obter-se metais polivalentes ligados tanto naturais como sintéticos, a partir de várias fontes comerciais, que são bem conhecidas na técnica. Em especial, podem incluir-se nos iões metálicos, sem que a estes se limitem, os de alumínio, bário, cálcio, ferro, manganês, magnésio, estrôncio e zinco. Os iões metálicos preferidos são os de cálcio e de zinco, ou os seus sais, tais como acetato de zinco, acetato de cálcio ou sais cloreto. Também se podem utilizar soluções aquosas de pequenas moléculas solúveis, tais como sulfato de amónio, acetona, etanol e glicerol.

Os álcoois da série alifática para utilização 16 como componentes esterificantes dos grupos carboxilo do ácido algínico, de acordo com a invenção presente, são por exemplo, aqueles que tiverem no máximo 34 átomos de carbono, podendo ser saturados ou insaturados, e que possivelmente sejam também substituídos com outros grupos livres ou funcionalmente modificados, tais como os grupos amino, hidroxilo, aldeído, ceto, mercapto, e carboxilo, ou com grupos derivados destes, tais como hidrocarbilo ou dihidrocarbilamino (doravante neste documento, deve entender-se o termo "hidrocarbilo" como significando não apenas espécies monovalentes derivadas de hidrocarbonetos, tais como as do tipo CnH2n+i/ mas também os grupos bivalentes ou trivalentes, tais como os "alquilenos" -CnH2n-i ou os "alquilidenos" CnH2n-3) , os grupos éter ou éster, os grupos acetal ou cetal, os grupos tio-éter ou tioéster e os grupos carboxilo esterifiçados ou grupos carbamídicos ou carbâmicos substituídos com um ou dois grupos hidroxilo, com grupos nitrilo ou com halogéneos.

Nos grupos acima que contêm espécies hidrocarbilo, tratar-se-á de preferência de grupos alifáticos inferiores, tais como heteroátomos, por exemplo oxigénio, azoto e enxofre. Dá-se preferência a álcoois substituídos com um ou dois dos grupos funcionais que se mencionaram acima.

Os álcoois do grupo acima que serão usados preferencialmente nos termos da invenção presente são aqueles com um máximo de 12, e em especial com um máximo de 17 6 átomos de carbono, e em que os grupos hidrocarbilo mencionados acima, amino, éter, éster, tioéter, tioéster, acetal, cetal representem grupos alquilo com um máximo de 4 átomos de carbono, e também nos grupos carboxilos esterifiçados ou carbamídicos substituídos, os grupos hidrocarbilo tenham o mesmo número de átomos de carbono, e em que os grupos carbamídicos possam ser grupos alquilenoamino ou alquilenocarbamídicos com um máximo de 8 átomos de carbono. Destes álcoois, aqueles que devem ser mencionados em primeiro lugar e são mais importantes são os que são saturados e não substituídos, tais como os álcoois metílico, etílico, propílico, e isopropílico, o álcool n-butílico, os álcoois isobutílico, terc-butílico, amílico, pentílico, hexílico, octílico, nonílico, e dodecílico, e acima de todos, aqueles com uma cadeia linear tais como os álcoois n-octílico e dodecílico. Dos álcoois substituídos deste grupo, devem listar-se os álcoois dihídricos, tais como o etilenoglicol, o propilenoglicol ou o butilenoglicol, os álcoois trivalentes tais como a glicerina, os álcoois aldeídicos tais como o álcool tartrónico, os álcoois carboxílicos tais como os ácidos lácticos, por exemplo ácido alfa-oxipropiónico, o ácido glicólico, o ácido málico, os ácidos tartáricos, o ácido cítrico, aminoalcoóis tais como aminoetanol, aminopropanol, n-aminobutanol e os seus derivados dimetílicos e dietílicos na função amino, a colina, o pirrolidiniletanol, o piperidiniletanol, o piperaziniletanol e os correspondentes derivados de álcoois n-propílico ou n-butílico, o monotioetilenoglicol ou os seus derivados alquílicos, por 18 exemplo o derivado etílico na função mercapto.

Dos álcoois saturados superiores, aqueles que merecem uma menção especial são por exemplo o álcool cetílico e o álcool miristílico, mas são especialmente importantes para os propósitos da invenção presente os álcoois superiores insaturados com uma ou com duas ligações duplas, tais como em especial aqueles que estão contidos em diversos óleos essenciais e que têm uma afinidade para com os tèrpenos, tais como citronelol, o geraniol, o nerol, o nerolidol, o linalool, o farnesol, e o fitol.

Dos álcoois inferiores insaturados, deve levar-se em consideração o álcool propargílico.

Dos álcoois alifáticos, aqueles que se devem mencionar acima de todos são aqueles com um único resíduo de benzeno e em que a cadeia alifática tem no máximo 4 átomos de carbono, e nos quais também o anel benzénico possa estar substituído com entre 1 e 3 grupos metilo ou hidroxilo, ou com átomos de halogéneo, em especial de cloro, de bromo ou de iodo, e em que a cadeia alifática possa ser substituída com um ou mais grupos funcionais seleccionados de entre o conjunto constituído por grupos amino livres ou grupos mono ou di-metilo, ou com grupos pirrolidina ou piperidina. Destes álcoois, o álcool benzílico e o álcool fenetílico são especialmente preferidos, os álcoois da série cicloalifática ou da série alifática cicloalifática podem derivar de hidrocarbonetos 19 mono ou policiclicos e podem ter no máximo 34 átomos de carbono. Dos álcoois derivados de hidrocarbonetos cíclicos com um único anel, deve fazer-se uma menção especial daqueles que têm um máximo de 12 átomos de carbono, com anéis contendo de preferência entre 5 e 7 átomos de carbono, substituído possivelmente com entre um e três grupos alquilo inferior, tais como os grupos metilo, etilo, propilo ou isopropilo. São álcoois específicos deste grupo, o ciclohexanol, o ciclohexanodiol, o 1,2,3-ciclohexanotriol e o 1,3,5-ciclohexanotriol (floroglucitol) , o inositol, os álcoois derivados de p-mentano tais como o carvomentol, o mentol, os alfa- e gama-terpineol, os álcoois 1-terpineólicos conhecidos como "terpineol", a 1,4- e 1,8-terpina. Os álcoois derivados de hidrocarbonetos com anéis condensados são, por exemplo, os derivados de grupos tujano, pinano, e canfano, em especial o tujanol, o sabinol, o hidrato de pinol, o D- e o L-borneol e o D- e o L-isoborneol.

Também devem ser incluídos os álcoois provenientes da reacção de esterificação de compostos contendo grupos epoxilo, com alginatos (Veja-se, por exemplo, a Patente U. S. 2.463.824 e a Patente U. S. 2.426.125) .

Os polianiões totais ou parciais contendo grupos éster da invenção presente são em geral polissacáridos ácidos em que o oxigénio glicosídico se encontra ligado em beta em relação ao carbono do carbonilo do éster. Embora 20 não se submetendo a um mecanismo qualquer em particular, este arranjo espacial das espécies permite a quebra da cadeia polimérica por um mecanismo de eliminação beta, que pode ocorrer em condições fisiológicas.

Os ésteres de ácido algínico da invenção presente contêm resíduos de ácido manurónico (m-COOH ou anião m-COO" ) e resíduos de ácido gulurónico (g-COOH ou anião g-COO") ligados uns aos outros por ligações etéreas glicosídicas por oxigénio, com a fórmula geral I:

- (M)nl- (M 1 ) n2 ~ (G)n3- ( G ' ) n4 ~ (A)nS- I em que: M seja um resíduo de ácido manurónico, m-COOH ou o anião m-COO",- M' seja um resíduo de ácido gulurónico, g-COOH ou o anião g-COO"; G' seja um resíduo de, éster gulurónico, g-C00R2; A represente unidades da cadeia que não são g nem m, tais como açúcares, produtos e oxidação de açúcar, ou grupos alifáticos, aromáticos, aralifáticos, alaromáticos, cicloalifáticos, que podem ser substituídos e podem ser interrompidos por heteroátomos ligados adentro ou na extremidade das cadeias; 21 nl, n2, n3, n4 e n5 são inteiros que representam os valores médios de unidades incorporadas; RI e R2 são independentemente grupos alifáticos, aromáticos, aralifáticos, alaromáticos, cicloalifáticos, que podem ser substituídos e interrompidos por heteroátomos; e derivados (por exemplo quando os grupos hidroxilo são acetilados e se fazem reagir com isocianatos), bem como os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Nos ésteres da invenção presente, ê desejável que RI = R2 alif ático ou alaromático, e também que 100(n2+n4)/(nl+n2+n3+n4) seja de entre 1-99 mol %, preferivelmente 5-50 mol %, mais preferivelmente 6-30 mol %, ainda mais preferivelmente 6-15 mol %, e de preferência 7-12 mol %, e que 100n5/(nl+n2+n3+n4+n5) seja de preferência inferior a 10 mol %.

Nos ésteres parciais da invenção, podem manter-se os grupos carboxilo não esterifiçados livres, ou podem transformar-se nos seus sais. Escolhem-se as bases para se obterem os sais de acordo com a utilização final a que se destina o produto. Podem formar-se sais inorgânicos a partir de metais alcalinos, tais como o potássio e em especial o sódio e o amónio, ou a partir de metais alcalinoterrosos tais como o cálcio e o magnésio, ou sais de alumínio. 22 Têm interesse específico os sais com bases orgânicas, em especial com bases de azoto, e portanto aminas alifáticas, aralifáticas, cicloalifáticas ou heterocíclicas. Estes sais de amónio podem ser derivados de aminas aceitáveis do ponto de vista terapêutico, ou de aminas não tóxicas mas inactivas do ponto de vista terapêutico, ou de aminas com uma acção terapêutica. São preferidas nas do primeiro tipo as aminas alifáticas, por exemplo as mono-, di- e trialquilaminas contendo grupos alquilo com um máximo de 8 átomos de carbono, ou as aralquilaminas com o mesmo número de átomos de carbono na sua parte alifática e em que arilo significa um grupo benzeno possivelmente substituído com entre 1 e 3 grupos metilo, ou átomos de halogéneo, ou grupos hidroxilo. As bases biologicamente inactivas para a formação de sais também podem ser cíclicas, tais como as alquilenoaminas monocíclicas com ciclos de entre 4 e 6 átomos de carbono, possivelmente interrompidos, no ciclo, com heteroátomos seleccionados de entre o conjunto formado por azoto, oxigénio e enxofre, tais como a piperazina ou a morfolina, ou podem ser substituídas, por exemplo com funções amino ou hidroxilo, tal como no aminoetanol, etilenediamol, etilenodiamina, efedrina ou colina. O grau ou o tipo de esterif icação podem ser controlados pelos métodos sintéticos que são conhecidos na técnica. Os ésteres de alginato são preparados de preferência por tratamento dos sais de amónio quaternário 23 do ácido algínico com agentes alquilantes convencionais, num solvente orgânico aprótico tal como o sulfóxido de dimetilo. Os ésteres resultantes são de preferência os ésteres de álcoois monovalentes, tais como os de alquilo inferior como etilo, ou os de aralquilo tais como o de benzilo, ou as suas misturas. Também é possível obterem-se ésteres por reacção do ácido algínico com compostos contendo oxirano ou epóxidos, tais como os óxidos de etileno ou de propileno.

Também é possível formarem-se sais de amónio quaternário de ésteres parciais, por exemplo os sais de tetra-alquilamónio com o número de átomos de carbono que se referiu acima, e de preferência os sais deste tipo em que o quarto grupo alquilo possua entre 1 e 4 átomos de carbono, por exemplo um grupo metilo. O graus de esterificação (expresso em mol %) do alginato tem a ver com a taxa de desaparecimento do gel no tecido do paciente. Esta taxa de desaparecimento do gel está em geral relacionada com a taxa de libertação pretendida para o agente activo a partir do gel, a qual se prolonga ao longo de um período de 5 anos, ou menos, em geral de entre 2 dias e 270 dias, mais habitualmente entre 2 dias e 180 dias, e mais habitualmente ainda entre 2 dias e 90 dias. O grau de esterificação (DE) é de entre 1 mol % e 99 mol %, preferivelmente de entre 5 mol % e 50 mol %, mais preferivelmente de entre 6 mol % e 30 mol %, mais preferivelmente ainda de entre 6 mol % e 15 mol %, e de 24 preferência entre 7 mol % e 12 mol %.

Tal como se utilizam neste documento, o termo tampão ou a expressão solução tampão referem-se à utilização de ácido orgânicos ou inorgânicos ou de misturas de ambos os tipos para se preparar uma solução tamponizante tal como é conhecido na técnica. Incluem-se nos ácidos inorgânicos no âmbito da invenção presente, os halogenetos de hidrogénio (por exemplo, ácido clorídrico), e os ácidos fosfórico, nítrico ou sulfúrico. Um especialista da técnica conhecerá outros ácidos inorgânicos, os quais também estão abrangidos neste documento. Incluem-se nos ácidos orgânicos abrangidos pelo âmbito da invenção, os ácidos orgânicos alifáticos e os ácidos aromáticos tais como os ácidos fórmico, carbónico, acético, propiónico, butírico, valérico, capróico, acrílico, malónico, succínico, glutárico, adípico, maleico, fumárico, a glicina ou o ácido fenolsulfónico. Um especialista da técnica conheceria outros ácidos orgânicos.

Tal como se utiliza neste documento, agentes biologicamente activos refere-se a proteínas de ocorrência natural ou recombinantes, quer de origem humana quer animal, úteis para a aplicação profilática, terapêutica ou em diagnóstico, bem como agentes não proteicos por exemplo com base em pequenas moléculas. O agente biologicamente activo pode ser natural, sintético ou semi sintético, ou derivados de qualquer um destes, os agentes biologicamente activos da invenção presente têm que ser precipitáveis. 25

Está contemplada uma larga gama de agentes biologicamente activos. Nela se incluem, sem que a estes se limitem, as hormonas, as citoquinas, os factores hematopoiéticos, os factores de crescimento, os factores anti obesidade, os factores tróficos, os factores anti inflamatórios, e os enzimas (veja-se também a Patente U. S. N°. 4.695.463 para exemplos adicionais de agentes biologicamente activos adicionais). Um especialista da técnica será facilmente capaz de adaptar um agente biologicamente activo às composições da invenção presente.

Incluem-se nas proteínas referidas, sem que a estas elas se limitem, os interferões (veja-se as Patentes U. S. Nos. 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471, e 4.695.623), as interleuquinas (veja-se a Patente U. S. N° . 5.075.222), as eritropoietinas (vejam-se as Patentes U. S. Nos. 4.703.008, 5.441.868, 5.618.698, 5.547.933, e 5.621.080), os factores de crescimento de colónias de granulócitos (vejam-se as Patentes U. S. Nos. 4.810.643, 4.999.291, 5.581.476, 5.582.823, e a publicação de PCT N°. 94/17.185), factores de células estaminais (Publicações de PCT Nos. 91/05.795, 92/17.505 e 95/17.206), e a proteína OB (vejam-se as publicações de PCT Nos. 96/40.912, 96/05.309, 97/00.128, 97/01.010 e 97/06.816). Para além disto, também se podem incluir nos agentes biologicamente activos, sem que a estes eles se limitem, produtos anti obesidade, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante da tiróide (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante dos 26 folículos (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferões (alfa, beta, gama), interleuquinas (IL-1 a IL-12), factor de necrose tumoral (TNF), proteína de ligação ao factor de necrose tumoral (TNF-bp), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), factor neurotrófico glial (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crescimento dos fibroblastos (FGF), factor de crescimento neurotrófico (NGF), factores de crescimento ósseo tais como a osteoprotegerina (OPG), factores de crescimento semelhantes à insulina (IGF), factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de estimulação de macrófagos de granulócitos (GM-CSF), factor de crescimento derivado de megaqueratinócitos (MGDF), trombopoietina, factor de crescimento derivado de plaquetas (PGDF), factores de crescimento estimulantes de colónias (CSF), proteína morfogénica dos ossos (BMP), superóxido dismutase (SOD), activador do plasminogénio tecidular (TOA), uroquinase, estreptoquinase e calicreína. O termo proteínas, tal como é utilizado neste documento, inclui péptidos, polipéptidos, moléculas consensuais, análogos, derivados, ou combinações de quaisquer destes.

Podem incluir-se nos derivados dos agentes biologicamente activos os obtidos por ligação de uma ou mais espécies químicas à molécula de proteína. Verificou-se que a modificação química dos agentes biologicamente activos confere determinadas vantagens adicionais em certas circunstâncias, tais como o aumento da estabilidade e do período de circulação da proteína terapêutica, e a 27 diminuição da imunogenicidade. um especialista da técnica saberá seleccionar a modificação química pretendida com base na dosagem pretendida, no período de circulação pretendido, na resistência à proteólise a conferir, nas utilizações terapêuticas e noutros argumentos.

Tal como se utiliza neste documento, a biodegradabilidade refere-se à quebra da massa molecular de um polímero determinado, em unidades com cadeias de menor dimensão, isto é, à quebra em unidades com menores massas moleculares. Um gel biodegradável é portanto aquele que se dissipa como gel, no ambiente de utilização, em que a dissipação depende da quebra de massa molecular dos polímeros constituintes, dela resultando menos unidades na cadeia polimérica.

Complexos

As proteínas, os seus análogos e derivados, podem ser administrados complexados a uma composição de ligação. Essas composições de ligação podem ter como efeito o prolongamento do período de circulação da proteína, ou do seu análogo ou derivado, ou o de aumentar a actividade do agente biologicamente activo. Uma tal composição pode ser uma proteína (ou, de forma idêntica, um péptido) , um seu derivado, um análogo ou uma combinação. Por exemplo, uma composição de ligação para a proteína OB é o receptor de proteína OB ou uma sua porção, por exemplo uma sua porção solúvel. Podem encontrar-se outras proteínas de ligação 28 examinando a proteína OB, ou a proteína escolhida, no soro, ou podem ser encontrados por um despiste empírico da existência de uma ligação. Uma ligação deste tipo não interferirá tipicamente com a capacidade da proteína OB ou do seu análogo ou derivado, para se ligar ao receptor endógeno da proteína OB e/ou para levar a cabo a transdução de sinal. Para além da proteína OB, os complexos de ligação também serão aplicáveis a outras proteínas terapêuticas da invenção presente. Os especialistas desta técnica serão capazes para averiguar quais as proteínas de ligação que são capazes de serem utilizadas na invenção presente.

De igual forma, podem obter-se os agentes de precipitação do agente biologicamente activo a partir de diversas fontes comerciais, naturais ou sintéticas, que são bem conhecidas dos especialistas da técnica. Incluem-se nos agentes de precipitação, sem que a estes eles se limitem, os iões metálicos polivalentes ou os seus sais, tais como os acetatos, citratos, cloretos, carbonatos, hidróxidos, oxalatos, tartaratos ou hidróxidos, ácidos ou polímeros solúveis em água. Em especial, podem incluir-se nos iões metálicos sem que a estes eles se limitem, os iões de alumínio, bário, cálcio, ferro, manganês, magnésio, estrôncio e zinco. De preferência o ião metálico será o zinco ou os seus sais, tais como os seus sais acetato, ou cloreto. Também se podem utilizar moléculas pequenas solúveis e os seus sais, tais como sulfato de amónio, acetona, etanol e glicerol. 29

No que toca aos polímeros solúveis em água, incluem-se neles, sem que a estes eles se limitem, o polietilenoglicol, os copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, a carboximetilcelulose, a dextrana, o álcool polivinílico, a polivinilpirrolidona, o poli-1,3-dioxolano, o poli-1,3,6-trioxano, os copolímeros de etileno/anidrido maleico, os poliaminoácidos, a dextrana, a poli(n-vinilpirolidona), o polietilenoglicol, os homopolímeros de propilenoglicol, os copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, os polióis polioxietilados, o succinato de álcool polivinílico, a glicerina, os óxidos de etileno, óxidos de propileno, os poloxâmeros, os copolímeros alcoxilados, os polianiões solúveis em água, os seus derivados e as combinações de todos estes. O polímero solúvel em água pode ter uma massa molecular qualquer, e pode ser ramificado ou não ramificado. Por exemplo, a massa molecular preferida para o polietilenoglicol é de entre cerca de 700 Da e cerca de 100 kDa, para facilidade de manuseamento e para eficiência de precipitação.

Podem utilizar-se outras dimensões e outros tipos de agentes precipitantes, consoante o perfil terapêutico pretendido (por exemplo, de acordo com o prolongamento pretendido para a libertação, com os efeitos, caso estejam presentes, sobre a actividade biológica, a facilidade de manuseamento, o grau ou a falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos de um agente precipitante desejável sobre uma proteína terapêutica ou um seu análogo) . Um 30 especialista da técnica entenderá quais os outros agentes precipitantes que se encontram adentro do âmbito da invenção.

Para além disto, as composições da invenção presente também podem incluir outros excipientes adicionais necessários para estabilizar o agente biologicamente activo e/ou o polímero hidrofílico. Estes agentes podem estar contidos no tampão, e podem incluir, sem que se limitem a, conservantes.

Composições Farmacêuticas

Podem administrar-se as composições para libertação prolongada da invenção presente por via oral (por exemplo, cápsulas tais como cápsulas duras e cápsulas moles, preparações sólidas tais como grânulos, comprimidos, pílulas, trociscos ou drageias, hóstias, pérolas, formas em pó e liofilizadas, preparações líquidas tais como suspensões) e preparações para administração por via não oral (por exemplo preparações para administração intramuscular, subcutânea, transdérmica, visceral, EV (endovenosa), IP (intraperitoneal), intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, injectável, pulmonar, nasal, rectal, e uterina-transmucosal).

Em geral, englobam-se na invenção as composições farmacêuticas para libertação prolongada que contenham quantidades eficazes de proteína, ou de produtos derivados, 31 em conjunto com as composições para libertação prolongada da invenção, e com os diluentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adjuvantes e/ou veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico que foram necessários para a administração. Veja-se a PCT 97/01.331. A formulação farmacêutica óptima para um agente biologicamente activo pretendido será determinada por um especialista da técnica em função da via de administração e da dosagem pretendida. São descritos no Pharmaceutical Sciences de Remington (Mack Publishing Co., 18a Ed., Easton, PA, págs. 1435-1712 (1990)), exemplos de composições farmacêuticas.

Devido à natureza tixotrópica da formulação de gel retardada, podem utilizar-se seringas para se fazer a administração por via subcutânea. A composição pode adquirir o estado de gel numa seringa para injecção futura. Esta gelificação pode ser levada a cabo num instante protelado, no tempo. O instante da transformação em gel é controlado pelo ajustamento judicioso da quantidade de agente promotor do gel e do doador de protões, na mistura, caso seja necessário. Uma tal preparação seria utilizada mais tarde para voltar a sofrer uma transição para gel no corpo, após a injecção. O termo tixotrópico, tal como se utiliza neste documento, refere-se à viscosidade da mistura do gel que decresce sob pressão, por exemplo, do êmbolo da seringa, a um ponto em que a mistura consegue fluir, por exemplo, através da agulha da seringa, voltando a formar um gel no local da injecção. 32 0 conceito de gelificação a prazo pode também ser aplicado ao acto de se encher uma seringa em que se coloca uma composição de um gel para libertação prolongada e ela sofre gelificação numa altura previamente determinada, dentro da seringa, por exemplo, desde entre alguns minutos após esse enchimento da seringa, até muitas horas depois. Isto evita o problema de se encher uma seringa com material que já gelificou. Estas seringas previamente enchidas podem ser armazenadas para injecção posterior aos pacientes.

Incluem-se nas componentes que podem ser necessárias para a administração, diluentes com conteúdos diferentes no tampão (por exemplo, Tris-HCl, acetato), no pH e na força iónica; aditivos tais como tensioactivos e agentes solubilizantes (por exemplo, Tween 80, HCO-60, Polissorbato 80) , antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, glutationa, metabissulfito de sódio), polissacáridos adicionais (por exemplo, carboximetilcelulose, alginato de sódio, hialuronato de sódio, sulfato de protamina, polietilenoglicol), conservantes (por exemplo, timersol, álcool benzilico, metilparabeno, propilparabeno) e substâncias espessantes (por exemplo, lactose, manitol); para incorporação do material em preparações dos compostos poliméricos em partículas, tais como polímeros ou copolímeros de ácidos poliláctico/poliglicólico, etc. ou em combinação com liposomas. Pode também utilizar-se o ácido hialurónico como uma componente de administração, e isto pode ter o efeito 33 de se promover ainda mais a duração prolongada na circulação. Para além disto, podem também dispersar-se com óleos as composições para libertação prolongada da invenção presente (por exemplo, óleo de gergelim, óleo de milho, óleo vegetal), ou uma mistura destes com um fosfolípido (por exemplo, lecitina), ou triacilgliceróis de ácidos gordos de cadeia intermédia (por exemplo, o Miglyol 812) , para se obter uma suspensão oleosa. Podem também dispersar-se as composições da invenção presente com agentes dispersantes tais como polissacáridos solúveis em água (por exemplo, manitol, lactose, glucose, amidos), ácido hialurónico, glicina, fibrina, colagéneo e sais inorgânicos (por exemplo, cloreto de sódio).

Para além disto, e também contemplados para utilização na administração das composições de libertação prolongada da invenção presente, são os dispositivos mecânicos concebidos para transporte de produtos terapêuticos até ao pulmão, incluindo mas não se limitando a nebulizadores, inaladores de doses quantificadas, e inaladores de pós, todos os quais são conhecidos dos especialistas da técnica.

As componentes administradas podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de libertação in vivo, e a taxa de desaparecimento in vivo das proteínas presentes e dos seus derivados. Um especialista da técnica entenderá quais as componentes apropriadas na administração e/ou os dispositivos mecânicos apropriados para utilização 34 consoante a utilização terapêutica, a via de administração pretendida, a dosagem pretendida, o período na circulação, a resistência à proteólise, a estabilidade da proteína , e outros factores. Métodos de Utilização

Terapêutica.

As utilizações terapêuticas dependem do agente biologicamente activo que se utilizar. Um especialista da técnica será facilmente capaz de adaptar um agente biologicamente activo pretendido à invenção presente, para as aplicações terapêuticas que forem pretendidas. As utilizações terapêuticas para esses agentes estão dispostas em mais pormenor nas publicações seguintes que se incorporam neste documento por citação, incluindo os desenhos. As utilizações terapêuticas incluem, sem que se limitem a, utilizações para proteínas tais como interferões (vejam-se as Patentes U.S. Nos. 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471 e 4.695.623), interleuquinas (veja-se a Patente U. S. N°. 5.075.222), eritropoietinas (vejam-se as Patentes U. S. Nos. 4.703.008, 5.441.868, 5.618.698, 5.547.933, e 5.621.080), factores de estimulação de colónias de granulócitos (vejam-se as Patentes U.S. Nos. 4.999.291, 5.581.476, 5.582.823, 4.810.643 e o pedido de Publicação de PCT N° . 94/17.185), factor de células estaminais (Publicações de PCT Nos. 91/05.795, 92/17.505 e 95/17.206), e a proteína OB (vejam-se as publicações de PCT Nos. 35 96/40.912, 96/05.309, 97/00.128, 97/01.010 e 97/06.816).

Para além disto, as utilizações terapêuticas da invenção presente incluem as utilizações de agentes biologicamente activos, nos quais se incluem mas não se limitando a, produtos relacionados com actuação anti obesidade, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante da tirõide (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante dos folículos (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferões (alfa, beta, gama), interleuquinas (IL-1 a IL-12), factor de necrose tumoral (TNF), proteína de ligação ao factor de necrose tumoral (TNF-bp), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), factor neurotrófico glial (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crescimento dos fibroblastos (FGF), factor de crescimento neurotrófico (NGF), factores de crescimento ósseo tais como a osteoprotegerina (OPG), factores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs), factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de estimulação de macrófagos de granulócitos (GM-CSF) , factor de crescimento derivado de megaqueratinócitos (MGDF), trombopoietina, factor de crescimento derivado de plaquetas (PGDF), factores de crescimento estimulantes de colónias (CSF), proteína morfogénica dos ossos (BMP), superóxido dismutase (SOD), activador do plasminogénio tecidular (TOA), uroquinase, estreptoquinase e calicreína. O termo proteínas, tal como é utilizado neste documento, inclui péptidos, polipéptidos, moléculas consensuais, análogos, 36 derivados, ou combinações de quaisquer destes. Para além disto, as composições presentes também podem ser utilizadas para a manufactura de um ou mais medicamentos para o tratamento ou para a melhoria dos estados que o agente biologicamente activo se destina a tratar. A título de exemplo, também se podem obter utilizações terapêuticas oxigenação do sangue) e uma diminuição da resorção õssea ou da osteoporose na ausência de perda de peso.?

Terapias de Combinação. As composições e os métodos presentes podem ser utilizados em conjunto com outras terapias, tais como uma alteração da dieta, e exercício. Também se podem usar outros medicamentos, tais como aqueles que são úteis para o tratamento do diabetes (por exemplo, insulina, e possivelmente amilina), medicamentos que baixem o colesterol e a tensão sanguínea (tais como os medicamentos que baixam o teor de lípidos no sangue, e outros medicamentos cardiovasculares), medicamentos que aumentem a actividade (por exemplo, anfetaminas), diuréticos (para eliminação de líquidos), e supressores do apetite. Uma tal administração pode ser simultânea ou sequencial. Para além disto, os métodos presentes podem ser utilizados em conjunto com procedimentos cirúrgicos, tais como cirurgias cosméticas concebidas para alterar o aspecto global de um corpo (por exemplo, a lipossucção ou as cirurgias com laser destinadas a diminuir a massa corporal, ou cirurgias de implantação 37 concebidas para alterar a aparência da massa corporal). Os benefícios de cirurgias cardíacas, tais como cirurgias de derivação ou outras cirurgias concebidas face a estados de doença provocados pelo bloqueamento de vasos sanguíneos por depósitos de gordura, tal como no caso de placa arterial, podem ser majorados com a utilização concomitante das composições e dos métodos presentes. Também se podem utilizar métodos para eliminar as pedras da vesícula, tais como métodos com ultrassons ou com laser, quer antes quer durante ou depois de um tratamento com os métodos terapêuticos presentes. Para além disto, os métodos presentes podem ser utilizados como adjuntos de cirurgias ou de terapias para ossos quebrados, músculo danificado, ou outras terapias que podem ser melhoradas por um aumento da massa magra.

Dosagens

Um especialista da técnica será capaz de avaliar as dosagens eficazes, pela administração e observação do efeito terapêuticos pretendido. A dosagem da preparação com libertação prolongada é a quantidade necessária para conseguir a concentração eficaz do agente biologicamente activo in vivo, durante um período de tempo determinado. A dosagem e a frequência de administração pretendidas para as preparações com libertação prolongada variam com o tipo de agente biologicamente activo, com a duração pretendida para a libertação, com a doença alvo, com a frequência de administração pretendida, com a espécie animal a que se 38 destina e com outros factores. De preferência, a formulação da molécula será tal que entre cerca de 0,10 μg/kg/dia e 100 mg/kg/dia permitam obter o efeito terapêutico desejado.

Podem determinar-se as dosagens eficazes utilizando ferramentas de diagnóstico, ao longo do tempo. A título de exemplo, a invenção presente proporciona as dosagens de proteína OB. Por exemplo, um diagnóstico para se medir a quantidade de proteína OB no sangue (ou no plasma ou no soro) pode ser utilizado em primeiro lugar para determinar teores endógenos de proteína OB. Uma tal ferramenta de diagnóstico pode assumir a forma de um teste com anticorpos, tal como um teste com anticorpos em sanduíche. A quantidade de proteína OB endógena é determinada inicialmente, e obtém-se assim uma linha de base. Determinam-se as dosagens terapêuticas em resultado da quantificação da proteína OB endógena e da exógena (isto é, proteína, um seu análogo ou um derivado encontrado no corpo, quer auto produzido quer administrado), em continuado ao longo do decurso da terapia. Por exemplo, pode ser necessária uma dosagem inicial relativamente elevada, até se verificar um benefício terapêutico, e depois poderão utilizar-se dosagens mais reduzidas para se manterem os benefícios terapêuticos.

Materiais e Métodos

Materiais. Pode encontrar-se o alginato sob a forma de alginato de sódio, em fontes bem conhecidas dos 39 técnicos. A proteína OB e o GCSF provêm da Amgen Inc. Os outros produtos químicos provêm de fontes bem conhecidas dos técnicos.

Preparação de Partículas/Pérolas de Hidrogel de Alginato. A preparação de partículas e de pérolas de hidrogel de alginato, com e sem outras proteínas, está descrita em pormenor no pedido co-pendente de Patente U. S. 08/842.756.

Preparação de Gel a Prazo. A preparação dos hidrogéis de alginato a prazo, com e sem proteína, foi descrita em pormenor nos pedidos co-pendentes de Patentes U. S. 08/857.913 e 08/912.902.

Listam-se os exemplos seguintes para ilustrar completamente a invenção, mas não devem ser interpretados como constituindo limitações do seu âmbito. Para além disto, no que toca à especificação acima ou aos exemplo adiante, um especialista da técnica será capaz de levar a cabo as alterações necessárias das descrições, para a produção em larga escala. EXEMPLO 1 O exemplo seguinte descreve a preparação de ésteres de alginato para serem utilizados na invenção presente. 40

Preparação A: Alginato de tetrabutilamónio (TBA) transforma-se um resina de ácido sulfónico (Bio-Rad, AG MP-50) na sua forma de tetrabutilamónio (TBA), por tratamento com hidróxido de tetrabutilamónio (Aldrich), usando um método em descontínuo à temperatura ambiente. Adiciona-se a uma solução de 10 g de sal de sódio do ácido algínico em 800 mL de água destilada, 60 mL de resina sulfónica (Bio-Rad, AG MP-50) , sob a sua forma de sal de tetrabutilamónio. Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante meia hora. Separa-se a resina por filtração e lava-se com água destilada. Isola-se o alginato de TBA no filtrado por liofilização (rendimento, 16,8 g) e confirma-se por RMN de 1H.

Preparação B: Éster etílico parcial do ácido algínico, grau de esterificação (DE) = 30 mol %.

Dissolve-se alginato de TBA (6 g, 14,4 mmol em unidades de TBA) em 500 mL de sulfóxido de dimetilo (DMSO) à temperatura ambiente. Adiciona-se-lhe então iodoetano (Aldrich, 673 mg, 4,3 mmol) . Agita-se a mistura a 30°C durante 15 horas, depois arrefece-se até à temperatura ambiente. Adiciona-se lentamente a esta mistura uma solução de 2 g de NaCl em 20 mL de água, para se transformar completamente o TBA no sal sódico. Depois de se agitar durante 15-30 min, verte-se lentamente a solução por sobre 1.500 mL de acetato de etilo. Separa-se o precipitado por filtração e lava-se por três vezes com acetona/água (a 8: 1 41 em volume) e por três vezes com acetona, e depois seca-se em vazio. Volta a dissolver-se o composto em água destilada (-100 mL) e depois ajusta-se o seu pH a -6,5 solução de NaHC03 a 0,2%, a 0°C. Dialisa-se então a solução (MM à qual se corta 8.000) de um dia para o outro, contra água destilada a 4°C, e depois liofiliza-se. O rendimento em éster parcial é de 2,8 g e o grau se esterificação ê de 30 +/- 1 % (RMN de '‘'H, maleimida como padrão interno) .

Preparação C: Éster etílico total e parcial de ácido algínico, DE = 100%, 50%, 20%, 10% e 5%. A preparação destes compostos é semelhante à que se descreveu na Preparação B, excepto que a quantidade de iodoetano é ajustada para se atingir o grau de esterificação pretendido.

Preparação D: Ésteres propílicos, hexílicos, octílicos e dodecílicos parciais do ácido algínico.

As preparações são semelhantes às descritas nas Preparações B e C acima, mas partindo respectivamente de 1-iodopropano, 1-iodohexano, 1-iodo-octano u de 1- iodododecano em vez de iodoetano.

Preparação E: Éster benzílico parcial de ácido algínico, DE = 30 %.

Dissolve-se alginato de TBA (2,5 g, 5,99 mmol em 42 unidades de TBA) em -200 mL de DMSO à temperatura ambiente. Adicionam-se-lhe brometo de benzilo (Aldrich, 307 mg, 1,8 mmol) e iodeto de TBA (Aldrich, 30 mg) . Agita-se então a mistura a 30°C durante 15 horas, e depois arrefece-se até à temperatura ambiente.

Adiciona-se lentamente a esta solução uma solução de 0,6 g de NaCl em 10 mL de água para transformar por completo o TBA no sal de sódio. Depois de se agitar durante 15-30 minutos, verte-se lentamente a solução por sobre 500 mL de acetato de etilo. Separa-se o precipitado por filtração e lava-se por três vezes com acetona/água (a 8:1 em volume) e por três vezes com acetona, e depois seca-se em vazio. Volta a dissolver-se o composto em água destilada (-60 mL) e ajusta-se o seu pH a -6,5 com solução de NaHC03 a 0,2 %, a 0°C, e depois dialisa-se (MM de corte 8000)-, de u dia para o outro, contra água destilada a 4°C. O rendimento no éster parcial é de 1,3 g e o grau de esterificação é de 30 +/- 1 % (RMN de 1H, maleimida como padrão interno).

Preparação F: Éster benzilico total e parcial de ácido algínico, com um DE diferente. A preparação destes compostos é semelhante à que se descreveu na Preparação E, excepto que a quantidade de brometo de benzilo e a de iodeto de TBA são ajustadas para se atingir o grau de esterificação pretendido. 43 EXEMPLO 2 O exemplo seguinte ilustra a preparação de um gel de éster etílico de alginato (DE = 15 mol % e 10 mol %) contendo um fármaco proteico (Leptina) - e a sua libertação prolongada in vitro a partir desse gel.

Arrefecem-se leptina (100 mg/mL; 10 mM em Tris HC1, pH 8,8; pH ajustado a entre 8,0 e 8,8 com NaOH 1 M) e éster etílico de alginato a 6 % (15 mol %, 10 mM em Tris HCL, pH 8,6), num banho de gelo. Adiciona-se a leptina (0,5 mL) ao éster etílico de alginato a 6 % (0,18 mL)e agita-se a mistura num banho de gelo durante 10-15 min; o pH final é de 8,6-8,8. Adiciona-se a esta mistura uma suspensão de CaC03 2 mM (16 μΕ) , e mistura-se bem a suspensão resultante. Adiciona-se gota a gota a esta suspensão, com agitação, uma solução de ZnCl2 0,1 m (100 μΕ) ; adiciona-se-lhe então água para perfazer o volume de 1 mL. Mistura-se o material por completo e mantém-se num banho de gelo durante 10-20 min. Adiciona-se então a esta solução, sob muito boa agitação, uma solução 1,68 M de β-gluconolactona (Aldrich, 56 μΕ). Coloca-se a mistura final (50 mg/mL de leptina, 1 % de éster etílico de alginato; 0,1 mL) no interior de um tubo de Eppendorf e deixa-se de um dia para o outro a 4°C para se obter um gel moldado. Depois da armazenagem de um dia para o outro, leva-se a cabo a libertação prolongada em tampão 10 mM de histidina, a pH 7,4. O gel moldado com 15 mol % de grau de esterificação exibe um pico de libertação mínimo e uma libertação razoavelmente constante de leptina 44 demonstrando 60 % de libertação em 6 dias. O gel moldado com 10 mol % de grau de esterif icação exibe um pico de libertação mínimo e uma libertação razoavelmente constante de leptina demonstrando 55 % de libertação em 6 dias. EXEMPLO 3 0 exemplo seguinte ilustra a preparação um gel de éster hexílico de alginato (DE = 15 mol % e 10 mol %) contendo um fãrmaco proteico (Leptina) - e a sua libertação prolongada in vitro a partir desse gel.

Leva-se este exemplo a cabo de uma forma semelhante à que se descreveu no Exemplo 2, excepto que se utiliza o éster hexílico de alginato.

Os géis de éster hexílico de alginato com 15 e com 10 mol % de grau de esterif icação exibe um pico de libertação mínimo e uma libertação razoavelmente constante de leptina demonstrando 50 % de libertação em 6 dias. EXAMPLE 4 0 exemplo seguinte ilustra a preparação de um gel de éster etílico de alginato (DE = 15 mol %) contendo um fármaco proteico (Zn-Leptina) - e a sua libertação prolongada in vitro a partir desse gel.

Adiciona-se a uma solução a 4 % (peso/volume) de 45 éster etílico de alginato (15 mol %, 0,75 mL), TrisHCl 1 M, pH 8,0 (7,5 μϋι) , PIPES 0,5 M, com pH 6,8 (33 μΐ») e ZnCl2 0,1 M (8,5 μ(Ε) . Agita-se bem a mistura. Adiciona-se a esta mistura a suspensão de Zn-leptina (100 mg/mL, 675 μΐ.) e agita-se muito bem a mistura. Sob agitação forte adicionam-se então à mistura uma suspensão de CaC03 1 M (24 μϋ) e uma solução de β-gluconolactona 1,68 M (70 μ!·) . Coloca-se a mistura final (0,1 mL) no interior de um tubo de Eppendorf e deixa-se de um dia para o outro a 4oC para se obter um gel moldado. Depois da armazenagem de um dia para o outro, leva-se a cabo a libertação prolongada em tampão 10 mM de histidina, a pH 7,4. O gel moldado de éster etílico de alginato exibe um pico de libertação mínimo e uma libertação razoavelmente constante de leptina demonstrando 65 % de libertação em 4 dias. EXEMPLO 5 O exemplo seguinte ilustra a preparação de um gel de éster etílico de alginato (DE = 30 mol %) contendo um fármaco proteico (GCSF) - e a sua libertação prolongada in vitro a partir desse gel.

Adicionam-se a uma solução de éster etílico de alginato a 2,39 % (30 mol %, 0,50 mL) tampão acetato 0,1 M (pH 4,5, 100 μL) , GCSF (104 μL, 48,2 mg/mL, HC1 pH 3) e água destilada (246 mL). Agita-se bem a mistura. Sob agitação forte adicionam-se a esta mistura uma suspensão de CaHP04 1 M (10 μL) e uma solução de β-gluconolactona 1,68 M 46 (40 μΐ,) . Coloca-se a mistura final (0,2 mL) no interior de um tubo de Eppendorf e deixa-se de um dia para o outro a 4 °C para se obter um gel moldado. Depois da armazenagem de um dia para o outro, leva-se a cabo a libertação prolongada em tampão 10 mM de Tris, a pH 7,5. 0 gel moldado de éster etílico de alginato com 30 mol % de grau de esterificação de exibe um pico de libertação inferior a 5% e uma libertação razoavelmente prolongada demonstrando 20 % de libertação em 1 dia e 40 % de libertação em 2 dias. EXEMPLO 6 0 exemplo seguinte ilustra a preparação de um gel de éster benzilico de alginato (DE = 3 0 mol %) contendo um fármaco proteico (GCSF) - e a sua libertação prolongada in vitro a partir desse gel.

Este exemplo é levado a cabo de uma forma semelhante à que se descreveu no Exemplo 5, excepto que se substitui o éster etílico por éster benzílico do alginato. O éster do alginato gelifica durante o período de armazenagem. O gel de éster benzílico de alginato com 30% de grau de esterif icação exibe menos do que 5% de pico de libertação inicial e uma libertação prolongada demonstrando 40 % de libertação em 1 dia, e 80%5 de libertação em 2 dias. EXEMPLO 7 47

Este exemplo mostra a preparação de pérolas de éster etílico de alginato.

Preparam-se as pérolas de gel adicionando gota a gota uma solução de éster de alginato a 2 % por sobre uma solução 100 mM de cloreto de cálcio (em água destilada ou em tampão Tris HC1 1 M, a pH 7,0). As pérolas formadas são lavadas com água destilada ou com o tampão. As pérolas são preparadas usando um grau de esterificação quer de 30 %, quer de 50 %. EXEMPLO 8

Este exemplo mostra a preparação de pérolas de éster etílico de alginato. contendo leptina

Preparam-se as pérolas adicionando gota a gota uma solução de Leptina a 25 mg/mL em éster de alginato a 2 % (em Tris HC1, pH 8,7), por sobre uma solução 100 mM em cloreto de cálcio e 25 mM em cloreto de zinco. As pérolas são preparadas usando um grau de esterificação de 30 %. As pérolas demonstram libertação prolongada de Leptina in vivo. EXEMPLO 9

Este exemplo demonstra a diminuição de massa molecular (ou degradação) de ésteres de alginato em tampões ao pH neutro fisiológico. 48

Dissolvem-se ésteres de alginato (solução a 1 %) quer em tampão fosfato (0,1 M em fosfato de sódio, pH 6,8) ou em tampão Tris 0,1 M (pH 7,0), e incubaram-se a 37°C. Determina-se a diminuição de massa molecular medindo a diminuição da viscosidade da solução (Brookfield, 25°C) a intervalos de tempo seleccionados. Verifica-se que o alginato de sódio não modificado é relativamente estável e que a sua viscosidade apenas diminui de 5 % em 8 dias (tampão de fosfato); no entanto com os ésteres etílico e benzílico de ácido algínico (DE = 30 %) a viscosidade diminui 35 % em 8 dias no mesmo tampão. A intensidade da degradação dos ésteres de ácido algínico também depende do seu grau de esterificação, por exemplo, para o éster etílico com menor grau de esterificação (DE = 15 %), a viscosidade diminui 25 5 em 8 dias. Desta forma a diminuição de massa molecular está directamente relacionada com o grau de esterificação. EXEMPLO 10

Este exemplo demonstra a degradação in vivo (ou o desaparecimento gradual) dos hidrogéis de ésteres de alginato sem proteína e dos hidrogéis contendo proteína.

Preparam-se os géis de ésteres de alginato de uma forma semelhante à que se descreveu no Exemplo 3, mas a mistura final é colocada numa seringa aonde se deixa gelificar a uma temperatura de 4°C, de um dia para o outro. Injecta-se então 100 μΕ de gel subcutaneamente na parte 49 traseira do pescoço de murganhos (Charles River, fêmeas com 12 semanas de idade, BDF1, 20 g, 5 murganhos por grupo) e examina-se o local de injecção periodicamente em diferentes membros do grupo.

Partindo de material de ésteres etílico e benzilico de alginato com um DE = 30 %, os resultados de uma injecção única mostram que os hidrogéis de éster de alginato desaparecem ao longo de 2 semanas. Usando gel de éster etílico de alginato com um DE = 15 %, os géis ainda estão presentes aos 3 0 e aos 61 dias, mas com menor dimensão. Usando gel de éster etílico de alginato com um DE = 5 %, os géis estão presentes aos 30 e aos 61 dias com pequena redução de dimensão. Usando o material de alginato de sódio não substituído, o gel permanece relativamente inalterado até ao dia 61. A taxa de desaparecimento do gel é semelhantes nos géis de éster de alginato, com ou sem proteína. EXEMPLO 11

Este exemplo proporciona a perda de massa e os dados farmacocinéticos relativos a hidrogéis de éster de alginato contendo leptina, em ratos.

Preparam-se os géis de éster etílico de alginato de uma forma semelhante à que se descreveu no Exemplo 4, mas coloca-se a mistura numa seringa e deixa-se ocorrer a 50 gelificação na seringa, a 4°c de um dia para o outro, administra-se aos ratos uma dose grande de 0 mg/kg (controlo) e de 100 mg/kg, e depois monitorizam-se os teores sanguíneos e a perda de peso ao longo de sete dias.

Os resultados mostram que: do éster etílico de alginato com um DE = 5 mol % resulta um teor constante no sangue de -2000 ng/mL durante 3 dias, e depois um declínio para 2-3 ng/mL ao longo dos próximos 3-4 dias; do éster etílico de alginato com um DE = 15 mol % resulta um teor constante no sangue de -2000 ng/mL durante 2 dias, e depois um declínio para 2-3 ng/mL aos 5 dias; do éster etílico de alginato com um DE = 30 mol % resulta um teor constante no sangue de -2000 ng/mL durante 1 dias, e depois um declínio para 2-3 ng/mL aos 4 dias; o teor sanguíneo da suspensão de Zn-leptina exibe um máximo às 12 horas, e depois descresse até 1-2 ng/mL aos 6 dias. Todos os animais exibem perdas de peso mostrando que a Zn-leptina está activa. Os resultados também demonstram que a incorporação de Zn-leptina nos géis de éster etílico de alginato (DE = 5 mol % e 15 mol ) quase que duplica a área sob a curva (AS) da Zn-leptina sugerindo que duplique a biodisponibilidade, e a utilização de gel de éster etílico de alginato (DE = 30 mol%) demonstra uma biodisponibilidade semelhante para a Zn-leptina, com base na sua ASC.

Lisboa, 7 de Dezembro de 2006

Claims (31)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de gel para libertação prolongada a prazo, que inclua: a) um polissacãrido aniónico biodegradável; b) um agente biologicamente activo; e c) pelo menos um ião metálico polivalente ligado, em que o agente biologicamente activo inclua uma proteína e em que o polissacárido aniónico biodegradável seja um éster de alginato que apresente ligações cruzadas iónicas, para proporcionar um hidrogel de éster de alginato biocompatível que seja injectável e biodegradável.

2. A composição para libertação prolongada da reivindicação 1, em que o ião metálico polivalente ligado seja uma mistura de ião metálico polivalente ligado, e não ligado.

3. A composição para libertação prolongada das reivindicações 1 ou 2, contendo também excipientes para estabilizar o agente biologicamente activo ou o polissacãrido aniónico.

4. A composição de qualquer das reivindicações anteriores, em que o ião metálico polivalente ligado 2 provenha de ura sal seleccionado de entre o conjunto constituído por acetatos, fosfatos, lactatos, tartaratos, cloretos, carbonatos ou hidróxidos desse ião.

5. A composição de qualquer das reivindicações anteriores, em que o ião metálico seja seleccionado de entre o conjunto constituído por manganésio, estrôncio, ferro, magnésio, cálcio, bário, cobre, alumínio e zinco.

6. A composição da reivindicação 5, em que o ião metálico seja de cálcio.

7. A composição de qualquer das reivindicações anteriores, em que a composição se destine a melhorar a biodisponibilidade.

8. A composição de qualquer das reivindicações anteriores, em que a proteína esteja presente a pelo menos 0,001 mg/mL.

9. A composição de qualquer das reivindicações anteriores, em que a proteína seja seleccionada de entre o conjunto constituído por factores hematopoiéticos, factores de estimulação de colónias, factores anti obesidade, factores de crescimento, factores tróficos, e factores anti inflamatórios.

10. A composição da reivindicação 9, em que a proteína seja seleccionada de entre o conjunto constituído 3 por leptina, G-CSF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-Ira, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferões, eritropoietina, KFG, insulina e os análogos ou derivados destas proteínas.

11. A composição de qualquer das reivindicações anteriores, em que o agente biologicamente activo seja um agente biologicamente activo complexado.

12. A composição da reivindicação 11, em que o agente biologicamente activo complexado seja uma proteína precipitada.

13. A composição da reivindicação 12, em que a proteína precipitada seja um precipitado de leptina de zinco.

14. Uma seringa previamente cheia contendo uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 .

15. Uma formulação farmacêutica que inclua a composição para libertação prolongada a prazo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, num veículo, diluente ou adjuvante que seja aceitável do ponto de vista farmacêutico.

16. A formulação farmacêutica da reivindicação 15, em que a formulação esteja numa seringa. 4

17. Um método de produzir uma composição de um gel para libertação prolongada a prazo, incluindo os passos de: a) se misturar um agente biologicamente activo com um polissacárido aniónico biodegradável para se obter uma primeira mistura; b) se misturar com a primeira mistura referida, pelo menos um ião metálico polivalente ligado, para se formar uma segunda mistura; em que o agente biologicamente activo contenha uma proteína e em que o polissacárido aniónico biodegradável referido seja um éster de alginato que esteja envolvido em ligações cruzadas iónicas, para proporcionar um hidrogel de éster de alginato biocompatível, que seja injectável e biodegradável.

18. 0 método da reivindicação 17 em que o ião metálico polivalente ligado provenha de um sal seleccionado de entre o conjunto constituído por acetatos, fosfatos, lactatos, tartaratos, cloretos, carbonatos ou hidróxidos desse ião.

19. O método das reivindicações 17 ou 18, em que o ião metálico seja seleccionado de entre o conjunto constituído por manganésio, estrôncio, ferro, magnésio, cálcio, bário, cobre, alumínio e zinco. 5

20. O método da reivindicação 19, em que o ião metálico seja de cálcio.

21. O método de qualquer uma das reivindicações 17 a 20, em que a proteína seja seleccionada de entre o conjunto constituído por factores hematopoiéticos, factores de estimulação de colónias, factores anti obesidade, factores de crescimento, factores tróficos, e factores anti inflamatórios.

22. O método da reivindicação 21, em que a proteína seja seleccionada de entre o conjunto constituído por leptina, G-CSF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-Ira, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferões, eritropoietina, KFG, insulina e os análogos ou derivados destas proteínas.

23. 0 método de qualquer uma das reivindicações 17 a 22, em que o agente biologicamente activo seja um agente biologicamente activo complexado.

24. 0 método da reivindicação 23, em que o agente biologicamente activo complexado seja uma proteína precipitada.

25. O método da reivindicação 24, em que a proteína precipitada seja um precipitado de leptina de zinco.

26. O método de qualquer uma das reivindicações 6 17 a 25, incluindo também o passo de se isolar a composição de gel para libertação prolongada a prazo.

27. Uma composição de gel para libertação prolongada a prazo que seja produzida pelo método de qualquer uma das reivindicações 17 a 26.

28. Uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para utilização num método de tratamento.

29. A utilização de uma composição para libertação prolongada de acordo com a reivindicação 1, em que o agente biologicamente activo seja uma leptina de ocorrência natural, recombinante, sintética ou semi sintética no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma patologia seleccionada de entre excesso de peso, diabetes, teor elevado de lípidos no sangue, esclerose arterial, placa arterial, para a diminuição de, ou para impedir que surjam, pedras na vesícula, no caso de massa insuficiente de tecido magro, de sensibilidade insuficiente à insulina, e na apoplexia.

30. A utilização de uma composição para libertação prolongada de acordo com a reivindicação 1, em que o agente biologicamente activo seja uma G-CSF de ocorrência natural, recombinante, sintética ou semi sintética, no fabrico de um medicamento para o tratamento de uma patologia seleccionada de entre o conjunto 7 constituído por factores hematopoiéticos, infecção e neutropenia.

31. A utilização de uma composição para libertação prolongada de acordo com a reivindicação 1, em que o agente biologicamente activo seja uma Il-lra de ocorrência natural, recombinante, sintética ou semi sintética, no fabrico de um medicamento para o tratamento da inflamação. Lisboa, 7 de Dezembro de 2006