ES2275341T3 - Geles de alginato biodegradables de liberacion sostenida. - Google Patents

Abstract

Una composición de gel retardado de liberación sostenida, que comprende: a) un polisacárido aniónico biodegradable; b) un agente biológicamente activo; y c) al menos un ion metálico polivalente unido, en la que el agente biológicamente activo comprende una proteína y en la que dicho polisacárido aniónico biodegradable es un éster de alginato que está reticulado iónicamente para proporcionar un hidrogel de éster de alginato inyectable, biodegradable y biocompatible.

Description

Geles de alginato biodegradables de liberación sostenida.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones de liberación sostenida que usan cuentas de gel de alginato biodegradables y/o a geles retardados y a sus métodos.

Antecedentes de la invención

Con los avances en las tecnologías genéticas y de ingeniería celular, la disponibilidad de proteínas recombinantes ha engendrado avances en el uso de proteínas como medicamentos para aplicaciones terapéuticas. Muchas enfermedades o estados tratados con proteínas farmacéuticas requieren niveles de proteína sostenidos para alcanzar el resultado terapéutico más eficaz. Sin embargo, como con la mayoría de los productos farmacéuticos proteínicos, la semivida biológica generalmente corta requiere una administración frecuente. Estas inyecciones repetidas se administran a diversos intervalos que dan como resultado niveles de medicación fluctuantes con una carga física y monetaria significativa sobre los pacientes. Puesto que muchos estados responden mejor a niveles controlados de un producto farmacéutico, existe una necesidad de liberación controlada de un medicamento para proporcionar períodos de liberación constante más prolongados. Tales medicamentos de liberación sostenida proporcionarían al paciente no solo efectos profilácticos, terapéuticos o diagnósticos potenciados, sino también una disminución en la frecuencia de las inyecciones así como en los costes globales.

Intentos actuales de niveles de medicación sostenidos en seres humanos o animales entre dosis han incluido el uso de polímeros biodegradables como matrices para controlar la liberación de medicamento. Por ejemplo, la Patente de Gran Bretaña Nº 1.388.580 describe el uso de hidrogeles para la liberación sostenida de insulina. La Patente de EE.UU. Nº 4.789.550 describe el uso de microcápsulas de alginato revestidas con polilisina para el aporte de proteína al encapsular células vivas. Intentos de liberación sostenida también han utilizado composiciones de polímero aniónicas o catiónicas rodeadas por polímeros iónicos de la carga opuesta para encapsular células capaces de producir composiciones biológicamente activas; Patente de EE.UU. Nº 4.744.933. Asimismo, también se han descrito múltiples capas de polímeros aniónicos o catiónicos que se reticulan como medios para obtener liberación controlada; Patentes de EE.UU. Nº 4.690.682 y 4.789.516. Además, intentos adicionales describen el uso de alginatos solos o alginatos revestidos con otros polímeros biodegradables, para la liberación controlada de composiciones polipeptídicas o sus precipitados catiónicos; documentos PCT WO 95/00081, PCT WO 95/29664 y PCT WO 96/03116.

La Patente Japonesa JP 1005460 describe un método para la producción de un material de gel retardado que usa goma de gelano y una sal de metal alcalinotérreo.

El documento EP-A-719548 describe un método para gelificar polietilenglicol líquido a temperatura ambiente con acetato cálcico, para producir geles sustancialmente translúcidos.

Sin embargo, estos intentos han proporcionado medios insuficientes para obtener un aporte de liberación sostenida de productos farmacéuticos proteínicos deseados. Se sabe generalmente que el uso de ciertos polímeros biodegradables, por ejemplo poli-láctido-co-glicólido, bajo condiciones in vivo, exhibe altas descargas instantáneas iniciales de liberación de medicamento; Johnson, O. y otros, Nature Med., 2(7): 795 (1996). Por otra parte, se sabe generalmente que las proteínas usadas con formas actuales de preparaciones de liberación sostenida pueden sufrir desnaturalización y perder su bioactividad durante la exposición a los agentes encapsulantes. Tales preparaciones usan disolventes orgánicos que pueden tener efectos perjudiciales sobre la proteína de elección. Finalmente, según se analiza posteriormente, el uso de alginato solo no ha proporcionado la liberación de proteína controlada deseada necesaria para unos resultados terapéuticos eficaces.

En general, los alginatos son polisacáridos aniónicos presentes en la naturaleza bien conocidos comprendidos por ácido \beta-D-manurónico conectado en 1,4 y ácido \alpha-L-gulurónico; Smidsrod, O. y otros, Trends in Biotechnol., 8: 71-78 (1990); Aslani, P. y otros, J. Microencapsulation, 13(5): 601-614 (1996). Los alginatos varían típicamente de 70% de ácido manurónico y 30% de ácido gulurónico a 30% de ácido manurónico y 70% de ácido gulurónico; Smidsrod, anteriormente. El ácido algínico es insoluble en agua mientras que las sales formadas con iones monovalentes como sodio, potasio y amonio son solubles en agua; McDowell, R.H., "Properties of Alginates" (Londres, Alginate Industries Ltd, 4ª edición, 1977). Se sabe que los cationes polivalentes reaccionan con alginatos y forman espontáneamente geles.

Los alginatos tienen una amplia variedad de aplicaciones tales como aditivos alimentarios, adhesivos, tabletas farmacéuticas y apósitos para heridas. Los alginatos también se han recomendado para técnicas de separación de proteínas. Por ejemplo, Gray, C.J. y otros, en Biotechnology and Bioengineering, 31: 607-612 (1988), atraparon insulina en geles de zinc/alginato cálcico para la separación de insulina de otras proteínas séricas.

Las matrices de alginato también han estado bien documentadas para sistemas de aporte de fármacos. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.695.463, que describe un sistema de aporte de goma de mascar basado en alginato y preparaciones farmacéuticas. Se han usado cuentas de alginato para la liberación controlada de diversas proteínas tales como: receptor de factor de necrosis tumoral en cuentas de catión-alginato revestidas con policationes; Wee, S.F, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Maten, 21: 730-31 (1994); factor de crecimiento transformante encapsulado en cuentas de alginato; Puolakkainen, P.A. y otros, Gastroenterology, 107: 1319-1326 (1994); factores angiogénicos atrapados en cuentas de alginato cálcico; Downs, E.C. y otros, J. of Cellular Physiology, 152: 422-429 (1992); albúmina atrapada en microcápsulas de quitosano-alginato; Polk, A. y otros, J. Pharmaceutical Sciences, 83(2): 178-185 (1994); cuentas de quitosano-alginato cálcico revestidas con polímeros; Okhamafe, A. O. y otros, J. Microencapsul., 13(5): 497-508 (1996); hemoglobina encapsulada con cuentas de quitosano-alginato cálcico; Huguet, M.L. y otros, J. Applied Polymer Science, 51:1427-1432 (1994), Huguet, M.L. y otros, Process Biochemistry, 31:745-751 (1996); e interleuquina-2 encapsulada en microesferas de alginato-quitosano; Liu, L.S. y otros, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 22: 542-543 (1995).

La Patente de EE.UU. 5.700.848 describe un método para producir microcápsulas que encapsulan materiales biológicos y revestidas con materiales polímeros, incluyendo, por ejemplo, alginato polimerizable o materiales compuestos polimerizables de alginato y PEG.

Los sistemas que usan cuentas de gel de alginato o cuentas de gel de alginato/calcio para atrapar proteínas sufren de falta de cualquier efecto de liberación sostenida debido a la rápida liberación de la proteína desde las cuentas de alginato; Liu, L. y otros, J. Control. Rel, 43: 65-74 (1997). Para evitar tal liberación rápida, un número de los sistemas anteriores intenta usar revestimientos de polímero policatiónico (por ejemplo, polilisina, quitosano) para retardar la liberación de las cuentas de proteína-alginato; Véanse, por ejemplo, Wheatley, M.A. y otros, J. Applied Polymer Science, 43: 2123-2135 (1991); Wee, S.F. y otros, anteriormente; Liu, L.S. y otros, anteriormente; Wee, S.F. y otros, Controlled Release Society, 22: 566-567 (1995) y Lim, y otros, anteriormente.

Los policationes, tales como la polilisina, son polielectrolitos cargados positivamente que interactúan con las moléculas de alginato cargadas negativamente para formar complejos de polielectrolito que actúan como barreras de difusión sobre la superficie de las cuentas. Pueden producirse problemas con el uso de policationes ya que: (1) tales formulaciones pueden se citotóxicas debido a los policationes; Huguet, M.L. y otros, anteriormente; Zimmermann, Ulrich, Electrophoresis, 13: 269 (1992); Bergmann, P. y otros, Clinical Science, 67: 35 (1984); (2) los policationes son propensos a la oxidación; (3) las cuentas con revestimientos policatiónicos tienden a no ser erosionables y se acumulan en el cuerpo; (4) tales formulaciones se elaboran a través de procedimientos de revestimiento laboriosos que incluyen múltiples revestimientos de la polilisina policatiónica; Padol y otros, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater, 2: 216 (1986) y (5) las interacciones iónicas entre la proteína y los policationes pueden dar como resultado pérdida de la actividad de la proteína o provocar inestabilidad de la proteína.

Francesco y otros, Patente de EE.UU. Nº 5.336.668 (y las referencias citadas allí), describen ésteres totales y parciales de ácido algínico, elaborados mediante diferentes procedimientos, y que poseen cualidades farmacéuticas interesantes. Se describe cómo podrían utilizarse los ésteres algínicos como materiales plásticos biodegradables para uso médico-quirúrgico; como aditivos para una amplia gama de materiales polímeros; o usarse en la preparación de diversos medicamentos. El uso potencial de los alginatos esterificados en formulaciones de liberación sostenida no se analiza ni tampoco se describen hidrogeles de alginato esterificado.

El documento EP-A-613693 describe un material de recubrimiento para heridas soluble en agua que comprende un éster de alginato de un alcohol polihidroxilado C_{1}-C_{6}, un humectante que consiste en uno o más alcoholes monohidroxilados o polihidroxilados C_{1}-C_{6} y opcionalmente agua.

TATESHITA, Kengo y otros, Biological and Pharm. Bulletin, 16(4), páginas 420-424, (1993) analiza cuentas de gel de alginato que contienen el antagonista del calcio nifedipina, y preparadas usando la gelificación de alginato o alginato y PGA.

Nightlinger y otros, Proceed. Inter. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22: 738-739 (1995) describen microesferas de ácido hialurónico (HA) esterificado que tienen capacidades de liberación controlada. Las referencias se dirigen generalmente a las diferentes velocidades de degradación para sus derivados de HA y describen cómo el éster se "rompe" para liberar los restos de alcohol y HA. No hay un análisis relativo a cómo la cadena principal de HA se descompone, o si lo hace, en unidades de polímero de peso molecular inferior.

Para que un sistema de aporte sostenido basado en polisacárido sea útil, el polisacárido debe ser biodegradable en productos atóxicos. Se ha encontrado que ciertos sistemas de gel de alginato, aunque son eficaces para proporcionar liberación sostenida de fármaco, dan como resultado una "protuberancia" (o nódulo) en la zona de inyección debido a la disipación muy lenta del gel. En una situación terapéutica que implica bajas dosis de fármaco e inyecciones poco frecuentes, esto podría no ser un problema principal. Sin embargo, en una situación terapéutica que implica altas dosis de fármaco e inyecciones más frecuentes, este efecto podría ser prohibitivo. Debe desarrollarse un medio para incrementar la velocidad de disipación del gel de alginato desde la zona de inyección.

Así, todavía existe una necesidad de desarrollar formulaciones farmacéuticas que alcancen un medio más versátil y eficaz de liberación sostenida para aplicaciones clínicas. Numerosas proteínas recombinantes o naturales podrían beneficiarse de una liberación constante a largo plazo y de ese modo proporcionar resultados clínicos más eficaces.

La presente invención proporciona tales avances. Las composiciones farmacéuticas que usan las partículas de gel de alginato biodegradable o los geles de la presente invención son capaces de proporcionar biodisponibilidad incrementada, protección de proteínas, degradación disminuida y baja liberación con estabilidad y potencia de proteínas incrementada. Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención proporcionan un medio simple, rápido y económico de liberación controlada de proteínas recombinantes para resultados profilácticos, terapéuticos o diagnósticos eficaces.

Sumario de la invención

La presente invención surge de estudios que usan hidrogeles de alginato (una clase de polisacáridos aniónicos) no modificados para la liberación sostenida de proteínas. Estos hidrogeles de alginato no modificados que contienen proteínas (véanse las solicitudes de EE.UU. en tramitación junto con la presente 08/857.913 y 08/912.902) se forman de una manera retardada en el tiempo con lo que los materiales pueden cargarse en una jeringa y dejarse gelificar más tarde en la misma jeringa; se encuentra que estos geles son inyectables. Después de una sola inyección subcutánea en modelos de roedores se observa la evidencia de muchos días de proteína sostenida; sin embargo, permanece una protuberancia o nódulo perceptible en la zona de inyección durante largos períodos de tiempo con poco cambio en su tamaño. Esta protuberancia consiste en el hidrogel de alginato relleno de agua y el tamaño de la protuberancia es una función del volumen de gel que se inyecta. Las cuentas de gel también permanecen en la zona de inyección.

La presente invención se refiere así a una nueva clase de hidrogeles de polisacárido biodegradables y biocompatibles, hidrogeles de éster de alginato, para la liberación sostenida de proteínas terapéuticas. Inesperadamente, los hidrogeles de éster de alginato, además de tener las propiedades de gelificación, capacidad de inyección y liberación sostenida de los alginatos no modificados, no dejan una protuberancia en la zona de inyección - esto es, los hidrogeles de éster de alginato son biodegradables o erosionables y se reabsorben gradualmente en los tejidos circundantes con poca reacción en la zona de inyección.

Las composiciones de la presente invención comprenden ésteres de alginato o sus derivados iónicamente reticulados en una matriz de hidrogel (que contiene agua) que contiene una proteína.

La presente invención se refiere además a un método para producir composiciones de liberación sostenida biodegradables.

La presente invención se refiere además al uso de los materiales de alginato estéricos en mezclas líquidas para la gelificación retardada en el tiempo en el cuerpo.

La presente invención se refiere además a composiciones en las que los hidrogeles de éster de alginato están en forma de cuentas o microesferas para la liberación sostenida de agentes activos, preferiblemente proteínas terapéuticas.

En una realización de la presente invención, los hidrogeles de éster de alginato proporcionan composiciones para aplicación en zonas elegidas del cuerpo de un paciente. Estas composiciones son útiles: para prevenir o inhibir la formación de adhesiones tisulares después de cirugía y lesión traumática; para complementar tejidos, especialmente para rellenar tejidos blandos y duros; para rellenar un espacio confinado con un material reabsorbible; como un andamio para el crecimiento tisular; y como un apósito para heridas.

En otra realización, los hidrogeles de éster de alginato proporcionan dispositivos que contienen agentes activos para la implantación en el cuerpo, con lo que el agente puede estar unido o no unido al polímero de alginato.

En otra realización, las composiciones de hidrogel de éster de alginato de la presente invención proporcionan un método para mejorar la biodisponibilidad del agente activo en la composición.

Finalmente, las composiciones de hidrogel de éster de alginato de la presente invención proporcionan además un método para obtener un nivel en sangre sustancialmente constante a lo largo del tiempo en el paciente.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una composición de gel retardado de liberación sostenida que comprende: a) un polisacárido aniónico biodegradable; b) un agente biológicamente activo; y c) al menos un ion metálico polivalente, en la que el agente biológicamente activo comprende una proteína y en la que dicho polisacárido aniónico biodegradable es un éster de alginato que está reticulado iónicamente para proporcionar un hidrogel de éster de alginato biodegradable y biocompatible.

De acuerdo con la presente invención, también se proporciona una jeringa precargada que contiene una composición de acuerdo con la presente invención, una formulación farmacéutica que comprende la composición de gel retardada de liberación sostenida de acuerdo con la presente invención en un portador, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y una composición para usar en un método de tratamiento.

De acuerdo con la presente invención, también se proporciona un método para producir una composición de gel retardado de liberación sostenida, que comprende las etapas de: a) mezclar un agente biológicamente activo y un polisacárido aniónico biodegradable para formar una primera mezcla; b) mezclar con dicha primera mezcla al menos un ion metálico polivalente unido para formar una segunda mezcla, en el que el agente biológicamente activo comprende una proteína y en el que dicho polisacárido aniónico biodegradable es un éster de alginato que está reticulado iónicamente para proporcionar un hidrogel de éster de alginato biodegradable y biocompatible.

La presente invención también proporciona el uso de una composición de liberación sostenida, en el que el agente biológicamente activo es leptina, uno de sus análogos o derivados, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno seleccionado de exceso de peso, diabetes, alto nivel de lípidos en sangre, esclerosis arterial, placa arterial, la reducción o la prevención de la formación de piedras vesiculares, masa de tejido magro insuficiente, sensibilidad insuficiente a insulina y apoplejía.

Descripción detallada de la invención Composiciones

Polímeros hidrófilos, incluyendo alginatos y sus derivados, pueden obtenerse de diversas fuentes comerciales, naturales o sintéticas bien conocidas en la técnica. Según se usa aquí, el término polímero hidrófobo se refiere a polímeros solubles en agua o polímeros que tienen afinidad para absorber agua. Los polímeros hidrófilos son bien conocidos por el experto en la técnica. Estos incluyen, pero no se limitan a, polianiones, incluyendo polisacáridos aniónicos tales como alginato, carboximetilamilosa, poli(sales de ácido acrílico), poli(sales de ácido metacrílico), copolímero de etileno-anhídrido maleico (semiéster), carboximetilcelulosa, sulfato de dextrano, heparina, carboximetildextrano, carboxicelulosa, 2,3-dicarboxicelulosa, tricarboxicelulosa, goma arábiga carboxílica, carboxicarragenina, pectina, carboxipectina, goma de tragacanto carboxílica, goma de xantano carboxílica, polisulfato de pentosano, carboxialmidón, carboximetilquitina/quitosano, curdlano, hexasulfato de inositol, sulfato de b-ciclodextrina, ácido hialurónico, 6-sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato de heparina, carboximetilalmidón, carragenina, poligalacturonato, goma guar carboxílica, polifosfato, ácido polialdehidocarbónico, poli-1-hidroxi-1-sulfonatopropeno-2, co-poliestireno-ácido maleico, agarosa, mesoglicano, poli(alcoholes vinílicos) sulfopropilados, sulfato de celulosa, sulfato de protamina, goma guar fosforada, poli(ácido glutámico), poli(ácido aspártico), poliaminoácidos, sus derivados o combinaciones. Un experto en la técnica apreciará otros diversos polímeros hidrófilos que están dentro del alcance de la presente invención.

Asimismo, iones metálicos polivalentes unidos pueden obtenerse de diversas fuentes comerciales, naturales o sintéticas que son bien conocidas en la técnica. En particular, los iones metálicos pueden incluir, pero no se limitan a, aluminio, bario, calcio, hierro, manganeso, magnesio, estroncio y zinc. Preferiblemente, los iones metálicos son calcio y zinc o sus sales, como acetato de zinc, acetato cálcico o sales de cloruro. También pueden usarse moléculas y sales pequeñas solubles en agua, tales como sulfato amónico, acetona, etanol y glicerol.

Alcoholes de la serie alifática para usar como componentes esterificantes de los grupos carboxi del ácido algínico de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo, aquellos con un máximo de 34 átomos de carbono, que pueden estar saturados o insaturados y que posiblemente también pueden estar sustituidos con otros grupos libres o funcionalmente modificados, tales como grupos amino, hidroxi, aldehído, ceto, mercapto, carboxi o con grupos derivados de los mismos, tales como hidrocarbilo o dihidrocarbilamino (en lo sucesivo debe considerarse que el término "hidrocarbilo" significa no solo radicales monovalentes de hidrocarburos tales como el tipo C_{n}H_{2n+1}, sino también radicales divalentes o trivalentes, tales como "alquilenos" -C_{n}H_{2}- o "alquilidenos" =C_{n}H_{2n}), grupos éter o éster, grupos acetal o cetal, grupos tioéter o tioéster y grupos carboxi esterificados o grupos carbamídicos o carbamídicos sustituidos con uno o dos grupos hidroxi, con grupos nitrilo o con halógenos.

En los grupos anteriores que contienen radicales hidrocarbilo, estos son preferiblemente radicales alifáticos inferiores, tales como heteroátomos, tales como oxígeno, nitrógeno y azufre. Se da preferencia a alcoholes sustituidos con uno o dos de los grupos funcionales mencionados anteriormente.

Alcoholes del grupo anterior que han de usarse preferentemente dentro de los términos de la presente invención son aquellos con un máximo de 12 y especialmente con un máximo de 6 átomos de carbono y en los que los radicales hidrocarbilo en los grupos amino, éter, éster, tioéter, tioéster, acetal y cetal mencionados anteriormente representan grupos alquilo con un máximo de 4 átomos de carbono, y también en los grupos carboxi esterificado o carbamídicos sustituidos los grupos hidrocarbilo son alquilos con el mismo número de átomos de carbono, y en los que los grupos amino o carbamídicos pueden ser grupos alquilenamino o alquilencarbamídicos con un máximo de 8 átomos de carbono. De estos alcoholes, los que han de mencionarse en primer lugar y principalmente son los saturados y no sustituidos tales como alcoholes metílico, etílico, propílico, alcoholes isopropílicos, alcohol n-butílico, alcoholes isobutílico, terc-butílico, alcoholes amílico, pentílico, hexílico, octílico, nonílico y dodecílico y, por encima de todos, aquellos con una cadena lineal, tales como alcoholes n-octílicos o n-dodecílicos. De los alcoholes sustituidos de este grupo, deben listarse los alcoholes bivalentes, tales como etilenglicol, propilenglicol o butilenglicol, los alcoholes trivalentes, tales como glicerina, aldehidoalcoholes tales como alcohol tartrónico, carboxialcoholes tales como ácidos lácticos, por ejemplo ácido alfa-oxipropiónico, ácido glicólico, ácido málico, ácidos tartáricos, ácido cítrico, aminoalcoholes, tales como aminoetanol, aminopropanol, n-aminobutanol y sus derivados dimetílicos y dietílicos en la función amínica, colina, pirrolidinetanol, piperidiniletanol, piperaziniletanol y los derivados correspondientes de alcoholes n-propílicos o n-butílicos, monotioetilenglicol o sus derivados alquílicos, por ejemplo el derivado etílico en la función mercapto.

De los alcoholes alifáticos saturados superiores, los merecedores de especial mención son, por ejemplo, el alcohol cetílico y el alcohol miristílico, pero especialmente importantes para los propósitos de la presente invención son los alcoholes insaturados superiores con uno o dos dobles enlaces, tales como especialmente los contenidos en muchos aceites esenciales y que tienen una afinidad con los terpenos, tales como citronelol, geraniol, nerol, nerolidol, linalol, farnesol, fitol.

De los alcoholes insaturados inferiores debe prestarse consideración al alcohol propargílico.

De los alcoholes alifáticos, los que han de mencionarse por encima de todos son aquellos con solo un residuo bencénico y en los que la cadena alifática tiene un máximo de 4 átomos de carbono, en los que además el residuo bencénico puede estar sustituido con entre 1 y 3 grupos metilo o hidroxi o con átomos de halógeno, especialmente cloro, bromo o yodo, y en los que la cadena alifática puede estar sustituida con uno o más grupos funcionales seleccionados del grupo que consiste en grupos amino libres o grupos mono- o di-metilo o por grupos pirrolidina o piperidina. De estos alcoholes, el alcohol bencílico y el alcohol fenetílico se prefieren especialmente. Los alcoholes de la serie cicloalifática o alifática-cicloalifática pueden derivar de hidrocarburos mono- o poli-cíclicos y pueden tener un máximo de 34 átomos de carbono. De los alcoholes derivados de hidrocarburos monoanulares cíclicos, debe hacerse mención especial a aquellos con un máximo de 12 átomos de carbono, con anillos que contienen preferiblemente entre 5 y 7 átomos de carbono, posiblemente sustituidos, por ejemplo, con entre 1 y 3 grupos alquilo inferior, tales como grupos metilo, etilo, propilo o isopropilo. Alcoholes específicos de este grupo son ciclohexanol, ciclohexanodiol, 1,2,3-ciclohexanotriol y 1,3,5-ciclohexanotriol (fluoroglucitol), inositol, los alcoholes que se derivan de p-mentano, tales como carbomentol, mentol, alfa y gamma-terpineol, alcoholes 1-terpineólicos conocidos como "terpineol", 1,4- y 1,8-terpina. Alcoholes que derivan de hidrocarburos con anillos condensados son, por ejemplo, aquellos de los grupos del tujano, pinano y campbano, particularmente tujanol, sabinol, hidrato de pinol, D- y L-borneol y D- y L-isoborneol.

También han de incluirse alcoholes derivados de la reacción de esterificación de compuestos que contienen epoxi con alginatos (Véanse, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 2.463.824 y la Patente de EE.UU. 2.426.125).

Los polianiones que contienen grupos éster totales y parciales de la presente invención son generalmente polisacáridos ácidos en los que el oxígeno glicosídico está enlazado en beta al carbono carbonílico del éster. Aunque sin querer estar limitados por ningún mecanismo específico, esta disposición de los restos permite la descomposición de la cadena de polímero por un mecanismo de beta-eliminación que puede producirse bajo condiciones fisiológicas.

Los ésteres de ácido algínico de la presente invención están comprendidos por residuos de ácido manurónico (m-COOH o anión m-COO) y residuos de ácido gulurónico (g-COOH o anión g-COO) empalmados entre sí por enlaces de oxígeno de éter glicosídico de la siguiente fórmula general I:

-(M)n1-(M')n2-(G)n3-(G')n4-(A)n5-

donde:

M es un residuo de ácido manurónico, m-COOH o anión m-COO;

M' es un residuo de éster de ácido manurónico, m-COOR1;

G es un residuo de ácido gulurónico, g-COOH o anión g-COO;

G' es un residuo de éster de ácido gulurónico, g-COOR2;

A representa unidades de cadenas no g o no m, tales como azúcares, productos de oxidación de azúcares, o radicales alifáticos, aromáticos, aralifáticos, alaromáticos y cicloalifáticos que pueden estar sustituidos e interrumpidos con heteroátomos conectados dentro o en los extremos de la cadena;

n1, n2, n3, n4 y n5 son números enteros que representan el número relativo medio de unidades incorporadas;

R1 y R2 son independientemente radicales alifáticos, aromáticos, aralifáticos, alaromáticos y cicloalifáticos que pueden estar sustituidos e interrumpidos con heteroátomos;

y sus derivados (por ejemplo, en los que los grupos hidroxi están acetilados y se hacen reaccionar con isocianatos) y sales farmacéuticamente aceptables.

En los ésteres de la presente invención, es deseable que R1 = R2 = alifático o alaromático y además que 100(n2+n4)/(n1+n2+n3+n4) sea de 1-99% en moles, preferiblemente 5-50% en moles, más preferiblemente 6-30% en moles, aún más preferiblemente 6-15% en moles y lo más preferiblemente 7-12% en moles, y 100n5/(n1+n2+n3+n4+n5) sea preferiblemente menor que 10% en moles.

En los ésteres parciales de la invención, los grupos carboxi no esterificados pueden mantenerse libres o pueden salificarse. Las bases para la formación de estas sales se eligen de acuerdo con el uso final definitivo del producto. Pueden formarse sales inorgánicas a partir de metales alcalinos, tales como potasio y en particular sodio y amonio, o derivando de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio o magnesio o aluminio.

De particular interés son las sales con bases orgánicas, especialmente bases azotizadas y, por lo tanto, aminas alifáticas, aralifáticas, cicloalifáticas o heterocíclicas. Estas sales de amonio pueden derivar de aminas farmacéuticamente aceptables o atóxicas pero aminas terapéuticamente inactivas, o de aminas con una acción terapéutica. Del primer tipo, se prefieren las aminas alifáticas, por ejemplo, mono-, di- y tri-alquilaminas con grupos alquilo con un máximo de 8 átomos de carbono, o arilalquilaminas con el mismo número de átomos de carbono en la parte alifática y donde arilo significa un grupo benceno posiblemente sustituido con entre 1 y 3 grupos metilo o átomos de halógeno o grupos hidroxi. Las bases biológicamente inactivas para la formación de las sales también pueden ser cíclicas, tales como alquilenaminas monocíclicas con ciclos de entre 4 y 6 átomos de carbono, posiblemente interrumpidos en su ciclo por heteroátomos elegidos del grupo formado por nitrógeno, oxígeno y azufre, tales como piperazina o morfolina, o pueden estar sustituidas, por ejemplo con funciones amino o hidroxi, tales como aminoetanol, etilendiamol, etilendiamina, efedrina o colina.

El grado y el tipo de esterificación pueden controlarse mediante métodos sintéticos conocidos en la técnica. Preferiblemente, los ésteres de alginato se preparan mediante el tratamiento de sales de amonio cuaternario de ácido algínico con agentes alquilantes convencionales en un disolvente orgánico aprótico tal como dimetilsulfóxido. Los ésteres resultantes son preferiblemente los ésteres de alcoholes monovalentes tales como alquilo inferior, tal como etilo, o aralquilo, tal como bencilo, o sus mezclas. También pueden formarse ésteres mediante la reacción de ácido algínico con compuestos que contienen oxirano o epoxi tales como óxido de etileno o propileno.

También es posible formar sales de amonio cuaternario de ésteres parciales, por ejemplo las sales de tetraalquilamonio con el número de átomos de carbono mencionado anteriormente y preferiblemente sales de este tipo en las que el cuarto grupo alquilo tiene entre 1 y 4 átomos de carbono, por ejemplo un grupo metilo.

El grado de esterificación (expresado en % en moles) del alginato está relacionado con la velocidad de desaparición deseada del gel en el tejido del paciente. Esta velocidad de desaparición del gel generalmente está relacionada con la velocidad de liberación deseada del agente activo desde el gel, esto es, durante un período de 5 años o menos, habitualmente 2 días a 270 días, más habitualmente 2 días a 180 días, más habitualmente 2 días a 90 días. El grado de esterificación (GE) es de 1% en moles a 99% en moles, preferiblemente de 5% en moles a 50% en moles, más preferiblemente de 6% en moles a 30% en moles, más preferiblemente de 6% en moles a 15% en moles, más preferiblemente de 7% en moles a 12% en moles.

Según se usa aquí, el término tampón o solución tamponadora se refiere al uso de ácidos inorgánicos u orgánicos o una de sus combinaciones para preparar una solución tamponadora, como se conoce en la técnica. Ácidos inorgánicos dentro del alcance de la presente invención incluyen haluro de hidrógeno (por ejemplo, ácido clorhídrico), fosfórico, nítrico o sulfúrico. Otros ácidos inorgánicos serán bien conocidos por un experto en la técnica y se contemplan aquí. Ácidos orgánicos dentro del alcance de la invención incluyen ácidos carboxílicos alifáticos y ácidos aromáticos tales como fórmico, carbónico, acético, propiónico, butírico, valérico, caproico, acrílico, malónico, succínico, glutárico, adípico, maleico, fumárico, glicin- o fenol-sulfónico. Otros ácidos orgánicos serían bien conocidos por un experto en la técnica.

Según se usa aquí, agentes biológicamente activos se refiere a proteínas recombinantes o presentes en la naturaleza, ya sean de ser humano o animal, útiles para aplicación profiláctica, terapéutica o diagnóstica, así como agentes no basados en proteínas tales como moléculas pequeñas. El agente biológicamente activo puede ser natural, sintético, semisintético o sus derivados. Los agentes biológicamente activos de la presente invención deben ser precipitables. Se contempla una amplia gama de agentes biológicamente activos. Estos incluyen, pero no se limitan a, hormonas, citoquinas, factores hematopoyéticos, factores de crecimiento, factores antiobesidad, factores tróficos, factores antiinflamatorios y enzimas (véase además la Patente de EE.UU. Nº 4.695.463 para ejemplos adicionales de agentes biológicamente activos útiles). Un experto en la técnica podrá fácilmente adaptar un agente biológicamente activo deseado a las composiciones de la presente invención.

Tales proteínas incluirían, pero no se limitan a, interferones (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 5.372.808,
5.541.293, 4.897.471 y 4.695.623), interleuquinas (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.075.222), eritropoyetinas (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 4.703.008, 5.441.868, 5.618.698, 5.547.933 y 5.621.080), factor estimulante de colonias de granulocitos (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 4.810.643, 4.999.291, 5.581.476, 5.582.823 y la Publicación PCT Nº 94/17185), factor de células pluripotenciales (Publicaciones PCT Nº 91/05795, 92/17505 y 95/17206) y la proteína OB (véanse las Publicaciones PCT Nº 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816). Además, agentes biológicamente activos también pueden incluir, pero no se limitan a, productos relacionados con la lucha contra la obesidad, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de folículos (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferones (alfa, beta, gamma), interleuquinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína que se une a factor de necrosis tumoral (TNF-bp), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento neurotrófico (NGF), factores de crecimiento óseos tales como osteoprotegerina (OPG), factores de crecimiento similares a insulina (IGFs), factor estimulante de colonias de macrófagos (MCSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de megaqueratinocitos (MGDF), trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF), factores de crecimiento estimulantes de colonias (CSFs), proteína morfogenética ósea (BMP), superóxido dismutasa (SOD), activador del plasminógeno tisular (TPA), uroquinasa, estreptoquinasa y calicreína. El término proteínas, según se usa aquí, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, sus análogos, derivados o combinaciones.

Derivados de agentes biológicamente activos pueden incluir la ligazón de uno o más restos químicos al resto proteínico. Se ha encontrado que la modificación química de agentes biológicamente activos proporciona ventajas adicionales bajo ciertas circunstancias, tales como incrementar la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y disminuir la inmunogenicidad. Un experto en la técnica podrá seleccionar la modificación química deseada basándose en la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteolisis, los usos terapéuticos y otras consideraciones.

Según se usa aquí, biodegradabilidad se refiere a la descomposición del peso molecular de un polímero particular en un número menor de unidades de la cadena, es decir, descomposición en unidades de peso molecular inferior. Gel biodegradable se refiere a la disipación del gel en el ambiente de uso, donde la disipación depende de la descomposición del peso molecular de los polímeros constituyentes, dando como resultado menos unidades en la cadena de polímero.

Complejos

Las proteínas, el análogo o el derivado pueden administrarse complejados a una composición de unión. Tal composición de unión puede tener el efecto de prolongar el tiempo de circulación de la proteína, el análogo o el derivado o potenciar la actividad del agente biológicamente activo. Tal composición puede ser una proteína (o sinónimamente un péptido), un derivado, un análogo o una combinación. Por ejemplo, una proteína de unión para la proteína OB es el receptor de la proteína OB o una de sus porciones, tal como una de sus porciones solubles. Otras proteínas de unión pueden determinarse examinando proteína OB, o la proteína de elección, en suero, o rastrearse empíricamente con respecto a la presencia de unión. Tal unión típicamente no interferirá con la capacidad de la proteína OB o el análogo o el derivado para unirse a receptor de proteína OB endógeno y/o efectuar la transducción de la señal. Además de la proteína OB, los complejos de unión también serán aplicables a otras proteínas terapéuticas de la presente invención. Aquellos con buena experiencia en la técnica podrán determinar proteínas de unión apropiadas para usar con la presente invención.

Asimismo, agentes precipitantes usados para precipitar el agente biológicamente activo pueden obtenerse de diversas fuentes comerciales, naturales o sintéticas que son bien conocidas en la técnica. Agentes precipitantes incluyen, pero no se limitan a, iones metálicos polivalentes o sus sales, tales como acetatos, citratos, cloruros, carbonatos, hidróxidos, oxalatos, tartratos o sus hidróxidos, ácidos o polímeros solubles en agua. En particular, los iones metálicos pueden incluir, pero no se limitan a, aluminio, bario, calcio, hierro, manganeso, magnesio, estroncio y zinc. Preferiblemente, el ion metálico es zinc o sus sales, como sales de acetato y cloruro. También pueden usarse moléculas pequeñas y sales solubles en agua tales como sulfato amónico, acetona, etanol y glicerol.

Como para los polímeros solubles en agua, estos incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos, dextrano, poli(n-vinilpirrolidona), polietilenglicol, copolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados, poli(alcohol vinílico-succinato), glicerina, óxidos de etileno, óxidos de propileno, poloxámeros, copolímeros alcoxilados, polianiones solubles en agua, sus derivados o combinaciones. El polímero soluble en agua puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. Por ejemplo, el peso molecular preferido del polietilenglicol está entre aproximadamente 700 Da y aproximadamente 100 kDa para la facilidad en el manejo y la eficacia de precipitación.

Pueden usarse otros tamaños y tipos de agentes precipitantes, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de liberación sostenida deseada, los efectos, si hay alguno, sobre la actividad biológica, la facilidad en el manejo, el grado o la falta de antigenicidad y otros efectos conocidos de un agente precipitante deseado para una proteína terapéutica o análogo). Un experto en la técnica apreciará otros agentes precipitantes que están dentro del alcance de la invención.

Además, las composiciones de la presente invención también pueden incluir excipientes adicionales necesarios para estabilizar el agente biológicamente activo y/o el polímero hidrófilo. Estos pueden estar contenidos en el tampón y pueden incluir, pero no se limitan a, conservantes.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas de liberación sostenida de la presente invención pueden administrarse mediante preparaciones orales (por ejemplo, cápsulas tales como cápsulas duras y cápsulas blandas, preparaciones sólidas tales como gránulos, tabletas, píldoras, trociscos o grageas, cachets, pastillas, formas en polvo y liofilizadas, preparaciones líquidas tales como suspensiones) y no orales (por ejemplo, preparaciones intramusculares, subcutáneas, transdérmicas, viscerales, IV (intravenosas), IP (intraperitoneales), intraarteriales, intratecales, intracapsulares, intraorbitales, inyectables, pulmonares, nasales, rectales y uterinas-transmucosales).

En general, están comprendidas por la invención composiciones farmacéuticas de liberación sostenida que comprenden cantidades eficaces de proteína, o productos derivados, con las composiciones de liberación sostenida de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables necesarios para la administración. Véase el documento PCT 97/01331. La formulación farmacéutica óptima para un agente biológicamente activo deseado será determinada por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. Composiciones farmacéuticas ejemplares se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., 18ª edición, Easton, PA, páginas 1435-1712 (1990)).

Debido a la naturaleza tixotrópica de la formulación de gel retardada, pueden usarse jeringas para administrar subcutáneamente. La composición puede gelificarse en una jeringa para inyección posterior. Esta gelificación puede realizarse de una manera retardada en el tiempo. La cronología se controla mediante el ajuste juicioso de la cantidad del agente gelificante y el donante de protones de la mezcla, si es necesario. Tal preparación se usaría para una regelificación posterior en el cuerpo después de la inyección. El término tixotrópico, según se usa aquí, se refiere a la viscosidad de la mezcla en gel que disminuye bajo presión, por ejemplo desde el émbolo de la jeringa, en cuyo punto la mezcla puede fluir, por ejemplo a través de la aguja de la jeringa, y a continuación volver a formar un gel en la zona de inyección.

El concepto de gelificación retardada también puede aplicarse a cargar una jeringa, donde una composición en gel de liberación sostenida se carga en una jeringa y a un tiempo prefijado se gelifica en la jeringa, por ejemplo de unos pocos minutos a muchas horas después de la carga. Esto evita el problema de cargar una jeringa con material que ya se ha gelificado. Estas jeringas precargadas pueden almacenarse para inyección posterior en pacientes.

Componentes que pueden ser necesarios para la administración incluyen diluyentes de diverso contenido de tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como tensioactivos y agentes solubilizantes (por ejemplo, Tween 80, HCO-60, Polysorbate 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, glutationa, metabisulfito sódico), polisacáridos adicionales (por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginato sódico, hialuronato sódico, sulfato de protamina, polietilenglicol), conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico, metilparabén, propilparabén) y sustancias formadoras (por ejemplo, lactosa, manitol); la incorporación del material en preparaciones en partículas de compuestos polímeros, tales como polímeros o copolímeros de poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico), etc., o combinado con liposomas. El ácido hialurónico también puede usarse como un componente de administración y esto puede tener el efecto de promover aún más la duración sostenida en la circulación. Adicionalmente, las composiciones de liberación sostenida de la presente invención también pueden dispersarse con aceites (por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite vegetal) o una de sus mezclas con un fosfolípido (por ejemplo, lecitina) o triglicéridos de ácido graso de cadena media (por ejemplo, Miglyol 812) para proporcionar una suspensión aceitosa. Las composiciones de la presente invención también pueden dispersarse con agentes dispersantes tales como polisacáridos solubles en agua (por ejemplo, manitol, lactosa, glucosa, almidones), ácido hialurónico, glicina, fibrina, colágeno y sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro sódico).

Además, también se contemplan para el uso en la administración de las composiciones de liberación sostenida de la presente invención dispositivos médicos destinados al aporte pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo, pero no limitados a, nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para los expertos en la técnica.

Los componentes de la administración pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de depuración in vivo de las presentes proteínas y derivados. Un experto en la técnica apreciará los componentes de administración apropiados y/o los dispositivos mecánicos apropiados para usar dependiendo del uso terapéutico, la ruta de administración, la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteolisis, la estabilidad de las proteínas y otras consideraciones.

Métodos de Uso

Terapéutico. Los usos terapéuticos dependen del agente biológicamente activo usado. Un experto en la técnica podrá fácilmente adaptar un agente biológicamente activo deseado a la presente invención para sus usos terapéuticos pretendidos. Usos terapéuticos para tales agentes se indican con más detalle en las siguientes publicaciones incorporadas por la presente mediante referencia incluyendo los dibujos. Usos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, usos para proteínas como interferones (véanse, las Patentes de EE.UU. Nº 5.372.808, 5.541.293, 4.897.471 y 4.695.623), interleuquinas (véase la Patente de EE.UU. Nº 5.075.222), eritropoyetinas (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 4.703.008, 5.441.868, 5.618.698, 5.547.933 y 5.621.080), factor estimulante de colonias de granulocitos (véanse las Patentes de EE.UU. Nº 4.999.291, 5.581.476, 5.582.823, 4.810.643 y la Publicación PCT Nº 94/17185), factor de células pluripotenciales (Publicaciones PCT Nº 91/05795, 92/17505 y 95/17206) y la proteína OB (véanse la publicaciones PCT Nº 96/40912, 96/05309, 97/00128, 97/01010 y 97/06816).

Además, usos terapéuticos de la presente invención incluyen usos de agentes biológicamente activos incluyendo, pero no limitados a, productos relacionados con la lucha contra la obesidad, insulina, gastrina, prolactina, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), hormona estimulante del tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), hormona estimulante de folículos (FSH), gonadotropina coriónica humana (HCG), motilina, interferones (alfa, beta, gamma), interleuquinas (IL-1 a IL-12), factor de necrosis tumoral (TNF), proteína de unión al factor de necrosis tumoral (TNF-bp), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF), factor neurotrófico 3 (NT3), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento neurotrófico (NGF), factores de crecimiento óseos tales como osteoprotegerina (OPG), factores de crecimiento similares a insulina (IGFs), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de crecimiento derivado de megaqueratinocitos (MGDF), trombopoyetina, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PGDF), factores de crecimiento estimulantes de colonias (CSFs), proteína morfogenética ósea (BMP), superóxido dismutasa (SOD), activador del plasminógeno tisular (TPA), uroquinasa, estreptoquinasa y calicreína. El término proteínas, según se usa aquí, incluye péptidos, polipéptidos, moléculas de consenso, sus análogos, derivados o combinaciones. Además, las presentes composiciones también pueden usarse para la fabricación de uno o más medicamentos para el tratamiento o la mejora de los estados que pretende tratar el agente biológicamente
activo.

A modo de ejemplo, los usos terapéuticos incluyen oxigenación en la sangre, y también puede alcanzarse una disminución en la reabsorción ósea o la osteoporosis en ausencia de pérdida de peso.

Terapias de Combinación. Las composiciones y los métodos presentes pueden usarse junto con otras terapias, tales como dieta alterada y ejercicio. Pueden usarse otros medicamentos, tales como aquellos útiles para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo, insulina y posiblemente amilina), medicamentos para el colesterol y para disminuir la presión sanguínea (tales como aquellos que reducen niveles de lípidos en sangre u otros medicamentos cardiovasculares), medicamentos que incrementan la actividad (por ejemplo, anfetaminas), diuréticos (para la eliminación de líquidos) y supresores del apetito. Tal administración puede ser simultánea o puede ser en serie. Además, los presentes métodos pueden usarse junto con procedimientos quirúrgicos destinados a para alterar la apariencia global del cuerpo (por ejemplo, liposucción o cirugías laséricas destinadas a reducir la masa corporal, o cirugías de implante destinadas a incrementar la apariencia de la masa corporal). Los beneficios sanitarios de las cirugías cardíacas, tales como cirugías de "bypass" u otras cirugías destinadas a aliviar un estado perjudicial provocado por el bloqueo de los vasos sanguíneos por depósitos de grasa, tales como la placa arterial, pueden incrementarse con el uso concomitante de las composiciones y los métodos presentes. Métodos para eliminar piedras vesiculares, tales como métodos ultrasónicos o laséricos, también puede usarse antes de, durante o después del transcurso de los presentes métodos terapéuticos. Por otra parte, los presentes métodos pueden usarse como un adyuvante para cirugías o terapias para huesos rotos, músculo dañado u otras terapias que se mejorarían mediante un incremento en la masa de tejido
magro.

Dosificaciones

Un experto en la técnica podrá determinar las dosificaciones eficaces mediante la administración y observando el efecto terapéutico deseado. La dosificación de la preparación de liberación sostenida es la cantidad necesaria para alcanzar la concentración eficaz del agente biológicamente activo in vivo, durante un período de tiempo dado. La dosificación y la frecuencia de administración preferida de las preparaciones de liberación sostenida varían con el tipo del agente biológicamente activo, la duración deseada de la liberación, la enfermedad elegida como objetivo, la frecuencia de administración deseada, la especie del animal en cuestión y otros factores. Preferiblemente, la formulación de la molécula será tal que entre aproximadamente 0,10 \mug/kg/día y 100 mg/kg/día darán el efecto terapéutico
deseado.

Las dosificaciones eficaces pueden determinarse usando herramientas diagnósticas a lo largo del tiempo. A modo de ejemplo, la presente invención proporciona las dosificaciones de proteína OB. Por ejemplo, puede usarse en primer lugar un diagnóstico para medir la cantidad de proteína OB en la sangre (o el plasma o el suero) para determinar niveles endógenos de proteína OB. Tal herramienta diagnóstica puede estar en la forma de un ensayo de anticuerpos, tal como un ensayo de anticuerpos de tipo sándwich. La cantidad de proteína OB endógena se cuantifica inicialmente y se determina una línea de base. Las dosificaciones terapéuticas se determinan a medida que la cuantificación de proteína OB endógena y exógena (esto es, proteína, análogo o derivado encontrado dentro del cuerpo, ya sea autoproducido o administrado) se continúa a lo largo del transcurso de la terapia. Por ejemplo, puede necesitarse una dosificación relativamente alta inicialmente, hasta que se observa un beneficio terapéutico, y a continuación usarse dosificaciones inferiores para mantener los beneficios terapéuticos.

Materiales y Métodos

Materiales. El alginato en forma de alginato sódico puede encontrarse de fuentes bien conocidas en la técnica. La proteína OB y el GCSF son de Amgen Inc. Otros productos químicos son de fuentes bien conocidas en la
técnica.

Preparación de Partículas/Cuentas de Hidrogel de Alginato. La preparación de las partículas y cuentas de hidrogel de alginato, con y sin proteínas, se describe con detalle en la solicitud de EE.UU. en tramitación junto con la presente 08/842.756.

Preparación de Gel Retardado. La preparación de los hidrogeles de alginato retardados, con y sin proteínas, se describe con detalle en las solicitudes de EE.UU. en tramitación junto con la presente 08/857.913 y 08/912.902.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más a fondo la invención. Además, con respecto a la descripción anterior o los ejemplos posteriores, un experto en la técnica podrá hacer los cambios necesarios en las descripciones para la producción a gran escala.

Ejemplo 1

El siguiente ejemplo describe la preparación de ésteres de alginato que han de usarse en la presente invención.

Preparación A

Alginato de tetrabutilamonio (TBA)

Una resina de ácido sulfónico (Bio-Rad, AG MP-50) se convierte en la forma de tetrabutilamonio (TBA) mediante tratamiento con hidróxido de tetrabutilamonio (Aldrich) usando un método discontinuo a temperatura ambiente. A una solución de 10 g de sal sódica de ácido algínico en 800 ml de agua destilada se añaden 60 ml de resina sulfónica (Bio-Rad, AG MP-50) en la forma de sal de tetrabutilamonio. La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 0,5 horas. La resina se retira mediante filtración y se lava con agua destilada. El alginato de TBA en el filtrado se aísla mediante secado por congelación (rendimiento 16,8 g) y se confirma mediante ^{1}H NMR.

Preparación B

Éster etílico parcial de ácido algínico, grado de esterificación (GE) = 30% en moles

Se disuelve alginato de TBA (6 g, 14,4 mmol de unidades de TBA) en 500 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) a temperatura ambiente. A continuación se añade yodoetano (Aldrich, 673 mg, 4,3 mmol). La mezcla se agita a 30ºC durante 15 horas y a continuación se enfría hasta temperatura ambiente. Se añade lentamente a esta solución una solución de 2 g de NaCl en 20 ml de agua hasta convertir completamente el TBA en la sal sódica. Después de agitar 15-30 min, la solución se cuela lentamente en 1500 ml de acetato de etilo. El precipitado se recoge mediante filtración y se lava tres veces con acetona/agua (8:1 v/v) y tres veces con acetona y a continuación se seca a vacío. El compuesto se redisuelve en agua destilada (\sim100 ml) y el pH se ajusta hasta \sim6,5 con NaHCO_{3} al 0,2% a 0ºC. La solución se dializa a continuación (separación de PM 8000) durante la noche frente a agua destilada a 4ºC y a continuación se seca por congelación. El rendimiento del éster parcial es 2,8 g y el grado de esterificación es 30 +/- 1% (1H NMR, maleimida como patrón interno).

Preparación C

Éster etílico total y parcial de ácido algínico, GE = 100%, 50%, 20%, 10% y 5%

La preparación de estos compuestos es similar a la descrita en la Preparación B, excepto que la cantidad de yodoetano añadida se ajusta para llegar al grado de esterificación deseado.

Preparación D

Ésteres propílico, hexílico, octílico y dodecílico parciales de ácido algínico

Las preparaciones son similares a las descritas en las Preparaciones B y C anteriormente, pero sustituyendo el yodoetano por 1-yodopropano, 1-yodohexano, 1-yodooctano o 1-yododecano, respectivamente.

Preparación E

Éster bencílico parcial de ácido algínico, GE = 30%

Se disuelve alginato de TBA (2,5 g, 5,99 mmol de unidades de TBA) en \sim200 ml de DMSO a temperatura ambiente. Se añaden bromuro de bencilo (Aldrich, 307 mg, 1,8 mmol) y yoduro de TBA (Aldrich, 30 mg). La mezcla se agita a 30ºC durante 15 horas y a continuación se enfría hasta temperatura ambiente. Se añade lentamente a esta solución una solución de 0,6 g de NaCl en 10 ml de agua para convertir completamente el DBA en la sal sódica. Después de agitar 15-30 minutos, la solución se cuela lentamente en 500 ml de acetato de etilo. El precipitado se recoge mediante filtración y se lava tres veces con acetona/agua (8:1 v/v) y tres veces con acetona, y a continuación se seca a vacío. El compuesto se redisuelve en agua destilada (\sim60 ml) y se ajusta hasta pH \sim6,5 con NaHCO_{3} al 0,2% a 0ºC, a continuación se dializa (separación de pm 8000) durante la noche frente a agua destilada a 4ºC. El rendimiento del éster parcial es 1,3 g y el grado de esterificación es 30 +/- 1% (^{1}H NMR, maleimida como patrón interno).

Preparación F

Éster bencílico total y parcial de ácido algínico con diferente GE

La preparación de estos compuestos es similar a la descrita en la Preparación E, excepto que la cantidad de bromuro de bencilo y yoduro de TBA añadida se ajusta para llegar al grado de esterificación deseado.

Ejemplo 2

El siguiente ejemplo muestra la preparación de un gel de éster etílico de alginato (GE = 15% en moles y 10% en moles) que contiene fármaco proteínico (leptina) y la liberación sostenida in vitro desde este gel.

Leptina (100 mg/ml; Tris-HCl 10 mM, pH 8,8; pH ajustado de 8,0 a 8,8 con NaOH 1M) y éster etílico de alginato al 6% (15% en moles, Tris-HCl 10 mM, pH 8,6) se enfrían en un baño de hielo. Se añade leptina (0,5 ml) al éster etílico de alginato al 6% (0,18 ml) y la mezcla se agita en un baño de hielo durante 10-15 min; el pH final es 8,6-8,8. A esta mezcla se añade una suspensión de CaCO_{3} 1M (16 \mul) y la suspensión resultante se mezcla bien. A esta suspensión se añade gota a gota, con agitación, una solución de ZnCl_{2} 0,1M (100 \mul); se añade a continuación agua para llevar el volumen hasta 1 ml. La mezcla se mezcla completamente y se mantiene sobre un baño de hielo durante 10-20 min. A continuación, se agita a fondo una solución de \delta-glucunolactona 1,68M (Aldrich, 56 \mul) en esta mezcla. La mezcla final (50 mg/ml de leptina, éster etílico de alginato al 1%; 0,1 ml) se cuela en el interior de un tubo de Eppendorf y se deja gelificar durante la noche a 4ºC. Después del almacenamiento durante la noche, se efectúa la liberación in vitro en tampón de histidina 10 mM, pH 7,4. El gel colado con un grado de esterificación de 15% en moles exhibe una descarga instantánea mínima y liberación de leptina bastante constante mostrando 60% liberado en 6 días. El gel colado con un grado de esterificación de 10% en moles exhibe una descarga instantánea mínima y liberación de leptina bastante constante mostrando 55% liberado en 6 días.

Ejemplo 3

El siguiente ejemplo muestra la preparación de un gel de éster hexílico de alginato (GE = 15% en moles y 10% en moles) que contiene fármaco proteínico (leptina) y la liberación sostenida in vitro desde este gel.

Este ejemplo se realiza de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 2, excepto que el éster etílico de alginato se sustituye por éster hexílico de alginato.

Los geles de éster hexílico de alginato con 15% en moles y 10% en moles del grado de esterificación exhiben una descarga instantánea mínima y exhiben liberación sostenida mostrando 50% liberado en 6 días.

Ejemplo 4

El siguiente ejemplo muestra la preparación de un gel de éster etílico de alginato (GE = 15% en moles) que contiene fármaco proteínico (Zn-leptina) y la liberación sostenida in vitro desde este gel.

A una solución de éster etílico de alginato al 4% (p/v) (15% en moles, 0,75 ml) se añade Tris-HCl 1M, pH 8,0 (7,5 \mul), PIPES 0,5M, pH 6,8 (33 \mul) y ZnCl_{2} 0,1M (8,5 \mul). La mezcla se agita bien. Se añade a esta solución suspensión de Zn-leptina (100 mg/ml, 675 \mul) y la mezcla se agita a fondo. Una suspensión de CaCO_{3} 1M (24 \mul) y una solución de d-glucunolactona 1,68M (70 \mul) se agitan a continuación a fondo en esta mezcla. La mezcla final (0,1 ml) se cuela sobre el interior de un tubo de Eppendorf y se deja gelificar durante la noche a 4ºC. Después del almacenamiento durante la noche, se efectúa la liberación in vitro en tampón de histidina 10 mM, pH 7,4. El gel de éster etílico de alginato colado con un grado de esterificación de 15% en moles exhibe poca descarga instantánea y una liberación de leptina sostenida que muestra 65% liberado en 4 días.

Ejemplo 5

El siguiente ejemplo muestra la preparación de un gel de éster etílico de alginato (GE = 30% en moles) que contiene fármaco proteínico (GCSF) y la liberación sostenida in vitro desde este gel.

A una solución de éster etílico de alginato al 2,39% (30% en moles, 0,50 ml) se añade tampón de acetato 0,1M (pH 4,5, 100 \mul), GCSF (104 \mul, 48,2 mg/ml, HCl, pH 3) y agua destilada (246 ml). La mezcla se agita bien. Una suspensión de CaHPO_{4} 1M (10 \mul) y una solución de \delta-glucurolactona 1,68M (40 \mul) se agitan a fondo en esta mezcla. La mezcla final (0,2 ml) se cuela sobre el interior de un tubo de Eppendorf y se deja gelificar durante la noche a 4ºC. Después del almacenamiento del gel durante la noche se efectúa la liberación in vitro en tampón de Tris 10 mM, pH 7,5. Este gel de éster etílico de alginato colado con un grado de esterificación de 30% en moles exhibe menos de 5% de descarga instantánea y liberación sostenida, mostrando 20% liberado en 1 día y 40% liberado en 2 días.

Ejemplo 6

El siguiente ejemplo muestra la preparación de un gel de éster bencílico de alginato (GE = 30% en moles) que contiene fármaco proteínico (GCSF) y la liberación sostenida in vitro desde este gel.

Este ejemplo se realiza de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 5, excepto que el éster etílico se reemplaza por el éster bencílico de alginato. El éster de alginato se gelifica dentro del período de almacenamiento nocturno. El gel de éster bencílico de alginato con un grado de esterificación de 30% exhibe menos de 5% de descarga instantánea y liberación sostenida, mostrando 40% liberado en 1 día y 80% liberado en 2 días.

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Ejemplo 7

Este ejemplo muestra la preparación de cuentas de éster etílico de alginato.

Las cuentas de gel se preparan al añadir gota a gota una solución de éster de alginato al 2% en soluciones de cloruro cálcico 100 mM (agua destilada o tampón de Tris-HCl 1M, pH 7,0). Las cuentas formadas se lavan con agua destilada o tampón. Las cuentas se preparan usando un grado de esterificación de 30% ó 50%.

Ejemplo 8

Este ejemplo muestra la preparación de cuentas de éster de alginato que contienen leptina.

Las cuentas se preparan al añadir gota a gota una solución de 25 mg/ml de leptina en éster etílico de alginato al 2% (Tris-HCl, pH 8,7) a una solución de cloruro cálcico 100 mM y cloruro de zinc 25 mM. Las cuentas se preparan usando un grado de esterificación de 30%. Las cuentas demuestran liberación sostenida de leptina in vitro.

Ejemplo 9

Este ejemplo muestra la descomposición (o degradación) de peso molecular de alginatos estéricos en tampones a pH fisiológico neutro.

Los ésteres de alginato (solución al 1%) se disuelven en tampón de fosfato (fosfato sódico 0,1M, pH 6,8) o tampón de Tris 0,1M (pH 7,0) y se incuban a 37ºC. La descomposición de peso molecular se determina al medir la disminución en la viscosidad de la solución (Brookfield, 25ºC) a intervalos de tiempo seleccionados. Se encuentra que el alginato sódico no modificado es relativamente estable ya que su viscosidad disminuía solo 5% en 8 días (tampón de fosfato); sin embargo, con los ésteres etílico y bencílico de ácido algínico (GE = 30%) la viscosidad cae 35% en 8 días en el mismo tampón. La cantidad de degradación de éster de ácido algínico también depende del grado de esterificación, por ejemplo, con el éster etílico de grado de esterificación inferior (GE = 15%), la viscosidad disminuye 25% en 8 días. Así, la descomposición de peso molecular está relacionada directamente con el grado de esterificación.

Ejemplo 10

Este ejemplo muestra la degradación (o desaparición gradual) in vivo de hidrogeles de éster de alginato sin proteína e hidrogeles que contienen proteína.

Los geles de alginato estérico se preparan de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 3, pero la mezcla final se recoge en una jeringa y se deja gelificar en la jeringa a 4ºC durante la noche. A continuación, se inyectan 100 \mul de gel subcutáneamente en el reverso del cuello de ratones (Charles River, hembras de 12 semanas de edad, BDF1, 20 g, 5 ratones por grupo) y la zona se examina quirúrgicamente de forma periódica en diferentes miembros del grupo.

Usando material de éster etílico y bencílico de alginato con GE = 30%, los resultados del estudio de la zona de inyección individual muestran que los hidrogeles de alginato estérico desaparecen en 2 semanas. Usando gel de éster etílico de alginato con GE = 15%, los geles todavía están presentes a los 30 y 61 días, pero con tamaño reducido. Usando material de éster etílico de alginato con GE = 5%, los geles todavía están presentes a los 30 y 61 días con poca reducción en el tamaño. Usando el material de alginato sódico no sustituido, los geles persisten relativamente inalterados hasta el día 61.

La velocidad de desaparición de los geles de alginato estérico es similar con o sin proteínas.

Ejemplo 11

Este ejemplo proporciona datos de pérdida de peso y farmacocinéticos para hidrogeles de éster de alginato que contienen leptina en ratas.

Los geles de éster etílico de alginato se preparan de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 4, pero la mezcla final se recoge en una jeringa y se deja gelificar en la jeringa a 4ºC durante la noche. Se les administra a las ratas una dosis en bolo de 0 mg/kg (control) y 100 mg/kg, y a continuación los niveles en sangre y la pérdida de peso se controlan durante 7 días.

Los resultados muestran: el éster etílico de alginato con GE = 5% en moles exhibe un nivel en sangre estable de \sim2000 ng/ml durante 3 días, a continuación disminuye hasta 2\sim3 ng/ml durante los siguientes 3-4 días; el éster etílico de alginato con GE = 15% en moles exhibe un nivel en sangre estable de \sim2000 ng/ml durante 2 días, a continuación disminuye hasta 2-3 ng/ml en 5 días; el éster etílico de alginato con GE = 30% en moles exhibe un nivel en sangre de \sim2000 ng/ml durante 1 día, que disminuye hasta 2-3 ng/ml en 4 días; el nivel en sangre de suspensión de Zn-leptina tiene un máximo a las 12 h, y a continuación disminuye hasta 1-2 ng/ml en 6 días. Todos los animales exhiben pérdida de peso mostrando que la Zn-leptina es activa. Los resultados también muestran que incorporar Zn-leptina en los geles de éster etílico de alginato (GE = 5% en moles y 15% en moles) casi dobla (factor de 1,8-1,9) el área bajo la curva (ABC) de la Zn-leptina, sugiriendo un doblamiento de la biodisponibilidad; y el uso de gel de éster etílico de alginato (GE = 30% en moles) muestra una biodisponibilidad similar a Zn-leptina, basado en el ABC.

Claims (31)

1. Una composición de gel retardado de liberación sostenida, que comprende:

a)

un polisacárido aniónico biodegradable;

b)

un agente biológicamente activo; y

c)

al menos un ion metálico polivalente unido,

en la que el agente biológicamente activo comprende una proteína y en la que dicho polisacárido aniónico biodegradable es un éster de alginato que está reticulado iónicamente para proporcionar un hidrogel de éster de alginato inyectable, biodegradable y biocompatible.

2. La composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el ion metálico polivalente unido es una mezcla de ion metálico polivalente unido y no unido.

3. El gel retardado de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende además excipientes para estabilizar el agente biológicamente activo o el polisacárido aniónico.

4. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el ion metálico polivalente unido es una sal seleccionada del grupo que consiste en acetatos, fosfatos, lactatos, tartratos, citratos, cloruros, carbonatos o sus hidróxidos.

5. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el ion metálico se selecciona del grupo que consiste en manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, cobre, aluminio o zinc.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el ion metálico es calcio.

7. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición es para mejorar la biodisponibilidad.

8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la proteína consiste en al menos 0,001 mg/ml.

9. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la proteína se selecciona del grupo que consiste en factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias, factores antiobesidad, factores de crecimiento, factores tróficos y factores antiinflamatorios.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la proteína se selecciona del grupo que consiste en leptina, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-Ira, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferones, eritropoyetina, KFG, insulina y sus análogos o derivados.

11. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el agente biológicamente activo es un agente biológicamente activo complejado.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el agente biológicamente activo complejado es una proteína precipitada.

13. La composición de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la proteína precipitada es un precipitado de zinc-leptina.

14. Una jeringa precargada que contiene una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.

15. Una formulación farmacéutica que comprende la composición de gel retardado de liberación sostenida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 en un portador, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

16. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, en donde la formulación está en una jeringa.

17. Un método para producir una composición de gel retardado de liberación sostenida, que comprende las etapas de:

a)

mezclar un agente biológicamente activo y un polisacárido aniónico biodegradable para formar una primera mezcla;

b)

mezclar con dicha primera mezcla al menos un ion metálico polivalente unido para formar una segunda mezcla,

en el que el agente biológicamente activo comprende una proteína y en el que dicho polisacárido aniónico biodegradable es un éster de alginato que está iónicamente reticulado para proporcionar un hidrogel de éster de alginato inyectable, biodegradable y biocompatible.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el ion metálico polivalente unido es una sal seleccionada del grupo que consiste en acetatos, fosfatos, lactatos, citratos, tartratos, cloruros, carbonatos o sus hidróxidos.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en el que el ion metálico se selecciona del grupo que consiste en manganeso, estroncio, hierro, magnesio, calcio, bario, cobre, aluminio o zinc.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el ion metálico es calcio.

21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en factores hematopoyéticos, factores estimulantes de colonias, factores antiobesidad, factores de crecimiento, factores tróficos y factores antiinflamatorios.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la proteína se selecciona del grupo que consiste en leptina, G-CSF, SCF, BDNF, GDNF, NT3, GM-CSF, IL-Ira, IL2, TNF-bp, MGDF, OPG, interferones, eritropoyetina, KFG y sus análogos o derivados.

23. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, en el que el agente biológicamente activo es un agente biológicamente activo complejado.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el agente biológicamente activo complejado es una proteína precipitada.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que la proteína precipitada es un precipitado de zinc-leptina.

26. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, que comprende además la etapa de aislar la composición de gel retardado de liberación sostenida.

27. Una composición de gel retardado de liberación sostenida producida mediante el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 26.

28. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para usar en un método de tratamiento.

29. Uso de una composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente biológicamente activo es leptina presente en la naturaleza, recombinante, sintética o semisintética, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno seleccionado de exceso de peso, diabetes, alto nivel de lípidos en sangre, esclerosis arterial, placa arterial, la reducción o prevención de la formación de piedras vesiculares, masa de tejido magro insuficiente, sensibilidad insuficiente a insulina y apoplejía.

30. Uso de una composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente biológicamente activo es G-CSF presente en la naturaleza, recombinante, sintético o semisintético, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en deficiencias de células hematopoyéticas, infección y neutropenia.

31. Uso de una composición de liberación sostenida de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el agente biológicamente activo es una IL-Ira presente en la en la naturaleza, recombinante, sintética o semisintética, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la inflamación.