PL186626B1

PL186626B1 - Nowe racemiczne i optycznie czynne pochodne estrowe kwasu trans apowinkaminowego, sposób ich wytwarzania i ich zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna i sposób jej wytwarzania

Info

Publication number: PL186626B1
Application number: PL96328170A
Authority: PL
Inventors: Csaba Szantay; Istvan Moldvai; Andras Vedres; Maria Incze; Janos Kreidl; Laszló Czibula; Jenöné Farkas; Juhasz Ida Deutschné; Anikó Gere; Paróczai Margit Pellioniszné; Erzsébet Lapis; Andras Szekeres; Balazs Maria Zajerné; Adam Sarkadi; Ferenc Auth; Béla Kiss; Egon Karpati; Sandor Farkas
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszet
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2004-02-27
Also published as: KR19990076606A; CZ290383B6; CN1205701A; TW366348B; WO1997023481A1; HU214600B; US6093720A; CA2238635A1; CZ196298A3; IL124097A; HU9503736D0; ES2181926T3; DE69623656T2; EP0876367B1; PL328170A1; EP0876367A1; UA61062C2; DE69623656D1; HUT76555A; JP2000502676A

Abstract

1. Nowe racemiczne i optycznie czynne pochodne estrowe kwasu trans apowinkami- nowego o wzorze 1, w którym R oznacza wo- dór lub grupe Z-C=O, w której Z oznacza C1 - 4 alkil, grupe fenylowa, ewentualnie pod- stawiona przez jedna lub wiecej grup ni- trowych, metoksylowych lub atomów chlo- ru, grupe tiofenylowa, pirydylowa lub grupe 14-ebumameninylowa, a n jest liczba calko- wita o wartosci 2, 3 lub 4 oraz ich dopuszczal- ne terapeutycznie sole. Wzór 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe racemiczne i optycznie czynne pochodne estrowe kwasu trans apowinkaminowego, sposób ich wytwarzania i ich zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna i sposób jej wytwarzania.

Związki o strukturze zbliżonej do struktury związków będących przedmiotem wynalazku są znane. W szczególności, estry kwasu trans apowinkaminowego o działaniu przeciwzapalnym, przeciwdrgawkowym, przeciwparkinsonowskim oraz przeciwarteriosklerotycznym zostały ujawnione w węgierskim opisie patentowym nr 187 733.

W odróżnieniu od związków znanych ze stanu techniki, nowe pochodne estrowe kwasu trans apowinkaminowego wykazują znaczące efekty przeciwutleniaczowe, przeciwamnestyczne i przeciwniedokrwieniowe.

Nowe racemiczne i optycznie czynne pochodne estrowe kwasu trans apowinkaminowego, zgodnie z wynalazkiem, są przedstawione za pomocą wzoru 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-Ć=O, w której Z oznacza Ć^alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-ebinmamemny łowią a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4 oraz ich dopuszczalne terapeutycznie sole.

Korzystnie, pochodną stanowi ester 2-(acetoksy)etylowy (3β, 16α) kwasu (-)-trans apowinkaminowego oraz jego dopuszczalne terapeutycznie sole.

Kompozycja farmaceutyczna, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że zawiera jako składnik aktywny związek o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-Ć=O, w której Z oznacza Ć^alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-ebumameninylową, a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4 lub jego dopuszczalną terapeutycznie sól w domieszce z nośnikiem i/lub innymi dodatkami powszechnie używanymi w przemyśle farmaceutycznym. Sposób wytwarzania nowych racemicznych i optycznie czynnych pochodnych estrowych kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-Ć=O, w której Z oznacza Ć^alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną, przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-ebumameninylową, a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4 oraz ich dopuszczalnych terapeutycznie soli, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że racemiczną lub optycznie czynną pochodną estrową kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 2, w którym R, oznacza grupę alkilową Ć_M, poddaje się transestryfikacji w rozpuszczalniku typu glikolu, w obecności katalizatora zasadowego, przy czym, jeśli potrzeba, związek o wzorze 1, w którym R jest wodorem poddaje się acylowaniu, i/lub, jeśli potrzeba, rozdziela się racemiczny związek o wzorze 1, i/lub, jeśli potrzeba, przekształca się związek o wzorze 1 w jego dopuszczalną terapeutycznie sól.

Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że aktywny składnik stanowiący nową racemiczną lub optycznie czynną pochodną estrową kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-Ć=O, w której Z oznacza Ć^alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-ebumameninylową, a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4

186 626 lub jej dopuszczalną terapeutycznie sól miesza się z nośnikiem i/lub innymi dodatkami powszechnie używanymi w przemyśle farmaceutycznym.

Zastosowanie związku o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-C=O, w której Z oznacza C^alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-ebumameninylową a n jest liczbą całkowitą, o wartości 2, 3 lub 4 lub j'ego terapeutycznie dopuszczalnej soli, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że związek ten stosuje się do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej do hamowania peroksydacji lipidów i do ochrony przed lub leczenia niedokrwienia i amnezji oraz leczenia różnych chorób neurodegeneracyjnych takich, jak choroba Alzheimera.

Zastosowanie związku o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-C=O, w której Z oznacza C₁_₄alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-ebumameninylową a n jest liczbą całkowitą, o wartości 2, 3 lub 4 lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się również tym, że związek ten stosuje się do hamowania peroksydacji lipidów i do ochrony przed lub leczenia niedokrwienia i amnezji oraz leczenia różnych chorób neurodegeneracyjnych takich, jak choroba Alzheimera.

Związki będące przedmiotem wynalazku są nowe i posiadają wartościową aktywność biologiczną. W warunkach in vitro wykazują znaczący efekt przeciwutleniaczowy (hamujący peroksydację lipidów). W badaniach w warunkach in vivo wykazują one znaczące działanie przeciwniedokrwieniowe i przeciwamnestyczne.

Przez podawanie aktywnej terapeutycznie ilości związku o wzorze 1 lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli leczy się pacjentów.

Podstawnik Z jako grupa alkilowa C^ może oznaczać grupę nasyconą lub nienasyconą, o prostym lub rozgałęzionym łańcuchu taką, jak np. grupa metylowa, etylowa, n-propylowa, izopropylowa, n-butylowa, sec-butylowa, tert-butylowa, izobutylowa, winylowa, propenylowa i tym podobne. Podstawnik Z jako grupa fenylowa może być podstawiony przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru.

Terapeutycznie dopuszczalnymi solami związków według wzoru 1 według wynalazku mogą być sole addycyjne z kwasami lub sole czwartorzędowe.

Pochodne kwasu apowinkaminowego o wzorze 2, wykorzystywane jako substancje wyjściowe, mogą być wytworzone przez działanie kwasem na odpowiednią pochodną hydroksyiminooktahydroindolo[2,3a]chinolizynową, jak ujawniono w opisie patentowym GB 2 124 214.

Jak już wspomniano, nowe pochodne estrowe kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 1, w którym podstawniki R i n mają znaczenia wcześniej podane, oraz ich dopuszczalne terapeutycznie sole, mogą być wytworzone przez transestryfikację racemicznej lub optycznie czynnej pochodnej estrowej kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 2, w którym R, oznacza grupę alkilową C_M, w odpowiednim glikolu, w obecności zasadowego katalizatora, przy czym, jeśli potrzeba, acylowanie tak otrzymanego związku o wzorze 1, w którym R jest wodorem, i/lub, jeśli potrzeba, rozdział racemicznego związku o wzorze 1, i/lub, jeśli potrzeba, przekształcenie związku o wzorze 1 w jego dopuszczalną terapeutycznie sól.

W sposobie według wynalazku, w celu uzyskania związków o wzorze 1, w których R oznacza wodór, związek o wzorze 2 poddaje się transestryfikacji. Reakcję tę prowadzi się w nadmiarze transestryfikującego alkoholu takiego, jak odpowiedni glikol, korzystnie glikol etylenowy, odpowiednio w warunkach bezwodnych, w obecności katalitycznych ilości mocnej zasady. Jako zasady mogą być użyte wodorki metali alkalicznych lub alkoholany metali alkalicznych, stosownie alkoholany trzeciorzędowe, korzystnie np. trzeciorzędowy butanolan potasu. Transestryfikację prowadzi się w zakresie temperatur pomiędzy 80°C a 140°C, korzystnie pomiędzy 110°C a 120°C. Jeśli potrzeba, produkt uzyskany po przeprowadzeniu reakcji jest stosowany w następnym etapie reakcji bez wyodrębniania, lub, jeśli potrzeba, może być

186 626 odzyskany w sposób taki, że mieszaninę reakcyjną wlewa się do wody i po filtracji, jeśli potrzeba, precypitat jest oczyszczany przez rekrystalizację, lub, po rozpuszczeniu w wodzie, mieszanina reakcyjna jest ekstrahowana obojętnym, niemie-szającym się z wodą rozpuszczalnikiem organicznym takim, jak dichlorometan, następnie produkt wyodrębnia się przez odparowanie lub wytworzenie soli. Związki o wzorze 1, w których R jest wodorem mogą być przekształcone przez acylowanie w związki o wzorze 1, w których R oznacza grupę Z-C=O.

Reakcję acylowania można przeprowadzić stosując dowolny organiczny kwas karboksylowy zawierający odpowiednią grupę acylową, lub przez użycie jego reaktywnej pochodnej takiej, jak np. halogenek acylu, korzystnie chlorek acylu lub bezwodnik kwasowy lub podobny, w znany sposób, jeśli potrzeba, w obecności czynnika wiążącego kwas.

Podczas prowadzenia acylowania odpowiednim kwasem karboksylowym, reakcję prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku organicznym, np. w dipolowym rozpuszczalniku aprotonowym takim, jak dimetyloformamid (DMF), dimetylosulfotlenek (DMSO), acetonitryl lub podobne, w obecności czynnika kondensującego. Użytecznymi czynnikami kondensującymi są np. pochodne karbodiimidowe takie, jak dicykloheksylokarbodiimid lub karbonylodiimidazol. Reakcję prowadzi się w temperaturze od 0°C do 40°C, korzystnie w temperaturze pokojowej.

Jeżeli acylowanie prowadzi się przy użyciu halogenku acylu, korzystnie chlorku acylu, reakcję prowadzi się w obojętnym rozpuszczalniku organicznym takim, jak eter alifatyczny lub cykliczny np. eter dietylowy lub tetrahydrofuran (THF), lub w chlorowanym węglowodorze np. chloroformie, lub w węglowodorze aromatycznym np. benzenie, chlorobenzenie lub toluenie, lub w zasadzie organicznej np. pirydynie, korzystnie w obecności czynnika wiążącego kwas. Zasady organiczne, np. pirydyna, stosowane w reakcji mogąjednocześnie grać rolę rozpuszczalnika i czynnika wiążącego kwas.

Związki o wzorze 1, w których R oznacza grupę Z-C=O mogą być odzyskane z rozpuszczalnika w sposób taki, że po usunięciu rozpuszczalnika lub, jeśli potrzeba, nadmiaru odczynnika i czynnika wiążącego kwas, uzyskany osad rozpuszcza się w mieszaninie wody i niemieszającego się z wodą rozpuszczalnika takiego, jak octan etylu, chloroform, dichlorometan, benzen, eter dietylowy i im podobne, następnie, jeśli potrzeba, pH mieszaniny doprowadza się do lekko zasadowego (pH 8 do 9) dodając wodnego roztworu wodorotlenku amonu lub wodnego roztworu wodorowęglanu metalu alkalicznego i rozdziela fazy. Fazę organiczną przemywa się wodą, suszy i usuwa rozpuszczalnik pod obniżonym ciśnieniem w celu uzyskania pożądanego związku.

Jeśli potrzeba, związki o wzorze 1 będące przedmiotem wynalazku mogą być przekształcone w sole czwartorzędowe. Nieco ponad równomolarną ilość halogenku alkilu, korzystnie chlorku, bromku jodku lub siarczanu alkilu jest korzystnie stosowana do wytworzenia soli czwartorzędowej. Reakcję tę można przeprowadzić w obojętnym, organicznym, dipolowym rozpuszczalniku aprotonowym.

Jeśli potrzeba, związki o wzorze 1 według wynalazku mogą być przekształcone w ich sole addycyjne z kwasami w znany sposób przy użyciu jakiegokolwiek kwasu przydatnego do wytworzenia terapeutycznie dopuszczalnych soli addycji kwasu. Jeśli potrzeba, związki o wzorze 1 wytworzone sposobem według wynalazku lub ich sole mogą być poddane dodatkowym działaniom oczyszczającym, np. rekrystalizacji. Zakres rozpuszczalników przydatnych do rekrystalizacji zależy od rozpuszczalności i właściwości krystalizacyjnych związków, które mają być rekrystalizowane.

Nowe pochodne estrowe kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 1, będące przedmiotem wynalazku, mogą być racemiczne lub czynne optycznie. Używając czynnych optycznie związków o wzorze 2 jako substancji wyjściowych uzyskuje się optycznie czynne związki o wzorze 1, podczas gdy racemiczne związki o wzorze 2, zastosowane jako substancje wyjściowe, dają w rezultacie’ racemiczne związki o wzorze 1. Z racematów o wzorze 1 można uzyskać czynne optycznie związki rozdzielając je w sposób znany per se.

186 626

Nowe racemiczne lub czynne optycznie pochodne estrowe kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 1 lub ich sole mogą być przekształcone w kompozycje farmaceutyczne przez zmieszanie ich z nietoksycznymi, obojętnymi stałymi lub ciekłymi nośnikami i/lub innymi środkami wspomagającymi, powszechnie stosowanymi w terapii do podawania pozajelitowego lub doustnego. Przydatnymi nośnikami są np. woda, żelatyna, laktoza, skrobia, pektyna, stearynian magnezu, kwas stearynowy, talk, oleje roślinne takie, jak olej z orzeszków ziemnych, olej z oliwek i im podobne. Składnik aktywny może zostać sformułowany w dowolnej, zwykłej kompozycji farmaceutycznej, szczególnie kompozycji stałej np. tabletce, drażetce, kapsułce, czopku i tym podobnych. Ilość nośnika stałego może zmieniać się w szerokim zakresie, korzystnie wynosi pomiędzy 25 mg a 1 g. Ewentualnie, kompozycje mogą zawierać również powszechnie stosowane, inne środki wspomagające, np. stabilizatory, związki konserwujące, czynniki zwilżające, czynniki powierzchniowo czynne, emulgatory i im podobne. Kompozycje mogą być przygotowane w znany sposób, przy użyciu dowolnej, zwykłej technologii farmaceutycznej i, jeśli potrzeba, mogą być poddane innym zwykłym działaniom np. sterylizacji.

Jak już wspomniano wcześniej, związki będące przedmiotem wynalazku wykazują znaczący efekt przeciwutleniaczowy. Ze względu na ich efekt hamujący peroksydację lipidów, związki przeciwutleniaczowe zapewniają ochronę przed uszkodzeniami wywołanymi przez wolne rodniki w warunkach niedokrwienia. Tak więc przeciwutleniacze jako związki przeciwniedokrwieniowe mogą być przydatne w leczeniu poniższych obrazów patologicznych.

Ciągłe zachowanie krążenia krwi jest wymagane dla normalnego funkcjonowania centralnego układu nerwowego (CNS), gdyż zapewnia odpowiednie zaspokojenie wyjątkowego zapotrzebowania tkanki mózgowej na glukozę i tlen.

Na skutek niedokrwienia i reperfuzji funkcje poznawcze są uszkodzone: dojść może zarówno do odwracalnych, jak i nieodwracalnych zmian, zależnie od nasilenia i czasu trwania niedokrwienia. Uszkodzenia struktury i funkcji błon komórek nerwowych mogą doprowadzić do śmierci neuronu.

Kilka patologicznych procesów takich, jak tworzenie się wolnych rodników może wystąpić w konsekwencji niedokrwienia. Tworzenie się wolnych rodników prowadzi do utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych (peroksydacja lipidów), które są ważnymi składnikami błon. Jest to proces niszczący komórki zmieniający lub uszkadzający biomolekuły. Funkcje różnych poziomów komórek, narządów lub całego organizmu mogą zatem zostać uszkodzone.

Reakcje wolnorodnikowe prawdopodobnie odgrywają rolę przyczynową w patogenezie kilku zaindukowanych przez niedokrwienie uszkodzeń takich, jak niedokrwieniowe choroby jelitowe, niedokrwienie mięśnia sercowego, szok krwotoczny, zakłócenia funkcji mózgowo naczyniowych, którym towarzyszy niedokrwienie, niedokrwieniowe uszkodzenie wątroby, niedokrwienie nerek i tym podobne.

Testy in vitro dla zbadania efektu przeciwutleniaczowego

Efekt przeciwutleniaczowy badano przy użyciu dwóch metod.

I. Wpływ na zaindukowaną przez NADPH peroksydację lipidów w mikrosomach mózgu

J. M. Braughler et al.: Novel 21-Amino Steroids as Potent inhibitors of Iron-dependent Lipid Peroxydation [J. Biol. Chem. 262. 10438-10440 (1987)].

T. J. Player and A. A. Horton: Enzyme Lipid Peroxydation in the Microsomal Fraction of Rat Brain [J. Neurochem. 37 422-426 (1981)].

Do przygotowania mikrosomów użyto samców szczura rasy Hannover-Wistar o wadze ciała 150-250 g. Po dekapitacji wypreparowano cały mózg i zhomogenizowano w dziesięciokrotnej objętości lodowatego 0,25 M roztworu sacharozy. Homogenat odwirowano w aparacie Hitachi CR 26H przy 15000 g w 4°C przez 10 minut, następnie supernatant zebrano i odwirowano w aparacie Hitachi SCP 85H przy 78000 g w 4°C przez 60 minut. Po zawieszeniu precypitatu w 0,15 M roztworze KCl wyznaczono zawartość białka w otrzymanym roztworze,

186 626 a następnie doprowadzono do stężenia 10 mg/ml. Tak uzyskane mikrosomy zamrożono w mieszaninie suchego lodu z acetonem i przechowywano w -70°C do czasu użycia. Składnikami mieszaniny inkubacyjnej były: 50 mM TRISHCl (pH 6,8), 0,2 mM FeCl₃, 1 mM KH₂PO₄, 0,5 mM ADP, 0,2 mg mikrosomów oraz testowany związek. Inkubację prowadzono w końcowej objętości 1 ml przy czasie inkubacji 20 minut w temperaturze 37°C. Peroksydację lipidów indukowano dodając 0,4 mM NADPH (ślepe próby nie zawierały NADPH). Reakcję zatrzymywano dodając 0,375 ml roztworu zatrzymającego zawierającego 40% kwas trójchlorooctowy oraz 5 M HCl w stosunku 2:1,

Wytwarzanie malonodialdehydu oznaczano przy użyciu kwasu tiobarbiturowego. Po zatrzymaniu reakcji do próbek dodawano po 1 ml 1% roztworu kwasu tiobarbiturowego, które następnie umieszczano w łaźni wodnej o około 100°C na 10 minut. Następnie próbki wirowano przy 2000 g w aparacie Janetzki K70 w 4°C przez 10 minut. Wartości absorbancji zabarwionego supematantu mierzono przy 535 nm w spektrofotometrze Hitachi 150-20. Jako związku 'odniesienia używano bis(dietyloacetalu) malonodialdehydu.

2. Wpływ na zaindukowaną przez Fe²⁺ peroksydację lipidów w homogenacie mózgu

Po zdekapitowaniu szczurów rasy Hannover-Wistar ważących po 150-220 g, cały mózg zhomogenizowano w 9 objętościach lodowatego buforu Krebsa-Ringera zawierającego 15 mM HEPES, (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynyletanosulfonowy) (pH 7,4), 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 1,5 mM CaCl₂, 0,7 mM MgClj, 1,4 mM KH₂PO4 oraz 10 mM glukozę. Następnie wyznaczono zawartość białka w roztworze i doprowadzono do stężenia 10 mg/ml.

Po dodaniu czynnika testowanego hamującego w objętości 5 pl do 200 pl homogenatu mieszaninę inkubacyjną inkubowano w 37°C przez 20 minut. Indukowaną przez Fe2+ peroksydację lipidów uzyskano dodając 5 pl 8 mM roztworu Fe₂(NH4)₂(S(04)2. Po upłynięciu czasu inkubacji reakcję zatrzymywano dodając 1 ml roztwory zatrzymującego zawierającego 0,8 M HCl i 12,5% kwas trój chlorooctowy, a następnie próbki odwirowywano przy 2000 g w aparacie Janetzki K70 w 4°C przez 10 minut.

Do 0,5 ml porcji supematantu dodawano 1 ml 1% roztworu kwasu tiobarbiturowego, następnie umieszczano próbki w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 20 minut. Intensywność uzyskanego koloru wyznaczano przy 535 nm w spektrofotometrze Hitachi 150-20 przy użyciu bis(dietyloacetalu) malondialdehydu jako związku odniesienia.

Na podstawie korelacji stężenie/efekt testowanych związków wyznaczono wartości IC₅₀; wyniki te przedstawiono w tabeli 1 dla obydwu metod.

Tabela 1

Związek Nr	Przykład Nr	AEI(IC₅₀ pM)	ANI(IC50 pM)
1	2	3	4
2705279	2	6,3	4,8
1010885	1	9,7	15,5
1010962	8	7,5	5,7
1010960	6	7,4	5,7
1010961	7	5,9	5,3
1011005	9	10,3	11,9
2705283	3	11,2	6,8
2705284	4	20,4	6,8
1011008	10	6,0	21,2
1010887	13	12,6	7,2
1010886	18	7,6	7,7
1011038	16	8,4	8,7

186 626 ciąg dalszy tabeli 1

1	2	3	4
1011036	14	7,7	9,3
1011037	13	3,2	11,4
1011047	17	5,9	16,1
Idebenon	1,2	18,9
Witamina E	406,3	12,1
Silimaryna	191,0	54,9

Na podstawie danych z tabeli 1 można zobaczyć, że każdy z badanych związków według wynalazku wywierał działanie przeciwutleniaczowe (hamujące peroksydację lipidów). Efekt przeciwutleniaczowy zbadano zarówno w teście enzymatycznej (indukowanej przez NADPH, AEI) oraz nieenzymatycznej (indukowanej przez Fe²⁺, ANI) peroksydacji lipidów. Poziom aktywności przeciwutleniaczowej związków scharakteryzowano przez ich wartości IC50 Jako związków odniesienia użyto aktywnego w ochronie mózgu idebenonu, rodzimego przeciwutleniacza witaminy E (DL-α-tokoferol) oraz chroniącej wątrobę silimaryny.

Jak wynika z danych w tabeli 1, testowane związki wykazały znacznie wyższą aktywność w hamowaniu indukowanej przez NADPH (enzymatycznie) peroksydacji lipidów niż związki odniesienia, jak pokazują to ich wartości IC50 znacznie niższe niż wartości DL-α-tokoferolu czy silimaryny. Spośród związków, które okazały się bardzo efektywne, efekt przeciwutleniaczowy związków nr nr 2705279, 1010961, 1011008, 1011037 i 1011047 był porównywalny z efektem idebenonu. Związki nr nr 1010885, 1010962, 1010960, 1011005, 1010887, 1010886, 1011038, 1011036 i 2705283 hamują indukowaną przez NADPH peroksydację lipidów około dwudziestokrotnie silniej niż silimaryna.

Przeważająca większość związków wymienionych w tabeli 1 wykazała znacznie silniejszy efekt hamujący indukowaną przez Fe2+ (nieenzymatycznie) peroksydację lipidów niż związki odniesienia. Związki o numerach 2705279, 2705283, 2705284, 1010962, 1010960, 1010961, 1010887, 1010886, 1011038 i 1011036 okazały się być szczególnie aktywne, gdyż każdy z nich był około dwukrotnie aktywniejszy od idebenonu czy DL-α-tokoferolu. Związki o numerach 1011005 i 1011037 wykazują efekt podobny do efektu DL-a-tokoferolu. Związki o numerach 1010885 i 1011047 hamują indukowaną przez jon Fe2+ peroksydację lipidów silniej niż idebenon. Aktywność przeciwutleniaczowa związku nr 1011008 również przewyższyła aktywność silimaryny.

Na podstawie porównania danych uzyskanych w obu testach in vitro można stwierdzić, że związki o numerach 2705279, 1010962, 1010960, 1010961, 1010886, 1011038 i 1011036 bardzo znacząco hamują peroksydację lipidów indukowaną w różny sposób (przez jony Fe2+ lub NADPH), a mianowicie wartości IC₅₀ tych związków okazały się być niższe od 50 μΜ. Ponieważ żaden ze związków odniesienia nie mógł wywierać takiego wpływu w obu testach (konkretnie, hamowały peroksydację lipidów indukowaną przez NADPH lub jony Fe2+ w różnym stopniu), związki według wynalazku mogą być uważane za bardziej efektywne od związków odniesienia.

Każdy z badanych związków posiada znaczącą efektywność przeciwutleniaczową, gdyż są one w stanie hamować peroksydację lipidów wywołaną przez wolne rodniki powstałe w reakcji Fentona (katalizowanej przez Fe2+) lub podczas działania enzymu reduktazy NADPH-cytochrom c.

186 626

Skróty:
NADPH:	fofforan dinuklootydu nikotnnoMiiidaadeninoweoo, forma zredukowana
TRIS:	tris(hydfoksymełylornminomeran
ADP:	adenozyno-5'-difofforan
Idebenon:	6( 110-hydfoksydecyfo--2,3-dmletoksy-5-metylo-1,4-benzochinon
DL-α-tokoferol:	2,5,7,8-tetrametylo-2-(4’,8’,12’-trimetylotridecylo)-6-chromanol
kwas elagowy:	2,3,7,8-tetrahydroksylo[ 1 ]benzopirrao[5,4,3cde[ 1 ]beazopirrao-5,10-dion
Silimaryna:	sllibmma + ΒΐΗάάΐΜΐηϋ + εΠϊοΙιηβώΉ
AEI:	test enzymatycznie przzez NADPH) pefoksydaci i lipidów
ANI:	test indukowane) nieenzyrnatycznie (przez Fe²⁺) pefokłydaei i lipidów

Testy in vitro używane do badania efektów przeciwniedokrwieniowych i przeciwamnestycznych

1. Efekt przeciwniedokrwieniowy (w modelu obustronnego podwiązania tętnicy)

N. Himori i wsp.,: Ćerebral ischemia model with conscious mice involvement of NMDA receptor activation and derangement of learning and memory ability [J. Pharmacol. Meth. 23. 311-327(1990)]

Tętnice szyjne myszy (ważących od 30 do 32 g każda) odsłonięto obustronnie pod znieczuleniem przez 450 mg/kg dootrzewnowo (i.p.) wodzianu chloralu. Nerwy współczulny i błędny oddzielono i umieszczono obustronnie pod tętnicą szyjną luźne podwiązanie. Oba końce podwiązania wyprowadzono z tyłu za uszami. Następnego dnia, w stanie świadomym oba końce podwiązania ściągnięto, powodując zatrzymanie dopływu krwi przez tętnice szyjne. Utrzymano to przez 5 minut, po czym poluzowano, by zapewnić reperfuzję. Liczbę zwierząt padłych podczas okresu pięciu minut oraz w ciągu następnych 24 godzin zarejestrowano. Obliczenie znaczenia przeprowadzono przy użyciu testu chi². Uprzednie podanie związku przeprowadzono dootrzewnowe (i.p.) 30 minut przed podwiązaniem.

Efekty na śmiertelność indukowaną przez obustronne podwiązanie tętnicy dawek 2 mg/kg i.p. związków przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Związek nr	Przykład nr	Śmiertelność w %
l	2	3
2705279	2	10
1010885	1	60
1010960	6	20
1010961	7	60
1010962	8	40
1011005	9	70
1010887	13	30
1010886	13	30
1011036	14	50
1011037	15	50
1011038	16	60

186 626 ciąg dalszy tabeli 2

1	2	3
1011047	17	50
Idebenon	40
Witamina E	70
Kontrola	70

Wartości ED₅₀ związków odniesienia oraz najbardziej efektywnych związków podanych i.p. przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Związek	ED50 i. p. (mg/kg)
Idebenon	4,50 (0,96-9,38)
Witamina E	17,80 (8,46-41,8)
2705279	0,76 (0,2-1,27)

Aktywność biologicczią zin vivo związków wykazujących znaczący efekt przeciwutleniaczowy (IC50 <10 μΜ) w warunkach in vitro zbadano w modelu niedokrwienia mózgowego indukowanego przez obustronne podwiązanie tętnicy. Przejściowe dramatyczne zmniejszenie dopływu krwi do mózgu, a następnie początek reperfuzji po zaprzestaniu podwiązania prowadzi do powstania wyjątkowo toksycznych wolnych rodników tlenowych (rodnik nadtlenkowy, nadtlenek wodoru). Związki posiadające właściwości przeciwutleniaczowe są bardzo efektywne w ochronie przed toksycznymi efektami uwolnionych rodników. Pięciominutowe obustronne podwiązanie tętnicy szyjnej powoduje 70% śmiertelność. Dawki dwu mg/kg i.p. najbardziej aktywnych związków według wynalazku (2705279, 1010960, 1010886,) zmniejsza tę śmiertelność do 10-30%, podczas gdy znane przeciwutleniacze takie, jak idebenon czy witamina E użyte jako związki odniesienia są mniej aktywne w tej samej dawce. Znakomita aktywność związku nr 2705279, który okazał się najbardziej aktywny, jest jeszcze bardziej uderzająca, gdy porówna się wartości ED5₀ związków. [ED5₀ jest to dawka (w mg/kg) zmniejszająca śmiertelność o 50% w porównaniu z nietraktowaną grupą kontrolną]. Wartość ED5₀i.p. idebenonu wynosi 4,5 mg/kg, podczas gdy wartość ta wynosi 0,75 mg/kg i.p. dla związku nr 2705279. Efekt przeciwniedokrwieniowy tego związku można zmierzyć również po podaniu doustnym. W innych doświadczeniach wykazano, że związek ten jest aktywny nie tylko w modelu ogólnego niedokrwienia obejmującego całość substancji mózgowej, lecz również w tak zwanych modelach niedokrwienia zogniskowanego, wywołanego w jednym dobrze określonym obszarze mózgu.

Działanie przeciwamnestyczne związków według wynalazku potwierdzono w następującym doświadczeniu.

2. Indukowana przez diazepam amnezja wstępująca

C. L. Broekkamp i wsp.: The comparative effects of benzodiazepines, progabide and PK 9084 on acquisition of passive avoidance in mice [Psychopharmacology (Berlin) 83, 122-125 (1984)]

Test pamięci przeprowadzono na myszach NMRI ważących 25 do 28 g każda przy użyciu biernego unikania, metody opartej na zdeterminowanym genetycznie nocolubnym zachowaniu gryzoni. Podczas okresu uczenia się, uprzednio wyselekcjonowane zwierzęta (myszy wchodzące do ciemnego pomieszczenia z oświetlonego pomieszczenia w ciągu 30 sekund) umieszczono w oświetlonym pomieszczeniu. Po wejściu do ciemnego pomieszczenia zwierzę otrzymywało wstrząs elektryczny (1 mA przez 3 minuty) na podeszwy stóp w ciągu 30 sekund,

186 626 następnie rejestrowano czas przed wejściem do ciemnego pomieszczenia (okres latencji). Po 24 godzinach zwierzęta ponownie umieszczano w oświetlonym pomieszczeniu i mierzono czas przed przejściem do ciemnego pomieszczenia (czas retencji = T, z limitem czasu wynoszącym 300 sekund). W celu wywołania amnezji wstępującej zwierzęta traktowano dootrzewnowo 3 mg/kg diazepamu 30 minut przed uczeniem. Związki podawano doustnie w dawkach 0,1 lub 10 mg/kg odpowiednio, godzinę przed uczeniem. Wartość procentową efektu ochronnego (P%) obliczano przy użyciu następującego wzoru i przedstawiono w tabeli 4.

P%

T -T _OWtcwany +DA placebo e DOI

DAOO

T - T placebo c oOceO+DU

Tabela 4

Efekt związków w modelu indukowanej przez diazepam amnezji wstępującej

Związek	Hamowanie indukowanej przez diazepam amnezji w %
Nr	Przykład	0,1 mg/kg p.o.	10,0 mg/kg p.o.
1010885	1	74	65
2705279	2	79	119
1010960	6	0	0
1010961	7	3	15
1010962	8	16	4
1010887	13	50	56
1010886	18	72	44
1011038	16	64	24
1011036	14	23	16
Winpocetyna	0	123

Związki posiadające aktywność przeciwutleniaczową wykazują znaczące działanie ochronne w przypadkach niedokrwienia mózgu [przejściowy atak niedokrwieniowy (TIA), udar], gdzie może dojść do uszkodzenia uczenia się i pamięci obok neurologicznych objawów o różnym nasileniu. Efekt przeciwamnestyczny związków według wynalazku został zbadany w modelu indukowanej przez diazepam amnezji wstępującej przy zastosowaniu w charakterze odniesienia związku winpocetyny, który jest strukturalnie podobny i jest stosowany w praktyce klinicznej. Związki aktywne znaleziono zarówno wśród trans-α-etylowych, jak i trans-P-etylowych pochodnych kwasu apowinkaminowego. Związki o numerach 2705279, 1010886, 1011038 oraz 1010887 okazały się być szczególnie efektywne. Najbardziej aktywną substancją był 2705279 wykazujący znaczący efekt ochronny w obydwu użytych dawkach oraz aktywność znacznie przewyższającą aktywność winpocentyny. Efekt przeciwamnestyczny 2705279 został potwierdzony także w innych modelach amnezji: wykazywał zależne od dawki działanie ochronne w zakresie dawek doustnych pomiędzy 0,1 a 10 mg/kg w modelu indukowanej elektrowstrząsami amnezji zstępującej oraz chronił przeciwko indukowanemu przez niedokrwienie uszkodzeniu pamięci w zakresie dawek doustnych pomiędzy 1 a 10 mg/kg. Jego działanie przeciwamnestyczne mogło również być zmierzone u szczurów.

Podsumowanie

Nowe pochodne kwasu apowinkaminowego według wynalazku posiadają znaczące efekty przeciwutleniaczowe i przeciwamnestyczne. Aktywność przeciwutleniaczowa związku nr 2705279, który okazał się najbardziej efektywny przekracza zarówno in vitro, jak i in vivo

186 626 aktywność idebenonu lub winpocentyny, odpowiednio użytych jako substancje odniesienia, w dodatku do ich efektów przeciwutleniaczowych i przeciwniedokrwieniowych,¹ związki według wynalazku wykazują również efekt przeciwamnestyczny o różnym nasileniu. Związek nr 2705279 jest najaktywniejszy również w tym zakresie.

Dzięki ich efektom przeciwutleniaczowym, przeciwniedokrwieniowym i przeciwamnestycznym, związki według wynalazku są przydatne w leczeniu obrazów patologicznych, w których wolne rodniki odgrywają rolę albo w ostrej fazie choroby, albo w rozwoju późnych następstw. Są to naczyniowo-mózgowy uraz niedokrwieniowy, udar, apopleksja, urazy mózgowe lub rdzeniowe, krwotoki podpajęczynówkowe lub wewnątrzmózgowe, a także różne choroby neurodegeneracyjne takie, jak choroba Alzheimera. Dzięki ich efektowi przeciwniedokrwieniowemu związki mogą być przydatne w leczeniu nie tylko niedokrwieniowego urazu mózgu, lecz także innych narządów takich, jak np. wątroba, serce lub mięśnie.

W powyższych syndromach klinicznych oczekiwane dawki terapeutyczne związków według wynalazku wynoszą pomiędzy 0,1 a 40 mg/kg wagi ciała, podawane raz dziennie lub w kilku podzielonych dawkach, drogą doustną lub pozajelitową.

Następujące przykłady ilustrują rozwiązania według wynalazku.

Przykład 1

Wytworzenie estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego.

Po mieszaniu 15 g (0,045 mola) estru metylowego (3β, 16α ) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 300 ml glikolu etylenowego wo becności 1 g tert-butanolanu potasu w 1'20°C przez 5 godzin, a następnie schłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do temperatury pokojowej, mieszaninę wlewa się do 1 litra lodowatej wody, krystaliczny precypitat jest odfiltrowany, przepłukany dwukrotnie 50 ml wody i wysuszony dając 15,9 g (wydajność 97%) produktu tytułowego o temperaturze topnienia 82-87°C.

[α]_ο ²⁰= -138,7° (c=0,2; chloroform).

Ή-NMR (CDCl₃) δ: 0,65 (3H), t, C^CH^; 0,66-3,2 (14H, m, protony szkieletowe, OH); 3,85 (2H, m, HO-CH₂); 4,43 (2H, m, CH₂-O-C=O); 6,35 (1H, s, H-15); 7,00-7,55 (4H, m, protony aromatyczne).

Analiza:

Obliczenia dla C₂2H₂₆N₂O₃ (masa cząsteczkowa 366,44)

C 72,10 H 7,15 N 7,65

Stwierdzono C 71,89 H7,15 N 7,62

Przykład 2

Wytworzenie monochlorowodorku estru 2-acetoksyetylowego (3 β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego.

Do roztworu zawierającego 3,66 g (0,01 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3 β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 50 ml bezwodnej pirydyny dodaje się kroplami 5 ml (0,052 mola) bezwodnika kwasu octowego, mieszaninę reakcyjną pozostawia się w temperaturze pokojowej przez noc, następnie odparowuje do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Po rozpuszczeniu odparowanego osadu w mieszaninie 100 ml octanu etylu, 30 ml wody i 50 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu rozdziela się fazy. Warstwę organiczną przepłukuje się 3 razy 20 ml wody i suszy nad bezwodnym siarczanem sodu.

Roztwór odparowanego osadu w 30 ml izopropanolu zakwasza się do pH 4 dodając etanolowego roztworu chlorowodoru, pozostawia w lodówce przez noc, następnie krystaliczny precypitat jest filtrowany i wysuszony, dając 2,8 g (68%) produktu tytułowego o temperaturze topnienia 179-189°C.

[α ]d²0= -118,9° (c=0,2; metanol).

Ή-NMR (CDCL·) δ: 0,75 (3H, t, CH3CH2); 2,1 (3H, s, CH₃CO); 4,28 (1H, s, H-3); 6,28 (1H, s, H-15); 4,30-4,70 (4H, m, -OCH2CH2CH2O-); 7,05-7,60 (4H, m, protony aromatyczne).

186 626

Przykład 3

Wytworzenie monochlorowodorku estru 2-(2-tiofenoilooksy)etylowego (3 β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego

Do roztworu przygotowanego w temperaturze pokojowej z 3,66 g (0,01 mola) estru

2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 20 ml bezwodnej pirydyny wkrapla się 4,8 ml (0,045 mola) chlorku kwasu tiofeno-2-karboksylowego, mieszaninę reakcyjną pozostawia na 24 godziny, a następnie odparowuje do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Po dodaniu 100 ml dichlorometanu i 20 ml wody do odparowanego osadu, pH doprowadza się do 9 dodając 20 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu. Po rozdzieleniu faz, faza organiczna jest płukana wodą i suszona nad bezwodnym siarczanem sodu. Po filtrowaniu roztwór jest odparowany do sucha pod obniżonym ciśnieniem, osad rozpuszcza się w 50 ml izopropanolu i doprowadza pH do 4 dodając etanolowy roztwór chlorowodoru. Po odstawieniu do lodówki na noc roztwór jest filtrowany, a krystaliczny precypitat jest płukany zimnym izopropanolem dając 2,9 g produktu tytułowego (wydajność 57%), t.t.: 178-183°C; [a]_D ²⁰= -113,9° (c=0,2; chloroform).

Przykład 4

Wytworzenie estru 2-(4-nitrobenzylooksy)etylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego

Do roztworu przygotowanego w temperaturze pokojowej z 3,66 g (0,01 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3 β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 20 ml bezwodnej pirydyny dodaje się 4,2 g (0,0225 mola) chlorku 4-nitrobenzoilu i pozostawia reakcję na noc. Po rozcieńczeniu mieszaniny reakcyjnej 150 ml octanu etylu dodaje się 50 ml wody i 3 ml stężonego, wodnego roztworu wodorotlenku amonu. Fazy rozdziela się, następnie faza organiczna jest płukana 4 razy 25 ml wody i suszona nad bezwodnym siarczanem sodu. Po filtracji roztwór jest odparowywany do sucha pod obniżonym ciśnieniem, oleisty osad rozpuszcza się w 50 ml gorącego izopropanolu, klaruje nad węglem aktywowanym i po filtracji roztwór pozostawia się na kilka godzin. Krystaliczny precypitat jest odfiltrowany, przemyty 10 ml izopropanolu i wysuszony dając 2,6 g (58%) produktu tytułowego, t.t.: 139-142°C; [α]_ο ²⁰= -86,7° (c=0,2; chloroform).

Przykład 5

Wytworzenie dwuchlorowodorku estru 2-(nikotynoilooksy)etylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego

Do roztworu zawierającego 2,4 g (0,0065 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 20 ml bezwodnej pirydyny dodaje się kroplami 2,15 g (0,015 mola) chlorku nikotynoilu rozpuszczonego w 10 ml pirydyny, mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, następnie odparowuje do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Po rozpuszczeniu odparowanego osadu w mieszaninie 150 ml octanu etylu i 50 ml nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu, rozdziela się fazy. Warstwa organiczna jest płukana dwukrotnie 20 ml wody i wysuszona nad bezwodnym siarczanem sodu. Po filtrowaniu roztwór odparowuje się do sucha pod obniżonym ciśnieniem, odparowany osad rozpuszcza w 30 ml izopropanolu i zakwasza roztwór do pH 4 dodając roztworu etanolowego chlorowodoru. Po odparowaniu do sucha pod obniżonym ciśnieniem osad jest krystalizowany z 50 ml octanu etylu dając 1,30 g (36%) związku tytułowego o temperaturze topnienia 158-164°C; [α]_ο2^θ= -69,5° (c=0,2; chloroform).

Analiza:

Obliczona dla wzoru C2₈H2₉N₃O₄2HCl (ciężar cząsteczkowy: 544,47):

C 61,76 H 5,73 N7,71 Cl 13,002/_o

Stwierdzona: C 61,73 H6,05 N7^ d 11,90%

186 626

Przykład 6

Wytworzenie chlorowodorku estru 2-(benzoiloksy)etylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego

Do roztworu zawierającego 4,4 g (0,012 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 60 ml chlorobenzenu dodaje się 1,83 g (0,018 mola) trietyloaminy oraz 2,5 g (0,018 mola) chlorku benzoilu. Mieszaninę miesza się w 40°C przez 30 minut, następnie alkalizuje do pH 8 przez dodanie 15 ml 10% roztworu wodorowęglanu sodu. Po rozdzieleniu fazę organiczną płucze się dwukrotnie 20 ml wody i suszy nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odfiltrowaniu czynnika suszącego i przepłukaniu go dwukrotnie 3 ml chlorobenzenu dodaje się roztworu chlorowodoru w dioksanie do pH 3-4, następnie krystaliczny precypitat jest filtrowany w 0°C, dokładnie roztarty na proszek w zimnym acetonie i odfiltrowany dając 4,8 g (79 %) produktu tytułowego, t.t.: 216-217,5°C; [α]_θ2^θ= -86,6° (c=1; metanol).

Przykład 7

Wytworzenie metanosulfonianu estru 2-(4-chlorobenzoiloksy)etylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego

Po rozpuszczeniu 4,4 g (0,012 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3|3, 16a[ kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 60 ml chlorobenzenu dodaje się 1,83 g (0,018 mola) trietyloaminy oraz 3,15 g (0,018 mola) chlorku 4-chlorobenzoilu i miesza mieszaninę reakcyjną w 40°C przez 30 minut. Po schłodzeniu do 10°C dodaje się 25 ml wody, a pH mieszaniny doprowadza do 8 dodając 15 ml 10 % roztworu wodorowęglanu sodu. Po rozdzieleniu faza organiczna jest przepłukana dwukrotnie 20 ml wody i wysuszona nad bezwodnym siarczanem magnezu: Po odfiltrowaniu czynnika suszącego i dwukrotnym przepłukaniu go 5 ml dichlorometanu, fazę organiczną odparowuje się aż do usunięcia rozpuszczalnika. Osad rozpuszcza się w 35 ml acetonu i zakwasza do pH 4 dodając kwasu metanosulfonowego. Krystaliczny precypitat jest odfiltrowany w 0°C, przepłukaniu zimnym acetonem i wysuszony dając 5,85 g (81%) tytułowej soli, t.t.: 197-199°C; [a]D= -73,3° (c=1; metanol).

Przykład 8

Wytworzenie chlorowodorku estru 2-(propionyloksyetylowego) (3β, 16α[ kwasu /-/-trans apowinkaminowego

Do roztworu zawierającego 4,4 g (0,012 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 100 ml chlorobenzenu dodaje się 5,33 g (0,04 mola) bezwodnika kwasu propionowego oraz 1,4 g (0,14 mola) trietyloaminy. Po mieszaniu mieszaniny reakcyjnej w 80°C przez 4 godziny, dodaje się 40 ml chlorobenzenu i oddestylowuje się nadmiar kwasu propionowego pod obniżonym ciśnieniem. Po dodaniu do osadu w temperaturze pokojowej 25 ml wody pH doprowadza się do 8 dodając 20 ml 10% roztworu wodorowęglanu sodu. Po rozdzieleniu faza organiczna jest dwukrotnie płukana 20 ml wody i wysuszona nad bezwodnym siarczanem magnezu. Czynnik suszący jest następnie odfiltrowany i przepłukany dwukrotnie 3 ml chlorobenzenu. Po odparowaniu fazy organicznej pod obniżonym ciśnieniem do usunięcia rozpuszczalnika, osad rozpuszcza się w 40 ml acetonu i zakwasza do pH 4 dodając dioksanowego roztworu chlorowodoru. Kryształy są odfiltrowane w 5°C, przepłukane acetonem i wysuszone dając w rezultacie 4,2 g (76%) tytułowego chlorowodorku, t.t: 219-220°C; [a]D²0= -111,9° (c=1; metanol).

Przykład 9

Wytworzenie chlorowodorku estru 2-(3,4,5-trimetoksybenzoiloksy)-etylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego.

Do roztworu zawierającego 5,1 g (0,014 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 80 ml dichloroetanu dodaje się 2 g (0,02 mola) trietyloaminy oraz 4,6 g (0,02 mola) chlorku 3,4,5-trimetoksybenzoilu. Mieszaninę miesza się w 50°C przez 1 godzinę, następnie dodaje 50 ml wody o temperaturze pokojowej i alkalizuje mieszaninę do pH 8 dodając 20 ml 10 % roztworu wodorowęglanu sodu. Po rozdzieleniu faza

186 626 organiczna jest płukana dwukrotnie 25 ml wody i wysuszona nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odfiltrowaniu czynnika suszącego i przepłukaniu go dwukrotnie 5 ml dichloroetanu filtrat odparowuje się do sucha pod obniżonym ciśnieniem, osad rozpuszcza się w 25 ml octanu etylu i zakwasza do pH 4 dioksanowym roztworem chlorowodoru. Krystaliczny precypitat jest odfiltrowany w 10°C i przepłukany acetonem dając 6,2 g (76%) tytułowego chlorowodorku, t.t.: 191-194°C; [a]_D ²⁰= -96,2° (c=1; metanol).

Przykład 10

Wytworzenie dwuchlorowodorku estru etylenoglikolowego (3β, 16α) kwasu /-/-bistrans apowinkaminowego

Do roztworu zawierającego 5,1 g (0,014 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 100 ml dichloroetanu dodaje się 6g (0,06 mola) trietyloaminy, po czym, podczas chłodzenia, 7,54 g (0,02 mola) chlorowodorku chlorku kwasu (-)-trans apowinkaminowego, a następnie mieszaninę reakcyjną miesza się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po dodaniu do mieszaniny 50 ml wody i 20 ml 10 % roztworu wodorowęglanu sodu do pH 8 i rozdzieleniu, faza organiczna jest dwukrotnie płukana 25 ml wody, wysuszona nad bezwodnym siarczanem magnezu, odfiltrowana i przepłukana dwukrotnie 5 ml dichloroetanu. Warstwę organiczną odparowuje się do usunięcia rozpuszczalnika. Osad rozpuszcza się w 60 ml acetonu i zakwasza do pH 3,5 dodając chlorowodoru rozpuszczonego w dioksanie. Krystaliczny precypitat jest odfiltrowany i płukany acetonem dając 6,55 g (63%) tytułowego dwuchlorowodorku. t.t.: 222-225°C; [α]θ2^θ= -131,5° (c=1; metanol).

Przykład 11

Wytworzenie metanosulfonianu estru 2-(acetoksy)etylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego.

Do roztworu zawierającego 7,3 g (0,02 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 100 ml dichloroetanu dodaje się 2,2 g (0,022 mola) trietyloaminy i 2,42 g (0,03 mola) chlorku acetylu. Po mieszaniu mieszaniny reakcyjnej w 50°C przez 15 minut, a następnie dodaniu 50 ml wody o temperaturze pokojowej, alkalizuje się ją do pH 8 dodając 20 ml 10 % roztworu wodorowęglanu sodu. Po rozdzieleniu faza organiczna jest dwukrotnie płukana 25 ml dichloroetanu i wysuszona nad bezwodnym siarczanem magnezu. Czynnik suszący jest odfiltrowany, przepłukany dwukrotnie 5 ml dichloroetanu, a filtrat jest odparowany pod zmniejszonym ciśnieniem do usunięcia rozpuszczalnika. Osad rozpuszcza się w 40 ml octanu etylu i zakwasza do pH 3 kwasem metanosulfonowym. Po odfiltrowaniu krystalicznego precypitatu w 0°C, przepłukaniu octanem etylu i wysuszeniu uzyskuje się 7,75 g (77 %) tytułowej soli, t.t.: 130-133°C; )^= -92,2° (c=1; metanol).

Przykład 12

Wytworzenie benzoesulfonianu estru 2-(acetoksy)etylowego (3β, 1<3cx) kwasu /-/-trans apowinkaminowego

Przeprowadzając procedurę opisaną w przykładzie 11 wytwarzanie soli przeprowadza się przy użyciu kwasu benzenosulfonowego zamiast kwasu metylosulfonowego przy wartości pH 3,5. Sól benzenosulfonową uzyskuje się z wydajnością 7,9 g (70%), t.t.: 180,5-183°C; [a]_D20= -90,3° (c=1; metanol).

Przykład 13

Wytworzenie estru 2-hydroksyetylowego (3α, 16β) kwasu (+)-trans apowinkaminowego

Roztwór zawierający 16,88 g (0,05 mola) estru metylowego (3a, 160) kwasu /+/-trans apowinkaminowego w 335 ml glikolu etylenowego miesza się z 1 g tert-butylanu potasu w 120°C przez 5 godzin. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej mieszaninę reakcyjną wlewa się powoli do 1 litra lodowatej wody. Precypitat jest odfiltrowany, przepłukany 3 razy 500 ml wody i wysuszony dając związek tytułowy z wydajnością 17,6 g (96%), t.t.: 85-90°C; [α]_β20= +131,2° (c=1; chloroform).

186 626

Przykład 14

Wytworzenie chlorowodorku estru 2-(benzoiloksy)etylowego (3 α, 16 β) kwasu /-/-trans apowinkaminowego.

Postępując zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 6 używa się 4,4 g (0,12 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /+/-trans apowinkaminowego zamiast estru 2-hydroksyetylowego (3(3, 16a) kwasu /-/-trans apowinkaminowego, by uzyskać 4,7 g (77%) tytułowego chlorowodorku, t.t.: 217-219°C; [a]D°= +84,9° (c=1; metanol).

Przykład 15

Wytworzenie metanosulfonianu estru 2-(4-chlorobenzoiloksy)-etylowego (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego.

Postępuje się zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 7, lecz zamiast 4,4 g (0,012 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego używa się 4,4 g (0,012 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego uzyskując w rezultacie sól tytułową z wydajnością 5,5 g (76%), t.t.: 199-200°C; [α]_β2^θ= +73,3° (c=1; metanol).

Przykład 16

Wytworzenie chlorowodorku estru 2-(propionyloksyetylowego) (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego.

Postępuje się zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 8, lecz używa się 4,4 g (0,012 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego zamiast 4,4 g (0,012 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego, by uzyskać 4,35g (79%) tytułowego chlorowodorku, t.t.: 220-221°C; )ot]_D20= +109,7° (c=1; metanol).

Przykład 17

Wytworzenie chlorowodorku estru 2-(3,4,5-trimetoksybenzoiloksy)etylowego (3α, 16β) kwasu /-/-trans apowinkaminowego.

Postępuje się zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 9, lecz używa się 5,1 g (0,14 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego zamiast 5,1 g (0,14 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego, by uzyskać 6,2 g (76%) tytułowego chlorowodorku, t.t.: 192-195°C; [α^0= +95,3° (c=l; metanol).

Przykład 18

Wytworzenie chlorowodorku estru 2-(acetoksy)etylowego (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego.

Do roztworu zawierającego 7,3 g (0,02 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3α, 16β) kwasu /-/-trans apowinkaminowego w 100 ml dichloroetanu dodaje się 2,2 g (0,022 mola) trietyloaminy i 2,42 g (0,03 mola) chlorku acetylu. Po mieszaniu w 40°C przez 25 minut, a następnie dodaniu 50 ml wody o temperaturze pokojowej, pH doprowadza się do 8 dodając 20 ml 10% roztworu wodorowęglanu sodu. Po rozdzieleniu faza organiczna jest dwukrotnie płukana 25 ml wody i wysuszona nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po odfiltrowaniu czynnik suszący jest przepłukany dwukrotnie 5 ml dichloroetanu, a filtrat jest odparowany pod zmniejszonym ciśnieniem do usunięcia rozpuszczalnika. Osad rozpuszcza się w 40 ml octanu etylu i zakwasza do pH 4 dodając dioksanowego roztworu chlorowodoru. Krystaliczny precypitat jest odfiltrowany w 0°C, przepłukany octanem etylu i wysuszony dając 6,95 g (78%) tytułowego chlorowodorku, t.t.: 221-224,5°C; [a]_D20= +107,4° (c=1; metanol).

Przykład 19

Wytworzenie racemicznego estru 2-hydroksyetylowego kwasu trans apowinkaminowego

Postępuje się zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 13, lecz używa się 16,8 g (0,05 mola) racemicznego estru metylowego kwasu trans apowinkaminowego zamiast 16,8 g

186 626 (0,05 mola) estru metylowego (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego, co daje tytułowy racemiczny chlorowodorek z wydajnością 17,4 g (95%, t.t.: 97-101°C.

Przykład 20

Wytworzenie racemicznego chlorowodorku estru 2-(acetoksy)etylowego kwasu trans apowinkaminowego.

Postępuje się zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 18, lecz używa się 7,3 mola racemicznego estru 2-hydroksyetylowego kwasu trans apowinkaminowego zamiast 7,3 g (0,02 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego, co daje 7,1 g (80%) tytułowego chlorowodorku, t.t.: 187-189°C.

Przykład 21

Wytworzenie estru 3-hydroksypropylowego (3β, 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego.

Postępuje się zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 1, lecz używa się 300 ml glikolu propylenowego zamiast 300 ml glikolu etylenowego. Po wlaniu do wody uzyskany nie mieszający się z wodą olej jest rozpuszczany w 100 ml dichlorometanu i dwukrotnie przepłukany 20 ml wody. Warstwa organiczna jest suszona nad bezwodnym siarczanem magnezu i filtrowana. Czynnik suszący jest dwukrotnie przepłukany 5 ml dichlorometanu i filtrat jest odparowany pod obniżonym ciśnieniem aż do usunięcia rozpuszczalnika. Tytułowy związek jest uzyskiwany z wydajnością 16,8 g w postaci lekko żółtego lepkiego oleju. Sól chlorowodorkowa topnieje w 216-218°C po rekrystalizacji z acetonu; [α]_β20= -122,2° (c=l; metanol).

Przykład 22

Wytworzenie chlorowodorku estru 3-(acetoksy)propylowego (3β , 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego.

Postępuje się zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie 18, lecz używa się 7,6 g (0,02 mola) estru 3-hydroksypropylowegoo (3β , 16α) kwasu /-/-trans apowinkaminowego zamiast 7,3 g (0,02 mola) estru 2-hydroksyetylowego (3α, 16β) kwasu /+/-trans apowinkaminowego, uzyskując tytułowy chlorowodorek z wydajnością 7,0 g (76%), t.t.: 205-207°C; [α]_θ20= -113,2° (c=1; metanol).

186 626

Wzór 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowe racemiczne i optycznie czynne pochodne estrowe kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-C=O, w której Z oznacza C,-₄alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-ebumameninyl^·^^ a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4 oraz ich dopuszczalne terapeutycznie sole.
2. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że stanowi ją ester 2-(acetoksy)etylowy (3β, 16α) kwasu (-)-trans apowinkaminowego oraz jego dopuszczalne terapeutycznie sole.
3. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera jako składnik aktywny związek o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-C=O, w której Z oznacza Cj-₄ alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową piryd^ylt^·^^ lub grupę 14-eburnameninylową, a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4, lub jego dopuszczalną terapeutycznie sól w domieszce z nośnikiem i/lub innymi dodatkami powszechnie używanymi w przemyśle farmaceutycznym.
4. Sposób wytwarzania nowych racemicznych i optycznie czynnych pochodnych estrowych kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę z-C=o, w której Z oznacza C₍-₄alkil, grupę fenylową ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-001^31^™^ tową a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4 oraz ich dopuszczalnych terapeutycznie soli, znamienny tym, że racemiczną lub optycznie czynną pochodną estrową kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 2, w którym R_] oznacza grupę al kilową C 4 poddaje się transestryfikacji w rozpuszczalniku typu glikolu, w obecności katalizatora zasadowego, przy czym, jeśli potrzeba, związek o wzorze 1, w którym R jest wodorem poddaje się acylowaniu, i/lub, jeśli potrzeba, rozdziela się racemiczny związek o wzorze 1, i/lub, jeśli potrzeba, przekształca się związek o wzorze 1 w jego dopuszczalną terapeutycznie sól.
5. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, znamienny tym, że aktywny składnik stanowiący nową racemiczną lub optycznie czynną pochodną estrową kwasu trans apowinkaminowego o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-C=O, w której Z oznacza C^alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową pirydylową lub grupę 14-ebumameninylową a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4 lub jej dopuszczalną terapeutycznie sól miesza się z nośnikiem i/lub innymi dodatkami powszechnie używanymi w przemyśle farmaceutycznym.
6. Zastosowanie związku o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-C=O, w której Z oznacza C^alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4 lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli do wytworzenia kompozycji farmaceutycznej do hamowania peroksydacji lipidów i do ochrony przed lub leczenia niedokrwienia i amnezji oraz leczenia różnych chorób neurodegeneracyjnych takich, jak choroba Alzheimera.

186 626
7. Zastosowanie związku o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub grupę Z-Ć=O, w której Z oznacza Ćj-₄alkil, grupę fenylową, ewentualnie podstawioną przez jedną lub więcej grup nitrowych, metoksylowych lub atomów chloru, grupę tiofenylową, pirydylową lub grupę 14-ebumameninylową, a n jest liczbą całkowitą o wartości 2, 3 lub 4 lub jego terapeutycznie dopuszczalnej soli do hamowania peroksydacji lipidów i do ochrony przed lub leczenia niedokrwienia i amnezji oraz leczenia różnych chorób neurodegeneracyjnych takich, jak choroba Alzheimera.

* * *