PL183461B1

PL183461B1 - Zastosowanie donorów i/lub substratów tlenku azotu lub inhibitorów tlenku azotu dla wytwarzania środka leczniczego dla regulacji rozszerzania lub rozciągliwości szyjki macicy

Info

Publication number: PL183461B1
Application number: PL96322252A
Authority: PL
Inventors: Kristof Chwalisz; Robert E. Garfield
Original assignee: Regents Board Of; Schering Ag
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 2002-06-28
Also published as: PL322252A1; KR100434239B1; IL117496A0; TW421594B; SK124197A3; EP0814785A1; IS4555A; NO974204L; MX9707007A; ID20742A; IL117496A; CN1151781C; CZ285197A3; ZA962089B; ES2297838T3; ATE377417T1; RU2199346C2; CZ292395B6; JPH11502200A; MY116500A

Abstract

1. Zastosowanie donorów i/lub substratów tlenku azotu lub inhibitorów tlenku azotu dla wytwarzania srodka leczniczego dla regulacji rozszerzenia i/lub rozciagliwosci szyjki macicy. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy regulacji rozszerzania lub rozciągliwości szyjki macicy przez użycie donorów i/lub substratów tlenku azotu lub inhibitorów tlenku azotu.

Stan techniki

Poród (wyparcie płodu z macicy), wymaga zarówno skurczenia mięśniówki macicy, mięśnia gładkiego macicy i zmiękczenia tkanki łącznej szyjki macicy, tak, że się ona dostatecznie rozciągnie i rozszerzy umożliwiając wyparcie płodu. To zmiękczenie jest znane jako dojrzewanie. Obecnie korzystny sposób dojrzewania szyjki to użycie prostaglandyny E₂. Stosuje się to jako pochwowy żel lub tabletkę lub jako żel umieszczony w szyjce macicy. Problem dotyczący użycia prostaglandyny E₂ to możliwość nadstymulacji macicy, prowadzącej do nadmiernie silnego skurczenia mięśniówki zanim szyjka jest dojrzała i tym samym nim jest możliwy dogodny lub bezpieczny poród. Idealny preparat zmiękczyłby i wytarłby szyjkę bez powodowania skurczenia mięśniówki. To umożliwiłoby, by następujące po tym skurcze (wywoływane, jeśli jest to niezbędne, małą dawką prostaglandyny) wydobyły dziecko przy minimalnym oporze. Dobrze udowodniono przez doświadczenia ze zwierzętami, że antyprogestyny, takie jak RU486, spełniłyby te żądania, lecz problem polega na tym, że lek jest związany z działaniem antyglukokortykoidowym, które może być szkodliwe dla płodu.

Jednym z najbardziej ostatnio frapujących osiągnięć w biologii i medycynie jest odkrycie, że tlenek azotu jest wytwarzany przez komórki śródbłonkowe i wiąże się z regulacją napięcia naczyniowego, agregacji płytek, neurotransmisją i immunoaktywacją (Furchgott i Zawadzki, 1980; Moncada Palmer i Higgs, 1991; Ignarro, 1991). Tlenek azotu jest ważnym mediatorem relaksacji mięśnia gładkiego (Montada, Palmer i Higgs, 1991) i był uprzednio znany jako EDRF (czynnik relaksujący pochodzenia śródbłonkowego) (Furchgott und Zawadzki 1980; Moncada, Palmer i Higgs, 1991). Tlenek azotu jest syntetyzowany przez utleniające deaminowanie azotu guanidynowego L-argininy przez co najmniej różne izoformy enzymu zawierającego flawin, syntazy tlenku azotu (Montada, Palmer i Higgs, 1991). Tlenek azotu można także wytwarzać przez zastosowanie różnych donorów tlenku azotu takich jak nitroprusydek sodu, nitrogliceryna, trójazotan glicerylu, SIN-1, monoazotan izosorbidu, diazotan izosorbidu etc. Wykazano, że synteza tlenku azotu jest kompetytywnie inhibitowana przez analogi L-argininy; ester metylowy NG-nitro-L-argininy (L-NAME), NG-monoetylo-Largininę (LMMA), N-iminoetylo-L-amitynę (L-NIO), L-monometylo-L-argininę (L-NNMA), L-NG-metylargininę (LNMA), Nw-nitro-L-argininę (L-NA) i aminoguanidynę.

Działanie na nieciężame świnki morskie L-NAME daje w wyniku zwiększoną kurczliwość macicy. Zatem, inhibitowanie kurczliwości macicy stymulowane syntazą tlenku azotu wskazuje, że toniczne uwalnianie tlenku azotu utrzymuje macicę w stanie nieaktywnym. Podobnie, działanie na ciężarne świnki morskie L-NAME wywoływało przedwczesny poród. Z drugiej strony, działanie na paski macicy szczura in vitro L-argininą inhibitowało skurczenia. Badania te pokazują, że wytwarzanie tlenku azotu przez macicę inhibituje kurczliwość macicy, a blokada tej syntezy daje w wyniku zwiększoną kurczliwość mięśnia u ciężarnych i nieciężamych zwierząt. Zatem, substraty lub donory tlenku azotu są przydatne terapeutycznie by zapobiec kurczliwości macicy, a inhibitory tlenku azotu są skuteczne w stymulowaniu skurczenia macicy. W oparciu o wstępne badania stosując małpy rezusy, Jennings i in. (The Journal of Maternal-Fetal Medicine 2:170-175 (1993)) zasugerowali, że tlenek azotu może być ważny w stanie spoczynku macicy podczas ciąży, i egzogenny tlenek azotu może być

183 461 przydatny w kontrolowaniu przedwczesnego porodu. Aktywność syntazy tlenku azotu (NOS) wykazano w wielu strukturach w macicy ciężarnych szczurów przez Natuzzi i in. (Biochem. and Biophys. Res. Commun., 194, No. 1, 1-8, (1993)) i ci autorzy doszli do wniosku, że NOS jest obecny w wielu strukturach macicy ciężarnych szczurów. Obniżenie aktywności NOS przy porodzie sugeruje, że NO może przyczyniać się do utrzymania kurczliwego stanu spoczynkowego macicy podczas ciąży.

Także, badania morfologiczne wykazały już występowanie enzymów metabolizujących NOS (ADPH-diaforaza, histochemiczny sposób wykrywający wszystkie izoformy NOS) i NO, takich jak dysmutaza nadtlenkowa w szyjce (Papka i in., Neuroscience Letters 147 (1992); Shiotani i in., Acta Histochem. Cytochem. 26:57-64 (1993)).

Stwierdzono, że działanie L-NAME s.c. u ciężarnych świnek morskich w dniach 48-49 p.c. (termin 67+3 dni) zaskakująco doprowadziło do obniżenia rozciągliwości szyjki i zmniejszenia rozszerzenia szyjki. U szczurów ciężarnych, stwierdzono zwiększone wytwarzanie tlenku azotu (parametr, uwalnianie azotynu i azotanu in vitró) z szyjki macicy w czasie w porównaniu z 18 dniem ciąży. Natomiast nastąpiło zmniejszenie wytwarzania NO macicy (mięśniówki macicy) w trakcie ciąży szczura. Antyprogestyna onapriston jeszcze zwiększyła wytwarzanie tlenku azotu w szyjce macicy u ciężarnych szczurów, lecz miała inhibitujący wpływ na wytwarzanie NO w macicy (mięśniówce macicy). Działanie tą samą dawką onapristonu wywołało dojrzewanie szyjki u szczurów.

Fakty te wykazują, że:

• działanie inhibitorem tlenku azotu takim jak L-NAMF inhibituje dojrzewanie szyjki lecz stymuluje skurcze macicy u ciężarnych świnek morskich;

• wytwarzanie NO, które ma rozluźniający wpływ na mięśniówkę macicy, obniża się w ciężarnej macicy (mięśniówce macicy) podczas przebiegu ciąży, lecz wzrasta w szyjce macicy podczas porodu normalnego i wywołanego antyprogestyną u szczurów;

• rozbieżne efekty wywierane przez inhibitor tlenku azotu, taki jak L-NAMB, na kurczliwość macicy i szyjki macicy są wynikiem różnych działań układu NO lub obecności różnych izoform enzymów w mięśniówce macicy i szyjce i • układ NO odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu szyjki macicy, przy czym wytwarzanie NO jest zwiększone podczas procesu dojrzewania szyjki.

Zatem stwierdza się, że:

(a) lokalne stosowanie donorów i/lub substratów tlenku azotu może być użyte do wywoływania dojrzewania szyjki lub (b) lokalne stosowanie inhibitora tlenku azotu może być użyte by zapobiec lub inhibitować dojrzewanie szyjki, np. dla leczenia niewydolności szyjkowej (zbyt wczesne dojrzewanie szyjki) lub przedwczesnego porodu.

Zatem niniejszy wynalazek jest ukierunkowany na użycie donorów i/lub substratów tlenku azotu lub inhibitorów tlenku azotu dla wytwarzania środka leczniczego dla regulowania rozszerzenia i/lub rozciągliwości szyjki.

Niniejszy wynalazek pociąga za sobą użycie:

(a) co najmniej jednego donora i/lub substratu tlenku azotu dla wytwarzania środka leczniczego podawanego lokalnie (np. doszyjkowo lub dopochwowo) dla wywołania dojrzewania szyjki lub (b) co najmniej jednego inhibitora tlenku azotu dla wytwarzania środka leczniczego podawanego lokalnie (np. doszyjkowo lub dopochwowo) dla inhibitowania dojrzewania szyjki dla leczenia niewydolności szyjkowej lub przedwczesnego porodu.

Odpowiednie dla celów niniejszego wynalazku jako (a) donor i/lub substrat tlenku azotu lub (b) inhibitor tlenku azotu są wszystkie związki znane biegłym w sztuce jako mające żądane właściwości; korzystne są związki podane w części „Stan techniki”.

Donor i/lub substrat tlenku azotu (a) można ponadto użyć w połączeniu z (i) co najmniej jedną antyprogestyną, prostaglandyną i/lub cytokiną.

Przykładami antyprogestyn są:

onapriston (11β- [4- (dimetylamino) fenylo] -17-a-hydroksy-17p-(3-hydroksypropylo)-13a-estra-4,9-dien-3-on), RU 486 (1 ip-[4-(dimetylamino)fenylo]-17p-hydroksy-17a-(l

183 461

-propinylo)estra-4,9-dien-3 -on), (Z)-11 β- [4-(Dimetylamino)fenylo]-17β-hydroksy-17a-(3 -hydroksy-l-propenylo)estr-4-en-3-on (EP-A 0 404 283), l^-(4-Acetylofenylo)-17^-hydroksy-17a-(l-propinylo)estra-4,9-dien-3-on (EP-A 0 190 759), 4',5'-Dihydro-l 1β-[4- (dimetylamino)-fenylo]-6β-metylospiro[estra-4,9-dien-17β,2'(3Ή)-furan]-3-on, 4',5'-Dihydro-l 1 β-[4-(dimetylamino)fenylo]-7β-metylospiro-[estra-4,9-dieno-17β,2'(3Ή)-furan]-3-on 11β-(4-Acetylfenylo)-19,24-dinor-17,23-epoksy-17a-chola-4,9,20-trien-3-on, (E)-l^-[4-[[(Acetyloksy) imino]metylo]fenylo]-17|3-metoksy-17a-(metoksymetylo)estra-4,9-dien-3-on (Ε)-11β-[4-[[[(Etoksykarbonyl)oksy]imino]metylo]fenylo]-17β-metoksy-17α-(metoksymetylo)estra-4,9-dien-3-on i wiele innych związków o kompetytywnej aktywności antagonistyczne) względem progesteronu które są dobrze znane osobom biegłym.

Jako prostaglandyny można np. użyć sulproston (PGE2) lub gemeprost.

Najważniejszymi przedstawicielami cytokin są interleukin-8 lub interleukin-ΐβ. Wykazów tych nie należy uważać za wyczerpujące.

Inhibitor tlenku azotu (b) można ponadto użyć w połączeniu z (ii) co najmniej jednym inhibitorem cyklooksygenazy i/lub progestyny (np. inhibitory COX-1-i COX-2).

Jako progestyna, korzystny jest naturalnie występujący progesteron lecz jest możliwe też użycie jednej lub więcej licznych syntetycznych progestyn znanych specjalistom dla stosowania w doustnych środkach antykoncepcyjnych, np. levonorgestrel, octan cyproteronu, gestoden, drospirenon, dezogestrel, 3-ketodezogestrel, dienogest itp. Inhibitorem cyklooksygenazy może być np. aspiryna (inhibitor COX-1 i COX-2). Dalsze przykłady inhibitorów COX-2 można uzyskać z: Robert Asianian, Nicholas I. Carrulliers, James S. Kamiński; Cyklooxygenase 2: A Novel Target for Therapeutic Intervention, Exp. Opin. Invest. Drugs, 1994,3 (12), 1323-1325, np. związki Sc-58125 (GD Searle), DuP-697, fluzolid [6-(2,4-difuorofenoksy)-5-metylosulfonylamino-l-indanon], Sc-57666 (GD Searle), L-745 337 (Merck Frosst), NS-398 (Monsanto).

W swoim pierwszym aspekcie (a) wynalazek dostarcza zastosowanie tych związków według wynalazku w związku z urodzeniem lub aborcją. W tej sytuacji ciąży szyjka jest poddana wstępnemu działaniu. Hormony podczas ciąży zmieniają szyjkę, która jest następnie podatna na skuteczną reakcję na inne stymulanty.

Ponadto, wynalazek dostarcza zastosowanie związków (a) wynalazku w związku z procedurą chirurgiczną i procedurą diagnostyczną. Zatem, związki (a) wynalazku mogą ewentualnie w połączeniu ze związkami wymienionymi w (i), być użyte dla wytwarzania środków leczniczych dla następujących wskazań:

(A) wywołanie porodu w terminie (czas zwykłego urodzenia, może być łączone z kolejnym działaniem oksytocyną lub podobnymi środkami), (B) wywołanie porodu w związku z ciążą patologiczną (np. wada rozwojowa płodu); (korzystna aborcja w drugim trymestrze), (C) wywołanie porodu w związku z wewnątrzmaciczną śmiercią płodu, (D) wywołanie aborcji (korzystna aborcja w pierwszym trymestrze), (E) wywołanie przedwczesnego porodu, (F) kierowanie przedłużonym porodem wskutek dystocji szyjkowej, (G) wywołanie dojrzewania szyjki kobiety nieciężamej lub ciężarnej dla wspomagania procedury chirurgicznej lub diagnostycznej, i (H) wywołanie dojrzewania szyjki u kobiety, która ma być poddana zapłodnieniu in vitro.

W swoim drugim aspekcie (b) wynalazek dostarcza zastosowania tych związków wynalazku we wskazaniach, które wymagają zapobiegania zbyt wczesnemu dojrzewaniu szyjki lub gdy szyjka ma być sztywna. Zatem związki (b) niniejszego wynalazku mogą ewentualnie w połączeniu ze związkami wymienionymi w (ii), być użyte dla wytwarzania środków leczniczych dla następujących wskazań:

(I) leczenie niewydolności szyjkowej i (K) leczenie zagrażającego przedwczesnego porodu.

183 461

W zasadzie związek może być użyty w przypadku kobiet jak i samic. Ludzie stanowią korzystną grupę dla tego działania.

Donor i/lub substrat tlenku azotu (a) lub inhibitor tlenku azotu (b) może być podawany dowolną drogą która bezpośrednio lub pośrednio osiągnie szyjkę. Zatem, dogodnie jest stosowany dopochwowo lub bezpośrednio do szyjki, np. w typowym przypadku jako żel lub krem. Może być również wstrzyknięty do tkanki szyjki lub przez tępą igłę do kanału szyjki. Może być również użyty pozaowodniowo, tzn. między ściankę macicy i worek o wodni stosując cewnik.

Korzystną formą jest żel lub krem, lecz może być też zastosowany jako zmiękczalne kapsułki, liposomy lub w formie o powolnym uwalnianiu, łub jako roztwór wodny, np. roztwór soli lub roztwór zawierający proteinę. Formę można uzyskać sposobami znanymi osobom biegłym w sztuce.

Jeśli jest zamierzone łączone zastosowanie związków wymienionych wyżej pod (a) i (i), antyprogestyna może być sformułowana dla podawania układowego lub miejscowego. Prostaglandyna jak też i cytokina będą korzystnie sformułowane dla stosowania lokalnego. Jeśli jest zamierzone łączone zastosowanie związków wymienionych wyżej pod (b) i (ii), związki pod (ii) mogą być sformułowane dla podawania układowego lub miejscowego. Formy związków pod (i) i (ii) można uzyskać sposobami znanymi osobom biegłym w sztuce.

Związki (a) wynalazku wykazują aktywność farmakologiczną wywoływania dojrzewania szyjki i mogą zatem, być przydatne jako środki farmaceutyczne.

Związki (b) wynalazku wykazują aktywność farmakologiczną zapobiegania dojrzewaniu szyjki i mogą zatem, być przydatne jako środki farmaceutyczne. Pomiar dojrzewania szyjki jest opisany w przykładzie 1.

Nitroprusydek sodu i inne donory tlenku azotu wykazują wpływ na dojrzewanie szyjki przy stężeniach od około 0,03 mM - 100 mM (1,8 pg - 6 mg/zastosowanie), gdy są lokalnie podawane ciężarnym samicom świnki morskiej. W przypadku tych wskazań wymienionych uprzednio pod (A) do (F) odpowiednie dawkowanie będzie, oczywiście, różne zależnie np. od: użytych związków wynalazku, gospodarza, sposobu podawania i charakteru i ostrości stanu poddawanego leczeniu. Jednak, zasadniczo okazuje się, że zadowalające wyniki u zwierząt są otrzymywane przy stężeniu od około 0,03 - 100 mM w formie lokalnej, korzystnie przy stężeniu około 10 mM.

Związki wynalazku można podawać 6 do 48 h przed końcowym dojrzewaniem szyjki. Dojrzewanie może następować przez wywołanie porodu związkiem przyspieszającym poród. Związki można podawać w jednej lub więcej dawkach podawanych w serii w odstępie szeregu godzin lub jednego dnia. Związki wynalazku można podawać jakąkolwiek konwencjonalną drogą w szczególności w formie żelu, maści lub lokalnej iniekcji (przy stężeniu około 0,03 do 100 mM).

Nitroprusydek sodu i inne donory tlenku azotu wykazują wpływ na dojrzewanie szyjki przy stężeniach od około 0,03 mM -100 mM (1,8 pg - 6 mmg/zastosowanie), gdy są podawane samicom świnki morskiej które nie są ciężarne. W przypadku tych wskazań wymienionych uprzednio pod (G) do (H) odpowiednie dawkowanie będzie, oczywiście, różne zależnie np. od: użytych związków wynalazku, gospodarza, sposobu podawania i charakteru i ostrości stanu poddawanego leczeniu. Jednak, zasadniczo okazuje się, że zadowalające wyniki u zwierząt są otrzymywane przy stężeniu od około 0,03 - 100 mM (1,8 pg - 6 mmg/zastosowanie), korzystnie przy stężeniu około 10 mM. Te związki wynalazku mogą być podawane 24 lub 48 godzin przed końcowym dojrzewaniem szyjki. Związki można podawać w jednej lub więcej dawkach podawanych w serii w odstępie szeregu godzin lub jednego dnia. Związki wynalazku można podawać jakąkolwiek konwencjonalną drogą, w szczególności w formie żelu, maści lub lokalnej iniekcji.

Przykładowe zakresy dawkowania typowych substratów NO i donorów NO ludziom:

L-Arginina

Nitroprusydek sodu zakres Nitrogliceryna Izosorbidu monoazotan Izosorbidu diazotan

500 mg-10 g/dzień 500-2000 pg/kg/dzień 0,5-10 mg/dzień 10-100 mg/dzień 10-100 mg/dzień.

183 461

Inne donory NO i substraty NO stosuje się w ilościach biorównoważnych. Przykłady zakresów dawkowania typowych inhibitorów NO:

L-NAME L-NIO L-NA L-MMA L-NG L-NMA

1 do 50 mg/kg/dzień 1 do 50 mg/kg/dzień 1 do 50 mg/kg/dzień 1 do 50 mg/kg/dzień 1 do 50 mg/kg/dzień 1 do 50 mg/kg/dzień

Aminoguanidyna 0,1 do 100 mg/kg/dzień.

Inne inhibitory NO stosuje się w ilościach biorównoważnych. Przykłady zakresów dawkowania:

Zakres dawkowania RU 486: 25-600 mg/dzień doustnie. Inne antyprogestyny stosuje się w ilościach biorównoważnych.

Zakres dawkowania sulprostonu: 100-1000 mg/dzień i.m. lub i.v. Inne prostaglandyny takie jak PGE₂ stosuje się w ilościach biorównoważnych.

Prostaglandyny mogą także być użyte lokalnie doszyjkowo w żelu, dopochwowo w żelu lub jako tabletki.

Zakres dawkowania inhibitorów COX-2: 0,1 - 100 mg/kg/dzień.

Zakres dawkowania IL-8: 100 ng - 500 mg/dzień; zakres dawkowania IL-lb: 100 ng 500 mg/dzień.

Biorównoważne ilości innych związków niż wymienione wyżej, można określić metodami ujawnionymi w przykładach jako takie ilości, które prowadzą do porównywalnych efektów w szyjce, jak specyficznie ujawnione ilości w innych analogicznych warunkach.

Wyniki wynalazku są poparte figurami przedstawiającymi co następuje:

Figura 1 przedstawia wpływ nitroprusydku sodu na dojrzewanie szyjki u ciężarnych świnek morskich. Zwierzęta poddano działaniu jak opisano w przykładzie 1. Górny panel przedstawia początkowe rozszerzenie (w mm) podczas pomiaru rozciągliwości; dolny panel przedstawia wpływ na rozciągliwość (nachylenie krzywej regresji). Dane przedstawiono jako wykresy prostokątów. Linie pionowe przedstawiają zakres od ilości najniższej do najwyższej. Wysokość prostokąta, linia pozioma i gwiazdka opisują odpowiednio, zakres interkwartylu, medianę, i wartość średnią.

Figura 2 przedstawia wpływ L-NAME na szyjkę macicy u ciężarnych świnek morskich. Górny panel przedstawia początkowe rozszerzenie (w mm) podczas pomiaru rozciągliwości; dolny panel przedstawia wpływ na rozciągliwość (nachylenie krzywej regresji [N/mm]). Dane przedstawiono jako wykresy prostokątów, jak opisano w przypadku figury 1.

Figury 3 do 5 przedstawiają rozciągliwość szyjki szczurów po działaniu L-NAME (50 mg/szczur) lub bez działania. Figura 3 przedstawia rozciągliwość szyjki podczas ciąży u szczurów (wartości średnie z co najmniej jednym wspólnym indeksem górnym nie są różne przy wartości p<0,05 (n-4 w każdej grupie). Analiza statystyczna: Powtarzana ANOVA, a następnie wielokrotne porównania stosując kryteria najmniejszej istotności Fishera). Figura 4 przedstawia rozciągliwość szyjki (inkubowanie in-vitro L-NAME 3 mM). Figura 5 przedstawia rozciągliwość szyjki po inkubowaniu L-NAME 3Mm in-vitro (wartości średnie są różne przy wartości p<0,005 n=6 w każdej grupie). Analiza statystyczna: parzysty test t.

Figura 6 przedstawia wpływ L-NAME (50 mg/dzień) na poród u szczurów (wartości średnie z różnymi indeksami górnymi są różne przy wartości p<0,01 (dwustronny test t), n=10 w każdej grupie), tzn. wzrost czasu trwania porodu i interwału potomstwa (czas pomiędzy porodem potomstwa podczas działania L-NAME)

Figury 7 do 9 przedstawiają wytwarzanie NO podczas normalnego rozszerzenia szyjki (ft), po progesteronie (U), antyprogestynie (ΪΤ), i LPS (1Ϊ). Figura 1 przedstawia poziomy azotynu + azotanu w szyjce szczura podczas ciąży (wartości średnie z co najmniej jednym wspólnym indeksem górnym nie są różne przy wartości p<0,05 (n=5-9). Analiza statystyczna: Powtarzana analiza wariancji (ANOVA), a następnie wielokrotne porównania stosując kryteria najmniejszej istotności Fishera). Figura 8 przedstawia poziomy azotynu + azotanu w szyjce szczura dla leczenia progesteronem lub antyprogestyną onapristonem (wartości średnie z co

183 461 najmniej jednym wspólnym indeksem górnym nie są różne przy wartości p<0,05 (n=5). Analiza statystyczna: Powtarzana analiza wariancji (ANOVA), a następnie wielokrotne porównania stosując kryteria najmniejszej istotności Fishera). Figura 9 przedstawia poziomy azotynu + azotanu w szyjce szczura dla leczenia LPS (wartości średnie z co najmniej jednym wspólnym indeksem górnym nie są różne przy wartości p<0,05 (n=5). Analiza statystyczna: Powtarzana analiza wariancji (ANOVA), a następnie wielokrotne porównania stosując kryteria najmniejszej istotności Fishera).

Przykład 1

Wpływ tlenku azotu na dojrzewanie szyjki u ciężarnych świnek morskich.

Część ogólna

Pomiar dojrzewania:

Całe szyjki otrzymano ze świnek morskich 44 dnia post coitum. Badania rozciągliwości wykonano przez modyfikację sposobu opisanego w publikacji DOWNING, S. J. i SHERWOOD. O.D. (1985) Endocrinology 116:1215 -1220.

Wyodrębnioną szyjkę umieszczono między dwoma haczykami wstawionymi przez każdy kanał szyjki. Jeden haczyk jest umocowany, a inny jest przemieszczany do góry podczas gdy mierzy się siłę i przemieszczenie przy częstości pobierania próbek 1 Hz. Najpierw każda szyjka jest rozszerzana do osiągnięcia siły 50 mN. Związane z tym przemieszczenie zapisuje się i będzie ono zwane początkowym rozszerzeniem.

Zatem oryginalny wewnętrzny obwód szyjki wynosi dwukrotną wartość początkowego rozszerzenia. Następnie szyjka jest rozszerzana przez przemieszczanie haczyka przez 0.1 mm. następnie haczyk jest umocowany i szyjka pozostawiona do rozluźnienia przez 2 minuty. Jest to powtarzane do zerwania szyjki lub co najmniej osiągnięcia granicy plastyczności, tzn. gdy obwiednia krzywej obciążenia względem czasu staje się nieliniowa (patrz publikacja CONRAD, J.T. i UELAND, K. (1979) Am J Obstet Gynecol 133: 11 -13).

(b) Analiza

Aby określić rozciągliwość szyjki bada się krzywą siły względem stosunku rozciągania. Krzywą tą uzyskuje się przez przyjęcie maksymalnej siły przy każdym stopniu rozciągania i związanego z tym stosunku rozciągania, który jest określony jako przemieszczenie podzielone przez początkowe rozszerzenie. Nachylenie linii regresji w liniowej części tej krzywej ustala się, by ująć ilościowo wpływ zastosowanego działania na rozciągliwość szyjkową. Obniżenie nachylenia przedstawia wzrost rozciągliwości szyjki (efekt dojrzewania).

(c) Część szczególna:

Ciężarne świnki morskie 42 dnia post coitum (n=6 zwierząt na grupę) poddano doowodniowo dwa razy dziennie działaniu 200 μΐ żelu (3% hydroksycelulozy) zawierającego 0,03 mM nitroprusydku sodu dnia 42 i dnia 43 (o 9:00 i 17:00). Pomiar rozciągliwości szyjki (parametry: nachylenie linii regresji, początkowe rozszerzenie) wykonano 44 dnia p.c.

Żel podaje się w następujący sposób: po wprowadzeniu wziernika do pochwy, 200 μΐ żelu celulozowego z lub bez SNP wstrzykuje się przez tępą igłę (ok. 100 mm długą) do kanału szyjkowego. Część żelu przesuwa się wzdłuż kanału sytuując się wokół cieśni szyjki macicy. Żel ma następującą recepturę: obejmuje związki wynalazku w PBS (solanka buforowana fosforanem, patrz L. HUDSON i P.C. HAY (1980) Practical Immunology, Oxford, Sec. edition) z 3 % (wag./obj.) hydroksyletylocelulozy. Grupa kontrolna otrzymuje żel zawierający 3 % (wag./obj.) hydroksyloetylocelulozy w PBS.

Właściwości mechaniczne szyjki mierzy się metodą opisaną powyżej, co umożliwia ujęcie ilościowe rozciągliwości i rozszerzenia szyjki macicy w warunkach izometrycznych.

(d) Wyniki:

Wyniki przykładu 1 podano na figurze 1. Górny panel przedstawia nachylenia linii regresji, co jest parametrem rozciągliwości szyjki. Dolny panel przedstawia początkowe rozszerzenie w mm szyjki.

Wyniki wykazują, że donor NO - nitroprusydek sodu (SNP) po lokalnym podaniu w żelu drastycznie zwiększa dojrzewanie u ciężarnych świnek morskich.

Przykład 2

Wpływ nitroprusydku sodu (SNP) na morfologię szyjki u ciężarnych świnek morskich.

183 461

SNP (0,1 M) dwukrotnie podawano doszyjkowo w 0.2 ml buforu PBS zawierającego 3% hydroksycelulozy w dniach (d) 42-43 post coitum (p.c.), i efekty oceniono 44 dnia p.c. przez ocenę morfologiczną. Zwierzętom kontrolnym podawano zaróbkę. Wszystkie szyjki użyte do oceny morfologicznej uzyskano po utrwaleniu in situ przez perfuzję naczyniową. Procedurę perfuzji wykonano dnia 50 p.c. między 9-10 przed południem przy znieczuleniu 1,5 ml pentobarbitalu i.m. (60 mg/ml). Kaniulę implantowano do aorty brzusznej pod rozgałęzieniem arterii nerkowych; zwierzęta poddano perfuzji buforem kakodylanowym, pH 7,4 przez 60-90 sek, a następnie przez utrwalenie 2,5% glutaraldehydem w buforze kakodylanowym, pH 7,4, przez 6-10 mm pod ciśnieniem 80-100 cm H2O. Szyjki wycięto i odcięto od sąsiadujących tkanek, a następnie utrwalono w 4°C w tym samym środku utrwalającym. Po przemyciu buforem, materiał utrwalono następczo przez 2h w 1 % OsO₄ buforowanym zimnym buforem kakodylanowym, odwodniono w stopniowanych dawkach etanolu i otoczono żywicą epoksydową Araldite. Poprzeczne półcienkie fragmenty przeglądowe, o grubości 1 -2 pm, wycięto z każdej z tych próbek i zabarwiono 1% błękitu toluidynowego w boranie sodu dla zbadania pod mikroskopem optycznym. To umożliwiło badanie całej szyjki, dając tym samym przegląd rozkładu populacji różnych komórek w szyjce. Następnie, małe próbki (1-2 mm³) wycięto z poprzecznego bloku szyjki i wytworzono ultracienkie fragmenty nożem szklanym lub diamentowym na mikrotomie Reichert 0mU3 i umieszczono na siatkach miedzianych pokrytych Formvar o pojedynczej szczelinie. Zabarwiono je octanem uranylu i cytrynianem ołowiu i zbadano za pomocą mikroskopu elektronowego Zeiss EM - 10 przy 60-80 kW. Badanie pod mikroskopem elektronowym ujawniło wyraźne dojrzewanie szyjki towarzyszące rozpuszczeniu włókien kolagenowych, obrzęk zrębowy, rozszerzenie i infiltrację makrofagów, limfocytów i granulocytów. Były również obecne liczne komórki tuczne. Efekty morfologiczne SNP były podobne do zaobserwowanych podczas normalnego dojrzewania szyjki w terminie, lub po działaniu antyprogestyną onapristonem lub cytokiną IL-8.

Przykład 3

Wpływ L-NAME na szyjkę macicy u ciężarnych świnek morskich

Ciężarne świnki morskie poddano działaniu L-NAME (12,5 mg/dzień/zwierzę s.c.) w dniach 48 i 49 p.c. Rozciągliwość i rozszerzenie szyjki zmierzono 50 dnia p.c., tzn. dwa dni po rozpoczęcia podawania. Pomiar przeprowadzono jak opisano w przykładzie 1.

Wyniki przykładu 3 podano na fig. 2. Zarówno początkowe rozszerzenie jak i rozciągliwość szyjki (wzrost nachylenia) obniżyły się w porównaniu z grupą kontrolną.

Przykład 4

Wpływ L-NAME na poród u ciężarnych świnek morskich

Minipompy osmotyczne zawierające L-NAME (grupa 1:7 mg; grupa 2: 12,5 i grupa 3: 25 mg/zwierzę/dzień) implantowano podskórnie dnia 50 p.c. (termin = dzień 67+2 p.c.). Na grupę kontrolną podziałano zaróbką. Wszystkie zwierzęta (5/5) grupy 3 i 3/5 grupy 2 wydano przedwcześnie (przed dniem 65 p.c.) w ciągu 8 dni zastosowanego działania. Badanie to pokazuje, że L-NAME wywołuje przedwczesny poród u świnek morskich przez aktywowanie skurczenia macicy. Jednak u zwierząt, na które działano L-NAME zaobserwowano przedłużone porody trwające szereg godzin. Obserwacja ta jest pośrednim wskazaniem niedostatecznego dojrzewania szyjki, które wykazano w oddzielnym doświadczeniu wykonanym dnia 50 p.c. stosując pomiar rozciągliwości szyjki (fig. 2).

Przykład 5

Wpływ L-NAME na poród u szczurów

Figura 6 która jest oparta na podobnym eksperymencie jak opisany w przykładzie 4 pokazuje, że podczas działania L-NAME (50 mg/dzień) na ciężarne szczury czas trwania porodu i interwał między potomstwem tzn. czas między urodzeniem pojedynczych osobników potomstwa, jest wyraźnie zwiększony. To wyraźnie pokazuje, że inhibitory tlenku azotu zapobiegają dojrzewaniu szyjki u szczurów.

Przykład 6

Wytwarzanie tlenku azotu u szczurów podczas normalnego rozszerzenia szyjki, po działaniu progesteronem, antyprogestyną i LPS

183 461 (a) Sposób

Aktywność tworzenia tlenku azotu zmierzoną in vitro jako całkowite nagromadzenie azotynów w tkankach szyjki i macicy oceniono stosując metodę opisaną w: Yallampalli C, Garfieid RE, Byam-Smith M (1993): Nitric oxide inhibits uterine contractility during pregnancy but not during delivery, Endocrinology 133:1899-1902. W skrócie, małe kawałki tkanki szyjki lub macicy uzyskane z rodzących szczurów (dzień 22-23 ciąży), szczurów poddanych działaniu onapristonu (10 mg dnia 18 p.c., s.c.) i poddanych działaniu zarobki w dniach 18-21 p.c. (szczurów kontrolnych) inkubowano w minimalnej zasadniczej pożywce (MEM) L-argininą z lub bez L-NAME przez 24 h w 3°C. Pożywkę zbadano na całość azotynów stosując reagent Griessa.

(b) Wyniki

Wytwarzanie azotynu w tkance macicy (mięśniówki macicy): wytwarzanie drastycznie obniża się w próbkach macicy uzyskanych ze zwierząt rodzących w porównaniu z dniem 18 ciąży (Yallampalli i in., loc.. cit). Wytwarzanie azotynu w tkance szyjki (fig. 7): znaczący wzrost wytwarzania NO w szyjce uzyskanej ze zwierząt rodzących w porównaniu z ciężarnymi szczurami w dniach 18-22 p.c. Wpływ onapristonu na wytwarzanie NO w szyjce macicy (fig. 8): znaczący wzrost szyjkowego wytwarzania NO w porównaniu z grupą kontrolną dnia 19 p.c. do poziomów zauważonych u zwierząt rodzących spontanicznie.

Przykład 7

Preindukowanie dojrzewania szyjki donorem tlenku azotu

Kobiecie ciężarnej (około 30 lat, 50 - 80 kg) w 38 tygodniu ciąży, zaklasyfikowanej do wywołania porodu z powodu stanu przedrzucawkowego, podawano dwa razy dziennie doszyjkowo nitroprusydek sodu w stężeniu 0,01-0,1 mM w żelu aby osiągnąć dojrzewanie szyjki. Wywołanie porodu będzie wykonane następnego dnia stosując infuzję oksytocyny i.v.

Przykład 8

Leczenie niewydolności szyjkowej lokalnym podawaniem L-NAME

Kobiecie ciężarnej (około 30 years, 50 - 80 kg) w 26 tygodniu ciąży, wykazującej oznaki niewydolności szyjkowej (rozszerzenia szyjki, zmiękczenia szyjki) podaje się L-NAME w żelu doszyjkowo lub dopochwowo w stężeniu 0,1 - 50 mg/ml w dwóch lub trzech dawkach dziennie do poprawy objawów niewydolności szyjkowej.

Claims

1. Zastosowanie donorów i/lub substratów tlenku azotu lub inhibitorów tlenku azotu dla wytwarzania środka leczniczego dla regulacji rozszerzenia i/lub rozciągliwości szyjki macicy.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje stosowanie (a) co najmniej jednego donora i/lub substratu tlenku azotu dla wytwarzania środka leczniczego podawanego lokalnie doszyjkowo lub dopochwowo dla wywołania dojrzewania szyjki lub (b) co najmniej jednego inhibitora tlenku azotu dla wytwarzania środka leczniczego podawanego lokalnie doszyjkowo lub dopochwowo dla inhibitowania dojrzewania szyjki dla leczenia niewydolności szyjkowej lub przedwczesnego porodu.

3. Zastosowanie według zastrz. 2 (a), znamienne tym, że stosuje się donor i/lub substrat tlenku azotu w połączeniu z antyprogestyną.

4. Zastosowanie według zastrz. 2 (b), znamienne tym, że stosuje się inhibitor tlenku azotu w połączeniu z progestyną.

5. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3 dla wywołania porodu w terminie.

6. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3 dla wywołania porodu w związku z ciążą patologiczną.

7. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3 dla wywołania porodu w związku z wewnątrzmaciczną śmiercią płodu.

8. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3 dla wywołania aborcji.

9. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3 dla wywołania przedwczesnego porodu.

10. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3 dla kierowania przedłużonym porodem.

11. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3 dla wywołania dojrzewania szyjki nieciężamej kobiety lub ciężarnej kobiety dla wspomagania procedury chirurgicznej lub diagnostycznej.

12. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 3 dla wywołania dojrzewania szyjki u kobiety, która ma być poddana zapłodnieniu in vitro.

13. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 4 dla leczenia niewydolności szyjkowej.

14. Zastosowanie według zastrz. 2 albo 4 dla leczenia zagrażającego przedwczesnego porodu.

15. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jako substrat i/lub donor tlenku azotu stosuje się L-argininę, nitroprusydku sodu.

16. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jako inhibitor tlenku azotu stosuje się ester metylowy NG-nitro-L-argininy (L-NAME), NG-monoetylo-L-argininy (L-MMA), N-iminoetylo-L-amityny (L-NIO), L-monometylo-L-argininy (L-NNMA), L-NG-metyloargininy (L-NMA) i Nw-nitro-L-argininy (L-NA).

17. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że jako antyprogestynę stosuje się jeden z wymienionych onapristonu (1 ip-[4-(dimetylamino)fenylo]-17a-hydroksy-17P-(3-hydroksypropylo)-13a-estra-4,9-diene-3-on),

RU 486 (1 lp-[4-(Dimetylamino)fenylo)-173-hydroksy-17a-(l-propinylo)estra-4,9-dien-3-on), (Z)-11 β- [4-(Dimetylamino)fenylo] -17p-hydroksy-17 a-(3 -hydroksy-1 -propenylo)estr-4-en-3-onu (EP-A 0 404 283),

11 P-(4-Acetylofenylo)-l 7p-hydroksy-l 7a-(l -propinylo)estra-4.9-dien-3-onu (EP-A 0 190 759).

4',5'-Dihydro-l l[3-[4-(dimetylamino)fenylo]-6p-metylospiro[estra-4,9-dien-17p,2'(3'H)-furan]-3-onu,

4',5'-Dihydro-lip-[4-(dimetylamino)fenylo]-7P-metylospiro[estra-4,9-dieno-17P,2'(3'H)-furan]-3-onu,

183 461

11 p-(4-Acetylfenylo)-19,24-dinor-l 7,23-epoksy-17a-chola-4,9,20-trien-3-onu, (E)-11 β - [4- [[(Acetyloksy)imino] metylo] fenylo] -17 β-metoksy-17a-(metoksymetylo) estra-4,9-dien-3-onu, (E)-l lβ-[4-[[[(Etoksykarbonyl)oksy]imino]metylo]fenylo]-17β-metoksy-17α-(metoksymetylo)estra-4,9-dien-3-onu.

18. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że jako progestynę stosuje się progesteron.