DE69637313T2

DE69637313T2 - Verwendung von stickstoffoxyddonoren oder -antagonisten zur regulierung der dehnung der zervix

Info

Publication number: DE69637313T2
Application number: DE69637313T
Authority: DE
Inventors: Kristof Chwalisz; Robert E. Friendswood GARFIELD
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-14
Publication date: 2008-09-04
Anticipated expiration: 2016-03-15
Also published as: UA57703C2; EP0814785A1; KR100434239B1; CA2214779A1; ID20742A; KR20040004515A; IL117496A; CZ285197A3; KR100434238B1; WO1996028145A1; CZ292395B6; PL322252A1; TW421594B; AU713172B2; NO974204L; NO974204D0; KR19980703060A; MY116500A; JPH11502200A; AU5311796A

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Regulierung zervikaler Dilatation und Dehnbarkeit durch die Verwendung von Stickoxiddonoren und/oder -substraten oder Stickoxidinhibitoren.
Beschreibung des Standes der Technik:
Eine Geburt (Ausscheidung des Fötus aus dem Uterus) erfordert sowohl Kontraktionen des Myometriums, der glatten Muskulatur des Uterus, als auch ein Erweichen des Bindegewebes der Zervix, so dass sie sich ausreichend ausweitet und dehnt, um das Ausscheiden des Fötus zu ermöglichen. Dieses Erweichen ist als „Reifung" bekannt.
Das derzeit bevorzugte Verfahren zur zervikalen Reifung erfolgt durch die Verwendung von Prostaglandin E₂. Dies wird als vaginales Gel oder als Tablette oder als ein Gel, das in die Zervix eingebracht wird, verwendet. Eine Sorge, die man bei der Verwendung von Prostaglandin E₂ hat, ist, dass die Möglichkeit besteht, dass der Uterus hyperstimuliert wird, was zu exzessiv starken myometrialen Kontraktionen führt, bevor die Zervix gereift ist und somit bevor eine bequeme oder sichere Geburt möglich ist.
Die ideale Vorbereitung würde die Zervix welch machen und zurücknehmen, ohne dass myometriale Kontraktionen verursacht werden. Dadurch könnten die anschließenden Kontraktionen (die, falls nötig, mit einer geringen Dosis Prostaglandin induziert werden können) das Baby mit einem minimalen Widerstand freisetzen. Es gibt einen guten Anhaltspunkt aus Tierversuchen, dass die Antiprogestine, wie z. B. RU 486, diese Erfordernisse erfüllen würden, allerdings ist das Problem bei diesem Arzneimittel, dass damit Antiglucocorticoide-Aktivität mit einhergeht, was für den Fötus schädlich sein könnte.
Eine der derzeit spannendsten Fortschritte in Biologie und Medizin ist die Entdeckung, dass Stickoxid durch Endothelzellen produziert wird und dass es an der Regulierung von Gefäßtonus, Plättchenaggregierung, Neurotransmission und Immunaktivierung (Furchgott und Zawadzki, 1980; Moncada, Palmer und Higgs, 1991; Ignarro, 1991) beteiligt ist. Stickoxid ist ein wichtiger Relaxationsmediator der glatten Muskulatur (Montada, Palmer und Higgs, 1991) und war früher als EDRF (von Endothelin abgeleiteter Entspannungsfaktor) bekannt (Furchgott und Zawadzki, 1980; Moncada, Palmer und Higgs, 1991).
Stickoxid wird durch die oxidative Deaminierung eines Guanidino-Stickstoffs des L-Arginins durch mindestens unterschiedliche Isoformen eines flavinhaltigen Enzyms, Stickoxidsynthase (Moncada, Palmer und Higgs, 1991), synthetisiert.
Stickoxid kann auch durch Anwendung verschiedener Stickoxiddonoren, wie z. B. Natriumnitroprussid, Nitroglycerin, Glyceryltrinitrat, SIN-1, Isosorbidmononitrat, Isosorbiddinitrat etc. erzeugt werden.
Es wurde gezeigt, dass Synthese von Stickoxid kompetitiv durch Analoga von L-Arginin; NG-Nitro-L-argininmethylester (L-NAME), NG-Monoethyl-L-arginin (LMMA), N-Imminoethyl-L-arnithin (L-NIO), L-Monomethyl-L-arginin (L-NNMA), L-NG-Methylarginin (LNMA), Nw-Nitro-L-arginin (L-NA) und Aminoguanidin inhibiert wird.
Die Behandlung von nicht schwangeren Meerschweinchenen mit L-NAME führt zu erhöhter Uteruskontraktilität. Inhibierung der Stickoxidsynthase-stimulierten Uteruskontraktilität deutet also an, dass die Tonikumfreisetzung von Stickoxid den Uterus im Ruhezustand belässt. In ähnlicher Weise induzierte die Behandlung von schwangeren Meerschweinchen mit L-NAME vorzeitige Wehen. Auf der anderen Seite inhibierte die Behandlung von Uterusstreifen von Ratten mit L-Arginin in vitro Kontraktionen. Diese Studien zeigen, dass Stickoxiderzeugung durch den Uterus Uteruskontraktilität inhibiert und dass eine Blockade dieser Synthese zu erhöhter Muskelkontraktilität sowohl in schwangeren als auch in nicht schwangeren Tieren führt. Stickoxidsubstrate oder -donoren sind also therapeutisch nützlich, um Uteruskontraktilität zu vermeiden und Stickoxidinhibitoren sind wirksam Uteruskontraktionen zu stimulieren.
Auf Basis vorläufiger Studien mit Rhesusaffen haben Jennings et al. (The Journal of Maternal-Fetal Medicine 2:170–175 (1993)) vorgeschlagen, dass Stickoxid für die Ruhe des Uterus während der Schwangerschaft wichtig sein kann und exogenes Stickoxid nützlich sein kann, um frühzeitige Wehen zu kontrollieren.
Aktivität von Stickoxidsynthase (NOS) wurde an vielen Strukturen innerhalb des Uterus einer trächtigen Ratte von Natuzzi et al. (Biochem. and Biophys. Res. Commun., 194, Nr. 1, 1–8, (1993)) demonstriert und sie schließen daraus, dass NOS innerhalb vielfältiger Strukturen des Uterus einer trächtigen Ratte vorhanden ist. Reduzierung der NOS-Aktivität bei Geburt lässt vermuten, dass NO zur Aufrechterhaltung der Ruhigstellung der Uteruskontraktilität während der Schwangerschaft beiträgt.
Morphologische Studien haben auch bereits das Auftreten von NOS (NADPH-Diaphorase, ein histochemisches Verfahren zum Nachweis sämtlicher NOS-Isoformen) und No metabolisierende Enzyme, wie z. B. Superoxiddismutase, in der Zervix gezeigt (Papka et al., Neuroscience Letters 147 (1992); Shiotani et al., Acta Histochem. Cytochem. 26:57-64 (1993)).
Es wurde nun gefunden, dass die Behandlung mit L-NAME (s. c.) bei schwangeren Meerschweinchenen an den Tagen 48–49 p. c. (Termin Tag 67 + 3 Tage) überraschenderweise zu einer Verringerung der zervikalen Dehnbarkeit und einer Verringerung der zervikalen Dilatation führte.
In schwangeren Ratten wurde eine erhöhte Produktion von Stickoxid (Parameter, Nitrit- und Nitratfreisetzung in vitro) von der Cervix uteri zu der Zeit der Freisetzung gefunden, verglichen mit dem Tag 18 der Schwangerschaft. Es wurde im Gegenteil dazu eine Verringerung bei der (myometrialen) NO-Herstellung im Uterus im Laufe der Schwangerschaft bei Ratten beobachtet. Das Antiprogestin Onapriston erhöhte die Stickoxidherstellung in der Cervix uteri in schwangeren Ratten noch weiter, hatte allerdings einen inhibierenden Einfluss auf die NO-Produktion im Uterus (Myometrium). Behandlung mit der gleichen Dosis von Onapriston induzierte zervikale Reifung bei Ratten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass

• Behandlung mit einem Stickoxidinhibitor, wie z. B. L-NAME, die zervikale Reifung inhibiert, allerdings die Uteruskontraktionen in schwangeren Meerschweinchenen stimuliert;
• die NO-Herstellung, die einen entspannenden Einfluss auf das Myometrium aufweist, sich in dem schwangeren Uterus (Myometrium) während des Verlaufs der Schwangerschaft verringert, sie allerdings in der Cervix uteri während normaler und Antiprogestin-induzierter Geburt bei Ratten ansteigt;
• die divergierenden Einflüsse eines Stickoxidinhibitors, wie z. B. L-NAME, auf Uteruskontraktilität und Cervix uteri entweder auf verschiedene Aktionen des NO-Systems oder auf die Anwesenheit von verschiedenen Enzymisoformen in dem Myometrium und der Zervix zurückzuführen sind und
• das NO-System eine wichtige Rolle bei der Steuerung der Cervix uteri spielt, wobei sich die NO-Herstellung während des Reifungsprozesses der Zervix erhöht.

Daraus wird geschlossen, dass

(a) eine lokale Applikation von Stickoxiddonoren und/oder -substraten verwendet werden kann, um die zervikale Reifung zu induzieren oder
(b) eine lokale Applikation eines Stickoxidinhibitors verwendet werden kann, um zervikale Reifung zu verhindern oder zu inhibieren, z. B. für die Behandlung von zervikaler Insuffizienz (zu früher zervikaler Reifung) oder vorzeitigen Wehen.

Die vorliegende Erfindung ist also auf die Verwendung von Stickoxiddonoren und/oder Substraten oder Stickoxidinhibitoren zur Herstellung eines Medikaments zur Regulierung zervikaler Dilatation und/oder Dehnbarkeit gerichtet.
Die vorliegende Erfindung bezieht die Verwendung von entweder

(a) mindestens einem Stickoxiddonor und/oder -substrat zur Herstellung eines Medikaments, das lokal angewendet wird (z. B. intrazervikal oder intravaginal) zur Einleitung von zervikaler Reifung oder
(b) mindestens einem Stickoxidinhibitor zur Herstellung eines Medikaments, das lokal angewendet wird (z. B. intrazervikal oder intravaginal) zur inhibierung zervikaler Reifung, um zervikale Insuffizienz oder frühzeitige Wehen zu behandeln, mit ein.

Zum Zwecke dieser Erfindung sind als (a) Stickoxiddonor und/oder -substrat oder (b) Stickoxidinhibitor alle Verbindungen, von denen der Fachmann weiss, dass sie die erforderlichen Eigenschaften aufweisen; die Verbindungen, die unter „Beschreibung des Standes der Technik" genannt sind, sind bevorzugt.
Der Stickoxiddonor und/oder das -substrat (a) kann ferner in Verbindung mit (i) mindestens einem Antiprogestin, Prostaglandin und/oder Cytokin verwendet werden.
Beispiele für Antiprogestine sind Onapriston(11β-[4-(dimethylamino)phenyl]-17α-hydroxy-17β-(3-hydroxypropyl)-13α-estra-4,9-dien-3-on), RU 486 (11β-[4-(dimetyhlamino)phenyl]-17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)estra-4,9-dien-3-on, (Z)-11β-[4-(Dimetyhlamino)phenyl]-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxy-1-propinyl)estra-4-en-3-on ( EPA 0 404 283 ), 11β-(4-Acetylphenyl)-17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)estra-4,9-dien-3-on ( EP-A 0 190 759 ), 4',5'-Dihydro-11β-[4-dimethylamino)phenyl]6β-methylspiro[estra-4,9-dien-17β,2'(3'H)-furan]-3-on, 4',5'-Dihydro-11β-[4-dimethyl-amino)phenyl]7β-methylspiro[estra-4,9-dien-17β,2'(3'H)-furan]-3-on, 11β-(4-Acetyl-phenyl)-19,24-dinor-17,23-epoxy-17α-chola-4,9,20-trien-3-on, (E)-11β-[4-[[Acetylyoxi]imino]methyl]phenyl]-17β-methoxy-17α-(methoxymethyl)estra-4,9-dien-3-on, (E)-11β-[4-[[Ethoxycarbonyl)oxi]imino]methyl]phenyl]-17β-methoxy-17α-(methoxy-methyl)estra-4,9-dien-3-on und viele andere Verbindungen, die eine kompetitive Progesteronantagonistische Aktivität aufweisen, und den Fachleuten wohl bekannt sind.
Als Prostaglandin kann Sulproston (PGE₂) oder Gemeprost beispielsweise verwendet werden.
Die prominentesten Vertreter für die Cytokine sind Interleukin-8 oder Interleukin-1β. Diese Auflistungen sind nicht als erschöpfend anzusehen.
Der Stickoxidinhibitor (b) kann ferner in Kombination mit (ii) mindestens einem Progestin und/oder einem Cyclooxygenase-Inhibitor, z. B. COX-1- und COX-2- Inhibitoren) verwendet werden.
Für Progestin wird das natürlich auftretende Progesteron bevorzugt, es ist allerdings auch möglich, ein oder mehrere der zahlreichen synthetischen Progestine, die dem Fachmann für die Verwendung in oralen Verhütungsmitteln bekannt sind, zu verwenden, zum Beispiel Levonorgestrel, Cyproteronacetat, Gestoden, Drospirenon, Desogestrel, 3-Ketodesogestrel, Dienogest etc.
Der Cyclooxygenaseinhibitor kann zum Beispiel Aspirin (COX-1- und COX-2-Inhibitor) sein. Weitere Beispiele für COX-2-Inhibitoren können Robert Aslanian, Nicholas I. Carruthers, James J. Kaminski; Cyclooxygenase 2: A Novel Target for Therapeutic Intervention, Exp. Opin. Invest. Drugs, 1194, 3 (12), 1323–1325 entnommen werden, wie zum Beispiel die Verbindungen Sc-58125 (GD-Searle), DuP-697, Flusolid [6-(2,4-Difluorophenoxy)-5-metylsulfonylamino-1-indanon], Sc-57666 (GD Searle), L-745 337 (Merck Frosst), NS-398 (Monsanto).
In dem ersten Aspekt (a) der Erfindung stellt die Erfindung die Verwendung von diesen erfindungsgemäßen Verbindungen im Zusammenhang mit Geburt oder Abort bereit. Unter diesen Umständen der Schwangerschaft ist die Zervix vorbehandelt. Die Hormone während der Schwangerschaft verändern die Zervix, die dann geneigt ist, effektiv auf andere Stimulantien zu reagieren.
Ferner stellt die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen unter (a) im Zusammenhang mit chirurgischen Eingriffen und diagnostischen Verfahren bereit. Daher können die Verbindungen unter (a) der Erfindung gegebenenfalls in Kombination mit den Verbindungen, die unter (i) genannt sind, zur Herstellung von Medikamenten für die folgenden Indikationen verwendet werden:

(A) Einleitung von Wehen zum jeweiligen Termin (normaler Geburtstermin, kann mit aufeinander folgender Behandlung mit Oxytocin oder ähnlichen Reagenzien kombiniert werden),
(B) Einleitung von Wehen in Verbindung mit einer pathologischen Schwangerschaft (z. B. fötaler Missbildung); (bevorzugt zweiter Trimester-Abort),
(C) Einleitung von Wehen in Verbindung mit intrauteriner Todgeburt,
(D) Einleitung eines Aborts (bevorzugt erster Trimester-Abort),
(E) Einleitung von frühzeitigen Wehen,
(F) Handhabung von verlängerten Wehen aufgrund zervikaler Dystokie,
(G) Einleitung zervikaler Reifung einer nicht schwangeren Frau oder einer schwangeren Frau, um einen chirurgischen Eingriff oder ein diagnostisches Verfahren zu erleichtern und
(H) Einleitung zervikaler Reifung bei einer Frau, die in vitro befruchtet werden soll.

Im zweiten Aspekt (b) stellt die Erfindung die Verwendung von diesen erfindungsgemäßen Verbindungen bei Indikationen, die die Prävention einer zu frühen zervikalen Reifung erfordern oder wo die Zervix steif gehalten werden soll, bereit. Daher können die Verbindungen unter (b) in dieser Erfindung gegebenenfalls in Kombination mit den Verbindungen, die unter (ii) genannt sind, zur Herstellung von Medikamenten für die folgenden Indikationen verwendet werden:

(I) Behandlung von zervikaler Insuffizienz (zervikale Inkompetenz) und
(K) Behandlung drohender frühzeitiger Wehen.

Im Prinzip kann die Verbindung für humane und nicht-humane Frauen verwendet werden. Menschen sind die bevorzugte Gruppe für diese Behandlung.
Der Stickoxiddonor und/oder das Stickoxidsubstrat (a) oder der Stickoxidinhibitor (b) kann auf jegliche Art und Weise verabreicht werden, auf dem er/es direkt oder indirekt die Zervix erreicht. So wird er/es günstigerweise intravaginal verabreicht oder direkt auf die Zervix, z. B. typischerweise als ein Gel oder eine Creme, aufgetragen. Er/es kann auch in das zervikale Gewebe injiziert werden oder über eine abgestumpfte Nadel in den Zervixkanal injiziert werden. Er/es kann auch extra-amniotikal, d. h. zwischen der Uteruswand und dem amniotischen Beutel, mittels eines Katheters verabreicht werden.
Die bevorzugte Formulierung ist ein Gel oder eine Creme, es kann allerdings auch als Zäpfchen, Liposom oder in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung oder als eine wässrige Lösung, z. B. als Salz- oder proteinhaltige Lösung, verabreicht werden. Die Formulierung kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren, erhalten werden.
Falls eine kombinierte Verwendung der Verbindungen, wie sie unter (a) und (i) genannt ist, angedacht ist, kann das Antiprogestin für systemische oder topische Verabreichung formuliert werden. Das Prostaglandin sowie das Cytokin werden bevorzugt für lokale Verwendung formuliert.
Falls eine kombinierte Verwendung der Verbindungen, wie sie unter (b) und (ii) genannt ist, angedacht ist, können die Verbindungen unter (ii) für lokale oder systemische Anwendungen formuliert werden.
Die Formulierungen der Verbindungen unter (i) und (ii) können auf die, dem Fachmann bekannte Weise, erhalten werden.
Die Verbindungen unter (a) in der Erfindung weisen pharmakologische Aktivität bei der Einleitung von zervikaler Reifung auf und können daher als Arzneimittel nützlich sein.
Die Verbindungen unter (b) in der Erfindung weisen pharmakologische Aktivität bei der Prävention zervikaler Reifung auf und können daher als Arzneimittel nützlich sein.
Die Messung der Zervixreifung wird in Beispiel 1 beschrieben.
Natriumnitroprussid und andere Stickoxiddonoren zeigen einen Einfluss auf die zervikale Reifung bei Konzentrationen von etwa 0,03 mM bis 100 mM (1,8 μg bis 6 mg pro Anwendung), wenn sie schwangeren weiblichen Meerschweinchen verabreicht werden. Für diese Indikationen, die zuvor unter (A) bis (F) genannt worden sind, variiert die geeignete Dosierung natürlich abhängig von beispielsweise den eingesetzten erfindungsgemäßen Verbindungen, dem Patienten, der Art der Verabreichung und der Art und der Schwere des Zustands, der behandelt werden soll. Allerdings zeigt sich, dass im Allgemeinen zufriedenstellende Ergebnisse bei einer Konzentration von etwa 0,03–100 mM bei Tieren erhalten werden, im Falle der lokalen Formulierung bevorzugt bei einer Konzentration von etwa 10 mM.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können 6 bis 48 h vor der endgültigen Zervixreifung verabreicht werden. Die Reifung kann beschleunigt werden durch Einleitung von Wehen mit einer oxytokischen Verbindung. Die Verbindungen können in einer oder mehreren Dosen, verabreicht in einer Serie mit einem Abstand von einigen Stunden oder einem Tag, verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf beliebige herkömmliche Weise verabreicht werden, insbesondere in Form eines Gels, einer Salbe oder lokaler Injektion (bei einer Konzentration von etwa 0,03 bis 100 mM).
Natriumnitroprussid und andere Stickoxiddonoren zeigen einen Einfluss auf die zervikale Reifung bei Konzentration von etwa 0,03 mM–100 mM (1,8 μg–6 mg pro Anwendung), wenn sie weiblichen nicht schwangeren Meerschweinchen verabreicht werden. Für diese Indikationen, die oben unter (G) bis (H) genannt worden sind, variiert die geeignete Dosierung natürlich abhängig von beispielsweise den eingesetzten erfindungsgemäßen Verbindungen, dem Patienten, der Art der Verabreichung und der Art und der Schwere des Zustands, der behandelt werden soll. Allerdings zeigt sich, dass im Allgemeinen zufriedenstellende Ergebnisse bei einer Konzentration von etwa 0,03–100 mM bei Tieren erhalten werden, im Falle der lokalen Formulierung bevorzugt bei einer Konzentration von etwa 10 mM.
Diese erfindungsgemäßen Verbindungen können 24 oder 48 h vor der endgültigen Cervixreifung verabreicht werden. Die Verbindungen können in einer oder mehreren Dosen, verabreicht in einer Serie mit einem Abstand von einigen Stunden oder einem Tag, verabreicht werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf beliebige herkömmliche Weise verabreicht werden, insbesondere in Form eines Gels, einer Salbe oder lokaler Injektion.
Beispiele von Dosierungsbereichen typischer NO-Substrate und NO-Donoren bei Menschen sind:

L-Arginin 500 mg–10 g/Tag

Natriumnitroprussid Bereich 500–2000 μg/kg/Tag

Nitroglycerin 0,5–10 mg/Tag

Isosorbidmononitrat 10–100 mg/Tag

Isosorbiddinitrat 10–100 mg/Tag.
Andere NO-Donoren oder NO-Substrate werden in bioäquivalenten Mengen verwendet.

Beispiele für Dosierungsbereiche typischer NO-Inhibitoren sind:

L-NAME	1 bis 50 mg/kg/Tag
L-NIO	1 bis 50 mg/kg/Tag
L-NA	1 bis 50 mg/kg/Tag
L-MMA	1 bis 50 mg/kg/Tag
L-NG	1 bis 50 mg/kg/Tag
L-NMA	1 bis 50 mg/kg/Tag
Aminoguanidin	0,1 bis 100 mg/kg/Tag.

Andere NO-Inhibitoren werden in bioäquivalenten Mengen verwendet.
Dosierungsbereich für RU 486: 25–600 mg/Tag pro os.
Andere Antiprogestine werden in biologisch äquivalenten Mengen verwendet.
Dosierungsbereich für Sulproston: 100–1000 μg/Tag i. m. oder i. v.
Andere Prostaglandine, wie zum Beispiel PGE₂ werden in bioäquivalenten Mengen verwendet.
Die Prostaglandine können auch lokal intrazervikal in Gel, intravaginal in Gel oder als Tabletten verwendet werden.
Dosierungsbereich für COX-2-Inhibitoren: 0,1–100 mg/kg/Tag.
Dosierungsbereich für IL-8: 100 ng–500 μg/Tag; Dosierungsbereich für IL-1β: 100 ng–500 μg/Tag.
Bioäquivalente Mengen anderer Verbindungen als der oben genannten können mittels in den Beispielen offenbarter Verfahren als solche Mengen bestimmt werden, die unter sonst analogen Bedingungen zu vergleichbaren Effekten in der Zervix führen, wie die spezifisch offenbarten Mengen.
Die Ergebnisse der Erfindung werden durch die Figuren, die Folgendes zeigen, belegt:
1 zeigt den Einfluss von Natriumnitroprussid auf die zervikale Reifung bei schwangeren Meerschweinchen, Die Tiere werden wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Die obere Tafel zeigt die anfängliche Dilatation (in mm) während der Dehnbarkeitsmessung: die untere Tafel zeigt den Einfluss auf die Dehnbarkeit (Steigung der Regressionskurve). Die Ergebnisse sind als Säulendiagramme dargestellt. Die vertikalen Linien stellen den Bereich der niedrigsten bis zur höchsten Menge dar. Die Höhe der Säule, die horizontale Linie und das Sternchen beschreiben den interquartilen Bereich, den Median bzw. den Durchschnittswert.
2 zeigt die Einflüsse von L-NAME auf die Cervix uteri bei schwangeren Meerschweinchen. Die obere Tafel zeigt die anfängliche Dilatation (in mm), während Dehnbarkeitsmessung; die untere Tafel zeigt den Einfluss auf die Dehnbarkeit (Steigung der Regressionskurve [N/mm]). Ergebnisse werden als Balkendiagramm, wie für 1 beschrieben, dargestellt.
3 bis 5 zeigen die Dehnbarkeit der Zervix von Ratten nach Behandlung von L-NAME (50 mg/Ratte) oder ohne Behandlung.
6 zeigt die Zunahme der Dauer der Ausscheidung und den Wurf-Intervall (Zeit zwischen Geburt des Wurfs während der Behandlung mit L-NAME).
7 bis 9 zeigen die NO-Produduktion während normaler zervikaler Dilatation (↑), nach Progesteron (↓), Antiprogestin (↑) und LPS (↑).
Beispiel 1
Der Einfluss von Stickoxid auf zervikale Reifung bei schwangeren Meerschweinchen
(a) Allgemeiner Teil:
Messung der Reifung:
Ganze Cervices werden von Meerschweinchen am Tag 44 post coitum erhalten. Die Dehnbarkeitsuntersuchungen werden nach einer Modifizierung des Verfahrens, das in der Publikation DOWNING, S. J. und SHERWOOD, O. D. (1985) Endocrinology 116:1215–1220 beschrieben ist, durchgeführt.
Die isolierte Zervix wird zwischen zwei Haken eingespannt, die durch jeweils einen Kanal der Zervix eingeführt werden. Der eine Haken ist fest, der andere wird nach oben bewegt, und dabei Kraft und Auslenkung mit einer Tastrate von 1 Hz gemessen. Zunächst wird jede Zervix aufgedehnt, bis eine Kraft von 50 mN erreicht ist. Die damit verbundene Auslenkung wird aufgezeichnet und wird als anfängliche Dilatation bezeichnet. Das heißt, der ursprüngliche innere Umfang der Zervix entspricht zweimal der anfänglichen Dilatation.
Anschließend wird die Zervix aufgeweitet, indem der Haken 0,1 mm bewegt wird, der Haken anschließend befestigt wird und die Zervix 2 Minuten relaxieren kann. Dies wird solange wiederholt, bis die Zervix reißt oder mindestens die Dehngrenze erreicht worden ist, d. h. die Einhüllende der Spannungs-Zeitkurve nicht-linear wird (siehe die Publikation CONRAD, J. T. und UELAND, K. (1979) Am J Obstet Gynecol 133:11–13).
(b) Analyse:
Um die Dehnbarkeit der Zervix zu bestimmen, wird die Verhältniskurve von Kraft gegenüber Dehnung untersucht. Diese Kurve wird erhalten, indem das Verhältnis der maximalen Kraft bei der jeweiligen Dehnungsstufe und der damit verbundenen Dehnung aufgenommen wird, welche definiert ist als der Abstand geteilt durch die anfängliche Dilatation. Die Steigung einer Regressionslinie am linearen Teil dieser Kurve wird aufgezeichnet, um den Einfluss der Behandlung auf die zervikale Dehnbarkeit zu quantifizieren. Eine Abnahme der Steigung deutet eine Zunahme der zervikalen Dehnung (Reifungseffekt) an.
(c) Spezieller Teil:
Schwangere Meerschweinchen, die im 42. Tag post coitum sind (n = 6 Tiere pro Gruppe), werden intrazervikal zweimal am Tag mit 200 μl Gel (3% Hydroxycellulose) enthaltend 0,03 mM Natriumnitroprussid am Tag 42 und Tag 43 (um 9.00 Uhr und um 17.00 Uhr) behandelt. Die Messung der zervikalen Dehnbarkeit (Parameter: Steigung der Regressionslinie, anfängliche Dilatation) wurde am Tag 44 p. c. durchgeführt.
Das Gel wird auf folgende Weise verabreicht: Nach Einführung des Speculums in die Vagina werden 200 μl Cellulosegel mit oder ohne SNP durch eine ca. 100 mm lange abgestumpfte Nadel in den zervikalen Kanal injiziert. Ein Teil des Gels bewegt sich entlang des Kanals, um sich im Innern der Cervix uteri abzuscheiden. Das Gel hat die folgende Formulierung: Das Gel umfasst die erfindungsgemäßen Verbindungen in PBS (phosphatgepufferte Saline, siehe L. HUDSON und F. C: HAY (1980) Practical Immunology, Oxford, 2. Auflage) mit 3% (w/v) Hydroxylethylcellulose.
Die Kontrollgruppe erhält ein Gel, das 3% (w/v) Hydroxylethylcellulose in PBS umfasst.
Die mechanischen Eigenschaften der Zervix werden mittels des oben beschriebenen Verfahrens gemessen, das die Quantifizierung der zervikalen Dehnbarkeit und der Dilatation der Cervix uteri unter gleichen Messbedingungen ermöglicht.
(d) Ergebnisse:
Die Ergebnisse aus Beispiel 1 sind in 1 gezeigt. Die obere Tafel zeigt die Steigungen der Regressionslinie, die ein Parameter für die Dehnbarkeit der Zervix ist. Die untere Tafel zeigt die anfängliche Dilatation der Zervix in mm.
Die Ergebnisse zeigen, dass der NO-Donor Natriumnitroprussid (SNP) nach lokaler Verabreichung in Gel die zervikale Reifung in schwangeren Meerschweinchen dramatisch erhöht.
Beispiel 2
Einflüsse von Natriumnitroprussid (SNP) auf die Morphologie der Zervix von schwangeren Meerschweinchen
SNP (0,1 M) wurde intrazervikal in 0,2 ml PBS-Puffer enthaltend 3% Hydroxycellulose zweimal an den Tagen (d) 42–43 post coitum (p. c.) verabreicht und die Einflüsse wurden am Tag 44 p. c. durch morphologische Auswertung untersucht. Die Kontrolltiere wurden mit dem Trägermittel behandelt. Sämtliche Cervices, die für die morphologische Untersuchung verwendet werden, wurden nach in situ-Fixierung durch vaskuläre Perfusion erhalten. Das Perfusionsverfahren wurde am Tag 50 p. c. zwischen 9–10 Uhr unter Narkose mit 1,5 ml Pentobarbital i. m. (60 mg/ml) durchgeführt. Eine Kanüle wurde in die abdominale Aorta neben der Verzweigung der Nierenarterien implantiert; die Tiere wurden mit Cacodylatpuffer, pH 7,4, für 60–90 sec durchspült und anschließend mit 2,5% Glutaraledhyd in Cacodylatpuffer, pH 7,4, für 6–10 min bei einem Druck von 80–100 cm H₂O fixiert. Die Cervices wurden herausgeschnitten und von angrenzendem Gewebe freipräpariert und in dem gleichen Fixiermittel bei 4°C fixiert. Nachdem mit Puffer gewaschen wurde, wurde das Material 2 h in kaltem Cacodylat gepuffertem 1%-igem OsO₄ nachfixiert, in abgestuften Serien dehydriert und in Aralditepoxyharz eingebettet. Querlaufende, halbdünne Untersuchungsschnitte von 1–2 μm Dicke wurden aus jedem dieser Proben geschnitten und mit 1%igem Toluidinblau in Natriumborat eingefärbt, um mittels eines Lichtmikroskops untersucht zu werden. Dies ermöglichte es, die gesamte Zervix zu untersuchen und dabei einen Überblick der Verteilung von verschiedenen Zellpopulationen in der Zervix zu erhalten. Danach wurden kleine Proben (1–2 mm³) aus dem querverlaufenden Zervixblock herausgeschnitten und ultradünne Schnitte wurden mit Glas- oder Diamantmessern auf einem Reichert OmU3-Mikrotrom präpariert und auf Formvar-beschichtete Kupfergrids mit einer Aussparung gebracht. Diese wurden mit Uranylacetat und Bleicitrat angefärbt und mit einem ZeissEM-10 Elektronenmikroskop bei 60–80 kW untersucht.
Eine elektronenmikroskopische Studie ergab eine ausgeprägte zervikale Reifung, begleitet von dem Zerfall von Collagenfasern, Bindegewebsödem, artierieller Dilatation und der Infiltration von Makrophagen, Lymphozyten und Granulozyten. Zahlreiche Mastzellen waren ebenfalls vorhanden. Die morphologischen Einflüsse von SNP waren vergleichbar mit denen, die während normaler zervikaler Reifung zum Termin oder nach Behandlung mit dem Antiprogestin Onapriston oder dem Cytokin IL-8 beobachtet wurden.
Beispiel 3
Einflüsse von L-NAME auf die Cervix uteri in schwangeren Meerschweinchen Schwangere Meerschweinchene wurden mit L-NAME (12,5 mg/Tag/Tier s. c.) an den Tagen 48 und 49 p. c. behandelt. Die zervikale Dehnbarkeit und Dilatation wurden am Tag 50 p. c. gemessen, d. h. zwei Tage nach dem Beginn der Behandlung. Die Messung wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Die Ergebnisse von Beispiel 3 sind in 2 gezeigt. Sowohl die anfängliche Dilatation als auch die zervikale Dehnbarkeit (Anstieg der Steigung) verringerten sich im Vergleich mit der Kontrollgruppe.
Beispiel 4
Auswirkungen von L-NAME auf die Geburt in schwangeren Meerschweinchen Osmotische Minipumpen mit L-NAME (Gruppe 1: 7 mg; Gruppe 2: 12,5 und Gruppe 3: 25 mg/Tier/Tag) wurden am Tag 50 p. c. subkutan implantiert (Termin ist Tag 67+2 p. c.). Die Kontrollgruppe wurde mit dem Trägermittel behandelt:
Alle Tiere (5/5) der Gruppe 3 und 3/5 der Gruppe 2 setzten frühzeitig (vor Tag 65 p. c.) innerhalb von 8 Tagen Behandlung frei.
Diese Studie zeigt, dass L-NAME frühzeitige Geburt bei Meerschweinchen durch die Aktivierung von Uteruskontraktionen induziert. Allerdings wurden verlängerte Freisetzungen, die mehrere Stunden dauerten, bei Tieren beobachtet, die mit L-NAME behandelt worden sind. Diese Beobachtung ist eine indirekte Indikation mangelhafter zervikaler Reifung, was in einem getrennten Experiment gezeigt wurde, das am Tag 50 p. c. durchgeführt wurde, indem die Dehnbarkeit der Zervix gemessen wurde (2).
Beispiel 5
Auswirkungen von L-NAME auf die Geburt in Ratten
6, die auf einem ähnlichen Experiment basiert wie das in Beispiel 4 beschriebene, zeigt, dass während der Behandlung von schwangeren Ratten mit L-NAME-(50 mg/Tag) die Dauer der Freisetzung und das Wurfintervall, d. h. die Zeit zwischen der Geburt der einzelnen Würfe, deutlich erhöht ist. Das zeigt deutlich, dass Stickoxidinhibitoren zervikale Reifung bei Ratten verhindern.
Beispiel 6
Stickoxidproduktion in der Ratte während normaler zervikaler Dilatation, nach Progesteron-, Antiprogestin- und LPS-Behandlung
(a) Verfahren
Die Stickoxid generierende Aktivität, die in vitro als Gesamtnitritanreicherung in zervikalem und uteralem Geweben gemessen wurde, wurde geschätzt mittels eines Verfahrens, beschrieben bei Yallampalli C, Garfield RE, Byam-Smith M (1993. Nitric Oxide inhibits uterine contractility during pregnancy but not during delivery, Endocrinology 133:1899–1902 [Stickoxid inhibiert Uteruskontraktilität während der Schwangerschaft, allerdings nicht während der Freisetzung]. Kurz gesagt werden kleine Stücke zervikalen oder uteralem Gewebes, das von freisetzenden Ratten (Tag 22–23 der Schwangerschaft), Onapriston-behandelten (10 mg/Tag 18 p. c., s. c.) und mit Trägermittel behandelten Ratten (Kontrolle) an den Tagen 18–21 p. c. erhalten wird, in minimal essentiellem Medium (MEM) mit L-Arginin mit oder ohne L-NAME für 24 h bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde auf Gesamtnitrit mittels Griess-Reagenz untersucht.
(b) Ergebnisse
Nitritproduktion im Uterus(myometrial)-Gewebe: Die Produktion verringert sich deutlich in den Uterusproben, die von freisetzenden Tieren erhalten werden verglichen mit denen am Tag 18 der Schwangerschaft (Yallampalli et al., dort zitiert).
Nitritproduktion in dem zervikalen Gewebe (7): es gibt einen signifikanten Anstieg bei der NO-Produktion in der Zervix, die von freisetzenden Tieren erhalten wird verglichen mit der, die von schwangeren Ratten an den Tagen 18–22 p. c erhalten wird.
Auswirkung von Onapriston auf die NO-Produktion in der Cervix uteri (8): es gibt einen signifikanten Anstieg in zervikaler NO-Produktion bis zu einem Grad, der bei spontan freisetzenden Tieren beobachtet wird, verglichen mit der Kontrollgruppe am Tag 19 p. c.
Beispiel 7
Prä-Einleitung von zervikaler Reifung mit einem Stickoxiddonor
Einer schwangeren Frau (ca. 30 Jahre, 50–80 kg), die für die Einleitung der Wehen wegen Präeklampsie vorgesehen war, wurde in der 38. Schwangerschaftswoche, Natriumnitroprussid in einer Konzentration von 0,01–0,1 mM in Gel intrazervikal zweimal am Tag verabreicht, um zervikale Reifung zu erzielen. Einleitung der Wehen wird am nächsten Tag mittels Infusion von Oxytocin i. v. durchgeführt.
Beispiel 8
Behandlung von zervikaler Insuffizienz mit einer lokalen Verabreichung von L-NAME Einer schwangeren Frau (ca. 30 Jahre, 50–80 kg) in der 26. Schwangerschaftswoche, bei der sich Anzeichen von zervikaler Insuffizienz (zervikaler Dilatation, Erweichen der Zervix) andeuteten, wurde L-NAME in Gel intrazervikal oder intravaginal in einer Konzentration von 0,1–50 mg/ml in zwei bis drei Dosen pro Tag verabreicht, bis sich die Symptome der zervikalen Insuffizienz verbesserten.

Claims

Verwendung mindestens eines Stickstoffoxid Donors und/oder Substrats zur Herstellung eines Medikaments für die Einleitung der Reifung der Cervix, das lokal intracervikal oder intravaginal verabreicht werden kann.
Verwendung nach Anspruch 1 in Kombination mit wenigstens einem aus einem Antiprogestin, einem Prostaglandin und/oder einem Zytokin.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Geburtseinleitung.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3 zur Einleitung von Wehen im Zusammenhang mit einer pathologischen Schwangerschaft.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3 zur Einleitung von Wehen im Zusammenhang mit intrauteriner Todgeburt.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3 zur Einleitung eines Aborts.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3 zur Einleitung vorzeitiger Wehentätigkeit.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3 zur Behandlung von anhaltender Wehentätigkeit.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3 zur Einleitung der Reifung der Cervix einer nicht schwangeren Frau oder einer schwangeren Frau, um einen chirurgischen oder diagnostischen Eingriff zu unterstützen.
Verwendung nach Anspruch 2 oder 3 zur Einleitung der Reifung der Cervix bei einer Frau, die in vitro befruchtet werden soll.
Verwendung mindestens eines aus L-Arginin, Natriumnitroprussid, Nitroglycerin, Glycerintrinitrat, SIN-1, Isosorbidmononitrat, Isosorbiddinitrat nach Anspruch 2 als Stickstoffoxid Substrat und/oder Donor.
Verwendung von mindestens einem aus Onapriston(11β-[4-(dimethylamino)phenyl]-17α-hydroxy-17β-(3-hydroxypropyl)-13α-estra-4,9-dien-3-on), RU 486 (11β-[4-(dimetyhlamino)phenyl]-17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)estra-4,9-dien-3-on, (Z)-11β-[4-(Dimetyhiamino)phenyl]-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxy-1-propinyl)estra-4-en-3-on ( EPA 0 404 283 ), 11β-(4-Acetylphenyl)-17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)estra-4,9-dien-3-on ( EP-A 0 190 759 ), 4',5'-Dihydro-11β-[4-dimethylamino)phenyl]6β-methylspiro[estra-4,9-dien-17β,2'(3'H)-furan]-3-on, 4',5'-Dihydro-11β-[4-dimethyl-amino)phenyl]7β-methylspiro[estra-4,9-dien-17β,2'(3'H)-furan]-3-on, 11β-(4-Acetyl-phenyl)-19,24-dinor-17,23-epoxy-17α-chola-4,9,20-trien-3-on, (E)-11β-[4-[[Acetylyoxi]imino]methyl] phenyl]-17β-methoxy-17α-(methoxymethyl)estra-4,9-dien-3-on, (E)-11β-[4-[[Ethoxycarbonyl)oxi]imino]methyl]phenyl]-17β-methoxy-17α-(methoxy-methyl)estra-4,9-dien-3-on als Antiprogestin nach Anspruch 2.
Verwendung von PGE₂ oder Gemeprost als Prostaglandin nach Anspruch 2.
Verwendung von Interleukin-8 oder Interleukin-1β als Zytokin nach Anspruch 2.