PL163447B1

PL163447B1 - Sposób wytwarzania makrocyklicznych zwiazków PL PL

Info

Publication number: PL163447B1
Application number: PL89281336A
Authority: PL
Inventors: Norbert Bedorf; Bettina Boehlendorf; Edgar Forsche; Klaus Gerth; Gerhard Hoefle; Herbert Irschik; Rolf Jansen; Brigitte Kunze; Hans Reichenbach; Florenz Sasse; Heinrich Steinmetz; Wolfram Trowitzsch-Kienast; Johannes P Pachlatko
Original assignee: Ciba Geigy Ag; F Biotechnologische Forschung
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1989-09-08
Publication date: 1994-03-31
Also published as: NO893623L; NZ230596A; IL91557A0; HU209950B; KR900004939A; CA1330203C; FI894211A; NO893623D0; PT91661B; EP0358606A3; FI894211A0; PT91661A; BR8904506A; AU629568B2; NO175826B; HUT53792A; JPH02200197A; AU4119489A; CZ517789A3; EP0358606A2

Abstract

I. Sposób wytwarzania makrocyklicznych zwiaz ków o wzorze 1, w którym wystepuje R1 = O C H 3; R2, R3 i A = CH 3; R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiazanie podwójne w polozeniu A 9, 10 (zwiazek A); albo R1 = OH; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H (zwiazek B); albo R1 = OH; R2, R3 i A = C H 3; R 4, R5, B, X i Y = H; oraz wiazanie podwójne w polozeniu ? 9,10 (zwiazek C);albo R 1 = OH; R2 i R 3 = C H 3; R 4, R 5, A, B, X i Y = H (zwiazek D); albo R 1 = OCH3; R 2, R 3 i A = CH3; R4, R 5, B i Y = H, H = OH (zwiazek E); albo R1 = O C H 3; R2, R3 i A = CH3; R 4, R 5, B, X i Y = H (zwiazek F); albo R1 = OCH3; R2 i A = C H 3; R3, R 4, R 5i B i X = H, Y = O H ; oraz wiazanie podwójne w polozeniu A 8, 9 (zwiazek H); albo R 1 = O C H 3; R 3 i A = C H 3; R 2, R4i R5, B, X i Y = H (zwiazek J); albo R 1 = O H ; R2, R 3 i A = C H 3; R 4, R 5, B i Y = H, X = O H (zwiazek M); albo R , = O H ; R 2, R 3 i A = CH3; R4, R5, B i X = H, Y = O C H 3; oraz wiazanie podwójne w polozeniu ? 9,10 (zwiazek N); albo R 1 = O C H 3; R 2 i R 3 = C H 3; R 4, R 5, A, B, X i Y = H (zwiazek Q); albo R 1 = OH; R2 = CH3; R3, R4, R5, A, B, X i Y = H (zwiazek R); albo R1 = OH; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiazanie podwójne w poloze niu ? 9,10 (zwiazek S); albo R1 = OH; R2 i A = CH 3; R3, R4, R5, B, X i Y = H (zwiazek T); albo R1 = OCH3; R2, R3 i A = CH3; R4 = OH; R5, B, X i Y = H; oraz wiazanie podwójne w polozeniu A 9, 10 (zwiazek U); albo R1 = OCH3; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; ... Wzór 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania makrocyklicznych związków o wzorze 1. Te makrocykliczne substancje czynne nadają się do zwalczania i zapobiegania chorobom roślin.

We wzorze 1 makrocykliczny pierścień jest albo nasycony albo wedle wyboru w położeniu - 8, w położeniu - 9, 10 lub w położeniu - 14, 15 zawiera wiązanie podwójne. I tak we wzorze 1 występuje R1 = OCH3; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu A 9, I0 (związek A); albo Ri=OH; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H (związek B); albo Ri = OH; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu A 9, I0 (związek C); albo Ri = OH; R2 i R3 = CH3; R4, R5, A, B, X i Y = H (związek D); albo R1 = OCH3; R2, R5 i A = CH3; R4, R5, B i Y = H, X = OH (związek E); albo R1 = OCH3; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H (związek F); albo Ri = OCH3; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B i X = H, Y = OH; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 8,9 (związek H); albo Ri = OCH3; R 3 i A = CH3; R2, R4, R5, B, X i Y = H (związek J); albo Ri = OH; R2, R 3 i A = CH3; R4, R5, B i Y = H, X = OH (związek M); albo Ri=OH; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B i X = H, Y = OCH3; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9,10 (związek N); albo Ri = OCH3; R2 i R 3 = CH3; R4, R5, A, B, X i Y = H (związek Q); albo R i = OH; R2 = CH3; R3, R4, R5, A, B, X i Y = H (związek R); albo Ri = OH; R 2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, I0 (związek S); albo R i = OH; R2 i A = CH3; R3, R 4, R5, B, X i Y = H (związek T); albo Ri = OCH3; R2, R3 i A = CH3; R4 = OH; R₅, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, I0 (związek U); albo Ri =OCH3; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9,10 (związek V); albo R i = OH; R 2, R 3 i A = CH3; R5 = OH; R4, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu A 9, (związek X); albo Ri = O; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B i Y = H; X = OH (związek Y); albo Ri = OCH3; R2 i A = CH3; R4 = OH; R3, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek Z); albo Ri = OCH3; R2, R 3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, I0 (związek β); albo Ri = OH; R2, R3 i A = CH3; R4, R5 i B = H; oraz grupę 9, 10-epoksy (związek γ); albo Ri = OH; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne A 9, 10 (związek δ); albo Ri = OH; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, X i Y = H; B = OH; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9,10 (związek ζ); albo Ri = OH; R2, R3 i A = CH3; R 4 = OH; R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek n); albo Ri =OH; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek κ); albo Ri = OCH3; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B i X = H; Y = OH (związek μ); albo Ri = OH; R2, R 3 i A = CH3; R4, R5, B i Y = H; X = OH; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 14, 15 (związek v); albo Ri = OH; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9,10 (związek ζ); albo Ri =OCH3; R2, R3 i A = CH3; R4 = OH; R5, B, X i Y = H, oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek u); albo Ri = OH; R 2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek π); albo Ri = OH; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B i Y = H; X = OH (związek p); albo Ri = OCH3; R2, R5 i A = CH3; R 4 = OH; R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek δ).

Te 32 związki uzyskuje się drogą mikrobiologicznego hodowania śluzowych bakterii z grupy Sorangium/Polyangium, przez które są one, w zależności od danego szczepu, wytwarzane całkowicie lub częściowo i w różnych liczbach stosunkowych. Wspólnym dla wszystkich szczepów jest wytwarzanie związku A jako jednego z produktów głównych. Związki o wzorze 1 tu i następnie nazywa się „Soraphenami“, przeto więc związki z poprzedniego zestawienia oznacza się nazwami od „Soraphen A“ do „Soraphen δ.

W sposobie wykorzystuje się, zwłaszcza 6 nowych szczepów mikroorganicznych szczepów bakterii śluzowych, rozkładających celulozę, z grupy Sorangium/Polyangium, które można, jak wiadomo, często znajdować w próbkach gleby, materiałach roślinnych lub w nawozie zwierzęcym.

163 447

Charakterystyczną dla tej taksonomicznie nie całkiem wiążąco zestawionej grupy jest jej zdolność rozwijania się na celulozie lub na produktach rozkładu celulozy jako jedynym źródle węgla. Tych 6 nowych szczepów, obojętnie, czy ściśle biorąc należą one do grupy Sorangium/Polyangium, czy tylko do taksonomicznie pokrewnej jednostki, wyróżnia się wobec zdecydowanej większości przedstawicieli tej grupy nadto tym, że wytwarzają one co najmniej jeden z poprzednio wspomnianych „Soraphenów“ o wzorze 1, a korzystnie co najmniej 2 „Sorapheny“, wśród nich zaś „Soraphen A“. Tych 6 szczepów tu i następnie nosi zbiorczą nazwę Sorangium/Polyangium/cellulosum. Pochodzą one z próbek glebowych, które w różnym czasie zebrano w różnych miejscach Europy, Afryki lub St. Zjedn. Am. Zgodnie z Umową Budapesztańską złożono je w międzynarodowej kolekcji Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) w Brunświku, Republika Federalna Niemiec.

1) Sorangium(Polyangium)cellulosum szczep „So ce 139“, wyodrębniony w maju 1986 r. z próbki glebowej, zebranej na jesieni 1982 r w Fort Huachaca, Arizona,, St. Zjedn. Am. Numer zdeponowania: DSM 5397. Dzień zdeponowania: 2 czerwca 1989 r.

2) Sorangium(Polyangium)cellulosum szczep „So ce 170“, wyodrębniony w kwietniu 1987 r z zebranej w maju 1981 r próbki glebowej z wyspy Delos, Grecja. Numer zdeponowania: DSM 4795. Dzień zdeponowania: 2 września 1988 r.

3) Sorangium(Polyangium)cellulosum szczep „So ce 191“, wyodrębniony w sierpniu 1987 r zebranej w lutym 1987 r próbki glebowej z wyspy Madera, Portugalia. Numer zdeponowania: DSM 4796. Dzień zdeponowania: 2 września 1988 r.

4) Sorangium(Polyangium)cellulosum szczep „So ce 192“, wyodrębniony w sierpniu 1987 r z zebranej w marcu 1987 r próbki glebowej w Nigerii. Numer zdeponowania: DSM 4797. Dzień zdeponowania: 2 września 1988 r.

5) Sorangium(Polyangium)cellulosum szczep „So ce 231“, wyodrębniony w kwietniu 1988 r. z zebranej w kwietniu 1987 r. próbki glebowej z Didyma, Turcja. Numer zdeponowania: DSM 5393. Dzień zdeponowania: 2 czerwca 1989 r.

6) SorangIum(Polyangium)cellulosum szczep „So ce 242“, wyodrębniony w październiku 1988 r zebranej w kwietniu 1988 r próbki glebowej z Pozzuoli, Włochy. Numer zdeponowania: DSM 5414. Dzień zdeponowania: 19 czerwca 1989 r.

W następnej części tekstu dla tych szczepów stosuje się nazwę Sorangium cellulosum.

Sposób wytwarzania „Soraphenu“ o wzorze 1 polega według wynalazku na tym, że w odpowiedniej pożywce prowadzi się aerobową hodowlę wedle wyboru szczepu Sorangium cellulosum „So ce 26“, „So ce 139“, „So ce 170“, „So ce 191“, „So ce 192“, „So ce 231“ lub „So ce 242“, albo kultury dającej się wyprowadzić z tych szczepów, np. dającego się z nich wyprowadzić z tych szczepów, np. dającego się z nich wyprowadzić klonu, mutanta, itd., i na życzenie prowadzi się następne rozdzielanie otrzymanych związków o wzorze 1, pod warunkiem, że szczepu „So ce 26“ (NCIB 12411) nie stosuje się do uzyskiwania związków A i B o wzorze 1.

W europejskim zgłoszeniu patentowym EP-A nr 282455 omawia się mikroorganizm Sorangium cellulosum „So ce 26“, którego fermentacja dostarcza omówionych wyżej Soraphenów A i B. Wynalazek nie rozciąga się na te oba preparaty i ich pojedyncze stosowanie w środkach.

Wynalazek dotyczy wytwarzania dalszych cennych fitomikrobójczych produktów fermentacji, produkowanych przez mikroorganizm „So ce 26“ (Numer zdeponowania: NCIB 12411) i/lub przez wspomniane mikroorganizmy „So ce 139“, „So ce 17(3“, „So ce 191“, „So ce 192“, „So ce 231“ lub „So ce 242“.

Niżej omówiono ogólne warunki postępowania dla hodowania tych 6 szczepów produkcyjnych.

Szczepy Sorangium cellulosum można w odpowiednich pożywkach hodować znanymi metodami biologicznymi, np. w kulturach wstrząsanych lub w fermentorach. Z reguły fermentację prowadzi się w temperaturze 10-40°C, korzystnie 10--5°C, a szczególnie korzystnie w temperaturze około 30-32°C, przy wartości pH = 6-8, korzystnie pH = 7,4. Proces ten przebiega aerobowo i w warunkach jałowych.

Skład pożywki można zmieniać w szerokim zakresie. Dla zasadniczo przyswajanych składników pokarmowych muszą być obecne: źródło węgla i źródło azotu oraz źródło mineralnych soli nieorganicznych, obejmujących P, S, Mg, K, Fe, Ca.

163 447

Procesy fermentacji jako źródło-C wykorzystują glukozę, skrobię i celulozę oraz ich produkty rozkładu (np. celobiozę), a nadto też dwusacharydy, glicerynę, kwas octowy i inne. Jako źródło-N odpowiednie są np. NH 4, NO 3 lub też peptony. Związek organiczny jako źródło-N z reguły nie może być równocześnie jednym źródlem-C i źródłem energii podczas fermentacji.

Jako sole mineralne wchodzą w rachubę chlorki, azotany, siarczany, węglany i fosforany pierwiastków: Na, K, NH4, Mg, Fe i Ca, nadto obecne mogą być Cu, Mn, Mo, Zn, Co i inne jako pierwiastki śladowe. O ile jest to możliwe, to sole takie mogą też występować związane z kwasem etyienodwuaminoczterooctowym (EDTA).

Kulturę mikroorganizmów wprowadza się do kultury wstrząsanej lub do fermentora w ilości zaszczepowej 0,1-20%, korzystnie 0,5-10%, a szczególnie korzystnie 0,5-5% (objętościowo/objętościowych). Hodowlę prowadzi się w temperaturze około 30°C w ciągu około 2-7 dni, wielkoobjętościowe szarże zaś rzadziej w ciągu do 10 dni lub dłużej. Dla wielkoobjętościowych szarż celowo najpierw fermentuje się mniejsze kultury wstępne. Stosowanie szczepów Sorangium cellulosum jest również możliwe w postaci unieruchomionej, np. w postaci nośnikowo utrwalonych komórek na alginianie.

Jako dający się wyprowadzić (pochodny) klon należy w powyższym sensie rozumieć każdą kulturę, która jeszcze wykazuje cechy zdeponowanego klonu istotne dla przeprowadzania sposobu według wynalazku, zwłaszcza należy rozumieć taką kulturę, której mikroorganizmy zawierają takie same geny strukturalne, jak przyczyniające się do tworzenia związku o wzorze 1 geny strukturalne szczepów „So ce 139“, „So ce 170“, „So ce 191“,„Soce 192“,„So ce 231“ i „So ce 242“. Jako dający się wyprowadzić klon służy też każda kultura, której mikroorganizmy zawierają możliwy z powodu degeneracji kodu genetycznego równoważnik przyczyniających się do tworzenia związku o wzorze 1 genów strukturalnych tych 4 szczepów. Jako dający się wyprowadzić (pochodny) klon uważa się zwłaszcza każdą kulturę, która zawiera rozkładające celulozę bakterie śluzowe, korzystnie z rodzaju Sorangium cellulosum, zdolne do wytwarzania związku o wzorze 1. Pojęcie „dający się wyprowadzić klon“ szczepów DSN 5397, DSM 4795, DSM 4796, DSM 4797, DSM 5395 i DSM 5414 obejmuje też wszystkie mutanty lub rekombinanty, które są zdolne do wytwarzania związku o wzorze 1.

Hodowanie następuje aerobowo, a więc np. w spoczynkowej kulturze powierzchniowej albo korzystnie wgłębnie w warunkach wstrząsania lub mieszania z powietrzem lub tlenem w kulturach wstrząsanych lub w fermentorach. Korzystnie hodowlę prowadzi się stopniowo, tzn. najpierw w ciekłej pożywce wytwarza się jedną lub wiele kultur wstępnych, którymi następnie, np. w stosunku 1:20, zaszczepia się właściwą pożywkę roboczą.

Oddzielanie „Soraphenu“ następuje na drodze fizykochemicznej za pomocą znanych metod rozdzielania, takich jak filtrowanie, w szczególności jednak ekstrakcja rozpuszczalnikowa, i chromatografia, przede wszystkim zaś chromatografia adsorpcyjna i podziałowa, oraz ewentualnie krystalizacja.

Z wodnej brzeczki fermentacyjnej można związki o wzorze 1 ekstrahować lipofilowymi rozpuszczalnikami organicznymi, np. ketonami, takimi jak metyloetyloketon lub cykloheksanon, alkoholami o średniej długości łańcucha, takimi jak izobutanol, pentanol lub heksanol, octanami C-1-Cg-alkiiowymi (octan etylowy, octan propylowy, octan butylowy, octan izobutylowy i inne), toluenem, dwuchlorometanem, 1,2-ciwuchloroetanem, chlorobenzenem, dwuchlorobenzenem i innymi.

Z odsączonego placka filtracyjnego można związki te łatwo ekstrahować alkoholami lub ketonami (np. metanolem, etanolem, acetonem, metyloetyloketonem).

Z danego ekstraktu można następnie drogą zatężania i/lub strącania uzyskiwać związki o wzorze 1, które można drogą frakcjonowanej krystalizacji lub innych chromatograficznych metod rozdziału rozdzielać na Sorapheny od A do p (Ro).

Korzystnie zakończa się proces fermentacyjny w celu uzyskiwania związków o wzorze 1 dodatkiem żywicy adsorpcyjnej, przez którą żądane produkty są pobierane, albo fermentację tę od początku przeprowadza się w obecności takiej żywicy adsorpcyjnej. Jako żywice adsorpcyjne wchodzą w rachubę przede wszystkim obojętne organiczne substancje polimeryczne, zwłaszcza zaś niejonowe hydrofobowe żywice adsorpcyjne, które są odpowiednie do ekstrakcji lipofilowej. Na żywicy tej związek o wzorze 1 zostaje związany niemal ilościowo. Przykładami takich żywic są półpolarne żywice akrylanowe, niepolarne żywice polistyrenodwuwinylobenzenowe, a zwłaszcza

163 447 usieciowany polistyren. Takie żywice dodaje się w ilości 0,1-5% (objętościowo/objętościowych) objętości fermentacyjnej, korzystnie 0,5-2% (objętościowo/objętościowych). W rachubę wchodzi też węgiel aktywny. Szczególnie korzystnymi pod względem technicznym są żywice polistyrenowe, takie jak XAD-1180 lub XAD-16 (producent: Rohm and Haas), które występują w postaci zdatnej do filtrowania (ziarna lub granulaty). Po zakończeniu tej fermentacji żywicę odfiltrowuje się, przemywa wodą i traktuje metanolem lub etanolem. Ekstrakt alkoholowy zatęża się. Dodając eter etylowy, octan etylowy lub octan butylowy można oddzielić wykrystalizowujący w znacznym stopniu związek 1A (= Soraphen A). Przesącz chromatograficznie oczyszcza się w celu uzyskania pozostałej ilości Soraphenu A, przede wszystkim zaś w celu uzyskania pozostałych ilości Soraphenu od B do σ (Sigma).

Sposobem według wynalazku wytwarza się związki o wzorze 1 w czystej postaci krystalicznej. Sposobem tym wytwarza się jednak też biomasy, ekstrakty surowe lub żywice adsorpcyjne po fermentacji, które zawierają związek o wzorze 1 i w niezmienionej lub w dalej przetworzonej postaci, np. preparatu, mogą być stosowane do zwalczania chorób roślin. Biomasy można również w postaci zmielonych lub prasowanych substancji suchych („cake“) stosować dalej lub rozprowadzać w handlu.

Omówiony sposób wytwarzania jest włącznie z wszystkimi etapami cząstkowymi objęty wynalazkiem.

W szczególności wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania Soraphenu o wzorze 1, polegającego na tym, że w wodnej, źródło węgla i źródło azotu oraz sole nieorganiczne zawierającej pożywce aeorobowo hoduje się jeden ze szczepów Sorangium cellulosum „So ce 139“, „So ce 170“, „So ce 191“, „So ce 192“, „So ce 231“ i „So ce 242“ albo mikroorganizm, który zawiera takie same geny strukturalne, jak przyczyniające się do tworzenia Soraphenu geny strukturalne wspomnianych szczepów i wyodrębnia się Sorapheny o wzorze 1.

Przede wszystkim wynalazek dotyczy postaci wykonania omówionego wyżej sposobu, wyróżniającej się tym, że hoduje się produkujący Soraphen mikroorganizm z grupy rozkładających celulozę bakterii śluzowych.

Korzystna postać wykonania omówionego wyżej sposobu wyróżnia się tym, że hoduje się jeden ze szczepów Sorangium cellulosum „Soce 139“, „So ce 170“, „Soce 191“, „So ce 192“, „So ce 231“, „So ce 242“ albo mutant tego szczepu, tworzący Soraphen.

Szczególnie korzystna postać wykonania omówionego wyżej sposobu odznacza się tym, że hoduje się jeden ze zgodnie z Umową Budapesztańską zdeponowych szczepów „So ce 139“, „So ce 191“, „So ce 192“, „So ce 231“, „So ce 242“.

Fermentację prowadzi się korzystnie w warunkach omówionych w części opisu, dotyczącej przykładów.

Mikroorganizmy, które zawierają takie same, do tworzenia Soraphenu przyczyniają się geny strukturalne, jak w tych 6 szczepach, można sztucznie stworzyć np. na drodze manipulacji genowej, polegającej na tym, że odpowiednie geny strukturalne wyodrębnia się z tych 6 szczepów i w odpowiednim miejscu wbudowuje się w materiał genowy innego odpowiedniego mikroorganizmu. Odpowiednimi mikroorganizmami są takie mikroorganizmy, w które nie tylko można wbudować geny strukturalne, lecz w których te geny strukturalne również podlegają ekspresji i w których utworzony Soraphen nie redegraduje się, lecz korzystnie wytrąca się do brzeczki fermentacyjnej. Takimi odpowiednimi mikroorganizmami są przede wszystkim inne szczepy bakterii śluzowych, zwłaszcza szczepy z rodzaju Sorangium cellulosum, o ile one jeszcze nie mają wyżej wspomnianych genów strukturalnych.

Produkujące Soraphen mutanty można wytwarzać działając promieniowaniem nadfioletowym lub rentgenowskim albo chemicznymi substancjami mutagennymi, takimi jak N-metylo-N'nitro-N-nitrozoguanidyna, i w znany sposób wyodrębniać drogą selekcji według ich specyficznych właściwości. Dalsze środki postępowania w celu wytworzenia mutantów i rekombinantów mikroorganizmu są znane i łatwe dla fachowca.

Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania produktu fermentacyjnego, zawierającego Soraphen w wykrywalnej ilości, który to sposób wyróżnia się tym, że w pożywce hoduje się jeden ze szczepów Sorangium cellulosum „So ce 139“, „So ce 170, „So ce 191“, „So ce 192“, „So ce 231“, „So ce 242¹¹ lub dający się z tych szczepów wyprowadzić klon i uzyskuje się Soraphen w odpowied163 447 niej postaci. Takie brzeczki hodowlane można w niezmienionej lub w stężonej postaci ewentualnie wobec dodatku dalszych nośników i/lub dyspergatorów stosować jako środki przeciwko fitopatogennym mikroorganizmom.

W ściślejszym ujęciu sposób ten wyróżnia się tym, że jeden z mikroorganizmów Sorangium cellulosum „So ce 139“, „So ce 170“, „So ce 191“, „So ce 192“,„So ce 231“,„So ce 242“ hoduje się w temperaturze 10-40°C, korzystnie w temperaturze 10-35°C, w obecności lub bez żywicy adsorpcyjnej w środowisku hodowlanym, zawierającym co najmniej po jednym przyswajalnym źródle-C i źródle-N oraz odpowiednie sole nieorganiczne, po czym brzeczkę hodowlaną względnie odfiltrowaną żywicę adsorpcyjną ekstrahuje się odpowiednią fazą rozpuszczalnikową, otrzymany roztwór zatęża się, a otrzymaną pozostałość na życzenie oczyszcza się drogą chromatografii i/lub przekrystalizowania.

Niżej omówiono kultury macierzyste i podano ich opis morfologiczny.

Kultury macierzyste utrzymuje się jako kultury płytkowe na agarze VY/2 (0,5% drożdży piekarniczych według wagi świeżej masy; 0,1% CaCk; 1,5% agaru; pH = 7,2) albo na bibule filtracyjnej ( = źródło celulozy) nad agarem ST21 (0,1% KNO 3; 0,1% MgSO4'7 H 2O; 0,1% CaCh; 0,1% K2HPO4; 0,01% MnSO4*7H2O; 0,02% FeCU; 0,002% ekstraktu drożdżowego; wzorcowy roztwór pierwiastków śladowych; 1% agaru). Płytki te inkubuje się w temperaturze 30°C. Wzorcowy roztwór pierwiastków śladowych zawiera 0,02-0,5 mg soli Mn, Mo, Cu, Co i/lub Zn w 1 litrze [R. Y. Stanier i współpracownicy, „General Microbiology“, wyd. 4, strona 36 (1976)], albo 500 mg EDTA, 300 mg FeSO4 · 7 H 2O, 3 mg MnCl₂ · 4 H 2O, 5 mg CoCl2 · 6 H 2O, 1 mg CuC12-2 H 2O, 2 mg NiCl2 · 6H 2O, 3 mg Na2MoO 4 · 2 H 20,5 mg ZnSO 4 · 7H 20,2 mg H 3BO 3 w 1 litrze wody destylowanej (pH około 4) [G. Drews, „Mikrobiolog., Praktikum“, wyd. 4, strona 11, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, Nowy Jork, Tokio 1983].

Na obu środkach organizmy tworzą kolonie rojowe, które powoli rozprzestrzeniają się po podłożu. W szczególności obserwuje się wyraźnie różnice między tymi 6 szczepami.

1) „So ce 139“ (DSM 5397): na bibule filtracyjnej nad agarem ST 21 pozostaje kolonia rojowa w znaczym stopniu ograniczona do bibuły filtracyjnej. W starszych kulturach pęka agar przy brzegu sączka, a rój i agar zwijają się. Bibuła filtracyjna całkowicie rozpada się, a zamiast niej znajduje się gęste pole czarnobrunatnych owocników. Składają się one z małych sporangioli o średnicy 15-30 μιη, które ze swej strony są upakowane od małych pakietów po rozległe niepodzielne masy. Komórki wegetatywne są smukłymi cylindrycznymi pręcikami z tępo zaokrąglonymi końcami i mierzą 0,7-0,9-2,5-4 y7m. W mikroskopie z kontrastem fazowym ukazują się one jako ciemne, często z jasnymi ziarnistościami na biegunach bakterii. Na agarze VY/2 tworzą się bardzo duże kolonie rojowe z bezbarwnymi po oranżowe promieniowymi żyłkami i wieloma czarnobrunatnymi owocnikami o podobnej budowie, jak wyżej opisano. Komórki drożdżowe pożywki zostają ledwie naruszone. Komórki wegetatywne wydają się nieco tęższe i są o 1 pm grubsze.

2) „So ce 170“ (DSM 4795): Na bibule filtracyjnej nad agarem ST 21 przedziera się rój daleko po sączku na powierzchnię agaru. Agar ten później pęka głęboko, a kolonia rojowa zwija się w kłębek. Na tej bibule filtracyjnej mogą rozwijać się owocniki: składają się one z małych grubościennych ciemnobrunatnych sporangioli o średnicy 20-30 pm, które są gęsto zbite w przeważnie ostro ograniczone, podłużne pakiety o średnicy około 50-200 pm. Miejscami mogą powstawać stykające się z sobą, rozległe skupienia owocników. Na agarze VY/2 tworzą się ledwo średniej wielkości, grubośluzowe, intensywnie oranżowo zabarwione kolonie rojowe o średnicy przeważnie 1-2 cm. Komórki drożdżowe rozkłada się powoli. Również tu agar miejscami pęka głęboko, tak więc rój może całkowicie wypaść z płytki. Na powierzchni agaru tworzą się często oranżowe, jasnobrunatne po ciemnobrunatne owocniki o podobnej budowie, jak wyżej podana. Komórki wegetatywne są tęższymi, w mikroskopie z kontrastem fazowym ciemnymi pręcikami o szeroko zaokrąglonych końcach i mierzą zwykle 0,8 - 1,0 X 2-5 pm. Szczep ten bardzo skutecznie rozkłada też chitynę.

3) „So ce 191“ (DSM 4796) rośnie na bibule filtracyjnej nad agarem ST 21, bez naruszania powierzchni agaru. Również w tym przypadku może agar naokoło bibuły filtracyjnej głębkowo popękać, a kolonie rojowe mogą się zwinąć w kłębek. Na agarze VY/2 rozwijają się duże roje o średnicy 6-8 cm z delikatnymi po mocne, promieniowymi żyłkami. Komórki drożdżowe zostają ledwo naruszone. Cylindrycze wegetatywne pręciki mają szeroko zaokrąglone końce, są w mikroskopie z kontrastem fazowym ciemne, często dość długie i mierzą przeważnie 0,7-0,9 X 3-8 pm.

163 447

Szczep ten w czystej kulturze w omówionych warunkach hodowlanych nie tworzy owocników. Szczep ten skutecznie rozkłada chitynę.

4) „So ce 192“ (DSM 4797) podczas hodowania na bibule filtracyjnej nad agarem ST 21 dalece rozprzestrzenia się po powierzchni agaru. Agar ten może głęboko popękać, kolonie rojowe zwijają się w kłębek. Na tej powierzchni agaru, zwłaszcza jednak na bibule filtracyjnej rozwija się wiele, świecąco oranżowo zabarwionych owocników, składających się z drobniutkich sporangioli o średnicy przeważnie 10-20 pm w ostro ograniczonych pakietach o długości przeważnie 50-500pm. Na agarze VY/2 rozwijają się średniej wielkości, silne roje o średnicy 2-3 cm, z promieniowymi żyłkami i wieloma intensywnie brunatnopomarańczowo zabarwionymi owocnikami w i na tym agarze o podobnej budowie, jak wyżej opisana. Wegetatywne komórki są cylindrycznymi ciemnymi pręcikami o szerokich końcach i mierzą przeważnie 0,7-0,9X 3-5 gm. Komórki drożdżowe nie rozkładają się, natomiast szczep ten bardzo skutecznie rozkłada chitynę.

5) „So ce 231“ (DSM 5393) w hodowlach na bibule filtracyjnej nad agarem ST 21 nie przechodzi na płytkę agarową. Agar może popękać przy brzegu sączka, jednakże kolonie nie zwijają się w kłębek. Bibuła filtracyjna rozkłada się całkowicie, na jej miejscu później znajduje się bardzo gęste pole intensywnie brunatnooranżowo zabarwionych owocników. Są one podobnie zbudowane, jak w przypadku innych szczepów, lecz sporangiole są często rozmieszczone w pasmach. Na agarze YV/2 rozwijają się bardzo duże roje z promieniowymi pękami delikatnych żyłek. Miejscami rozwijają się świecąco oranżowobrunatno zabarwione owocniki. Smukłe wegetatywne pręciki są bardzo delikatne i mierzą 0,6-0,8 X 2,5-6pm. Komórki drożdżowe podłoża pożywkowego ulegają powoli rozkładowi. Szczep ten bardzo skutecznie rozkłada chitynę.

6) „So ce 242“ (DSM 5414) przedziera się na bibule filtracyjnej nad agarem ST 21 na powierzchnię agaru i tworzy tam również owocniki. Agar ten głęboko pęka przy brzegu bibuły filtracyjnej. Bibuła filtracyjna całkowicie rozkłada się i zostaje zastąpiona przez gęstą masę z czarnobrunatno zabarwionych owocników. Sporangiole są w tym często rozmieszczone w łańcuchach. Na agarze VY/2 rozwijają się bardzo duże roje z delikatnymi promieniowymi żyłkami. Agar w obszarze toju w wielu miejscach pęka w kształcie szponu. Nadto powstają obficie owocniki. Komórki drożdżowe w podłożu rozkładają się powoli. Komórki wegetatywne mierzą 0,7-1,0 X 24 pm. Szczep ten jest bardzo skutecznym czynnikiem rozkładającym chitynę. Szczepy te wytwarzają substancję, które hamują wzrost licznych drożdży i grzybów strzępkowych. Pod względem chemicznym w przypadku tych substancji hamujących chodzi nie tylko o Sorapheny, których struktury, jak niżej podano, są już wyjśnione. Te mieszaniny związków makrocyklicznych typu Soraphenu pojawiają się w ciekłych kulturach w supernatancie hodowlanym, lecz mogą też być wyodrębnione z komórek. Wytwarzanie tych antybiotyków następuje w czasie od logarytmicznej aż po środek stacjonarnej fazy wzrostu.

Wszystkie 6 szczepów musi być adaptowanych do wzrostu w środowiskach ciekłych. Rosną one najpierw w postaci małych, stałych, oranżowo zabarwionych bulwek i dopiero po wielu zabiegach przenoszenia ze środowiska ciekłego do środowiska ciekłego tworzą bardziej lub mniej jednorodne zawiesiny komórkowe.

Szczepy „So ce 139“, „So ce 170“, „So ce 191“, „So ce 192“, „So ce 231“ i „So ce 242“ mają następującą charakterystykę biologiczną: rozkład celulozy: pozytywnie; rozkład glukozy: pozytywnie; rozkład skrobi: pozytywnie; NH4 jako źródło-N: pozytywnie; NO3 jako źródło-N: pozytywnie.

Supernatanty hodowlane (płyny znad osadu pohodowlanego) szczepów „So ce 139“, „So ce 170“, „So ce 191“, „So ce 231“ i „So ce 242“ hamują wzrost np. następujących organizmów:

drożdże:

Debaryomyces hansenii Nematospora coryli Candica albicans Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula glutinis Hansenula anomala Nadsonia fulvescnes Torulopsis glabrata Schizozaccharomyces pombe ocena:* silne ha^^v/^ne silne hamowanie slne hamowame średniosHne hamowame średniosHne hamowame średnóosUne hamowame brak hamowania brak hamowama brak hamowama;

163 447 grzyby strzępkowe: Alternaria solani Pythium debaryanum Mucor hiemalis Rhizopus arrhizus silne hamowanie silne hamowanie silne hamowanie słabe hamowanie.

^xWartości hamowania odnoszą się do przeciętnej szarży hodowlanej i należy je pojmować jako wartości relatywne wzajemnie.

Wynalazek dotyczy też wytwarzania Soraphenów od C do σ (Sigma) o wzorze 1 w czystej postaci. Wynalazek dotyczy jednak także wytwarzania biomas, ekstraktów surowych lub żywic adsorpcyjnych z fermentacji, które zawierają Sorapheny C - σ o wzorze 1 i mogą w niezmienionej lub w dalej przetworzonej postaci, np. do preparatu, być stosowane do zwalczania chorób roślin. Biomasy można też w postaci zmielonych lub sprasowanych substancji suchych („cake“) dalej stosować lub wprowadzać do handlu.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że związki o wzorze 1 wykazują bardzo korzystny zakres biobójczy przeciwko fitopatogennym mikroorganizmom, zwłaszcza przeciwko grzybom. Związki te wykazują bardzo korzystne kuracyjne, układowe i zwłaszcza prewencyjne właściwości, toteż mogą być stosowane do ochrony licznych roślin uprawnych. Za pomocą substancji czynnych o wzorze 1 można na roślinach lub na częściach roślin (owoce, kwiaty, ulistnienie, łodygi, kłęby, korzenie) z różnych upraw użytkowych tłumić lub niszczyć występujące szkodniki, przy czym nawet później wyrastające części roślin pozostają nie atakowane przez fitopatogenne organizmy.

Jako substancje mikrobobójcze są substancje czynne o wzorze 1 skuteczne np. przeciwko fitopatogennym grzybom należącym do następujących klas: Fungi imperfecti (np. zwłaszcza Botrytis, dalej Pyricularia, Heilminthosporium, Fusarium, Septoria, Cercospora i Alternaria); Basidiomycetes (np. Rhizoctonia, Hemileia, Puccinia). Działają one również przeciwko klasie Ascomycetes (np. zwłaszcza Venturia i Erysiphe, dalej Podosphaera, Monknia, Uncinula) i Oomycetes (np. Phytophthora, Plasmopara). Związki o wzorze 1 można nadto stosować jako zaprawy do traktowania materiału siewnego (owoce, kłęby, ziarna) i sadzonek w celu ochrony przed zakażeniami grzybami oraz przeciwko fitopatogennym grzybom występującym w glebie.

Nowe środki jako składową substancję czynną zawierającą jeden lub więcej Somphenów C-σ o wzorze 1, zwłaszcza są to środki chroniące rośliny, przeznaczone do stosowania w sektorze agarowym lub w pokrewnych dziedzinach.

Sposób traktowania roślin, odznacza się aplikowaniem nowych związków o nazwie Soraphen C-σ i o wzorze 1, bądź aplikowanie odpowiednich nowych środków.

Jako docelowe uprawy dla tu ujawnionego zastosowania chroniącego rośliny służą np. następujące gatunki roślin: zboża, takie jak pszenica, jęczmień, żyto, owies, ryż, kukurydza, sorgo i pokrewne; buraki, takie jak burak cukrowy i pastewny; drzewa ziarnkowe, drzewa pestkowe i krzewy jagodowe, takie jak jabłoniec, grusze, śliwy, brzoskwinie, migdałowce, wiśnie, truskawki, maliny i jeżyny; rośliny strączkowe, takie jak fasola, soczewica, groch, soja; słoneczniki, palmy kokosowe, rącznik, krzewy kakaowe i orzechy ziemne; dyniowate, takie jak dynia, ogórki i melony; uprawy włókniste, takie jak bawełna, len, konopie i juta; owoce cytrusowe, takie jak pomarańcze, cytryny, grapefruite i mandarynki; gatunki warzyw, takie jak szpinak, sałata głowiasta, szparagi, kapusty, marchew jadalna, cebula, pomidory, ziemniaki i papryka; uprawy korzenne, takie jak smaczliwka właściwa, cynamonowiec cejloński, cynamonowiec kamforowy; albo takie rośliny, jak tytoń, orzechy, kawa, ananas, trzcina cukrowa, herbata, pieprz, winorośl, chmiel, banany, drzewa kauczukodajne oraz rośliny ozdobne (Campositae). wyliczenie to nie stanowi ograniczenia.

Substancje czynne o wzorze 1 zwykle stosuje się w postaci preparatów, a można je aplikować wraz z dalszymi substancjami czynnymi równocześnie lub kolejno z dalszymi substancjami czynnymi na poddawane traktowaniu powierzchnie lub rośliny. Tymi dalszymi substancjami czynnymi mogą być zarówno nawozy sztuczne, środki wzbogacające w mikropierwiastki lub inne preparaty wywierające wpływ na wzrost roślin. Mogą to być również selektywne środki chwastobójcze oraz środki owadobójcze, grzybobójcze, bakteriobójcze, eicieeiobójcze, mięczakobójcze lub mieszaniny kilku tych środków, razem z ewentualnymi dalszymi w technice sporządzania preparatów

163 447 znanymi nośnikami, substancjami powierzchniowo czynnymi lub innymi dodatkami sprzyjającymi aplikowaniu preparatów.

Stosowane nośniki i dodatki mogą być substancjami stałymi lub ciekłymi i odpowiadają do tego celu w technice preparatywnej przewidzianym substancjom, takim jak naturalne lub regenerowane substancje mineralne, rozpuszczalniki, dyspergatory, zwilżacze, środki polepszające przyczepność, zagęszczacze, lepiszcza lub nawozy sztuczne.

Korzystnym sposobem rozprowadzania substancji czynnej o wzorze 1 lub środka agrochemicznego, zawierającego co najmniej jedną z tych substancji czynnych, jest nanoszenie na ulistnienie (aplikowanie na liściach). Częstotliwość aplikowań i ilości dawek dobiera się przy tym według parcia porażennego dla danego czynnika chorobotwórczego. Substancje czynne o wzorze 1 mogą także dochodzić do roślin poprzez glebę i przez układ korzeniowy (działanie układowe) w ten sposób, że siedlisko roślin nasyca się ciekłym preparatem albo substancje czynne o postaci stałej wprowadza się do gleby, np. w postaci granulatu (aplikowanie do gleby). Ten granulat lub odpowiedni proszek może być też suchą masą z otrzymanej z fermentora biomasy lub odsianą z brzeczki fermentacyjnej żywicą adsorpcyjną, obsadzoną substancjami czynnymi o wzorze 1. Związki o wzorze 1 można też nanosić na ziarna nasion (powlekanie) w ten sposób, że ziarna albo impregnuje się ciekłym preparatem substancji czynnej, albo powleka się je stałym preparatem.

Związki o wzorze 1 stosuje się przy tym w niezmienionej postaci lub korzystnie razem ze znanymi w technice preparatywnej środkami pomocniczymi i wówczas w znany sposób przetwarza się te związki np. do postaci koncentratów emulsyjnych, past do malowania, roztworów gotowych do bezpośredniego opryskiwania lub roztworów rozcieńczalnych, emulsji rozcieńczalnych, proszków zwilżalnych, proszków rozpuszczalnych, środków do opylania, granulatów lub przez kapslowanie np. w substancjach polimerycznych. Sposoby stosowania, takie jak opryskiwanie mgławicowe, rozpylanie mgławicowe, opylanie, rozsiewanie, malowanie lub polewanie, dobiera się tak, jak rodzaj środków, w zależności od zamierzonego celu i od podanych warunków. Korzystne dawki odpowiadają na ogół ilości 10g - 2 kg substancji czynnej na 1 ha, korzystnie 50-500 g substancji czynnej na 1 ha.

Preparaty, tzn. środki zawierające substancję czynną o wzorze 1 i ewentualnie stałą lub ciekłą substancję pomocniczą, sporządza się w znany sposób.

Jako rozpuszczalniki wchodzą w rachubę aromatycznie i alifatyczne węglowodory, takie jak mieszaniny ksylenu, cykloheksan lub parafiny, alkohole i glikole oraz ich etery i estry, takie jak etanol, glikol etylenowy, jednometylowy lub jednoetylowy eter glikolu etylenowego, ketony, takie jak cykloheksanon, rozpuszczalniki silnie polarne, takie jak N-metylopirolidon-2, sulfotlenek dwumetylowy lub dwumetyloformamid, oraz ewentualnie epoksydowane oleje roślinne, takie jak epoksydowany olej kokosowy lub olej sojowy oraz woda.

Jako stałe nośniki, np. do środków do opylania i do proszków dyspergowalnych, z reguły stosuje się mączki ze skał naturalnych, takich jak kalcyt, talk, kaolin, montmorylonit lub attapulgit. W celu polepszenia właściwości fizycznych można dodawać też krzemionkę wysokodyspersyyną lub wysokodyspersyjne polimery nasiąkliwe. Jako ziarnisty, adsorpcyjny nośnik granulatorowy wchodzą w rachubę typy porowate, np. pumeks, kruszonka ceglana, sepiolit lub bentonit, a jako niesorpcyjne substancje nośnikowe, np. kalcyt lub piasek. Ponadto można stosować cały szereg wstępnie zgranulowanych substancji pochodzenia nieorganicznego, takich jak zwłaszcza dolomit, albo rozdrobnione pozostałości roślinne.

Jako związki powierzchniowo czynne w zależności od przetwarzanej w preparat substancji czynnej o wzorze 1 wchodzą w rachubę niejonowe, kationowe i/lub anionowe tensydy o silnych właściwościach emulgujących, dyspergujących i zwiżających. Pod określeniem tensydy należy rozmieć także mieszaniny tensydów.

Odpowiednimi tensydami anionowymi mogą być zarówno tzw. mydła rozpuszczalne w wodzie, jak i w wodzie rozpuszczalne, syntetyczne związki powierzchniowo czynne. Częściej jednak stosuje się tzw. tensydy syntetyczne, zwłaszcza alkanosulfoniany, siarczany alkoholi tłuszczowych, sulfonowane pochodne benzimidazolu lub sulfoniany alkilowe.

Do niejonowych tensydów zaliczają się przede wszystkim pochodne eterów glikolu polietylenowego z alkoholami alifatycznymi lub cykloalifatycznymi, z nasyconymi lub nienasyconymi kwasami tłuszczowymi i alkilofenolami, zawierające 3-30 grup glikoloestrowych i 8-20 atomów

163 447 11 węgla w (alifatycznym) rodniku węglowodorowym i 6-18 atomów węgla w rodniku alkilowym alkilofenolu.

Jako przykład niejonowych tensydów należy podać nonylofenolopolietoksyetanole, etery oleju rącznikowego z glikolem polietylenowym, addukty polipropylenopolietylenotlenkowe, trójbutylofenoksypolietoksyetanol, glikol polietylenowy i oktylofenoksypolietoksyetanol. Dalej wchodzą w rachubę też estry kwasów tłuszczowych z polioksyetylenohydrosorbitem, takie jak trójoleinian polioksyetylenoanhydrosorbitu.

Tensydy rozpowszechnione w technice preparatywnej są omówione m. in. w następujących publikacjach: „Mc Cucheon's Detergents and Emulsifiers Annual“, wyd. MC Publishing Corp., Ridgewood New Jersey, 1980; Sisley and Wood, „Encyclopedia of Surface Active Agents“, wyd. Chemical Publishing Co., Inc. Nowy Jork, 1980.

Szczególnie korzystnymi, wspomagającymi aplikowanie dodatkami, mogącymi prowadzić do znacznego zmniejszenia dawek, są nadto naturalne (zwierzęce lub roślinne) albo syntetyczne fosfolipidy z szeregu kefaliny i lecytyny, takie jak fosfatydyloetanoloamina, fosfatydyloseryna, fosfatydylogliceryna lub lizolecytyna.

Preparaty agrochemiczne zawierają z reguły 0,1-95% substancji czynnej o wzorze 1, 99,9-5% stałego lub ciekłego dodatku i 0-25% substancji powierzchniowo czynnej.

Chociaż jako wyrób handlowy jest korzystny środek stężony, to jednak z reguły użytkownik ostateczny stosuje środki rozcieńczone. Środki te mogą też zawierać dalsze dodatkie, takie jak stabilizatory, substancje przeciwpieniące, regulatory lepkości, lepiszcza, środki polepszające przyczepność oraz nawozy syntetyczne lub inne substancje czynne dla uzyskania efektów specjalnych.

Podane niżej przykłady objaśniają bliżej wynalazek.

Przykład I. Wytwarzanie związków o wzorze 1 w obecności żywicy adsorpcyjnej.

Sposób ten przeprowadza się w objętości fermentacyjnej 1000 litrów wobec dodatku 0,s% (objętościowo/objętościowych) żywicy adsorpcyjnej XAD-1180 (firmy Rohm und Haas). Warunki postępowania dla tej szarży odpowiadają warunkom podanym niżej w przykładzie II. Zamiast tu stosowanego szczepu „So ce 26“ z europejskiego zgłoszenia EP-A nr 2824ss można też stosować jeden z innych 6 wyszczególnionych szczepów według wynalazku.

Po zakończeniu fermentacji nośnik polimeryczny odsiewa się, spłukuje do kolumny szklanej, przemywa 3 objętością wody (względem złoża) i eluuje 4 objętością (względem złoża) metanolu. Eluat zatęża się pod próżnią do sucha. Otrzymuje się 16s g ekstraktu surowego.

Dalsze postępowanie chromatograficzne następuje według schematu przedstawionego na fig. 1, przy czym poszczególne operacje rozdzielania zachodzą w niżej omówionych warunkach 1-17. Wydajność podano w nawiasach, skrót h oznacza godzinę.

Warunki 1-7 dotyczą toku rozdzielania w celu wyodrębnienia Soraphenu A-Q.

1. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 100 mm i o długości 4s cm: Sorbent: Lichroprep Si 100; 40-63μτη (producent: Merck); Czynnik obiegowy: dwuchlorometan/aceton w stopniach 98/2, 9s/s, 93/10, s0/s0; po 2 litry na stopień. Pobiera się s frakcji. Frakcja 3 zawiera Soraphen A. Frakcję 4 (2s g) oczyszcza się dalej.

2. Chromatografia żelowa: kolumna o średnicy 60 mm i o długości 100 cm: Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH); Czynnik obiegowy: metanol. Pobiera się s frakcji. Frakcję 3 (17 g) oczyszcza się dalej.

3. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 76 mm i o długości 70cm: Sorbent: HDSIL RP-18; 18-60-60 3s-70μαη (producent: Labomatic); Czynnik obiegowy: metanol/woda 40/60 lin. gradient w 2h do metanolu. Pobiera się 9 frakcji. Frakcje 3 (1,3g), 4 (1,s g), s (3,s g) i 6 (1,6 g) oczyszcza się dalej.

4. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 40 mm i o długości 30 cm: Sorbent: Lichrosorb Si 100; 7//m (producent: Merck). Czynnik obiegowy: dwuchlorometan/heksan 1/1 + 2% metanolu. Pobiera się 6 frakcji. Frakcje 2 ^00 mg) i 4 (88 mg) oczyszcza się dalej.

s. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym: kolumna o średnicy 40 mm i od długości 30 cm: Sorbent: Lichrosorb Si 100; 7 μm (producent: Merck); Czynnik obiegowy: dwuchlorometan/heksan 1/1 + 2% metanolu. Pobiera się 6 frakcji. Frakcję 3 (s00 mg) oczyszcza się dalej.

6. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 3s mm i o długości 4s cm: Sorbent: Lichroprep Si 60; 40-63 μm (producent: Merck). Czynnik obiegowy: dwuchlorometan lin.

163 447 gradient w 1h do dwuchlorwmetan/acetwe 1/1. Pobiera się 6 frakcji. Frakcje 1 (2,4 g) i 2 g (400 mg) oczyszcza się dalej.

7. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 35 mm i o długości 45 cm: Sorbent: HDSIL RP-18; 18-30-60 25-40pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 80/20. Pobiera się 9 frakcji. Frakcję 7 (1,4g) oczyszcza się dalej.

8. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm: Sorbent: Nucleosil 100-7; 7 pm (producent: Macherey Nagel); Czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30. Pobiera się 7 frakcji. Frakcję 3(15 mg) oczyszcza się dalej. Frakcja 7 zawiera Soraphen N (18 mg).

9. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm: Sorbent: Nucleosil 100-7 Cie; 7pm (producent: Mecherey Nagel). Czynnik obiegowy: metanol/woda 65/35. Pobiera się 7 frakcji. Frakcja 3 zawiera Soraphen H (7 mg).

10. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm: Sorbent: HDSIL 100-Ci8-10pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 65/35. Pobiera się 4 frakcje. Frakcja 2 zawiera Soraphen D (108 mg).

11. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 40 mm i.o długości 30 cm: Sorbent: Lichrosorb Si 100; 7 pm (producent: Merck). Czynnik obiegowy: dwuchlorometan/ /heksan 1/1 + 1% metanolu. Pobiera się 9 frakcji. Frakcje 4 (530 mg) i 6 (280 mg) oczyszcza się dalej.

12. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 40 mm i od długości 3)cm: Sorbent: Lichrosorb Si 100; 7 pm (producent: Merck); Czynnik obiegowy: dwuchlorometan/heksan 1/1 + 1% metanolu. Pobiera się 8 frakcji. Frakcję 7 (290 mg) oczyszcza się dalej.

13. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm: Sorbent: Nucleosil Si 100-7; 7 pm (producent: Marcherey Nagel). Czynnik obiegowy: eter III-rz.butylowometylowy/heksan 1/2 + 1% metanolu. Pobiera się 2 frakcje. Frakcja 1 (325 mg) zawiera Soraphen F.

14. Rozdzielanie podziałowe z. odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm: Sorbent: Nucleosil 100-7 Cie; 7pm (producent: Macherey Nagel); Czynnik, obiegowy: metanol/woda 68/32. Pobiera się 2 frakcje. Frakcja 1 zawiera Soraphen Q (3 mg).

15. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm: Sorbent: Nucleosil 100-7 C18; 7pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: metanol/woda 66/34. Pobiera się 4 frakcje. Frakcja 1 zawiera Soraphen C (21 mg). Frakcja 2 zawiera Soraphen B (230 mg).

16. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm: Sorbent: Nucleosil 100-7 Cie; 7 pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: metanol/woda 65/35. Pobiera się 10 frakcji. Frakcja 4 zawiera Soraphen^J (18 mg). Frakcja 9 zawiera Soraphen E (96 mg).

17. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm: Sorbent: Nucleosil 100-7 Cu; 7pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30. Pobiera się 10 frakcji. Frakcja 6 zawiera Soraphen M (98 mg).

Niżej podano fizykochemiczną charakterystykę Soraphenów C-Q, przy czym IR oznacza widmo w podczerwieni, NMR oznacza magnetyczny rezonans jądrowy, HPLC oznacza cieczową chromatografię ciśnieniową, UV oznacza nadfiolet, a Mz oznacza masę cząsteczkową.

Soraphen C: C 28H 42O 8 Mz = 506

IR (błonka): 3411,2939,2831, 1725,1461,1382,1266,1230,1187,1152,1098,1068,1023,988,

975.

Przesunięcia ⁿC-NMR (CDCU: δ w ppm): 10,3, 11,,7, 12,5, 23,0,29,,4,35,2,35,6,35,8 46,2 57,3 57,6 68,8 72,5 74,6 74,9 76,1 83,7 99,4 125,0 126,2 126,2 128,2 128,6 137,3 141,0 170,6.

HPLC: Rt = 8,6 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 C18, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 2100nm.

Soraphen D: C 27H 42O 8 Mz = 494

IR (błonka): 3411,2937,2831,1733,1461,1432, 1382,1359,1268,1208,1195,1096, 1050,988,

933.

163 447 13

P^esumęria ¹³C-NMR (COCU: δ ^w pp^m): K^,^, 14,4,²2,8,²⁴,3,²⁵,0,²⁷,⁵, ³¹,⁶, ³⁵,3 3⁵,6 ⁴³,²

57.5 58,6 69,1 70,8 71,2 74,8 80,7 82,6 97,7 126,4 126,4 128,0 128,6 128,6 141,0 168,6.

’ HPLC: Rt = 7,4 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Cu, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen E: C 29H 4eO 9 Mz = 538

IR (błonka): 3398,2939,2829, 1725, 1461, 1430, 1380, 1266, 1154, 1102, 1044,971. Przesunięcia ’³C-NMR (CDCh: δ w ppm): 10,3 10,5 11,5 23,0 25,0 29,5 30,0 35,3 35,3 35,5 40,2

46.3 56,4 57,4 58,0 69,0 71,3 71,7 75,0 76,3 80,2 81,1 99,9 126,5 126,5 128,1 128,6 140,9 170,9. HPLC: Rt = 11,8 min;

Kolumna: 4X250mm Nucleosil 100-7 Cu, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen F: C 29H 4eO 8 Mz = 522

IR (błonka): 3394, 2937, 2827,1729,1710,1461,1382,1326,1314,1266,1253,1232,1189,1154,

104, 1075, 1048, 1021, 994, 971, 907.

Przesunięcia ¹³C-NMR (CDCb: δ w ppm): 10,4 11,7 14,1 23,0 24,2 24,2 28,3 28,8 33,3 34,1 35,2

45,7 57,4 57,4 57,9 69,0 70,1 75,9 76,3 80,8 82,1 99,6 126,6 126,6 128,2 128,6 128,6 140,4 171,8. HPLC: Rt = 8,1 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Cu, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 75/25; detektor: UV 210 nm.

Soraphen H: C 28H 42O 9 Mz = 522

IR (błonka): 3444,2935,2867,2833, 1123,1459,1409,1382,1334,1270,1230,1179,1156,1104,

1069,996, 971.

Przesunięcia ⁿC-NMR (CDCl₃: δ w ppm): 10,9 11,6 14,4 23,4 25,0 28,6 35,6 36,3 45,6 57,7 57,8

67.5 68,7 69,2 73,9 73,9 76,1 81,7 100,1 122,9 126,0 126,0 128,2 128,7 128,7 138,0 140,6 171,5. HPLC: Rt = 7,0 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Cie, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 65/35; detektor: UV 210 nm.

Soraphen J: C28H44O8 Mz = 508

IR (błonka): 3394, 2939, 1729, 1461, 1380, 1313, 1270, 1187, 1158, 1100, 1042, 987. Przesunięcia ^C-NMR (CDCl₃: z5 w ppm): 11,5 13,8 14,3 22,5 24,1 25,6 25,8 27,7 31,6 35,2 36,3

49.3 57,3 59,4 60,6 70,5 72,6 75,7 81,0 84,6 98,2 126,3 126,3 128,1 128,7 141,3 172,5.

HPLC: Rt = 8,1 min;

Soraphen M: C 28H 44O 9 Mz = 524

IR (błonka): 3396, 2939,2831, 1725, 1461, 1380, 1270, 1235, 1191, 1154, 1085, 1048,994,971,

898,850.

Przesunięcia ^C-NMR (CDCl₃: δ w ppm): 9,0 10,4 11,5 23,1 25,3 28,3 29,3 35,1 35,7 40,3 46,5

57.2 57,9 68,8 71,9 72,9 74,4 76,3 83,8 99,6 126,3 126,3 128,0 128,5 128,5 141,2 171,0.

HPLC: Rt = 8,5 min;

Soraphen N: C29H44O9 Mz = 536

IR (błonka): 3444, 1966, 1929, 1731, 1461,1380, 1309, 1268, 1164, 1098.

Przesunięcia ’³C-NMR (CDCl₃: δ w ppm): 13,8 13,9 23,3 23,3 23,4 24,2 26,3 26,7 29,5 32,1 36,3

50.3 54,5 57,6 68,1 75,2 78,4 79,9 105,7 125,8 125,8 127,5 128,4 128,4.

Przesunięcia: ¹H-NMR (CDCfo: δ w ppm): 0,9d 1,05d 1,24d 5,23d 5,85dd.

HPLC: Rt= 13,4 min.

Soraphen Q: C28H 44O 8 Mz = 508

IR (błonka): 3448, 2939, 2831, 1733, 1459, 1382, 1330, 1270, 1203, 1098, 11018, 987. Przesunięta 13C-NMR (CDCl₃: δ w ppm): 11,5 14,5 23,1 24,9 26,2 27,1 27,6 31,7 35,5 35,9 50,7

57.4 58,7 69,5 71,3 71,6 74,6 79,4 81,9, 102,2 126,6 126,6 126,6 127,9 128,4 128,4 137,9 168,0. HPLC: Rt = 7,7 min;

163 447

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Cie, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Przykład II. Wytwarzanie związków o wzorze 1

a) Kultura wstępna.

Kulturę wstępną hoduje się w 2 litrowej kolbie w porcji 500 ml pożywki hodowlanej (zawierającej 0,I% peptonu z kazeiny, 0,5% glukozy; 0,05% CaCl2 · H 2O, 0,05% MgSO 4 -7H2O) wobec odczynu o wartości pH = 7,4 bez buforu (albo z 50 mM buforu-HEPES, stanowiącego sól potasową i/lub sodową kwasu 4--2-h ydroksyetylo^piperazyno- 1-etanosulfonowego) przy 160 obr/min w temperaturze 30°C na wstrząsarce. Najkorzystniejszy moment dla przeniesienia do hodowli w fermentorze osiąga się po upływie 2-3 dni (górna faza logarytmiczna). Zamiast tu stosowanego szczepu „So ce 192“ można też stosować jeden z 5 innych szczepów według wynalazku lub szczep „So ce 26“ według europejskiego zgłoszenia EP-A nr 282455.

b) Fermentacja.

Fermentor o pojemności 70 litrów firmy Giovanola Fr'eres, Monthey, Szwajcaria, z zawartością 60 litrów tej samej pożywki hodowlanej zaszczepia się za pomocą i0 litrów kultury wstępnej. Fermentacja następuje w temperaturze 30-32°C. Szybkość mieszania odpowiada 500 obr/min, a szybkość napowietrzania wynosi 0,12 litra na 1 litr pożywki i na 1 godzinę. Fermentacja trwa w ciągu 7-14 dni. Należy uważać na to, żeby wartość pH nie zmalała poniżej 7,0, w szczególności zaś by nie zmalała poniżej 6,2. Utworzone związki makrocykliczne o wzorze 1 znajdują się po części w supernatancie hodowlanym, a po części w komórkach. Z komórek można je ekstrahować alkoholami lub ketonami (np. acetonem), z supernatantu zaś octanem etylowym lub octanem butylowym. Brzeczkę fermentacyjną następnie wytrząsa się np. pięciokrotnie w ciągu po 5 minut z porcjami po 2 litry octanu etylowego. Te połączone ekstrakty przemywa się dwukrotnie wodą i zatęża pod próżnią. Jako pozostałość otrzymany, ciemny olej można rozdzielać według schematu przedstawionego w fig. 2 na rysunku.

Korzystniej jednak utworzone związki o wzorze 1 usuwa się po zakończeniu fermentacji z objętości fermentacyjnej za pomocą żywicy adsorpcyjnej. W tym celu dodaje się 0,5% objętościowo/objętościowych drobnoziarnistej żywicy (np. XAD-1180 lub XAD-16) do brzeczki w fermentorze i miesza w ciągu 4 godzin, po czym związki o wzorze 1 całkowicie wiążą się z żywicą. Po oddzieleniu od brzeczki z fermentora przez odsiewanie żywicę tę spłukuje się do kolumny szklanej, przemywa 3 (względem złoża) objętością wody i eluuje 4 (względem złoża) objętością metanolu. Eluat ten zatęża się pod próżnią do sucha. Taki eluat lub taki ekstrakt surowy można wraz z odpowiednimi dyspergatorami i/lub rozrzadzalnikami przetwarzać do postaci przemysłowo stosowalnych środków ochrony roślin, albo też ten ekstrakt surowy można tak, jak to przedstawiono w fig. na rysunku, poddać rozdzielaniu w celu wyodrębnienia poszczególnych Soraphenów A-Q (Omikron). Tu omówione rozdzielanie przeprowadzono za pomocą 65 g ekstraktu surowego z łącznie 400 litrów brzeczki fermentacyjnej.

Chromatograficzne oczyszczanie według schematu podanego na fig. 2, dotyczące toku II rozdzielania w celu wyodrębnienia Soraphenów, obejmuje niżej omówione warunki 1-31 tego postępowania, przy czym wydajność podano w nawiasach, a skrót H oznacza godzinę.

1. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 200 mm i o długości 200 mm; Sorbent: Lichroprep Si 100; 25-40pm (producent: Mercek). Czynnik obiegowy: gradient w stopniach; L-d^u^^Il^i^ometan; 2-9-hwuchIosometan/aceto 98/2, 96/4, 95/5, 90/10, 85/15, 80/20, 50/50, 25/75; 10-1 I-dwucMorometan/metanol 75/25, 50/50;

Pobiera się I4 frakcji. Frakcje 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oczyszcza się dalej.

2. Chromatografia żelowa; kolumna o średnicy 60 mm i o długości 100cm; Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH). Czynnik obiegowy: metanol.

Pobiera się 7 frakcji. Frakcja 3 zawiera Soraphen A (2,5 g).

3. Chromatografia żelowa; kolumna o średnicy 30 mm i o długości 100 cm; Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH). Czynnik obiegowy: metanol.

Pobiera się 5 frakcji. Frakcja 2 zawiera Soraphen C (6,6 g).

4. Chromatografia żelowa; kolumna o średnicy 30 mm i o długości 100 cm; Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH). Czynnik obiegowy: metanol.

Pobiera się 6 frakcji. Frakcję 2 (1 g) oczyszcza się dalej.

163 447

5. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 37 mm i o długości 34cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 72/28.

Pobiera się 9 frakcji. Frakcja 7 zawiera Soraphen V (1,1 g).

6. Chromatografia żelowa; kolumna o średnicy 30 mm i o długości 100 cm; Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH). Czynnik obiegowy: metanol.

Pobiera się 4 frakcje. Frakcję 2 (1,1 g) oczyszcza się dalej.

7. Chromatografia żelowa; kolumna o średnicy 30 mm i o długości 100 cm; Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH). Czynnik obiegowy: metanol.

Pobiera się 6 frakcji. Frakcje 2 (0,54g) i 3 (0,18 g) oczyszcza się dalej.

8. Chromatografia żelowa; kolumna o średnicy 30 mm i o długości 100 cm; Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH). Czynnik obiegowy: metanol.

Pobiera się 6 frakcji. Frakcje 2 (0,3 g) i 3 (1,3 g) oczyszcza się dalej.

9. Chromatografia żelowa; kolumna o średnicy 60 mm i o długości 100 cm; Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH). Czynnik obiegowy: metanol.

Pobiera się 7 frakcji. Frakcję 2 (3,3 g) oczyszcza się dalej.

10. Chromatografia żelowa; kolumna o średnicy 60 mm i o długości 100 cm; Sorbent: Sephadex LH-20 (producent: Pharmacia LKB GmbH). Laufmittel: metanol.

Pobiera się 6 frakcji. Frakcję 2 (6,1 g) oczyszcza się dalej.

11. Rozdzielania podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 37 mm i o długości 31cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18--20-(50 15-25pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 15/25.

Pobiera się 8 frakcji. Frakcja 5 zawiera Soraphen D (40 mg). Frakcja 7 zawiera Soraphen B (0,5 g).

12. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 35 mm i o długości 45 cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18-30-60 25-40pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 80/20.

Pobiera się 10 frakcji. Frakcja 8 zawiera Soraphen E (30 mg). Frakcję 4 oczyszcza się dalej.

13. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 37 mm i o długości 34 cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 pm (producent: Labomatic) . Czynnik obćegowy : metanol/woda 75/25.

Pobiera się 10 frakcji. Frakcję 6 (80 mg) oczyszcza się dalej. Frakcję 8 (20 mg) oczyszcza się dalej.

14. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 37 mm i o długości 34cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 75/25.

Pobiera się 11 frakcji. Frakcja 5 zawiera Soraphen X (16 mg).

15. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 35 mm i o długości 45 cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18-30-60 25-40 pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30 lin. gradient w 2 h do metanolu.

Pobiera się 8 frakcji. Frakcja 5 zawiera Soraphen U (150 mg).

16. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 35 mm i o długości 45 cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18-30-60 25-40 pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 75/27 lin. gradient w 1h do 90/10.

Pobiera się 9 frakcji. Frakcja 8 zawiera Soraphen M (0,93 g). Frakcję 7 (250 mg) oczyszcza się dalej.

17. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 37 mm i o długości 3!cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30.

Pobiera się 13 frakcji. Frakcję 4 (105 mg) oczyszcza się dalej. Frakcja 6 zawiera Soraphen R (20 mg). Frakcja 7 zawiera Soraphen S (490 mg). Frakcja 8 zawiera Soraphen T (80 mg). Frakcję 9 (80 mg) oczyszcza się dalej.

18. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 37 mm i o długości 34 cm; Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 pm (producent: Labomatic). Czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30.

163 447

Pobiera się 14 frakcji. Frakcja 7 (700 mg) oczyszcza się dalej. Frakcję 8 (570 mg) oczyszcza się dalej. Frakcja 9 zawiera Soraphen 6 (120 mg).

19. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami: kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: RP-18 Nucleosil 100-7 Cie; 7 μ m (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: metanol/woda 67/33.

Pobiera się 6 frakcji. Frakcja 5 zawiera Soraphen y (11 mg).

20. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleosil 100-7; 7 pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: eter II]drz.-butylowometylowyI-n-heksae 1) + 1% metanolu.

Pobiera się 3 frakcje. Frakcja 2 zawiera Soraphen v (8 mg).

21. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleosil 100-7; 7 pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: eter III--z.-dutylowometylowy/e-heksan 1/2 + 1% metanolu.

Pobiera się 2 frakcje. Frakcja 2 zawiera Soraphen β (8 mg).

22. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleosil 100-7; 7pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: eter III-rz.-dutylowometylowy/n-heksae 1/2 + 5% metanolu.

Pobiera się 7 frakcji. Frakcja 1 zawiera Soraphen Y (64 mg). Frakcja 4 zawiera Soraphen δ (5 mg). Frakcja 6 zawiera Soraphen ξ (7 mg).

23. Rozdzielanie podziałowe z odwróconymi fazami; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: RP-18 Nucleosil 100-7 Cu; 7 pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: metanol/woda 60/40.

Pobiera się 6 frakcji. Frakcję 2 (35 mg) oczyszcza się dalej.

24. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleosil 100-7; 7pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: eter III-rz.-butylowometylowy/n-heksan 1/2 + 10% metanolu.

Pobiera się 5 frakcji. Frakcja 2 zawiera Soraphen δ (20 mg).

5. Rozdzielanie panziałowe a oww rócowyn^i fnzo^i; kalmn-rna u ónd nicy 20,5mm i o OOgości cm; Sorbent: RP-18 Nucleasil 100-7 Cu; 7 pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: metanol/wona 60/40.

Pobiera się 9 frakcji. Frakcję 4 (194 mg) oczyszcza się dalej. Frakcję 5 (130 mg) oczyszcza się Onlej. Frakcję 6 (50 mg) oczyszcza się dniej.

26. Rozdzielanie nn żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleosil 100-7; 7 pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: eter III-rz.-butylowametzlawz/-e-heksae 1/2 + 5% metanolu.

Pobiera się 9 frakcji. Frakcja 4 zawiera Soraphen p (45 mg).

27. Rozdzielanie nn żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleasil 100-7; 7 pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: eter III-rz.Ibutzlowamety{owyd-n-heksan 1/2+ 10% metanolu.

Pobiera się 4 frakcje. Frakcja 2 zawiera Soraphen ζ (26 mg).

28. Rozdzielanie nn żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleasil 100-7; 7 pm (producent: Macherey Nngeł). Czynnik obiegowy: eter III-rz.Ibutzlowamety{owyd-n-hekaαe 1/2 + 5% metanolu.

Pobiera się 4 frakcje. Frakcja 2 zawiera Soraphen p (18 mg). Frakcja 3 zawiera Soraphen η (69 mg).

29. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleosil 100-7; 7 pm (producent: Macherey Nagel). Czynnik obiegowy: eter III-rz.-dutylowometzlowz/n-heksne 1/2 + 5% metanolu.

Pobiera się 5 frakcji. Frakcja 4 (10 mg) zawiera Somphen κ (5,5 mg).

30. Rozdzielanie na żelu krzemionkowym; kolumna o średnicy 20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nucleosil 100-7; 7pm (producent: Machesey Nagei). Czynnik obiegowy: eter III-ra.-butzlowometylowyd-n-heksne 1/2 + 5% metanolu.

Pobiera się 4 frakcje. Frakcję 4 (10 mg) oczyszcza się dalej.

163 447

31. Rozdzielanie aa eenu krze mionkowym; yolu mna o śreonicy20,5 mm i o długości 25 cm; Sorbent: SI 100 Nuclegstl 100-7; 7 μΓο (producent: Machemy Nagel). Czynnik obiegowy: eter III--z.-eutylzwomrtylowy/n-hrksaa 1/2 + 5% metanolu.

Pobiera się 2 frakcje. Frakcja 1 zawiera Somphen π (2,2 mg). Frakcja 2 zawiera Somphen Z (6,5 mg).

Niżej podano fizykochemiczną charakterystykę dalszych uzyskanych Sgraphraów R-Z; przy czym IR oznacza widmo w podczerwieni, NMR oznacza magnetyczny rezonans jądrowy, HPLC oznacza cieczową chromatografię ciśnieniową, UV oznacza nadfiolet, a Mz oznacza masę cząsteczkową.

Soraphen V: C 2sH 42O 8 Mz = 506

IR (błonka, ν w cm-1): 3394, 2942, 2900, 2829, 1723, 1461, 1380, 1270, 1233, 1189, 1068, 988, 898, 851.

Przesunięcia ^C-NMR (CDO3: δ w ppm): 10,3 11,7 12,6 23,2 26,0 32,7 35,6 36,2 46,3 55,8 57,3

68.9 72,5 74,6 76,3 84,5 99,5 122,1 126,2 126,2 128,1 128,5 128,5 139,9 141,2 170,9.

HPLC: Rt = 9,2 min;

Kolumna: 4X250 mm NuclemU 100-7 C18, Machmy Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen X: C 28H 42O 9 Mz = 522

IR (błonka, v w οιο^): 3404,2941, 1716, 1598, 1461, 1380, 1272, 1233, 1189, 1156, 1100, 1069,

988.

Przesunięcia ^'C-NMR (CDCU: δ w ppm): 10,3 11,7 12,5 23,1 25,9 35,2 35,6 35,7 46,2 57,3 57,6

68.9 72,5 74,5 75,0 76,1 83,8 99,5 113,4 115,2 118,0 124,9 129,8 137,4 142,7 156,2 170,9.

HPLC: R, = 4,4 min;

Kolumna: 4X250 mm ^ο^^Π 100-7 Cu, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen U: C29H44O9 Mz = 536

IR (błonka, v w οο^): 3386, 3361,2977, 2939,2892, 2823, 1698, 1461, 1380, 1268, 1185, 1152, 1096, 1064, 1023, 975, 900, 840.

Przesuń nęcia 1³C-NMR (CDCl₃: δ w ppm): 10,111,4 12,2 31,8 32,9 35,2 35,2 38,6 46,3 56,0 57,0

57.9 64,2 68,7 72,2 73,3 76,2 80,0 84,5 99,3 122,2 126,1 126,1 127,9 128,4 128,4 140,6 141,4 171,7.

HPLC: Rt = 5,2 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Cu, Machemy Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen R: C 26H 40O 8 Mz = 480

IR (błonka, v w οο^): 3404,2937, 1731, 1459, 1430, 1384, 1355, 1330, 1270, 1212, 1110, 1083, 1033,988.

Przesunięcia ¹³C-NMR (CDCb: δ w ppm): 10,7 14,5 22,7 23,3, 24,8, 27,9, 30,9, 31,8 35,5 35,3

43.4 58,6 68,9 71,0 72,9 73,3 74,6 80,5 97,6 126,5 126,5 128,0 128,6 128,6 141,1 168,8.

HPLC: Rt = 5,1 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Cu, Machmy Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Somphen S: C 27H 4oO, Mz = 492

IR (błonka, v w οο^): 3431,2941, 1720, 1604, 1459, 1426, 1380, 1264, 1187, 1150, 1104, 1062,

977.

Przesunięcia ¹³C-NMR (CDCh: z5 w ppm): 10,5 11,9 12,7 24,9 26,2 35,5 36,2 36,3 37,9 47,5 57,6

69.5 73,5 74,1 75,8 76,3 77,9 100,6 125,1 127,1 127,1 128,7 129,4 129,4 138,8 143,3 173,8.

HPLC: Rt = 5,9 min;

Somphen T: C 27H 42O 8 Mz = 494

IR (błonka, ν w οο^): 3427,2941, 1720, 1461, 1382, 1268, 1191, 1154, 1106, 1068,994, 971.

Przesunięcia ⁿC-NMR (CDCh: δ w ppm): 10,4 11,7 14,2 22,7 24,8 25,3 30,6 32,8 34,6 35,2 45,8

57,3 69,1 69,8 73,0 76,0 99,6 126,5 126,5 128,1 128,5 128,5 150,6 171,9.

HPLC: Rt = 6,5 min;

163 447

Soraphen δ (delta): C27H42O8 Mz = 506

IR (błonka, v w cm¹): 3440, 3311 2937, 1731, 1600, 1461, 1380, 1340, 1185, 1096, 988, 850. Przesunięcia ^C-NMi^CDCh: δ w ppm): 10,2 12,0 12,7 23,2 25,629,6 34,9 36,0 37,345,3 56,2

57,6 70,3 72,1 72,6 74,3 74,9 84,2 99,5 124,9 126,3 126,3 128,0 128,6 128,6, 131,6 141,2 171,2. HPLC: Rt = 7,1 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Cis, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen y (gamma): C 28H 42O 9 Mz = 522

IR (błonka, v w cm'¹): 3398, 2939, 1723, 1461, 1382, 1264, 1189, 1152, 1102, 1066, 975, 894. Przesunięcia ^C-NMR (CDCU: δ w ppm): 8,6 10,3 11,5 23,6 25,8 28,8 33,9 35,4 46,6 54,7 57,3

58.1 59,2 68,8 69,3 73,5 74,3 76,2 83,5 99,7 126,1 126,1 128,0 128,6 128,6 141,4 170,4.

HPLC: Rt = 8,4 min.

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 C18, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen v (Ni): C 28H 42O 9 Mz = 522

IR (błonka, i/wcm-’): 3402, 2971,2935,2827, 1733, 1459, 1367, 1181, 1095, 1050,990, 860. Przesunięcie ¹³C-NMR (CDCla: δ w ppm): 8,7 10,3 11,5 26,3 33,4 35,2 40,2 46,2 57,4 58,1 67,8

71,5 73,5 76,3 78,9 82,6 99,4 125,9 125,9 128,3 128,7 129,5 140,7 170,3.

HPLC: Rt = 8,5 min;

Soraphen β (Beta): C29H44O8 Mz = 520

IR (błonka, v w cm-): 3408, 2971, 2935, 2825, 1733, 1459, 1365, 1181, 1095, 1050, 990, 958, 842, 738.

Przesunięcia 1³C-NMR (CDCla: δ w ppm): 10,1 12,1 12,6 23,4 25,5 30,4 35,0 35,9 37,2 45,3 56,2

56.3 57,9 70,3 72,1 72,7 74,2 83,1 84,8 99,4 122,6 126,3 126,3 128,0 128,6 128,6 140,0 141,3 171,3. HPLC: Rt= 16,8 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 C18, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210nm.

Soraphen Y: C27H40O9 Mz = 508

IR (błonka, v w cm*): 3436, 29 37, 1721, 1459, 1376, 1268, 1199, 1114, 1(045,988,961. Przesunięcia ^C-NMR (CDCU: δ w ppm): 10,8 11,2 18,8 23,0 23,5 31,7 34,4 36,2 40,641,1 51,1

61.1 70,8 74,6 76,4 78,7 86,4 99,9 125,5 125,5 127,4 128,4 142,5 171,1 212,4.

HPLC: Rt = 6,1 min;

Soraphen o (Omikron): C29H44O9 Mz = 536

IR (błonka, v w cm-’): 3402,3361,2933,2894, 1708, 1457, 1360, 1269, 1187, 1150, 1096, 1062, 975, 898,838, 765.

Przesunięcia ’³C-NMR (CDCU: δ w ppm): 10,4 11,6 12,6 31,7 33,4 35,3 35,7 38,746,3 56,3 57,4

58.3 65,7 69,0 72,3 74,2 76,2 80,0 84,8 99,5 122,9 126,3 126,3 128,2 128,6 128,6 140,1 140,7 170,8. HPLC: R, = 4,8 min;

Soraphen ξ (ksi): C27H40O8 Mz = 492

IR (błonka, ν w cm): 3402 , 2969 , 2933, 1731, 1459, 1367, 1179, 1095, 1050, 990. Przesunięcia ’³C-NMR (CDCU : δ w ppm) : 10,4 117 12,5 20’ 1 26,2 318 35,2 35,7 36,2 46,4 57,4

68,9 72,3 73,5 75,0 76,1 99,6 126,2 126,2 127,0 128,1 128,6 138,3 141,2 170,7.

HPLC: Rt = 4,1 min;

Soraphen σ (Sigma): C29H44O9 Mz = 536

163 447

IR (błonka, v w cm-¹): 3398, 3363, 3301,2971,2933,2894, 1702, 1453, 1378, 1262, 1167, 1150,

1100.979, 838.

Przesunięcia ^,3C-NMR (CDCI3: ów ppm): 10,3 11,5 12,431,6 34,235,0 35,5 38,946,2 56,1 57,3

64.3 69,1 73,1 76,1 77,2 79,8 85,2 99,7 121,8 126,0 128,5 128,5 141,9 142,0 171,4.

HPLC: Rt = 6,2 min;

Soraphen κ (ko): C27H42O9 Mz = 510

IR (błonka, ν w cm'1): 3398, 3363, 3301,2971,2933,2894, 1700, 1453, 1378, 1262, 1 187, 1150, 1100, 1064, 979, 898, 838, 763.

Przesunięcia ⁿC-NMR (CDCI3: δ wppm): 8,7 10,3 11,4 23,1 25,5 26,4 32,3 35,0 36,1 40,5 46,6

57.2 68,5 68,8 71,8 73,1 73,7 74,3 76,4 99,7 126,3 127,9 128,5 128,5 141,4 171,4.

HPLC: Rt = 4,7 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Cie, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210nm.

Soraphen ζ (Zeta): C28H42O9 Mz = 522

IR (błonka, v w cm'^: 3398, 2937, 1718, 1457, 1378, 1272, 1203, 1102, 978.

Przesunięcia “C-NMR (CDCI3: δ w ppm): 11,8 21,9 25,9 25,9 28,7 36,3 39,9 43,0 45,7 56,7 57,4

58,6 70,6 75,5 76,2 78,2 84,3 98,9 125,9 125,9 128,0 128,4 128,7 128,7 133,1 141,2 171,6.

HPLC: Rt = 3,5 min;

Kolumna: 4 X 250 mm Nucleosil 100-7 Cie, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen μ (Mi): C28H44O9 Mz = 524

IR (błonka, v w cm-): 3423, 2939, 1725, 1459, 1380, 1264, 1191, 1154, 1102, 1052, 992,971.

. Przesunięcia ^C-NMR (CDCI3: δ w ppm): 10,4 11,7 14,1 21,3 27,7 28,2 30,9 32,9 34,1 35,245,6

57.4 60,7 69,1 70,00 70,4 72,1 76,2 76,3 85,4, 99,6 126,6 126,6 128,1 128,6 172,0.

HPLC: Rt = 4,7 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 100-7 Ci8, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen ξ (Eta): C28H42O9 Mz = 522

IR (błonka, v w cm^: 3411,2935, 1718, 1459, 1382, 1266, 1189, 1152, 1104, 1066, 981. Przesunięcia ^C-NMR (CDCI3: δ w ppm): 10,2 11,4 12,3 31,6 32,9 35,4 38,1 46,2 57,2 57,7 64,0

68,8 72,2 73,7 74,7 76,2 81,2 99,3 124,8 1 26,1 127,9 128,4 1 28,4 1 37,8 141,1 174,4.

HPLC: Rt = 4,6 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 1)0-7 Cia, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen κ (kappa): C 27H 40O 8 Mz = 492

IR (błonka, ν w cifi): 3411,2935, 1731, 1461, 1382, 1347, 1270, 1189, 1104, 1048,990. Przesunięcia ⁿC-NMR(CDCl3: δ w ppm): 10,1 12,1 12,8 23,4 25,4 33,5 35,0 36,1 37,245,456,1

70.3 72,0 72,7 74,2 75,6 99,4 124,1 126,2 126,2 127,9 128,5 128,5 138,6 141,3 171,5.

HPLC: Rt = 4,7 min;

Soraphen π (Pi): C27H40O8 Mz = 492

IR (błonka, v w αη^): 3396, 3363, 3299, 2969, 2933, 2694, 1702,1451, 1378, 1262, 1167, 1150,

1100.979.

Przesunięcia '³C-NMR (CDCI3: δ w ppm): 10,3' 12,3 14,6 23,4 25,0 32,2 35,6 36,0 36,8 50,4 55,4 70,2 71,2 73,9 75,0 75,5 98,3 125,2 126,2 126,2 128,1 128,6 128,6 137,8 141,0 171,5.

HPLC: Rt = 4,9 min;

Kolumna: 4X250 mm Nucleosil 1)0-7 Ci8, Macherey Nagel; przepływ: 1,5 ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 210 nm.

Soraphen Z: C 28H 42O 9 Mz = 522

IR (błonka, v w cm-): 3405, 2937, 1718, 1439, 1380, 1266, 1189, 1152, 1104, 1069, 989, 902, 850, 813, 738.

163 447

Przesunięcia ⁿC-NMR (CDCle: δ w ppm): 10^ 11,7 12,6 31,8 33,s 3s,3 3s,741,1 46,3 s6,0 s7,3 66,0 69,0 70,s 72,s 74,3 76,2 84,3 99,s 122,4 126,2 126,2 128,2 128,6 128,6 140,4 140,9 170,9. ’

HPLC: Rt = 7,7 min;

Kolumna: 4X2s0 mm Nucleosil 100-7 Cia, Macherey Nagel; przepływ: 1,s ml/min; czynnik obiegowy: metanol/woda 70/30; detektor: UV 219 nm.

Na podstawie rentgenowskiej analizy strukturalnej Soraphenu A i poprzednio ustalonych danych przyjmuje się dla Soraphenów C-Q przestrzenne struktury o wzorach 1C'-1Q'.

Dla pozostałych związków IR, 1S, 1T, 1U, 1V, 1Y, 1Z, 1β, 1y, 1δ, 1ζ, I17, 1κ, 1/y, i ξ i lp przyjmuje się podobne konfiguracje.

Dla Soraphenu 1 v prawdopodobną jest konfiguracja o wzorze i v'. Dla Soraphenów p, π i δ konfiguracja nie jest pewna. Ponadto widocznym jest, że poszczególne Sorapheny są między sobą epimeryczne. Soraphen δ jest epimeryczny z Soraphenem C; Sorapheny ξ i ζ są epimeryczne wzajemnie i z Soraphenem S, podobnie Sorapheny U, δ i β. Wiążącymi w każdym przypadku są oznaczone dla określonego związku o wzorze 1 wartości pomiarowe, które jak wiedzą fachowcy, niekiedy nie pozwalają na ścisłe przyporządkowanie określonej konfiguracji.

Jak wspomniano, wynalazek obejmuje sposób wytwarzania wszystkich stereoizomerycznych postaci poszczególnych cytowanych związków o wzorze i, nadających się do stosowania w celu zwalczania lub zapobiegania chorobom roślin. W dalszym ciągu jednak wynalazek dotyczy wytwarzania, zwłaszcza związków 1C'-1Q' z powodu ich danych fizykochemicznych, dla których przyjmuje się wyżej odtworzone konfiguracje.

Należy zauważyć, że makrocykliczne Sorapheny o wzorze i zwykle występują w podanej odmianie hemiacetalowej, odmiana ta jednak w warunkach zasadowych doznaje odwracalnego otwarcia pierścienia według schematu przedstawionego na rysunku. W zależności od metodyki wytwarzania lub metodyki obróbki otrzymuje się, zależnie od wartości pH i rozpuszczalnika, Sorapheny w tej lub innej odmianie lub w postaci mieszaniny obu odmian. Charakterystycznym dla otwarcia pierścienia jest przesunięcie sygnału i³C-NMR w położenie -3 i przesunięcie sygnału iH-NMR w określone inne położenie.

W przypadku Soraphenu A przykładowo obserwuje się następujące zmiany: ^C-NMR (CDCla; δ w ppm): 99,s - 203,1 (3-C); ¹H-NMR (CDCla; δ w ppm): 3,14 - (2-H), 3,18 - 4^ (4-H), 3,83 3,16 (7-H), s,87 — s,7 (17-H). Poobnee pΓeesnnicciaobsrrwut e się równiżż w przypakuu Soraphenów B -p. Wzór 1 związków wytworzonych sposobem według wynalazku zasadniczo obejmuje zarówno przeważające przy niskich wartościach pH odmiany 3-hemiacetalowe, jak i otwarte odmiany 3-keto-7-hyZΓoksylowe.

Ri X

Rr . .1.

\ or₃ y A CHz-B .. > 0 0 V

In II .1 _s|

CH3 /vvw

OH

2'

A 0R₂

Wzór 1

163 447

χ\,(Η

ohj °π ĆH,™’ \ OCH,

Z\zV i li \X

Wzór 1C‘

OCH

Xi'^V'W ^CH \/' ch₃ och₃

Wzór 1F'

Wzór 1D'

OCH

\/ j_x ⁰ ? i ·' V ' ' OhY CH och₃ch₃

Wzór 1H‘

OCH OH

OH i ,CH₃ z\_zCH₃ ^z \-^Zxq^/’\.X\XY ćh₃ och₃

OH

OCH 3

X Z z YX \ / -= \ / nu | II ⁰ i OHi YX ch₃ ^oh

Wzór 1E'

Wzór 1J·

OH OH

li °^/YóHi^/ OH \/' OCHa

Wzór 1M'

ttrtOCHj! / o x\/\ un 1 \/ ĆH, OCH a

Wzór 1N' och₃

Wzór 1Q'

CH₃Q

OH

..···· \

1C:

CHs

o^z OH

CH₃ qch₃

Wzór 18

163447 β.

1	HOA ch₂-b —- 0 V
4ł/'0H	3.¹·¹. s! / ^X0H
ORz	ORz

Schemat

Tok rozdzielania w celu wyodrębnienia Soraphenów E

Tok rozdzielania w celu wyodrębnienia Soraphenów

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zl

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania makrocyklicznych związków o wzorze 1, w którym występuje R, = OCH 3; R 2, R 3 i A = CH 3; R 4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek A); albo Ri = OH; R 2, R 3 i A = CH 3; R4, R 5, B, X i Y = H (związek B); albo Ri = OH; R₂, R 3 i A = CH 3; R4, R 5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9,10 (związek C); albo R1 = OH; R 2 i R 3 = CH 3; R 4, R5, A, B, X i Y = H (związek D); albo R1 = OCH 3; R 2, R 3 i A = CH 3; R4, R5, B i Y = H, H = OH (związek E); albo R1 = OCH3; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H (związek F); albo R1 =OCH3; R 2 i A = CH 3; R 3, R 4, R5, B i X = H, Y = OH; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 8,9 (związek H); albo R1 = OCH 3; R 3 i A = CH 3; R 2, R 4, R5, B, X i Y = H (związek J); albo R1 =OH; R₂, R3 i A = CH3; R4, R5, B i Y = H, X = OH (związek M);' albo R1 = OH; R 2, R 3 i A = CH 3; R 4, R5, B i X = H, Y = OCH 3; oraz wiązanie podwójne w położeniu A 9,10 (związek N); albo Ri = OCH3; R2 i R3 = CH3; R4, R5, A, B, X i Y = H (związek Q); albo Ri = OH; R₂ = CH3; R3, R4, R5, A, B, X i Y = H (związek R); albo R1 = OH; R₂ i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek S); albo R1 = OH; R2 i A = CH3; R3, R4, Rs , B, X i Y = H (zwikzek Tb a Ibo R1 = HCH₃; R3 , R31 Ah cH4 ; Ro = OH; R₅ , B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek U); albo Ri =OCH 3; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek V); albo R1 = OH; R3, R3 i A = CH3; Rs = OH; R4, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek X); albo R1=O; R2 i A = CH3; R 3, R 4, R5; B i Y = H; X = OH (związek Y); albo R1 = OCH3; R2 i A = CH3; R 4 = OH; R 3, Rs, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu A 9,10 (związek Z); albo R1 = OCH 3; R 2, R 3 i A = CH 3; R 4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek β); albo R1 = OH; R3, R3 i A = CH3; R4, R5 i B = H; oraz grupę 9, 10-epoksy (związek y); albo R1=OH; R2, R3 i A = CH3; R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek δ); albo R1 =OH; R ₂, R 3 i A = CH3; R 4, R5, X i Y = H; B = OH; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek f); albo R1 = OH; R ₂, R 3 i A = CH 3; R 4' = OH; R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek n); albo R1 = OH; R 2 i A = CH 3; R 3, R 4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek κ); albo R1 =OCH3; R2 i A = CH3; R3, R4, Rs, B i X = H; Y = OH (związek μ); albo R1 = OH; R 2, R 3 i A = CH 3; R4, R5, B i Y = H; X = OH; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 14, 15 (związek v); albo R1 = OH; R2 i A = CH3; R3, R4, R5, B, X i Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek f); albo R1 = OCH 3; R 2, R 3 i A = CH 3; R 4 = OH; R5, B, X i Y = H, oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9,10 (związek u); albo R1 = OH; R ₂ i A = CH 3; R 3, R 4, R5, B, X i

Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9, 10 (związek π); albo R1 = OH; R 2 i A = CH 3; R 3, R4, R5, B i Y = H; X = OH (związek p); albo R1 = OCH 3; R 2, R 3 i A = CH 3; R 4 = OH; R5, B, X i

Y = H; oraz wiązanie podwójne w położeniu Δ 9,10 (związek J); włącznie ze stereoizomerami tych związków, znamienny tym, że w odpowiedniej pożywce prowadzi się aerobową hodowlę wedle wyboru szczepu Sorangium cellulosum „So ce 36“ (NCIB 13411), Sorangium cellulosum „So ce 139“ (DSN 5397), Sorangium cellulosum „So ce 1710“ (DSM 4795), Sorangium cellulosum „So ce 191“ (DSM 4796), Sorangium cellulosum „So ce 192“ (DSM 4797), Sorangium cellulosum „So ce 231“ (DSM 5393), lub Sorangium cellulosum „So ce 242“ (DSM 5414), albo kultury dającej się wyprowadzić z tych szczepów, i na życzenie prowadzi się następne rozdzielanie otrzymanych związków o wzorze 1, pod warunkiem, że szczepu „So ce 26“ (NCIB 12411) nie stosuje się do uzyskiwania związków 1A i 1B.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jeden ze wspomnianych siedmiu szczepów Sorangium cellulosum hoduje się w temperaturze 10-40°C w obecności lub bez żywicy adsorpcyjnej w środowisku hodowlanym, zawierającym co najmniej po jednym przyswajalnym źródle-C i źródle-N oraz odpowiednie sole nieorganiczne, po czym brzeczkę hodowlaną względnie odfiltrowaną żywicę adsorpcyjną ekstrahuje się odpowiednią fazą rozpuszczalnikową, otrzymany roztwór zatęża się, a otrzymaną pozostałość na życzenie oczyszcza się drogą chromatografii i/lub przekrystalizowania.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że fermentację w temperaturze 10-35°C prowadzi się z jednym ze szczepów „So ce 170“ (DSM 4795), „So ce 191“ (DSM 4796), „So ce 192“ (DSM 4797).

163 447
4. Sposób według zastrz. I, znamienny tym, że szczep „So ce 26“ (NCIB 124I1) poddaje się aerobowej hodowli w temperaturze I0-35°C wobec odczynu o wartości pH = 6-8 aż do uzyskania związków C, D, E, F, H, J, M, N, Q.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że uzyskane związki C-Q oddziela się za pomocą żywicy adsorpcyjnej i ewentualnie oczyszcza się na drodze chromatografii.