HU209950B - Microbiological process for producing agriculturally acceptable active ingredients and fungicid composition containing them - Google Patents

Description

A találmány tárgya:

— mikrobiológiai eljárás az (I) általános képletű, a mezőgazdaságban alkalmazható makrociklusos vegyületek előállítására,

- az eljárás végrehajtására szolgáló új mikroorgasúzmusok előállítására, valamint “· ^;az eljárással előállított hatóanyagok ill. az eljárással előállított, ilyen hatóanyagokat tartalmazó készítmények, és

- a hatóanyagok alkalmazása növényi betegségek leküzdésére ill. megelőzésére.

Az (I) általános képlet az I. táblázat szerinti szubsztituens-kombinációkra vonatkozik, mimellett a makrociklusos gyűrű telített vagy a 8,9-, 9,10- vagy 14,15helyzetben kettőskötést tartalmaz.

I. táblázat

	R!	r2	R3	r4	r5	A	B	X	Υ
A	och3	ch3	ch3	H	H	CH3	Η	Η	Η	Δ9,10
B	OH	ch3	ch3	H	H	ch3	Η	Η	Η	-
C	OH	ch3	ch3	H	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9.10
d	OH	ch3	ch3	H	H	H	Η	Η	Η	-
E	OCH3	ch3	ch3	H	H	CH3	Η	ΟΗ	Η	-
IP	och3	ch3	ch3	H	H	ch3	Η	Η	Η	-
H	och3	ch3	Η	H	H	ch3	Η	Η	ΟΗ	Δ8,9
J	och3	H	ch3	H	H	ch3	Η	Η	Η	-
Mi	OH	ch3	ch3	H	H	ch3	Η	ΟΗ	Η	-
N	OH	ch3	ch3	H	H	ch3	Η	Η	och3	Δ9.10
Q	OCH3	ch3	ch3	H	H	Η	Η	Η	Η	-
	OH	ch3	H	H	H	H	Η	Η	Η	-
S	OH	ch3	H	H	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9,10
T	OH	ch3	H	H	H	ch3	Η	Η	Η	-
V	OCH3	ch3	ch3	OH	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9,10
’V	och3	ch3	H	H	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9.10
X	OH	ch3	H	H	OH	ch3	Η	Η	Η	Δ9,10
Y	=0	ch3	H	H	H	ch3	Η	ΟΗ	Η	-
z	och3	ch3	H	OH	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9.10
p	och3	ch3	CH3	H	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9,10
T	OH	ch3	ch3	H	H	ch3	Η	9,10-epoxi	-
a	OH	ch3	ch3	H	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9,10
C	OH	ch3	ch3	H	H	ch3	ΟΗ	Η	Η	Δ9.10
n	OH	ch3	ch3	OH	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9,10
K,	OH	ch3	Η	H	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9,10
Di	och3	ch3	H	Ή	H	ch3	Η	Η	ΟΗ	-
V	OH	ch3	CH3	H	H	ch3	Η	ΟΗ	Η	Δ14.15
%	OH	ch3	H	H	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9.10
0	OCH3	ch3	ch3	OH	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9.10
X	OH	ch3	H	H	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9,10
(?'	OH	ch3	H	H	H	ch3	Η	ΟΗ	Η	-
	OCH3	ch3	ch3	OH	H	ch3	Η	Η	Η	Δ9.10

íLn-a 32 vegyületet mikrobiológiai úton állítjuk elő, a Sorwgium/Polyangium csoportba tartozó Myxobaktériuwök tenyésztésével. Az adott törzs a vegyületeket ill. essék egy részét különböző arányokban termeli. Valamewyi törzsre jellemző, hogy az A vegyületet mint egyik Tőterméket állítja elő.

Az (I) általános képletű vegyületeket a leírásban mint „szorafeneket” fogjuk említeni: ez a név a Táblázatban felsorolt vegyületekre jellemző, a „szorafen Atól” a „szorafen szigmáig”.

A találmány tárgyát képezi 6 új, a Sorangium/Poliangium csoportba tartozó, cellulóz-lebontó Myxobak2

HU 209 950 Β térium mikroorganizmus törzs, amelyek, mint ismeretes, gyakran megtalálhatók földmintákban, növényi anyagokban vagy állati trágyában. Erre a (toxonómiailag nem általánosan, kötelezően megkülönböztetett) csoportra jellemző az a képesség, hogy egyedüli szénforrásként cellulózon vagy a cellulóz bomlástermékein képes tenyészni. Erre a találmány szerinti 6 törzsre függetlenül attól, hogy ezek szigorúan véve a Sorangium/Polyangium csoportba vagy csak egy ezzel taxonómiai rokonságban álló csoportba tartoznak-e - e csoport képviselőinek döntő többségével szemben jellemző továbbá az, hogy legalább egy, az előzőekben említett (I) általános képletű szorafent, és előnyösen legalább két szorafent (amelyek egyike a szorafen A) termelnek.

A hat törzset itt és a továbbiakban a Sorangium(Polyangium) cellulosum néven fogjuk említeni. Ezek olyan földmintákból származnak, amelyeket különböző időpontokban Európa, Afrika ill. az Egyesült Államok különböző helyein gyűjtöttünk. A törzseket a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen nevű intézetben (DSM, Braunschweig, NSZK) helyeztük letétbe, a Budapesti Szerződés szerint.

A törzsek a következőkkel jellemezhetők:

1. ) Sorangium (Polyangium) cellulosum „So ce 139” törzs:

1986 májusában különítettük el egy földmintából, amelyet 1982 őszén Fort Huachaca (Arizona, AEÁ) közelében vettünk.

Letéti száma: DSM 5397. A letétbe helyezés napja: 1989.06.02.

2. ) Sorangium (Polyangium) cellulosum „So ce 170” törzs:

1987 áprilisában különítettük el egy földmintából, amelyet 1981 májusában vettünk Delos szigetén (Görögország).

Letéti száma: DSM 4795. A letétbe helyezés napja: 1988.09.02.

3. ) Sorangium (Polyangium) cellulosum „So ce 191” törzs:

1987 augusztusában különítettük el egy földmintából, amelyet 1987-ben vettünk Madeira szigetén, Portugáliában.

Letéti száma: DSM 4796. A letétbe helyezés napja: 1988.09. 02.

4. ) Sorangium (Polyangium) cellulosum „So ce 192” törzs:

1987 augusztusában különítettük el egy, 1987 márciusában Nigériában vett földmintából.

Letéti száma: DSM 4797. A letétbe helyezés napja: 1988.09.02.

5. ) Sorangium (Polyangium) cellulosum „So ce 231” törzs:

1988 áprilisában különítettük el egy földmintából, amelyet 1987 áprilisában Didyma (Törökország) közelében vettünk.

Letéti száma: DSM 5393. A letétbe helyezés napja: 1989. 06. 02.

6. ) Sorangium (Polyangium) cellulosum „So ce 242” törzs:

1988 októberében különítettük el egy földmintából, amelyet 1988 áprilisában Pozzuoli (Olaszország) mellett vettünk.

Letéti száma: DSM 5414. A letétbe helyezés napja: 1989. 06. 19.

A továbbiakban a fenti törzsek megnevezésére a Sorangium cellulosum elnevezést fogjuk alkalmazni.

Az (I) általános képletű szorafenek valamelyikének előállítására irányuló, találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy a Sorangium cellulosum „So ce 139”, „So ce 170”, „So ce 191”, „So ce 192”, „So ce 231” vagy „So ce 242” törzset, vagy egy ezekből levezethető kiónt, mutánst stb. megfelelő táptalajban aerob körülmények között tenyésztjük és a képződött szorafent elkülönítjük.

282,455 sz. európai közrebocsátási iratban egy másik Sorangium cellulosum mikroorganizmust („So ce 26”) írnak le, amelynek tenyésztésével a fent említett soraién A és B állítható elő. Találmányunk nem erre a két anyagra és ezek szerekben való egyedüli alkalmazására vonatkozik.

A találmány tárgyát további értékes növényi mikrobicid fermentációs termékek képezik, amelyeket az „So ce 26” mikroorganizmus (letéti száma NCIB 12411) és a találmány szerinti eljárásban alkalmazott „So ce 139”, „So ce 170”, „So ce 191”, „So ce 192”, „So ce 231” vagy „So ce 242” mikroorganizmus termelni képes.

A 6 termelő törzs tenyésztésére szolgáló eljárás általános jellemzői

A Sorangium cellulosum törzsek megfelelő táptalajban a szokásos mikrobiológiai eljárásokkal - pl. rázott tenyészetekben vagy fermentorokban - tenyészthetők. A fermentáció hőmérséklete általában 10-40 °C, előnyösen 10-35 °C és különösen előnyösen kb. 3032 °C; a pH érték 6-8, előnyösen 7,4. Az eljárást aerob és steril körülmények között folytatjuk le.

A táptalaj összetétele tág határok között változhat. Az eszenciális, asszimilálandó tápanyagok biztosítására a táptalajnak egy szén- és egy nitrogén-forrást, valamint egy szervetlen ásványi só forrást (amelyekből P, S, Mg, K, F, Ca vehető fel) kell tartalmaznia.

A fermentációs eljárások során C-forrásként előnyösen glukózt, keményítőt és cellulózt vagy ezek lebontási termékeit (pl. a cellobiózt) alkalmazzák, diszacharidok, glicerin, ecetsav stb. mellett. N-forrásként megfelelő pl. az NH₄ ⁺, NO₃~ ion vagy a peptonok is. Egy szerves vegyület mint nitrogén-forrás általában nem lehet egyidejűleg az egyetlen szénforrás és energiaforrás a fermentáció során.

Ásványi sóként kloridok, nitrátok, szulfátok, karbonátok és foszfátok - Na⁺, K⁺, NH₄ ⁺, Mg²⁺, Fe²⁺ és Ca²⁺ kationnal - vehetők figyelembe, emellett nyomelemként jelen lehet a Cu, Mo, Me, Zn, Co stb. Hacsak lehetséges, az ilyen sók etilén-diamin-tetraecetsavhoz (EDTA) kötve is előfordulhatnak.

A rázott tenyészetekbe vagy a fermentorba a mikroorganizmus-tenyészetet 0,1-20 térf./térf.% előnyösen 0,5-10 térf./térf.% és különösen előnyösen 0,5— 5 térf./térf.% mennyiségű inokulummal visszük be. A

HU 209 950 Β tenyésztés időtartama 30 °C-on kb. 2-7 nap, nagytérfogatú fermentáció esetében ritkábban max. 10. nap vagy ennél hosszabb. A nagytérforgatú fermentációk esetében célszerűen először kisebb előtenyészeteket állítunk elő. A Sorangium cellulosum törzsek rögzített formában is alkalmazhatók, pl. algináthoz mint hordozóhoz rögzített sejtekként.

A fenti értelemben „levezethető klórí’-nak tekintendő minden olyan tenyészet, amely még mutatja a találmány szerinti eljárás végrehajtása szempontjából lényeges ismérveket. Különösen ilyen egy tenyészet, amelyben a mikroorganizmusok ugyanazokat a struktúrgéneket tartalmazzák, mint az „So ce 139”, „So ce 170”, „So ce 191”, „So ce 192”, „So ce 231” és „So ce 242”, amely törzsek eredeti struktúrgénjei felelősek az (I) általános képletű vegyületek képzéséért. Levezethető kiónnak tekintünk minden olyan tenyészetet is, amelyben a mikroorganizmusok a 6 törzs (I) általános képletű vegyületek képződéséért eredetileg felelős struktúrgénjei - a genetikai kód torzítása szempontjából véve - lehetséges ekvivalensét tartalmazzák. Levezethető kiónnak tekintendő konkréten minden olyan tenyészet, amely a cellulózt lebontó - előnyösen Sorangium cellulosum fajtához tartozó - Myxobaktériumokat tartalmaz, amelyek képesek az (I) általános képletű vegyületek termelésére. A DSM 5397, DSM 4795, DSM 4796, DSM 4797, DSM 5393 és DSM 5414 törzs „levezethető kiónjának” fogalma magában foglal minden mutánst vagy variánst is, amely az (I) általános képletű vegyületek termelésére képes.

A tenyésztést aerob körülmények között végezzük, tehát pl. nyugvó felületi tenyészetben vagy előnyösen szubmerz módon, rázatással vagy kevertetéssel, levegő vagy oxigén bevezetésével, rázott tenyészetekben vagy fermentorokban. Előnyös többlépcsős tenyésztést végzünk, azaz először egy vagy több előtenyészetet állítunk elő folyékony táptalajban, amelyekkel azután a tulajdonképpeni termelő táptalajt beoltjuk, pl. 1:20 arányban.

A szorafenek elkülönítését fizikokémiai úton végezzük, ismert elkülönítési módszerek, pl. szűrés, de különösen oldószeres extrakció és kromatografálás segítségével (ilyen mindenekelőtt az abszorpciós és a megosztási kromatográfia) és adott esetben kristályosítással.

A vizes fermentléből az (I) általános képletű vegyületek lipofil szerves oldószerekkel extrahálhatók. Ilyenek pl.

- a ketonok, mint a metil-etil-keton, ciklohexanon,

- közepes szénatomszámú alkoholok, mint az izobutanol, pentánok hexánok

- az ecetsav 1-6 szénatomos alkilészterei (etil-acetát, propil-acetát, butil-acetát, izobutil-acetát stb.),

- toluol, diklór-metán, 1,2-diklór-etán, klór-benzol, diklór-benzol stb.

A szűrt sejttömegből (szűrőlepényből) a vegyületek alkoholokkal vagy ketonokkal (pl. metanollal, etanollal, acetonnal, metil-etil-ketonnal) könnyen extrahálhatók.

A mindenkori extraktumokból bepárlással és/vagy kicsapással kinyerhetők az (I) általános képletű vegyületek, amelyeket frakciónak kristályosítással vagy más kromatográfiás elválasztási eljárással a Táblázat szerinti szorafenekre bonthatunk fel (a szorafen A - szorafen ró jelű vegyületeket tekintve).

Az (I) általános képletű vegyületek előállítására irányuló fermentációs eljárás előnyösen azzal zárul, hogy egy adszorbens gyantát adunk a fermentléhez (amely a keresett termékeket adszorbeálja, vagy a fermentációt kezdettől fogva egy ilyen adszorbens gyanta jelenlétében végezzük. Adszorbens gyantaként mindenekelőtt semleges szerves polimerek vehetők figyelembe, különösen a nemionos hidrofób adszorbens gyanták, amelyek a lipofil extrakció szempontjából megfelelők. A gyanta az (I) általános képletű vegyületeket csaknem kvantitatíve megköti. Ilyen gyanta pl. a félig poláris akrilészter-gyanta, az apoláris polisztirol/divinil-benzol gyanta és különösen a térhálós polisztirol. Ezeket a gyantákat a fermentációs térfogat 0,1-5 térf./térf.%-ának megfelelő mennyiségben (előnyösen 0,5-2 térf./térf.% mennyiségben) adagoljuk. Aktívszén alkalmazása is szóba jöhet. Technikailag különösen előnyösek a polisztriol gyanták, pl. az XAD1180 vagy az XAD-16 (gyártó: Rohm és Haas), amelyek szűrhető alakban (szemcsék vagy granulátumok alakjában) szerezhetők be. A fermentáció befejezése után a gyantát szűrjük, vízzel mossuk és metanollal és etanollal kezeljük. Az alkoholos kivonatot bepároljuk. Dietil-éter, etilacetát vagy butil-acetát hozzáadására elkülöníthető a nagymértékben kikristályosodott (IA) általános képletű vegyület (azaz a szorafen A).

A szűrletet a fennmaradó szorafen A és mindenekelőtt a többi szorafen (szorafen B-szigma) kinyerésére kromatográfiásan tisztítjuk.

A találmány tárgya az (I) általános képletű vegyületek tiszta ill. kristályos alakban való előállítása. A találmány vonatkozik azonban az (I) általános képletű vegyületeket tartalmazó, a fermentációból kinyert biomasszára, nyers kivonatokra vagy adszorbens gyantákra is, amelyek önmagukban vagy egy további lépésben formázott alakban a növényi betegségek elhárítására. A biomassza őrölt vagy préselt száraz anyag (cake) alakjában is alkalmazható a továbbfelhasználás során, vagy kereskedelmi forgalomba hozható.

A leírt előállítási eljárás - minden rész-lépést beleértve - a találmány részét képezi.

A találmány tárgya konkréten eljárás (I) általános képletű szorafenek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Sorangium cellulosum „So ce 139”, „So ce 170”, „So ce 191”, „So ce 192”, „So ce 231” vagy „So ce 242” törzset vagy egy olyan mikroorganizmust, amely az említett törzseknek a szorafenek képzéséért felelős struktúrgénjeivel azonos struktúrgéneket tartalmaz, vizes táptalajban - amely szénhidrát- és nitrogén-forrást, valamint szervetlen sókat tartalmaz - aerob körülmények között tenyésztünk és az (I) általános képletű szorafeneket elkülönítjük.

A találmány mindenekelőtt az említett eljárás egy foganatosítási módjára vonatkozik, amely azzal jelle4

HU 209 950 Β mezhető, hogy egy, a cellulózbontó Myxobaktériumok csoportjába tartozó, szorafent termelő mikroorganizmust tenyésztünk.

Az említett eljárás egy előnyös foganatosítási módja azzal jellemezhető, hogy az „So ce 139”, „So ce 170”, „So ce 191”, „So ce 192”, „So ce 231”, „So ce 242” Sorangium cellulosum törzset vagy e törzsek egy szorafeneket termelő mutánsát tenyésztjük.

Az előbbiekben említett eljárás egy különösen előnyös kiviteli alakjára az jellemző, hogy egy, a Budapesti Szerződés szerint letétbe helyezett „So ce 139”, „So ce 170”, „So ce 191”, „So ce 192”, „So ce 231” vagy „So ce 242” törzset tenyésztünk.

A fermentációt előnyösen a példa-részben leírt körülmények között hajtjuk végre.

Azokat a mikroorganizmusokat, amelyek ugyanazokat - a szorafenek képzéséért felelős-struktúrgéneket tartalmazzák, mint az említett 6 törzs, pl. génmanipuláció segítségével, mesterségesen állíthatjuk elő. Ennek során a megfelelő struktúrgéneket a 6 törzsből elkülönítjük és megfelelő helyen egy másik, alkalmas mikroorganizmus génanyagába építjük be. Megfelelők azok a mikroorganizmusok, amelyekbe a vonatkozó struktúrgének nemcsak beépíthetők, hanem amelyekben ezek a struktúrgének ki is tudnak fejeződni és amelyekben a képződött szorafen nem bomlik le, hanem előnyösen a fermentlébe választódik ki.

Ilyen megfelelő mikroorganizmusok elsősorban más Myxobaktérium törzsek, különösen a Sorangium cellulosum fajtához tartozók, hacsak már eleve nem tartalmazzák az említett struktúrgéneket.

Szorafen-termelő mutánsokat előállíthatunk pl. UV vagy röntgensugarak vagy kémiai mutagének (pl. Nmetil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin) alkalmazásával. Ezeket a mutánsokat jellemző tulajdonságaik alapján ismert módon különíthetjük el. A mikroorganizmusok mutánsainak és rekombinánsainak előállításához szükséges további eljárási lépések a szakember számára ismertek és szokásosak.

Ugyancsak a találmány tárgya eljárás egy olyan fermentációs termék előállítására, amely kimutatható mennyiségben tartalmaz szorafent és amelyre az jellemző, hogy egy Sorangium cellulosum „So ce 139”, „So ce 170”, „So ce 191”, „So ce 192”, „So ce 231”, „So ce 242” törzset vagy ezekből a törzsekből leszármaztatható kiónt táptalajban tenyésztünk és a szorafent megfelelő alakban kinyerjük. Ezek a fermentlevek önmagukban vagy betöményített alakban, adott esetben további hordozóanyagok vagy az eloszlatást elősegítő szerek hozzáadása után a növénypatogén mikroorganizmusok elleni készítményként használhatók fel és ezért a találmány fontos részét képezik.

Szőkébb értelemben a találmány szerinti eljárásra az jellemző, hogy az „So ce 139”, „So ce 170”, „So ce 191”, „So ce 192”, „So ce 231” vagy „So ce 242” Sorangium cellulosum mikroorganizmusok egyikét egy táptalajban - amely legalább 1 asszimilálható Cforrást és N-forrást, valamint megfelelő szervetlen sókat tartalmaz -10-40 °C-on (előnyösen 10-35 °C-on) adott esetben egy adszorbens gyanta jelenlétében tenyésztjük, majd a fermentlevet ill. a kiszűrt adszorbens gyantát megfelelő oldószerrel extraháljuk, a kapott oldatot bepároljuk és a visszamaradó anyagot kívánt esetben kromatografálással és/vagy kristályosítással tisztítjuk.

A törzsek tenyészetei és morfológiai leírásuk:

A törzsek tenyészeteit VY/agar lemezeken tartjuk fenn; ennek összetétele:

0,5% (nedvességet tartalmazó) pékélesztő,

0,1% CaCl₂

1,5% agar pH 7,2

A tenyészetek eltarthatok ST21 agarra helyezett szűrőpapíron is, amely a cellulóz-forrás szerepét játszsza. Az agar összetétele:

0,1% KNO₃

0,1% MgSO₄-7H₂O

0,l%CaCl₂

0,1% K₂HP₄

0,01% MnSO₄-7H₂O

0,02% FeCl₃

0,002% élesztőkivonat % agar standard nyomelem oldat:

0,02-0,5 mg Μη-, Μο-, Cu-, Co- és/vagy Zn-só/liter (R. Y. Stanier et al., General Microbiology, 4. kiadás, p. 36. 1976) vagy

500 mg EDTA, 300 mg FeSO₄.7H₂O, 3 mg MnCl₂.4H₂O, 5 mg CoCl₂.6H₂O, 1 mg CuCl₂.2H₂O, 2 mg NiCl₂.6H₂O, 3 mg Na₂Mo.O₄2H₂O, 5 mg ZnSO₄.7H₂O, 2 mg H₃BO₃/liter deszt. víz (kb. pH 4) (G. Drews, Mikrobiol-Praktikum, 4. kiadás, p. 11, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo, 1983).

A lemezeket 30 °C-on inkubáljuk.

A mikroorganizmusok mindkét táptalajon csoporttelepeket képeznek, amelyek lassan terjednek szét a szubsztrátumon. A részletek tekintetében a 6 törzs között jelentős különbségek figyelhetők meg.

1) „So ce 139” (DSM 5397):

Az ST21 agarra helyezett szűrőpapíron a telep-csoport nagymértékben a szűrőpapírra korlátozódik. Az idősebb tenyészetekben a szűrőpapír szélénél az agar felhasad és a telep és az agar egybeolvad. A szűrőpapír teljesen lebomlik, helyén egy feketésbarna termőtestekből álló, sűrűn benőtt terület található. Ezek a termőtestek kis, 15-30 μιη átmérőjű sporangiolumokból tevődnek össze, amelyek kis csomókká vagy kiterjedt, tagolatlan tömegekké állnak össze. A vegetatív sejtek vékony hengeres pálcák, tompán lekerekített végekkel; méretük 0,77-0,9x2,5-4 μπι. A fáziskontrasztmikroszkópban sötéten jelennek meg, gyakran világos szemcsékkel a pólusokon. VY-2 agaron óriás-csoporttelepeket képeznek színtelentől narancsszínűig terjedő sugárirányú erezettel és sok sötétbarna termőtesttel, amelyek felépítése az előbbiekben leírtakhoz hasonló. A táptalajban jelenlevő élesztősejteket alig támadják meg. A vegetatív sejtek valamivel keményebbnek tűnnek és vastagságuk kb. 1 μιη.

2) „So ce 170 (DSM 4795):

Al ST21 agarra helyezett szűrőpapíron a telep

HU 209 950 Β messze meghaladja a szűrőpapír területét és kinyúlik az agar-felüleírre. Az agar a későbbiekben mélyen felhasad, és a ntilepcsoport begyűrődik. A szűrőpapíron kialakulhatnak termőtestek. Ezek kis, vastagfalú sötétbarna sporaagiolumokból állnak, amelyek mérete álta- 5 Iában 20-30 (pm (átmérő). E termőtestek többnyire szorosan tömörülnek, élesen elhatárolt hosszúkás csomók alakjában, amelyek mérete (átmérő) kb. 50200 pm. Au termőtestekből helyenként összefüggő, kiterjedt aggregátumok alakulhatnak ki. VY-2 agaron 10 többnyire li-l-em átmérőjű közepes, vastag nyalkával fedett, intenzív narancsszínű telepcsoportok képződnek. Az élesztősejtek lassan lebomlanak. Az agar itt is helyenként; mélyen felhasad, úgyhogy a telepcsoport teljesen kieáhgt a lemezből. Az agar felületén gyakran 15 képződnek narancsszínű, vagy a világostól a sötétbarnáig terjesSS színű, a fentiekhez hasonló szerkezetű termőtestek. A vegetatív sejtek tömöttek, a fáziskontrasztmikrorstkóípban sötét pálcáknak tűnnek, széles, lekerekített végekkel; méretük általában 0,8-1,0x2- 20 5 pm. A törzs nagyon hatásosan bontja le a kitint is.

3) „Soem ,191 ” (DSM4796):

ST21 adatra helyezett szűrőpapíron növekszik anélkül, hogy átnyúlna az agar felületére. Az agar ebben az esettben is mélyen felhasadhat a szűrőpapír kö- 25 rül és a telepscsoport begyűrődheL VY/2 agaron nagy,

6-8 cm átmérőjű telepcsoportok képződnek, finomtól erősig teijeöő sugárirányú erezettel. Az élesztősejtek alig sérülraek. A hengeres vegetatív pálcácskák széles lekerekített regekkel rendelkeznek, és a fáziskontraszt- 30 mikroszkópban’ sötét, gyakran elég hosszú alakzatoknak tűnnelk; méretük általában 0,7-0,9x3-8 pm. A törzs tiszta tenyészetben az említett tenyésztési körülmények köziött nem képez termőtesteket. A törzs hatékonyan bontjjaíie a kitint. 35

4) „So ere T92 (DSM4797):

Az ST2E agar felületére helyezett szűrőpapíron való tenyésztés során a papíron túl messze szétterjed az agar felületém.Az agar mélyen felrepedhet, és az óriástelepek begyurodhetnek. Az agar felületén, de különö- 40 sen a szűrőpapíron sok fényes narancssárga színű termőtest képződik, amelyek kisméretű (átmérő többnyire 10-20 pm) sprarangiolumokból állnak. Ezek éles határokkal rendidikezŐ csoportokat alkotnak, amelyek mérete ál találóan 50-500 pm. A VY/2 agaron közepes 45 nagyságú (átmérő 2-3 cm) telepcsoportok intenzív képződése figjsifctő meg. Ezek radiális erezetet mutatnak. Az agaiban és az agaron sok, intenzív barnás-narancsszínűt, az előbbiekben leírthoz hasonló szerkezetű termőtest látható. A vegetatív sejtek hengeres, sötétszí- 50 nű kis pálcáik, széles végekkel; méretük általában 0,70,9x3-5 pm. Az élesztősejteket nem bontja le a törzs, ezzel szemben nagyon intenzíven lebontja a kitint

5) „So cel231 (DSM 5393):

Az ST2I ugarra helyezett szűrőpapíron való te- 55 nyésztés esetéfeen nem terjed át az agar-felületre. Az agar a szűrőpapír szélénél esetleg felhasad, de a telepek nem gyűrőfeek be. A szűrőpapír teljesen lebomlik: helyén későbtb intenzív bama-narancsszínű termétestekkel nagyra®‘sűrűn benőtt terület figyelhető meg. En- 60 nek a termőtest-tömegnek a szerkezete hasonló a többi törzs esetében leírthoz, de jellemző az, hogy a sporangiolumok gyakran sávokban rendeződnek el. A VY/2 agaron igen nagy telepcsoportok képződnek; ezek finom erekből álló sugárirányú kötegeket mutatnak. Helyileg fényes narancssárga-barna termőtestek fejlődnek ki. A vékony vegetatív pálcikák nagyon finom felépítésűek és méretük 0,6-0,8x2,5-6 pm. A táptalaj élesztősejtjei lassú lízisen mennek át. A törzs nagyon hatékonyan bontja le a kitint.

6) „Soce 242” (DSM 5414):

Az ST21 agarra helyezett szűrőpapírra ránő és ott is képez termőtesteket. Az agar a szűrőpapír szélén mélyen felhasad. A szűrőpapír teljesen lebomlik: helyette feketés-bama termőtestekből álló sűrű tömeg figyelhető meg. Ebben a sporangiolumok gyakran láncokban rendeződnek el. A VY/2 agaron igen nagy telepcsoportok alakulnak ki, finom sugárirányú erezettel. A telepek közelében az agar sok helyen kapanyom-szerűen felhasad. Ezenkívül termőtestek intenzív fejlődése figyelhető meg. A táptalajban jelenlevő élesztősejtek lassan lebomlanak. A vegetatív sejtek mérete 0,7-1,0x24 pm. A törzs igen hatásos kitin-bontó.

A törzsek olyan anyagokat termelnek, amelyek számos élesztő és fonalas gomba növekedését gátolják. A gátló anyagok tekintetében kémiailag nemcsak a szorafeneket kell figyelembe vennünk, amelyek szerkezete, mint erre a következőkben rámutatunk, már tisztázott. Ezek a szorafen-típusú makrociklusos vegyületeket tartalmazó keverékek a fermentlében a felülúszóban jelennek meg, de a sejtekből is elkülöníthetők. Az antibiotikum-termelés a logaritmikus fázistól kezdve, a stacionárius növekedési fázisig (a logaritmikus fázis alatt) megy végbe.

Mind a hat törzsnek adaptálódnia kell a folyékony közegekben való növekedéshez. A törzsek eleinte kis, stabil, narancsszínű csomók alakjában növekednek és csak több - folyadék-közegből folyadék-közegbe történő - átviteli lépés után képeznek, lassanként, többé-kevésbé homogén sejtszuszpenziókat.

Az „So ce 139”, „So ce 170, „So ce 191, „So ce 192, „So ce 231” és az „So ce 242 törzs biológiai jellemzése cellulóz-lebontás: + glukóz-lebontás: + keményítő-lebontás: +

NH₄ mint N-forrás: +

NO₃ mint N-forrás: +

II. táblázat

Példák azokra az organizmusokra, amelyek növekedését az So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231 és az So ce 242 törzs tenyészetének felülúszója gátolja

Élesztő

Debaromyces hansenii Nematospora coryli Candida albicans Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula glutinis Hansenula anomala

Értékelés⁺ erős gátlás erős gátlás erős gátlás középerős gátlás középerős gátlás középerős gátlás

HU 209 950 Β

Nadsonia fulvescens	nincs gátlás
Torulopsis glabrata	nincs gátlás
Schizosaccharomyces pombe	nincs gátlás
Fonalas gomba
Alternaria solani	erős gátlás
Pythium debaryanum	erős gátlás
Mucor hiemalis	erős gátlás
Rhizopus arrhizus	gyenge gátlás

⁺ A gátlási értékek egy átlagos tenyészetre vonatkoznak és egymáshoz viszonyítottaknak tekintendők.

A találmány tárgya az (I) általános képlet körébe tartozó szorafen C-szigma tiszta alakban való előállítása. A találmány vonatkozik azonban azokra a fermentációkból származó biomasszákra, nyers kivonatokra vagy adszorbens gyantákra is, amelyek az (I) általános képlet körébe tartozó szorafen C-szigma vegyületeket tartalmazzák és önmagukban vagy feldolgozott (kikészített) alakban növényi betegségek elhárítására alkalmazhatók. A biomasszák őrölt vagy préselt száraz anyagként (cake) is alkalmazhatók vagy kereskedelemben forgalomba hozhatók.

A leírt előállítási eljárások - valamennyi rész-lépést beleértve - a találmány részét képezik.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az (I) általános képletű vegyületek nagyon kedvező biocid spektrummal rendelkeznek fitopatogén mikroorganizmusokkal, különösen gombákkal szemben. Igen előnyös kuratív, szisztémás és különösen preventív tulajdonságokkal rendelkeznek és számos kultúrnövény védelmére alkalmazhatók. Az (I) általános képletű hatóanyagok alkalmazásával a növényeken vagy növény-részeken (gyümölcs, virág, lomb, szár, gumó, gyökér) a legkülönbözőbb haszonnövény kultúrákban fellépő kártevők fejlődése megállítható és a kártevők elpusztíthatok. Emellett a később kinőtt növényi részt is megkíméljük a növénypatogén mikroorganizmusok hatásától.

Az (I) általános képletű vegyületek mikrobicid anyagként pl. a következő osztályokba tartozó növénypatogén gombákkal szemben hatásosak:

- Fungi imperfecti (pl. különösen a Botrytis, továbbá a következők: Pyricularia, Helminthosporium, Fusarium, Septoria, Cercospora és Alternaria);

- Basidiomyceták (pl. Rhizoctonia, Hemileia, Puccinia).

Ezenkívül hatásosak az Ascomyceták (pl. különösen a Venturia és az Erysiphe, továbbá a Podosphaera, monilia, Unicula alosztályt) és az Oemyceták osztály (pl. a Phytophtora, Plasmopara alosztály) ellen.

Az (I) általános képletű vegyületek továbbá csávázószerként alkalmazhatók szaporítóanyag (gyümölcs, gumó, mag) és dugványok kezelésére, a gombafertőzéstől való védelem érdekében, valamint a talajban fellépő növénypatogén gombák ellen.

A találmány tárgyát képezik azok a szerek is, amelyek hatóanyagként egy vagy több, az (I) általános képletű vegyületek közé tartozó szorafen C-szigma vegyületet tartalmaznak, különösen a növényvédőszerek, valamint ezek alkalmazása a mezőgazdasági szektorban vagy ezzel rokon területeken.

Az előbbiekben vázolt növényvédelmi alkalmazás szempontjából a találmány keretében célkultúráknak pl. a következő növényfajták tekintendők:

- gabonafélék (búza, köles, rozs, zab, rizs, kukorica, árpa és hasonlók),

- répa (cukorrépa és takarmányrépa),

- almafélék, csonthéjas és bogyós gyümölcsök (alma, körte, szilva, őszibarack, mandula, cseresznye, eper, málna és szeder),

- hüvelyesek (bab, lencse, borsó, szója),

- olajos magvúak (repce, mustár, mák, olajbogyó, napraforgó, kókusz, ricinus, kakaó, földimogyoró),

- uborkafélék (tök, uborka, dinnye),

- rostos növények (gyapot, len, kender, juta),

- citrusfélék (narancs, citrom, mandarin, szentjánoskenyér),

- főzelékfélék (spenót, fejes saláta, spárga, káposztafélék, sárgarépa, hagyma, paradicsom, burgonya, paprika),

- babérfélék (avocado, fahéj, kámfor), valamint a következő növények:

dohány, dió, kávé, ananász, cukornád, tea, bors, szőlő, komló, banán és természetes gumi, ill. a dísznövények (Compositae).

Az előbbi felsorolás nem jelent korlátozást.

Az (I) általános képletű vegyületeket rendszerint készítmények alakjában alkalmazzuk és egyidejűleg vagy egymás után adagolhatjuk különböző további hatóanyagokkal a kezelendő felületre vagy növényhez. Ezek a további hatóanyagok ugyancsak csávázószerek, nyomelem-források vagy más, a növényi növekedést befolyásoló készítmények lehetnek. Ennek során alkalmazhatók szelektív herbicidek is, valamint inszekticidek, fungicidek, baktericidek, nematocidek, molluszkicidek vagy több ilyen készítmény keverékei, adott esetben további, a formázási technikában szokásos vivőanyagokkal, tenzidekkeí vagy más, az alkalmazást elősegítő adalékanyaggal.

A megfelelő vivőanyagok és adalékanyagok szilárd vagy folyékony anyagok lehetnek és ilyenekként a formázási technikában célszerűen alkalmazott anyagok vehetők figyelembe, pl. a természetes vagy regenerált ásványi anyagok, oldó-, diszpergáló-, nedvesítő-, tapadást fokozó, sűrítő, kötő- vagy trágyaként ható anyagok.

Egy (I) általános képletű hatóanyag ill. egy olyan agrokémiai készítmény felvitelére, amely legalább 1 ilyen hatóanyagot tartalmaz, egy előnyös eljárás szerint azt a levélzetre visszük rá („a levélzetre való alkalmazás”). A felvitel gyakorisága és az alkalmazott mennyiség ennek során a szóbanforgó kárhatásának intenzitásától függ. Az (I) általános képletű hatóanyagok azonban a talaj fölött, a növény gyökérzetének hatására is bejuthatnak a növénybe (szisztémás hatás), ha a növény telepítésének helyét folyékony készítménnyel öntözzük vagy a hatóanyagokat szilárd alakban - pl. granulátumok alakjában - bejuttatjuk a talajba („alkalmazás a talajban”). Ilyen granulátumként vagy megfelelő porként alkalmazható a fermentorból eltávolított

HU 209 950 Β biomassza száraz anyaga vagy a fermentléből kiszűrt és az (I) általános képletű hatóanyagokat tartalmazó adszorbens gyanta is (bevonás), oly módon, hogy a magvakat a hatóanyagot tartalmazó folyékony készítményben áztatjuk vagy szilárd készítménnyel vonjuk be.

Az (I) általános képletű vegyületek ennek során önmagukban vagy előnyösen a formázási technikában szokásos segédanyagokkal együtt alkalmazhatók. Az utóbbi esetben célszerűen pl. a következő alakokban formázhatok;

- emulziós koncentrátumok,

- kenhető pépek,

- közvetlenül permetezhető vagy hígítható oldatok,

- hígított emulziók,

- permetezhető porok,

- oldható porok,

- porozószerek,

- granulátumok,

- pl. polimer anyagokból készült kapszulákba való töltés, a formázási technikában szokásos módon.

Az alkalmazási módot (permetezés, ködképzés, porozás, szétszórás, bekenés vagy öntözés), akárcsak az alkalmazott készítményt, az elérni kívánt cél és az adott körülmények függvényében választjuk meg. A felhasználandó mennyiség általában előnyösen a következő': 10 g-2 kg aktív anyag (AS) hektáronként, előnyösen 50 g-500 g AS hektáronként.

A formázott készítmények, azaz az (I) általános képletű hatóanyagot és adott esetben egy szilárd vagy folyékony adalékanyagot tartalmazó szerek ismert módon állíthatók elő.

Oldószerként a következők vehetők figyelembe:

- aromás és alifás szénhidrogének, mint pl. xilolelegyek, ciklohexán vagy paraffinok,

- alkoholok és glikolok, valamint ezek éterei és észterei, mint etanol, etilén-glikol, etilén-glikolmonometil- vagy etil-éter, etil-acetát,

- ketonok, mint ciklohexanon, erősen poláris oldószerek (pl. N-metil-2-pirrolidon, dimetil-szulfoxid vagy dimetil-formamid),

- adott esetben epoxidált növényi olajok, mint epoxidált kókuszdió olaj vagy szójaolaj, vagy

- víz.

Szilárd vivőanyagként - pl. porozószerek és diszpergálható porok esetében - általában természetes kőzetekből készített őrleményt alkalmazunk (ilyen ásvány pl. a kalcit, talkum, kaolin, montmorillonit vagy attapulgit). A fizikai tulajdonságok javítására adagolhatunk nagydiszperzitású kovasavat vagy nagydiszperzitású nedvszívó polimerizátumokat is. Szemcsézett, adszorpcióra képes granulátumok hordozóiként porózus féleségek vehetők figyelembe (pl. horzsakő, tégla-töredékek, szepiolit vagy bentonit), nem-szívóképes vivőanyagként pedig pl. kalcit vagy homok. Ezenkívül számos szervetlen előgranulált anyag alkalmazható, különösen a dolomit, vagy aprított növényi hulladékok.

Felületaktív anyagként a formázandó (I) általános képletű hatóanyag minőségétől függően nem-ionogén, kation- vagy anion-aktív tenzideket alkalmazhatunk, amelyek jó emulgeáló, diszpergáló vagy nedvesítő tulajdonságokkal rendelkeznek. A „tenzidek” kifejezés tenzid-keverékeket is jelent.

Megfelelő anionos tenzidek lehetnek az ún. vízoldható szappanok, valamint a vízoldható szerves felületaktív vegyületek is.

Gyakrabban azonban inkább ún. szintetikus tenzideket alkalmazunk, különösen alkán-:-/súfonátokat, zsíralkohol-szulfonátokat, szulfonált b- .zimidazolszármazékokat vagy alkil-szulfonátokat.

Nem-ionos tenzidként alifás vagy cikioalifás alkoholok, telített vagy telítetlen zsírsavak c.. alkil-fenolok poliglikol-éter-származékai jöhetnek s/óba, amelyek az (alifás) szénhidrogén csoportban 3-30 glikol-éter csoportot és 8-20 szénatomot és az alkil-fenolok alkilcsoportjában 6-18 szénatomot tartalmazhatnak.

További példaként a következőket említjük meg nem-ionos tenzidként:

nonil-fenol-polietoxi-etanol, ricinusolaj-poliglikoléter, polipropilén-polietilén-oxid adduktumok, tributilfenoxi-polietilén-etanol, polietilén-glikol és oktil-fenoxi-polietoxi-etanol.

Továbbá polioxi-etilén-szorbitán-zsírsavészterek is szóbajöhetnek, mint a polioxietilén-szorbitán-trioleát.

A formázási technikában használatos tenzideket pl. a következő közlemények ismertetik:

„Mc Cutcheon” Detergents and Emulsifiers Annual”, MC Publ. Co., Ridgewood, New Jersey, 1980 „Encyclopedia of Surface Active Agents”, Sisley and Wood; Chemical Publ. Co., Inc., New York, 1980.

Különösen előnyös, az alkalmazást elősegítő adalékok - amelyek alkalmazása a felhasználandó mennyiség erőteljes csökkentéséhez vezethet - továbbá a természetes (állati vagy növényi eredetű) vagy szintetikus foszfolipidek, amilyenek a kefalinok és a lecitinek. pl. a foszfatidil-etanol-amin, foszfatidil-szerin, foszfatidilglicerin vagy a lizolecitin.

Az agrokémiai készítmények általában 0,1-95 t% (I) általános képletű hatóanyagot, 99,9-51% szilárd vagy folyékony adalékanyagot és 0-251% tenzidet tartalmaznak.

Míg a kereskedelmi forgalomban inkább a koncentrált készítményeket tüntetjük ki, a végfelhasználó rendszerint hígított szereket alkalmaz.

A szerek különleges hatások elérése céljából további adalékanyagokat is tartalmazhatnak, amilyenek a stabilizátorok, habzásgátlók, a viszkozitást szabályozó anyagok, kötőanyagok, tapadást fokozó anyagok, valamint trágya ill. más hatóanyagok.

1. ábra A szorafenek (A-Q) kromatográfiás elkülönítésének folyamatábrája;

2. ábra A szorafenek (A-szigma) kromatográfiás szétválasztásának folyamatábrája.

A következő példák a találmány további szemléltetésére szolgálnak, annak korlátozása nélkül.

1. Előállítási példák

H-l példa: Az (I) általános képletű vegyületek előállítása adszorbens gyanta jelenlétében Az eljárást 1000 liter fermentációs térfogatban hajt1

HU 209 950 Β juk végre, 0,5 térf ./térf. % XAD-1180 (Rohm és Haas) adszorbens gyanta hozzáadásával. Ugyanazokat az eljárási körülményeket alkalmazzuk, amelyeket a következő H-2 példában ismertetünk. Az itt alkalmazott So ce 26 helyett (amely az EP-A-282,455-nek felel meg) a találmány szerinti 6 említett törzs bármelyike alkalmazható.

A fermentáció befejeződése után a polimer hordozót leszűrjük, üvegoszlopban felszuszpendáljuk, 3 ágytérfogatnyi vízzel mossuk és 4 ágy-térfogatnyi metanollal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban szárazra pároljuk.

A kinyert nyers kivonat mennyisége: 165 g.

További kromatográfiás tisztítást végzünk a mellékelt 1. ábrán látható séma szerint. Az egyes eljárási lépéseket az elkülönítés során a következő körülmények között hajtjuk végre. A kitermelési adatokat zárójelben adjuk meg. A „h” jelölés „órát” jelent.

A szorafen A-Q izolálására irányuló szétválasztási eljárás

1. Elkülönítés szilikagélen: 100 mm, 45 cm oszlophosszúság;

Szorbens: Lichroprep Si 100; 40-63 pm (Merck), Futtatószer: diklór-metán/aceton a következő lépcsőkben: 98/2, 95/5, 93/7, 90/10. 50/50, lépésenként 2 liter, frakciót szedünk.

A 3. frakció tartalmazza a szorafen A-t.

A 4. frakciót (25 g) tovább tisztítjuk.

2. Gélkromatográfia: oszlopméret 60 mm 0, 100 cm hosszúság,

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH),

Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A 3. frakciót (17 g) tovább tisztítjuk.

3. Fordított fázisú szétválasztás: az oszlopméret 76 mm 0. 70 cm hosszúság,

Szorbens: HDSIL RP 18; 18-60-60, 35-70 pm (Labomatic),

Futtatószer: metanol/víz 40/60, lineáris grádiens 2 órával a metanol után.

frakciót szedünk.

A 3., 4., 5. és 6. frakciót (tömegük 1,3 g; 1,5 g;

3,5 g és 1,6 g) tovább tisztítjuk.

4. Szétválasztás szilikagél oszlopon: oszlopméret 40 mm 0, 30 cm hosszúság

Szorbens: Lichrosorb Si 100,7 pm (Merck), Futtatószer: 2% metanolt tartalmazó 1:1 diklór-metán:hexán elegy.

frakciót szedünk.

A 2. és a 4. frakciót (tömegük 500 mg ill. 88 mg) tovább tisztítjuk.

5. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret 40 mm 0, hosszúság 30 cm

Szorbens: Lichrosorb Si 100,7 pm (Merck), Futtatószer: 2% metanolt tartalmazó diklór-metán/hexán 1/1.

frakciót szedünk.

A 3. frakciót (tömege 500 mg) tovább tisztítjuk.

6. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret 35 mm 0, 45 cm hosszúság.

Szorbens: Lichroprop Si 60, 40-63 pm (Merck), Futtatószer: diklór-metán, lineáris grádiens 1 órával a diklór-metán:aceton 1:1 után.

frakciót szedünk.

Az 1. és a 2. frakciót (tömege 2,4 g ill. 400 mg) tovább tisztítjuk.

7. Fordított fázisú szétválasztás; oszlopméret: 35 mm 0, 45 cm hosszúság,

Szorbens: HDSIL RP-18-30-60, 25-40 pm (Labomatic),

Futtatószer: metanokvíz 80:20.

frakciót szedünk.

A 7. frakciót (tömege 1,4 g) tovább tisztítjuk.

8. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20,5 mm 0,25 cm hosszúság.

Szorbens: Nucleosil 100-7 C_lg; 7 pm (MachereyNagel),

Futtatószer: 70/30 metanol/víz.

frakciót szedünk. A 3. frakciót (15 mg) tovább tisztítjuk.

A 7. frakció 18 mg szorafen N-t tartalmaz.

9. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság,

Szorbens: Nucleosil 100-7 C₁₈, 7 pm (MachereyNagel),

Futtatószer: metanokvíz 65:35.

frakciót szedünk.

A 3. frakció 7 mg szorafen H-t tartalmaz.

10. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20,5 mm 0,25 cm hosszúság,

Szorbens: HDSIL 100 C_lg, 10 pm (Labomatic), Futtatószer: metanokvíz 65:35.

frakciót szedünk.

A 2. frakció 108 mg szorafen D-t tartalmaz.

.11. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret 40 mm

0, 30 cm hosszúság,

Szorbens: Lichrosorb Si 100, 7 pm (Merck), Futtatószer: 1% metanolt tartalmazó 1:1 diklór-metámhexán.

frakciót szedünk.

A 4. és a 6. frakciót (tömegük 530 mg ill. 280 mg) tovább tisztítjuk.

12. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret 40 mm 0, 30 cm hosszúság,

Szorbens: Lichrosorb Si 100, 7 pm (Merck), Futtatószer: 1% metanolt tartalmazó 1:1 diklór-metámhexán.

frakciót szedünk.

A 7. frakciót (290 mg) tovább tisztítjuk.

13. Kromatográfiás szétválasztás szilikagélen: oszlopméret 20,5 mm 0, 25 cm hosszúság,

Szorbens: Nucleosil Si 100-7,7 pm (Macherey-Nagel), Futtatószer: 1% metanolt tartalmazó 1:2 terc.butilmetil-éter:hexán.

frakciót szedünk.

Az 1. frakció 325 mg szorafen F-t tartalmaz.

14. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság,

HU 209 950 Β

Szorbens: Nucleosil 100-7 Cl8, 7 mm (MachereyNagel),

Futtatószer: 68/32 metanohvíz.

frakciót szedünk.

Az 1. frakció 3 mg szorafen Q-t tartalmaz.

15. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság,

Szorbens: Nucleosil 100-7 C₁₈, 7 pm (MachereyNagel),

Futtatószer: 66:34 metanohvíz.

frakciót szedünk.

Az 1. frakció 21 mg szorafen C-t tartalmaz.

A 2. frakció 230 mg szorafen B-t tartalmaz.

16. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság,

Szorbens: Nucleosil 100-7 C₁₈, 7 pm (MachereyNagel),

Futtatószer: 65/35 metanohvíz.

frakciót szedünk.

A 4. frakció 18 mg szorafen J-t tartalmaz,

A 9. frakció 96 mg szorafen E-t tartalmaz.

17. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság,

Szorbens: Nucleosil 100-7 C_!8, 7 pm (MachereyNagel),

Futtatószer: 70/30 metanol/víz.

frakciót szedünk.

A 6. frakció 98 mg szorafen M-t tartalmaz.

A szorafen C-Qfizikokémiai jellemzése

Szorafen C ϋ28^Η42θ8 Mz 506 IR (film):

3411, 2939, 2831, 1725, 1461, 1382, 1266, 1230, 1187, 1152, 1098, 1068, 1023,988,975.

¹³C-NMR (CDC1₃; delta, ppm):

10,3; 11,7; 12,5; 23,0; 26,0; 29,4; 35,6; 35,8; 46,2;

57,3; 57,6; 68,8; 72,5; 74,6; 74,9; 76,1; 83,7; 99,4;

125,0; 726,2; 128,2; 128,6; 137,3; 141,0; 170,6.

HPLC R_t = 8,6 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 C_I8, Macherey-Nagel

Futtatási sebesség: 1,5 ml/perc; futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm.

Szorafen D

C₂₇H₄₂O₈

Mz 494

IR (film):

3411, 2937, 2831, 1733, 1461, 1432, 1382, 1359, 1328, 1268, 1208, 1195, 1096, 1050,988,933. ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,7; 14,4; 22,8; 24,3; 25,0; 27,5; 27,7; 31,6; 35,3;

43,2; 57,5; 58,6; 69,1; 70,8; 71,2; 74,8; 80,7; 82,6;

97,7; 126,4; 128,0; 128,6; 141,0; 168,6.

HPLC R,= 7,4 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 Cl8, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc; futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm.

Szorafen E

C29H46O9

Mz 538

IR (film):

3398, 2939, 2829, 1725, 1461, 1430, 1380, 1266, 1235, 1191, 1156, 1102, 1044, 971 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,3; 10,5; 11,5; 23,0; 25,0; 29,5; 30,0; 35,3: 35,5;

40,2; 46,3; 56,4; 57,4; 58,0; 69,0; 71,3; 71,7: 75,0;

76,3; 80,2; 81,1; 99,9; 126,5; 128,1; 128,6; 140,9;

170,9

HPLC R,= 11,8 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm.

Szorafen F

C₂₉H₄₆O₈

Mz 522 IR (film):

3394, 2937, 2827, 1729, 1710, 1461, 1382. 1326,

1314, 1266, 1253, 1232, 1189, 1154, 1104, 1075,

1048,1021,994,971,907 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,4; 11,7; 14,1; 23,0; 24,2; 28,3; 28,8; 33,3; 34,1;

35,2; 45,7; 57,4; 57,9; 69,0; 70,1; 75,9; 76,3; 80,8;

82,1; 99,6; 126,6; 128,2; 128,6; 140,4; 171,8

HPLC R, = 8,1 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc; futtatószer 75/25 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm

Szorafen H

C₂₈H₄₂O₉

Mz 522 IR (film):

3444, 2935, 2867, 2833, 1723, 1459, 1409, 1382,

1334, 1270, 1230, 1179, 1156, 1104, 1069. 996,

971 ^I3C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,9; 11,6; 14,4; 23,4; 25,0; 28,6; 35,6; 36,3; 45,6;

57,7; 57,8; 67,5; 68,7; 69,2; 73,9; 76,1; 81,7; 100,1;

122,9; 126,0; 128,2; 128,7; 138,0, 140,6; 171,5

HPLC R, = 7,0 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 C₁₈ Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc; futtatószer: 65/36 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm.

Szorafen J

C_2gH₄₄O₈

Mz 508 IR (film):

3394; 2939; 2829; 1729; 1461; 1380; 1313; 1270;

1187; 1158; 1100; 1042; 987 ¹³C-NMR (delta, ppm):

11,5; 13,8; 14,3; 22,5; 24,1; 25,6; 25,8; 27,7; 31,6;

HU 209 950 Β

35,2; 36,3; 49,3; 57,3; 59,4: 69,6; 70,5; 72,6; 75,7; 81,0; 84,6; 98,2; 126,3; 128,1; 128,7; 141,3; 172,5 HPLC R_t = 8,1 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc; futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen M C28H44O9 Mz524

ÍR (film):

3396, 2939, 2831, 1725, 1461, 1380, 1270, 1235, 1191, 1154, 1075,1048, 994, 971, 898, 850 ¹³C-NMR (CDCI3, delta, ppm):

9,0; 10,4; 11,5; 23,1; 25,3; 28,3; 29,3; 35,1; 35,7; 40,3; 46,5; 57,2; 57,9; 68,8; 71,9; 72,9; 74,4; 76,3; 83,8; 99,6; 126,3; 128,0; 128,5; 141,2; 171,0

HPLC Rj = 8,5 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 Cl8, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc; futtatószer: metanol/víz 70/30

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen N C29H44O9 Mz 536

IR (film):

3444, 2966, 2939, 1731, 1461, 1380, 1309, 1268, 1224,1164,1098 ¹³C-NMR (CDCI3, delta, ppm):

13,8; 13,9; 23,3; 23,4; 24,2; 26,3; 26,7; 29,5; 32,1; 36,3; 50,3; 54,5; 57,6; 68,1; 75,2; 78,4; 79,9; 105,7; 125,8; 127,5; 128,4;

’C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

0,9 (d), 1,05 (d) 6,1,24 (d), 5,23 (d), 5,85 (dd) HPLC Rt=13,4 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc; futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV 210 mm Szorafen Q ^28^4408

Mz508

IR(film):

3448, 2939, 2831, 1733, 1459, 1382, 1330, 1270, 1203,1098,1048,987 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

11,5; 14,5; 23,1; 24,9; 26,2; 27,1; 31,7; 35,5; 35,9; 39,5; 50,7; 57,4; 58,7; 69,5; 71,3; 71,6; 74,6; 79,4; 81,9; 102,2; 126,6; 127,9; 128,4; 137,9; 168,0

HPLC R, = 7,7 perc

Oszlop: 4x250 mm, Nucleosil 100-7 C_lg, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc; futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV 210 nm

H-2 példa: Az (I) általános képletű vegyületek előállítása

a) Előtenyésztés

Az inokulumot 2 literes lombikokban állítjuk elő, amelyek 500 ml, következő összetételű táptalajt tartalmaznak:

0,1% kazein-pepton,

0,5% glukóz,

0,05% CaCl₂.H₂O,

0,05% MgSO₄.7H,O, pH 7,4 (puffer nélkül, vagy 50 mM HEPES pufferben; HEPES = 4-(2-hidroxi-etil)-piperazin-l-etán-szulfonsavkálium- és/vagy nátrium-só).

A lombikokat 160 ford./perc sebességgel 30 °C-on rázóasztalon rázatjuk. A fermentor-tenyészetbe való átvitel megfelelő időpontját a log-fázis felső szakasza (2-3 nap múlva érjük el.

Az itt alkalmazott So ce 192 törzs helyett a találmány szerinti többi 5 törzs bármelyike, vagy az A282,455 sz. európai közrebocsátási irat szerinti So ce 26 törzs is felhasználható.

b) Fermentáció:

Egy 70 literes fermentort (Giovanola Freres, Monthey, Svájc) - amely 60 liter, előbbi összetételű táptalajt tartalmaz - beoltunk 10 liter inokulummal. A fermentációt 30-32 °C-on folytatjuk le. A kevertetést sebesség 500 ford./perc, a levegőztetést sebesség pedig 0,12 liter/liter táptalaj, óra. A fermentáció időtartama 7-14 nap. Ügyelnünk kell arra, hogy a pH-érték ne essen 7,0 - különösen 6,2 - alá. A képződött (I) általános képletű makrociklusos vegyületek részben a felülúszóban, részben a sejtekben találhatók. A sejtekből alkoholokkal vagy ketonokkal (pl. acetonnal), a felülúszóból pedig etil-acetáttal vagy butil-acetáttal extrahálhatók. A fermentlevet ezután pl. ötször kirázzuk 2-2 liter etil-acetáttal, 5-5 percen át. Az egyesített kivonatokat kétszer mossuk vízzel és vákuumban bepároljuk. A visszamaradó sötét olajat a 2. ábrán ismertetett módszer szerint választhatjuk szét a komponensekre. Az itt leírt szétválasztást 65 g nyers kivonattal végezzük, amelyet összesen 400 liter fermentléből kaptunk.

Előnyösebben azonban úgy járunk el, hogy a képződött (I) általános képletű vegyületeket a fermentáció befejeződése után adszorbens gyantával távolítjuk el a fermentorból. Ennek érdekében 0,5 térf./térf.% finomszemcséjű gyantát (pl. XAD-1180 vagy XAD-16 (adunk a fermentléhez és azt 4 órán át kevertetjük, mire az (I) általános képletű vegyületek teljesen megkötődnek a gyantán. A fermentlétől szűréssel való elkülönítés után a gyantát egy üvegoszlopba visszük át, 3 ágy-térfogatnak megfelelő mennyiségű vízzel és 4 ágytérfogatnak megfelelő mennyiségű metanollal eluáljuk. Az eluátumot vákuumban szárazra pároljuk. Egy ilyen eluátum vagy egy ilyen nyers kivonat megfelelő diszpergáló és/vagy hígító anyagok segítségével a gyakorlatban alkalmazható növényvédőszerré formálható, de eljárhatunk úgy is - mint ezt a következőkben és a 2. ábrán bemutatjuk -, hogy a nyers kivonatot megosztjuk és az egyes szorafeneket (A - szigma) izoláljuk.

HU 209 950 Β

Kromatográfiás tisztítás (1. II. szétválasztási eljárás a szó rajenek szétválasztására)

1. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret 200 mm 0, 200 mm hosszúság

Szorbens: Lichroprep Si 100; 25-40 μιη (Merck) Futtatószer: grádiens módon, a következőik szerint:

1. diklór-metán

2. -9. diklór-metán/aceton 98/2, 96/4, 95/5, 90/10, 85/15, 80/20, 50/50, 25/75

10.—11.: diklór-metán/metanol 75/25; 50/50.

frakciót szedünk.

A 2., 3., 5., 6., 7., 8., 9., 10. és 11. frakciót tovább tisztítjuk.

2. Gélkromatográfia: oszlopméret 60 mm 0, 100 cm hosszúság

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH)

Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A 3. frakció 2,5 g szorafen A-t tartalmaz.

3. Gélkromatográfia: oszlopméret 30 mm 0, 100 cm hosszúság

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH)

Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A 2. frakció 6,6 g szorafen C-t tartalmaz.

4. Gélkromatográfia: oszlopméret 30 mm 0, 100 cm hosszúság

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH)

Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A 2. frakciót (1 g) tovább tisztítjuk.

5. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret 37 mm 0, 34 cm hosszúság

Szorbens: HDSIL RP-18, 18-20-60, 15-25 pm (Labomatic)

Futtatószer: 72/28 metanol/víz.

frakciót szedünk.

A 7. frakció 1,1 g szorafen V-t tartalmaz.

6. Gélkromatográfia: oszlopméret 30 mm 0, 100 cm hosszúság

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH)

Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A 2. frakciót (1,1 g) tovább tisztítjuk.

7. Gélkromatográfia: oszlopméret 30 mm 0, 100 cm hosszúság

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH)

Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A2. és 2 3. frakciót (0,54 ill. 0,18 g) tovább tisztítjuk.

8. Gélkromatográfia: oszlopméret 30 mm 0, hoszszúság 100 cm.

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH)

Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A 2. és a 3. frakciót (0,3 g ill. 1,3 g) tovább tisztítjuk.

9. Gélkromatográfia: oszlopméret 60 mm 0, 100 cm hosszúság

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH)

Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A 2. frakciót (3,3 g) tovább tisztítjuk.

10. Gélkromatográfia: oszlopéret 60 mm 0, 100 cm hosszúság

Szorbens: Sephadex LH-20 (Pharmacia LKB GmbH) Futtatószer: metanol.

frakciót szedünk.

A 2. frakciót (6,1 g) tovább tisztítjuk.

11. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret 37 mm 0, 34 cm hosszúság

Szorbens: HDSIL RP-18, 18-20-60, 15-25 pm (Labomatic)

Futtatószer: 75/25 metanol/víz.

frakciót szedünk.

Az 5. frakció 40 mg szorafen D-t tartalmaz.

A 7. frakció 0,5 g szorafen B-t tartalmaz.

12. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret 35 mm 0,45 cm hosszúság

Szorbens: HDSIL RP-18, 18-30-60, 25-40 pm (Labomatic)

Futtatószer: 80/20 metanol/víz.

frakciót szedünk.

A 8. frakció 30 mg szorafen E-t tartalmaz.

A 4. frakciót tovább tisztítjuk.

13. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret 37 mm 0, 34 cm hosszúság

Szorbens: HDSIL RP-18, 18-20-60, 15-25 pm (Labomatic)

Futtatószer: metanol/víz 75/25.

frakciót szedünk.

A 6. frakciót (80 mg) tovább tisztítjuk.

A 8. frakciót (20 mg) tovább tisztítjuk.

14. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret 37 mm 0, 34 cm hosszúság

Futtatószer: 75/25 metanol/víz.

frakciót szedünk.

Az 5. frakció 16 mg szorafen X-et tartalmaz.

15. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret 35 mm 0, 45 cm hosszúság

Szorbens: HDSIL RP-18, 18-30-60, 25—40 pm (Labomatic)

Futtatószer: 70/30 metanol/víz, lineáris grádiens 2 órával metanol után frakciót szedünk.

Az 5. frakció 150 mg szorafen U-t tartalmaz.

16. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret 35 mm 0, 45 cm hosszúság

Szorbens: HDSIL RP-18, 18-30-60, 25-40 pm (Labomatic)

Futtatószer: 75/25 metanol/víz, lineáris grádiens 90/10 metanol/víz után, 1 óra múlva.

frakciót szedünk.

HU 209 950 Β

A 8, frakció 0,93 g szorafen M-et tartalmaz.

A 7. frakciót (250 mg) tovább tisztítjuk.

17. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

3'7 mm 0,34 cm hosszúság

Szorbens: HDSIL RP-18, 18-20-60, 15-25 pm (Lafeömatic)

Futtatószer: 70/30 metanol/víz.

frakciót szedünk.

A 4. frakciót (105 mg) tovább tisztítjuk.

A 6, frakció 20 mg szorafen R-t tartalmaz.

Ά7. frakció 490 mg szorafen S-t tartalmaz.

A 8. frakció 80 mg szorafen T-t tartalmaz.

A 9. frakciót (80 mg) tovább tisztítjuk.

48. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret mm 0,34 cm hosszúság

Szorbens: HDSIL RP-18, 18-20-60, 15-25 pm

ÍLabomatic)

Futtatószer: 70/30 metanol/víz.

’!4 frakciót szedünk A 7. frakciót (700 mg) tovább tisztítjuk.

A 8. frakciót (570 mg) tovább tisztítjuk.

A 9. frakció 120 mg szorafen deltát tartalmaz, f®. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

2sG,S mm 0,25 cm hosszúság

Szorbens: RP-18 Nucleosil 100-7 C_lg; 7 pm (Macterey-Nagel)

Wttatószer: 67/33 metanol/víz. ófrakciót szedünk.

Az 5. frakció 11 mg szorafen gammát tartalmaz.

S0. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret mm 0,25 cm hosszúság

Szorbens' Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (MacheW-Nagel)

Futtatószer: 1% metanolt tartalmazó 1/2 butil-meú$4áer)-n--hexán frakciót szedünk.

A 2. frakció szorafen nü-t tartalmaz (8 mg).

21. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret 2®5«vn 0,25 cm hosszúság ' Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 1% metanolt tartalmazó terc.butil-me®®3crVn-hexán.

frakciót szedünk.

A 2. frakció 8 mg szorafen bétát tartalmaz.

22. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret 2®,S mm 0,25 cm hosszúság

Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (Macher'cy-Nagel)

Futtalőszer: 5% metanolt tartalmazó 1/2 terc.butil0JB3Osgrer/n-hexán.

frakciót szedünk.

Az 1. frakció 64 mg szorafen Y-t tartalmaz.

A 4. frakció 5 mg szorafen o-t tartalmaz.

A ÜL frakció 7 mg szorafen kszi-t tartalmaz.

$3, Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20.5 írni, 25 cm hosszúság

Szorbens: RP-18 Nucleosil 100-7 C_lg, 7 pm (MaAw^Nagd)

Wttatöszer: 60/40 metanol/víz.

frakciót szedünk.

A 2. frakciót (35 mg) tovább tisztítjuk.

24. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság

Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 10% metanolt tartalmazó 1/2 terc.butilmetil-éter/n-hexán.

frakciót szedünk.

A 2. frakció 20 mg szorafen szigmát tartalmaz.

25. Fordított fázisú szétválasztás: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság

Szorbens: RP-18 Nucleosil 100-7 C₁₈, 7 pm (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 60/40 metanol/víz.

frakciót szedünk.

A 4. frakciót (194 mg) tovább tisztítjuk.

Az 5. frakciót (130 mg) tovább tisztítjuk.

A 6. frakciót (50 mg) tovább tisztítjuk.

26. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság

Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 5% metanolt tartalmazó 1/2 terc.butilmetil-éter/n-hexán frakciót szedünk.

A 4. frakció szorafen rőt tartalmaz (45 mg).

27. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret

20,5 mm 0,25 cm hosszúság

Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 10% metanolt tartalmazó 1/2 terc.butilmetil-éter/n-hexán frakciót szedünk.

A 2. frakció 26 mg szorafen zétát tartalmaz.

28. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság

Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 5% metanolt tartalmazó 1/2 terc.butilmetil-éter/ n-hexán.

frakciót szedünk.

A 2. frakció 18 mg szorafen müt tartalmaz.

A 3. frakció 69 mg szorafen étát tartalmaz.

29. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság

Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 5% metanolt tartalmazó 1/2 terc.butilmetil-éter/n-hexán.

frakciót szedünk.

A 4. frakció 5,5 mg szorafen kappát tartalmaz.

30. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság

Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 pm (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 5% metanolt tartalmazó 1/2 terc.butilmetil-éter/n-hexán frakciót szedünk.

A 4. frakciót (10 mg) tovább tisztítjuk.

HU 209 950 Β

31. Szétválasztás szilikagélen: oszlopméret

20,5 mm 0, 25 cm hosszúság

Szorbens: Si 100 Nucleosil 100-7, 7 μπι (Macherey-Nagel)

Futtatószer: 5% metanolt tartalmazó 1/2 terc.butilmetil-éter/n-hexán.

frakciót szedünk.

Az 1. frakció 2,2 mg szorafen pit tartalmaz.

A 2. frakció 6,5 mg szorafen Z-t tartalmaz.

A továbbiakban kinyert szorafen R-szigma fizikokémiai jellemzése Szorafen V C₂₈H₄₂O₈ Mz 506

IR (film):

3394, 2942, 2900, 2829, 1723, 1461, 1380, 1270, 1233, 1189, 1068, 988, 898,851 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm);

10,3; 11,7; 12,6; 23,2; 26,0; 32,7; 35,3; 35,6; 36,2; 46,3; 55,8; 57,3; 68,9; 72,5; 72,9; 74,6; 76,3; 84,5; 99,5; 122,1; 126,2-, 128,1; 128,5; 139,9; 141,2;

170,9

HPLC R_t - 9,2 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen X ^28Η₄₂Ο₉ Mz 522

IR (film, nü cm^-1-ben);

3404, 2941, 1716, 1598, 1461, 1380, 1272, 1233, 1189, 1156, 1100, 1069, 988 ¹³C-NMR (CDCIj, delta, ppm):

10,3; 11,7; 12,5; 23,1; 25,9; 29,4; 35,2; 35,6; 35,7; 46,2; 57,3; 68,9; 72,5; 74,5; 75,0; 76,1; 83,8; 99,5; 113,4; 115,2; 118,0; 124,9; 129,8; 137,4; 142,7; 156,2; 170,9

HPLC R_t+4,4 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm.

Szorafen U C₂₉H₄₄O₉ Mz 536

IR (film, nü cm^-1):

3386, 3361, 2977, 2939, 2892, 2823, 1698, 1461, 1380, 1268, 1185, 1152, 1096, 1064, 1023, 975, 900, 840 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,1; 11,4; 12,2; 31,8; 32,9; 35,2; 38,6; 46,3; 56,0; 56,0; 57,2; 57,9; 64,2; 68,7; 72,2; 73,3; 76,2; 80,0; 84,5; 99,3; 122,2; 126,1; 127,9; 128,4; 140,6; 141,4; 171,7

HPLC R_t = 5,2 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen R C26H40O8 Mz 480

IR (film, nü cm^-1):

3404, 2937, 1731, 1459, 1430, 1384, 1355. 1330, 1270, 1212, 1110, 1083, 1033,988 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,7; 14,5; 22,7; 23,3; 24,8; 27,9; 30,9; 31,8: 35,5; 35,3; 43,4; 58,6; 68,9; 71,0; 72,9; 73,3; 74,6; 80,5; 97,6; 726,5; 128,0; 128,6; 141,1; 168,8 HPLC R, = 5,1 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C_lg, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen S C₂₇H4o0₈ Mz492

IR (film, nü cm^-1:

3431, 2941, 1720, 1604, 1459, 1426, 1380, 1264, 1187, 1150, 1104, 1062, 977 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,5; 11,9; 12,7; 24,9; 26,2; 35,5; 36,2; 36,3; 37,9; 47,5; 57,6; 69,5; 73,5; 74,1; 75,8; 76,3; 77,9; 100,6; 125,1; 127,1; 128,7; 129,4; 138,8; 143,3; 173,8 HPLC R, = 5,9 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen T C₂₇H₄₂O₈ Mz 494

IR (film, nü cm^-1):

3427, 2941, 1720, 1461, 1382, 1268, 1191, 1154, 1106, 1068,994, 971 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,4; 11,7; 14,2; 22,7; 24,8; 25,3; 28,3; 30,6; 32,8; 34,6; 35,2; 45,8; 57,3; 69,1; 69,8; 73,0; 73,3; 76,0; 76,4; 99,6; 726,5; 128,1; 128,5; 140,6; 171,9 HPLC R, - 6,5 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈ (Macherey-Nagel)

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen delta C₂₇H₄₂O₈ Mz 506

IR (film, nü cm^-1):

3440, 3311, 2937, 1731, 1600, 1461, 1380, 1340, 1185, 1096; 988,850 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,2; 12,0; 12,7; 23,2; 25,6; 29,6; 34,9; 36,0; 37,3; 45,3; 56,2; 57,6; 70,3; 72,1; 72,6; 74,3; 74,9; 84,2;

HU 209 950 Β

99,5; 124,9; 126,3; 128,0; 128,6; 131,6; 141,2;

171.2

HPLC R, = 7,1 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C(₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen gamma CagHeOs Mz522

IR (film, nü cm^-1):

3398, 2939, 1723, 1461, 1382, 1264, 1189, 1152, 1.102, 1066,975, 894 ⁱ³C-NMR (CDCI3, delta, ppm):

8,6; 10,3; 11,5; 23,6; 25,8; 28,8; 33,9; 35,4; 36,3; 46,6; 54,7; 57,3; 58,1; 59,2; 68,8; 69,3; 73,5; 74,3; 76,2; 83,5; 99,7; 126,1; 128,0; 128,6; 141,4; 170,4 HPLC R_t = 8,4 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen nil Ú2SH42O9 Kfe.522

IR '/fílm, nü cm^-1):

3402, 2971, 2827, 1738, 1459, 1367, 1181, 1095, 1050,990,860 ¹³C4íMR (CDC1₃, delta, ppm):

8,'7; 10,3; 11,5; 26,3; 33,4; 35,2; 40,2; 40,8; 46,2; 57,4; 58,1; 67,8; 68,9; 71,5; 73,5; 76,3; 78,9; 82,6; §9,4; 125,9; 128,3; 128,7; 128,8; 129,5; 140,7;

170.3

HPLC R, = 8,5 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen béta

Οκ>Ηΐ4θ8

Mz520

IR '/film, nü cm^-1):

3408, 2971, 2935, 1733, 1459, 1365, 1343, 1181, 1095,1050,990,958,738 ¹³C4NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,1; 12,1; 12,6; 23,4; 25,5; 30,4; 35,0; 35,9; 37,2; 45,3; 56,2; 56,3; 57,9; 70,3; 72,1; 72,7; 74,2; 83,1; M8; 99,4; 122,6; 126,3; 128,0; 128,6; 140,0; 141,3; 171,3

HPLCR,= 16,8 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, MacherejMNagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen Y

W,

Mz 508

IR (film, nü cm^-1):

3436, 2937, 1721, 1459, 1376, 1268, 1199, 1114, 1048,988,961 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,8; 11,2; 18,2; 23,0; 23,5; 31,7; 33,4; 36,2; 40,6; 41,1; 51,1; 61,1; 70,8; 74,6; 76,4; 77,1; 78,7; 86,4; 99,9; 125,5; 127,4; 128,4; 142,5; 171,1; 212,4 HPLC R_t = 6,1 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C18, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: Uv, 210 nm Szorafen 0 C29H44O9 Mz 536

IR (film, nü cm^-!:

3402, 3361, 2933, 2894, 1708, 1457, 1360, 1269, 1187, 1150, 1096, 1062, 975, 898, 838, 765 ¹³NMR-C (CDC1₃, delta, ppm):

10,4; 11,6; 12,6; 31,7; 33,4; 35,3; 35,7; 38,7; 46,3; 56,3; 57,4; 58,3; 65,7; 69,0; 72,3; 74,2; 76,2; 80,0; 84,8; 99,5; 122,9; 126,3; 128,2; 128,6; 140,1; 140,7; 170,8

HPLC R_t = 4,8 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈ MachereyNagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen kszi C27H40O8 Mz 492

IR (film, nü cm^-1):

3402, 2969, 2933, 1731, 1459, 1367, 1179, 1095, 1050, 990 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,4; 11,7; 12,5; 20,1; 26,2; 31,8; 35,2; 35,7; 36,2; 46,4; 57,4; 68,9; 72,3; 73,5; 75,0; 76,1; 86,3; 99,6; 126,2; 127,0; 128,1; 128,6; 138,3; 141,2; 170,7

HPLC R, = 4,1 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen szigma:

C29H44O9 Mz 536

IR (film, nü cm^-1):

3398, 3363, 3301, 2971, 2933, 2894, 1702, 1453, 1378, 1262, 1167, 1150, 1100, 979, 838 ¹³C-NMR (CDC1₃, delta, ppm):

10,5; 11,5; 12,4; 31,6; 34,2; 35,0; 35,5; 38,9; 46,2; 56,1; 57,5; 58,5; 64,3; 69,1; 73,1; 76,1; 77,2; 79,8; 85,2; 99,7; 121,8; /26,0; 128,0; 128,5; 141,9; 142,0; 171,4

HPLC R_t = 6,2 perc

HU 209 950 Β

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen ró

Mz 510

IR (film, nü cm^-1):

3398, 3363, 3301, 2971, 2933, 2894, 1700, 1453, 1378, K62,1187, 1150, 1100, 1064, 979, 898, 838, 765 ¹³C-NMR (CDCIj, delta, ppm):

8,7; KU; 11,4; 23,1; 25,5; 26,4; 32,3; 35,0; 36,1; 40,5; 4(6(6; 57,2; 68,5; 71,8; 73,1; 74,3; 76,4; 99,7; 126,3; 127,9; 128,5; 141,4; 171,4

HPLC R, = 4,7 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C_]g, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/vfe

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafenzéta C28H42O9 Mz 522

IR (film, πΰ cm^-1):

3398, 2S®7, 1718, 1457, 1378, 1332, 1272, 1203, 1102, 978 ¹³C-NMR XCDCI3, delta, ppm):

11,8; 25,9: 25,9; 28,7; 36,3; 39,9; 43,0; 45,7; 56,7; 57,4; 5S/6; 70,6; 75,5; 76,2; 78,2; 84,3; 98,9; 125,9; 128,0; 08,4; 128,7; 133,1; 141,2; 171,6 HPLC R(_t = 3,5 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C_lg, Macherey-Nagel

Áramlása sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/víz.

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen mii C₂₈H₄₄Q_B Mz 524

IR (film, niicm^-1):

3423, 2939, 1725, 1459, 1380, 1264, 1191, 1154, 1102, 50/52,992,971 ¹³C-NMRíCDC1₃, delta, ppm):

10,4; n.,7; 14,1; 21,3; 27,7; 28,2; 30,9; 32,9; 34,1; 35,2; 45,β; 57,4; 60,7; 69,1; 70,0; 70,4; 72,1; 76,2; 76,3; SS„4;99,6; 126,6; 128,2; 128,6; 140,2; 172,0 HPLC ÍR, = 4,7 perc

Oszlogs; 4x250 mm Nucleosil 100-7 C_lg, Macherey-Nagel

Áramlási 'ifébesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/v£z

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen éra C_2gH₄₂(B Mz 522

IR (film, nö cm^-1):

3411, 2935, 1718, 1459, 1382, 1266, 1189, 1152, 1104, KK6®, 981 ^l3C-NMR (CDCI3, delta, ppm):

10,3; 11,4; 12,3; 31,6; 32,9; 35,1; 35,4; 38,1; 46,2; 57,2; 57,7; 64,0; 68,8; 72,2; 73,7; 74,7; 76,2; 81,2; 99,3; 124,8; 126,1; 127,9; 128,4; 137,8; 141,1;

171,4

HPLC R_t = 4,6 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C₁₈, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen kappa:

^27^4()03

Mz492

IR (film, nü cm^-1):

3411, 2935, 1731, 1461, 1382, 1347, 1270, 1189, 1104, 1048,990 ¹³C-NMR (CDCI3, delta, ppm):

10,1; 12,1; 12,8; 23,4; 25,4; 33,5; 35,0; 36,1; 37,2; 45,4; 56,1; 70,3; 72,0; 72,7; 74,2; 75,6; 99,4; 124,1; 126,2; 127,9; 128,5; 138,6; 141,3; 171,5 HPLC R, = 4,7 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C_lg, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen pi C₂7H4oO_g Mz 492

IR (film, nü cm^-1);

3396, 3363, 3299, 2969, 2933, 2694, 1702, 1451, 1378, 1262, 1167, 1150, 1100, 979 ¹³C-NMR (CDCI₃, delta, ppm):

10,3; 12,3; 14,6; 23,4; 25,0; 32,2; 35,6; 36,0; 36,8; 50,4; 55,9; 70,2; 71,2; 73,9; 75,0; 75,5; 98,3; 125,2; 126,2; 128,1; 128,6; 137,8; 141,0; 171,5 HPLC R_t = 4,9 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C_Ig, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer: 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm Szorafen Z C28U42O9 Mz 522 ír (film, nü cm^-1);

3405, 2937, 1718, 1459, 1380, 1266, 1189, 1152, 1104,1069;987,902,850,813,738 ¹³C-NMR (CDCI3, delta, ppm):

10,5; 11,7; 12,6; 31,8; 33,5; 35,3; 35,7; 41,1; 46,3; 56,0; 57,3; 66,0; 69,0; 70,5; 72,5; 74,3; 76,2; 84,3; 99,5; 122,4; 126,2; 128,2; 128,6; 140,4; 140,9;

170,9

HPLC R, = 7,7 perc

Oszlop: 4x250 mm Nucleosil 100-7 C_[g, Macherey-Nagel

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, futtatószer 70/30 metanol/víz

Kimutatás: UV, 210 nm

I

HU 209 950 Β

A szEsrafen A röntgen szerkezeti elemzése és az előbbiekben bemutatott adatok alapján a szorafen C-Q vegyülefekre az (IC’)-(IQ’) képletekkel jelölt térszerkezetet tételezzük fel.

A fennmaradó vegyületeknek - szorafen IR’, IS’, ΓΓ, IU\ ISV’. IX’, IT, IZ’, Ibeta’, Igámmá’, Idelta’, Izéta’, Kta’. Ikappa’, Imii’, Ikszi’ és író’ - hasonló konfiguirációt tulajdonítunk.

A szwafen húi’ valószínű konfigurációját az (Inü’) képlet áfeazoija.

A saaoráfen o, pi és szigma konfigurációját nem igazoltunk.

Ezenkívül látható, hogy az egyes szorafenek egymás között epibiaerek. Aszorafen delta a szorafen C epimeijei; a szorafen' kappa és kszi egymás és a szorafen S epimerjei; hascinlö a helyzet a szorafen U, o és szigma esetében. Egy meghatározott (I) általános képletű vegyület esetében minifai esetben a megadott mérési értékek kötelezők, ameöyék -mint ez a szakember számára ismeretes olykor raem teszik lehetővé az egy meghatározott konfigurációbstsz való szigorú hozzárendelést

Mint említettük, a találmány tárgya eljárás az egyes, előbbiekbe:bemutatott, az (I) általános képlet körébe tartozó vegyületek valamennyi sztereoizomer alakjának előállításai és ezek alkalmazása növényi betegségek elhárítására ilE. .'megelőzésére. Különösen azonban a találmány az (ífífe-flszignuí) vegyületekre vonatkozik, amelyekre az; ábrázolt konfigurációkat tételezzük fel.

Figyelemre méltó, hogy az (I) általános képletű makrociklusos szorafenek rendszerint a megadott hemiacetál alakban fortSulnak elő, ez az alak azonban az A. reakcióvázlat szffiífíbt reverzibilis gyűiű-felnyitáson mehet át.

Az eilŐállítási eljárás ill. a feldolgozási metodika (pH érteik, oldószer) függvényében a szorafenek egyik vagy másükalakban vagy a két alak keverékeként fordulnak dfő. A gyűrű felnyílásra jellemző, hogy a 3. helyzetű ¹³C-NMR szignál és az ’H-NMR szignálok meghatározott más helyzetekbe tolódnak el.

A szonöíén A esetében pL a következő változások figyelhet®? meg: (CDCÍ₃, delta, ppm): 40

13C-NMM:	eredeti 99,5	új 203,1 (3-c)
‘H-NMB3.	3,14	3,72 (2-H)
	3,18	4,5 (4-H)
	3,83	3,16 (7-H)
	5,86	5,7(17-H)
HassnUö eltolódások figyelhetők meg a szorafen

B-szignwesetében is.

A taEimány szerinti (I) általános képlet alapvetően kiteljed imrél az alacsony pH-értékek mellett kitüntetett 3- 50 henáacetáltá’akra, mind a felnyílt 3-keto-7-hidroxi-alakra.

A fizfficőkemiai jellemzők előző ismertetésben a ¹³C-NM®.; spektrum aláhúzott szignáljai kétszeres intenzitásúsk.

2. Formázási példák olyan készítmények előállt- 55 tására, atméjyek egy vagy több (I) általános képletű hatóanyagot tartalmaznak (% = tömeg%)

A „haS&nyag” kifejezés a továbbiakban egy szorafent - tisztet álakban több szorafen C-szigma vegyületet, ill. qggy/a mikrobiológiai eljárással előállított elu- 60 átumot (folyékony alakban vagy szárított maradékként) jelent, amelyben a szorafenek összmennyisége el nem különített alakban van jelen.

2.1. Emulziós koncentrátum	a)	b) %	c)
hatóanyag	25	40	50
Ca-dodecil-benzol-szulfonát	5	8	6
ricinusolaj-polietilén-
glikol-éter
(36 mól etilén-oxid)	5
tributil-fenol-polietilén-glikol-
éter (30 mól etilén-oxid)		12	4
ciklohexanon		15	20
xilol-elegy	65	25	20

Ezekből a koncentrátumokból vízzel való hígítással bármely kívánt koncentrációjú emulzió előállítható.

2.2. Oldatok	a)	b) %	c)	d)
hatóanyag	80	10	5	95
etilén-glikol-
monometil-éter	20
polietilén-glikol
(MT 400)		70
N-metil-2-pirrolidon		20
epoxidált kókuszolaj			1	5
benzin (f.p. 160-190 °C)	-	-	94	-

Az oldatok alkalmasak az igen apró cseppek alakjában való felhasználásra.

2.3. Granulátumok a) b) %

hatóanyag 5 10 kaolin 94 nagydiszperzitású kovasav 1 attapulgit 90

A hatóanyagot metilén-kloridban oldjuk, permetezéssel felvisszük a hordozóra és végül az oldószert vákuumban Iedesztilláljuk.

2.4. Porozószerek a) b) %

hatóanyag 2 5 nagydiszperzitású kovasav 1 5 talkum 97 kaolin 90

A hatóanyag és a vivőanyagok intenzív összekeverésével felhasználható porozószereket kapunk. Ezek hordozóanyagok további hozzáadása után - 0,001% hatóanyag-tartalomra állíthatók be és porítással alkalmazásra kész porokká alakíthatók.

2.5. Permetezhető porok

a)

c)

b) %

hatóanyag 25

Na-lignin-szulfonát 5

Na-lauril-szulfát 3

Na-diizobutil-naftalin-szulfonát 6 oktil-fenol-polietilén-glikoléter (7-8 mól etilén-oxid) 2 nagydiszperzitású kovasav 5 10 kaolin 62 27

A hatóanyagot az adalékanyagokkal alaposan öszszekeverjük és megfelelő malomban megőröljük.

HU 209 950 Β

Olyan permetezhető porokat kapunk, amelyek vízzel bármely kívánt koncentrációjú szuszpenzióvá hígíthatok.

2.6. Bevonatos granulátumok hatóanyag 3 polietilénglikol (MT 200) 3 kaolin 94

A finomra őrölt hatóanyagot keverőben egyenletesen felvisszük a polietilén-glikollal megnedvesített kaolinra. Ily módon pormentes bevont granulátumot kapunk.

2.7. Szuszpenziós koncentráum	%
hatóanyag	40
etilén-glikol	10
nonil-fenol-polietilén-
glikol-éter (15 mól etilén-oxid)	6
Na-lignin-szulfonát	10
karboxi-metil-cellulóz	1
37%-os vizes formaldehid oldat	0,2
szilikonolaj, 75%-os vizes
emulzió alakjában	0,8
víz	32
A finomra őrölt hatóanyagot intenzíven összekever-

jük az adalékanyagokkal. így egy szuszpenziós koncentrátumot kapunk, amelyből vízzel való hígítással bármely kívánt koncentrációjú szuszpenzió előállítható.

2.8. Biomassza-koncentrátum

A termelő tenyészetekből fennmaradó biomasszát szárítjuk, megőröljük és 80:20 arányban (tömeg) etilén-glikol-monometil-éterrel keverjük össze. Egy ilyen koncentrátum vízzel tetszés szerint permetezhető szuszpenzióvá hígítható.

3. Példák a biológiai alkalmazásra, növényeken (A következőkben a „hatóanyag” kifejezés a találmány szerinti szorafen C-szigma közül egy vegyületet jelent).

3.1. példa: Hatás Puccinia graminis-szel szemben búzán

a) Maradék védőhatás nappal a kikelés után a búzanövényeket egy (0,02% hatóanyagot tartalmazó) permedével permetezzük be, amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő. Az így kezelt növényeket 24 óra múlva a gomba ureidospóra-szuszpenziójával fertőzzük. 48 órán át 95-100% relatív levegőnedvesség mellett, kb. 20 °C-on végzett inkubálás után a fertőzött növényeket kb. 22 °C hőmérsékletű üvegházba ültetjük ki. A fertőzéstől számított 12 nappal végezzük el a rozsdafoltok kialakulásának értékelését.

b) Szisztemikus hatás

Búzanövényeket 5 nappal a kikelés után olyan permedével öntözünk (a talaj térfogatra vonatkoztatva 0,002% hatóanyagmennyiséggel), amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő. A kezelt növényeket 48 óra múlva a gomba ureidospóraszuszpenziójával fertőzzük meg. 48 órán át 95-100% relatív levegőnedvesség mellett, kb. 20 °C-on való tenyésztés után a fertőzött növényeket üvegházban kb. 22 °C-on hagyjuk fejlődni. A rozsdafoltok alakulásának értékelését a fertőzés után 12 nappal végezzük.

A gomba károsító hatását a hatóanyag mindkét kísérletben teljesen gátolja.

A nem kezelt, de fertőzött kontroll növények ezzel szemben 100%-os Puccinia-hatást mutatnak.

3.2. példa: Hatás Phytophthora-val szemben paradicsomnövényen

a) Maradék védőhatás hetes növekedés után a paradicsomnövényeket bepermetezzük egy permetlevél (0,02% hatóanyag-tartalom), amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő. 48 óra múlva a kezelt növényeket a gomba sporangium-szuszpenziójával fertőzzük meg. A fertőzött növényeket 5 napon át 90-100% relatív levegőnedvesség mellett 20 °C-on inkubáljuk, majd értékeljük a gomba károsító hatását.

b) Szisztémás hatás hetes termesztés után a paradicsomnövényeket egy olyan permedével öntözzük, amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő (hatóanyag-tartalom 0,006%, a talaj-térfogatra vonatkoztatva). Ennek során ügyelünk arra, hogy a permedé ne jusson érintkezésbe a földfeletti növényrészekkel. 48 óra múlva a kezelt növényeket a gomba sporangium-szuszpenziójával fertőzzük. A gomba hatását a fertőzött növények 5 napon át 90-100% relatív levegőnedvesség mellett, 20 °C-on való inkubálása után értékeljük.

A kiértékelés során egyik kísérletben sem figyeltünk meg gombafertőzésre mutató jeleket, míg a fertőzött kontrallnövények teljes mértékben károsodtak.

3.3. példa: Hatás Plasmopara viticola ellen szőlőn

Maradék védőhatás

A 4-5 leveles fejlődési fázist elért szőlő-növénykéket 0,006% hatóanyagot tartalmazó permedével permetezzük be, amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő. 24 óra múlva a kezelt növényeket a gomba sporangium-szuszpenziójával fertőzzük meg. 6 napon át 95-100% relatív levegőnedvesség mellett, 20 °C-on végzett inkubálás után értékeljük a gomba károsító hatását.

A nem kezelt, de fertőzött kontroli-növényekkel szemben - amelyek esetében a gomba hatása 100% az (I) általános képletű hatóanyaggal kezelt növények nem mutatnak a gomba kártevő hatására utaló jeleket.

3.4 példa: Hatás Cercospora arachidocola ellen földimogyoró növényen Maradék védőhatás

10-15 cm magas földimogyoró növényeket bepermetezünk egy 0,006% hatóanyagot tartalmazó permetlével, amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő. 48 óra múlva a növényeket a gomba konídium-szuszpenziójával fertőzzük meg. A fertőzött növényeket 72 órán át kb. 21 °C-on és magas

HU 209 950 Β levegó'nedvesség mellett inkubáljuk, végül a jellegzetes rozsdafoltok megjelenéséig üvegházban növesztjük. A fungicid hatást 12 nappal a fertőzés után értékeljük, a fellépő foltok száma és mérete alapján.

Az (I) általános képletű vegyülettel kezelt növényeken nem találhatók a károsodásra utaló jelek. A szorafen A-val kezelt növények még 0,002% permetlé-koncentráció alkalmazása esetén sem mutatnak károsodást. Ezzel szemben a nem kezelt, de fertőzött kontroli-növények esetében a Cercospora-hatás 100%-os.

3.5. példa: Hatás Venturia insequalia ellen almahajtásokon

Maradék védőhatás

10-20 cm hosszúságú ágakkal rendelkező almahajtásokat 0,02% hatóanyagot tartalmazó permedével permetezzük be, amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítunk elő. 24 óra múlva a kezelt növényeket a gomba konídium-szuszpenziójával fertőzzük meg. A növényeket 5 napon át 90-100% relatív levegőnedvesség mellett inkubáljuk, majd további 10 napon át üvegházban 20-24 °C-on növesztjük. A fertőzés után 15 nappal értékeljük a varasodást.

A hatóanyaggal kezelt csemeték nem mutattak károsodást. A kontroli-növények esetében ezzel szemben a gomba károsító hatása teljesnek bizonyul.

3.6. példa: Hatás Botrytis cinerea-val szemben alma-gyümölcsön

Maradék védőhatás

Mesterségesen sérültté tett almákat oly módon kezelünk, hogy a sérülési helyekre 0,02% hatóanyag-tartalmú permetlevet csepegtetünk, amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő. A kezelt gyümölcsöket ezután a gomba spóraszuszpenziójával inokuláljuk és 1 héten át magas levegőnedvesség mellett és kb. 20 °C-ón inkubáljuk. A kiértékelés során megszámoljuk a rothadt sérülési helyeket és ebből vezetjük le a vizsgált anyag fungicid hatékonyságát.

A hatóanyag teljes mértékben gátolja a gomba növekedését. A nem kezelt, de fertőzött kontroll növények esetében ezzel szemben a Botrytis hatás 100%-os.

3.7. példa: Hatás Erysiphe graminis ellen árpán a) Maradék védőhatás

Kb. 8 cm magas árpanövényeket bepermetezünk egy 0,006% hatóanyagot tartalmazó permedével, amelyet egy, a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő. 3-4 óra múlva a kezelt növényeket a gomba konídiumaival porozzuk be. A fertőzött árpanövényeket 22 °C-on üvegházban növesztjük és 10 nap múlva meghatározzuk a gomba károsító hatását.

b) Szisztemikus hatás

Kb. 8 cm magas árpanövényeket 0,002% (a talajtérfogatra vonatkoztatva) hatóanyag-tartalmú permetlével öntözünk, amelyet a hatóanyagot tartalmazó permetezhető porból állítottunk elő. Ennek során ügyelünk ara, hogy a permedé ne jusson érintkezésbe a földfeletti növényi részekkel. 48 óra múlva a kezelt növényeket a gomba konídiumaival porozzuk be. A fertőzött árpanövényeket kb. 22 °C-on üvegházban növesztjük és 10 nap múlva meghatározzuk a gomba károsító hatását.

A kezelt növények mindkét kísérletben károsodástól mentesek, míg a kontroli-növények esetében a gomba hatása 100%-os.

3.8. példa: Hatás Rhizoctonia solani (talajgomba) ellen rizsnövényeken

Védő-helyi alkalmazás a talajban napos rizsnövényeket elárasztunk egy 0,02% hatóanyagot tartalmazó permedével, amelyet egy, a hatóanyagot tartalmazó készítményből állítottunk elő, anélkül, hogy a földfeletti növényrészeket szennyeznénk. A kezelt növények fertőzésére R. solani micélium- és szklerócium-szuszpenzióját visszük fel a talajfelszínre, 6 napi, klímakamrában való inkubálás után nappal 27 °C, éjjel 23 °C, 100% relatív levegőnedvesség (nedveskamra) - értékeljük a levélhüvelyen, a leveleken és a száron a gomba hatására bekövetkezett károsodást.

A hatóanyaggal való kezelés után károsodás nem lép fel, míg a fertőzött kontroli-növények esetében a Rhizoctonia károsító hatása teljes mértékben érvényesül.

Claims (17)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás (I) általános képletű vegyületek és sztereoizomerjeik előállítására - mely képletben a makrociklusos gyűrű a 8,9- vagy 9,10- vagy 14,15helyzetben egyes- vagy kettőskötés és a következő szubsztituens-kombinációkat tartalmazza, ahol a kettőskötés helye és R_b R₂, R₃, R₄, R5, A, Β, X és Y jelentése az alábbi táblázatban megadott -

   Vegyület Rí r₂ r₃ r₄ r₅ A B X Y Kettőskötés A och₃ ch₃ ch₃ H H ch₃ H H H Δ9.10 B OH ch₃ ch₃ H H ch₃ H H H - C OH ch₃ ch₃ H H ch₃ H H H Δ9.10 D OH ch₃ ch₃ H H H H H H - E och₃ ch₃ ch₃ H H ch₃ H OH H - F och₃ ch₃ ch₃ H H ch₃ H H H - H och₃ ch₃ H H H ch₃ H H OH Δ8,9

   HU 209 950 Β

   Vegyület Rí r₂ r₃ r₄ r₅ A B X Y Kettőskötés J och₃ H ch₃ H H ch₃ H H H - M OH ch₃ ch₃ H H ch₃ H OH H - N OH ch₃ ch₃ H H ch₃ H H och₃ Δ9.10 Q och₃ ch₃ ch₃ H H H H H H - R OH ch₃ H H H H H H H - S OH ch₃ H H H ch₃ H H H Δ9,10 T OH ch₃ H H H ch₃ H H H - u och₃ ch₃ ch₃ OH H ch₃ H H H Δ9.10 V och₃ ch₃ H H H ch₃ H H H Δ9,10 X OH ch₃ H H OH ch₃ H H H Δ9,10 Y =0 ch₃ H H H ch₃ H OH H - z och₃ ch₃ H OH H ch₃ H H H Δ9.10 β OCH3 ch₃ ch₃ H H ch₃ H H H Δ9.10 γ OH ch₃ ch₃ H H ch₃ H 9,10-epoxi - δ OH ch₃ ch₃ H H ch₃ H H H Δ9,10 ζ OH ch₃ ch₃ H H ch₃ OH H H Δ9,10 η OH ch₃ ch₃ OH H ch₃ H H H Δ9,10 κ OH ch₃ H H H ch₃ H H H Δ9,10 μ och₃ ch₃ H H H ch₃ H H OH - V OH ch₃ ch₃ H H ch₃ H OH H ΔΙ4.Ι5 ξ OH ch₃ H H H ch₃ H H H Δ9,10 0 OCH₃ ch₃ ch₃ OH H ch₃ H H H Δ9.10 π OH ch₃ H H H ch₃ H H H Δ9,10 Ρ OH ch₃ H H H ch₃ H OH H - σ och₃ CH3 ch₃ OH H ch₃ H H H Δ9.10

   azzal jellemezve, hogy a

   Sorangium cellulosum „So ce 26” (NCIB 12411), a Sorangium cellulosum „So ce 139” (DSM 5397), a Sorangium cellulosum „So ce 170” (DSM 4795), a Sorangium cellulosum „So ce 191” (DSM 4796), a Sorangium cellulosum „So ce 192” (DSM 4797), a Sorangium cellulosum „So ce 231” (DSM 5393) vagy a Sorangium cellulosum „So ce 139” (DSM 5414) törzsek egyikét vagy ennek mutánsát vagy variánsát aerob körülmények között megfelelő táptalajban tenyésztjük, és kívánt esetben a kapott (I) általános képletű vegyületeket ezt követően szétválasztjuk és izoláljuk, azzal a megkötéssel, hogy az (IA) és az (ΓΒ) képletű vegyület előállításánál a „So ce 26” jelű törzstől eltérő törzset tenyésztünk.

   (Elsőbbsége: 1989. 09. 08.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a táblázatban feltüntetett C-Q jelű (I) általános képletű vegyületek és sztereoizomerjeik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Sorangium cellulosum „So ce 26” (NCIB 12411) jelű törzset vagy mutánsát vagy variánsát tenyésztjük, a kapott (I) általános képletű vegyületeket kromatográfiás úton szétválasztjuk, és a C-Q jelű vegyületeket izoláljuk.

   (Elsőbbsége: 1988. 09. 09.)
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás a táblázatban feltüntetett C-Q jelű (I) általános képletű vegyületek és sztereoizomerjeik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Sorangium cellulosum „So ce 170” (DSM 4795) vagy Sorangium cellulosum „So ce 191” (DSM 4796) vagy Sorangium cellulosum „So ce 192” (DSM 4797) jelű törzset, vagy mutánsát vagy variánsát tenyésztjük, a kapott (I) általános képletű vegyületeket kromatográfiás úton szétválasztjuk, és a C-Q jelű vegyületeket izoláljuk.

   (Elsőbbsége: 1988. 09. 12.)
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett hét Sorangium cellulosum törzs valamelyikét egy - legalább 1 asszimilálható C- és N-forrást, valamint megfelelő szervetlen sókat tartalmazó táptalajban 1CM0 °C-on, adott esetben egy adszorbens gyanta jelenlétében tenyésztjük, majd a fermentlevet, illetve a kiszűrt adszorbens gyantát megfelelő oldószerrel extraháljuk, a kapott oldatot bepároljuk, és a kapott maradékot kívánt esetben kromatografálással és/vagy átkristályosítással tisztítjuk.

   (Elsőbbsége: 1989. 09. 08.)
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fermentációt 10-35 °C-on a „So ce 170” (DSM 4795) vagy a „So ce 191” (DSM 4796) vagy a „So ce 192” (DSM 4797) törzzsel folytatjuk le.

   (Elsőbbsége: 1988. 09. 12.)
6. 6. Fungicid készítmény növényi betegségek leküz20

   HU 209 950 Β désére illetve megelőzésére, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületeket tartalmazza 0,1-95 tömeg%-ban, az eljárásban alkalmazott tenyészközeggel és legalább egy szokásos töltő-, hordozó-, adalékanyaggal és/vagy felületaktív szerrel együtt.

   (Elsőbbsége: 1989. 09. 08.)
7. 7. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 2. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületeket tartalmazza.

   (Elsőbbsége: 1988. 09. 09.)
8. 8. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 3. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületeket tartalmazza.

   (Elsőbbsége: 1988. 09. 12.)
9. 9. Fungicid készítmény növényi betegségek leküzdésére illetve megelőzésére, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületeket tartalmazza 0,1-95 tömeg%-ban, az eljárás során keletkezett eluátum formájában legalább egy szokásos töltő-, hordozó, adalékanyaggal és/vagy felületaktív szerrel együtt.

   (Elsőbbsége: 1989. 09. 08.)
10. 10. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 2. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületeket tartalmazza.

    (Elsőbbsége: 1988. 09. 09.)
11. 11. A 9. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 3. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületeket tartalmazza.

    (Elsőbbsége: 1988. 09. 12.)
12. 12. Fungicid készítmény növényi betegségek leküzdésére illetve megelőzésére, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként 0,1-95 tömeg%-ban az 1. igénypont szerint előállított valamely (I) általános képletű vegyületet - az (IA) és az (IB) vegyület kivételével - és legalább egy szokásos töltő-, hordozó-, adalékanyagot és/vagy felületaktív szert tartalmaz.

    (Elsőbbsége: 1989. 09. 08.)
13. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 2. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületeket tartalmazza.

    (Elsőbbsége: 1988. 09. 09.)
14. 14. Eljárás az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű vegyületek előállítására képes Sorangium cellulosum mikroorganizmus-törzsek, a Sorangium (Polyangium) cellulosum „So ce 26” (NCIB 12411) mikroorganizmus kivételével, ezek mutánsai vagy variánsai előállítására, azzal jellemezve, hogy e törzseket termelőképességük alapján vegyes tenyészetekből izoláljuk.

    (Elsőbbsége: 1989. 09. 08.)
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypontban említett törzseket izoláljuk.

    (Elsőbbsége: 1988. 09. 12.)
16. 16. A14. igénypont szerinti eljárás a

    Sorangium cellulosum „So ce 139” (DSM 5397),

    Sorangium cellulosum „So ce 170” (DSM 4795),

    Sorangium cellulosum „So ce 191” (DSM 4796),

    Sorangium cellulosum „So ce 192” (DSM 4797),

    Sorangium cellulosum „So ce 231” (DSM 5393), vagy a

    Sorangium cellulosum „So ce 242” (DSM 4797) tiszta tenyészeteinek előállítására, azzal jellemezve, hogy az izolált törzseket steril körülmények között tenyésztjük.

    (Elsőbbsége: 1989. 09. 08.)
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább két (I) általános képletű vegyület termelésére - ideértve az A-vegyületet - képes törzset steril körülmények között tenyésztünk.