DE3632168A1 - Galbonolide und ihr einsatz als botrytizide - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Streptomyces-Stamm, der die nachstehend definierten Verbindungen der Formel I zu produzieren vermag. Sie betrifft die Verwendung dieser Substanzen, deren Ether, Ester und ihrer Salze zur Bekämpfung von Botrytispilzen, das Verfahren zur Kultivierung des neuen Streptomyces Stammes und zur Herstellung der Verbindungen der Formel I sowie die neue Verbindung im Umfang der Formel I.

In der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 60-6 197 (Meÿi Seika Kaisha) wird beschrieben, wie man aus der Kulturbrühe des Mikroorganismus Micromonospora chalcea des Stammes 980-MCI (FREM-P 7046) die Verbindung der Formel isolieren kann. Es wird ferner beschrieben, dass man diese Substanz als Wirkstoff gegen Rostpilze an Weizen (Puccinia graminis) einsetzen kann.

Es wurde nun überraschenderweise ein völlig andersartiger Mikroorganismus gefunden und kultiviert, der die eingangs genannte Verbindung ebenfalls produziert. Dieser neue Mikroorganismus wurde aus einer Bodenprobe aus Tunesien isoliert und gemäss:

1) Hütter, R.: Systematik der Streptomyceten. Basel: Karger Verlag (1967)

2) Nonomura, H.: Key for classification and identification of 458 species of the streptomyces included in ISP. J. Ferment. Technol. 52, 78-92 (1974)

als Streptomyces galbus ssp. eurythermus klassifiziert und am 5. 8. 1985 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400 Göttingen unter der Hinterlegungsnummer DSM 3412 hinterlegt. Im folgenden wird gelegentlich für diesen neuen Stamm die abgekürzte Schreibweise Str. g. DSM 3412 verwendet.

Nach der Bestimmung und Nomenklatur von Hütter¹) ergeben sich folgende Kennzeichen:
- Luftmycel: cinerus
- Sporenketten am Ende gerader Hyphen, Sporenketten vom Typ retinaculum-apertum (RAa), Sporenoberfläche glatt, Sporengrösse: 0.7 × 1.3 µm
- Chromogenität: Melaninbildung auf Hefe-Malz-Agar

Dieser neue Mikroorganismus Streptomyces galbus ssp. eurythermus DSM 3412 stellt einen wesentlichen Bestandteil der vorliegenden Erfindung dar. Dieser neue Streptomyces Stamm produziert zwei strukturähnliche Wirkstoffe. Ihre chemische Struktur wird durch die Formel I worin R für OCH₃ oder CH₃ steht, wiedergeben.

Diejenige Verbindung, worin R für OCH₃, steht, soll auch als Galbonolid A und die mit R = CH₃ als Galbonolid B bezeichnet werden. Galbonolid A unb B werden in etwa zu gleichen Teilen produziert.

Wie bereits eingangs erwähnt, wird das Galbonolid A in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 60-6 197 offenbart. Es wird dort beschrieben, dass sich diese Verbindung gegen einen bestimmten Rostpilz im Getreideanbau, nämlich Puccinia grammis auf Weizen einsetzen lässt. Es wurde nunmehr überraschend festgestellt, dass die Verbindungen der Formel I auf einem ganz anderen landwirtschaftlichen Gebiet, nämlich im Obst-, Wein und Gemüseanbau gegen einen dort im Vordergrund stehenden Schadpilz nämlich den Grauschimmel (Botrytis spp.), eingesetzt werden können. Botrytis Sporen finden sich in allen Pflanzenbeständen, da der Pilz auf totem oder absterbendem organischen Material wächst oder sporuliert. Die Grauschimmelfäule befällt unterschiedliche Obst und Gemüsesorten, wie z. B. Reben, Erdbeeren, Himbeeren, Brombeeren, Aepfel, Birnen, Aprikosen, Pfirsiche, Nectarinen, aber auch Zwiebeln, Gurken und viele andere mehr sowohl im ungeerntetem als auch im geerntetem Zustand, vor allem, wenn sie Druckstellen oder Verletzungen vorhanden sind. So befällt z. B. der Grauschimmel die Erdbeerfrüchte in allen Reifestadien, auch als ganz junge, grüne Früchte. Die anfänglich kleinen braunen Flecken dehnen sich schnell über grosse Bereiche der Fruchtoberfläche aus, und bei feuchtwarmer Witterung überziehen sich die Früchte dann mit dem typischen mausgrauen Pilzrasen. Die Früchte sind dann ungeniesbar und dürfen auch nicht mit anderen, gesunden Früchten zusammen verpackt oder gelagert werden, da die gesunden Beeren rasch infiziert werden. Die Infektion der wachsenden Pflanze, d. h. vor allem der Früchte, erfolgt bereits zur Blütezeit, wobei wahrscheinlich abstrebende Staubgefässe und Blütenkornblätter die bevorzugten Orte des Eindringens für den Pilz darstellen. Der gleiche Pilz befällt auch Weintrauben, wo ein früher Befall der noch unreifen, sauren Beeren als "Säurefäule" besonders gefürchtet ist. Beim Uebergang auf den Traubenstiel entwickelt sich die "Stickfäule", als deren Folge die Trauben zu Boden fallen. Werden keine Gegenmassnahmen ergriffen, so kann es zu einem totalen Ernteausfall kommen. Die Grauschimmelfäule wird durch die zur Familie der Fungi imperfecti gehörenden Botrytis spp., wie z. B. Botrytis cinerea oder Botrytis allii erzeugt. Diese Pilzspezies unterscheiden sich morphologisch wesentlich von dem oben genannten Rostpilz Puccinia gramminis aus der Familie der Basidiomycetes. Beide Pilzarten befallen häufig völlig unterschiedliche Kulturpflanzen. Aus der bekannten Wirkung von Galbonolid A gegen Puccinia gramminis war die Aktivität der Verbindungen der Formel I gegen Botrytis spp. nicht ableitbar.

Die Verwendung der Verbindungen der Formel I zur Bekämpfung von Botrytis-Pilzen stellt somit einen weiteren wesentlichen Bestandteil der vorliegenden Erfindung dar.

Es wurde ferner festgestellt, dass die Botrytisaktivität auch kann noch erhalten oder nur marginal verändert wird, wenn eine oder beide Hydroxygruppen in den Verbindungen der Formel I in funktionell abgewandelter Form vorliegen. So können eine oder beide OH-Gruppen verethert oder verestert auch in Salzform vorliegen, ohne dass die Botrytiswirkung wesentlich gemindert wird.

Eine veretherte Hydroxygruppe ist z. B. eine gegebenenfalls substituierte aliphatische, carbocyclische oder carbocyclisch-aliphatische Hydrocarbyloxy- oder Heterocyclyloxy-Gruppe mit 1-12 C-Atomen, insbesondere eine Alkoxygruppe mit 1-7 C-Atomen, vor allem eine Niederalkoxy-, wie eine Ethoxy- oder Methoxygruppe.

Eine veresterte Hydroxygruppe kann sich von einer organischen oder anorganischen Säure ableiten. Von den anorganischen Säuren sind z. B. Schwefel- und Phosphorsäuren zu nennen. Sodann sind unter den anorganischen Estergruppen auch die Ester mit den Halogenwasserstoffsäuren, insbesondere die Chlor- oder Bromwasserstoffsäure, zu zählen.

In Estergruppen, die sich von organischen Säuren ableiten, können die Kohlenwasserstoffreste unsubstituiert oder durch Halogene, z. B. Chlor oder Brom, veresterte oder veretherte Hydroxygruppen, Amino- oder Carboxylgruppen substituiert sein. Veresterte Hydroxy, das sich von einer organischen Carbonsäure oder Dicarbonsäure ableitet, ist vor alllem aliphatisches Acyloxy mit 1-12 C-Atomen, insbesondere Alkanoyloxy, vor allem gegebenenfalls durch vorzugsweise 1-2 Halogenatome, insbesondere Chlor oder Brom, Hydroxy-, Alkoxy-oder Aryloxygruppen, wie Phenoxygruppen, substituiertes Niederalkanoyloxy, wie z. B. Formyloxy, Propionoxy, Butyryloxy, 2-Chloracetoxy, 2,2-Dichloracetoxy, 3,3-Dichlorpropionyloxy, 2-Hydroxyacetoxy, Hydroxycarbonyloxy oder eine Niederalkoxycarbonyloxy-, oder eine unsubstituierte oder im aromatischen Teil durch 1-2 Chloratome, insbesondere Chlor oder Brom, Methylgruppen, Aminogruppen oder Nitrogruppen substituierte Phenoxycarbonyloxy-Gruppe, wie 2-Methoxyacetoxy oder 2-Phenoxyacetoxy. Die Acyloxygruppe kann sich aber auch von einer carbocyclischen, z. B. einer aromatischen, aromatisch- aliphatischen oder heterocyclischen Säure, ableiten und kann somit Cycloalkanoyloxy, Phenylcarbonyloxy oder Phenyl-niederalkanoyloxy sein. Besonders hervorzuheben sind auch niederaliphatische Urethane mit 1-7 C-Atomen, wie z. B. das Methyl-, Aethyl- oder n-Propylurethan oder unsubstituiertes oder z. B. durch 1-2 Methylgruppen oder 1-2 Chlor- oder Bromatome substituiertes Phenylurethan.

Ester von organischen Säuren können sich aber auch von Sulfonsäuren ableiten, z. B. monocyclischen aromatischen oder niederaliphatischen Sulfonsäuren.

Der Heterocyclyl-Rest einer sich von einer heterocyclischen Carbonsäure ableitenden Estergruppe oder einer Aethergruppe ist vorzugsweise ein gegebenenfalls substituiertes, gesättigtes oder ungesättigtes monocyclisches, fünf- oder sechsgliedriges Heterocyclyl mit einem Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatom als Ringglied.

Unter veretherten und veresterten Hydroxygruppen können aber auch die sich von Thiolen bzw. Thiosäuren abgeleiteten verstanden werden, wobei vorzugsweise jene Thiole bzw. Thiosäuren in Betracht kommen, die den oben besonders hervorgehobenen Alkoholen und Säuren als Ether- bzw. Esterkomponenten entsprechen, wie z. B. eine Niederalkylthio-, z. B. Methyl- oder Ethylthiogruppe, bzw. eine Acylthio-, z. B. eine Niederalkylcarbonylthio-, in erster Linie die Formylthio- uund Ethylthiogruppe.

Die vor- und nachstehend verwendeten Allgemeindefinitionen haben Rahmen der vorliegenden Beschreibung vorzugsweise die folgenden Bedeutungen:

"Nieder"- umschreibt im Zusammenhang mit obigen aliphatischen Hydrocarbyl und insbesondere Alkoxy- und Alkanoylgruppen einen Rest mit 1-7 C-Atomen. Der Niederalkylrest ist in solchen Gruppen z. B. Methyl, Aethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sek.-Butyl oder tert.- Butyl, ferner n-Pentyl, Neopentyl, n-Hexyl oder n-Heptyl. Cyclloalkyl in obigen Cycloalkonoyl-Gruppen enthält vorzugsweise 3-8, in erster Linie 5 oder 6 Ringglieder und ist z. B. Cyclopentyl oder Cyclohexyl. Phenylniederalkyl in obigen Phenyl-niederalkanoyloxy- Gruppen ist z. B. Benzyl, 1- oder 2-Phenylethyl oder 3-Phenylpropyl. Halogen ist insbesondere Brom, kann jedoch auch für Chlor oder Jod, ferner für Fluor stehen. Niederalkoxy ist z. B. Methoxy, ferner Aethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, Isobutoxy oder tert.- Butoxy. Niederalkoxycarbonyl ist z. B. Methoxycarbonyl oder Aethoxycarbonyl, Niederalkoxycarbonyloxy ist z. B. Methoxycarbonyloxy oder Aethoxycarbonyloxy. Heterocyclyl ist z. B. 2-Tetrahydropranyl, 2,3-oder 4-Pyridyl, 2-Thienyl oder 2-Furyl.

Substituenten z. B. von Aromaten sind gegebenenfalls substituiertes Niederalkyl, Niederalkoxy, Nitro und/oder Halogen, oder basische Gruppen, wie eine gegebenenfalls substituierte Aminogruppe, oder saure Gruppen, wie gegebenenfalls funktionell abgewandeltes, z. B. verestertes Carboxy, z. B. Niederalkoxycarbonyl, oder gegebenenfalls veräthertes, verestertes oder geschütztes Hydroxy oder Oxo.

Monocyclisches aromatisches Sulfonyloxy ist z. B. p-Toluolsulfonyloxy oder Benzolsulfonyloxy.

Niederaliphatisches Sulfonyloxy ist z. B. Methansulfonyloxy.

Sofern in einer funktionell abgewandelten Hydroxygruppe salzbildende Substituenten vorhanden sind, können auch Salze der neuen Verbindungen gemäss der Erfindung hergestellt werden, insbesondere landwirtschaftlich verwendbare, nicht-phytotoxische Salze. So können z. B. Säureadditionssalze von Estern hergestellt werden, in denen ein gesättigter stickstoffhaltiger Heterocyclylrest vorhanden ist, wie die Salze der Halogenwasserstoffsäuren, Schwefelsäuren oder Phosphorsäuren oder von niederaliphatischen Carbonsäuren. Hemiester von Dicarbonsäuren können Metall-Salze geben, z. B. Alkalimetallsalze die infolge ihrer guten Wasserlöslichkeit von besonderem Interesse sind.

Auch die Mono-Ester der Schwefel- oder Phosphorsäuren können in ihre Salze, z. B. in die Alkalisalze übergeführt werden und auch diese Ester beanspruchen deshalb besonderes Interesse.

Zur Isolierung oder Reinigung der neuen Verbindungen können auch agrochemisch ungeeignete Salze Verwendung finden.

Die Hydroxygruppen können auch durch leicht abspaltbare Abgangsgruppen, wie z. B. Silylgruppen maskiert vorliegen. Als geeignete Syliylgruppe kommt der Rest -Si(R₁)(R₂)(R₃) in Frage, wobei R₁, R₂ und R₃ vorzugsweise unabhängig voneinander für C₁-C₄-Alkyl, Benzyl oder Phenyl stehen und beispielsweise eine der Gruppen Trimethylsilyl, tris(tert.-Butyl)silyl, Diphenyl-tert.-butylsilyl, bis- (Isopropyl)methylsilyl, Triphenylsilyl usw. und insbesondere tert.-Butyl-dimethylsilyl bildet.

Der Begriff Ether umfasst somit auch Verbindungen der Formel I mit silylierten OH-Gruppen.

Es hat sich ferner gezeigt, dass für ihren Einsatz im Obst- und Gemüseanbau die Verbindungen der Formel I nicht in reiner Form vorliegen müssen. Vielmehr können ebenso Extrakte der Fermentationsbrühe des Str. g. DSM 3412 verwendet werden. Hierdurch entfallen aufwendige und kostenspielige Reinigungsmassnahmen bzw. Trennverfahren.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit nicht nur die Verwendung der Verbindungen der Formel I selbst gegen Botrytis spp., sondern auch deren Ether, Ester und ihre Salzformen sondern auch Extrakte der Kulturbrühe des Str. g. DSM 3412 oder einer seiner Mutanten, denn es sind aus dem Str. g. DSM 3412 spontan oder künstlich in an sich bekannter Weise zu erzeugende Mutanten zugänglich, die ebenso wie der Wildstamm mindestens eine, überwiegend beide, der Verbindungen der Formel I zu erzeugen vermögen. Solche Mutanten können z. B. durch chemische Mittel wie mit N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin oder mit Senfölen oder mit physikalischen Mitteln z. B. durch Bestrahlungen mit ultravioletter oder Röntgenstrahlung künstlich erzeugt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Streptomyces galbus ssp. eurythermus DSM 3412 oder eine von diesem Stamm abgeleitete, die Verbindungen der Formel I produzierende Mutante, in einem eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltendem flüssigen Nährmedium aerob züchtet, bis die Nährlösung eine botryticide Wirkung zeigt, wenn erwünscht die Verbindungen der Formel I isoliert und, wenn erwünscht, diese in seine an einer oder beiden Hydroxylgruppen funktionell abgewandelten Derivate bestehend aus Ethern, Estern oder deren Salze überführt.

Die Kultivierung kann in verschiedenen Nährmedien mit assimilierbaren Nährstoffquellen durchgeführt werden. Die Nährstoffquellen können aus definierten Einzelsubstanzen oder aus komplexeren Gemischen, insbesondere biologischer Herkunft bestehen. Geeignete assimilierbare Kohlenstoffquellen sind z. B. Gemische von Naturprodukten, wie Malzextrakte, Getreidemehle oder Milchpulver oder reine definierte Kohlenhydrate, insbesondere Polysaccharide, z. B. Stärke, Raffinose oder Dextrine; Disaccharide, wie z. B. Surcrose, Maltose, Lactose, Trhalose oder Cellobiose; Monosaccharide, wie z. B. Glucose, Arabinose, Xylose, Mannit, Fructose, Galactose, Ribose, Lyxose, Allose, Altrose, Mannose, Idose oder Talrose. Als stickstoffhaltige Nährstoffe seien genannt: Aminosäuren, Peptine und Proteine sowie deren Abbauprodukte wie Pepton oder Trypton, ferner Fleischextrakte, Getreidemehle, z. B. von Mais, Weizen, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Hefeextrakte usw., aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. Von anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate, Phosphate von Alkali-oder Erdalkalimetallen, von Magnesium, Eisen, Zink und Mangan enthalten.

Besonders vorteilhaft lässt sich die Kultivierung von Str. g. DSM 3412 und die Bildung der Wirkstoffe der Formel I durchführen, wenn die Nährlösung
0,2 bis 0,7% Hefeextrakt
0,2 bis 1,0% Glucose oder Lactose
0 bis 1,5% Malzextrakt
0 bis 0,3% NaNO₃ und
bis 0,8% NaCl
enthält und einen pH-Wert von 7,0 bis 7,8 aufweist. Der Zusatz von 0,5 bis 10 mM, vorzugsweise 1 mM Isoleucin erweist sich als vorteilhaft.

Die Züchtung erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelkolben oder den bekannten Fermentern. Als Temperatur eignet sich eine solche zwischen 20 und 33°C. Eine wesentliche antibiotische Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 2-3 Tagen. Vorzugsweise kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in flüssigem Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium der Hauptkultur, z. B. im Verhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man beispielsweise indem man ein durch ca. 14-tägiges Wachstum auf einem festen Nährboden, z. B. Hefe-Malz-Agar, enthaltenes versportes Mycel in eine Nährlösung überimpft und 30-60, z. B. 45 Stunden, wachsen lässt.

Der Fermentationsverlauf kann anhand folgender Kriterien überwacht werden: pH-Wert der Kultur, Nassvolumen, 10 ml Kulturbrühe werden 5 Minuten bei 2000 g zentrifugiert und die Menge des abzentrifugierten Sediments ermittelt; biologische Aktivität.

Die Isolierung der Galbonolide A und B aus dem Kulturmedium erfolgt nach an sich bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Substanzen.

Zum Testieren der Antibiotika-Konzentration in den einzelnen Isolierungsstufen - wie auch im Kulturmedium - kann die Dünnschichtchromatographie und die Bioautographie mit Botrytis cinerea oder der Plattendiffusionstest mit Botrytis cinerea verwendet werden.

Während der Fermentation, der Aufarbeitung und Isolierung kann die Produktion an Galbonolid A und B als biologische Aktivität im Plattendiffusionstest gegen Botrytis cinerea bestimmt werden. Der Test wird nach
Hütter, R.; Keller-Schierlein, W.; Nüesch, J. und H. Zähner: Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen. 48. Mitteilung Scopamycine. Arch. Michrobiol. 51, 1-8 (1965). durchgeführt. Dabei geht man im einzelnen wie folgt:

Als Testorganismus dient ein gut wachsender Stamm von Botrytis cinerea. Auf Malzagarplatten wird ein rundes, 5 mm grosses Impfstück auf die Plattenmitte gelegt und die Platten werden 2-3 Tage bei 24°C inkubiert. In dieser Zeit wächst das Mycel auf eine Grösse von 25-30 mm Durchmesser aus. Die zu prüfenden Lösungen werden mit Filterrondellen (6 mm Durchmesser) am Rande des Mycels aufgebracht. Die Platten werden 34-36 Std. inkubiert und dann unter dem Mikroskop ausgewertet. Bei einem gut aktiven Kulturfiltrat des Stammes sind die Hyphen bis zu einem Abstand von etwa 20 mm vom Rande der Filterrondelle aus gemessen deutlich verändert. Fig. 1 zeigt normale Hyphen von Botrytis cinerea.

Zur Isolierung der Galbonolide A und B wird vorteilhafterweise die Kulturbrühe, z. B. mit einer Mehrschichtenpresse in Mycel und Kulturfiltrat aufgetrennt und Mycel und Filtrat getrennt aufgearbeitet.

Hierzu wird das Kulturfiltrat z. B. mit Ethylacetat extrahiert, die organische Phase z. B. im Vakuum entfernt und der wässrige Rückstand mit einem halogenierten Kohlenwasserstoff wie Dichlormethan erneut extrahiert.

Extrahiert man die Wirkstoffe aus dem Mycel, so verwendet man zweckmässigerweise ein polares Lösungsmittel, vorzugsweise ein Alkanol, wie z. B. Methanol. Die methanolische Phase wird eingeengt und zur weiteren Reinigung mit einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z. B. mit Dichlormethan, erneut extrahiert.

Die aus der Kulturbrühe und der Mycelaufarbeitung erhaltenen Extrakte können nunmehr getrennt säulenchromatographisch gereinigt und im die Galbonolide A und B aufgetrennt werden. Hierzu arbeitet man vorzugsweise mit stationären Phasen, die für Gel-Chromatographie geeignet sind. Beispiele werden in den Herstellungsvorschriften angegeben. Als Fliessmittel werden Alkanole, vorzugsweise Methanol, Methanol/Petrolether (bzw. Benzin)-Gemische oder Ethylacetat eingesetzt. Die Chromatographie wird zweckmässigerweise bei relativ tiefen Temperaturen 0°C bis +10°C und unter Lichtausschluss durchgeführt.

Die Reinigung bzw. Abtennung der Wirksubstanzen kann nach anderen Varianten dieser an sich bekannten Reinigungsmethoden, z. B. mit anderen Lösungsmitteln bzw. Lösungsmittelgemischen und anderen Absorptionsmitteln erhalten werden.

Die reinen Galbonolide A und B stellen farblose kristalline Substanzen dar, die in Chloroform, Dichlormethan, Aceton, Methanol sehr gut und in Wasser weniger gut löslich sind. Die Substanzen sind in lösungsmittelfreiem Zustand in Abwesenheit von Alkalin relativ stabil. Als Aufbewahrungsmittel eignet sich bedingt Chloroform oder Methanol. In wässrigen Lösungen ist eine einigermassen gute Stabilität bei pH 5-7 gegeben. Es ist somit möglich, die Verbindungen in Form all jener agrochemischen Präparate zu verwenden, die Wasser enthalten, wie insbesondere von wässrigen Emulsionen bei der Blatt- oder Boden-Applikation.

Eine oder beide Hydroxygruppen können in an sich bekannter Weise verestert oder veräthert werden. Geeignete Mittel zur Veretherung sind beispielswesie Diazoverbindungen, wie gegebenenfalls substituierte Diazoniederalkane, z. B. Diazomethan, Diezoethan, Diazo-n- butan oder Diphenyldiazomethan. Diese Reagenzien werden in Gegenwart eines geeigneten inerten Lösungsmittels, wie eines aliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, wie Hexan, Cyclohexan, Benzol oder Toluol, eines halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoffes, z. B. Methylenchlorids, oder eines Ethers, wie eines Diniederalkylethers, z. B. Diethylether, oder eines cyclischen Ethers, z. B. Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder eines Lösungsmittelgemisches, angewendet.

Weitere geeignete Veretherungsmittel sind Ester entsprechender Alkohole, in erster Linie solche mit starkem anorganischen oder organischen Säuren, wie Mineralsäuren, z. B. Halogenwasserstoffsäuren, wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-oder Jodwasserstoffsäure, ferner Schwefelsäure, oder Halogen-Schwefelsäuren, z. B. Fluorschwefelsäure, oder starken organischen Sulfonsäuren, wie gegebenenfalls, z. B. durch Halogen, wie Fluor, substituierten Niederalkansulfonsäuren, oder aromatischen Sulfonsäuren, wie z. B. gegebenenfalls, durch Niederalkyl, wie Methyl, Halogen, wie Brom, und/oder Nitro substituierten Benzolsulfonsäuren, z. B. Methansulfon-, Trifluormethansulfon- oder p-Toluolsulfonsäure. Solche Ester sind u. a. Niederalkylhalogenide, Diniederalkylsulfate, wie Dimethylsulfat, ferner Fluorsulfonsäureester, oder gegebenenfalls Halogen-substituierte Methansulfonsäure-niederalkylester, z. B. Trifuormethansulfonsäuremethylester. Sie werden üblicherweise in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, wie eines gegebenenfalls halogenierten, wie chlorierten, aliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff, z. B. Methylchlorid, eines Aethers, wie Dioxan oder Tetrahydrofuran, oder eines Gemisches verwendet. Dabei wendet man vorzugsweise geeignete Kondensationsmittel, wie Alkalimetallcarbonate oder -hydrogencarbonate, z. B. Natrium- oder Kaliumcarbonat oder -hydrogencarbonat (üblicherweise zusammen mit einem Sulfat), oder organische Basen, wie, üblicherweise sterische gehinderte, Triniederalkylamine, z. B. N,N-Diisopropyl- N-ethyl-amin (vorzugsweise zusammen mit Halogensulfonsäureniederalkylestern oder gegebenenfalls halogensubstituierten Methansulfonsäure- niederalkylestern) an, wobei unter Kühlen, bei Raumtemperatur oder unter Erwärmen, z. B. bei Temperaturen von etwa -20°C bis etwa 50°C und, wenn notwendig, in einem geschlossenen Gefäss und/oder in einer Inertgas-, z. B. Stickstoffatmosphäre gearbeitet wird.

Durch Phasentransfer-Katalyse [siehe Dehmlow, Angewendete Chemie, Bd. 5, S. 187 (1974)] kann die oben beschriebene Veretherungsreaktion wesentlich beschleunigt werden. Als Phasentransfer- Katalysatoren können quartäre Phosphoniumsalze und insbesondere quartäre Ammoniumsalze, wie gegebenenfalls substituierte Tetraalkylammoniumhalogenide, z. B. Tetrabutylammoniumchlorid, -bromid oder -jodid, oder auch Benzyl-triethylammoniumchlorid, in katalytischen oder bis zu äquimolaren Mengen verwendet werden. Als organische Phase kann irgendein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel dienen, beispielsweise einer der gegebenenfalls halogenierten, wie chlorierten niederaliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffe, wie Tri- oder Tetrachlorethylen, Tetrachlorethan, Tetrachlorkohlenstoff, Chlorbenzol, Toluol oder Xylol. Die als Kondensationsmittel geeigneten Alkalimetallcarbonate oder -hydrogencarbonate, z. B. Kalium- oder Natriumcarbonat oder -hydrogencarbonat, Alkalimetallphosphate, z. B. Kaliumphosphat, und Alkalimetallhydroxide, z. B. Natriumhydroxyd, können bei basenempfindlichen Verbindungen der Reaktionsmischung titrimetrisch, z. B. mittels eines Titrierautomaten, zugesetzt werden, damit der pH-Wert während der Verätherung zwischen etwa 7 und etwa 8.5 bleibt.

Weitere Veretherungsmittel sind geeignete Acetal-Verbindungen, z. B. gem-Di-niederalkoxy-niederalkane, wie 2,2-Dimethoxy-propan, die in Gegenwart von starken organischen Sulfonsäuren, wie p-Toluolsulfonsäure, und eines geeigneten Lösungsmittels, wie eine Diniederalkyl- oder Niederalkylensulfoxyds, z. B. Dimethylsulfoxyd, zur Anwendung gelangen, oder geeignete Orthoester, z. B. Orthoameisensäuretriniederalkylester, z. B. Orthoameisensäure-triethylester, die in Gegenwart einer starken Mineralsäure, z. B. Schwefelsäure, oder einer starken organischen Sulfonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure, und eines geeigneten Lösungsmittels, wie eines Ethers, z. B. Dioxan, verwendet werden.

Weitere Veretherungsmittel sind entsprechende trisubstituierte Oxoniumsalze (sogenannte Meerweinsalze), oder disubstituierte Carbenium- oder Haloniumsalze, worin die Substituenten die verethernden Reste sind, beispielsweise Triniederalkyloxoniumsalze, sowie Diniederalkoxycarbenium- oder Diniederalkylhaloniumsalze, insbesondere die entsprechenden Salze mit komplexen, fluorhaltigen Säuren, wie die entsprechenden Tetrafluorborate, Hexafluorphosphate, Hexafluorantimonate oder Hexachlorantimonate. Solche Reagentien sind z. B. Trimethyloxonium- oder Triethyloxonium-hexafluorantimonat, -hexachlorantimonat, -hexafluorphosphat oder -tetrafluorborat, Dimethoxycarbeniumhexafluorphosphat oder Dimethylbromoniumhexafluorantimonat. Man verwendet diese Veretherungsmittel vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel, wie einem Ether oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff, z. B. Diethylether, Tetrahydrofuran oder Methylenchlorid, oder in einem Gemisch davon, wenn notwendig, in Gegenwart einer Base, wie einer organischen Base, z. B. eines, vorzugsweise sterisch gehinderten, Triniederalkylamins, z. B. N,N-Diisopropyl-N-ethyl-amin, und unter Kühlen, bei Raumtemperatur oder unter leichtem Erwärmen, z. B. bei etwa -20°C bis etwa 50°C, wenn notwendig, in einem geschlossenen Gefäss und/oder in einer Inertgas-, z. B. Stickstoffatmosphäre.

Weitere Veretherungsmittel sind schließlich entsprechende 1-substituierte 3-Aryltriazenverbindungen, worin der Substituent den veräthernden Rest, und Aryl vorzugsweise gegebenenfalls substituiertes Phenyl, z. B. Niederalkylphenyl, wie 4-Methylphenyl, bedeutet. Solche Triazenverbindungen sind 3-Aryl-1-niederalkyltriazene, z. B. 3-(4-Methylphenyl)-1-methyl-triazen, 3-(4-Methylphenyl)- 1-ethyl-triazen oder 3-(4-methylphenyl)-1-isopropyl-triazen. Diese Reagentien werden üblicherweise in Gegenwart von inerten Lösungsmitteln, wie gegebenenfalls halogenierten Kohlenwasserstoffen oder Ethern, z. B. Benzol, oder Lösungsmittelgemischen, und unter Kühlen, bei Raumtemperatur und vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, z. B. bei etwa 20°C bis etwa 100°C, wenn notwendig, in einem geschlossenen Gefäss und/oder in einer Inertgas-, z. B. Stickstoffatmosphäre verwendet.

Zur Veresterung der Hydroxygruppe behandelt man den Ausgangsalkohol der Formel I mit einem den gewünschten Acylrest einer organischen Carbonsäure einführenden Acylierungsmittel. Dabei verwendet man die entsprechende Carbonsäure oder ein reaktionsfähiges Derivat davon, insbesondere ein Anhydrid, inkl. ein gemischtes oder inneres Anhydrid einer solchen Säure. Gemischte Anhydride sind z. B diejenigen mit Halogenwasserstoffsäuren, d. h. die entsprechenden Säurehalogenide, insbesondere -chloride, ferner mit Cyanwasserstoffsäure, oder dann diejenigen mit geeigneten Kohlensäurehalbderivaten, wie entsprechenden -halbestern (wie die z. B. mit einem Halogen-ameisensäure-niederalkyl, wie Chlorameisensäure-äthylester oder -isobutylester, gebildeten gemischten Anhydriden oder mit gegebenenfalls substituierten, z. B. Halogen, wie Chlor, enthaltenden Niederalkancarbonsäuren (wie die mit Pivalinsäurechlorid oder Trichloressigsäurechlorid gebildeten gemischten Anhydride). Innere Anhydride sind z. B. diejenigen von organischen Carbonsäuren, d. h. Ketene, wie Keten oder Diketen, oder diejenigen von Carbamin- oder Thiocarbaminsäuren, d. h. Isocyanate oder Isothiocyanate. Weitere reaktionsfähige, als Acylierungsmittel verwendbare Derivate von organischen Carbonsäuren sind aktivierte Ester, wie geeignet substituierte Niederalkylester, z. B. Cyanmethylester, oder geeignet substituierte Phenylester, z. B. Pentachlorphenyl- oder 4-Nitrophenylester. Die Veresterung kann, wenn notwendig, in Gegenwart von geeigneten Kondensationsmitteln, bei Verwendung von freien Carbonsäuren, z. B. in Gegenwart von Carbodiimidverbindungen, wie Dicyclohexylcarbodiimid, oder Carbonylverbindungen, wie Diimidazolylcarbonyl, und bei Verwendung von reaktionsfähigen Säurederivaten z. B. in Gegenwart von basischen Mitteln, wie Triniederalkylaminen, z. B. Triäthylamin, oder heterocyclischen Basen, z. B. Pyridin oder 4-Dimethylaminopyridin, durchgeführt werden. Die Acylierungsreaktion kann in Abwesenheit oder in Gegenwart eines Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches, unter Kühlen, bei Raumtemperatur oder unter Erwärmen, und, wenn notwendig, in einem geschlossenen Gefäss und/oder in einer Inertgas-, z. B. Stickstoffatmosphäre, durchgeführt werden. Geeignete Lösungsmittel sind z. B. gegebenenfalls substituierte, insbesondere gegebenenfalls chlorierte, aliphatische, cycloaliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe, wie Benzol oder Toluol, wobei man geeignete Veresterungsreagentien, wie Essigsäureanhydrid, auch als Verdünnungsmittel verwenden kann.

Eine durch eine organische Sulfonsäure, z. B. Niederalkansulfonsäure, wie Methansulfonsäure, oder eine aromatische Sulfonsäure, wie p-Toluolsulfonsäure, veresterte Hydroxygruppe kann man vorzugsweise durch Behandeln des Ausgangsmaterials der Formel (I) mit einem reaktionsfähigen Sulfonsäurederivat, wie einem entsprechenden Halogenid, z. B. Chlorid, wenn notwendig, in Gegenwart eines Säureneutralisierenden basischen Mittels, z. B. einer anorganischen oder organischen Base, z. B. in analoger Weise wie die entsprechenden Ester mit organischen Carbonsäuren, bilden.

Enthält die Estergruppe eine salzbildende Gruppe, wie z. B. im Falle, dass die Estergruppe sich von einer mehrbasischen Carbonsäure oder von einer anorganischen Säure, wie einer Schwefel- oder Phosphorsäure ableitet, so können die entsprechenden Ester in Metallsalze, insbesondere in die Alkalimetallsalze wie das Kalium-oder Natriumsalz oder in die Salze von anorganischen Basen, vorzugsweise therapeutisch verwendbaren Stickstoffbasen wie z. B. Aethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dibenzylethylendiamin, Ephöedrin oder 1-Phenyl-2-methyl-3-aminopropan übergeführt werden. Infolge der engen Verwandtschaft zwischen den Salzen und den oben besprochenen Galbonolid-derivaten gemäss der Erfindung gelten die obigen Ausführungen betreffend diese Derivate sinngemäss auf für die Salze, die ebenso zum Gegenstand der Erfindung gehören.

Die Salze können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, z. B. durch Umsetzen der freien Verbindungen mit einem Alkali- oder Erdalkalimetallhydroxid, -carbonat, -amid oder -hydrid oder mit einem geeigneten Alkalimetall-niederalkanoat, oder mit Ammoniak oder einem Amin, wie einem der oben angeführten. Man stellt so insbesondere agrotechnisch anwendbare Salze her.

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des obigen Verfahrens, bei denen man von einer auf irgendeiner Stufe als Zwischenprodukt erhältlichen Verbindung ausgeht und die fehlenden Schritte durchführt oder man das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht oder man eine nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhältliche Verbindung unter den Verfahrensbedingungen erzeugt und in situ weiterverarbeitet.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls botrytizide Mittel, welche eine Verbindung gemäss der Formel I oder gegebenenfalls ein Salz davon als Wirksubstanz enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Mit den Wirkstoffen der Formel I kann, wie eingangs dargelegt, an Pflanzen oder an Pflanzenteile (Früchte, Blüten, Laubwerk, Stengel, Knollen) von unterschiedlichen Nutzkulturen ein auftretender Botrytis-Befall eingedämmt oder unterdrückt bzw. beseitigt werden, wobei auch später zuwachsende Pflanzenteile von derartigen Mikroorganismen verschont bleiben.

Die Wirkstoffe der Formel I sind nicht nur gegen Puccinia graminis sondern insbesondere gegen wichtige Schadpilze aus der Familie der Fungi imperfecti aktiv und vor allem gegen Botrytis spp. (B. cinerea, B. allii).

Als Pflanzenschutzmittel besitzen die Verbindungen der Formel I ein für die praktische Anwendung in der Landwirtschaft sehr günstiges Wirkungsprofil zum Schutze von Kulturpflanzen, ohne dieses durch unerwünschte Nebenwirkungen nachteilig zu beeinflussen.

Sie können auch als Beizmittel zur Behandlung von Saatgut (Früchte, Knollen, Körner) und Pflanzenstecklingen zum Schutz von Botrytisinfektionen eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft somit auch botrytizide Mittel sowie die Verwendung der Verbindungen der Formel I zur Bekämpfung von Botrytis-Pilzen, pflanzenschädigender Pilze bzw. die präventive Verhütung eines Botrytis-Befalls an Pflanzen.

Darüberhinaus schliesst die vorliegende Erfindung auch die Herstellung (agro)chemischer Mittel ein, die gekennzeichnet ist durch das innige Vermischen der Aktivsubstanz mit einem oder mehreren hierin beschriebenen Substanzen bzw. Substanzgruppen von Träger- oder Zuschlagstoffen.

Wirkstoffe der Formel I werden üblicherweise in Form von Zusammensetzungen verwendet und können gleichzeitig oder nacheinander mit weiteren Wirkstoffen auf die zu behandelnde Pflanze oder deren Lebensraum gegeben werden. Diese weiteren Wirkstoffe können sowohl Düngemittel, Spurenelement-Vermittler oder andere das Pflanzenwachstum beeinflussende Präparate sein. Es können aber auch selektive Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluskizide oder Gemische mehrerer dieser Präparate sein, zusammen mit gegebenenfalls weiteren in der Formulierungstechnik üblichen Trägerstoffen, Tensiden oder anderen applikationsfördernden Zusätzen.

Geeignete Träger und Zusätze können fest oder flüssig sein und entsprechen den in der Formulierungstechnik zweckdienlichen Stoffen, wie z. B. natürlichen oder regenerierten mineralischen Stoffen, Lösungs-, Dispergier-, Netz-, Haft-, Verdickungs-, Binde- oder Düngemitteln.

Ein bevorzugtes Verfahren zum Aufbringen eines Wirkstoffes der Formel I bzw. eines (agro)chemischen Mittels, das mindestens einen dieser Wirkstoffe enthält, ist das Aufbringen auf das Blattwerk (Blattapplikation). Anzahl der Applikationen und Aufwandmenge richten sich dabei nach dem Befallsdruck für den entsprechenden Erreger (Pilzsorte). Die Wirkstoffe der Formel I können aber auch über den Erdboden durch das Wurzelwerk in die Pflanze gelangen (systemische Wirkung), indem man den Standort der Pflanze mit einer flüssigen Zubereitung tränkt oder die Substanzen in fester Form in den Boden einbringt, z. B. in Form von Granulat (Bodenapplikation). Die Verbindungen der Formel I können aber auch auf Samenkörner aufgebracht werden (Coating), indem man die Körner entweder mit eine flüssigen Zubereitung des Wirkstoffs tränkt oder sie mit einer festen Zubereitung beschichtet. Darüberhinaus sind in besonderen Fällen weitere Applikationsarten möglich, so z. B. die gezielte Behandlung der Pflanzenstengel oder der Knospen.

Die Verbindungen der Formel I werden dabei in unveränderter Form oder vorzugsweise zusammen mit den in der Formulierungstechnik üblichen Hilfsmitteln eingesetzt und werden daher z. B. zu Emulsionskonzentraten, streichfähigen Pasten, direkt versprühbaren oder verdünnbaren Lösungen, verdünnten Emulsionen, Spritzpulvern, löslichen Pulvern, Stäubemitteln, Granulaten, durch Verkapselungen in z. B. polymeren Stoffen, in bekannter Weise verarbeitet. Die Anwendungsverfahren wie Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen, Bestreichen oder Giessen werden gleich wie die Art der Mittel den angestrebten Zielen und den gegebenen Verhältnissen entsprechend gewählt. Günstige Aufwandmengen liegen im allgemeinen bei 10 g bis 5 kg Aktivsubstanz (AS) je ha: bevorzugt 100 g bis 2 kg AS/ha, insbesondere bei 200 g bis 600 g AS/ha.

Die Formulierungen, d. h. die den Wirkstoff der Formel I und gegebenenfalls einen festen oder flüssigen Zusatzstoff enthaltenden Mittel, Zubereitungen oder Zusammensetzungen, werden in bekannter Weise hergestellt, z. B. durch inniges Vermischen und/oder Vermahlen der Wirkstoffe mit Streckmitteln, wie z. B. mit Lösungsmitteln, festen Trägerstoffen, und gegebenenfalls oberflächenaktiven Verbindungen (Tensiden).

Als Lösungsmittel können in Frage kommen: Aromatische Kohlenwasserstoffe, bevorzugt die Fraktionen C₈ bis C₁₂, wie z. B Xylolgemische oder substituierte Naphthaline, Phthalsäureester wie Dibutyl- oder Dioctylphthalat, aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Cyclohexan oder Paraffine, Alkohole und Glykole sowie deren Aether und Ester, wie Aethanol, Aethylenglykol, Aethylenglykolmonomethyl- oder -äthyläther, Ketone wie Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel wie N-Methyl-2- pyrrolidon, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid, sowie gegebenenfalls epoxydierte Pflanzenöle wie epoxydiertes Kokosnussöl, Sonnenblumenöl oder Sojaöl; oder Wasser.

Als feste Trägerstoffe, z. B. für Stäubemittel und dispergierbare Pulver, werden in der Regel natürliche Gesteinsmehle verwendet, wie Galcit, Talkum, Kaolin, Montmorrillonit oder Attapulgit. Zur Verbesserung der physikalischen Eigenschaften können auch hochdisperse Kieselsäure oder hochdisperse saugfähige Polymerisate zugesetzt werden. Als gekörnte, adsorptive Granulatträger kommen poröse Typen wie z. B. Bimsstein, Ziegelbruch, Sepiolit oder Bentonit, als nicht adsorptive Trägermaterialien z. B. Calcit oder Sand in Frage. Darüberhinaus kann eine Vielzahl von vorgranulierten Materialien anorganischer oder organischer Natur wie insbesondere Dolomit oder zerkleinerte Pflanzenrückstände, wie z. B. Korkmehl oder Sägemehl, verwendet werden.

Besonders vorteilhafte, applikationsfördernde Zuschlagstoffe, die zu einer starken der Aufwandmenge führen können, sind ferner natürliche (tierische oder pflanzliche) oder synthetische Phospholipide aus der Reihe der Kephaline und Lecithine, wie z. B. Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Sphingomyelin, Phosphatidylinosit, Phosphatidylglycerin, Lysolecithin, Plasmologene oder Cardiolipin.

Als oberflächenaktive Verbindungen kommen je nach Art des zu formulierenden Wirkstoffes der Formel I nichtionogene, kation- und/oder anionaktive Tenside in guten Emulgier-, Dispergier- und Netzeigenschaften in Betracht. Unter Tensiden sind auch Tensidgemische zu verstehen.

Geeignete anionische Tenside können sowohl sog. wasserlösliche Seifen, als auch wasserlösliche synthetische oberflächenaktive Verbindungen sein.

Als Seifen seien die Alkali-, Erdalkali- oder gegebenenfalls substituierten Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (C₁₀-C₂₂), wie z. B. die Na- oder K-Salze der Oel- oder Stearinsäure, oder von natürlichen Fettsäuregemischen, die z. B. als Kokosnuss- oder Talgöl gewonnen werden können, genannt. Ferner sind auch die Fettsäuremethyllaurinsalze zu erwähnen.

Häufiger werden jedoch sog. synthetische Tenside verwendet, insbesondere Fettsulfonate, Fettsulfate, sulfonierte Benzimidazolderivate oder Alkylsulfonate.

Die Fettsulfonate oder -sulfate liegen in der Regel als Alkali-, Erdalkali- oder gegebenenfalls substituierte Ammoniumsalze vor und weisen einen Alkalirest mit 8 bis 22 C-Atomen auf, wobei Alkyl auch den Alkylteil von Acylresten einschliesst, z. B. das Na- oder Ca-Salz der Ligninsulfonsäure, des Dodecylschwefelsäureesters oder eines aus natürlichen Fettsäuren hergestellten Fettalkoholsulfatgemisches. Hierher gehören auch die Salze der Schwefelsäureester und Sulfonsäuren von Fettalkohol-Aethylenoxid-Addukten. Die sulfonierten Benzimidazolderivate enthalten vorzugsweise 2 Sulfonsäuregruppen und einen Fettsäurerest mit 8-22 C-Atomen. Alkylarylsulfonate sind z. B. die Na-, Ca- oder Triäthanolaminsalze der Dodecylbenzolsulfonsäure, der Dibutylnaphthalinsulfonsäure, oder eines Naphthalinsulfonsäure- Formaldehydkondensationsproduktes.

Ferner kommen auch entsprechende Phosphate wie z. B. Salze des Phosphorsäureesters eines p-Nonylphenol-(4-14-äthylenoxidadduktes in Frage.

Als nichtionische Tenside kommen in erster Linie Polyglykolätherderivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen, gesätigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen in Frage, die 3 bis 30 Glykoläthergruppen und 8 bis 20 Kohlenstoffatome im (aliphatischen) Kohlenwasserstoffrest und 6 bis 18 Kohlenstoffatome im Alkylrest der Alkylphenole enthalten können.

Weitere geeignete nichtionische Tenside sind die wasserlöslichen, 20 bis 250 Aethylengykoläthergruppen und 10 bis 100 Propylenglykoläthergruppen enthaltenden Polyäthylenoxidaddukte an Polypropylenglykol, Aethylendiaminopolypropylenglykol und Alkylpolypropylenglykol mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette. Die genannten Verbindungen enthalten üblicherweise pro Propylenglykol- Einheit 1 bis 5 Aethylenglykoleinheiten.

Als Beispiele nichtionischer Tenside seien Nonylphenolpolyäthoxyäthanole, Ricinusölpolyglykoläther, Polypropylen-Polyäthylenoxidaddukte, Tributylphenoxypolyäthylenäthanol, Polyäthylenglykol und Octylphenoxypolyäthoxyäthanol erwähnt.

Ferner kommen auch Fettsäureester von Polyoxyäthylensorbitan wie das Polyoxyäthylensorbitan-trioleat in Betracht.

Bei den kationischen Tensiden handelt es sich vor allem um quartäre Ammoniumsalze, welche als N-Substituenten mindestens einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen enthalten und als weitere Substituenten niedrige, gegebenenfalls halogenierte Alkyl-, Benzyl- oder niedrige Hydroxyalkylreste aufweisen. Die Salze liegen vorzugsweise als Halogenide, Methylsulfate oder Aethylsulfate vor, z. B. das Stearyltrimethylammoniumchlorid oder das Benzyldi(2-chloräthyl)äthylammoniumbromid. Auf dem Vorratsschutzgebiet werden die für die menschliche und tierische Ernährung unbedenklichen Zuschlagstoffe bevorzugt.

Die in der Formulierungstechnik gebräuchlichen Tenside sind u. a. in folgenden Publikationee beschrieben:

"Mc Cutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual" MC Publishing Corp., Ridgewood, New Jersey, 1981; H. Stache, "Tensid-Taschenbuch", 2. Aufl., C. Hanser Verlag, München, Wien, 1981; M. and J. Ash. "Encylopedia of Surfactants", Vol. I-III, Chemical Publishing Co., New York, 1980-1981.

Die agrochemischen Zubereitungen enthalten in der Regel 0,1 bis 99%, insbesondere 0,1 bis 95% Wirkstoff der Formel I, 99,9 bis 1%, insbesondere 99,8 bis 5% eines festen oder flüssigen Zusatzstoffes und 0 bis 25%, insbesondere 0,1 bis 25% eines Tensides.

Während als Handelsware eher konzentrierte Mittel bevorzugt werden, verwendet der Endverbraucher in der Regel verdünnte Mittel.

Die Mittel können auch weitere Zusätze wie Stabilisatoren, Entschäumer, Viskositätsregulatoren, Bindemittel, Haftmittel sowie Dünger oder andere Wirkstoffe zur Erzielung spezieller Effekte enthalten.

Derartige (agro)chemische Mittel sind ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, ohne dieselbe einzuschränken. Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben. Prozente und Teile beziehen sich auf das Gewicht. Darüberhinaus werden folgende Symbole verwendet: h = Stunde; RT = Raumtemperatur; abs. = absolut, wasserfrei; DMF = Dimethylformamid. Druckangaben erfolgen in Millibar mb, oder Bar b.

Herstellungsbeispiele:

Die Haltung des Stammes Str. g. DSM 3412 erfolgt dadurch, dass man Schrägager-Röhrchen mit Nährmedium (0,4%, Hefeextrakt, 0,4% Glucose, 1,0% Malzextrakt, 2% Agar, pH 7,3) 14 Tage inkubiert, dann bei 4°C maximal 2 Monate aufbewahrt. Anschliessend werden neue Schrägagar-Röhrchen aus Flüssigkulturen des obigen Mediums beimpft. Zur längerfristigen Aufbewahrung werden Sporen des Stammes lyophilisiert.

Die nachfolgenden Beispiele illustrieren die oben beschriebene Erfindung; sie sollen jedoch diese in ihrem Umfang in keiner Weise einschränken. Temperaturen werden in Celsiusgraden angegeben. Alle Medien für Submers-Kulturen, wenn nicht anders angegeben, 20 Minuten bei 121°C im Autoklaven sterilisiert, 10 und 100 Liter Fermentationsmedien 30 Minuten bei 134°C.

Beispiel 1: a) Kultivierung des Str. g. DSM 3412

In einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einer Schikane werden 100 ml Nährmedien (4 g Hefeextrakt; 10 g Malzextrakt; 8 g Glucose; 0,15 g L-Isoleucin; 20 g Agar; pH 7,3 mit Wasser ad 1000 ml verdünnt) gegeben. Der Inhalt wird mit einer auf Schrägröhrchen gezogen Kultur von Str. g. DSM 3412 angeimpft und 48 Stunden auf einer Schüttelapparatur (120 Umdrehungen pro Minute, 5 cm Auslenkung, 27°C) inkubiert. 1 Liter einer derart hergestellten 48 Stunden alten Schüttelkultur wird zur Beimpfung eines 10 Liter-Fermenters (mit Blattrührsystem, 300 Umdrehungen pro Minute, Luftdurchsatz [sterile Luft] 6 Liter pro Minute, Temperatur 27°C) mit 9 Liter des obigen Nährmediums verwendet. Die Schaumbildung wird durch Zusatz von 1 ml Polyol, das vor der Sterilisation zugegeben wird, unterdrückt. Nach 24 stündiger Inkubation wird der Inhalt des 10 Liter-Fermenters zur Beimpfung eines 100 Liter-Fermenters (Blattrührsystem, 250 Umdrehungen pro Minute, 60 Liter sterile Luft pro Minute, Temperatur 27°C, 10 ml steriles Polyol) mit 90 Liter des identischen Nährmdiums benutzt. Der Zeitpunkt der Ernte (maximale Produktion der Verbindung der Formel I ist nach ca. 42 bis 45 Stunden erreicht, wobei der pH-Wert nach Absinken auf 4,5 wieder auf 6,0 ansteigt.

b) Isolierung der Verbindung der Formel I

100 Liter Kulturbrühe werden unter Zusatz von 2% Celit über eine Mehrschichtenfilterpresse unter Verwendung von Filterschichten geklärt. Kulturfiltrat und Mycel werden getrennt aufgearbeitet: Das Kulturfiltrat wird mit insgesamt 50 Liter Ethylacetat dreimal extrahiert. Die vereinigten Ethylacetat-Phasen werden eigeengt bis zum wässrigen Rückstand, der dann mit insgesamt 3 Liter Dichlormethan dreimal extrahiert wird. Die vereinigten Dichlormethan-Phasen werden wieder eingeengt nunmehr bis zum öligen Rohextrakt. Das Mycel wird mit insgesamt 50 Liter Methanol dreimal extrahiert. Der gesamte Methanol-Extrakt wird eingeengt bis zum wässrigen Rückstand anschliessend mit insgesamt 7 Liter Dichlormethan dreimal extrahiert. Die vereinigten Dichlormethan-Phasen werden bis zum öligen Rohextrakt eingeengt und über mehrstufiges Verfahren säulenchromatographisch gereinigt und die Galbonolide A (R = OCH₃) und B (R = CH₃) aufgetrennt. Ihre Reinigung und Isolierung wird säulenchromatographisch in drei Stufen durchgeführt.

Sämtliche Chromatographien werden bei +2°C im Dunkeln ausgeführt. Ebenso erfolgt die Aufbewahrung der Fraktionen und der isolierten Verbindungen im Dunkeln bei -20°C. Die verwendeten Glasgeräte dürfen keine Säure- oder Alkalispuren mehr enthalten - sie werden vor Gebrauch mit einer (pH 7)-Pufferlösung (Phosphatpuffer) behandelt.

Es werden frisch destillierte Lösungsmittel verwendet. Einengen i. Vak. erfolgt bei maximal 25°C.

Für die Chromatographie (bei Normaldruck) gelangen folgende Gele als stationäre Phase zur Anwendung ("abgekürzte Schreibweise"):

"LH 20": Sephadex®-LH 20 a) der Fa. Pharmacia; ca. 20 Stunden in Methanol gequollen.

"TSK": Fractogel® TSK HW-40 (S) b) der Fa. Merck; die käufliche Aufschlämmung in Wasser wird folgendermassen vorbehandelt: Filtrieren, Rückstand mit Wasser gründlich waschen, 24 Stunden in Methanol umquellen lassen, in der Chromatographiesäule noch einmal mit 1 Liter Methanol waschen.

"PVA": Fractogel® PVA-500 c) der Fa. Merck; ca. 20 Stunden in entsäuertem und getrocknetem Essigsäureethylester gequollen.

a) Standart-Säule für Gel-Chromatographie der Firma Pharmacia, erhältlich auch bei der Firma Merck.

b) Hydrophile Vinyl-Polymere der Firma Merck für Gel-Chromatographien; Korngrösse 25-40 µm.

c) Polyvinylacetat-Gel der Firma Merck zur Anwendung mit organischen Elutionsmitteln; Korngrösse (trocken) 0,032-0,063 mm.

Durchführung der Chromatographien:

α) Ca. 10 g Mycelextrakt werden in 5 ml Methanol aufgenommen und über 210 g "LH 20" chromatographiert; Säulendurchmesser 42 mm, Füllhöhe 74 cm, mobile Phase: Methanol, Flussrate 18 ml/Stunde. Die Fraktionen von 350-880 ml (5 g) enthalten Antibiotikum.

β) 5 g aktive Fraktion werden erneut über die unter α) genannte "LH 220"-Säule chromatographiert. Flussrate 21 ml/h. Aktive Fraktion: 440-770 ml (1.5 g).

γ) Die unter α) und β) genannte "LH 20"-Säule wird langsam mit Methanol gesättigtem Benzin (65-70°C) umgequollen, bis die Benzin-Front eluiert wird. Dann wird die unter β) gewonnene Fraktion aufgetragen und mit ca. 20 ml/h Flussrate chromatographiert. Fraktion 1120-1380 ml enthält 220 mg Galbonolid B, Fraktion 1380-1600 ml enthält 64 mg Galbonolid A.

Reinigung von Galbonolid A:

Die unter γ) gewonnene Galbonolid-A-Fraktion wird über "TSK" chromatographiert: Säulendurchmesser 27 mm, Füllhöhe 74 cm (entspricht) 500 ml käuflicher TSK-Aufschlämmung); Elutionsmittel: Methanol; Flussrate 5 ml/h: 277-304 ml (22 mg) = Galbonolid A. Endreinigung über 18 g "PVA" (Säulendurchmesser 1 cm; Elutionsmittel Essigsäureethylester; Flussrate ca. 1.8 ml/h; 32-53 ml) und Kristallisation aus wenig Benzin (65-70°) bei -20°C.

Reinigung von Galbonolid B:

Die unter γ) gewonnene Galbonolid-B-Fraktion wird erneut über die frisch (!) mit Benzin/methanol umgequollene "LH 20"-Säule chromatographiert (genau wie unter γ)): 1944-2187 ml (24 mg) enthält Galbonolid B.

Diese Fraktion wird über "TSK" gereinigt: Säule und Bedingungen wie bei der Reinigung von Galbonolid A; 268-308 ml (14 mg) = Galbonolid B.

Endreinigung genau wie Galbonolid A.

Da die Ergebnisse der Verteilungschromatographie über "LH 20"/ Methanol/Benzin von der Flussrate, der Umquelldauer von Methanol auf Benzin/Methanol sowie vom Wassergehalt des Methanols abhängig sind, ist eine geeignete Detektion unumgänglich.

Detektion der Galbonolide während der Trennschritte 1) Biologische Detektion:

Empfindlichste Detektionsmethode bis in den picomol-Bereich ist der Agar-Plattendiffusionstest an der Riesenkolonie von Botrytis cinerea. Nachteil: Keine Differenzierung zwischen den wirksamen Komponenten.

2) HPLC-Detektion:

UV-Detektion bei 230 nm (λ _max ). RP-System: Nucleosil®-RP 18^d) oder Lichrosorb®-RP 18^e), 7 µ, Säulen: ⌀ 4 mm, 1 = 25 cm. Elution mit Methanol/Wasser 60 : 40 (v/v), Flussrate 1.6 ml/min. Galbonolid A: t _R = 55 min.

d) und e) Standart-Säulen für HLPC der Firmen Pharmacia bzw. Merck.

3) DC-Detektion:

Nach der ersten LC lassen sich in der Regel Galbonolide A und B bereits per Dünnschichtchromatographie detektieren: Nano- Platten® SIL^f) -20UV₂₅₄ (Machery-Nagel); Cyclohexan/ Essigsäureethylester 70 : 30 v/v; DC-Kammern 9×12×12 cm³ ohne Filterpapiereinlage. R _F = 0.26 (Galb. A.) bzw. 0.37 (Galb. B). Anfärbbar mit Anisaldehyd nach E. Stahl nach Trocknen bei 120°C: tiefbau, Galb. A nach türkis und Galb. B nach graublau verblassend.

f) Käufliche Platten zur Dünnschicht-Chromatographie der Firma Merck.

Beide Galbonolide A und B kristallisieren in Petrolether bei -20°C in Form von farblosen Nadeln.

Physikochemische Daten:

Der Wirkstoff wird mit den Zusatzstoffen gut vermischt und in einer geeigneten Mühle vermahlen. Man erhält Spritzpulver, die sich mit Wasser zu Suspensionen jeder gewünschten Konzentration verdünnen lassen.

Aus diesem Konzentrat können durch Verdünnen mit Wasser Emulsionen jeder gewünschten Konzentration hergestellt werden.

Man erhält anwendungsfertige Stäubemittel, indem der Wirkstoff mit dem Träger vermischt auf einer geeigneten Mühle vermahlen wird.

Der Wirkstoff wird mit den Zusatzstoffen vermischt, vermahlen und mit Wasser angefeuchtet. Dieses Gemisch wird extrudiert und anschliessend im Luftstrom getrocknet.

Der fein gemahlene Wirkstoff wird in einem Mischer auf das mit Polyäthylenglykol angefeuchtete Kaolin gleichmässig aufgetragen. Auf diese Weise erhält man staubfreie Umhüllungs-Granulate.

Der fein gemahlene Wirkstoff wird mit den Zusatzstoffen innig vermischt. Man erhält so ein Suspensions-Konzentrat, aus welchem durch Verdünnen mit Wasser Suspensionen jeder gewünschten Konzentration hergestellt werden können.

Bilogische Beispiele: (Untersuchung im Gewächshaus) Beispiel B1: Wirkung gegen Botrytis cinerea auf Bohnen Residual protektive Wirkung

Ca 10 cm hohe Bohnen-Pflanzen werden mit einer aus Spritzpulver des Wirkstoffes hergestellten Spritzbrühe (0,002% Aktivsubstanz) besprüht. Nach 48 Stunden werden die behandelten Pflanzen mit einer Konidiensuspension des Pilzes infiziert. Nach einer Ikubation der infizierten Pflanzen während 3 Tagen bei 95-100% relativer Luftfeuchtigkeit und 21°C erfolgt die Beurteilung des Pilzbefalles. Die Galbonolide A und B bewirken eine drastische Hemmung des Botrytis Befalls.

Beispiel B2:Wirkung gegen Botrytis cinerea an Apfelfrüchten

Künstlich verletzte Aepfel werden behandelt, indem eine aus Spritzpulver der Wirksubstanz hergestellte Spritzbrühe (0,006% Aktivsubstanz) auf die Verletzungsstellen aufgetropft wird. Die behandelten Früchte werden anschliessend mit einer Sporensuspension von Botrytis cinerea inokuliert und während einer Woche bei einer hohen Luftfeuchtigkeit und ca. 20°C inkubiert.

Die Galbonolide A und B bewirken eine drastische Hemmung des Pilzbefalls.

Claims (12)

1. Der Stamm Streptomyces galbus ssp. eurythermus DSM 3412 oder eine sich davon ableitende, eine der Verbindungen der Formel I worin R für OCH₃ oder CH₃ steht, produzierende Mutante.

2. Botrytizides Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es als aktive Komponente mindestens eine der Verbindungen der Formel I worin R für OCH₃ oder CH₃ steht oder einen ihrer Ether, Ester oder deren Salze zusammen mit üblichen Trägermaterialien enthält.

3. Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Verbindung der Formel I enthält, worin R für CH₃ steht.

4. Verfahren zur prophylaktischen oder kurativen Bekämpfung von Botrytis-Pilzen an Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine botrytizid-wirksame Menge einer Verbindung der Formel I worin R für OCH₃ oder CH₃ steht oder einen seiner Ester, Ether oder deren Salze auf die Pflanze, Pflanzenteile oder den Standort der Pflanze appliziert.

5. Die Verbindungen der Formel I′ oder eines seiner Ester, Ether oder deren Salze.

6. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I worin R für OCH₃ oder CH₃ steht oder eines seiner Ester, Ether oder deren Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm Streptomyces galbus ssp. eurythermus DSM 3412 oder eine sich von diesem Stamm ableitende, eine Verbindung der Formel I produzierende Mutante, in einem eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle und anorganische Salze enthaltenden flüssigen Nährmedium aerob züchtet, bis die Nährlösung die gewünschte antibiotische Wirkung zeigt, wenn erwünscht, das entstandene Galbonolid isoliert, und, wenn erwünscht, dieses in seine an den Hydroxygruppen funktionell abgewandelten Derivate, und diese gegebenenfalls in ihre Salze überführt.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung bei Temperaturen von 18-40°C während 2-3 Tagen vornimmt, bis eine maximale Wirkstoff-Produktion stattgefunden hat.

8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man bei der Produktions-Züchtung mit einer Vorkultur auf festem oder flüssigem Nährmedium oder mit einer Sporensuspension animpft.

9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass man als assimilierbare Kohlenstoffquellen in der Nährlösung Raffinose, Dextrine, Sucrose, Maltose, Lactose, Trehalose, Cellobiose, Glucose, Arabinose, Xylose, Mannit, Fructose, Galactose, Ribose, Lyxose, Allose, Altrose, Mannose, Idose oder Talose verwendet.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Nährmedium verwendet das
0,2 bis 0,7% Hefeextrakt
0,2 bis 1,0% Glucose oder Lactose
0 bis 1,5% Malzextrakt
0 bis 0,3% NaNO₃
0 bis 0,8% NaCl
und 0,5 bis 10 mM Isoleucin
enthält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass man das gewonnene Rohprodukt einer säulenchromatographischen Reinigung unterzieht.

12. Eine nach einem der Ansprüche 6 bis 11 erhältliche Verbindung der Formel I.