PT91661B

PT91661B - Processo microbiologico para a producao de compostos macrociclicos agroquimicamente uteis

Info

Publication number: PT91661B
Application number: PT91661A
Authority: PT
Inventors: Johannes Paul Pachatko; Gerhard Hoefle; Hans Reichenbach; Wolfram Trowitzsch-Kienast; Norbert Bedfor; Bettina Bohlendorf; Edgar Forche; Klaus Gerth; Herbert Irschik; Rolf Jansen; Brigitte Kunze; Florenz Sasse; Heirich Steinmetz
Original assignee: Ciba Geigy Ag; Biotechnolog Forschung Gmbh
Priority date: 1988-09-09
Filing date: 1989-09-08
Publication date: 1995-05-31
Also published as: JPH02200197A; AU629568B2; KR900004939A; NO893623L; HU209950B; NO893623D0; CZ517789A3; PL163447B1; FI894211A; FI894211A0; HUT53792A; PT91661A; BR8904506A; NO175826C; NO175826B; DK444589D0; EP0358606A2; NZ230596A; CA1330203C; DK444589A

Description

PROCESSO MICROBIOLÓGICO PARA A PRODUÇÃO DE COMPOSTOS MACROCÍCLICOS AGROGUIMICAMENTE ÚTEIS

GESELLSOHAFT FUR ΒIOTECHIMOLDGISCHE FORSCHUNG mbH e CIBA-GEIGY AG

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo microbiológico para a produção de compostos com a fórmula (I):

5’

4' . V Λ. CHj \ /^ι\^ιΧιΚ·Ζ’\·./’>

L, \ „

6' i“ I /VvW:

1« ·:

\ /tr-’ ,‘i (I) \’/'^r l·· &

CH que podem ser usados em aqroquímica para o combate ou prevenção das doenças das plantas. São também descritos seis novos microorqanismos para a realização do processo. Na fórmula anteriormente referida o anel macrocíclico ou é saturado ou, alternativamente, contem um dupla ligação na posição B,P ou na posição 9,10 ou na posição 14,15 e os substi. tuin tes R^, R,-,, R-.,

R., R_r, A, Β, X e Y 4 - u tem, por exemplo, os significados combinadas de, respectivamente, OCR!,, CRL, CRL, Η, H, CRU, H „ H e H.

•2* ’ -2« ' .j» ' ' A ' processo consiste em se cultivar, por exemplo, a estirpe Soranqium cellulosum So ce 26 (NCIS 12411), num meio nutriente apropriado, por meio de cultura aeróbica e, se desejado, se separarem subsequentemente os compostos com a fórmula I obtidos.

□ presente invento relaciona-se com um processo microbiológico para a produção de ingredientes activos macrocíc1icos com a fórmula I utilizáveis agroquímicamente, com novos microorganismos para a realização do processo e também com os ingredientes activos preparados pelo processo ou com o substrato preparado pelo processo que contem esses ingredientes activos, e a utilização dos ingredientes activos para o combate e prevenção das doenças das plantas.

(I)

A fórmula anterior relaciona-se com as combinações substituintes que se sequem, sendo o anel macrocíclico ou saturado ou, alternativamente, contendo uma dupla ligação na posição-8,9 ou na posição-9,i0 ou na posição-14,15:

Comp.	Ri	Rz	Ri	R*	Rs	A	£	X	Y	Dupla Ligação
A	OCHj	CHj	CHj	H	H	CHj	Η	H	H	Δ9.10
B	OH	CHj	CHj	H	H	CHj	H	H	H	—
C	OH	CHj	CHj	H	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
D	OH	CHj	CHj	H	H	H	H	H	H	—
E	OCHj	CHj	CHj	H	H	CHj	H	OH	H	—
F	OCHj	CHj	CHj	H	H	CHj	H	H	H	—
H	OCHj	CHj	H	H	H	CHj	H	H	OH	Δ8,9
J	OCHj	H	CHj	H	H	CHj	H	H	H	—
M	OH	CHj	CHj	H	H	CHj	H	OH	H	—
H	OH	CHj	CHj	H	H	CHj	H	H	OCHj	Δ9.10
Q	OCHj	CHj	CHj	H	H	H	H	H	H	• —
R	OH	CHj	H	H	H	H	H	H	H	—
S	OH	CHj	H	H	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
T	OH	CHj	H	H	H	CHj	H	H	H	-—
u	OCHj	CHj	CHj	OH	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
V	OCHj	CHj	H	H	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
X	OH	CHj	H	H	OH	CHj	H	H	H	' Δ9.10
Y	=0	CHj	H	H	H	CHj	H	OH	H	—
2	OCHj	CHj	H	OH	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
B	OCHj	CHj	CHj	H	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
r	OH	CHj	CHj	H	H	CHj	H	9,10-	-epojti	—
4	OH	CHj	CHj	H	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
C	OH	CHj	CHj	H	H	CHj	OH .	H	H	Δ9.10
n	OH	CHj	CHj	OH	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
r	OH	CHj	H	H	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
μ	OCHj	CHj	H	H	H	CHj	H	H	OH	—
V	OH	CHj	CHj	H	H	CHj	H	OH	H	Δ14.15
ξ	OH	CHj	H	H	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
ο	OCHj	CHj	CHj	OH	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
1	OH	CHj	H	H	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
Ρ	OH	CHj	H	H	H	CHj	H	OH	H	—
a	OCHj	CHj	CHj	OH	H	CHj	H	H	H	Δ9.10
	Estes 3	2 compostos são	preparados	por	'cultura microbio-
lógica	de mi:	lobac	terias	&	parti r	do	grupo	So rangi um/F'ol yanqium

por meio do qual eles são produzidos contpletamen te ou parcialmente e com diferentes taxas em função da estirpe particular utilizada. Comum a todas as estirpes é a produção do composto A como um dos principais produtos. Os compostos com a fórmula I serão aqui e mais abaixo denominados “sorafenes, e deste modo os compostos no qu.adro anterior são chamados, sorafen A a sorafen σ .

invento relaciona-se, em particular, com 6 novas estirpes microorgãnicas da myxobacteria que decompõe a celulose do qru.po Sor ang iutn/Po 1 vanq iiim o qual, como é sabido, pode frequentemente ser encontrado em amostras de solo, material vegetacional ou em excremento animal. Característica deste grupo, que não é geralmente mandatóriamente classificada taxonómicamente, é a sua capacidade para crescer em celulose ou em produtos de degradação da celulose como a única fonte de carbono. Independent.emente do facto de pertencerem, num sentido estricto, ou ao grupo Sorangiuffl/Polyarigium ou a um sector taxonómicamen te afim, as ó estirpes de acordo com o invento tem, de longe, em comparação com a maior parte dos elementos representativos deste grupo, o aspecto ca.racterístico de produzirem pelo menos um dos sorafenes com a fórmula I anteriormente mencionados, e produzem de preferencia pelo menos dois sorafenes, incluindo o sorafen A.

As ó estirpes têm, aqui e mais abaixo, o nome colectivo de Sor ang i um ( F'o 1 yang ium ) cel 1 u 1 osum . São originadas a partir de amostras do solo que são colhidas em diversas alturas em diferentes locais da Europa, África ou os E.U.A. Foram depositadas em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) (Colecção Alemã de Microorqanismos) em Braunschweig, República Federal Alemãa, de acordo com o Tratado de Budapeste. Possuem as seguintes caract.erísticas.

1») Sor ang ium (F’p1 yang ium ) cel 1 ul osum , estirpe So ce 139, isolada em Maio de 1986 a partir de uma amostra de solo colhida no Outono de 19Q2 em Fort Huachaca, Arizona, E.U.A. Número de depósito: DSM 5397. Data do depósito: 2 de Junho de 1989.

ce

7ϋ . ) Soranqiunt ( Po 1 yanqium) cel I u 1 osuin, estirpe So isolada em Abril de 1987 ã partir de uma amostra de solo da ilha de Delos, Grécia, colhida em Maio de 1981. Número de depósito: DSM 4795. Data do depósito: 2 de Setembro de 1988.

3. ) Soranq.imn(FOlyariqium) cel lulosum, estirpe So ce 191, isolada em Agosto de 1987 a partir de uma amostra do solo da ilha da Madeira, Portugal, colhida em Fevereiro de 1987. Número de depósito: DSM 4796. Data do depósito: 2 de Setembro de 1988.

4. ) Sorangium (Po 1 yanqium) cel lulosum. estirpe: So ce 192, isolada em Agosto de 1987 a partir de uma amostra de solo da Niqeria colhida em Março de 1987. Número de depósito: DSM 4797. Data do depósito: 2 de Setembro 1988.

5. ) Sorariqium ( Po 1 yanqium ) cel 1 u 1 osum , estirpe So ce 231, isolada em Abril de 1988 a partir de uma amostra de solo colhida em Abril de 1987 em Didyma, Turquia. Número de depósito: DSM 5393. Data do depósito: 2 de Junho 1989.

ó. > Soranq ium(Po 1yanqium) celIu1osum. estirpe So ce 242, isolada em Outubro 1988 a partir de uma amostra de solo colhida em Abril 1988 em Pozzuoli, Italia. Número de depósito: DSM 5414. Data do depósito: 19 de Junho 1989.

No que se segue, será usado para estas estirpes o nome Sor an q i um cel1 u 1osum.

processo de acordo com o invento para a produção de sorafen com a fórmula I compreende a cultura aeróbica de uma das estirpes de Sorangium cellulosum. So ce 139, SO ce 170, So ce 192, So ce 231 ou So ce 242 ou um clone, mutante,

etc. deles derivado, num meio nutritivo apropriado e deles separando o sorafen formado.

Requerimento da Patente Europeia EP-A-232,455 descreve um outro microorganismo Soranqium ce11u1osum So ce 26 cuja fermentação proporciona os sorafenes fl e B anteriormente mencionados. 0 presente invento não se relaciona com estes dois produtos e com a sua exclusiva utilização em agentes.

presente invento rei ac iona.-se com outros produtos de fermentação microbicidas importantes que são produzidos pelos microorganismos So ce 26 (número de depósito NCIB 12.411) e/ou pelos microorganismos So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231 ou So ce 242 aqui reivindicados.

CondiçSes gerais do processo para a. cultura de 6 estirpes__de produção

As estirpes de Soranqium cellulosum podem ser cultivadas num meio nutritivo apropriado por métodos biológicos padrão, por exemplo em culturas agitadas ou em fermentadores. A temperatura de fermentação é, em regra, de 10--40'-C, de preferência 10-35 -C e par ti cu 1 armen te preferível 30-32‘^;‘C, e d pH é 6-8, de preferência 7,4. □ processo prossegue aeróbicaniente e em condições estéreis.

A composição do meio nutritivo pode ser variada dentro de limites bastante alargados. Para que os nutrientes sejam assimilados devem estar presentes essencialmente, uma fonte de carbono e uma fonte de azoto e também uma fonte de sais minerais inorgânicos ds quais incluem F', B, Mg, K, Fe, Ca.

tí

As fontes de C usadas nos processos de fermentação são de preferência glucose, amido e celulose, e também os seus produtos de degradação (por exemplo cellobiose) e também ainda dissacáridos, glicerol, ácido acético e outros. Fontes apropriadas de N são, por exemplo, NH^, N0_. ou também peptonas. Um composto orgânico como fonte de N não pode, como reqra, ser simultaneamente a única fonte de C e fonte de energia na fermentação .

Sais de minerais apropriados são c1 oretos, nitratos, sulfatos, carbonatos e fosfatos dos elementos Na, K, NH^, Mg, Fe e Ca, e além disso Cu, Mn, Mo, Zn, Co e podem estar presentes outros como elementos vestiqiais. Tanto quanto possível, estes sais presentes podem também estar ligados a ácido et.ilenediaminetetraacético (EDTA).

A cultura de microorganismos é introduzida na cultura agitada ou no fermentador numa quantidade inicial de inoculação de 0,1-207», de preferência 0,5-10%, com preferência particular 0,5-5% (v/v). A duração da cultura é de cerca de 2-7 dias a aproximadamente 30°C, com lotes mais volumosos mais raramente até 10 dias ou mais. Para lotes mais volumosos, são expedientemente fermentadas inicialmente pré-culturas mais pequenas. A utilização das estirpes de Sorangium ce11u1osum é também possível numa forma imobilizada, por exemplo sob a forma de células imobilizadas em veículo sobre alginato.

Um clone derivâvel no significado anterior é qualquer cultura que tem as características do clone essencial depositado para a realização do processo de acordo com o invento, em particular uma cultura cujos microorganismos contêm os mesmos_genes estruturais que os qenes estruturais, responsáveis pela formação do composto com a fórmula I, das estirpes So ce 139, So ce

170, So cs 191, So ce 192, So ce 231 e So ce 242. Um clone derivâvel é também qualquer cultura cujos microorganismos contém um possível código genético, do composto I, ção do equivalente, devido à degenerescência do genes estruturais, responsáveis pela formadas 4 estirpes. Um clone derivâvel é, em particular, qualquer cultura que contenha myxobacter ia que decompoe a celulose, de preferência das espécies Soranq ium ce11u1osum que são capazes de produzir o composto com a fórmula I. A expressão clone derivâvel das estirpes DSM 5397, DSM 4795, DSM 4796, DSM 4797, DSM 5393 e DSM 5414 também inclui todos os mutantes ou recombinantes que são capazes de produzir o composto I .

h cultura tem lugar aeróbicamente, ou seja, por exemplo, numa cultura superficial estacionária ou, de preferência, imersa com movimento ou agitação com ar ou oxigénio em culturas agitadas ou fermentadores. De preferência, a cultura é realizada em estádios, isto é uma ou mais pré-culturas sãD primeiramente produzidas num meio nutritivo líquido sendo então transferidas por inoculação, por exemplo com uma taxa de 1:20, no próprio meio de produção.

sorafen é separado por meios físico-químicos usando métodos de separação conhecidos per se tais como filtração, em particular, e também extracção do solvente, e cromatografia, em particular cromatografia de adsorção e de separação, e, possivelmente, cristalização.

Os compostos com a fórmula I podem ser extraídos do caldo de fermentação aquoso com solventes orgânicos lipofílicos, por exemplo com retortas tais como cetona metil etílica, ciclohaxanona; com álcoois com cadeia de comprimento médio tais como isobutanol, pentanol, hexanol; com acetatos de C.-C, alquilo 1 ò (acetato de etilo, acetato de propilo, acetato de butilo, acetato de isobutilo, etc.); com tolueno, diclorometano, 1,2-dic1oroetano, clorobenzeno, diclorobenzeno, etc.

Os compostos podem ser rápidamente extraídos da massa celular filtrada com álcoois ou cetonas (por exemplo metanol, etanol, acetona, cetona metil etílica).

Os compostos com a fórmula I que podem ser separados por cristalização fraccionada ou por meio de outros processos de separação cromatográficos em sorafenes A a ró, podem então ser preparados a partir do extracto específico por concentração e/ou prec ipi tação.

Va.ntajosamente, a operação de fermentação para a preparação de compostos com a fórmula I conclui com a adição de uma resina adsorvente que adsorve os produtos desejados, ou a fermentação é realizada desde o início na presença dessa resina adsorvente. As resinas adsorventes possíveis são, em particular, substâncias poliméricas orgânicas neutrais, particularmente resinas adsorventes hidrofóbicas não iónicas que são apropriadas para a extracção lipofílica. 0 composto com a fórmula I é ligada quase quantitativamente ao último. Exemplos dessas resinas são resinas semipolares de éster acrílico, resinas não polares; polistireno/divini1benzeno e, particularmente, polistireno de ligação cruzada. Essas resinas são adicionadas em quantidades de 0,1 a 57. (v/v), de preferência 0,5 a 27. (v/v), do volume de fermentação, é também apropriado carvão activo. Particularmente vantajosas industria 1mente sãc< as resinas polistireno tais como, por exemplo, XAD—1190 ou XAD—ló (fabricante 4: Rohm and Haas) que se apresentam sob uma forma filtrável (grãos ou pílulas). Quando a fermentação fica completa a resina é separada por filtração, lavada com água e tratada com metanol ou etanol. 0 extracto

alcoólico é LoriLtritradu. U com pus tu IA (—sorafen A) , que apresenta um alto teor de cristalização, pode ser separado adicionando éter dietilico, acetato de etilo ou acetato de butilo. 0 filtrado é purificado cromatoqréficamente a. fim de se obter o sorafen A residual, em especial, e também para se obter os sorafens B residuais B a σ (sigma).

□ invento relaciona-se cdíti os compostos com a fórmula I sob uma forma, pura ou sob uma forma cristalizada. 0 invento relaciona-se, contudo, também com biomassas, extractos crús ou resinas adsorventes a partir de fermentação que contam o composto com (¾ T o rmula I e que podem ser usados como tal ou sob Dutra forma formulada a fim de combater as doenças das plantas. As biomassas podem também encontrar uma utilização subsequente ou ser comercializadas como substâncias secas moldas ou prensadas (bolo)„

Os processos de produção descritos, incluindo todos os sub-passos, constituem um componente do presente invento.

Em particular, o invento relaciona-se com um processo para a produção de sorafen com a fórmula I que compreende a cultura aeróbica de uma das estirpes de Soranqium cellulosum So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231 e “SO ce 242 ou um microorganismo que contem os mesmos genes estruturais que os genes estruturais responsáveis pela formação de sorafen, das referidas estirpes num meio nutritivo aquoso contendo uma fonte de carbono e uma fonte de azoto e também sais inorgânicos e isolamento dos sorafenes com a fórmula ΙΟ invento relaciona-se principalmente com uma apresentação do processo anteriormente mencionado em que é cultivado um microorganismo formador de sorafen do grupo das mixobacteria que decompõe a celulose.

Uma apresentação preferida do processo anteriormente mencionado compreende a cultura de uma das estirpes de Sorangium cellulosum So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231, So ce 242 ou um mutante formador de sorafen desta estirpe.

Uma apresentação particularmente preferida do processo anteriormente mencionada compreende a cultura de uma destas estirpes, depositada de acordo com o Tratado de Budapeste, So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231, ou So ce 242.

De preferência, a fermentação é realizada nas condições descritas na secção dos exemplos.

Ds micrDorqanismcs que contêm os mesmos genes estruturais responsáveis pela formação de sorafen tal como as 6 estirpes podem ser produzidos sintáticamente, por exemplo por manipulação genética, isolando os genes estruturais correspondentes a partir das ó estirpes e incorporando-as num ponto apropriado no material genético de um outro microorganismo apropriado. Microorçanismos apropriados são aqueles em que os genes estruturais envolvidos não podem ser apenas incorporados mas em que estes genes estruturais são também expressos e em que o sorafen formado não é degradado de novo, mas é de preferência extraído para um caldo de fermentação. Esses microorqanismos apropriados sSd principal mente outras estirpes de myxobacteria, em particular as; das espécies de Sorangium cellulosum, contanto que eis não tenham já os genes estruturais atrás mencionados.

□s mutantes formadores de sorafen, podem, por exemplo, ser produzidos por exposição et raios ultravioletas ou a raios X ou. a mutagénios químicos, por exemplo N-metil-N -nitro-N-nitrosoquanidina e ser isolados por selecção de acordo com as suas propriedades específicas de um modo conhecido per se. Outros processos para a. produção de mutantes e recombinantes de um microorganismo são conhecidos e familiares para as pessoas especializadas nesta técnica.

processa para a numa quantidade clone derivável de sorafen numa destas forma invento relaciona-se também com um produção de um material que contem sorafen detectável e que compreende a cultura de uma das estirpes de Soranqium cellulosum So ce 138”, So ce 179”, Bo ce 191, Bo ce 192, So ce 231 e So ce 242 ou um estirpes num meio nutritivo e produção apropriada. Esses caldos de cultura podem ser usados coma tal ou sob uma forma, concentrada, possivelmente com a adição de outras substâncias veículo e/ou dispersantes como agentes para o combate de microorqanismos patogénicos das plantas e que constituem assim uma parte importante do presente invento.

Num sentido ma.is limitado, o processo compreende a cultura de um dos microorqanismos Soranqium cellulosum So ce 139, So ce 179, So ce 191, So ce 192, So ce 231 ou So ce 242 num meio de cultura contendo pelo menos uma fonte de C e uma fonte de N assimiláveis em cada caso e sais inorgânicos apropriados, a 19-40‘^:'C, de preferência a 10-35‘^:'C, na presença ou ausência de uma resina adsorvente, estraindo—se em seguida o caldo de cultura ou a resina adsorvente separada por filtração com uma fase solvente apropriada, concentrando a solução obtida e purificando o resíduo deixado, na medida do que for desejado, por cromatoqrafia e/ou recristalização.

Culturas de estirpes e descrição morfológica:

As culturas ds estirpes são mantidas como culturas em placa sobre agar VY/2 (0,55 de fermento de padeiro por peso recente; 0,17 CaCl_o; 1,57. agar; pH 7,2) ou sobre um papel de filtro (-fonte de celulose) sobre agar ST 21 (0,171 KNO^; Õ,17. MgS0₄.7H_r,0; O, 171 CaCl^,; Θ,17 Κ,,ΗΡΠ^; 0,017. idnSO .71-^0,- õ,027 FeCl..; 0,0027. extracto de levedura; solução^ de elementos vestiqiais padrão; 17. agar). As placas são incubadas a 30°C.

Em ambos os meios os organismos formam colónias abundantes que se espalham lentamente ao longo do substrato. São observadas diferenças evidentes em detalhe entre as ó estirpes.

1) ¹¹ So ce 139 (DSM 5397): A colónia espalhada permanece amplamente confinada ao papel de filtro sobre papel de filtra em agar ST 21. Em culturas bastante velhas, o agar racha na borda do filtro, e espalha-se e o agar enrola-as em sí. 0 papel de filtro é então completamente degradado e no seu lugar fica um campo denso de corpos em frutificação negro acatanhado. Estes são compostos por pequenas sprorangiola com um diâmetro de 15-30 p.m as quais por seu lado coalescem a fim de formar pequenas agregados evoluindo até extensas massas não organizadas. As células vegetativas são hastes cilíndricas, delgadas, com extremidades abruptamente arredondadas e medem 0,7-0,9 x 2,5 - 4pm. Na microscopia de contraste de fase aparecem grânulos polares escuros, frequentemente brilhantes. Em agar VY/2 formam colónias espalhadas muito grandes com veias radiais incolores a alaranjadas e muitos corpos em frutificação pretos acastanhados com uma estrutura semelhante ás descritas anteriormente. Existe dificilmente qualquer ataque às células de levedura do meio nutritivo. As células vegetativas parecem de certo modo mais grosseiras e tãm cerca de 1 pm de espessura.

0,02-0,5 mg de sal Mn, sal Mo, sal Cu, sal Co e/ou sal Zn por litro CR.Y. Stanier et al. General Microbioloqy 4th ed . , p. 36 (1976)3; ou 500 mq de EDTA, 300 mq de FeS0_a.7H_?0, 3 mq de MnCl^.4H^0, 5 mq de CoC 1.-,. 6H_D, 1 mg de CuCl . 2H^0, 2 mq de NiCl^.óH^O, mq de ZnB0^.7H.-,0 e 2 mg litro de água destilada (aprox. pH 4)CG. Drews,

Praktikum, 4th ed. p 11, Springer Verlag, Berlin,

New York, Tokyo (1983)].

de Η-,ΒΟ-^ por Mikrobioloq. Heide1berq, mq de Na^MoO. . 2FL,D , x; 4 z.

2) Go ce 170 (DSM 4795): Em papel de filtra sabre agar ST 21, as colónias espalhadas alargam-se para além do filtro para a superfície de agar. 0 agar racha-se posteriormente profundamente e a colónia espalhada enrola-se nele. Ds corpos em frutificação podem desenvolver-se sobre papel de filtra: estes são compostos por sporangiola castanhas escuras de parede espessa, pequenas, geralmente com um diâmetro de 20-30 pm, que se encontram firmemente unidas entre sí em aqregaçSes prolongadas tendo geralmente limites agudos e um diâmetro de cerca, de 50-200 pm. Em locais contínuos podem aparecer agregados extensos de corpos em frutificação. Sobre agar VY/2 formam-se colónias alargadas cor de Ιευ-anja intensao exactamente abaixo do tamanho médio e geralmente com 1-2 cm de diâmetro. As células de levedura são degradadas lentamente. Aqui de novo o agar racha-se profundamente em certos pontos de modo à colónia espalhada poder cair completamente para fora da placa. Corpos em frutificação castanho claro a castanho escura com uma estrutura semelhante à anterior formam-se frequentemente sobre a superfície de agar. As células vegetativas sã.o hastes grosseiras que são escuras na microscopia de contraste de fase com extremidades bastante arredondadas e medindo usualmente 0,9-1,0 x 2-5 pirn. A estirpe também degrada muito eficientemente a q u i t i. n a .

3) So re 191 (Ρ5ΓΊ 4796) cresce em papel de filtro sobre agar ST 21 sem se espalhar para a superfície do agar. Também neste caso, o agar pode rachar-se profundamente à volta da borda do papel de filtro e a colónia espalhada pode enrolar-se nele. Desenvolvem-se sobre agar VY/2 grandes colónias espalhadas com um diâmetro de 6-3 cm as quais possuam veias radiais finas du espessas. Verifica-se dificilmente qualquer ataque ás células de levedura. As hastes veqetativas cilíndricas possuem extremidades amplamente arredondadas, apresentam-se escuras por microscopia de contraste de fase, são bastante longas e medem qeralmente 0,7-0,9 x 3-8 pm. A estirpe não forma quaisquer corpos de frutificação numa cultura pura em condições de cultura referidas. A estirpe degrada efici— entemente a quitina.

4) So ce 192 (DST1 4797) expalha-se extensivamente sobre a superfície do agar quando cultivada em papel de filtro sobre agar ST 21. 0 agar pode rachar—se profundamente e a colónia espalhada pode nele enrolar—se. Contudo, especialmente sobre a superfície de agar, em papel de filtro, desenvolvem-se muitos corpos em frutificação côr de laranja brilhante que consistem em sporanqiola pequenas com usualmente um diâmetro de 10-20 pm em aqragados ligados abruptamente tendo uma extensão usualmente de 50-500 pm . Colónias espalhadas espessas de tamanho médio com um diâmetro de 2-3 cm com veias radiais e muitos corpos em frutificação cor de laranja acastanhado intensa tendo uma estrutura semelhante à descrita anteriormente desenvolvem-se em e sobre o agar. As células vegetativas são hastes escuras, cilíndricas com extremidades amplas e medindo usualmente 0,7-0,9 x 3—5 pm. As células de levedura não são degradadas, mas a estirpe degrada· com grande eficácia a q u i t i n a.

5) 5o ce 231 (DSM 5393) nãD se espalha para a placa de agar em culturas em papel de filtro sobre agar ST 21. 0 aqar pode

quebrar-se no bordo do filtro mas as colónias não se enrolam nele. 0 papel de- filtro é completamente destruído e no seu local encontra-se mais tarde um campo muito denso de corpos em frutificação cor de laranja acastanhada intensa. Estes têm uma estrutura semelhante tal como no caso de outras estirpes, mas as esporangiola organizam-se- frequsntemente em faixas. Sobre agar VY/2 desenvolvem-se colónias espalhadas muito grandes que têm feixes radiais de veias finas. Desenvolvem-se localmente corpos em frutificação castanho alaranjado brilhante. As hastes veqetativas delgadas; são muito delicadas e medem 0,6-0,8 x 2,5-6 pm. As células da levedura do meio nutritivo são lentamente submetidas a lise. A estirpe também degrada muito eficientemente a quitina.

6) So ce 242 (DSII 5414) desenvolve-se em papel de filtro sobre ST 21 e também alí forma corpos em frutificação. 0 agar racha-se profundamente na. borda do papel de filtro. 0 papel de filtro é completamente degradado e é substituído por uma massa densa de corpos em frutificação preto acastanhado. As sporangiola são frequentemente organizadas em cadeias; naqueles últimos. Desenvolvem—se colónias espalhadas muito grandes com veias radiais finas sobre- VY/2. □ agar racha-se na região da colónia espalhada em muitos pontos com uma forma semelhante a garra. Além disso, aparecem grande número de corpos em frutificação. As células de levedura no substrato são degradadas lentamente. As células veqetativas medem 0,7-1,0 pm x 2-4 pm. A estirpe é muito eficiente a decompor quitina.

As estirpes produzem substâncias que inibem o crescimento de numerosas leveduras e fungos hifais.. Quimicamente as substancias inibidoras não são apenas sorafenes cujas estruturas foram já elucidadas tal como é indicado a seguir. Estas misturas de compostos macrocíclicos do tipo sorafen aparecem em culturas líquidas no produto flutuante no meio de cultura, mas podem também ser isoladas a partir das células. Os antibióticos são produzidos durante a fase logarítmica e a produção continua até ao estádio invariável da fase de crescimento.

As 6 estirpes têm que ser todas adaptadas ao crescimento no meio líquido. Crescem primeiro sob a forma de nódulos cor de laranja, sólidos, pequenos e só qradualmente formam suspensões celulares mais ou menos homogéneas após muitas operações de trarisferência de um meio líquido para outro meio líquido.

Caracterização biloóqica das estirpes So ce 13?, So ce ___170,

So ce 191, So ce 192, So ce 231 e So ce 242

Degradação da celulose: positiva Degradação da glucose: positiva Degradação do amido: positiva

NH^ como fonte de N: positivo ND-, como fonte de N: positivo

Quadro 1: Exemplos de· organismos produtos flutuantes das estirpes So ce 192, So ce 231 e So ce 242

Leveduras:

Debaryomyces hansenii

Nematospora coryli

Candida albicans

Saccharomyces cerevisiae

Rhodotorula glutinis

Hansenula anómala

Nadsonia fu.lvescens

Torulopsis glabrata

Schizosaccharomyces pombe cujo crescimento é inibido pelos So ce 139, So ce 170, So ce 191,

Classificação

inibição forte

inibição média a forte

sem inibição

Fungos hifais

Alternaria solam	inibição	forte
Pythium debaeyanum	inibição	forte
Mucor hiemal is	inibição	forte
Rhizopus arrhizus	inibição	fraca

Os valores de inibição relacionam-se com um lote de cultura médio e devem ser encarados como valores relativos no que se refere um ao outro.

invento relaciona-se com os scrafenes Ca σ com a fórmula I sob uma forma pura. 0 inventa também se relaciona, contudo, com biomassas, estractos crús ou resinas adsorventes a partir de fermentação que contém os sorafenes C a σ com a fórmula I e são capazes de ser usados como tal ou sob uma outra forma formulada para o combate de doenças das plantas. As biomassas podem também ser usadas ou comercializadas como substancias secas moídas ou prensadas (bolo).

□ processo su.b—passas constitui.

de produção descrito, incluindo um componente do presente invento todos os

Surpreendentemente, verificou-se actualmente que compostos com a fórmula I possuem um espectro biocida muito favorável contra mic roorganismos f i topa tc-gén icos , em particular contra fungos. Possuem propriedades curativas, sistémicas e em especial preventivas altamente vantajosas e podem ser utilizados para a protecção de numerosas colheitas de plantas. Usando as ingredientes activos com a fórmula I, pragas que ocorrem em plantas ou partes de plantas (frutos, flores, folhagem, caules, tubérculos, raízes) de várias colheitas podem ser mantidas sob controlo ou podem ser destruídas, mantendo-se também livres de de Lresciffiento adicioiuTíl raicroorgan israos fitopatoqénicos partes das plantas.

Carao microbicidas, os ingredientes activos com a fórmula I são activos, por exemplo, contra os fungos fitopatogénicos que pertencem às classes que se sequem: Fungi imperfecti (por exemplo, em particular, Botrytis, e ainda Pyricu.laria, He1minthosporium, Fusarium, Septoria, Cercospora e Alternaria); Basidiomycetes (por exemplo Rhizoctonia, Hemileia, Puccinia). Além disso, são activos contra a classe dos Ascomycetes (por exemplo em particular Venturia e Erysiphe, e ainda Podosphaera, Moni1inia, Uncinula) e dos Oomycetes (por exemplo Phytophtora, Plasmopara). Os compostos com a fórmula I podem ainda ser utilizados como agentes de revestimento das sementes para o tratamento de sementes (frutos, tubérculos, grãos) e estacas a fim de os proteger das infecções por fungos, assim como de fungos fitopatoqénicos originados no solo.

□ invento também se relaciona 'com os agentes que contêm um ou mais dos sorafenes C a σ com a fórmula I como o ingrediente activo, em particular agentes protectores das plantas, assim como com a sua utilização no sector agrícola ou em campos afins.

O mesmo se aplica a um processo para o tratamento de plantas que se distingue pela aplicação dos novos compostos sorafen C a σ com a fórmula I ou dos novos agentes correspondentes .

plantas são as cevada, (beterf rutos

Exemplos de colheitas alvo para a protecção das apresentados nesta publicação, no âmbito deste invento, espécies de plantas que se seguem: cereais (trigo, centeio, aveia, milho, sorgo e espécies afins); beterraba raba de açúcar e beterraba de forragem); frutos pomáceos.

duros e frutos moles (macãs, peras, ameixas, pessegos, amêndoas, cerejas, morangos, framboesas e amoras); leguminosas (feijões, lentilhas, ervilhas, grãos de soja); colheitas de oleaginosas (óleo de semente de colza, mustarda, papoila, azeitonas, girassóis, côcos, castor, cacau, amendoins); a familia das cabaças (abóbora, pepino, melão); plantas fibrosas (algodão, linho, canhamo, juta); frutos citrinos (laranjas, limões, toranjas, tangerinas); vários legumes (espinafres, alface, aspargos, espécies de couves, cenouras, cebolas, tomates, batatas, pimentão); as Lau.racea.e (avocado, Cinnamonium, cânfora) ou plantas tais como o tabaco, nozes, café, ananaz, cana de açúcar, chá, pimenta, videiras, lúpulo, a familia das bananas e plantas que fornecem a borracha natural, assim como plantas ornamentais (Compositae). Esta enumeração não representa qualquer limitação.

Os ingredientes activos com a fórmula I são habitualmente usados sob a forma de composições e podem ser aplicados. à zona da planta a ser tratada quer simultaneamente quer em sucessão com outros ingredientes· activos. Estes outros ingredientes activos podem ser fertilizantes, fornecedores de elementos vestiqiais ou outras preparações que influenciem o crescimento da planta. Neste contexto, é também passível usar herbicidas selectivos assim como insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, mo1useicidas ou misturas de uma série destas preparações, se desejado juntamente com outros veículos convencionalmente usadas na técnica da formulação, surfactantes ou outros aditivas que auxiliam a aplicação.

Veículos e aditivos apropriados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem a substancias usadas vantajosamente na técnica da formulação, por exempla substâncias naturais ou regeneradas, solventes, dispersantes, agentes de humidificação, aqetes de viscosidade, ligação ou fertilizantes.

agentes de espessamento, agentes de

Um método preferido de aplicação de um ingrediente activo com a fórmula I ou de um agente agroquímico que contenha pelo menos um destes ingredientes activos, consiste na aplicação à folhagem (aplicação às folhas). Neste contexto, a frequência da aplicação e a taxa de dosagem dependem da intensidade da infecção do agente patogénico específico. Contudo, os ingredientes activos com a fórmula I podem também entrar na planta pela via do solo e do sistema radicular (acção sistémica), regando o local onde a planta cresce com uma preparação líquida, ou incorporando as substâncias sob uma forma sólida no solo, por exemplo sob a forma de grânulos (aplicação ao solo). Estes grânulos ou pó correspondente podem também ser constituídos pela massa seca da biomassa produzida a partir do fermentador ou da resina adsorvente passada pelo crivo a partir do caldo de fermentação e fornecida juntamente com os ingredientes activos com a fórmula I. Ds compostos com a fórmula I podem também ser aplicados a sementes (revestimento), quer por imersão dos grãos numa preparação líquida do ingrediente activo quer pelo seu revestimento com uma preparação sólida.

Neste contexto, os compostos com a fórmula I são utilizados sob uma forma inalterada ou, de preferência, juntamente com os adjuvantes convencionalmente usados na técnica da formulação. Com esta finalidade, eles são expedientemente processados de um modo conhecido, por exemplo para dar origem a concentrados em emulsão, pastas que se possam espalhar, soluções diluíveis directamente pulverizáveis, emulsões diluídas, pós humidificáveis, pós solúveis, poeiras, grânulos ou encapsu1 ações, por exemplo em substancias poliméricas. Os métodos de aplicação, tais como pulverização, enevoamento, polvi 1hamento, dispersão, varredura ou rega, assim como o tipo de agentes, são escolhidos de acordo com a utilização pretendida e com as circunstancias prevalecentes, fts taxas de aplicação vantajosas situam-se geralmente a cerca de 10 q a 20 kq do ingrediente activo (AI) por hectare, de preferência a cerca de 50 q a 500 g de Al/ha.

As preparações, isto é os agentes que contêm o ingrediente activo com a fórmula I e facultativamente um aditivo sólido ou líquido, são preparados de um modo conhecido.

Solventes possíveis são: hidrocarbonetos aromático e alifático, por exemplo misturas de xileno, ciclohexa.no ou parafinas; também alcDois e glicois assim como os seus éteres e ésteres, tais como etanol, etileno glicol, éter etileno glicol monometí1ico ou éter etileno glicol monoetílico, ou ésteres de ácido acético; cetonas, tais como ciclohexanona, solventes fortemente polares, tais como l'J-meti 1-2-pirrol idona, dimetil sulfóxido ou dimeti1formamida, assim como óleos vegetais epoxidizados ou não epoxidizados, tais como óleo de cóco ou óleo de soja epoxidizados; ou água.

Os veículos sólidos que são geralmente usados, por exemplo para agentes de polvi 1hamento e pós dispersíveis, são minerais naturais moidos, tais como calcite, talco, caolino, montmorilonite ou atapulgite. Para melhorar as propriedades físicas, é também possível adicionar ácido silícico altamente disperso ou polímeros absortivos altamente dispersos. Possíveis veículos granulados em grânulos, adsortivos são do tipo poroso, por exemplo pómice, tijolo, sepiolite ou bentonite moidos, materiais veículos não-sorptivos possíveis são, por exemplo, calcite ou areia. Além disso, pode—se usar um grande número de materiais pré-granu1mados de natureza inorgânica, tal como, em particular, dolomite, ou resíduos de plantas fragmentados.

Compostos tensio-activos apropriados são surfactantos não ionogénicos ou activos em relação aos catiSes e/ou activos em relação aos artiões apresentando boas propriedades de emulsificação, dispersão e de humidificação, dependendo do tipo do ingrediente activo com a fórmula I a ser formulado. Considera—se que os surf actantes signifiquem também misturas de surfactantes.

Surfactantes aniónicos apropriados podem ser ou os chamados sabões solúveis na água ou compostos tensio-activos sintéticos solúveis na água.

Mais frequentemente, contudo, são usados os chamados surfactantes sintéticos, em particular sulfonatos de alcario, sulfatos de álcool gordo, derivados do benzimidazole sulfonatado ou sulfonatos de alquilo.

Surfactantes não-iónicos possíveis são derivados de éter ρο1iq1icó1ico de álcoois alifático ou cic1oa1ifático, de ácidos gordos saturados ou não saturados e de alqui1fenois, que podem conter 3 a 30 grupos de éter glicólico e 9 a 20 átomos de carbono na metade hidrocarboneto (alifático) e ó a 18 átomos de carbono na metade alquilo dos a.lqui 1 f enois .

Outros exemplos de surfactantes não-iónicos que podem ser mencionados são polietoxietanois de noni1feno1, éters poliglicólicos de óleo de castor, aductos óxido de polipropilenD/óxido de polietileno, tributi 1 fenoxipo 1 iet.i 1 eneetanal, polietilena glicol e octi1fenoxipolietoxietanol.

Outras substâncias apropriadas são também ésteres de ácido gordo de polioxietilenD sorbitan, tais polietileno sorbitan.

como trioleato de

Os Burfactantes que são usados na técnica da formulação são descritos, inter alia, nas publicações que se sequem:

Ide Cutcheon s detergents and Emu 1 sifiers Annual MC Publishirsg Corp., Ridgewood New Jersey, 1980.

Sisley and Wood, Encyc1opedia of Surface Active Agentes, Chemical Rublishinq Co., New York, 1980.

Aditivos particularmente vantajosos que promovem a aplicação e que podem resultar numa considerável redução na quantidade aplicada são ainda fosfolípidos naturais (animais ou vegetais) ou sintéticos das séries compreendendo as cefalinas e lecitinas tais como, por exemplo, fDsfatidil etanolamina, fosfatid.il serirta, fosfatidil glicerol ou 1 isolecitina.

Em regra, as preparações agroquímicas contêm 0,1 a 957. de ingrediente activo com a fórmula I, 99,9 a 57. de um aditivo sólido ou líquido e 0 a 257. de um surfactante.

Embora sejam preferidos aqentes bastante concentrados como produtos comerciais, o consumidor final, em reqra, utiliza agentes diluídos.

Ds aqentes podem também conter outros aditivos, tais como estabilizadores, agentes anti formação de espuma, reguladores da viscosidade, agentes de ligação, agentes de viscosidade assim como fertilizantes ou outros ingredientes activos, para a obtenção de efeitos específicos.

Os exemplos que se sequem pretendem ilustrar o invento com maior detalhe sem imporem qualquer limitação.

1. Exemplos de preparação

Exemplo H~1: Preparação de compostos com a fórmula I na pr de uma resina adsorvente.

processo é realizado num volume de fermentação de 1.Θ00 litros com a adição de de 0,57. (v/v) da resina adsorvente XAD-1180 (Rohm and Haas). As condiçSes do processo para esta mistura correspondem às do Exempla 2 mais abaixo. Em vez da estirpe So ce 26 de EP-A-2282.455 aqui usada, pode-se também usar uma das outras estirpes mencionadas do presente invento.

Depois da fermentação ficar completa, o veículo polímero é passado por um crivo, lavado numa coluna de vidro, lavado com 3 volumes de base de água e eluido com 4 volumes de base de metanol. 0 produto eluido é concentrado até à secura sob vácua,

Extracto cró 4: 165 g.

A subsequente purificação cromatográfica segue o gráfico na figura 1 apensa cujos passos individuais de separação se realizam nas condiçSes que se sequem. Os rendimentos são especificados entre parentese. (h = hora).

Processo de separação para o isolamento de sorafen A a 0

1. Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 100 mm; comprimento 45 cm; Absorvente: Lichroprep Si 100; 40-63 pm (fabricante: Merck) Fase móvel: diclorometano/acetona nos passos 98/2, 95/5, 93/7, 90/10, 50/50; 2 litros por passa são tomadas 5 fracçSes.

A fracção 3 contém soraphen A.

A fracção 4 (25 g) é purificada posteriormente.

2. Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 60 mm, comprimento 100 cm; Absorvente: Sephãdex LH-20 (fabricante: Pharmacia LKB GmbH) Fase móvel: metanol são tomadas 5 fracçSes.

A fracção 3 (17 g) é purificada posteriormente.

3. Separação de fase-reversa; diâmetro 76 mm; comprimento 70 cm;

Absorvente: HDSIL RP—19; 13-60—60 35-76» p.m (fabricante:

Labomatic) Fase móvel; gradiente linear metano 1/água em 2 h tometanol.

São tomadas 9 fracçSes.

FracçSes 3(1,3 q), 4 (1,5 g), 5 (3,5 g) e 6 (1,6 g) são purificadas posteriormente.

4. Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 40 mm; comprimento 30 cm; Absorvente: Lichrosorb Si 100; 7 pm (fabricante;

Merck)

Fase móvel: diclorometano/hexano 1/1 + 27. metanol são tomadas 6 fracçSes.

FracçSes 2 (590 mg) e 4 (88 mg) são purificadas posteriormente.

5. Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 40 mm; comprimento 30 cm; Absorvente; Lichrosorb Si 100; 7 pm (fabricante:

Merck) Fase móvel: dic1orometano/hexano 1/1 + 27. metanol são tomadas 6 fracçSes.

Fracção 3 (500 mg) é· purificada posteriormente.

6» Separação em qel de sílica; coluna: diâmetro 35 mm; comprimento 45 cm;

Absorvente: Lichroprep Si 60; 40-ó3pm (fabricante: Merck) Fase móvel: gradiente linear diclorometano em lha diclorometano/acetona 1/1.,

São tomadas ó fracçSes.

FracçSes 1 (2,4 g> e 2 (400 mg) são purificadas posteriormente.

7. Separação de fase-reversa; coluna: diâmetro 35 mm; comprimento 45 cm; Absorvente: HDSIL RF'-18; 18-30-60 25-40 pm (fabricante:

Labomatic) Fase móvel: metanol/água BC/20.

São tomadas 9 fracções.

Fracção 7 (1,4 g) é purificada pósteriormente.

8. Separação de fase-reversa; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm; Absorvente: Mucleosil 100-7 C ; 7 pm (fabricante: Macherey Nagel) Fase móvel: metanol/água 70/30«

São tomadas 7 fracções. Fracção 3 (15 mg) è purificada posteriormente. Fracção 7 contem Sorafen N (18 mg).

9. Separação de fase-reversa; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm; Absorvente: Nucleosil 100-7 C^₍; 7 pm (fabricante: Macherey Nagel) Fase móvel: metanol/água 65/35.

São tomadas 7 fracções.

Fracção 3 contem Sorafen_H (7 mg).

10. Separação de fase-reversa; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm; Absorvente: HDSIL 100-C -10@pm (fabricante: Laboma·· o

tic) Fase móvel: metanol/água 65/35.São tomadas 4 fracções. Fracção 2 contem Sorafen D (1Θ8 mg).

11. Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 40 mm; comprimento 30 cm; Absorvente: Lichrosorb Si 100; 7 pm (fabricante:

Merck) Fase móvel: diclorometano/hexano 1/1 + 17. metanol.São tomadas 9 fracções.

Fracção 4 (530 mg) e 6 (280 mg) são purificadas posteriormente.

12. Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 40 mm; comprimento 39 cm; fthsorven te: L ic hrosor b Si 100; 7 pm (fabricante: Merck) Fase móvel; diclorometano/hexano 1/1 + 1% metanol.

São tomadas 8 fracçSes.

Fracção 7 (290 mg) é purificada posteriormente.,

13. Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm; Absorvente: Nucleosil Si 100-7; 7 pm (fabricante: Macherey Nagel) Fase móvel: éter terc-butimetí1ico/hexano 1/2 + 1“/. metanol.

São tomadas 2 fracçSes.

Fracção 1 (325 mg) contem Sorafen___F

14. Separação de fase-reversa; coluna: diâmetro 20,5; comprimento 25 cm;

Absorvente: Nucleosil 190-7 ; 7pm (fabricante: Macherey Nagel)

Fase móvel: metanol/água 68/32.

São tomadas 2 fracçSes.

Fracção 1. contem Sora.phen Q (3 mg).

15. Separação de fase-reversa; coluna: diâmetro 29,5 mm; comprimento 25 cm; Absorvente: Nucleosil 199-7 C^_D; 7 μπι (fabricante: Macherey Nagel) Fase móvel: metanol/água. 66/34.

São tomadas 4 fracçSes.

Fracção 1 contem Sora.phen C (21 mg).

Fracção 2 contem Soraphen B (239 mg).

16. Separação de fase-reversa; coluna: diâmetro 29,5; comprimento 25 cm; Absorvente; Nucleosil 199-7 C^; 7 pm (fabricante;

Macherey Nagel) Fase móvel: metanol/água 65/35.

São tomadas 19 fracçSes.

Fracção 4 contem Sorafen J (18 mg).

Fracção 8 contem Sorafen E (96 mg).

17. Separação de fase—reversa; coluna: diâmetro 20,5; comprimento 25 cm; Absorvente: Nucleosil 100-7 7 pm (fabricante:

Macherey Nagel) Fase móvel; metanol/água 7Θ/30.

São tomadas 10 fracções.

Fracção 6 contem Sorafen M (93 mg).

Caracterização físicoquimica dos sorafenes C a Q

Sorafen C ^C2S^H42°S

Peso mo1ec u1 ar 506 IV (película)

3411; 2939; 2S31; 1725; 10ÓS; 1023; 939; 975.

Desvios RMM ^'C (CDCU; 10,3; 11,7; 12,5; 23,0:

1461; 1332; 1266; 1230; 1137; 1152; 1098;

6' em ppm)

26,0; 29,4;

35,8; 46,2; 57,3;

57,6; 68,8; 75,5; 74,6; 74,9; 76,1; 83,7; 99,4; 125,0; 126,2;

.26,2; 123,2; 129,6; 137,3; 141,0; 170,6.

HPLC R = 8,6 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C. _o , Macherey Nagel; fluxo:

1,5 ml/min;

fase móvel: metanol/água 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen D

C^yH^^Og PesD molecular 494

IV (película)

3411; 2937; 2831; 1733; 1461; 1432; 1382; 1359; 1328; 1268; 1208; 1195; 1096; 1050; 99S; 933.

C (CDC1_;

Desvios F(MN

6' em ppm)

10,7; 14,4; 2.2,8; 24,3; 25,0; 27,5; 27,7; 31,6; 35,3; 35,6; 43,2; 57,5; 53,6; 69,1; 70,S; 71,2; 74,8; 80,7; 82,6; 97,7; 126,4; 123,0; 123,6; 123,6; 141,0; 163,6,

HPLC R^. — 7,4 min mm Nucleos.il 100-7 C^, Macherey Naqel; fluxo:

Coluna; 4 25£

1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30; detector: UV 210 nm. Sorafen E ^C29^H46°9

Peso molecular 538

IV (película)

3393; 2939;	2329; 1725;	1461;	1430; 1380; 1266; 1235; 1191	; 11
1102; 1044;	971 .
	1 3
Desvios RMN	C (CDCl^;	A em	ppm) 10,3; 10,5; 11,5; 23,0;	,CC
29,5; 30,0;	Tc.’ τ · T^7 C.’ * vJ «1 q -'U 4 U n	40,2;	46,3; 56,4; 57,4; 58,0; 69,0
71,7; 75,0;	76,3; 80,2;	81,1;	99,9; 126,5; 126,5; 128,1;	128
140,9; 170,9

HPLC R^. = 11,8 min

Coluna: 4 250 mm Mucleosil 100-7 Cj_q, Macherey Naqel; fluxo:

1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen F ^C29^H46°8

Peso molecular 522 IV (película)

3394;	2937;	2827	; 1729;	1710;	1461 ;	1382;	1326; 1314; 1266;
1232;	1189;	1154	; 1104;	1075;	1048;	1021 ;	994; 971; 907.
Desvio	s RMN	13C	(CDC1,; .j»	8 em	ppm)
10,4;	11,7;	14,1	0, ·—W -· 1	04 o -	04 o. j» 4	28,3:	2S 8 í ? ·-* 5 τ 1 ΐ

45,7;

1;

57,4; 57,4; 57,9:

6 , ο ; 121>, 6; 128 <

69,0; 70,1;

128

140,4; 171

76,

HPLC R_x = 8,1 min

L

Coluna: 4 :·: 250 mm Nucleosil 100-7 Macqerey Nagel; fluxo:

1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen H

Γ. H 8

-gg 42 9

Peso molecular 522'

IV (pe1ícu1 a)

3444; 2935; 2867; 2833; 1723; 1459; 1409; 1382; 1334; 1270; 1230;

1179; 1156; 1104; 1069; 996; 971.

Desvios RMN 10,9:; 11,6;

C (CDC1-,; Ó em ppm)

14,4; 23,4:

25,0; 28,6; 35,6; 36,3; 43,6; 57,7; 57,8; 67,5; 68,7; 69,2; 73,9; 73,9; 76,1; 81,7; 100,1; 122,9; 126,0; 123,2; 123,7; 128,7; 138,0; 140,6; 171,5.

HPLC R_t = 7,0 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^_p, Macherey Nagel; fluxo:

1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 65/35; detector: UV 210 nm.

Sorafen J ^C23^H44°8

Peso molecular 508

IV (película)

3394; 2939; 2829; 1729; 1461; 1380; 1313; 1270; 1187; 1158; 1100;

1042; 937.

Desvios RMN (CDCU ;

6' em ppm)

11,5; 13,S; 14,3; 22,5; 24,1 ’ # 5 ^Γ_· π -_V 1

?„ τι T,5 o. T.'., t;

W ·—¹ i R ¹ t| η J— I, H ·_' tí '1 , # ; 84,6; 9tí, 2 ;

126,3; 126,3; 128,1; 123,7; 123,7; 141,3; 1727

HPLC R, tí, 1 mm

Coluna: 4 ;·; 25# mm Nucleosil 100-7 C,^,, Macherey Naqel; fluxo:

lo'

1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen 11 ^C28^H44°9

Peso mo 1ecu1 ar 524

IV (película)

3396; 2939; 2331; 1725; 1461; 1330; 1270; 1235; 1191; 1154; 1075;

1048; 994; 871; 393; 350.

Desvios RMN ^'C (CDC1-, 9,0; 10,4; 11,5; 23,1;

57,2; 57, 9; 63,8; 63,S em ppm?

‘•5, 1 ; 35,7 ; 40,3 ; 46

71,9; 72,9; 74,4; 76,3; 83,3; 99,6;

HPLC R._h = 8,5 min

Co1una

25# mm Nucleosil 1007 C,„, Macherey Naqel lo f 1 u.: :o:

1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30; detector: UV 210 nm,

Sorafen N ^C29 ^H44 °9

Peso molecular 536

IV ( pe 1 í c u. 1 a )

3444; 2939; 1731; 1461; 1380; 1309; 1268; 1224; 1164; 1098.

Desvios RMN

C (CDC1.

$ em ppm )

13,3; 13,9; 23,3; 24,4;; 24,2; 26,3; 26,7; 29,5; 32,1; 36,3;

50,3; 54,5; 57,6; 63,1; 75,2; 73,4; 79,9; 105,7; 125,8; 125,3;

127,5; 123,4; 128,4.

Desviso RMN (CDC1-,; S eni ppm)

0,9 d; 1,05 d; 1,24 d; 5,23 d; 5,85 dd.

HPLC R*. = 13,4 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C,„, Machersy Magel ; fluxo:

lo '

1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen Q ^C23^H44°3

Peso molecular 508

IV (película)

3443; 2939; 2831; 1733; 1459; 1382; 1330; 1270; 1203; 1098; 1048;

987 .

Desvios RMN (CDC1-.; 6' em ppm)

11,5; 14,5; 23,1; 24,9; 26,2; 27,1; 27,6; 31,7; 35,5; 35,9; 39,5; 50,7; 57,4; 58,7; 69,5; 71,3; 71,6; 74,6; 79,4; 81,9; 102;2; 126,6; 126,6; 127,9; 128,4; 137,9; 168,0.

HPLC R, : 4 >: 250 mm Nucleosil 100-7 C , Macherey Nagel; fluxo: L 1 t? '

1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30; detector: UV 210 nm.

Exemplo H~2: Preparação dos compostos com a fórmula I a) Précultura:

A précultura. é cultivada em frascos de 2 litros cada contenda 500 ml de um meia de cultura (contendo 0,17. de peptona da caseina, 0,5% de glucose, 0,057. CaCl^H^O, 0,05% MqB0..7H^D) a pH 7,4 sem tampão (ou com 50 mM de tampão HEF‘ES-) a 160 rpm e

30*C num quadra vibratório. O tempu mais favorável para a transferência para a cultura de fermentação é atingido após 2-3 dias (fase log superior). Em vez da estirpe So ce 192 aqui usada, pode também ser usada, uma das outras 5 estirpes do presente invento ou a estirpe So ce 26 de acordo com EF'—A—2S2,45o.

b) Fermen tação:

Um fermentador de 70 litros fornecido por Giovanola Frêres company, Monthey, Switzerland, contendo 60 litros do mesmo meio de cultura é inoculado com 10 litros de précultura. A fermentação é realizada a 30-32'^:'C. A velocidade de agitação é de 500 rpm, a taxa de arejamento 0,12 litros por litro de meio e hora. A duração da fermentação é de 7--14 dias. Assegura-se que o pH não desça abaixo de 7,0, em particular abaixo de 6,2. Os compostos macrocíclicos com a fórmula I formados encontram-se parcialmente

HEPES é o sal de K e/ou Na de ácido 4-(2-hidroxieti1)piperazina-1 —etanessu1fón ico na cultura flutuante,parcialmente nas células. Podem ser extraídos das células com álcoois ou cetonas (por exemplo acetona), e do produto flutuante da cultura com acetato de etilo du acetato de butilo. 0 caldo de fermentação é então agitado, por exemplo cinco vezes usando 2 litros de acetato de etilo em cada caso durante 5 minutos em cada caso. Estes extractos combinados são lavados duas vezes com água e concentrados sob vácuo» □ óleo escuro residual pode ser separado pelo método indicado na Figura ··>

É mais vantajoso contudo, remover os compostos com a fórmula I do volume de fermentação com resina adsorvente depois da fermentação ficar completa. Com esta finalidade, adiciona-se 0,5% v/v de resina moída finamente (por exemplo XAD-1180 ou XAD-ló) ao caldo em fermentação agitando-se durante 4 horas, após o que os compostos com a fórmula I são completamente ligados a resina. Depois de separação do caldo de fermentação por passagem por crivo, a resina é lavada numa coluna de vidro, lavada com 3 volumes de base de água e eluida com 4 volumes de base de metanol . 0 produto de eluição é concentrado até à secura in vacuo. Esse produto de eluição ou esse extracto crú. pode ser formulado com agentes de dispersão e/ou de extensão para produzir agentes de protecção das plantas utilizáveis comercia 1mente, mas o extracto crú pode também ser separado para isolar os sorafenes individuais A a σ tal como é indicado mais abaixo e na Figura 2 apensa. 0 processo de separação tal como é indicado aqui a seguir foi realizado com 65 g de extracto crú obtido a partir de 400 litros de caldo de fermentação.

Purificação cromatoqráfica (ver: processo de separação II para___o isolamento de sorafenes).

mm; compripim ( fa.bricand ic1orometano; 90/10, 85/15,

75/25, 50/50;

Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 2 mento 200 mm; Absorvente: Lichroprep Si 100; 25-40 te: Merck) Fase móvel: gradiente em estádios; 1.

2.-9. dic lorometa.no/acetona 98/2, 96/4, 95/5,

80/20, 50/50, 25/75; 10.11- diclorometano/metanol são tomadas 14 fracçSes.

FracçSes 2, 3, 5, ó, 7, 8, 9, 10, 11 são purificadas posteriormente .

Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 60 mm; comprimento 100 cm; Absorvente: Sephadex LH-20 (fabricante: Pharmacia LKB GmbH) Fase móvel: metanol são tomadas 7 fracçSes.

“Γ—\

Fracção 5 contem Sorafen A (2,5 g).

Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 30 mm; comprimento 100 cm; Absorvente: Sefadex LH—2© (fabricante: Pharmacia LKB GmbH? Fase móvel: metanol são tomadas 5 fracçSes.

Fracção 2 contem sorafen—6 (6,6 g).

Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 3© mm; comprimento 10© cm; Absorvente: Sephadex LH-20 (fabricante LKB GmbH)

Fase móvel: metanol são tomadas ó fracçSes

Fracção 2 (1 g) έ· purificada posteriormente.

Separação em 'fase reversa; coluna: diâmetro 37 mm; comprimento cm; Absorvente: HD3IL F,‘F'-18; 18-20-60 15-25 pm (f abricante:

Labomatic)

Fase movei: metanol/água 72/28.

são tomadas 9 fracçSes.

Fracção 7 contem sorafen V /1,1 g).

6. Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 3© mm; comprimento 100 cm; Absorvente: Sephadex LH—2© (fabricante: Pharmacia LKB GmbH) Fase móvel: metanol são tomadas 4 fracçSes.

Fracção 2 (1,1 g) é purificada posteriormente.

Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 30 mm; comprimento 100 cm; Absorvente: Sephadex LH-2© (fabricante: Pharmacia LKB GmbH) Fase móvel: metanol são tomadas 6 fracçSes.

FracçSes 2 (0,54 q) e 3 (0,18 q) são purificadas posteriormente.

S. Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 30 mm; comprimento 100 cm; Absorvente: Sephadex L.H-20 (fabricante: Ftiarmacia LKE: GmbH) Fase móvel: metanol são tomadas 6 fracçBes,

Fracções 2 (0,3 g) e 3(1,3 g) são purificados posteríormente.

Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 60 mm; comprimento ICO cm; Absorvente: Sephadex L.H—20 (fabricante: Pharmacia LKB GmbH) Fase móvel : metanol são tomadas 7 fracçoes.

Fracção 2 (3,3 g) é purificado posteríormente.

1Θ Cromatografia em gel; coluna: diâmetro 60 mm; comprimento 100 cm; Absorvente: Sephadex LH-20 (fabricante: Pharmacia LKE: GmbH) Fase móvel: metanol são tomadas 6 fracçoes.

Fracção 2 (6,1 g) é purificada posteríormente.

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 37 mm; comprimento 34 cm; Absorvente; HDSIL RP—13; 13-20-60 15-25 pm (fabricante:

Labomatic)

Fase móvel: metanol/água 75/25.

Fracção 5 contem sorafen Ei (40 mq).

Fracção 7 contem sorafen B (0,5 g).

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 35 mm; comprimento 45 cm; Absorvente: HDSIL RP-16; 13-30-60 25-40 ptm (fabricante: Labomatic)

Fase móvel: metanol/água 30/20.

São tomadas 10 fracçoes.

Fracção 3 contem sorafen E (30 mg).

Fracção 4 é purificada posteríormente.

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 37 mm; comprimento 34 cm; Absorvente: HDSIL RP-1S; 18-20-60 15-25 pm (fabricante:

Labomatic >

Fase móvel: metanol/água 75/25.

São tomadas 10 fracçSes.

Fracção 6 (80 mg) é· purificada posteriormente. Fracção S (20 mg) à purificada posteriormente.

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 37 mm; comprimento 34 cm; Absorvente: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 pm (fabricante:

Labomatic:)

Fase móvel: metanol/água 75/25.

São tomadas 11 fracçSes.

Fracção 5 contem sorafen X (16 mq).

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 35 mm; comprimento 45 cm; Absorvente: HDSIL RP-13; 13-30-60 25-40 pm (fabricante:

Labomatic)

Fase móvel: gradiente linear metanol/água 70/30 em 2 h para me tano1.

São tomadas 8 fracçSes.

Fracção 5 contem sorafen U (150 mg).

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 35 mm; comprimento 45 cm; Absorvente: HDSIL RP-13; 13-30-60 25-4-0 pm (fabricante: Labomatic)

Fase móvel: gradiente linear metano 1/água 75/25 em 1 h a 90/10. São tomadas 9 fracçSes.

Fracção B contem sorafen M (0,93 g).

Fracção 7 (250 mg) é purificada posteriormente.

Separarão de fase reversa; coluna: diâmetro 37 mm; comprimeri to 34 cm; Absorvente: HDSIL RF—18; 18—20—60 15—20 pim (fabricante

Labomatic)

Fase móvel: metanol/áqua 70/30.

São tomadas 13 fracções.

Fracção 4 (105 mg) é purificada pósteriormente.

Fracção 6 contem sorafen R (20 mg).

Fracção 7 contem sorafen S (490 mg).

Fracção 8 contem sorafen T (80 mg).

Fracção 9 (SO mq) é purificada pósteriomente.

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 37 mm; comprimento 3 cm; Absorvente: HDSIL RP-18; 13-20-60 15-25 pm (fabricante

Labomatic)

Fase móvel: metanol/áqua 70/30.

São tomadas 14 fracções.

Fracção 7 (700 mq) é purificada posteriormente,

Fracção 3 (570 mg) é purificada posteriormente.

Fracção 9 contem sorafen $ (120 mg).

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 20 mento 25 cm; Absorvente; RP-13 Nucleosil 100-7 C _p mm; 7 p.m compri ( f a b r i cante: Macberey Nagel)

Fase móvel: metanol/áqua 67/33. São tomadas 6 fracções.

Fracção 5 contem sorafen Γ (11 mg).

Separação eã gel de sílica; coluna: diâmetro 20,5 mm; compri mento 25 cm; Absorvente: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 pm (fabrican te: Macberey Nagel)

Fase móvel: éter terc—butil meti 1 ico/n —he:-:ano/+metanol 1/2+17 são tomadas 3 fracções. Fracção 2 contem sorafen niu (3 mg).

Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm; Absorvente: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 pm (fabricante: Macherey Nagel)

Fase móvel: éter terc-butil metilico/n-he:<ano/+metanol 1/2/+ 17. são tomadas 2 fracçoes.

Fracção 2 contem sorafen β (B mq).

Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm;

Absorvente: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 pm (fabricante: Macherey Naqe1)

Fase móvel: éter terc-butil meti 1 ico/n-he;:ano/ + metanol 1/2/+ 57. são tomadas 7 fracções.

Fracção 1 contem sorafen Y (64 mg).

Fracção 4 contem sorafen o (5 mq).

Fracção 6 contem sorafen csi (7 mg).

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm: Absorvente: RP-1B Nucleosil 100-7 C ; 7 pm (fabri1 o ' cante: Macherey Nagel)

Fase móvel: metano1/água 60/40.

São tomadas 6 fracçoes.

Fracção 2 (35 mg) é purificada posteriormente.

Fase móvel: éter terc-butil metí 1 ico/n-hexano/+metanol 1/2/+ 107. são tomadas 5 fracções.

Fracção 2 contem sorafen σ (20 mg).

Separação de fase reversa; coluna: diâmetro 20,5 mm;

mento 25 cm: Absorvente: RF'-13 Nucleosil 100-7 C._ ; 7 pm 1 o cante: Macherey Nagel) compri” (fabri—

Fase móvel: metano 1/áqu.a 60/40.

São tomadas 9 fracçSes.

Fracção 4 (194 mg) é purificada posteriormente. Fracção 5 (130 mg) é purificada posteriormente. Fracção 6 (50 mg) é purificada posteriormente.

Fase móvel: éter terc-butil metilico/n-hexano/+metanol 1/2/ + 57. são tomadas 9 fracçSes.

Fracção 4 contem sorafen ró (45 mg).

Fase móvel: éter terc-butil meti 1 ico/n-he::ano/+metanol 1/2/ + 107. são tomadas 4 fracçSes.

Fracção 2 contem sorafen zeta (26 mg).

Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm; Absorvente: Si 100 Nucleosil 100-7; Gm (fabricante: Macherey Nagel)

Fase móvel: éter terc-butil meti lico/n-hexano/+metanol 1/2/+ 57. são tomadas 4 fracçSes.Fracção 2 contem sorafen p (18 mg).

Fracção 3 contem sorafen eta (69 mg).

são tomadas 5 fracçSes.

Fracção 4 contem sorafen k (5,5 mg).

Separação em gel de sílica; coluna: diâmetro 20,5 mm; comprimento 25 cm; Absorvente: Si. 100 Mucleosil 100-7; 7 pm (fabricante: Hacherey Nagel)

Fase móvel: éter terc-hutil meti 1 ico/n-hexanoZ+metanol 1/2/+ 57. são tomadas 4 fracçSes.

Fracção 4 (10 mg) é purificada posteriormente.

Fase móvel: éter terc—butil meti 1 ico/n —he;:ano/+metanol 1/2/+ 5% são tomadas 2 fracçSes.

Fracção 1 contem sorafen π. (2,2 mq) .

Fracção 2 contem sorafen Z (6,5 mg.).

Caracterização físicoquímica dos sorafenes R a σ obtidos adicional mente

Sorafen V ^C2e^H42°S

F'eso molecular 506

IV(película, niu em cm

1169; 10Ó8

Desvios RMN

C (CDC1_.; 6' em ppm)

HPLC R = 9,2 min

Coluna.: 4 x 256» mm Mucleosil 100-7 C,_, Macherey Na.qel;

Cj fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/36»; d e tec to r : UV 216» n m.

Sorafen X ^C2B^H42°9

Peso molecular 522 19 (película, niu em cm

3404; 2941; 1716; 1596; 14Ó1; 1360; 1272; 122

1069; 983.

1189; 1156; 1106»;

Desvios RMM ^C (CDCl-.; 6' em ppm) 10,3; 11,7; 12,5; 23,1; 25,9; 29,4; 68,9; 72,5; 74,5; 75,6»; 76,1; 83,8:

35,2; 35,6; 35,7; 46, 99,5; 113,4; 115,2;

57,3;

118,0;

170,9.

HPLC R = 4,4 min

Coluna: 4 x 256» mm IMucleosil 100-7 C^g, Macherey Na.qel; fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metano1/áqua 70/30; de tec to r: UV 216» n m .

Sorafen U ^C29^H44°9

Peso molecular 536

IV (película, niu em cm 3336; 3361; 2977; 2939;

-1 ) i:

ÍB92; 2823; 1698; 1461; 1386»; 1268; 1185;

1096; 1064; 1023; 975; 900; 846».

Desvio RMM ^-'C (CDCl^;

10,1; 11,4; 12,2; 31,8;

57,9; 64,2; 68,7; 72,2; 73,3; 76,2; 80,0; 84,5; 99.3;

126,1; 126,1; 127,9; 128,4; 128,4; 140,6; 141,4; 171,7.

em ppm)

32.9: 35.2: 35.2: 38.6: 46.3: 56.. 0

HPLC R^ — 3,2 min

>50 mm Nucleosil 100-7 C._, Macherey Nagel;

16'

Coluna: 4 fluxo; 1,5 ml/min; fase móvelϊmetanol/água 70/30 detector: UV 210 rim.

Sorafen R

C^, H..0_o26 40 8

Peso molecular 480 IV (pe1ícula, niu em cm

3404; 2937; 1731; 1459; 1430; 1384; 1355; 1330; 1270; 1212; 1110; 1083; 1033; 988.

Desvios RMN 10,7; 14,5;

l‘C (CDCl-,; & em ppm)

22,7; 23,3; 24,8; 27,9; 30,9; 31,8;

43,4; 58,6; 6Θ,9; 71,0; 72,9; 73,3; 74,6; 80,5; 97,6; 126,5;

126,5; 128,0; 123,6; 128,6; 141,1; 168,8.

HPLC R = 5,1 mm

Coluna: 4 250 mm Nucleosil 100-7 C,,-,, Macherey Naqel ;

fluxo; 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen S C H D _p

Peso molecular 492 10 (película, niu em cm

3431; 2941; 1720; 1604; 1459; 1426; 1380; 1264; 1187; 1150; 1104;

1062; 977.

Desvios RMN '“'C (CDCl-,.; Ó em ppm) o L Ou

10,5; 11,9; 12,7; 24,9;

69,5;

73,5; 74,1; 75,8; 76,3; 77,9; 100,6; 125,1; 127,1; 128,7; 129,4;

129,4; 138,8; 143,3;

HPLC R. = 5,9 min t ’

Coluna: 4 250 mm Nucleosil 100-7 C,-,, Macherey Naqel;

cl ' ' fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metano1/água 70/30; detector: UV 210 n m.

Sorafen T ^C27^H42°B

Peso molecular 494

IV (película, niu em cm

3427; 2941; 1720; 1461; 13B2; 1268; 1191; 1154; 1106; 1068; 994,

971 .

Desvios RMM ^'C (CDC1_; 6' em ppm)

10,4; 11,7; 14,2; 22,7; 24,S; 25,3; 23,3; 30,6; 32,3; 34,6; 35,2; 45,8; 57,3; 69,1; 69,8; 73,0; 73,3; 76,0; 76,4; 99,6; 126,5; 126,5; 128,1; 128,5; 123,5; 140,6; 171,9.

HPLC R =6,5 min

Coluna: 4 x 250 mm Nu.cleosil 100-7 C^g, Macherey Naqel; fluxo: 1,5 ml/min; fase móve1:metano1/água 70/30; detector: UV 210 mu.

Sorafen_δ (delta)

Cf27^H42°B

Peso molecular 506

IV (película	, niu	-1 ) em cm
3440; 3311;	2937 ;	1731; 1600;	1461	; 1380;	1340;	1185; 1096;	988;
350.
Desvios RMM	^r-'C (CDCU; 6 em	ppm)
10,2; 12,0;	12,7;		29,6	; 34,9;	36,0;	37,3; 45,3;	56,2;
57,6; 70,3;	72,1;	72,6; 74,3	; 74	,9; 84,	2; 99	,5; 124,9;	126,3;

126,3; 128,0; 128,6; 123,6; 131,6; 141,2; 171,2.

Sorafen Γ (gama)

Γ Η 0 '28 42 9

Peso molecular 522

IV (película, niu em cm ^ )

3398; 2939; 1723; 1461; 1382; 1264; 1139; 1152; 1102; 1066; 975;

894 .

Desvios RMN ^''C (CDCU); 6 em ppm)

8,6; 10,3; 11,5; 23,6; 25,8; 28,8; 33,9; 35,4; 36,3; 46,6; 54,7;

57,3; 58,1; 59,2; 68,3; 69,3; 73,5; 74,3; 76,2; 33,5; 99,7;

126,1; 126,1; 128,0; 128,6; 141,4; 170,4.

HPLC R = 8,4 min

Coluna.·: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^g, Macherey Nagel fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen niu

C„„H,_O„ Peso molecular 522 28 42 9

IV (película, niu em cm ')

3402; 2971; 2953; 2872; 1733; 1459; 1367; 1181; 860.

1095; 1050; 990;

Desvios RMN ^''C (CDCl_.j & em ppm)

3,7; 10,3; 11,5; 26,3; 33,4; 35,2; 40,2; 40,8; 46,2; 57,4; 58,1; 67,8; 68,9; 71,5; 73,5; 76,3; 78,9; 82,6; 99,4; 125,9; 125,9; 128,3; 128,7; 128,7; 128,3; 129,5; 140,7; 170,3.

HPLC R_t = 8,5 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C-^θ, Macherey Nagel;

fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30;

detector: UV 210 nm.

Sorafen β (beta) ^C29^H44°S

Peso mo 1 ecul a r 520

IV (película, niu em cm 3408;

1365;	1343;	1181; 1095; 1050;	99«;
Desvio	s RMN	^r’'C (CDC1..; A em	ppm)
10,1 ;	12,1;	12,6; 23,4; 25,5;	30,4
56,3;	57,9;	70,3; 72,1; 72,	4; 74

126,3; 126,3; 129,0; 128,6; 128,6;

2971; 2935; 2825; 171

958; 842; 738.

1459 ; 35,0; 35,9; 37,2; 45 ,2; 83,1; 84,8; 99,4

140,0; 141,3; 171,3.

H F' L C R — 16,8 m i n

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100—7 C^g, Macherey Naqel; fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen Y ^C27^H4C,^D9

F'eso molecular 508

IV (película, niu em cm

3436; 2937; 1721; 1459; 1376; 1268; 1199; 1114; 1048; 988; 961.

Desvios RMN 10,8; 11,2;

13_r em ppm)

23,5; 31,7; 33,4; 36,2; 40,6; 41,1; 51,1 61,1; 70,8; 74,6; 76,4; 77,1; 78,7; 86,4; 99,9; 125,5; 125,5 127,4; 128,4; 128,4; 142,5; 171,1; 212,4.

C (CDCU; 18,8; 23,0;

HRLC R^ = 6,1 min

Coluna; 4 250 mm Nucleosil 100-7 C^g, Macherey Nagel;

fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30; detector; UV 210 nm.

Sorafen o (omicron) ^29^44^9

Peso mo 1 ec li 1 a r 536 IV (película, niu em cm ^x)

3402; 3361; 2933; 2894; 1708; 1457; 1360; 1269; 1187; 1150; 1096;

1062; 975; 898; 838; 765.

Desvias RMN

13,-.

(CDCl-.; 8 em ppm)

10,4; 11,6; 12,6; 31,7; 33,4; 35,3; 35,7; 38,7; 46,3; 56,3; 57,4; 58,3; 65,7; 69,0; 72,3; 74,2; 76,2; 80,0; 84,8; 99,5; 122,9; 126,3; 126,3; 128,2; 128,6; 140,1; 140,7; 170,8.

HPLC R = 4,8 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^g, Macherey Nagel; fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metano1/água 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen csi ^C27^H40°8

Peso molecular 492 IV (película, niu em cm

3402; 2969; 2933; 1731; 1459; 1367; 1179; 1095; 1050; 990.

68,9; 72,3; 73,5:

Desvio^. RMN ¹ C (CuCl-.; 8 em ppm)

10,4; 11,7; 12,5; 20,1; 26,2; 31,8; 35,2; 35,7; 36,2; 46,4; 57,4;

75,0; 76,1; 76,3; 99,6; 126,2; 126,2; 127,0;

128,1; 128,6; 128,6; 138,3; 141,2; 170,7.

HPLC R^ = 4,1 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C,.-,, Macherey Naqel;

o ' - .

fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30;

detector: UV 210 nm.

Sorafen_σ (sigma)

^29^44^9

Peso molecu 1 ar 536 IV (película, niu em cm

3398; 3363

3301 '71 ;

2894; 1702; 1453; 1378; 1262; 1167;

1150; 1100; 979; 838.

Desvios RMN ^'C (CDC-,; 9 em ppm)

10,3;	11,5;	12,4;	31,6;	34,2;	35,0;	35,5; 38,9; 46,2; 56,1;	tc“7 cr o / , o ;
58,5;	64,3;	69,1;	73,1 ;	76,	1 ; 77,	2; 79,8; 85,2; 99,7;	121,8;
126,0	; 126,(	í; 128,	0; 123,5; 1	23,5;	141,9; 142,0; 171,4.

HPLC R = 6,2 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C_<o, Macherey Naqel ; fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen ró ^C27^H42°9

Peso molecular 510

IV (película, niu em cm

3398; 3363; 3301; 2971; 2933; 2894; 1700; 1451 1150; 1100; 1064; 979; 898; 338; 765.

1378; 1262; 1187;

Desvios RMN ^1-'C (CDCl-,; 9 em ppm) 8,7; 10,3; 11,4; 23,1; 25,5; 26,4; 57,2; 68,5; 68,0; 71,8; 73,1; 73

127,9; 128,5; 128,5; 141,4; 171,4.

32,3; 35,0; 36,1; 40,5; 7; 74,3; 76,4; 99,7;

46,6; 126,3;

HPLC R = 4,7 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100—7 C^g, Macherey Naqel;

fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30;

detector: UV 210 nm.

Sorafen zeta ^23^42θ9

Peso molecular 522

IV < pe 1 ícu.l a., niu em cm

3398; 2937; 1718; 1457; 1378; 133

Desvios RMN ^''C (CDC1-.; 6' em ppm) 11,8; 21,9; 25,9; 25,9; 23,7; 36,

120

110:

978.

39,9; 43,Θ; 45,7; 56,7; 57,4

58,6; 70,6; 75,5; 76,2; 78

128,0; 128,4; 123,7; 128,7;

78,2; 84,3; 98,9; 125,9;

3,1; 141,2; 171,6.

125,9

HPLC R^ = 3,5 min

Coluna: 4 x 250 mm Mucleosil 100-7 C_1r,, Macherey Naqel ;

13’ fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen μ (mu) ^C2B^H44°9

Peso molecular 524

IV (película	-í , nlu em cm )
3423; 2939;	1725; 1459; 1380; 1264;	1191;	1154; 1102; 1052;	992
971 ; .
Desvias RMN	1*‘C (CDC1-,; 6' em ppm)
10,4; 11,7;	14,1; 21,3; 27,7; 28,2;	•j.0,9;	32,9; 34,1; 35,2;	45,6
57,4; 60,7;	69,1; 70,0; 70,4; 72	, 1 ; 76	,2; 76,3; 85,4;	99,6
126,6; 126,6	; 128,2; 128,6; 128,6;	140,2;	172,a.

HPLC Rj_ = 4,7 min

Coluna: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^g, Macherey Nagel;

fluxo; 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/áqua 70/30;

detector: UV 210 nm.

Sorafen eta

92 9

Peso molecular 522 IV (película, niu em cm 3411, 2935; 1718; 1459; 1332; 1266; 1139'; 1152:

1104; 1066; 9tíl

Desvios RMM ^'^-’C (CDCl,,; <5 em ppm)

10,2; 11,4; 12,3; 31,6; 32,9; 35,1; 35,4; 33,1; 46,2; 57,2; 57,7; 64,0; 63,3; 72,2; 73,7; 74,7; 76,2; 81,2; 99,3; 124,8; 126,1; 127,9; 128,4; 128,4; 137,8; 141,1; 171,4.

HF'LC R^ - 4,6 min

Coluna: 4 :< 250 mm Nucleosil 100-7 C._n, Macherey Naqel; fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 70/30; detector: UV 210 nm.

Sorafen k (kapa) ^C27^H40°B

Peso molecular 492 IV (película, niu em cm ⁱ) 3411; 2935; 1270; 1189; 1104; 1048; 990.

•1

1731; 1461; 1382; 1347:

Desvios RM	N	^b-'C (!
10,1; 12,1	R	12,8;
70,3; 72,0	R	72,7;
127,9; 128	,5	; 128
HPLC R'_t =	4,	7 min
Coluna: 4	x	250
1,5 ml/min	R	fase ι
detec tc-r :	UV	210 ι
Sorafen π	< P	i )

^C27^H40°8 nm.

'18

F'eso mo lecu 1 sr 492 IV (película, niu em cm ¹)

3396; 3363;	3299 q 2968;	2933;	2694 ;	1792;	1451; 1378; 1262;	1167;
1159; 1109;	979.
Desvios RMN	^-'C (CDC1-,;	í'd em	ppm)
19,3; 12,3;	14,6; 23,4;	25,9;	T·-? o. •J4,λ— 4	T CT ' - -u , ΰ;	36,9; 36,8; 59,4;	55,9;
79,2; 71,2;	73,9; 75,9;	75,5;	98,3	; 125,	2; 126,2; 128,1;	128,6;

128,6; 137,8; 141,9; 171,5.

HF'LC R = 4,8 min

Coluna: 4 :·: 259 mm Nucleosil 199-7 C^g, Macherey Nagel ; fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 79/39; detector; UV 219 nm.

Sorafen Z ^C28^H42°8

Peso molecular 522

IV (película, niu em cm / 3495; 2937; 1718; 1459; 1389;

992; 859; 813; 738.

1266; 1189; 115

1194; 1969; 987;

Desvios RMN ^ ’C (CDCl-.; £ em ρριη) 19,5; 11,7; 12,6; 31,3; 33,5; 35,3

66,9; 69,9; 79,5; 72,5; 74,3; 76

126,2; 123,2; 123,6; 128,6; 149,4;

2; 84, 149,9;

41,1; 46,3; 56,9; 57,3; .; 89,5; 122,4; 126,2; 179,9.

HF'LC R_fc = 7,7 min

Coluna: 4 x 259 mm Nucleosil 199-7 C^g, Macherey Nagel;

fluxo: 1,5 ml/min; fase móvel: metanol/água 79/39;

detector: UV 219 n m

Na base da análise estrutural par raios X de sorafen e dos dados anteriormente determinados, são assumidas as estrutu ras estéricas IC a. IQ que se seguem para os sorafenes C a Q:

(ΙΈ) (IH')

OCHj

ÊHj (π·)

São assumidas tes compostos IR , IS , I* ,Izeta , lata , Ik , configurações semelhantes para os restanIT , IU , IV , IX , IY , IZ , Ιβ , ΙΓ , Ιμ , Icsi e I ró

A configuração que se seque é provável para sorafen

I n i. u

OH

ι **

CHj (!%>' ) !

A configuração não foi estabelecida com uma certeza para os sorafenes ο, π e σ. Além disso, é evidente que os sorafenes individuais são epiméricos no que se refere um ao outro. 0 sorafen 6' é epimérico no que se refere ao sorafen C; os sorafenes k e csi são epiméricos no que se refere um ao outro e ao sorafen S, e o mesmo se aplica aos sorafenes U, o e σ. Os; valores físicos medidos determinados para um composto em especial com a fórmula I os quais, tal como o especialista nesta técnica, sabe, por vezesnão torna possível qualquer atribuição exacta a uma determinada configuração, são em cada caso de ligação.

as

Tal como foi mencionado, o invento compreende todas formas estereoisoméricas dos compostos individuais indicados com a fórmula I e também a sua preparação e a sua utilização para o combate ou prevenção das doenças das plantas. Além disso, o invento inclui, contudo, em particular também compostas IC a Iσ , para os quais são assumidas as configurações indicadas anteriormente, tendo como base os seus dados fisicoquímicos.

Deve tomar-se em consideração que ds sorafenes com a fórmula I se apresentam normalmente sob a forma hem.iacetal indicada, mas esta forma pode ser submetida a uma fissão do anel reversível de acordo com o esquema:

— v-⁸i ho-2·· \/ ch₂-b fí ₅ί

Z\*/\

Ór₂

OH

Dependendo dos métodos de preparação ou de manipulação os sorafenes são produzidos sob uma ou outra forma ou como uma mistura das duas formas, dependendo do pH e do solvente. Caracte— rístico da fissão do núcleo é α desvio do sinal de RMN ^'‘C na posição-3 e o desvio dos sinais de RI1M 'noutras posições particulares. No caso do sorafen A, por exemplo, são observadas as alterações que se seguem. RMN ¹ ''C (CDC1 -», Ó em ppm) 99,5 -> 203,1(3-0. RMN ¹H(CDC1^, S em ppm): 3,14 -> 3,72 (2-H>; 3,18 -> 4,5(4-H); 3,83 -> 31,ó /7-H); 5,86 -> 5,7 (17-H). Desvios semelhantes são também observados no caso dos sorafenes B a ró. A fórmula I do presente invento compreende em princípio ambas as formas hemiacetal—3 preferidas com pHs baixos e também a forma

3-ceto-7-hidroxilo f ission.ada.

2. Exemplos de formulação para um ou mais ingredientes activos com a fórmula I (7. - por cento em peso)

A sequir, um ingrediente activo é um dos sorafenes numa forma pura ou uma série de sorafenes C a σ ou um seu produto de eluição, obtido a partir de preparação microbiolóqica numa forma líqu.ida ou sob a forma de um resíduo seco que contem a quantidade total não separada de sorafenes.

2.1 Concentrados em emulsão	a)	b)	c )
Ingrediente activo	257.	407.	507.
Dodeci1benzenessu1fonato de Ca	57.	87.	Ó7.
Éter polietilene glicólico
de óleo de castor(3ó mol de
óxido de etileno)	57.	-	-
Éter polietilene glicol
tributi1fenólico (30 mol de
óxido de etileno)	...	127.	47.
Ciclo he x an on a	-	157.	207.
Mistura de xileno	Ó57.	257.	207.
Emulsões de qualquer	concentração	dese j ada	podem
preparadas a partir desses concentrados por	diluição c	om água
1 r~- _ i . ,~~^J_... Z. » Z. □UlLiÇDfbi	a)	b)	c )	d)
Ingrediente activo	80 7.	107.	57.	957,
Éter etileno glicol etilenico	207.	-	-	-
Polietileno qlicol PM 400	-	707.	-	...

N-meti1-2-pirrolidona		207.
Oleo de cScd epoxidizado	-	17. 57.
Éter de petróleo (variação ebulição
160-1 90C )	-	94%
(PM - peso molecular)
As soluções são apropriadas	p 3 Γ* 3 3	plicação sob a forma
de microgotico1 as.
2.3 Grânulos	3 ?	b)
Ingrediente activo	57.	1 0%
C a o 1 i η o	947.	-
Ácido silícico altamente disperso	17.	...
Atapulgite	-	90%
0 ingrediente activo é dissolvido	em cloreto de metile-
no, sendo a solução pulverizada para o	v e í c u	lo, e sendo o solven-
te evaporado então sob vacu.o.
2..4 Poeiras	a)	b )
Ingrediente activo	27.	57.
Ácido silícico altamente disperso	17.	cr·/ 4/·
Talco	977.	-
Caolino	-	90%

Uma mistura íntima das substancias veículo com o ingrediente activo dá origem a poeiras prontas a usar. Com a posterior adição das três substâncias veiculo, estas poeiras podem ser moidas para dar origem a poeiras prontas para aplicação contendo 0,0017. de inqrediente activo.

2.4 Pós humidifiçáveis	a)	b>	c )
Ingrediente activo	257	50 Λ	757
Liqninsulfonato de Na	57	57.	-7.
Lauri1 sulfato de Na	7;-/	-	57.
Diisobutilnaftalenessulfonato de Na	-	Ó7	107
Éter pDlietilene glicol octi1fenólico
(7-8 mol de óxido de etileno)	-	27.	-7
Acido silícico altamente disperso	C··/ /·	107	107
Caolino	Ó27.	277	-

ingrediente activo é completamente misturado com os aditivos, e a mistura é moida completamente nu.m moinho apropriado. Isto dá origem a pós humidificáveis que podem ser diluídas com água para dar origem a uma suspensão de qualquer concentração desejada.

2.6 Grânulos revestidos

Ingrediente activo 37. F'o 1 ietei 1 eno glicol (PM 200) 37. Caolino 947 (PM = peso molecular)

Num misturador, o caolino humidificado com polietileno glicol é revestido uniformemente com o ingrediente activo finamente moido. Deste modo,, são Dbtidos grânulos revestidos sem poeiras.

2.7 Concentrado em suspensão

Ingrediente activo 4Ú7

Etileno glicol 107.

Éter polietileno glicol noni 1 fenó 1 ico 67.

(15 mol de óxido de etileno)

Ligninsu1fonato de Na

107.

Celulose carboximetí1ica

17.

Solução de formaldeido aquoso a 377. 0,27.

óleo de silicone sob a forma de uma e m u 1 s a o a q υ o s a a 7 5 /. 0,0/.

Água 327.

ingrediente activo finamente rnoido é intimamente misturado com os aditivos. Isto dã origem a um concentrado em suspensão, a partir do qual se podem preparar quaisquer concentrações desejadas por diluição com água.

2.8 Concentrado de biomassa

A biomassa proporcionada pela cultura de produção é seca, moida e misturada com éter etileno glicol monometílico com uma relação entre os pesos de S0:20. Esse concentrado pode ser diluído tal como seja desejado com água para produzir suspensões para pulverização.

3Exemplos biológicos em plantas (A seguir ingrediente activo indica um dos sorafenes C a σ de acordo com o presente invento).

Exemplo 3.1: Acção contra Puccinia qraminis em trigo

a) Acção protectora residual ó dias após a sementeira, plantas de trigo são pulverizarias com um líquido para pulverizar (0,027 de ingrediente activo) preparada a partir de pó humidificáve1 do ingrediente activo. Após 24 horas, as plantas tratadas são infectadas com uma suspensão de uredosporos dos fungos. Após incubação durante 48 horas a 95-1007 de humidade atmosférica relativa e a cerca de

20'-C, as plantas infectadas são colocadas numa estufa a cerca de 22'~’C. 0 desenvolvimento de pústulas de ferrugem è avaliado 12 dias depois da infecção.

b) Acção sistémica dias depois da sementeira, um líquido para pulverizar (0,0027 de inqrediente ac tivo relativo ao volume de solo) preparado a partir de um pó humidificável do inqrediente activo, é vertido sobre as plantas de trigo. Após 43 horas, as plantas tratadas são infectadas com uma suspensão de uredosporos dos fungos. Após incubação durante 43 horas a 95-1007. de humidade atmosférica relativa e a cerca de 20°C, as plantas infectadas são colocadas numa estufa a cerca de 22^,;,C. 0 desenvolvimento de pústulas de ferrugem é avaliado 12 dias após a infecção.

Em ambas as experiências, a infestação por funqos foi inibida completamente pelo ingrediente activo.

Pelo contrário, as plantas de controlo infectadas, não tratadas revelaram 1007. de infestação cdui Puccinia.

Exemplo 5.2: Acção contra Phytophtora em tomateiros

a) Acção protectora residual

Após um período de crescimento de 3 semanas, os tomateiros foram pulverizados com um líquido para pulverizar (0,027 de inqrediente activo) preparado a partir de um pó humidificável do .ingrediente activo. Após 24 horas, as plantas tratadas foram infectadas com um suspensão de Sporanqia dos funqos. A infestação por funqos foi avaliada depois das plantas infectadas terem sido incubadas durante 5 dias a relativa e a 20^,:'C.

90-1007, de humidade atmosférica

b) Acção sistémica

Após um período de crescimento de 3 semanas, um líquido para pulverizar (0,0067. de ingrediente activo em relação ao volume do solo) preparado a partir de um pó humidificável do ingrediente activo, foi vertido para os tomateiros. Deve tomar-se a precaução do líquido para pulverizar não entrar em contacto com as partes da planta acima do solo, tratadas foram infectadas com uma.

Após 43 horas, as plantas suspensão de Sporanqia dos fungos. A infestação por fungos foi. avaliada depois das plantas infectadas terem sido incubadas durante humidade atmosférica relativa e a 20'^:'C.

dias a 90-1O07. de

Em ambas as experiências, não de observou qualquer infestação por fungas durante a avaliação, enquanto as plantas de controlo infectadas apresentaram uma infestação completa.

Exemplo 5.3: Acção contra Flasmopara vitícola em videiras Acção protectora residual

Pequenas plantas de videira no estádio de 4-5 folhas foram pulverizadas com um líquido para pulverizar (0,0067. de ingrediente activo) preparado a partir de um pó humidificável do ingrediente activo. Após 24 horas, as plantas tratadas são infectadas com uma suspensão de Sporanqia dos fungos. Depois das plantas terem sido incubadas durante 6 dias a 95-1007. de humidade atmosférica relativa e a 20^,:,C, é avaliada a infestação por fungos.

Ao contrário das plantas de controlo infectadas, não tratadas, em que a. infestação foi de 10Θ7., as plantas que tinham sido tratadas com o ingrediente activo I apresentavam-se infestação.

sem

Exemplo

3.4: Acção contra Cercospora Arachidicola em plantas_do amendoim ficção protectora residual

Plantas do amendoim com 10-15 cm de altura são pulverizadas com um líquido para pulverizar (0,006% de ingrediente activo) preparado a partir de um pó humidificável do ingrediente activo, e, 48 horas mais tarde, são infectadas com uma suspensão de Conidia dos fungos. As plantas infectadas são incubadas durante 72 horas a cerca de 21°C e sob uma humidade atmosférica elevada sendo então colocadas numa estufa até aparecerem as manchas típicas nas folhas. A acção fungicida é avaliada 12 dias após a infecção no que se refere ao número e tamanho de manchas que ocorrem.

As plantas que tinham sido tratadas com o ingrediente activo I apresentaram-se sem infestação. As plantas tratadas com sorafen A não apresentavam infestação no final da avaliação, mesmo com concentrações de pulverização de 0,0027.. Pelo contrário, plantas de controlo infectadas, não tratadas, revelaram infestação de 1007. com Cercospora.

Exemplo 3„5: Acção contra Venturia inaequalis em rebentos de macieira

Acção protectora residual

Pequenas plantas de macieira tendo rebentos recentes com 10-2O cm de comprimento são pulverizadas com um líquido para pulverizar (0,02% de ingrediente activo) preparado a partir de um pó humidif icável do ingrediente activa. Após 24- horas, as plantas tratadas são infectadas com uma suspensão de Conidia dos fungos. As plantas são então incubadas durante 5 dias a 90-100% de humidade atmosférica relativa e colocadas durante mais 10 dias éj~7 numa estufa a 20-24^c‘C. A infestação por sarna é avaliada 15 dias após a infecção.

As estacas apresentaram qualquer apresentaram-se tratadas com o ingrediente activo não infestação, mas as plantas de controlo completamente infestadas.

Exemplo 3.6: Acção contra Botrytis cinerea em macãs Acção protectora. residual

Maçãs lesadas artificialmente são tratadas aplicando gota a gota um líquido para pulverização (0,027 de ingrediente activo) preparado a partir de um pó humidificâvel dD ingrediente activo, aos pontos lesados. As frutas tratadas são então inoculadas com uma suspensão de esporos dos fungos e incubadas durante uma semana sob humidade atmosférica elevada e a cerca 20'^:'C. Na avaliação, os pontos lesados que apresentam sinais de apodrecimento sSo contados, e a acção fungicida da substância do teste é ca Ic.u lada a partir deles.

□ ingrediente activo inibiu completamente o crescimento dos fungos. As plantas de controlo não tratadas mas infectadas tinham, contudo, 1007. de infestação por Botrytis.

Exemplo 5.7: Acção contra Erysiphae qraminis em cevada

a) Acção protectora residual

Plantas de cevada com aproximadamente 8 cm de altura são pulverizadas com um líquido para pulverizar (0,0067 de ingrediente activo) preparado a partir de um pó humidificâvel do ingrediente activo. Após 3-4 horas, as plantas tratadas são polvilhadas com Conidia dos fungos. As plantas de cevada são

colocadas numa estufa a cerca de 22°C, e a infestação por fungos; é avaliada após 10 dias.

b) Acção sistémica

Um líquido para pulverizar (0,002% de ingrediente activo em relação ao volume do solo) preparado a partir de um pó humidificável do ingrediente activo, é vertido para plantas de cevada com aproximadamente 8 cm de altura. Tomou-se a precaução do líquido de pulverização não entrar em contacto com as partes da planta acima do solo. Após 43 horas, as plantas tratadas são empilhadas com Conidia dos fungos. As plantas da cevada infectadas são colocadas numa estufa a cerca de 22°C, e a infestação pelos fungos é avaliada após 10 dias.

Em ambas as experiências, as plantas não apresentavam infestação, in fec tadas.

e as plantas de controlo estavam completamente

Exemplo 3.8: Acção contra Rhizoctonia solani (fungos originados no solo em plantas de arroz)

Aplicação protectora ao local do solo

Um líquido para pulverizar (0,027. de ingrediente activo) preparado a partir de uma preparação do ingrediente activo, é vertido para plantas de arroz com 12 dias de idade sem contaminar as partes das plantas acima dc< solo. Para infectar as plantas tratadas, coloca-se uma suspensão de micélia e de esclerótica de R. solani na superfície do solo. Após incubação durante 6 dias a 27°C(dia) e 23^8 (noite) e a 1007. de humidade atmosférica relativa (câmara húmida) num gabinete de crescimento, avalia-se a infestação pelos fungos na bainha das folhas , folhas e caule.

Não ocorreu infestação após tratamento com o ingredien te activo, enquanto que as plantas de controlo apresentavam uminfestação completa por Rhizoctonia.

Claims

REIVINDICASSES iê„ - Processo parei a produção de compostos com a fórmula I em que o anel macrocíclicD ou é saturado ou, alternativamente, contem um dupla ligação na posição S, 9 ou na posição 9,19 ou ria posição 14,15 de acordo com a combinação de substituintes indicados mais abaixo e os substituintes R, a R,_, A, Β, X e Y estão

1 ύ' presentes nos significados combinados que se sequem:

Corap. Ri Rj Ri Rh R» A B X Y Dupla Ligação A OCHj CHj CHj H H CHj H H H Δ9.10 . B OH CHj CHj H H CH, H H H — C OH CHj CHj H H CHj H H H Δ9.10 D OH CHj CHj H H H H H H — E OCHj CHj CHj H H CHj H OH H — Γ OCHj CHj CHj H H CH, H H H — H OCHj CHj Η H H CHj H H OH Δ8.9 J OCHj H CHj H H CHj H H H — H OH CHj CHj H H CHj H OH H — N OH CHj CHj H H CHj H H OCHj Δ9.10 Q OCHj CHj CHj H H H H H H • — R OH CHj H H H H H H H s OH CHj H H H CHj H H H Δ9.10 τ' OH CHj H H H CHj H H H — u OCHj CHj CHj OH H CHj H H H Δ9.10 V OCHj CHj H H H CHj H H H Δ9.10 X OH CHj H H OH CHj H H H • Δ9.10 Y =0 CHj H H H CHj H OH H — z OCHj CHj H OH H CHj H H H . Δ9.10 B OCHj CHj CHj H H CHj H H ^H 1 Δ9.10 7 OH CHj CHj H H CHj H 9,10- -•poxi — 6 OH CHj CHj H H CHj H H H Δ9.10 ζ OH CHj CHj H H CHj OH . H H Δ9.10 n OH CHj CHj OH H CHj H H H Δ9.10 r OH CHj H H H CHj H H H Δ9.10 μ OCHj CHj H H H CHj H H OH — V OH CHj CHj H H CHj H OH H Δ14.15 ζ OH CHj H H H CHj H H H Δ9.10 o OCHj CHj CHj OH H CHj H H H Δ9.10 1 OH CHj H H H CHj H H . H Δ9.10 P OH CHj H H H CHj H OH H — 0 OCHj CHj CHj OH H CHj H H H Δ9,10

incluindo os seus estereoisómeros, caracterizado por se cultivar, em alternativa, uma estirpe

Soranq ium cellulosum So L_ t? 26 (NCIB 12411 ) , Sorangium ce11u1osum So ce 139 (DSM 5397 ) K Soranq i.um ce11u1osum Π Γ' — OU l“ & 170 ( DSM 4795) Soranq ium cellulosum So ce 191 (DSM 4796) Soranq ium ce11u1osum So ce 192 < DSM 4797) '1 Sorangium ce11u1osum Sc. ce 231 (DSM 5393) ou Soranq ium ce11u1osum So ce 021*7 “ ( DSM 5414)

ou uma cultura derivâvel dos anteriormente referidos, num meio nutriente apropriado, por meio de cultura aeróbica e, se desejado, se separarem subsequentemente os compostos com a fórmula I obtidos, com a condição da estirpe So ce 2ó (NCIB 12411) não ser usada para se obter os compostos IA e IB.

2â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender a cultura de uma das sete estirpes mencionads de Sorangium cellulosum num meio de cultura contendo pelo menos uma fonte de C e uma fonte de N, assimiláveis, em cada caso, e sais inorgânicos apropriados a 10-40*C na presença ou ausência de uma resina adsorvente, seguida de extracção do caldo de cultura ou da resina adsorvente separada por filtração com uma fase solvente apropriada, a concentração da solução obtida e a purificação do resíduo deixado, cromatografia e/ou recristalização.

na medida da desejado, por
3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a fermentação ser realizada a 10-35*C cdoi uma. das esti rpes:

So ce 170

So ce 191”

So ce 192 (DSM 4795) (DSM 4796) (DSM 4797).
4â. - Processo de acordo com a. reivindicação 1, caracterizado por o meio de cultura contenda as produtos resultantes do processo ser em seguida utilizado para fins aqroquímicos.
5â. - Processa para a obtenção de extractos brutos utilizáveis agroquimi camente , carac ter i z a.do por se proceder à extracção dos mesmos a partir do meio de cultura do processa de acordo com a reivindicação 1.
6ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar um composto macrocíclico com a fórmula I e os seus estereoisómeros sob uma forma pura, com a excepção das compostos IA e IB.
7ã. - Processo de acordo com a fórmula I, caracterizado por se obter o composto I(Y) e o composto I(ró), sob uma forma pura.

Sã. - Processo para.a preparação de um aqente para o combate e prevenção de doenças das plantas, caracterizado por se incluir no referido agente um produto com a. fórmula I, obtido de acordo com o processo da reivindicação 1, como ingrediente activo, com a excepção dos compostos IA e IB.
9®. - Método para o combate ou prevenção de doenças das plantas, caracterizado por se aplicarem os produtos obtidos durante o processo de acordo com a reivindicação 1, com a excepção dos compostos IA s IB, sendo a taxa de aplicação de substância activa de cerca de lõq até 2kg por hectare, de preferência de cerca de 5Θ até 500g por hectare..
10â. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizada par os produtos obtidos no processo serem os que tem a fórmula I ou os seus estereoisómeros.
11®. - Microorqanismo caracterizado por ser capaz de produzir um composto com a fórmula I, de acorda comi a reivindicação 1, com a excepção dos microorganismc· Sorangium(F'o 1 yanqium) cel 1 u 1 osum So ce 2ó (NCIB 12411) ou um mutante ou um recomtiinante deste último.
12®. - Cultura biologicamente pura seleccionada de entre:

Sorangium ce11u1osum So ce 139 (DSM 5397 ) Soranqium cel lulosum “ So γρ 170 (DSM 4795) Soranqium cellulosum So ce 191 (DSM 479Ó) Soranq ium cellulosum So ce 192“ ( DSM 4797 ) Soranq ium c e11u1osum So ce 231 (DSM 5393)

e Sorangium cellulosum So ce 242 (DSM 4794), caracterizada por ser capaz de produzir pelo menos um composto com a fórmula I, de acordo com a reivindicação 1.
13â. - Cultura derivável biologicamente de um dos; microorganismos de acordo com a. reivindicação 12, caracterizada por ser capaz de produzir um composta com a fórmula I.
14ê. - Cultura derivável biologicamente de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser capaz de produzir pelo menos dois compostos com a fórmula I, incluindo o composto A.