FI93014C - Sorafeeni, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö kasvitautien torjumiseksi - Google Patents

Description

9301 4

Sorafeeni, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö kasvitautien torjumiseksi Tämän keksinnön kohteena on kaavan I mukainen makrosykli-nen yhdiste, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö kasvitautien torjumiseksi sekä kasvimikrobisidiset aineet, jotka sisältävät tätä yhdistettä vaikuttavana aineena.

?R

/,ν/,ν/’Χ/π3 P i23 lo 8j ·“ ÖCHa y en 3 \ n y\ /2o / I» ! 1 :i ,/VY'W\, *'\/r k 5· Tässä kaavassa R merkitsee metyyliä, kun 9,10-asemassa on kaksoissidos (= yhdiste Ia), tai R merkitsee vetyä, kun 9,10-asemassa on yksinkertainen sidos (= yhdiste Ib).

Tässä ja seuraavassa yhdistettä Ia nimitetään myös "sorafeeni A:ksi" ja yhdistettä Ib "sorafeeni B:ksi". Kaava I käsittää periaatteessa myös isomeeriset rakenteet ja niiden keskinäiset seokset sekä yhdisteen Ia ja Ib mielivaltaisen seoksen. Parhaimpana pidetään sorafeeni A:ta.

Tämän rakenneluokan yhdisteet ovat uusia. Kirjallisuudessa ei ole mitään viitettä tällaisesta rakenteesta.

Kaavan I mukainen yhdiste valmistetaan viljelemällä mikrobiologisesti Sorangium (Polyanqium) cellulosum-kantaa "So : ce 26". Tämä kanta talletettiin 5. maaliskuuta 1987 lai tokseen "National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIB·)", Torrey Research Station, Aberdeen, Iso-Britannia, numerolla NCIB 12 411 Budapestin sopimuksen mu- 2 93014 kaisesti. Sorangium cellulosum kuuluu Myxobacteriales-lah-kon alalohkon Sorangineae heimoon Polyangiaceae.

Mikro-organismi "So ce 26" eristettiin 1980 vuohen lannan näytteestä, jota oli kerätty 1978 Djerbassa Tunisiassa. Itse "So ce 26" tai sen mutantit tai rekombinantit, jotka tuottavat samoin kaavan I mukaisia yhdisteitä, ovat myös tämän keksinnön kohteena. Mikro-organismia Sorangium "So ce 26" voidaan viljellä tavanomaisten biologisten menetelmien mukaisesti, esim. ravisteluviljelmissä tai fermento-reissa ravintoalustoilla. Fermentaatiolämpötila on yleensä 10° - 35°C ja edullisesti se on n. 30° - 32°C, pH-arvo on 6-8, etenkin 7,4. Prosessi tapahtuu aerobisesti ja steriileissä olosuhteissa.

Ravintoalustan koostumus voi vaihdella hyvin paljon. Olennaisesti assimiloitaville ravintoaineille on oltava käytettävissä hiili- ja typpilähde sekä epäorgaanisten alkuaineiden lähde, joihin kuuluvat P, S, Mg, K, Ca.

Fermentointiprosessissa käytetään C-lähteenä mieluummin glukoosia, tärkkelystä tai selluloosaa, tämän lisäksi myös glyserolia, etikkahappoa ja muita. N-lähteiksi soveltuvat NH4, NO3 tai myös peptonit. Orgaaninen yhdiste N-lähteenä ei voi olla samanaikaisesti ainoa C-lähde ja energialähde fermentoinnille.

Mineraalisuoloina tulevat kysymykseen alkuaineiden Na, K, NH4, Mg ja Ca kloridit, nitraatit, sulfaatit, karbonaatit ja fosfaatit, tämän lisäksi läsnä voi olla Fe, Cu, Mn, Zn, Co tai muita hivenaineina.

Mikro-organismi-viljelmää käytetään ravisteluviljelmään tai fermentoriin 0,1 - 7 % (v/v), etenkin 0,5 - 5 % (v/v). Reaktion kesto on n. 30°C:ssa suunnilleen 2-7 päivää, 3 93014 harvemmin 10 päivää. Suurempia eriä varten fermentoidaan tarkoituksenmukaisesti aluksi pienempiä esiviljelmiä.

"So ce 26":n käyttö on mahdollista myös immobilisoidussa muodossa, esim. kantoaineelle kiinnitettyjen solujen muodossa alginaatissa.

On selvää, että tämän keksinnön mukainen menetelmä ei rajoitu kannan "So ce 26" NCIB 12411 käyttöön, vaan siinä voidaan käyttää muita luonnollisia tai laboratoriossa tuotettuja keinotekoisia mutantteja tai rekombinantteja, jotka pystyvät tuottamaan kaavan I mukaista yhdistettä. Menetelmät mikro-organismin mutanttien ja rekombinanttien valmistamiseksi ovat alan ammattihenkilölle tunnettuja ja tuttuja.

Siten keksinnön kohteena on menetelmä kaavan I mukaisen makrosyklisen yhdisteen valmistamiseksi viljelemällä vesipitoisessa viljelyalustassa mikro-organismia Sorangium (Polyanqium) cellulosum "So ce 26" (NCIB 12 411) tai sen mutanttia tai rekombinanttia, joka pystyy samoin tuottamaan kaavan I mukaisia yhdisteitä. Ahtaammmassa mielessä menetelmä on tunnettu siitä, että viljellään mikro-organismia Sorangium (Polyangium) cellulosum "So ce 26" (NCIB 12 411) viljelyalustassa, joka sisältää vähintään yhden assimiloitumiskykyisen C-lähteen ja N-lähteen sekä vastaavia epäorgaanisia suoloja, 10° - 35°C:ssa adsorberihartsin läsnäollessa tai ilman sitä, sitten viljelyliemi tai vast, suodatettu adsorberihartsi uutetaan sopivalla liuotinfaa-silla, saatu liuos haihdutetaan ja jäljelle jäävä jäännös puhdistetaan haluttaessa kromatografoimalla ja/tai kiteyttämällä uudelleen.

4 93014

Kantaviljelmä ja morfologinen kuvaus:

Kantaviljelmät pidetään VY/2-agarilla (0,5 % leivinhiivaa tuorepainon mukaisesti, 0,1 % CaCl2:a, 1,5 % agaria, pH 7,2) tai suodatinpaperilla ST21-agarin päällä (0,1 % KN03:a, 0,1 % MgS04.7H20:ta, 0,1 % CaCl2:a, 0,1 % Κ2ΗΡ04:ä, 0,01 % MnS04.7H20:ta, 0,02 % FeCl3:a, 0,002 % hiivauutetta, vakiohivenaineliuosta, 1 % agaria). Maljoja inkuboidaan 30°C:ssa.

Suodatinpaperilla mineraalisuola-agarin päälle tai hiiva-agarilla (VY/2-agar) kanta muodostaa suuria joukkokolo-nioita, joissa on useita keltaisenoransseja - mustanruskeita itiöemiä. Nämä koostuvat pienistä sporangioleista, joiden läpimitta on 15 - 20 nm ja jotka ovat enemmän tai vähemmän suurina kasoina tiiviisti pakattuina. Kasat ovat useimmiten 50 - 150 ym läpimitaltaan. Vegetatiivisilla sauvabakteereilla on Sorangiumille tyypillinen muoto: suhteellisen tiiviit, vaihekontrastimikroskoopissa tummat, . sylinterimäiset sauvabakteerit, joissa on leveästi pyöris tyneet päät, joiden pituus on keksimäärin 3-6 ym ja joiden paksuus on n. 1 ym. Pitkähkön sopeutumisen jälkeen kasvuun nestealustassa kanta kasvaa homogeenisena solu-suspensiona .

Kannan "So ce 26" (NCIB 12 411) biologinen karakterisointi glukoosi-hajotus: positiivinen selluloosa-hajotus: positiivinen tärkkelys-hajotus: positiivinen NH4 N-lähteenä: positiivinen V N03 N-lähteenä: positiivinen

Kanta So ce 26 tuottaa kaksi kemiallisesti läheistä yhdistettä Ia ja Ib, jotka estävät useiden sienien kasvun. Nämä

Il .

5 93014 makrosykliset yhdisteet voidaan eristää sekä soluista että vi1jelysupernatantista.

Vesipitoisesta fermentaatioliemestä yhdiste I voidaan uuttaa lipofiilisesti orgaanisilla liuottimilla, esim. keto-neilla, kuten metyylietyyliketonilla, sykloheksanonilla, keskinkertaisen ketjupituuden omaavilla alkoholeilla, kuten isobutanolilla, pentanolilla, heksanolilla, etikkahap-po-Ci-Cg-alkyyliestereillä (etyyliasetaatti, propyyliase-taatti, butyyliasetaatti, isobutyyliasetaatti jne.), hiilivedyillä tai klooratuilla hiilivedyillä, kuten heksaa-nilla, tolueenilla, dikloorimetaanilla, 1,2-dikloorietaa-nilla, klooribentseenillä, diklooribentseenillä jne.

Suodatetusta solukakusta yhdiste I voidaan uuttaa helposti alkoholeilla tai ketoneilla (esim. metanoli, etanoli, asetoni, metyylietyyliketoni).

Kulloinkin kyseessä olevasta uutteesta voidaan ottaa sitten talteen haihduttamalla ja/tai seostamalla kaavan I mukainen yhdiste, joka voidaan erottaa jakokiteytyksen tai muiden erotusmenetelmien avulla (esim. pylväskromatogra-fia) molemmiksi komponenteiksi Ia ja Ib.

Fermentaatio kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi suoritetaan edullisesti adsorberihartsin läsnäollessa, josta haluttu tuote otetaan talteen. Adsorberihartsina tulevat kysymykseen ennen kaikkea neutraalit orgaaniset po-lymeeriaineet, etenkin ei-ioniset hydrofobiset adsorberi-hartsit, jotka soveltuvat lipofiiliseen uuttamiseen. Näihin sidotaan kaavan I mukainen yhdiste lähes kvantitatiivisesti. Esimerkkeinä tällaisista hartseista mainittakoon puolipolaariset akryyliesteri-hartsit, ei-polaariset poly-styreeni/divinyylibentseeni-hartsit ja etenkin verkkopoly-styreeni. Tällaisia hartseja lisätään 0,1 - 5 % (v/v) fer- s 93014 mentaatiotilavuudesta, etenkin 0,5 - 2 % (v/v). Myös aktiivihiiltä voidaan käyttää.

Teknisesti erittäin edullinen muunnelma kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi perustuu siihen, että fermentoi-daan "So ce 26" (NCIB 12 411) edellä esitetyissä olosuhteissa polystyreenihartsin (esim. XAD-1180, Rohm and Haas) läsnäollessa, joka esiintyy edullisesti suodatettavassa muodossa (rakeita tai granulaatteja). Fermentaation loputtua hartsi suodatetaan pois, pestään vedellä ja käsitellään metanolilla tai etanolilla. Alkoholinen uute haihdutetaan, dietyylieetterin lisäyksen avulla kiteytyvä yhdiste Ia (= sorafeeni A) suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan yhdisteen Ib (= sorafeeni B) talteenottamiseksi ja haluttaessa puhdistetaan kromatografisesti.

Keksinnön kohteena on kaavan I mukainen yhdiste puhtaassa muodossa tai vast, kiteytetyssä muodossa. Keksinnön kohteena ovat kuitenkin myös fermentaatiosta peräisin olevat . biomassat, raakauutteet tai adsorberihartsit, jotka sisäl tävät kaavan I mukaiset yhdisteen ja joita voidaan käyttää sellaisenaan tai edelleenmuokatussa muodossa kasvitautien torjumiseksi. Biomassat voidaan käyttää edelleen tai saattaa myyntiin jauhettuina tai puristettuina kuiva-aineina ("cake").

Esitetyt valmistusmenetelmät, mukaanlukien kaikki osavaiheet ovat tämän keksinnön kohteena.

yllättäen on nyt todettu, että kaavan I mukaisilla yhdisteillä on käytännön tarpeisiin erittäin edullinen biosidi-nen kirjo fytopatogeenisia mikro-organismeja, etenkin sieniä vastaan. Niillä on erittäin edullisia kuratiivisia, systeemisiä ja etenkin ennaltaehkäiseviä ominaisuuksia ja niitä käytetään erilaisten viljelykasvien suojaamiseksi.

Il , 7 93014

Kaavan I mukaisilla vaikuttavilla aineilla voidaan erilaisten hyötyviljelyjen kasveissa tai kasvinosissa (hedelmät, kukat, lehdet, varret, mukulat, juuret) ehkäistä tai hävittää esiintyvät tuholaiset, jolloin myös myöhemmin kasvavat kasvinosat säästyvät fytopatogeenisilta mikro-organismeilta .

Mikrobisideinä kaavan I mukaiset vaikuttavat aineet tehoavat esim. seuraaviin luokkiin kuuluvia fytopatogeenisia sieniä vastaan: Fungi imperfecti (esim. etenkin Botrytis, edelleen Pyricularia, Helminthosporium, Fusarium, Sektoria, Cercospora ja Alternaria), Basidiomycetes (esim. Rhi-zoctania, Hemileia, Puccinia). Tämän lisäksi ne tehoavat luokkia Ascomycetes (esim. etenkin Venturis ja Erysiphe, edelleen Podosphaera, Monilinia, Uncinula), ja Oomycetes (esim. Phytophora, Plasmospora) vastaan. Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää edelleen peittausaineena siementen (hedelmien, mukuloiden, jyvien) tai kasvipistokkai-den käsittelemiseksi niiden suojaamiseksi sieni-infektioilta sekä maassa esiintyviltä fytopatogeenisilta sieni Itä.

Keksinnön kohteena ovat myös aineet, jotka sisältävät vaikuttavan aineen komponenttina kaavan I mukaisia yhdisteitä, etenkin kasveja suojaavat aineet, sekä niiden • käyttö agraarisektorilla tai läheisillä aloilla.

Samoin keksinnön kohteena on myös menetelmä kasvien käsittelemiseksi, jolle menetelmälle on ominaista, että levitetään uusia kaavan I mukaisia yhdisteitä tai vast, näitä sisältäviä uusia aineita.

Tässä julkaistun kasveja suojaavan käytön kohdeviljelminä tulevat tämän keksinnön puitteissa kysymykseen esim. seu-raavat kasvilajit: vilja (vehnä, ohra, ruis, kaura, riisi, β 9301 4 maissi, durra ja vastaavat), juurikkaat (sokeri- ja rehujuurikkaat), sydän-, kivi- ja marjahedelmät (omenat, päärynät, luumut, persikat, mantelit, kirsikat, mansikka, vadelma ja karhunvatukka), palkokasvit (pavut, linssit, herneet, soija), öljykasvit (rapsi, sinappi, unikko, oliivi, auringonkukka, kookos, risiini, kaakao, maapähkinät), kurkkukasvit (kurpitsa, kurkut, melonit), kuitukasvit (puuvilla, pellava, hamppu, juutti), sitrushedelmät (appelsiinit, sitruunat, greipit, mandariinit), vihannekset (pinaatti, keräsalaatti, parsa, kaalilajit, porkkana, sipuli, tomaatti, peruna, paprika), laakerikasvit (avokado, kaneli, kamferi) tai sellaiset kasvit kuin tupakka, pähkinät, kahvi, ananas, sokeriruoko, tee, pippuri, viiniköynnökset, humala, banaani- ja luonnonkautsukasvit sekä koristekasvit (Compositeae). Tämä luettelo ei ole kuitenkaan mitenkään rajoittava.

Kaavan I mukaisia vaikuttavia aineita käytetään tavanomaisesti koostumusten muodossa ja niitä voidaan levittää samanaikaisesti tai peräkkäin muiden vaikuttavien aineiden kanssa käsiteltävälle pinnalle tai kasville. Nämä muut vaikuttavat aineet voivat olla sekä lannoitusaineita, hivenaineita välittäviä aineita tai muita kasvin kasvuun vaikuttavia aineita. Ne voivat olla kuitenkin myös selektiivisiä herbisidejä, insektisidejä, fungisidejä, bakterisidejä, nematisidejä, molluskisidejä tai usean tällaisen valmisteen seoksia, yhdessä mahdollisesti muiden valmistustekniikassa tavanomaisten kantoaineiden, tensi-dien tai muiden levitystä helpottavien lisäaineiden kanssa .

Sopivat kantoaineet ja lisäaineet voivat olla kiinteitä tai nestemäisiä ja ne vastaavat valmistustekniikassa tarkoituksenmukaisia aineita kuten esim. luonnollisia tai re-

Il : 9 93014 generoituja mineraaliaineita, liuottimia, dispergointi-, kostutus-, kiinnitys-, sakeutusaineita, sideaineita tai lannoitusaineita.

Eräs edullinen menetelmä keksinnön mukaisen vaikuttavan aineen tai vähintään yhtä tällaista vaikuttavaa ainetta sisältävän agrokemiallisen aineen levittämiseksi on sen levittäminen lehdistöön (lehtilevitys). Levitysten määrä ja käyttömäärä riippuvat tällöin vastaavan patogeenin (sienilajin) tautipaineesta. Keksinnön mukaiset vaikuttavat aineet voivat myös tunkeutua kasviin juurien läpi maaperän kautta (systeeminen vaikutus) siten, että kasvin kasvupaikka kostutetaan nestemäisellä valmisteella tai aineet levitetään kiinteässä muodossa maaperään, esim. gra-nulaatin muodossa (maalevitys). Tämä granulaatti tai vastaava jauhe voi olla fermentorista saatavan biomassan kui-vamassaa tai fermentaatioliemestä suodatettua ja kaavan I mukaisia vaikuttavia aineita sisältävää adsorberihartsia. Kaavan I mukaiset yhdisteet voidaan levittää myös siemeniin (coating) siten, että siemenet kostutetaan vaikuttavan aineen nestemäisessä valmisteessa tai ne päällystetään kiinteällä valmisteella.

Keksinnön mukaisia yhdisteitä käytetään tällöin muuttamattomassa muodossa tai mieluummin yhdessä valmistustekniikassa tavanomaisten apuaineiden kanssa. Tätä varten ne käsitellään tarkoituksenmukaisesti tunnetulla tavalla esim. emulsiokonsentraateiksi, siveltäviksi tahnoiksi, suoraan suihkutettaviksi tai laimennettaviksi liuoksiksi, laimennetuiksi emulsioiksi, ruiskutus jauheiksi, liukeneviksi jauheiksi, pölytysaineiksi, granulaateiksi, kapseloimalla esim. polymeerisiin aineisiin. Käyttömenetelmät, kuten suihkutus, sumutus, pölytys, levitys, sively tai kastelu sekä aineiden laatu valitaan pyrittyjen päämäärien ja olemassa olevien olosuhteiden mukaisesti. Sopivat käyttömää- « 93014 rät ovat yleensä 10 g - 2 kg aktiivista ainetta (AA)/ha, mieluummin 50 g - 500 g AA/ha.

Valmistusmuodot, s.o. kaavan I mukaista vaikuttavaa ainetta ja mahdollisesti kiinteää tai nestemäistä lisäainetta sisältävät aineet valmistetaan tunnetulla tavalla.

Liuottimina tulevat kysymykseen: aromaattiset ja alifaat-tiset hiilivedyt, kuten esim. ksyleeniseokset, syklohek-saani tai parafiinit, alkoholit ja glykolit sekä niiden eetterit ja esterit, kuten etanoli, eteeniglykoli, eteeni-glykolimonometyyli- tai -etyylieetteri, etikkahappoeste-rit, ketonit, kuten sykloheksanoni, vahvasti polaariset liuottimet, kuten N-metyyli-2-pyrrolidoni, dimetyylisul-foksidi tai dimetyyliformamidi, sekä mahdollisesti epoksi-doidut kasviöljyt, kuten epoksidoitu kookospähkinöljy tai soijaöljy, tai vesi.

Kiinteinä kantoaineina, joita käytetään esim. pölytysai-neissa ja dispergoitavissa jauheissa, käytetään yleensä luonnollisia kivijauhoja, kuten kalsiittia, talkkia, kaoliinia, montmorilloniittia tai attapulgiittia. Fysikaalisten ominaisuuksien parantamiseksi voidaan myös lisätä kor-keadisperssiä piihappoa tai korkeadisperssejä imukykyisiä polymeraatteja. Rakeisina adsorboivina granulaatin kanto-. aineina tulevat kysymykseen huokoiset tyypit, esimerkiksi hohkakivi, murskattu tiili, sepioliitti tai bentoniitti, ei-sorptiivisina kantoaineina esim. kalsiitti tai hiekka. Tämän lisäksi voidaan käyttää useita epäorgaanisia esi-granuloituja aineita, kuten etenkin dolomiittia tai jauhettuja kasvintähteitä.

Pinta-aktiivisina yhdisteinä tulevat kysymykseen riippuen valmistettavan kaavan I mukaisen vaikuttavan aineen laadusta ei-ionogeeniset, kationi- ja/tai anioniaktiiviset n U 9301 4 tensidit, joilla on hyvät emulgointi-, dispergointi- ja kostutusominaisuudet. Tensideillä tarkoitetaan myös tensi-dien seoksia.

Sopivia anionisia tensidejä voivat olla sekä nk. vesiliukoiset saippuat että vesiliuokoiset synteettiset pinta-aktiiviset yhdisteet.

Useimmiten käytetään kuitenkin nk. synteettisiä tensidejä, etenkin alkaanisulfonaatteja, rasva-alkoholisulfaatteja, sulfonoituja bentsimidatsoli-johdannaisia tai alkyylisul-fonaatteja.

Ei-ionisina tensideinä tulevat kysymykseen alifaattisten tai sykloalifaattisten alkoholien, tyydyttyneiden tai tyydy ttymättömi en rasvahappojen ja alkyylifenolien polyglyko-lieetterijohdannaiset, jotka sisältävät 3-30 glykoli-eetteri -ryhmää ja 8 - 20 hiiliatomia (alifaattisessa) hiilivetytähteessä ja 6 - 18 hiiliatomia alkyylifenolien alkyylitähteessä.

Muina ei-ionisten tensidien esimerkkeinä mainittakoon no-nyylifenolipolyetoksietanolit, risiiniöljypolyglykolieet-terit, polypropyleeni-polyetyleenioksidiadditiotuotteet, tributyylifenoksipolyetyleenietanoli, polyetyleeniglykoli ja oktyylifenoksipolyetoksietanoli.

Edelleen tulevat kysymykseen myös polyoksietyleenisorbi-taanin rasvahappoesterit, kuten polyoksietyleenisorbitaa-ni-trioleaatti.

Alan ammattihenkilölle ovat tunnettuja myös muut valmistustekniikassa tavanomaiset tensidit tai ne voidaan saada asiaan kuuluvasta ammattikirjallisuudesta.

12 9301 4

Agrokemialliset valmisteet sisältävät yleensä 0,1 - 95 % kaavan I mukaista vaikuttavaa ainetta, 99,9 - 5 % kiinteää tai nestemäistä lisäainetta ja 0 - 25 % tensidiä.

Kauppatavarana käytetään mieluummin konsentroituja aineita, kun taas loppukuluttaja käyttää yleensä laimennettuja aineita.

Aineet voivat sisältää myös muita lisäaineita, kuten stabilointiaineita, vaahdonestoaineita, viskositeetin säätö-aineita, sideaineita, kiinnitysaineita ja lannoitteita tai muita vaikuttavia aineita erityisen vaikutuksen aikaansaamiseksi .

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä rajoittamatta sitä kuitenkaan millään tavoin (prosentit ja osat koskevat painoa, lämpötilat on esitetty celsius-asteina).

Valmistusesimerkkejä

Esimerkki H-l; Kaavan I mukaisen yhdisteen valmistus 70 litran fermentori (Giovanola, Monthey, Sveitsi) täytetään 60 1:11a kasvualustaa (0,1 % peptonia, 0,5 % glukoosia, 0,05 % CaCl2 · 2H20:ta , 0,05 % MgSC>4.71^0: ta, pH 7,4). Ympätään 10 1:11a samassa kasvualustassa ravistelukolvissa kasvatettua esiviljelmää (160 rpm, 30°C). Sitten fermen-toidaan 32°C:ssa 500 rpm:n sekoitusnopeudella ja 0,5 Nm^jn ilmastuksella tuntia kohden. Fermentaatio kestää n. 7 päivää. Kaavan I mukainen yhdiste tuotetaan logaritmisen -stationaarisen kasvuvaiheen kuluessa. Se rikastuu osittain soluihin, osittain viljelysupernatanttiin.

Fermentaatiolientä ravistellaan sitten 5 kertaa kulloinkin 2 litran kanssa etyyliasetaattia kulloinkin 5 minuutin li .

13 9301 4 ajan. Yhdistetyt uutteet pestään kaksi kertaa vedellä ja haihdutetaan tyhjössä. Jäljelle jäävä tumma öljy kroma-tografoidaan piihappogeelin läpi (Lichroprep Si60, Merck, 25 - 40 ym. Ajoaine: dikloorimetaani/asetoni vaiheissa 97/3 - 80/20).

Yhdisteen Ia (= sorafeeni A) sisältävät fraktiot haihdutetaan uudelleen ja kromatografoidaan toisen kerran piihappogeelin läpi (Lichroprep Si60, Merck, 15 - 25 ym. Ajoaine: dikloorimetaani/asetoni 97/3). Näin saatu sorafeeni A kiteytyy dietyylieetteristä. Saanto: 220 mg.

Yhdisteen Ib (= sorafeeni B) sisältävät fraktiot haihdutetaan uudelleen ja kromatografoidaan saman piihappogeeli-tyypin läpi (15 - 25 ym) dikloorimetaani/asetonilla (gra-dientti: 90/10 - 85/15). Hienopuhdistus tapahtuu kolmannen kromatografiän avulla verkkoutetussa dekstraani-geelissä, kuten esim. Sephadex LH-20:ssä (Pharmacia) metanolilla. Saanto: 100 mg.

• I

‘ Esimerkki H-2: Kaavan I mukaisen yhdisteen valmistus ad sorber i harts in läsnäollessa

Menetelmä suoritetaan 300 litran fermentaatiomäärässä lisäämällä 0,5 % (v/v) adsorberihartsia XAD-1180 (Rohm ja Haas). Tämän suurennetun erän menetelmäolosuhteet vastaavat muutoin esimerkin H-l olosuhteita.

Fermentaation loputtua polymeerikantoaine seulotaan pois, huuhdotaan lasipylvääseen, pestään 3 pylvästilavuudella vettä ja eluoidaan 2 pylvästilavuudella metanolia. Eluaat-ti haihdutetaan kuiviin tyhjössä ja kromatografoidaan piihappogeelissä (Lichroprep Si60, 25 - 40 pm, Merck, ajo-aine: dikloorimetaani/asetoni 97/3 - 80/20).

14 9301 4 a) Sorafeeni A:n sisältävä fraktio haihdutetaan ja kroma-tografoidaan piihappogeelissä (Lichoprep Si60, 15 - 25 ym, Merck. Ajoaine: dikloorimetaani/asetoni 97/3).

Valinnaisesti polymeerikantoaineen metanoli-käsittelyn jälkeen metanolinen liuos voidaan haihduttaa varovasti ilman kromatografiaa, jolloin haluttu sorafeeni A kiteytyy dietyylieetterin lisäyksen jälkeen.

Tuote voidaan kiteyttää uudelleen dietyylieetteristä. Saanto: 1 g sorafeenia A.

b) Sorafeeni B:n sisältävä fraktio kromatografoidaan uudelleen piihappogeelissä (Lichroprep Si60, 15 - 25 ym, Merck, ajoainegradientti: dikloorimetaani/asetoni 90/10 -85/15). Hienopuhdistus tapahtuu kromatografoimalla Sepha-dex Ifl-20:ssä (Pharmacia, ajoaine: metanoli), saanto: 0,6 g·

Sorafeeni A:n (= yhd. Ia) kemiallinen karakterisointi Summakaava: C29H44O8. Mg: 520.

Värittömiä kiteitä dietyylieetteristä, sp. 101°C.

[a]25D = -131° (MeOH, c = 1) UV (MeOH) λmax <lo9ε > = 317 sh (2,03); 267 sh (2,47); 2,63 (2,59); 2,57 (2,68); 251 (2,66); 245 sh (2,66); 228 sh (2,84); 215 (3,72); 207 (3,94) IR (KBr): 975, 992, 1021, 1045, 1071, 1102, 1152, 1187, 1230, 1255, 1272, 1380, 1451, 1708 (sh), 1729, 2854 (sh), 2923 cm"1.

MS FAB (neg. ioneja) = 519 (M-H)-: EI (70ev) = 520

Suuri resoluutio: lask.: 520,3036 saatu: 520,3020 DC (DC-Alufolio 6OF254, Merck, ajoaine: dikloorimetaani/- 15 93014 asetoni 90/10) Rp = 0,5 (ilmaisu suihkuttamalla anisalde-hydi/rikkihappo-reagenssilla ja kuumentamalla 120°C:seen) HPLC (pylväs: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^g, Macherey Nagel, virtaus 1,5 ml/min., ajoaine: metanoli/vesi 70/30 20 minuutissa lineaarisesti arvoon 100/0) = 11,8 min.

Sorafeeni B:n (= yhd. Ib) kemiallinen karakterisointi

Summakaava: C28H44°8* Mg: 508.

[a]25d . -57° (MeOH, c = 1) UV (MeOH) (log ε) = 26 3 sh (2,98); 256 sh (3,11); 247 sh (3,36); 238 (3,42); 215 sh (3,77); 207 (3,98) IR (KBr): 713, 973, 994, 1050 (sh), 1071 (sh), 1098, 1154, 1183, 1232 (sh), 1274, 1378, 1459, 1723, 2933, 2952, 3377, 3413, 3451 cm'1.

MS (FAB) (neg. ioneja) =508 (M-H)- DC (DC-Alufolio 6OF254, Merck, ajoaine: dikloorimetaani/-asetoni 90/10) Rp = 0,3 (ilmaisu suihkuttamalla anisalde-hydi/rikkihappo-reagenssilla ja kuumentamalla 120°C:seen) HPLC (pylväs: 4 x 25 0 mm Nucleosil 100-7 C]_g, Macherey Nagel, virtaus 1,5 ml/min., ajoaine metanoli/vesi 70/30 20 minuutissa lineaarisesti arvoon 100/0) R^ = 9,0 min.

Molempien yhdisteiden NMR-arvot ovat seuraavat.

16 9301 4

Taulukko 1 lH-NMR-arvot (CDCI3, δ , ppm)

SORAPHEN A_B

2 3,14 3,08 3 4 3,18 3,12 5 4,04 4,04 6 1,94 1,82 7 3,83 3,92 8 2,51 1,88 9 6,19 10 5,48 1,80/1,402) 11 3,69 3,793) 12 3,43 3,353) 13A/B 1,69/1,26 1,59/1,352) 14A/B 1,37/1,17 15A/B 1,48 16A/B 1,69/2,10 17 5,86 5,72 18 1,12 1,10 19 3,38 3,41 20 1,05 1,01 21 1,03 0,84 22 3,29 23 3,44 3,36 Γ - 2' /6' : 3'/5' 7,27-7,38 7,25-7,36 4' 3-OH 4,43 4,68 5-OH 3,56 1) : multipietit 1,25 - 1,8 ppm 2) , 3): järjestys kulloinkin vaihdettavissa

II

17 9301 4

Taulukko 2 13C-NMR-arvot (CDCI3, δ , ppm)

SORAPHEN A_B

1 170,8 171,6 2 46,3 45,7 3 99,5 99,5 4 76,3 76,4 5 68,9 69,3^ 6 35,6 35,1 7 42,4 71,3 8 35,3 32,5 9 139,6 27,92> 10 122,8 27,32)

11 85,0 68,91J

12 82,8 69,3° 13 30,4 25,42) 14 23,3 24,72) 15 25,7 22,82) 16 35,7 34,6 17 74,4 75,7 18 11,5 11,6 19 57,2 57,43) 20 10,2 10,2 21 12,4 14,1 22 56,1 23 58,0 57,23) 1' 141,1 140,7 .: 2’ ;6' 126,2 126,4 3’;5' 128,5 128,4 4’ 128,0 128,0 1); 2); 3): järjestys kulloinkin vaihdettavissa . Röntgenrakenneanalyysin ja edellä selvitettyjen arvojen perusteella sorafeeni As lie (= yhdiste Ia) ja sorafeeni Bslle (= yhdiste Ib) oletetaan seuraavat avaruusrakenteet Ia' ja Ib' : « « ia 9301 4 2 2 gcHi /\ /\ /\ /"· I i>CH 3 I 20 V *3 ✓ \ ,013 i « ? ! ./\/'Y'\4/ I II ! 6chj Y / e">

HO

• · · XHj / \/ \/ \/ I Ach3 ! \ n n' \/CH3 i f I i (lb·) /VV\4V'S°“ I II I 6ch3 \ /

Keksintö käsittää etenkin myös yhdisteet Ia' ja Ib', niiden valmistuksen ja niiden käytön kasvimikrobisideinä.

Yhdisteiden Ia ja Ib vaikutuskirjo levydiffuusiotestissä

Yhdisteiden konsentraatio on 1 yg/testilehtinen, agarmäärä 10 ml/levy (petrimaljät, läpimitta 9 cm). Yhdisteelle Ia ja Ib selvitettiin samat arvot.

ff, 19 9301 4

Testiorganismi Estoalueenläpimitta [mm]

Debaryomyces hansenii 29

Candida albicans 25

Hansenula anomala 15

Nadsonia fulvescens

Nematospora coryli 35

Rhodotorula qlutinia 21

Saccaromyces cerevisiae 20

Schi2osaccharomyces pombe Torulopsis glabrata

Alternaria solani 27

Botrytis cinerea 30

Mucor hiemalis 30

Pythium debaryanum 45

Rhizopus arrhizus 10

Myös minimiestokonsentraatio MIC tuottaa molempien yhdisteiden Ia ja Ib kohdalla samat arvot.

Minimiestokonsentraatiot

Organismi_MNK/yq/ml

Nematospora coryli 0,05

Candida albicans 0,06

Rhodotorula glutinis 1,0

Saccharomyces cerevisiae 2,0

Torulopsis glabrata 3,0

Nadsonia fulvescens 3,0

Mucor hiemalis 0,03 ’·' Estovaikutus Candidan suhteen on vielä reversiibeli 24-tuntisen vaikutuksen jälkeen. Nematospora corylin lisääntyminen lakkaa 90 minuutin kuluttua yhdisteen I lisäyksen jälkeen. Samanaikaisesti säädetään DNS- ja proteiinisynteesi .

20 9301 4

Seerumisitoutuminen: Naudan seerumilla ei ole mitään vaikutusta yhdisteen I tehokkuuteen.

2. Kaavan I mukaisen vaikuttavan aineen valmiste-esimerkkejä (% = painoprosentti) 2.1 Emulsiokonsentraatit a) b) c) vaikuttavaa ainetta 25% 40% 50%

Ca-dodekyylibentseenisulfonaattia 5% 8% 6% risiiniöljy-polyeteeniglykolieetteriä (36 moolia etyleenioksidia) 5% tributyylifenoyyli-polyeteeniglykoli- eetteriä (30 moolia etyleenioksidia) - 12% 4% sykloheksanonia - 15% 20% ksyleeniseosta 65% 25% 20% Tällaisista konsentraateista voidaan valmistaa laimentamalla vedellä halutun konsentraation omaavia emulsioita.

2.2 Liuokset a) b) c) d) vaikuttavaa ainetta 80% 10% 5% 95% eteeniglykoli-monometyyli-eetteriä 20% - - polyeteeniglykoli MG 400 - 70% : N-metyyli-2-pyrrolidonia - 20% epoksidoitua kookospähkinäöljyä - - 1% 5% bentsiiniä (kiehumisrajät 160-190°C) - - 94% (MG = molekyylipaino)

Liuokset voidaan käyttää erittäin hienojen pisaroiden muo- v dossa.

» K .

21 9301 4 2.3 Granulaatit a) b) vaikuttavaa ainetta 5% 10% kaoliinia 94% korkeadisperssiä piihappoa 1% attapulgiittia - 90%

Vaikuttava aine liuotetaan metyleenikloridiin, suihkutetaan kantoaineen päälle ja liuotin haihdutetaan tämän jälkeen tyhjössä.

2.4 Pölytysaineet a) b) vaikuttavaa ainetta 2% 5% korkeadisperssiä piihappoa 1% 5% talkkia 97% kaoliinia - 90%

Sekoittamalla tehokkaasti kantoaineet vaikuttavan aineen kanssa saadaan käyttövalmiita pölytysaineita. Nämä voidaan jauhaa lisäämällä lisää näitä kolmea kantoainetta käyttövalmiiksi pölytteiksi, joiden vaikuttavan aineen pitoisuus on 0,001 %.

2.5 Ruiskutus jauheet a) b) c) vaikuttavaa ainetta 25% 50% 75%

Na-ligniinisulfonaattia 5% 5%

Na-lauryylisulfaattia 3% - 5%

Na-di-isobutyylinaftaliinisulfonaattia - 6% 10% oktyylifenolipolyeteeniglykolieetteriä - 2% - (7-8 moolia etyleenioksidia) korkeadisperssiä piihappoa 5% 10% 10% kaoliinia 62% 27% 22 9301 4

Vaikuttava aine sekoitetaan hyvin lisäaineiden kanssa ja jauhetaan sopivassa myllyssä. Saadaan ruiskutus jauhe, joka voidaan laimentaa vedellä halutun konsentraation omaaviksi suspensioiksi.

2.6 Päällystetty granulaatti vaikuttavaa ainetta 3 % polyeteeniglykolia (MG 200) 3 % kaoliinia 94 % (MG = molekyylipaino)

Hienoksi jauhettu vaikuttava aine levitetään tasaisesti sekoittimessa polyeteeniglykolilla kostutetun kaoliinin päälle. Tällä tavalla saadaan pölyttömiä päällystettyjä granulaatteja.

2.7 Suspensiokonsentraatti vaikuttavaa ainetta 40 % etyleeniglykolia 10 % nonyylifenolipolyeteeniglykolia (15 moolia etyleenioksidia) 6 %

Na-ligniinisulfonaattia 10 % karboksimetyyliselluloosaa 1 % 37%:ista formaldehydin vesiliuosta 0,2 % silikoniöljyä 75%:isen vesiemulsion muodossa 0,8 % vettä 32 %

Hienoksi jauhettu aktiivinen aine sekoitetaan perusteellisesti lisäaineiden kanssa. Näin saadaan suspensiokonsentraatti, josta voidaan valmistaa halutun konsentraation omaavia suspensioita laimentamalla vedellä.

li 23 *3ϋ14 2.8 Biomassakonsentraatti

Valmistusviljelystä saatava biomassa kuivatetaan, jauhetaan ja sekoitetaan etyleeniglykoli-monometyylieetterin kanssa painosuhteessa 80:20. Tällainen konsentraatti voidaan laimentaa mielivaltaisesti vedellä suihkutussuspen-sioiksi.

3. Biologiset esimerkit (Seuraavassa "vaikuttava aine" tarkoittaa ilman lisämai-nintaa sekä "sorafeeni A:ta" että "sorafeeni B:tä")

Esimerkki 3.1: Vaikutus Puccinia graminista vastaan vehnässä a) Jäännössuojavaikutus

Vehnäntaimet ruiskutettiin 6 päivän kuluttua kylvämisestä vaikuttavan aineen ruiskutusjauheesta valmistetulla ruis-kutusliemellä (0,02 % aktiivista ainetta). 24 tunnin ku-·. luttua käsitellyt kasvit infektoitiin sienen uredospori- suspensiolla. Inkuboitiin 48 tunnin ajan 95 - 100 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa ja n. 20°C:ssa, minkä jälkeen infektoidut taimet sijoitettiin kasvihuoneeseen n. 22°C:ssa. Ruostepilkkujen arviointi suoritettiin 12 päivän kuluttua infektoinnista.

b) Systeeminen vaikutus

Vehnäntaimille kaadettiin 5 päivän kuluttua kylvöstä vaikuttavan aineen ruiskutusjauheesta valmistettua ruisku-tuslientä (0,002 % aktiivista ainetta maa-alan suhteen).

48 tunnin kuluttua käsitellyt taimet infektoitiin sienen uredosporisuspensiolla. Inkuboitiin 48 tunnin ajan 95 -100 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa ja n. 20°C:ssa, minkä jälkeen infektoidut taimet sijoitettiin kasvihuoneeseen n. 22°C:ssa. Ruostetäplien arviointi suoritettiin 12 päivän kuluttua infektoinnista.

24 9301 4

Sienitauti estettiin molemmissa kokeissa täysin vaikuttavalla aineella.

Käsittelemättömissä, mutta infektoiduissa kontrollitaimis-sa oli sitä vastoin 100%:inen Puccinia-tauti.

Esimerkki 3.2: Vaikutus Phytophthoraa vastaan tomaatintai-Iftissa a) Jäännössuojavaikutus 3 viikon kasvatuksen jälkeen tomaatintaimet ruiskutettiin vaikuttavan aineen ruiskutusjauheesta valmistetulla ruis-kutusliemellä (0,02 % aktiivista ainetta). 24 tunnin kuluttua käsitellyt taimet käsiteltiin sienen sporangiosus-pensiolla. Sienitaudin arviointi tapahtui sen jälkeen, kun taimia oli inkuboitu 5 päivän ajan 90 - 100 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa ja 20°C:ssa.

b) Systeeminen vaikutus

Tomaatintaimille kaadettiin 3-viikkoisen kasvatuksen jälkeen vaikuttavan aineen ruiskutusjauheesta valmistettua ruiskutuslientä (0,006 % aktiivista ainetta maamäärän suhteen). Pidettiin huolta siitä, että ruiskutusliemi ei tullut kosketuksiin taimien maanpäällisten osien kanssa.

48 tunnin kuluttua käsitellyt taimet infektoitiin sienen ; sporangiosuspensiolla. Infektoituja taimia inkuboitiin 5 päivän ajan 90 - 100 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa ja 20°C:ssa, minkä jälkeen arvioitiin sienitaudin esiintyminen .

Molemmissa kokeissa ei havaittu yhtään sienitautia.

Il » 93014

Esimerkki 3.3: Vaikutus Plasmopara viticolaa vastaan viiniköynnöksissä a) Jäännössuojavaikutus 4...5-lehtisessä tilassa viiniköynnöksen taimet ruiskutettiin vaikuttavan aineen ruiskutus jauheesta valmistetulla ruiskutusliemellä (0,006 % aktiivista ainetta). 24 tunnin kuluttua käsitellyt taimet infektoitiin sienen sporangio-suspensiolla. Inkuboitiin 6 päivän ajan 95 - 100 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa ja 20°C:ssa, minkä jälkeen sienitauti arvioitiin.

Verrattuna käsittelemättömiin, mutta infektoituihin kont-rollitaimiin, joissa esiintyi 100-%:nen sienitauti, vaikuttavalla aineella I käsitellyt taimet olivat sienitaudista vapaita.

Esimerkki 3:4; Vaikutus Cercospora arachidicolaa vastaan maapähkinäntaimissa Jäännössuojavaikutus 10 - 15 cm korkeat maapähkinäntaimet ruiskutettiin vaikuttavan aineen ruiskutus jauheesta valmistetulla ruiskutus-liemellä (0,006 % aktiivista ainetta) ja 48 tunnin kuluttua ne infektoitiin sienen konidiosuspensiolla. Infektoi-: tuja taimia inkuboitiin 72 tunnin ajan n. 21°C:ssa ja suu ressa ilmankosteudessa ja tämän jälkeen ne sijoitettiin kasvihuoneeseen, kunnes esiintyi tyypillisiä lehtitäpliä. Fungisidisen vaikutuksen arviointi suoritettiin 12 päivän kuluttua infektoinnista perustuen esiintyvien täplien määrään ja kokoon.

Vaikuttavalla aineella I käsitellyt taimet olivat koskemattomia. Sorafeeni A:11a käsittelyissä taimissa ei esiintynyt myöskään mitään tautia arvioinnin lopussa käytet- 26 9301 4 taessa 0,002 %:n ruiskutuskonsentraatiota. Käsittelemättömissä, mutta infektoiduissa kontrollitaimissa esiintyi sitä vastoin 100-%:sesti Cercospora-tauti♦

Esimerkki 3.5; Vaikutus Venturia inaequalista vastaan ome-nantaimissa Jäännössuojavaikutus

Omenanpistokkaita, joissa on 10 - 20 cm pitkiä uusia versoja, ruiskutettiin vaikuttavan aineen ruiskutusjauheesta valmistetulla ruiskutusliemellä (0,02 % aktiivista ainetta). 24 tunnin kuluttua käsitellyt taimet infektoitiin sienen konidiosuspensiolla. Taimia inkuboitiin sitten 5 päivän ajan 90 - 100 %:n suhteellisessa ilmankosteudessa ja sijoitettiin 10 päivän ajaksi kasvihuoneeseen 20 -24°C:ssa. Rupisuus arvioitiin 15 päivän kuluttua infek-toinnista.

Vaikuttavalla aineella käsitellyt pistokkaat olivat tau-dittomia.

Esimerkki 3.6; Vaikutus Botrytis cinereaa vastaan omenissa Jäännössuojavaikutus

Keinotekoisesti vioitettuja omenia käsiteltiin siten, että vaikuttavan aineen ruiskutusjauheesta valmistettua ruisku-tuslientä (0,02 % aktiivista ainetta) tiputettiin vioit-tuneesiin kohtiin. Käsitellyt omenat inokuloitiin tämän jälkeen sienen itiösuspensiolla ja inkuboitiin viikon ajan suuressa ilmankosteudessa ja n. 20°C:ssa. Arvioinnissa laskettiin pilaantuneet vioittuneet kohdat ja tästä johdettiin testiaineen fungisidinen vaikutus.

Vaikuttava aine esti täysin sienen kasvun.

Il .

„ 9301 4

Esimerkki 3,7; Vaikutus Erysiphae qraminista vastaan ohrassa a) Jäännössuojavaikutus N. 8 cm korkeille ohrantaimille ruiskutettiin vaikuttavan aineen ruiskutus jauheesta valmistettua ruiskutuslientä (0,006 % aktiivista ainetta). 3-4 tunnin kuluttua käsitellyt taimet pölytettiin sienen konidioilla. Infektoidut ohrantaimet sijoitettiin kasvihuoneeseen n. 22°C:ssa ja sienitauti arvioitiin 10 päivän kuluttua.

b) Systeeminen vaikutus N. 8 cm korkeille ohrantaimille kaadettiin vaikuttavan aineen ruiskutusjauheesta valmistettua ruiskutuslientä (0,002 % aktiivista ainetta suhteessa maa-alaan). Tällöin pidettiin huolta siitä, että ruiskutusliemi ei tullut kosketuksiin maanpäällisten taimenosien kanssa. 48 tunnin kuluttua käsitellyt taimet pölytettiin sienen konidioilla. Infektoidut ohrantaimet sijoitettiin kasvihuoneeseen n.

. 22°C:ssa ja sienitauti arvioitiin 10 päivän kuluttua.

Taimet olivat molemmissa kokeissa taudittomia, mutta kaikissa kontrollitaimissa esiintyi tautia.

Esimerkki 3.8: Vaikutus Rhizoctonia solania vastaan (maa-: sieni riisikasveilla)

Suojaava paikallinen maalevitys 12 päivän ikäisille riisintaimille kaadettiin vaikuttavan aineen valmisteesta valmistettua ruiskutuslientä (0,002 % aktiivista ainetta) saastuttamatta maanpäällisiä taimien osia. Käsiteltyjen taimien infektoimiseksi R. solanin rihmaston ja rihmastopahkojen suspensio kaadetaan maan pinnalle. Inkuboitiin 6 päivän ajan 27°C:ssa (päivä) tai vast. 23°C:ssa (yö) ja 100 %:n suhteellisessa ilmankosteu- 2β 9301 4 dessa (kostutuslaatikko) ilmastointikammiossa, minkä jälkeen sienitauti arvioidaan lehtitupessa, lehdissä ja varsissa.

Vaikuttavalla aineella suoritetun käsittelyn jälkeen ei esiinny mitään tautia. 1

II

» »

Claims (4)

29 9 3014

1. Kaavan I mukainen sorafeeni ?R • ί .1· /«ν/,Κ./.χ /1i :jm : · e: 23 jo ·** ÖCHj y CHj \ \ Xzo *’ !.’> ? Jf »! s/VVW\h k 3’ jossa kaavassa R merkitsee joko metyyliä ja 9,10-asemassa on kaksoissidos tai jossa R merkitsee vetyä ja 9,10-asemassa on yksinkertainen sidos.

2. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen sorafeenin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään mikro-organismia Sorangium (Polyangium) cellulosum "So ce 26" (NCIB 12 411) viljelyalustassa, joka sisältää kulloinkin vähintään yhden assimiloitumiskykyisen C-lähteen ja N-lähteen sekä vastaavia epäorgaanisia suoloja, 10-35 °C:ssa adsorberihartsin läsnäollessa tai ilman sitä, sitten viljelyliemi tai vastaavasti suodatettu adsorberi-hartsi uutetaan sopivalla liuotinfaasilla, saatu liuos haihdutetaan ja jäljelle jäävä jäännös puhdistetaan haluttaessa kromatografoimalla ja/tai kiteyttämällä uudelleen.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen sorafeenin tai vaikut- ! tavana aineena vähintään yhtä kaavan I mukaista, patent tivaatimuksen 1 mukaista yhdistettä yhdessä sopivan kan-toaineen kanssa sisältävän aineen käyttö kasvitautien torjumiseksi.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen käyttö, tunnettu siitä, 9301 4 30 että käytettävän aineen olennainen aineosa on kaavan I mukaista yhdistettä sisältävä, patenttivaatimuksen 2 mukaisella menetelmällä valmistettu biomassa.