CZ517789A3 - Microbiological process for preparing macrocyclic active substance - Google Patents

Description

Vynález se týká zejména Šesti nových kmenů mikroorganismů myxobakterií rozkládajících celulózu ze skupiny Sorangium/Polyangium, které se, jak známo, dají často nalézt ve vzorcích půdy v rostlinném materiálu nebo ve hnoji zvířat. Charakteristickou pro tuto taxonom_|cky nikoli obecně závazně členěnou skupinu je její schopnost prospívat na celulóze nebo na produktech odbourávání celulózy jakožto jediném zdroji uhlíku. Uvedených Šest kmenů podle předloženého vynálezu, lhostejno zda náleží přísně ke skupině Sorangium/Polyangium nebo pouze k taxonomicky příbuzné oblasti, je oproti větSině zástupců této skupiny vyznačeno dále tím/že produkují alespoň jeden ze shora uvedených Soraphenů vzorce I, a výhodně alespoň dva Sorapheny, z nichž rovněž Soraphen A.

Těchto šest kmenů bude zde i v následující části označováno souborným názvem Sorangium(Polyangium)ceRulosum. Tyto kmeny pocházejí ze vzorků půdy, které byly odebrány v různých časových intervalech na různých místech Evropy, Afriky popřípadě USA. Tyto kmeny byly uloženy v německé sbíree mikroorganismů (ESM) v Braunsehveigu, NSR, podle budapeštské smlouvy. Tyto kme ny jsou označeny následujícím způsobem:

- 6 1. kmen Sorangium(Polyangium)cellulosum So ce 139, Izolovaný v květnu 1986 ze vzorku půdy odebraného na podzim 1982 u Fort Huachaca, Arizona, USA. Číslo uloženého kmene: DSM 5397 · Den uložení: 2. červen 1989;

2. kmen Sorangiua(Polyangium)cellulosum So ce 170, Izolovaný v dubnu 1987 ze vzorku půdy odebraného v květnu 1981 na ostrově Delos, Řecko, číslo uloženého kmene: DSM 4795· Den uložení: 2. záři 1988;

3. kmen Sorangium(Polyangium)cellulosua So ce 191, izolovaný v srpnu 1987 ze vzorku půdy odebraného v únoru 1987 na ostrově Madeira, Portugalsko. Číslo uloženého . kmene: DSM 4796. Den uložení : 2. září 1988;

4· kmen Sorangium(Polyangium)cellulosum So ce 192, izolovaný v srpnu 1987 ze vzorku půdy odebraného v březnu 1987 v Higerii. číslo uloženého kmene:

DSM 4797· Den uložení: 2. září 1988;

5· kmen Sorangium(Polyangium)cellulbsum So ce 231', izolovaný v dubnu 1988 ze vzorků půdy odebraných v dubnu 1987 u města Didyma, Turecko, číslo uloženého kmene: DSM 5393· Den uložení: 2. září 1989;

6. kmen Sorangium(Polyangium)cellulosum So ce 242, izolovaný v říjnu 1988 ze vzorku půdy odebraného v dubnu 1988 u města Pozzuoli, Itálie, číslo uloženého kmene: DSM 5414. Den uložení: 19. června 1989.

- 7 V následující části se pro tyto kmeny používá označení Sorangium cellulosum.

Způsob výroby Soraphenu vzorce I podle vynálezu spočívá v aerobní kultivaci některého z kmenů Sorangium cellulosum So ce 139”, So ce 170”, So ce 191, So ce 192”, So ce 231 nebo So ce 242 nebo některého klonu odvoditelného od těchto kmenů, mutantu atd. ve vhodném živném prostředí a v izolaci vzniklého Soraphenu.

V evropské patentové přihláěce EP-A-282,455 se popisuje další mikroorganismus Sorangium cellulosum So ce 26, jehož fermentace skýtá shora uvedené Sorapheny A a B. Předložený vynález se nevztahuje na tyto oba přípravky a jejich samotné použiti v prostředcích.

Předložený vynález se týká dalších cenných produktů fermentace, které jsou produkovány mikroorganismem So ce 26 (číslo uloženého kmene: HCIB 12 411) nebo/a mikroorganismy podle vynálezu So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231 nebo So ce 242.

Obecné podmínky způsobu kultivace šesti produkčních kmenů

Kmeny Sorangium cellulosum se dají kultivovat ve vhodných živných prostředích podle obvyklých biologických metod, například v třepacích kulturách nebo fermentátorech. Teplota fermentace činí zpravidla 10 až 40 °C, výhodně 10 až 35 °C a zvláště výhodně 30 až 32 °C. Hodnota pH činí 6 až 8, výhodně 7,4. Proces probíhá aerobně a za sterilních podmínek.

Složení živného prostředí se může měnit v Širokých mezích. Pro hlavní živné látky, které se mají asimilovat, musí být přítomen zdroj uhlíku a zdroj dusíku jakož i zdroj anorganických minerálních solí, které zahrnují fosfor, síru, hořčík, draslík, železo a vápník.

Fermentační procesy využívají jako zdrojů uhlíku výhodně glukózy, škrobu a celulózy, jakož i produktů jejich odbourání (například Cellobiosu) a kromě toho také di sacharidy, glycerol, kyselinu octovou a další. Jako zdroje dusíku jsou vhodné^NH^, nebo také peptony. Organická sloučenina jako zdroj dusíku nemůže být zpravidla současně jediným zdrojem uhlíku a zdrojem energie při fermentaci.

Jako minerální soli přicházejí v úvahu chloridy, dusičnany, sírany, uhličitany a fosforečnany prvků sodíku, draslíku, skupiny NH^, hořčíku, železa a vápníku; vedle nich mohou být přítomny jako stopové prvky měó, mangan, molybden, zinek, kobalt a další. Pokud je to možné, mohou být takovéto soli přítomny také ve formě vázané na ethylendiamintetraoctovou kyselinu (EDTA).

Kultura mikroorganismu se používá v třepací kultuře nebo ve farmentátoru v očkovacím množství 0,1 až 20 %, výhodně 0,5 až 10 %, zcela zvláště výhodně 0,5 až 5 % (objem/objem). Doba kultivace činí při teplotě asi 30 °C asi 2 až 7 dnů;

- 9 v případě násad s velkým objemem v řidších případech až 10 dnů nebo déle. Pro násady o velkém objemu se účelně fermentují na začátku menší předběžné kultury. Použití kmenů Sorangium cellulosum je možné také v immobilizované formě, například ve formě buněk fixovaných na nosiči (na alginátu).

Odvoditelným klonem ve shora uvedeném smyslu se rozumí každá kultura, která má ještě znaky uloženého klonu důležité pro provádění postupu podle vynálezu, zejména kultura, jejíž mikroorganismy obsahují stejné strukturní geny jako jsou strukturní geny kmenů So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192”, So ce 231 a So ce 242, které jsou příčinou vzniku slou čeniny vzorce I. Odvoditelným klonem se rozumí také každá kultura, jejíž mikroorganismy obsahují možný ekvivalent proti zvrhnutí genetického kódu strukturních genů 4 kmenů, které jsou příčinou vzniku sloučeniny vzorce I. Odvoditelným klonem se rozumí i

zejména každá kultura, která obsahuje myxobakterie rozkládající celulózu, výhodně typu Sorangium cellulosum, které jsou schopny produkovat sloučeninu vzorce I. Výraz odvoditelný klon kmenů DSM 5397, DSM 4795, DSM 4796, DSM 4797, DSM 5393 a DSM 5414 zahrnuje také všechny mutanty a rekombinace, které jsau schopny produkce sloučeniny vzorce I.

Kultivace se provádí aerobně, tedy například v kultuře, jejíž povrch je v klidovém stavu, nebo výhodně submersně za třepání nebo míchání se vzduchem nebo kyslíkem v třepacích kulturách nebo ve fermentátorech. Kultivace se provádí výhodně postupně, tj. nejprve se připraví jedna nebo několik předběžných kultur v tekutém živném prostředí, které se poté přeočkují do vlastního produkčního prostředí, například v poměru 1:20.

Oddělování (izolace) Soraphenu se provádí fyzikálně-chemickou cestou pomocí o sobě známých dělicích metod jako jefiltrace, zvláště však extrakce pomocí rozpouštědel, a chromatografie, předevSím adsorpční chromatografie a rozdělovači chro matografie a popřípadě krystalizace.

Z vodné fermentační břeČky se dají sloučeniny vzorce I extrahovat pomocí lipoflíních organických rozpouštědel, například pomocí ketonů, jako je methylethylketon a cyklohexanon; pomocí alkoholu se střední délkou řetězce, jako je isobutylalkohol, pentanol a hexanol; pomocí alkylesterů kyseliny octové 8 1 až 6 atomy uhlíku v alkylové části (jako ethylacetátu, propylacetátu, butylacetátu, isobutylaceťátu a dalších); pomocí toluenu, dichlormethanu, 1,2-dichlorethanu, chlorbenzenu, dichlorbenzenu a dalších.

Z filtračního buněčného koláče se dají sloučeniny snad no extrahovat pomocí alkoholů nebo ketonů (například methanolu, ethanolu, acetonu, methylethylketonu).

Z příslušného extraktu se pak mohou slou^&ny vzorce I získat zahuštěním nebo/a vysrážením, přičemž se získané sloučeniny dají rozdělit frakční krystalizací nebo jinými chromatografickými dělicími metodami na Soraphen A až Soraphen p

Výhodně se fermentační postup k získání sloučenin vzorce I ukončí přidáním adsorbční pryskyřice, na kterou se zachytí žádané produkty nebo se fermentace od začátku provádí v přítomnosti takové adsorbční pryskyřice. Jako adsorbční pryskyřice přicházejí v úvahu především neutrální organické polymerní látky, zejména neiontové hydrofobní adsorbční pryskyřice, které jsou vhodné k lipofilní extrakci. Na tuto pryskyřici se sloučenina vzorce I váže téměř kvantitativně. Jako příklady takovýchto pryskyřic lze uvést polopolární pryskyřice akrylátového typu, nepolární polystyren-divinylbenzenové pryskyřice a zvláStě zesítěný polystyren. Takovéto pryskyřice se přidávají v množství 0,1 až 5 % (objem/objem), vztaženo na objem fermentačního prostředí, výhodně v množství 0,5 až 2 % (objem/ /objem). V úvahu přichází také aktivní uhlí. Technicky zvláště výhodné jsou polystyrénové pryskyřice, jako například XAD-1180 i

nebo XAD-16 (výrobce: Rohm and Haas), které jsou přítomny ve filtrovatelné formě (ve formě zrn nebo granulí).

v

Po ukončení fermentace se pryskyřice odfiltruje, promyje se vodou a ošetří se methanolem nebo ethanolem. Alkoholický extrakt se zahustí. Přidáním diethyletheru, ethylacetátu nebo butylacetátu lze oddělit v podstatě zcela vykrystalovanou sloučeninu IA (« Soraphen A). Filtrát se čistí za účelem získání zbylého Soraphenu A, především vSak za účelem získání zbývajících Soraphenů B až d chromatografickou metodou.

Vynález se týká sloučenin vzorce I v čisté formě popřípadě v krystalické formě. Vynález se týká rovněž biomasy, surových extraktů nebo adsorbční pryskyřice z fermentace, které obsahují sloučeninu vzorce I a jako takové nebo v dále upravené formě se mohou používat k potírání chorob rostlin. Biomasa se aůže dále používat nebo uvádět na trh také jako rozemletá nebo slisovaná suchá látka (cake).

Popisované způsoby výroby včetně všech dílčích stupňů jsou součástí předloženého vynálezu.

Zejména se vynález týká způsobu výroby Soraphenu vzorce I, který spočívá v tom, že se některý z kmenů Sorangium cellulosum So ce 139”, So ce 170, So ce 191,

So ce 192, So ce 231 a So ce 242 nebo mikroorganismus, který obsahuje stejné strukturní geny jako jsou strukturní geny uvedených kmenů umožňující tvorbu Soraphenu, ve vodném živném prostředí obsahujícím zdroj uhlíku a zdroj dusíku jakož i anorganické soli, aerobně kultivuje a izolují se Sorapheny vzorce I.

Především pak se vynález týká takové formy provedení shora uvedeného postupu, která spočívá v tom, že se kultivu-” je mikroorganismus tvořící Soraphen ze skupiny myxobakterií rozkládajících celulózu.

Výhodná forma provedení shora uvedeného postupu spočívá v tom, že se kultivuje některý z kmenů Sorangium cellulosum So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231, So ce 242 nebo mutant tvořící Soraphen a odvozený od tohoto kmene.

Zvláště výhodná formě provedení shora uvedeného postupu spočívá v tom, že se kultivuje některý z těchto kmenů

-So ce 139”, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce

231, So ce 242, uložený podle budapešťské smlouvy.

Fermentace se provádí výhodně za podmínek, které jsou popsány v příkladové části.

Mikroorganismy, které obsahují stejné strukturní geny, které umožňují tvorbu Soraphenu, jako je uvedených kmenů, se mohou vytvořit například uměle genovou manipulací tím, že se izolují odpovídající strukturní geny ze 6 kmenů a na vhodném místě se vestaví do genového materiálu vhodného jiného mikroorganismu. Vhodnými mikroorganismy jsou takové mikroorganismy, do kterých lze dotyčné strukturní geny nejen vestavět, nýbrž ve kterých lze tyto strukturní geny také exprimovat a ve kterých se vzniklý Soraphen znovu neodbourává, nýbrž se výhodně vylučuje do fermentační břečky. Ta kovými vhodnými mikroorganismy jsOu především další kmeny myxobakterií, zejména myxobakterií typu Sorangium cellulosum pokud již neobsahují shora zmíněné strukturní geny.

Mutanty tvořící Soraphen se mohou získávat například působením ultrafialového záření nebo rentgenového záření nebo působením chemických mutagenů, například N-methyl-K'-nitro-N-nitrosoguanidinu a izolovat selekcí na základě jejich specifických vlastností o sobě známým způsobem. Další opatře ni způsobu výroby mutantů a rekombinantů mikroorganismu jsou

- 14 pro odborníka známé a běžné.

Vynález se rovněž týká způsobu výroby produktu fermentace, který obsahuje v prokazatelném množství Soraphen, a který spočívá v tom, že se kultivuje některý z kmenů Sorangium cellulosum So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231, So ce 242 nebo klon odvoditelný od těchto kmenů v živném prostředí a Soraphen se získává ve vhodné formě. Takovéto kultivační břečky se dají používat jako takové nebo v koncentrované formě, popřípadě za přídavku dalších nosných látek nebo/a dispergačních prostředků, jakožto prostředky proti fytopathogenním mikroorganismům a jsou tudíž důležitou součástí předloženého vynálezu.

V užším smyslu je uvedený způsob vyznačen tím, že se kultivuje některý z mikroorganismů Sorangium cellulosum So ce 139, So ce 170, So ce 191, So ce 192, So ce 231 nebo So ce 242 v kultivačním prostředí, které obsahuje vždy alespoň jeden asimilace' schopný zdroj uhlíku a zdroj dusíku, jakož i odpovídající anorganické soli, při teplotě 10 až 40 °C, výhodně při teplotě 10 až 35 °C, v přítomnosti nebo v nepřítomnosti adsorbční pryskyřice, poté se kultivační břečka popřípadě odfiltrovaná adsorbční pryskyřice extrahuje vhodnou rozpouštědlovou fází. Získaný roztok se zahustí a zbytek, pokud je to žádoucí, se čistí chromatografováním nebo/a překrystalováním.

- 15 Základní kultury a morfologický popis:

Základní kultury se získají ve formě deskových kultur na agaru VY/2 (0,5 % pekařských kvasnic podle čerstvé váhy; 0,1 % chloridu vápenatého; 1,5 % agaru; pH 7,2) nebo na filtračním papíru ( zdroj celulózy) přes agar ST21 (0,1 % dusičnanu draselného; 0,1 % heptahydrátu síranu hořečnatého; 0,1 % chloridu vápenatého; 0,1 % hydrogenfosforečnanu draselného; 0,01 % heptahydrátu síranu manganatého; 0,02 % chloridu železitého; 0,002 % extraktu z kvasnic; standardní roztok sto pových prvků, který obsahuje 0,02 až 0,5 mg soli manganu, molybdenu, mědi, kobaltu nebo/a zinku na 1 litr [R.Y. Stanier a dalěí General Microbiology, 4. vydání, str. 36 (1976)]; nebo 500 mg ethylendiamintetraoctove kyseliny, 300 mg heptahydrátu síranu železnatého, 3 mg tetrahydrátu chloridu manganaté ho, 5 mg hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 1 mg dihydrátu chloridu měánatého, 2 mg hexahydrátu chloridu nikelnatého, mg dihydrátu molybdenanu sodného, 5 mg heptahydrátu síranu zinečnatého, 2 mg kyseliny borité na 1 litr destilované vody (pH asi 4) [G. Drews Mikrobiolog. Praktikum, 4. vydání, str. 11, Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo [1983]; a 1 % agaru). Desky se kultivují při teplotě 30 °C.

Na obou prostředích tvoří organismy shluky kolonií, které se pozvolna rozšiřují mimo substrát. Jednotlivě lze pozorovat zřetelné rozdíly mezi 6 kmeny.

l)Sc ce 139” (DSM 5397)

Na filtračním papíru nad agarem ST 21 zůstává čelní fronta kolonie v podstatě omezena na filtrační papír. U starších kultur narušuje agar okraj filtračního papíru a kolonie a agar se zde navzájem spojí. Filtrační papír se úplně odbourá přičemž na jeho místě se nachází husté pole černohnědých plcdnic. Ty sestávají z malých sporangiol o průměru 15 až 30 yum, které se opět spékají do malých shluků až na rozsáhlou nerozčlenšnou hmotu. Vegetativní buňky jsou představovány štíhlými válcovitými tyčinkami s tupě zaoblenými konci a měří 0,7 až 0,9 x 2,5 až 4 /Um. V optickém mikroskopu s fázovým kontrastem se jeví tmavě, často se světlými pólovými zrníčky.

Na agaru VY/2 tvoří velmi značné rojnice kolonií s bezbarvými až oranžovými radiálními žilkami a s mnoha černohnědými plodnicemi podobné stavby jako je popsána shora. Kvasinkové buňky živného média nejsou téměř napadeny. Vegetativní buňky se jeví ooněkud hrubší a jsou o 1 _zum tlustší.

/

2) So ce 170 (DSM 4795)

Na filtrační papír nad agarem ST 21 proniká rojnicová kolonie přes filtr na povrchuagaru. Agar se později trhá do hloubky a rojnice kolonií se navzájem sbalí s agarem. Na filtračním papíru se mohou vyvíjet plodnice. Ty sestávají z malých tlustostěnných tmavo hnědých sporangiol, většinou o průměru 20 až 30 mm, které jsou hustě stěsnány do většinou ostře ohraničených podlouhlých shluků o průměru asi 50 až 200 /um. Místy mohou vznikat rozlehlé agregáty plodnic.

- 17 na agaru VY/2 se tvoří středně velké, slizovité, oranžově intenzivně zbarvené shluky kolonií většinou o průměru 1 až 2 cm. Kvasinkové buňky se pomalu odbourávají. Také zde se agar místy do hloubky trhá, takže kolonie může zcela spadat do těchto trhlin agaru. Na povrchu agaru se tvoří často oranžové, světle hnědé až tmavohnědé plodnice podobné stavby jako shora. Vegetativní buňky jsou představovány hrubšími tyčinkami, které se v optickém mikroskopu s fázovým kontrastem jeví jako tmavé s širo ce zaoblenými konci a obvykle měří 0,8 až 1,0 x 2 - 5 Kmen odbourává také účinně chitin.

3) So ce 191 (DSM 4796)

Tento kmen roste na filtračním papíru umístěném na agaru ST21, aniž by překročil plochu agaru. Také v tomto případě může agar kolem filtračního papíru vytvářet hluboké trhliny a rojnice kolonií se stáčí do těchto trhlin. Na agaru VY/2 se vytvářejí velké rojnice kolonií o průměru 6 až 8 cm s jemnými až výraznými radiálními žilkami. Kvasinkové buňky nejsou téměř napadány. Válcovité vegetativní tyčinky mají zaoblené konce a v optickém mikroskopu s fázovým kontrastem se jeví jako tmavé,”' často značně dlouhé a měří většinou 0,7 až 0,9 x 3 - 8 jxa.

Kmen netvoří v čisté kultuře za uvedených podmínek kultivace žádné plodnice. Uvedený kmen účinně odbourává chitin.

4) So ce 192 (DSM 4797)

Tento kmen se při kultivaci na filtračním papíru na agaru ST21 rozšiřuje daleko pres povrch agaru. Agar může vytvá18 řet hluboké trhliny a rojnice kolonií se stáčí do těchto trhlin. Na povrchu agaru, zejména však na filtračním papíru se vytváří mnoho svítivě oranžově zbarvených plodnic, sestávajících z maličkých sporangiol většinou o průměru 10 až 20 jam. v ostře ohraničených shlucích většinou o rozměru 50 až 500 ^^111, Na agaru VY/2 se vytváří středně velké intensivní rojnice kolonií o průměru 2 až 3 cm, s radiálními žilkami a s mnoha intensivně hnědo-oranžově zbarvenými plodnicemi v agaru a na agaru podobné stavby jako je popsána shora. Vegetativní buňky jsou představovány válcovitými malými tyčinkami se širokými konci a měří většinou 0,7 až 0,9 x 3 sž 5 Kvasinkové buňky se neodbourávají, zatímco kmen velmi.intenzivně odbourává chitin.

5) So ce 231 (DSM 5393)

Při kultivaci na filtračním papíru nad egarem ST 21 nepřechází na agarovou plotnu. Agar sě může na okraji filtračního papíru trhat, avšak kolonie se v tomto případě nesbalují. Filtrační papír se zcela rozruší a na jeho místě se· později nadchází velmi husté pole intensivně hnědě oranžově zbarvených plodnic. Tyto plodnice mají podobnou strukturu jako plodnice tvořící se v případě jiných kmenů, avšak sporengioly jsou v tom to případě často uspořádány do svazků. Na agaru VY/2 se vytváří velmi značné rojnice s radiálními svazky jemných žilek. Míst ně se vytvářejí svítivě oranžově hnědě zbarvené plodnice. Štíhlé vegetativní tyčinky jsou velmi jemné a měří 0,6 až 0,8 x x 2,5 sž 6 fun. Kvasinkové buňky živné půdy se pomalu rozkládají s uvedený kmen odbourává velmi účinně chitin.

18a 6) So ce 242 (DSM 5414)

Kmen proniká na filtračním papíru na agaru ST 21 a tvoří tam také plodnice. Agar tvoří na okraji filtračního papíru hluboké trhliny. Filtrační papír se zcela odbourává a je nahrazován hustou masou černohnědých plodnic. Sporangioly jsou v této mase často uspořádány v řetězcích. Na agaru VY/2 se tvoří velmi značné rojnice s jemnými radiálními žilkami.

V oblasti této rojnice se agar trhá a vytváří no mnoha místech drápovité útvary. Dále vznikají ve značné míře plodnice. Kvasinkové buňky v substrátu se pomalu odbourávají. Vegetativní buňky měří 0,7 až 1,0 ^im x 2 až 4 ^^101, Uvedený kmen je velmi účinným při rozkladu chitinu.

Uvedené kmeny produkují látky, které inhibují růst četných kvasinek a hyf. Chemicky se jedná u těchto inhibičních látek nejen o Sorapheny, jejichž struktury, jak je uvedeno níže, byly již vysvětleny. Tyto směsi makrocyklických sloučenin typu Soraphenu se vyskytují v kapalných kulturách v supernatantu kultury, mohou se však také izolovat z buněk. Produkce antibiotik probíhá podle logaritmické až stacionární růstové fáze.

Všech šest kmenů se musí adaptovat na růst v kapalných médiích. Tyto kmeny rostou nejprve ve formě malých, pevných, oranžově zbarvených částic ve formě hlíz a tvoří teprve po mnoha stupních přenosu z kapalného média do kapalného média pozvolna více či méně homogenní suspenzi buněk.

Biologická charakteristika kmenů So ce 139, So ce 170,

So ce 191“, So ce 192, So ce 231 a So ce 242 odbourávání celulózy: pozitivní odbourávání glukózy: pozitivní odbourávání škrobu: pozitivní

NH^ jako zdroj dusíku: pozitivní

ΝΟβ jako zdroj dusíku: pozitivní

Tabulka 1

Příklady organismů, které jsou inhibovány v růstu supernatanty

kultury kmenů So ce 139, So	ce 170, So ce 191, So ce 192,
So ce 231 a So ce 242
kvasinky	hodnocení *
Debaryomyces hansenii	i silná inhibice
Nematospora coryli	silná inhibice
Candida albicans	silná inhibice k . '
Saccharomyces cerevisiae	středně silná inhibice
Rhodotorula glutinis	středně silná inhibice
Hansenula anomala	středně silná inhibice
Nadsonia fulvescens	žádná inhibice
Torulopsis glabrata	žádná inhibice

Schizosaccharomyces pombe žádná inhibice

- 20 Hyfy:

Alternaria solani	silná	inhibice
Pythium debaryanum	silná	inhibice
Mucor hiemalis	silná	inhibice
Rhizopus arrhizus	slabá	inhibice

* Hodnocení inhibice se vztahuje na kulturu průměrné šarže. Jednotlivé údaje představují navzájem poměrné hodnoty.

Předložený vynález se dále týká Soraphenu C až vzorce I v čisté formě. Vynález se týká také biomasy, surového extraktu nebo adsorbční pryskyřice z fermentace, které obsahují Sorapheny C až š vzorce I a jako takové nebo ve formě dále upraveného přípravku se mohou používat k potírání houbových chorob. Biomasy se mohou dále používat nebo uvádět na trh také ve formě rozemleté nebo slisované suché látky (cake). ¹

Popsané způsoby výroby včetně všech dílčích stupňů jsou rovněž součástí předloženého vynálezu.

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že sloučeniny obecného vzorce I mají velmi příznivé spektrum biocidních účinků vůči fytopathogenním mikroorganismům, zejména vůči houbám. .Uvedené sloučeniny mají velmi výhodné kuřativní, systemické a zejména preventivní vlastnosti a dají se používat k ochraně četných kulturních rostlin. Pomocí účinných látek vzorce I se mohou na rostlinách nebo na částech rošt21 lin (plodech, květech, listech, stoncích, hlízách, kořenech) různých užitkových rostlin potlačovat nebo ničit vyskytující se škůdci, přičemž pak zůstávají chráněny před fytopathogenními mikroorganismy i později vzrostlé části rostlin.

Jako mikrobicidy jsou účinné látky vzorce I účinné například vůči fytopathogenním houbám náležejícím do následujících tříd: Fungi imperfecti (například zejména Botrytis, dále Pyricularia, Helminthosporium, Pusarium, Septoria, Cercospora a Alternaria); Basidiomycetes (například Rhizoctonia, Hemileia, Puccinia). Kromě toho jsou účinné proti houbám třídy Ascomycetes (například zejména proti Venturia, Erysiphe, dále Podosphaera, Monilinia, Uncinula) a třídy Oomycetes (například Phytophthora, Plasmopara). Sloučeniny vzorce I se mohou dále používat jako mořidla k ošetřování osiva (plodů, hlíz, zrní) a semenáčků rostlin k ochraně před houbovými infekcemi, jakož i k ochraně proti fytopathogenním houbám, které se vyskytují v půdě.

v » .

Předložený vynález se týká také prostředků, které obsahují jako účinnou složku jeden nebo několik Soraphenů C až £? vzorce I, zejména prostředků k ochraně rostlin, jakož i jejich použití v zemědělství nebo v příbuzných oborech.

Vynález se rovněž týká způsobu ošetřování rostlin, kte rý spočívá v aplikaci nových sloučenin Soraphenu C až d vzorce I popřípadě Odpovídajících nových prostředků.

- 22 Jako kulturní rostliny, pro které platí shora uvedené oblasti aplikace, přicházejí v rámci tohoto vynálezu v úvahu například následující druhy rostlin: obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné rostliny); řepy (cukrová řepa a krmné řepy); ovocné stromy rodící plody s jádry, peckoviny a bobuloviny (jabloň, hrušeň, švestka, broskvoň, mandlovník, třešeň, jahodník, maliník, ostružiník); luskoviny (fazol, čočka, hrách, sója); olejniny (řepka, hořčice, mák, olivovník, slunečnice, kokosovník, skočec, kakaovník, podzem- nice olejná); tykvovité rostliny (dynš, okurky, melouny); vlákniny (bavlník, len, konopí, juta); citrusovníky (oranžovník, citroník, citroník největší, mandarinka); různé druhy zeleniny (špenát, hlávkový salát, chřest, hlávkové zelí, mrkev, cibule, rajská jablíčka, brambory, paprika); vavřínovité rostli-ny (avokádo, skořicovník, kafrovník) nebo další rostliny jako i

tabák, ořešák, kávovník, ananas, cukrová třtina, čajovník, vinná réva, chmel, banánovník a kaučukovník, jakož i okrasné rostliny (Compositae). Tento výčeť nemá limitující' charakter.

Účinné látky vzorce I se používají obvykle ve formě prostředků a mohou se aplikovat na ošetřované plochy nebo na rostliny současně nebo postupně s dalšími účinnými látkami. Těmito dalšími účinnými látkami mohou být jak hnojivá, prostředky obsahující stopové prvky nebo další přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Mohou jimi být také selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskicidy nebo směsi těchto přípravků společně s případně

- 23 dalšími nosnými látkami, tensidy nebo dalšími přísadami podporujícími aplikace, které se používají při přípravě takových to prostředků.

Vhodné nosné látky a přísady mohou být pevné nebo kapalné a odpovídají látkám, které se používají při přípravě takovýchto prostředků, jako jsou například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, adheziva, zahušíovadla, pojidla nebo hnojivá.

Výhodný způsob aplikace účinné látky vzorce I, popřípadě agrochemického prostředku, který obsahuje alespoň jednu z těchto účinných látek, je aplikace na listy rostlin. Počet aplikací a aplikované množství se přitom řídí stupněm napadení příslušného původce choroby. Účinné látky vzorce I se mohou aplikovat věak také prostřednictvím půdy, kdy přicházejí do rostliny přes kořenový systém (systemický účinek) tím, že se místo, kde rsstliny rostou, zalije kapalným přípravkem nebo se účinné látky aplikují v pevné formě do půdy, například v

ve formě granulátu (půdní aplikace). Tímto granulátem nebo od povídajícím práškem může však být také suchá hmota biomasy vznikající ve fermentátoru nebo adsorbční pryskyřice oddělená z fermentační břečky a obsahující účinné látky vzorce I. Sloučeniny vzorce I se však mohou aplikovat také na semena rostlin tím, že se zrní bud impregnuje kapalným přípravkem účinné látky nebo se na zrní vytváří vrstva pevného přípravku.

- 24 Sloučeniny vzorce I se přitom používají v nezměněné formě nebo výhodně společně s pomocnými látkami, které jsou obvyklé při přípravě takovýchto prostředků. Pro tyto účely se sloučeniny vzorce I zpracovávají účelně například na emulsní koncentráty, na pasty, které lze aplikovat natíráním, na přímo rozstřikovatelné roztoky nebo na roztoky, které se dají dále ředit, na zředěné emulze, smáčitelné prášky, rozpustné prášky, popraše, granuláty a na prostředky enkapsulované například v polymerních látkách. Toto zpracování se provádí o sobě známým způsobem. Aplikační postupy jako postřik, zamlžování, poprašování, posyp, natírání nebo zalévání, se stejně jako druh prostředků volí v souhlase s požadovanými cíly a danými podmínkami. Příznivá aplikovaná množství se pohybují obecně mezi 10 g až 2 kg účinné látky na 1 ha, výhodně mezi 50 g a 500 g účinné látky/ha.

i

Uvedené přípravky, tj. prostředky obsahující účinnou látku vzorce I a popřípadě pevnou nebo kapalnou přísadu, se v , připravují známým způsobem.

Jako rozpouštědla přicházejí v úvahu: aromatické a- alifatické uhlovodíky, jako například směsi xylenů, cyklohexan nebo parafiny; poté alkoholy a glykoly, jakož i jejich ethery a estery, jako ethanol, ethylenglykol, ethylenglykolmonomethy1nebo -ethylether, ethylacetát; ketony jako cyklohexanon, silně polární rozpouštědla, jako N-methyl-2-pyrrolidon, dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid, jakož i popřípadě epoxidované rošt

- 25 linné oleje, jako epoxidovaný kokosový olej nebo sojový olej; nebo voda.

Jako pevné nosné látky, například pro popraše a dispergovatelné prášky se používají zpravidla přírodní kamenné moučky, jako vápenec, mastek, kaolin, montmorillonit nebo attapulgit. Ke zlepšení fyzikálních vlastností se může přidávat také vysocedisperzní kyselina křemičitá nebo vysocedisperzní savé polymery. *^ako zrněné adsorptivní nosiče granulátu jřicházejí v úvahu porézní typy, jako například pemza, cihlová dri, sepiolit nebo bentonit; jako neadsorptivní nosné materiály přicházejí v úvahu například vápenec nebo písek. Kromě toho se může používat také celá řada předem granulovaných materiálů anorganického původu jako zejména dolomit nebo rozmělněné zbytky rostlin.

Jako povrchově aktivní sloučeniny přicházejí v úvahu vidy podle druhu zpracovávané účinné látky vaorce I neionogenní, kationaktivní nebo/a anionaktivní tensidy s dobrými emulv · . · gačními, dispergačními a smáčecími vlastnostmi. Tensidy se rozumí také směsi tensidů. Vhodnými anionickými tensidy mohou být jak tzv. ve vodě rozpustná mýdla, tak i ve vodě rozpustné syntetické povrchově aktivní sloučeniny.

častěji se však používá t. zv. syntetických tensidů, zejména alkansulfnnátů, sulfátováných mastných alkoholů, sulfonovaných derivátů benzimidazolu nebo alkylsulíonátů.

Jako neionogenní tensidy přicházejí v úvahu polyglykol

- 26 etherderiváty alifatických nebo cykloalifatických alkoholů, nasycených nebo nenasycených mastných kyselin a alkylfenolů, které mohou obsahovat 3 až 30 glykoletherových skupin a 8 až 20 atomů uhlíku v (alifatickém) uhlovodíkovém zbytku a β až 18 atomů uhlíku v alkylovém zbytku alkylfenolů.

Jako další příklady neionogenních tensidů lze uvést nonylfenolpolyethoxyethanoly, polyglykolethery ricinového oleje, adukty polypropylenu a polyethylenoxidu, tributylfenoxypolyethylenethanol, polyethylenglykol a oktylfenoxypolyethoxyethanol.

V úvahu přicházejí dále také estery polyoxyethylensorbitanu s mastnými kyselinami, jako pólyoxyethylensorbitan-trioleát.

Tensidy upotřebitelné pii přípravě takovýchto prostředků jsou kromě jiného popsány v následujících publikacích:

Mc Cutcheon*s Detergents and Kaulsifiers Annual MC

Publishing Corp., Ridgewood New Jer_tsey, 1980;

Sisley and Wood, Encyclopedia of Surface Active Agents, Chemical Publishing Co., Inc. New lork, 1980.

Zvláště výhodnými přísadami, které podporují aplikaci a které mohou vést ke značnému snížení aplikovaného množství, jsou dále přírodní (živočišné nebo rostlinné) nebo syntetické fosfolipidy ze skupiny kefalinů a lecithinů, jako například fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylglycerol nebo lysolecithin.

- 27 Agrochemické přípravky obsahují zpravidla 0,1 až 95 % účinné látky vzorce I, 99,9 až 5 % pevné nebo kapalné přísady a 0 až 25 % tensidu.

Zatímco jako tržní zboží jsou výhodné spíše koncentro váné prostředky, používá konečný spotřebitel zpravidla zředěných prostředků.

Prostředky mohou obsahovat také další přísady jako jsou stabilizátory, prostředky proti pěnění, regulátory viskosity, pojidla, adheziva, jakož i hnojivá nebo další účinné lát ky k dosažení speciálních účinků.

Následující příklady slouží k bližšímu objasnění vynálezu, aniž by vynález nějakým způsobem omezovaly.

1. Příklady ilustrující způsob výrobyiúčinných látek

P ř í k 1 a d H-l

i. . »

Výroba sloučenin vzorce I v přítomnosti adsorbční pryskyřice

Postup se provádí ve fermentátoru o objemu 1000 litrů za přídavku 0,5 % (objem/objem) adsorbční pryskyřice XAD-1180 (výrobek firmy Rohm und Haas). Reakční podmínky pro tuto násadu odpovídají podmínkám uvedeným v následujícím příkladu H-2. Místo zde používaného kmene So ce 26 známého z SP-A-282,455 je možno použít také některého z dalších 6 uvedených kmenů podle předloženého vynálezu.

- 28 Po ukončení fermentace se polymerní nosič odstraní přesátím přes síto, promyje se ve skleněném válci, poté se promyje třemi objemy vody a eluce se provádí čtyřmi objemy methanolu (objem je vztažen na objem lože). Eluát se zahustí za sníženého tlaku k suchu.

Hmotnost surového extraktu: 165 g.

Další chromatografické čištění se provádí podle schématu, které je znázorněno na připojeném obr. 1, jehož jednotlivé dělicí stupně probíhají za následujících podmínek. Výtěž ky jsou udávány v závorkách.

Postup dělení za účelem izolace Soraphenu A až Q

1. Dělení na silikagelu; sloupec: průměr 100 mm; délka 45 cm. Sorbent: Lichroprep Si 100; 40-63 (výrobce: Merck)· Rožpouštědlový systém: směs dichlormethanu a acetonu ve stupních 98/2, 95/5, 93/7, 90/10, 50/50; každý stupen o objemu 2 litrů.

Odebírá se 5 frakci.

Frakce 3 obsahuje Soraphen A.

Frakce 4 (25 g) se dále čistí.

2. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 60 mm; délka 100 cm Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia LK3 GmbH). Rozpouštědlový systém: methanol.

Odebírá se 5 frakcí.

Frakce 3 (17 g) se dále čistí.

- 29 3. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 76 mm; délka:

cm.

Sorbent: HDSIL RP-18; 18-60-60 35-70 2¹¹° (výrobce: Labomat-ic) RozpouStědlový systém: směs methanolu a vody 40/60 lineární gradient za 2 hodiny po methanolu.

Odebírá se 9 frakcí.

Frakce 3 (1,3 g), 4 (1,5 g), 5 (3,5 g) a 6 (1,6 g) se dále , čistí.

4· Dělení na silikagelu; sloupec: průměr 40 mm; délka: 30 cm. Sorbent: Lichrosorb Si 100; 7 jxa (výrobce: Merck). RozpouStědlový systém: směs dichlormethanu a hexanu 1/1 + + 2 % methanolu.

Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 2 (500 mg) a 4 (88 mg) se dále čistí.

5. Dělení na silikagelu; sloupec: průměr 40 mm; délka:

cm.

Sorbent: Lichrosorb Si 100; 7 jua (výrobce: Merck). RozpouStědlový systém: směs dichlormethanu a hexanu 1/1 + + 2 % methanolu.

Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 3 (500 mg) se dále čistí.

6. Dělení na silikagelu; sloupec: průměr 35 mm; délka:

cm.

Sorbent: Lichroprep Si 60; 40-63 (výrobce: Merck). RozpouStědlový systém: dichlormethan lineární gradient za 1 hodinu po směsi dichlormethanu a acetonu 1/1.

- 30 Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 1 (2,4 g) a 2 (400 mg) se dále čistí.

7. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 35 mm; délka:

cm.

Sorbent: HDSIL RP-18; 18-30-60 25-40 ^um (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody 80/20.

Odebírá se 9 frakcí.

Frakce 7 (1,4 g) se dále čistí.

8. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 mm; délka: 25 cm.

Sorbent: Nucleosil 100-7 Ο^θ; 7 Jan (výrobce: Macherey Nagel). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody 70/30.

Odebírá se 7 frakcí.

Frakce 3 (15 mg) se dále čistí.

i

Frakce 7 obsahuje Soraphen N (18 mg).

9. Dělení na obrácené fázi; sloupec: 20,5 mm (průměr); délka: 25 cm.

Sorbent: Nucleosil 100-7 C^g; 7 jun (výrobce: Macherey Na- gel).

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody 65/35.

Odebírá se 7 frakcí.

Frakce 3 obsahuje Soraphen H (7 mg).

- 31 10. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 mm; délka: 25 cm.

Sorbent: HDSIL ΙΟΟ-Ο^θ-ΙΟ jita (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 65 : 35.

Odebírají se 4 frakce.

Frakce 2 obsahuje Soraphen D (108 mg).

11. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 40 mm, délka: 30 cm.

Sorbent: Lichrosorb Si 100; 7 jud. (výrobce : Merck). Rozpouštědlový systém: směs dichlormethanu a hexanu v poměru 1:1+1% methanolu.

Odebírá se 9 frakcí.

Frakce 4 (530 mg) a frakce 6 (280 mg) se dále čistí.

12. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 40 mm, délka: 30 cm.

Sorbent: Lichrosorb Si 100; 7 yim (výrobce: Merck). Rozpouštědlový systém: směs dichlormethanu a hexanu v poměru 1:1+1% methanolu.

Odebírá se 8 frakcí.

Frakce 7 (290 mg) se dále čistí.

13. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm; délka: 25 cm.

Sorbent: Nucleosil Si 100-7; 7 jxa (výrobce: Macherey Nagel) Rozpouštědlový systém: směs terc.butylmethyletheru a hexanu v poměru 1:2+1% methanolu.

- 32 Odebírají se 2 frakce.

Frakce 1 (325 mg) obsahuje Soraphen F.

14· Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Nucleosil 100-7 Ο^θ; 7 ý²® (výrobce: Macherey Nagel) Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 68 : 32 Odebírají se 2 frakce.

Frakce 1 obsahuje Soraphen Q (3 mg).

15· Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 mm, délka: 25 cm.

Sorbent: Nucleosil 100-7 Ο-^θ; 7 ýim (výrobce: Macherey Nagel) Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 66 : 34 Odebírají se 4 frakce.

Frakce 1 obsahuje Soraphen C (21 mg).

Frakce 2 obsahuje Soraphen B (230*mg).

16. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Nucleosil 100-7 Ο^θ; 7 ýim (výrobce: Macherey Nagel) Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 65 : 35 Odebírá se 10 frakcí.

Frakce 4 obsahuje Soraphen J (18 mg).

Frakce 9 obsahuje Soraphen E (96 mg).

17. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 mm, délka: 25 cm.

Sorbent: Nucleosil 100-7 Ο^θ; 7 (výrobce: Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Odebírá se 10 frakcí.

Frakce 6 obsahuje Soraphen M (98 mg).

Fyzikálně-chemická charakteristika Soraphenů C až Q:

Sorapen C

Sumární vzorec: θ28^Η42θ8

Mz«, 506

IČ spektrum (film): 3411, 2939, 2831, 1725, 1461, 1382, 1266, 1230, 1187, 1152, 1098, 1068, 1023, 988,

i.

975.

l^c-NMR spektrum (deuterochloroform, hodnoty v ppm)

10,3,

35,8,

83,7,

137,3

11,7, 12,5, 23,0, 26,0, 29,4, 35,2, 35,6,

46,2, 57,3, 57,6, 68,8, 72,5, 74,9, 76,1,

99,4, 125,0, 126,2, 126,2, 128,2, 128,6, 141,0, 170,6.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 8,6 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^g, (výrobce: Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min; rozpouštšdlo/ý systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: UV záření 210 nm.

- 34 Soraphen D

Sumární vzorec: ^γΗ^Οθ.

Mz: 494.

IČ spektrum (film): 3411, 2937, 2831, 1733, 1461, 1432, 1382, 1359, 1328, 1268, 1208, 1195, 1096, 1050,

988, 933.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty <f v ppm):

10,7,	14,4,	22,8,	24,3,	25,0.	27,5, 27,7,	31,	6,
35,3,	35,6,	43,2,	57,5,	58,6,	69,1, 70,8,	71,	2,
74,8,	80,7,	82,6,	97,7,	126,4,	, 126,4, 128	,0,	128,6,
128,6,	141,	0, 168	,6.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R+ = 7,4 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil.100-7 Ο^θ, (výrobce: Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min; rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: UV záření 210 nm. _k

Soraphen E

Sumární vzorec: Ο^^Η^^Οθ

Mz: 538.

IČ spektrum (film): 3398, 2939, 2829, 1725, 1451 1430, 1380,

1266, 1235, 1191, .1154, 1102, 1044, 971.

Posuny v ^^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty $ v ppm):

10,3, 10,5, 11,5, 23,0, 25,0, 29,5, 30,0, 35,3,

35,5, 40,2, 46,3, 56,4, 57,4, 58,0, 69,0, 71,3, 71,7, 75,0, 76,3, 80,2, 81,1, 99,9, 126,5, 126,5, 128,1,

128,6, 140,9, 170,9,

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): = 11,8 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ (výrobce: Macherey

Nagel).

Průtok: 1,5 ml/aia: rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: UV záření 210 nm.

Soraphen F

Sumární vzorec: °29^ΗΛ· Mz: 522.

IČ spektrum (film): 3394,	2937,	2827,	1729,	1710,	1461,	1382,
1326,	1314,	1266,	1253,	1232,	1189,	1154,
1104,	1075,	1048,	1021,	994,	971,	907.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty £ v ppm):

10,4,	11,7,	14,1,	23,0,	24,2,	24,2,	28,3,	28,8,
33,3,	34,1,	35,2,	45,7,	57,4,	57,4,	57,9,	69,0,
70,1,	75,9,	76,3,	80,8,	82,1,	99,6,	126,6.	, 126,6,

128,2, 128,6, 128,6, 140,4, 171,8.

Vysoce účinná kapalinová chr omat ografie (HPLC): R_t »

8,1 min.

- 36 Sloupec: 4 χ 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ (výrobce: Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min; rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 75 : 25·

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen H

Sumární vzorec: θ28^42°9* Mzí 522.

IČ spektrum (film): 3444,	2935,	2867,	2833,	1723,	1459,	1409,
1382,	1334,	1270,	1230,	1179,	1156,	1104,
1069,	996,	971.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty v v ppm}:

10.9, 11,6, 14,4, 23,4, 25,0, 28,6, 35,6, 36,3, 45,6,

57,7, 57,8, 67,5, 68,7, 69,2, 73,9, 76,1, 81,7, 100,1,

122.9, 126,0, 126,0, 128,2, 128,7, 128,7, 138,0, 140,6,

171,5.

v .

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ 7,0 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ, (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém : směs methanolu a vody v poměru 65 : 35.

Detekce: záření UV 210 nm.

- 37 Soraphen J

Sumární vzorec: ^2θΗ^^0θ.

Mz: 508.

IČ spektrum (film): 3394, 2939, 2829, 1729, 1461, 1380, 1313, 1270, 1187, 1158, 1100, 1042, 987.

Posuny v ^^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty <fv ppm):

11,5,	13,8,	14,3,	22,5,
35,2,	36,3,	49,3,	57,3,
81,0,	84,6,	98,2,	126,3
141,3	, 172,	5.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ « 8,1 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C-^θ, (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/rain.

Rozpouštědlový systém: směs methánolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm. <

Soraphen M

Sumární vzorec: ^gH^O^.

Mz: 524.

IČ spektrum (film): 3396, 2939, 2831, 1725, 1461, 1380, 1270, 1235, 1191, 1154, 1075, 1048, 994, 971,

898, 850.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty 0 v ppm)

- 38 9,0, 10,4, 11,5, 23,1, 25,3, 28,3, 29,3, 35,1, 35,7,

40.3, 46,5, 57,2, 57,9, 68,8, 68,8, 71,9, 72,9, 74,4,

76.3, 83,8, 99,6, 126,3, 126,3, 128,0, 128,5, 141,2, 171,0 Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ « 8,5 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ, (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen N

Sumární vzorec: Cg^H^O^.

Mz: 536.

IČ spektrum (film): 3444, 2966, 2939, 1731, 1461, 1380, 1309, 1268, 1224, 1164, 1Ó98.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty (Γv ppm):

13.8, 139, 23,3, 23,4, 24,4, 2^,2, 26,3, 26,7, 29,5, 32,1,

36.3, 50,3, 54,5, 57,6, 68,1, 75,2, 78,4, 79,9, 105,7,

125.8, 125,8, 127,5, 128,4, 128,4.

Posuny v ^H-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty v ppm):

0,9 d, 1,05 d, 1,24 d, 5,23 d, 5,85 dd.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R_t * 13,4 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^, (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen Q

Sumární vzorec: θ28^44θ8*

Mz: 508.

IČ spektrum (film): 3448, 2939, 2831, 1733, 1459, 1382, 1330, 1270, 1203, 1098, 1048, 987.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty cTv ppm):

11,5, 14,5, 23,1, 24,9, 26,2, 27,1, 27,6, 31,7, 35,5,

35,9, 39,5, 50,7, 57,4, 58,7, 69,5, 71,3, 71,6, 74,6,

79,4, 81,9, 102,2, 126,6, 126,6, 127,9, 128,4, 128,4, 137,9 168,0.

i

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 7,7 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ, (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

- 40 Příklad H-2

Výroba sloučenin vzorce I

a) Předběžná kultura:

Předběžná kultura se kultivuje v baňce o obsahu 2 litrů vždy s 500 ml kultivačního média ( obsahujícího 0,1 % peptonu z kaseinu, 0,5 % glukózy, 0,05 % hydrátu chloridu vápenatého a 0,05 % heptahydrátu síranu horečnatého) při pH 7,4 bez pufru (nebo s 50 mM pufru HEPES, tj. draselné nebo/a sodné soli 4-(2-hydroxyethyl)piperazin-l-ethansulfonové kyseliny) při 160 otáč kách za minutu a při 30 °C na trepacím stole. Příznivý okamžik k přenosu předběžné kultury do kultury fermentátoru se dosáhne po dvou až třech dnech (horní log-fáze). Místo zde používaného kmene So ce 192 lze použít také některého z dalších pěti kmenů podle předloženého vynálezu nebo kmenu So ce 26 podle evropské patentové přihlášky EP-A-282 455*

b) Fermentace ^k

Fermentátor o obsahu 70 litrů (výrobek firmy Giovanola Freres, Monthey, švýcarsko) s 60 litry stejného kultivačního média se naočkuje 10 litry předběžné kultury. Fermentace se provádí při teplotě 30 až 32 °C. Rychlost míchání činí 500 otáček za minutu, stupeň provzdušňování činí 0,12 litrů na 1 litr média a hodinu. Doba fermentace činí 7-14 dnů. Poté lze pozorovat, že hodnota pH neklesá pod 7,0, zejména ne pod hodnotu

6,2. Vzniklé makrocyklické sloučeniny vzorce I se nacházejí zčásti v supernatantu kultury a zčásti v buňkách. Tyto sloučeniny se mohou z buněk extrahovat alkoholy nebo ketony (například acetonem); ze supernatantu kultury se extrahují ethylacetátem nebo butylacetátem. Fermentační břečka se poté například pětkrát extrahuje vždy dvěma litry ethylacetátu a vždy po dobu 5 minut. Tyto spojené extrakty se dvakrát promyjí vodou a zahustí se ve vakuu. Zbylý tmavý olej se může rozdělit metodou, která je znázorněna na obr. 2.

Výhodněji se však vzniklé sloučeniny vzorce I odstraní z fermentačního prostředí po ukončení fermentace pomocí adsorbční pryskyřice. Za tím účelem se přidá 0,5 % (objem/objem) pryskyřice v jemně zrnitém stavu (například XAD-1180 nebo XAD-16) do fermentační břečky a směs se míchá 4 hodiny, načež se sloučeniny vzorce I úplně vážou na pryskyřici. Po oddělení fermentační břečky prosátím se pryskyřice propláchne na skleněném sloupci za použití trojnásobného objemu vody a čtyřnásobného objemu methanolu. Eluát se zahustí ve vakuu k suchu. Takovýto eluát nebo takovýto surový extrakt lze zpracovat za použití vhodných dispergátoru nebo/a nosných látek na tržně použitelný prostředek k ochraně rostlin. Surový extrakt lze však rovněž, jak je znázorněno na připojeném obr. 2, rozdělit za účelm izolace jednotlivých Soraphenů A až (F. Zde popsané dělení se provádí za použití 65 g surového extraktu z celkem 400 litrů fermentační břečky.

- 42 Chromatografické čištění (viz: dělení II za účelem izolace Soraphenů)

1. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 200 mm, délka 200 mm.

Sorbent: Lichroprep Si 100; 25-40 ^u¹¹¹ (výrobce: Merck). Rozpouštědlový systém: gradient ve stupních: 1. dichlormethan; 2. až 9. směs dichlormethanu a acetonu v poměru 98 : 2, 96 : 4, 95 : 5, 90 : 10, 85 : 15, 80 : 20, 50 : 50, 25 : 75;

10. až 11. směs dichlormethanu a methanolu v poměru 75 : 25, 50 : 50.

Odebírá se 14 frakcí.

Frakce 2, 3, 5, 6, 7, 8 9, 10, 11 se dále čistí.

2. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 60 mm, délka 100 cm. Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia LK3 GmbH). Rozpouštědlový systém: methanol.

i.

Odebírá se 7 frakcí.

Frakce 3 obsahuje Soraphen A (2,5 g)· v

3. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 30 mm, délka 100 cm. Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia IK3 GmbH). Rozpouštědlový systém: methanol.

Odebírá se 5 frakcí.

Frakce 2 obsahuje Soraphen C (6,6 g).

4. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 30 mm, délka ICO cm.

Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia IKB GmbH), vý systém: /

Rozpouštědlo / aretfianoi.

Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 2 (1 g) se dále čistí.

5. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 37 mm, délka 34 cm. Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 jita (výrobce: Labomatic), Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 72 : 28. Odebírá se 9 frakcí.

Frakce 7 obsahuje Soraphen V (1,1 g).

6. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 30 mm, délka 100 cm. Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia LKB GmbH). Rozpouštědlový systém: methanol.

Odebírají se 4 frakce.

Frakce 2 (1,1 g) se dále čistí.

7. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 30 mm, délka 100 cm. Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia LKB GmbH). Rozpouštědlový systém: methanol. *

Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 2 (0,54 g) a 3 (0,18 g) se dále čistí.

8. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 30 mm, délka 100 cm. Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia IXB GmbH). Rozpouštědlový systém: methanol.

Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 2 (0,3 g) a 3 (1,3 g) se dále čistí.

9. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 60 mm, délka 100 cm. Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia LKB GmbH). Rozpouštědlový systém: methanol.

Odebírá se 7 frakcí.

Frakce 2 (3,3 g) se dále čistí.

10. Gelová chromatografie; sloupec: průměr 60 «mm, délka 100 cm. Sorbent: Sephadex LH-20 (výrobce: Pharmacia LKB GmbH). Rozpouštědlový systém: methanol.

Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 2 (6,1 g) se dále čistí.

11. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 37 mm, délka 34 cm. Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 75 ί 25. Odebírá se 8 frakcí.

Frakce 5 obsahuje Soraphen D (40 mg).

Frakce 7 obsahuje Soraphen B (0,5 g).

12. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 35 mm, délka 45 cm. Sorbent: HDSIL RP-18; 18-30-60 25-40 pan (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 80 : 20. Odebírá se 10 frakcí.

Frakce 8 obsahuje Soraphen E (30 mg).

Frakce 4 se dále čistí.

v

13. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 37 mm, délka 34 cm. Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 pan (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 75 : 25. Odebírá se 10 frakcí.

Frakce 6 (80 mg) se dále čistí.

Frakce 8 (20 mg) se dále čistí.

14. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 37 mm, délka 34 cm.

- 45 Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 75 : 25. Odebírá se 11 frakcí.

Frakce 5 obsahuje Soraphen X (16 mg).

15· Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 35 mm, délka 45 cm. Sorbent: HDSIL RP-18; 18-30-60 25-40 jxa. (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70/30; . lineární gradient 2 hodiny po methanolu.

Odebírá se 8 frakcí.

Frakce 5 obsahuje Soraphen U (150 mg).

16. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 35 mm, délka 45 cm. Sorbent: HDSIL RP-18; 18-30-60 25-40 ^μ*³¹ (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 75 ί 25; lineární gradient 1 hodinu po 90/10.

Odebírá se 9 frakcí.

Frakce 8 obsahuje Soraphen M (0,93 g).

Frakce 7 (250 mg) se dále čistí.

17· Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 37 mm, délka 34 cm.Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 ýim (výrobce: Labomatic). Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70:30. Odebírá se 13 frakcí.

Frakce 4 (105 mg) se dále čistí.

Frakce 6 obsahuje Soraphen R (20 mg).

Frakce 7 obsahuje Soraphen S (490 mg).

Frakce 8 obsahuje Soraphen T (80 mg).

Frakce 9 (80 mg) se dále čistí.

- 46 18. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 37 mm, délka 34 cm. Sorbent: HDSIL RP-18; 18-20-60 15-25 yim (výrobce: Lebomatic). RozpouStědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30. Odebírá se 14 frakcí.

Frakce 7 (700 mg) se dále čistí.

Frakce 8 (570 mg) se dále čistí.

Frakce 9 obsahuje Soraphen í (120 mg).

19. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm. Sorbent: RP-18 Nucleosil 100-7 Ο^θ; 7 (výrobce:

Macherey Nagel).

RozpouStědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 67 : 33. Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 5 obsahuje Soraphen (11 mg).

20. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

i

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 (výrobce: Macherey Nagel).

směs <.

RozpouStědlový systém: terc.butylmethyletheru a n-hexanu + + methanol 1/2 + 1 % .

Odebírají se 3 frakce.

Frakce 2 obsahuje Soraphen (8 mg.

21. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 (výrobce: Macherey Nagel).

- 47 Rozpouštědlový systém: směs terc.butylmethyletheru a n-hexanu + methanol 1/2 + 1 %.

Odebírají se 2 frakce.

Frakce 2 obsahuje Soraphen 0 (8 mg)

22. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 nm, délka 25 cm.

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 (výrobce: Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs terc.butylmethyletheru a n-hexanu + methanol 1/2 + 5 %·

Odebírá se 7 frakcí.

Frakce 1 obsahuje Soraphen Y (64 mg).

Frakce 4 obsahuje Soraphen o (5 mg).

Frakce 6 obsahuje Soraphen ^(7 mg).

23. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm. Sorbent: RP-18 Nucleosil 100-7 Ο^θ; 7 fun (výrobce: Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 60 : 40. Odebírá se 6 frakcí.

Frakce 2 (35 mg) se dále čistí.

24. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 ^m (výrobce: Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs terc.butylmethyletheru a n-hexanu + methanol 1/2 + 10 %.

Odebírá se 5 frakcí.

- 48 Frakce 2 obsahuje Soraphen <5 (20 mg).

25. Dělení na obrácené fázi; sloupec: průměr 20,5 nim, délka 25 cm. Sorbent: RP-18 Nucleosil 100-7 Ο-^θ; 7 ^um (výrobce:

Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 60 : 40. Odebírá se 9 frakcí.

Frakce 4 (194 mg) se dále čistí.

Frakce 5 (130 mg) se dále čistí.

Frakce 6 (50 mg) se dále čistí.

průměr

26. Dělení na sloupci silikagelu: sloupec: 20,5 mm , délka 25 cm.

7fint;

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7; (výrobce: Macherey Nagel). směs

Rozpouštědlový systém: terč. butylmethyletheru a n-hexanu + + methanol 1/2 + 5 %·

Odebírá se 9 frakcí.

Frakce 4 obsahuje Soraphen P (45 mg).

27· Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7;^ 7 ýam (výrobce:. Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs terč.butylmethyletheru a n-hexanu + methanol 1/2 + 10 %.

Odebírají se 4 frakce.

Frakce 2 obsahuje Soraphen % (26 mg).

28. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 /am (výrobce: Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs terc.butylmethyletheru a n-hexanu + methanol 1/2 + 5 %.

Odebírají se 4 frakce.

Frakce 2 obsahuje Soraphen jx (18 mg).

Frakce 3 obsahuje Soraphen >| (69 mg).

29. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 ýim (výrobce: Machereyl Nagel).

Rozpouštědový systém: směs terc.butylmethyletheru a n-hexanu + methanol 1/2 + 5 %.

Odebírá se 5 frakcí.

Frakce 4 obsahuje Soraphen κ(5,5 mg).

30. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7? 7 ý¹¹¹¹ (výrobce; Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs terc.burylmethyletheru a n-hexanu + methanol 1/2 + 5 %.

Odebírají se 4 frakce.

Frakce 4 (10 mg) se dále čistí.

- 50 31. Dělení na sloupci silikagelu; sloupec: průměr 20,5 mm, délka 25 cm.

Sorbent: Si 100 Nucleosil 100-7; 7 ýim (výrobce: Macherey Nagel).

Rozpouštědlový systém: směs terc.butylmethyletheru a n-hexanu + methanol 1/2 + 5 %·

Odebírají se 2 frakce.

Frakce 1 obsahuje Soraphen Tf (2,2 mg).

Frakce 2 obsahuje Soraphen Z (6,5 mg).

Fyzikálně-chemická charakteristika dalších získaných Soraphenů R až ď

Soraphen V

Sumární vzorec: θ28^42θδ*

Mz: 506.

IČ spektrum (film, S v cm”^): 3394, 294.2, 2900, 2829, 1723,

1461, 1380, 1270, 1233, 1189, 1068, 988, 898, 851.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 9,2 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 ^C18’ (výrobce: Macherey

Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30. Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen X

Sumární vzorec: θ28^Η42θ9’

Mz: 522.

IČ spektrum (film,v cm^-1): 3404, 2941, 1716, 1598, 1461, 1380,

1272, 1233, 1189, 1156, 1100, 1069 988.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ * 4,4 min.

i

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Cjg (výrobce: Macherey

Nagel)

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30. Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen U

Sumární vzorec: ^C29^H44°9Mz: 536.

IČ spektrum (film, v cm^-1): 3386, 3361, 2977, 2939, 2892,

1698, 1461, 1380, 1268, 1185 1096, 1064, 1023, 975, 900

2823,

1152,

840.

- 52 Posuny v ^^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty v v ppm):

10.1, 11,4, 12,2, 31,8, 32,9, 35,2, 38,6, 46,3, 56,0, 57,2,

57,9, 64,2, 68,7, 72,2, 73,3, 76,2, 80,0, 84,5, 99,3, 122,2,

126.1, 126,1, 127,9, 128,4, 140,6, 141,4, 171,7.

Vysoce účňná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 5,2 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 °18> (výrobce: Macherey

Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30. Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen R

Sumární vzorec: ^26^40%*

Mz: 480.

IČ spektrum (film, v cm^-^): 3404, 2937, 1731, 1459, 1430, 1384, 1355, 1330, 1270, 1212, 1110, 1083, 1033, 988.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty <fv ppm): 10,7, 14,5, 22,7, 23,3, 24,8, 27,9, 30,9, 31,8, 35,5, 35,3,

43,4, 58,6, 68,9, 71,0, 72,9, 73,3, 74,6, 80,5, 97,6, 126,5,

126,5, 128,0, 128,6, 128,6, 141,1, 168,8.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ « 5,1 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ, (výrobce: Macherey

Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 7O:3C

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen S

Sumární vzorec: CL„H.„0_o.

40 8

Mz: 492.

IČ spektrum (film, v cm“¹): 3431, 2941, 1720, 1604, 1459, 1426, 1380, 1264, 1187, 1150, 1104, 1062;

977.

Posuny v ¹^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty cf v ppm):

10.5, 11,9, 12,7, 24,9, 26,2, 35,5, 36,2, 36,3, 37,9, 47,5,57.6, 69,5, 73,5, 74,1, 75,8, 76,3, 77,9, 100,6, 125,1,

127,1, 127,1, 128,7, 129,4, 129,4, 138,8, 143,3, 173,8.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 5,9 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ (výrobce: Macherey

i.

Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlo: směs methanolu a vody v poměru 70': 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen T

Sumární vzorec: Ο,,γΗ^Οθ Mz: 494.

IČ spektrum (film, v cm¹): 3427, 2941, 1720, 1461, 1382, 1268, 1191, 1154, 1106, 1068 994, 971.

Posuny v ¹¹C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty $ v ppm):

10,4, H,_7, 14,2, 22,7, 24,8, 25,3, 28,3, 30,6, 32,8, 34,6,

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 6,5 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^g (výrobce: Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouátědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30. Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen

Sumární vzorec: C_o«H._o0 * 27423*

Mz: 506.

IČ spektrum (film, S v cm^-1): 3440, 3311, 2937, 1731, 1600, 1461,

1380, 1340, 1185, 1096, 988, 850.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 6,5 min......Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100- ^{7 C}18 (výrobce: Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouátědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30 Detekce: záření UV 210 nm.

- 55 Soraphen ϊ

Sumární vzorec: C_ooH,_o0,

28“42^v9’

Mz: 522.

IČ spektrum (film, i v cm^-1): 3398, 2939, 1723, 1461, 1382, 1264,

1189, 1152, 1102, 1066, 975. Ffr.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty J* v ppm):

8.6, 10,3, 11,5, 23,6, 25,8, 28,8, 33,9, 35,4, 36,3,

46.6, 54,7, 57,3, 58,1, 59,2, 68,8, 69,3, 73,5, 74,3,

76,2, 83.5, 99,7, 126,1, 126,1, 128,0, 128,6, 128,6,

141,4, 170,4.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 8,4 min. Slo^japec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ, (výrobce: Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlo: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30. Detekce: záření UV 210 nm. ⁴

Soraphen Ί)

Sumární vzorec: ^28^42^3

Mz: 522.

IČ spektrum (film, 4 v cm“¹): 3402, 2971, 2935, 2827, 1733, 1459,

1367, 1181, 1095, 1050, 990, 860.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100- ^{7 C}18- (výrobce: Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen 0

Mz: 520.

IČ spektrum (film, Ό v cm”³·): 3408, 2971, 2935, 2825, 1733, 1459,

1365, 1343, 1181, 1095, 1050, 990,

958, 842, 738.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^. = 16,8 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^g (výrobce: Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methenolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

- 57 Soraphen Y

Sumární vzorec: ^₂γΗ^θΟ^

Mz: 508.

IČ spektrum (film, *4 v cm“¹): 3436, 2937, 1721, 1459, 1376,

1268, 1199, 1114, 1048, 988, 961.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty v ppm):

10,ε, 11,2, 18,ε, 23,0, 23,5, 31,7, 33,4, 36,2,

41,1, 51,1, 61,1, 70,S, 74,6, 76,4, 77,1, 75,7,

95,5, 125,5, 125,5, 127,4, 128,4, 128,4, 142,5,

212,4.

40,6,

86,4,

171,1,

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 16,1 min. Sloupec: 4 x 250 am Nucleosil 100-7 C_lg (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém:směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

k

Soraphen o

Sumární vzorec: ,0_

4^ 5

Mz: 536.

IČ

spektrum (film, v cm“1): 3402,	3361,	2933,	2894,	1708,	1457,
1360,	1269,	1187,	1150,	1096,	1062,
975,	89S,	83S,	765.

5c Posuny v ^C-NLóR spektru (čcuterochloroform, hodnoty υ ί ppm) :

10,4, 11,6, 12,6, 31,7, 33,4, 35,3, 35,7, 38,7, 46,3,

56,3, 57,4, 58,3, 65,7, 69,0, 72,3, 74,2, 76,2, 80,0, £4,8, 99,5, 122,9, 126,3, 126,3, 128,2, 128,6, 128,6,

140,1, 140,7, 170,8.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): = 4,8 rain.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^g (výrobce:

Macherey Kagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systěer.směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen

Sumární vzorec: C„_H.~0_o.

<i7 4^ 3

Kz: 45 2.

ΐδ spektrum (film, *9 v cm^-·¹·) : 3402, 2569, 2933, 1731, 1459, 1367, 1179, 1095, 1050, 990.

Posun;/ v ^C-IUJR spektru (deuterochloroform) hodnoty J v ppm) :

10.4, 11,7, 12,5, 20,1, 26,2, 31,8, 35,2, 35,7, 36,2,

46.4, 57,4, 68,9, 72,3, 73,5, 75,0, 76,1, 76,3, 99,6,

126,2, 126,2, 127,0, 128,1, 128,6, 128,6, 138,3, 141,2,

170,7.

- 59 Vysoce účinné kapalinová chromatografie (HPLC): R. = 4,1 min.

u

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 0_Ί3 (výrobce: uacherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

RozpouStědlový systém: směs methanolu a vody v poměru

30.

Detekce: záření UV 210 na.

Soraphen 5 Sumární vzorec:

^C29^H44°S·

Liz: 536.

3393,	3363,	3301,	2971,	29 33,	2894
1702,	1453,	1378,	1262,	1167,	1150
l Ί ΩΓ* J	? /7 ,	838.

Posuny v '^C-NuP. spektru '.deuterochloroform, hodnoty v ppm): 10,3, 11,5, 12,4, 31,6, 34,2, ‘35,0, 35,5, 38,9, 46,2,

56.1, 57,5, 58,5, 64,3, 55,1, 73,1, 76,1, 77,2, 79,8, '

35.2, 99,7, 121,8, 126,0, 126,0, 128,0, -128,5, 128,5,,

141,9, 142,0, 171,4.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC^-: K = 6,2 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 (výrobce:

Sacherey Nagel).

Průtok : 1,5 al/min.

Rospouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70

30.

Detekce: záření UV 210 nm.

- 60 Soraphen ρ

Sumární vzorec: θ₂7^42θ9* Mz: 510.

IČ spektrum (film, v cm^): 3398,	3363,	3301,	2971,	2933,	2894,
1700,	1453,	1378,	1262,	1187,	1150,
1100,	1064,	979,	898,	838,	765.

Posuny v ^^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty <T v ppm):

8.7, 10,3, 11,4, 23,1, 25,5, 26,4, 32,3, 35,0, 36,1,

40.5, 46,6, 57,2, 68,5, 68,8, 71,8, 73,1, 73,7, 74,3, 76,4,

99.7, 126,3, 127,9, 128,5, 128,5, 141,4, 171,4.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 4,7 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru <

: 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen ’ζ*

Sumární vzorec: 0_2gH^₂0^.

Mz: 522.

IČ spektrum (film, *0 v cm“^·): 3398, 2937, 1718, 1457, 1378, 1332 1272, 1203, 1102, 978.

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty v ppm):

11.8, 21,9, 25,9, 28,7, 36,3, 39,9, 43,0, 45,7, 56,7, 57,4,

58.6, 70,6, 75,5, 76,2, 78,2, 78,2, 84,3, 98,9, 125,9,

125,9, 128,0, 128,4, 128,7, 128,7, 133,1, 141,2, 171,6.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R_t = 3,5 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 0_1θ (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70:30 Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen í

Sumární vzorec:

Mz: 524.

^C28^H44°9*

IČ spektrum (film, v cm”¹): 3423, 2939, 1725, 1459, 1380, 1264 1191, 1154, 1102, 1052, 992, 971

Posuny v ^C-NMR spektru (deuterochloroform, hodnoty<£ v ppm):

10,4, 11,7, 14,1, 21,3, 27,7, 28,2, 30,9, 32,9, 34,1,

35.2, 45,6, 57,4, 60,7, 69,1, 70,0, 70,4, 72,1, 76,2,

76.3, 85,4, 99,6, 126,6, 126,6, 128,2, 128,6, 128,6,

140,2, 172,0.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 4,7. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen *»} ;

Sumární vzorec:

Mz: 522.

IČ spektrum (film, S v cm”^·): 3411, 2935, 1718, 1459, 1382, 1266 1189, 1152, 1104, 1066, 981.

Posuny ^C-NMR spektra (deuterochloroform, hodnoty (Γ v ppm):

10,2,	11,4, 12,3, 31,6, 32,9, 35,1, 35,4, 38,1,	46,2,
57,2,	57,7, 64,0, 68,8, 72,2, 73,7, 74,7, 76,2,	81,2,
99,3,	124,8, 126,1, 126,1, 127,9, 128,4, 128,4,	137,8,

141,1, 171,4.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ « 4,6. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methánolu a vody ve směsi 70 : 30.

Detekce: záření UV 210 nm. _t

Soraphen W

Sumární vzorec:

^C27^H40°8 *

Mz: 492.

IČ spektrum (film, Ú v cm ^): 3411, 2935, 1731, 1461, 1382, 1347, 1270, 1189, 1104, 1048,

990.

- 63 Posuny ^JC-NMR spektra (deuterochloroform, hodnoty £ v ppm):

10.1, 12,1, 12,8, 23,4, 25,4, 33,5, 35,0, 36,1, 37,2,

45,4, 56,1, 70,3, 72,0, 72,7, 74,2, 74,2, 75,6, 99,4,

124.1, 126,2, 126,2, 127,9, 128,5, 128,5, 138,6, 141,3,

171,5.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R_t = 4,7 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ, (výrobce:

Macherey Nagel).

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru

Detekce: záření UV 210	70 : 30. nm.
Soraphen 7Γ
Sumární vzorec: θ27^40θ8’
Mz: 492.		í
IČ spektrum (film, S v cm-^)	: 3396,	3363,	3299,	2969,	2933,
	2694,	1702,	1451,	1378,	1262,
	1167,	1150,	1100,	979.

Posuny ^^C-NMR spektra (deuterochloroform, hodnoty v ppm):

10,3,	12,3, 14,6,	23,4,	25,0,	32,2, 35,6,	36,0,	36,8,
50,4,	55,9, 70,2,	71,2,	73,9,	75,0, 75,5,	98,3,	125,2
126,2	, 126,2, 128.	,1, 128,6, 128,6, 137,8,	141,0	, 171,

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): R^ = 4,9 min. Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 Ο^θ, (výrobce:

Macherey Nagel).

- 64 Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru 70 : 30

Detekce: záření UV 210 nm.

Soraphen Z

Sumární vzorec: ^C28^H42°9’

MZ: 522.

IČ spektrum (film, S v cm“¹): 3405, 2937, 1718, 1459, 1380, 1266,

1189, 1152, 1104, 1069, 987, 902,

850, 813, 738.

Vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC): = 7,7 min.

Sloupec: 4 x 250 mm Nucleosil 100-7 C^_Q (výrobce: Macherey

Nagel).

v .

Průtok: 1,5 ml/min.

Rozpouštědlový systém: směs methanolu a vody v poměru : 30.

Detekce: záření UV 210 nm.

Na základě rentgenové strukturní analýzy Soraphenu A a shora zjištěných údajů se pro Sorapheny C až Q předpokládají následující prostorové struktury vyjádřené vzorci IC až IQ :

(ic')

OH

(ID') (IE')

(IF')

(IH*) (IJ*)

(IM')

(IN*)

Pro zbývající sloučeniny IR*, IS*, IT*, IU*, IV*, IX* IY*, IZ*, Ιβ*, iy, I<P, Ις*, Ιη', Ικ*, 1/, I<j' a 1(0* se předpokládají podobné konfigurace.

Pro Soraphen 1^* je pravděpodobná následující konfigu race:

- 69 Pro Sorapheny o, 7Γ a <T není konfigurace zajištěna. Kromě toho je zřejmé, že jednotlivé Sorapheny jsou navzájem epimerní. Soraphen <T je epimerní vůči Soraphenu C; Sorapheny K a jsou epimerní navzájem a vůči Soraphenu S a totéž platí pro Sorapheny U, o a ď . Závazné jsou v každém případě naměřené hodnoty zjištěné pro určitou sloučeninu vzorce I, které, jak je odborníkovi známo, někdy nedovolují přesné zařazení k určité konfiguraci.

Jak bylo uvedeno, zahrnuje vynález veškeré steroisomerní formy jednotlivých uvedených sloučenin vzorce I, jakož i jejich výrobu a jejich použití k potírání chorob rostlin popřípadě k prevenci chorob rostlin. Dále pak se vynález týká zejména také sloučenin vzorců IC' až I ď* na základě jejich fyzikálně-chemických dat, pro které, se předpokládají shora uvedené konfigurace.

Nutno dbát na to, že mskrocyklické Sorapheny vzorce I se obvykle vyskytují v uvedené hemiacetalové formě, přičemž však tato forma může dovolovat reversibilní otevření kruhu podle následujícího schématu:

Vždy podle výrobního způsobu popřípadě pracovní metodiky vznikají v závislosti na hodnotě pH a rozpouštědle Sorapheny jedné nebo druhé formy nebo jako směs obou forem. Charakteris tickým pro otevření kruhu je posun signálu ^C-NMR spektra v poloze 3 a signály ^H-NMR spektra v určitých jiných polohách. U

Soraphenu A lze pozorovat například- následující změny:

^JC-NMR spektrum (deuterochloroform, hodnoty cP v ppm):

99,5-?203,l (3-C) . ^H-NMR spektrum Cdeuterochloroform, hodnoty $ v ppm): 3,14->3,72 (2-H); 3,18—>4,5 (4-H);

3,83->3,16 (7H); 5,86->5,7 (17 H). Podobné posuny lze pozorovat také v případě Soraphenů B až p . Vzorec I podle předloženého vynálezu zahrnuje zásadněf3-hemiacetalovou formu, výhodnou při nízkých hodnotách pH,tak i rovněž otevřenou 3-keto-7-hydroxyformu.

- 71 2. Příklady prostředků pro jednu nebo několik účinných látek vzorce I (% = procenta hmotnostní)

Účinná látka znamená v následujících příkladech jeden ze Soraphenů v čisté formě nebo několik Soraphenů C až 6*nebo elUát získaný z mikrobiologické výroby v kapalné formě nebo ve formě vysušeného zbytku, obsahující nerozdělené celkové množství Soraphenů.

2.1 Emulzní koncentráty účinná látka vápenatá sůl dodecylbenzensulfonové kyseliny polyethylenglykolether ricinového oleje (36 mol ethylenoxidu) tributylf enyijéthylenglykolether (30 mol ethylenoxidu) cyklohexanon směs xylenů

Z takovýchto koncentrátů se

a) b) c) % 40 % 50 % % 8 % 6 %

- 12 % . 4 % % 20 % % 25 % 20 % mohou ředěním vodou vyrábět emulze každé požadované koncentrace.

2.2 Roztoky účinná látka ethylenglykolmonomethylether

a.

b)

c)

d) % 10 % 5 % 95 % %

polyethylenglykol (molekulová hmotnost 400)

N-methyl-2-pyrrolidon epoxidovaný kokosový olej benzin (teplota varu v rozsahu od 160 do 190 °C) %

% % 5 % %

Tyto roztoky jsou vhodné minimálních kapek.

pro aplikaci ve formě

2.3 Granuláty účinná látka kaolin vysocedispersní kyselina mičitá attapulgit

a) b) < 5 % 10 % %

kre1 % %

tfčinná látka se rozpustí v methylenchloridu, roztok se nastříká na nosnou látku a rozpouštědlo se potom odpaří za sníženého tlaku.

2.4 Popraš a) b) účinná látka 2 % 5 % vysocedisperzní kyselina křemičitá 1 % 5 % mastek 97 % kaolin - 90 %

Důkladným smísením nosných látek s účinnou látkou se získá přímo upotřebitelná popraš. Tsi se dá dalším přidáním uvedených tří nosných látek rozemlít na popraš pro přímé upotřebení o koncentraci 0,001 % účinné látky.

2.5 Smáčitelné prášky účinná látka sodná sůl ligninsulfonové kyseliny natriumlaurylsulfét aatriumdiisobutylnaftalensulfonát oktylfenolpolyethylenglykolether (7 až 8 mol ethylenoxidu vysocedispersní kyselina křemičitá

a) b) c) % 50 % 75 % % 5 % % 5 % % 10 % %

% 10 % kaolin % 27

- 74 Účinná látka se dobře promísí s přísadami a směs se dokonale rozemele ve vhodném mlýnu. Získá se smáčitelný prášek, který lze ředit vodou na suspenze každé požadova né koncentrace.

2.6 Obalovaný granulát účinná látka 3 % polyethylénglykol (molekulová hmotnost 200) 3 % kaolin 94 %

Jemně rozemletá účinná látka se v rnísiči rovnoměrně nanese na kaolin zvlhčený polyethylenglykolem. Tímto způsobem se získá obalovaný granulát, který je prostý prachu.

2.7 Suspenzní koncentrát: * účinná látka 40 % ethylenglykol ^ť 10 % nonylfenolpolyethylenglykolether (15 mol ethylenoxidu) 6 % sodná sůl ligninsulfonové kyseliny 10 % karboxymethylcelulóza 1 %

37% vodný roztok formaldehydu 0,2 silikonový olej ve formě 75% vodné emulze 0,8 % voda %

- 75 Jemně rozemletá účinná látka se důkladně smísí s přísadami. Takto se získá suspenzní koncentrát, ze kterého se mohou vyrábět ředěním vodou suspenze každé požadované koncentrace.

2.8 Koncentrát biomasy

Biomasa vznikající z produkční kultury se vysuší, rozemele se a smísí s ethylenglykolmonomethyletherem v hmotnostním poměru 80 : 20. Takovýto koncentrát se dá ředit libo volně vodou na postřikové suspenze.

3. Příklady ilustrující biologickou účinnost na rostlinách (V následující části znamená výraz účinná látka jeden ze Soraphenů C až podle předloženého vynálezu)

Příklad 3.1 <

Účinek proti rzi travní (Puccinia graminis) na pšenici

a) Reziduálně-protektivní účinek <

Rostliny pšenice se 6 dnů po zasetí postříkají postřikovou suspenzí (0,02 % účinné látky) připravenou z účinné látky ve formě smáčitelného prášku. Po 24 hodinách se ošetřené rostliny infikují suspenzí uredospór houby. Po inkubaci trvající 48 hodin při 95 až 100% relativní vlhkosti vzduchu a při teplotě asi 20 °C se infikované rostliny umístí do skleníku, kde se ponechají při teplotě asi 22 °C. Posouzení vývoje kupek rzi se provádí 12 dnů po infekci.

- 76 b) Systemický účinek

Rostliny pšenice se 5 dnů po zasetí zalijí suspenzí účinné látky (0,002 % účinné látky, vztaženo na objem půdy), která byla připravena ze smáčitelného prášku. Po 48 hodinách se ošetřené rostliny infikují suspenzí uredospór houby. Po inkubaci trvající 48 hodin při 95 až 100% relativní vlhkosti vzduchu a při teplotě asi 20 °C se infikované rostliny umístí do skleníku, kde se udržují při teplotě asi 22 °C. Posouzení vývoje kupek rzi se provede 12 dnů po infekci.

Při obou těchto pokusech bylo napadení houbou v důsledku použití účinné látky zcela potlačeno.

Neošetřené, avšak infikované kontrolní rostliny, vykazovaly naproti tomu 100% napadení houbou Puccinia.

Příklad 3.2 k

Účinek proti plísni bramborové (Phytophthora infestans) na rostlinách rajských jablíček

a) Reziduálně-protektivní účinek

Rostliny rajských jablíček se po třítýdenním pěstování postříkají postřikovou suspenzí připravenou ze smáčitelného prášku účinné látky ( koncentrace postřikové suspenze činí 0,02 % účinné látky). Po 24 hodinách se ošetřené rostliny infikují suspenzí sporangií houby. Posouzení stupně napadení

- 77 houbou se provádí po inkubaci infikovaných rostlin trvající 5 dnů při teplotě 20 °C a při 90 až 100% relativní vlhkosti vzduchu.

b) Systemický účinek

Rostliny rajských jablíček se po třítýdenním pěstování zalijí suspenzí účinné látky (koncentrace 0,006 % účinné látky vztaženo na objem půdy) připravenou ze smáčitelného prášku účinné látky. Přitom se dbá na to, aby postřiková suspenze nepřišla do styku s nadzemními částmi rostlin. Po 48 hodinách se ošetřené rostliny infikují suspenzí sporangií houby. Posouzení stupně napadení houbou se provádí po inkubaci infikovaných rostlin, která trvá 5 dnů při 90 sž 100% relativní vlhkosti vzduchu a při teplotě 20 °C.

Při obou těchto pokusech nebylo při vyhodnocení pozorováno žádné napadení houbou, zatímco infikované kontrolní rostliny byly zcela napadeny.

Příklad 3.3

Účinek proti peronospóře révy vinné (Plasmopara viticola) na vinné révě

Reziduálně-protektivní účinek

Semenáčky révy vinné se ve stádiu 4 až 5 listů postříkají postřikovou suspenzí obsahující 0,006 % účinné látky. Postřiková suspenze byla připravena ze smáčitelného práš- 78 ku účinné látky. Po 24 hodinách se ošetřené rostliny infikují suspenzí sporangií houby. Po inkubaci trvající 6 dnů a probíhající při teplotě 20 °C a při 95 až 100% relativní vlhkosti vzduchu se posoudí stupen napadení houbou.

Na rozdíl od neošetřených, avšak infikovaných kontrolních rostlin, které vykazovaly 100% napadení houbou, nedošlo u rostlin ošetřených účinnou látkou I k žádnému napadení.

Příklad 3.4

Účinek proti Cercospora arachidicola na rostlinách podzemnice olejné

Rezdiuálně-protektivní účinek

Rostliny podzemnice olejné o výšce asi 10 až 15 cm se postříkají suspenzí (0,006% účinné látky) připravenou ze smáčitelného prášku účinné látky a o 48 hodin později se infikují suspenzí konidií houby. Infikované rostliny se poté po dobu 72 hodin inkubují při teplotě asi 21 °C a při vysoké relativní vlhkosti vzduchu a potom se umístí do skleníku až do výskytu typických skvrn na listech. Posouzení fungicidního účinku se provádí 12 dnů po infekci na základě počtu a velikosti vyskytujících se skvrn.

Rostliny ošetřené účinnou látkou I nevykazují žádné napadení. Rostliny ošetřené Soraphenem A nevykazovaly na konci vyhodnocování žádné napadení ani při použití koncentrace postřikové suspenze 0,002 %. Neošetřené, avšak infikované kontrolní rostliny vykazovaly naproti tomu 100% napadení houbou Cercospora.

Příklad 3.5

Účinek proti strupovitosti jabloní (Venturia inaequalis) na jabloňových výhoncích Reziduálně-protektivní účinek

Jabloňové semenáčky s čerstvými výhonky dlouhými 10 až 20 cm se postříkají postřikovou suspenzí (0,02 % účinné látky) připravenou ze smáčitelného prášku účinné látky. Po 24 hodinách se ošetřené rostliny infikují suspenzí konidií houby. Rostliny se potem inkubují po dobu 5 dnů při 90 až 100% relativní vlhkosti vzduchu a po dobu dalších 10 dnů se ponechají ve skleníku při teplotěi20 až 24 °C. 15 dnů pc infekci se posoudí stupeň napadení strupovitosti jabloní.

Semenáčky ošetřené účinnou látkou nevykazují žádné napadení, zatímco kontrolní rostliny vykazují 100% napadení .

Příklad 3.6

Účinek proti plísni šedé (Botrytis cinerea) na jablkách !<??·/'ahiálnž— PToÝak.-fivm ItCiKClé

Umělou cestou poškozená jablka se ošetří tak, že se na místa poranění nakape suspenze účinné látky (0,02 % účinné látky), která byla vyrobena ze smáčitelného prášku účinné látky. Ošetřené plody se potom inokulují suspenzí spor plísně šedé (Botrytis cinerea) a po dobu 1 týdne se inkubují při vysoké relativní vlhkosti vzduchu a při teplotě asi 20 °C.

Při vyhodnocování pokusu se spočítají místa, která byla poraněna a jsou napadená hnilobou a na základě tohoto údaje se odvodí fungicidní účinek testované látky.

Účinná látke zcela potlačuje růst houby. Neošetřené avšak infikované kontrolní rostliny vykazují naproti tomu 100% napadení plísní šedou.

Příklad 3.7

Účinek proti padlí travnímu (Erysiphe graminis) na ječmeni

a) Reziduálně-protektivní účinek *

Rostliny ječmene o výšce asi 8 cm se postříkají suspenzí (0,006 % účinné látky), která byla připravena ze smáčitelného prášku účinné látky. Po 3 až 4 hodinách se ošetřené rostliny popráší konidiemi houby. Infikované rostliny ječmene se potom umístí do skleníku při teplotě asi 22 °C a po 10 dnech se posoudí napadení houbou.

b) Systemický účinek

Rostliny ječmene o výšce asi 8 cm se zalijí suspenzí (0,002 % účinné látky, vztaženo na objem půdy), která se připraví ze smáčitelného prášku účinné látky. Přitom je nutno dbát na to, aby suspenze při zalévání nepřišla do styku s nadzemními částmi rostlin. Po 48 hodinách se ošetřené rostliny postříkají konidiemi houby. Infikované rostliny ječmene se potom ponechají ve skleníku při teplotě asi 22 C a po 10 dnech se posoudí stupen napadení houbou.

Účinná látka potlačuje zcela při obou pokusech napadení padlím travním. Kontrolní rostliny vykazují 100% napadení.

Příklad 3.8

Účinek proti kořenomorce bramborové CRhizoctonia solani) (houba napadající rostliny rýž.e z půdy)

Protektivně-lokální účinek při půdní aplikaci

Rostliny rýže staré 12 dnů se zalijí suspenzí připrai vénou z účinné látky zpracované ve formě prostředku (koncentrace účinné látky 0,02 %), aniž by byly kontaminovány nadzemní části rostliny. Za účelem infekce ošetřených rostlin se povrch půdy zamoří suspenzí mycelia a sklerocií kořenomorky bramborové (Rhizoctonia solani). Po 6-denní inkubaci při teplotě 27 °C (den), popřípadě 23 °C (noc) a při 100% relativní vlhkosti vzduchu v klimatizované komoře se posoudí napadení houbou na listové pochvě, listech a stonku.

Po ošetření účinnou látkou nedošlo k žádnému napadení, zatímco infikované kontrolní rostliny vykazovaly 100% nspadení houbou Rhizoctonia solani.

JVDt, Ivan &0R2ČEK

Advokátní a patentová kancelář

110 00 Praha I. Jungtnannova 16 tel.: 26 14 68 - 82 -

Claims (10)

PATENTOVÉ NÁROKY; ~

1. Způsob mikrobiologicky probíhající výroby sloučenin obecného vzorce I v kultivačním prostředí obsahujícím alespoň vždy jeden asimilovatelný zdroj uhliku a zdroj dusíku, jakož i odpovídající anorganické soli.

ve kterég je makrocyklický kruh buň nasycen nebo obsahuje dvojnou vazbu libovolně v poloze 8, 9* 9, 10 nebo 14, 15 podle následující kombinace substituerrtů a substituenty R^, R₂, R^, R₄, Rg. A, Β, X a Y jsou přítomny v následujících kombinovaných významech

Sloučenina ^R1 ^R2 ^R3 ^R4 ^R5 A B X Y dvojná vazba A 0CH₃ ^CH3 ch₃ H H ch₃ H H H Δ 9,10 B OH CH3 ch₃ H H ch₃ H H H — C OH ^CH3 ^CH3 H H ^CK3 H H H D OH ch₃ ^CH3 H H H H H H —

Slou- R, R_o R, R R_ A Β X Y dvojná čeni- ¹ * ^{ó 4 13} vazba na

E OCH₃ ch₃ ^CH3 H H ^CH3 H OH H — F och₃ ch₃ ^CH3 H H ch₃ H H H — H och₃ ch₃ H H H ch₃ H H OH Δ8.9 0 och₃ H ch₃ H H ^CH3 H H H — M OH ch₃ ^CH3 H H ^CH3 H OH H — N OH ch₃ ^CH3 H H ^CH3 H H och₃ £9,10 Q och₃ ch₃ ^CH3 H H H H H H — R OH ch₃ H H H H H H H -- S OH ch₃ H H H ch₃ H H H Δ 9,10 T OH ch₃ H H H ch₃ H H H -- u och₃ ch₃ ch₃ OH H ch₃ H H H £9,10 v och₃ ch₃ H H H ch₃ H H H Δ9,1Ο X OH ch₃ H H OH ch₃ H H H Λ 9,10 Y 0 ch₃ H H H ch₃ H OH H -- z 0CH₃ ch₃ H OH H ch₃ H H H Δ9.10 15 och₃ ch₃ ch₃ H H ch₃ H H H Δ 9.10 z OH ch₃ ^CH3 H H ^CH3 H 9,10 -epoxy — — z OH ch₃ ^CH3 H H ch₃ H H H ^9,10 ζ OH ch₃ ch₃ H H ch₃ OH H H £>9,10 OH ch₃ ^CH3 OH H ch₃ H H H Δ9.10 OH ch₃ H H H ch_3í H H H _Δ9,10 ť och₃ ch₃ H H H ch₃ H H OH * * Μ OH ^CH3 ch₃ H H ch₃ H OH H A 14.15 f OH ch₃ H H H ch₃ H H H A 9,10 o och₃ ch₃ ^CH3 OH H ch₃ H H H A 9,10 OH ch₃ H H H ch₃ H H H Δ 9.10 f OH ch₃ H H H ch₃ H OH H — — ď och₃ ch₃ ch₃ OH H ch₃ H H H Δ 9,10 jakož i jejich stereoisomerú, v V z n a Č u j í c i s e tím , že se za aerobních podmínek kultivuje libovolně některý

nen zvolený ze souboru., který je tvořen kmenv orangium cellulosum So ce 26 (NCIB 12411),

So ce 170' So ce 191' orangium cellulosum So ce 139' orangium cellulosum orangium cellulosum orangium cellulosum So ce 192' orangium cellulosum So ce 231' orangium cellulosum So ce 242 (DSM 5414), ři teplotě od 10 do 40 °C v přítomnosti nebo nenřítomnost (DSM 5397), (DSM 4795), (DSM 4796), (DSM 4797), (DSM 5393) nebo absorbční pryskyřice, poté se kultivační .prostředí popřípadě odfiltrovaná adsorbční pryskyřice extrahuje vhodnou rozpouštědlovou fází, získaný roztok se zahustí a poté se získaný zbytek, pokud je to žádoucí, čistí chromatografii nebo/a překrystalováním s podmínkou, že kmene So ce 26 (NCIB 12411) se nepoužívá pro získáni sloučenin vzorce IA a IB.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující s θ t í m, že se fermentace provádí při teplotě 10 až 35 °C za použiti některého z kmenů

Só ce 170 (DSM 4795),

So ce 191 (DSM 4796) a

Só ce 192 (DSM 4797).

3. Reakční produkty vzorce IA až IB získané postupem podle nároku 1.

4. Makrocyklickó sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 a jejich stereoisomery v čisté formě s výjimkou sloučeniny IA a IB.

i

5. Sloučenina vzorce IC podle nároku 4.

6. Sloučenina IY a sloučenina Ij» podle nároku 1 v v čisté formě.

7. Prostředek k potíráni chorob rostlin popřípadě k prevenci chorob rostlin, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje reakční produkt vzorce I postupu podle nároku 1 s výjimkou sloučenin IA a IB.

8. Použití obecných reakčních produktů získaných postupem podle nároku 1 k potírání chorob rostlin popřípadě k prevenci chorob rostlin s výjimkou sloučenin IA a IB.

9. Použiti podle nároku 8, vyznačuj ící s θ t i m, že reakčními produkty jsou reakční produkty vzorce I nebo jejich stereoisomery.

10. Biologicky čistá kultura zvolená z kmenů

Sorangium cellulosum So ce 139 (DSM 5397),

Sorangium cellulosum So ce 170” (DSM 4795),

Sorangium cellulosum So ce 191(DSM 4796),

Sorangium cellulosum So ce 192 (DSM 4797),

Sorangium cellulosum So ce 231 (DSM 5393) a

Sorangium cellulosum So ce 242 (DSM 5414), která je schopna produkovat alespoň jednu sloučeninu vzorce I podle nároku 1.

JUDr. Ivan XOREČEX

Advokátní a patentová kancelář 11000 Praha 1. Jungtnannova 16

Π-7 7/ i

XAD-ΙΞ

Ti / , Ϊ lít c ( / jfJC.-., jv,_n

Aa-cŘí. j ,□ č. 10

C-'í ^'<aHA 1, žitná 25