PL106032B1 - Sposob wytwarzania nowych merkaptoacylowych pochodnych aminokwasow - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych merkaptoacylowych-pochodnych aminokwasów, stosowanych do redukowania lub lagodzenia nadcisnienia zaleznego u ssaków od angiotensyny.

Angiotensyna II jest czynnikiem silnie zwezajacym naczynia, który jak to wykazano, jest glównym czynnikiem przyczynowym w etiologii nadcisnienia naczyniowonerkowego. Angiotensyna II powstaje z angioten¬ syny I w wyniku oddzialywania enzymu przeksztalcajacego angiotensyne. Angiotensyna I stanowi biologicznie Obojetny dziesieciopeptyd powstajacy w wyniku odszczepienia z angiotensynogenu, bedacego bialkiem krwi, pod wplywem enzymu reniny [Oparil i wsp., New England J. of Med. 291, 389-457 (1974)]. Angiotensynogen i renina takze sa biologicznieobojetne. - Enzym przeksztalcajacy angiotensyne jest takze odpowiedzialny za inaktywacje bradykininy, czynnika rozszerzajacego naczynia, który jak wykazano, bierze udzial w regulacji czynnosci nerek [Erdos, Ciroulation Research, 36,247 1975].

Czynniki hamujace aktywnosc enzymu przeksztalcajacego angiotensyny moga przez to przeciwdzialac podnoszeniu sie cisnienia krwi pod wplywem angiotensyny, poniewaz'wplyw ten zalezy wylacznie od przeksztalcania sie jej w angiotensyne II. Czynniki te mozna stosowac w leczeniu nadcisnienia naczyniowonerko¬ wego i zlosliwego oraz innych postaci nadcisnienia zaleznego od angiotensyny. [Gavras i wsp. New. England J.

Med., 291,817 (1974)].

Wedlug wyzej wspomnianej publikacji Oparila i wsp. angiotensyna II odgrywa zasadnicza role w utrzyma¬ niu homeostazy krazenia u zwierzecia z niedoborem sodu, ale zwierzeciu pobierajacemu normalna ilosc soli angiotensyna II nie jest niezbedna do utrzymania cisnienia krwi na scisle kontrolowanym poziomie. W rozmai¬ tych warunkach wywolujacych stres ukladu renina-angiotensyna, podawanie w scisle dobranych dawkach inhibitora enzymu przeksztalcajacego angiotensyne lub blokera angiotensyny II obniza cisnienie krwi, a takze powoduje wzrost aktywnosci reaniny w osoczu.

W literaturze fachowej ppisano pewne merkaptoacylowe pochodne aminokwasów. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3246025 oraz w opisie patentowym RFN nr 2349707 opisano pochodne2 106 032 merkaptopropionylowe glicyny, uzyteczne przy wzmacnianiu czynnosci watroby oraz jako odtrutki w przypadku zatrucia takimi substancjami toksycznymi jak zwiazki rteci i organiczne zwiazki arsenu. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3897480 opisano N-(a-merkaptoacylo)aminokwasy uzyteczne przy zapobie¬ ganiu i leczeniu zaburzen metabolicznych, takich jak zatrucie metalem ciezkim, zaburzenia powstale w wyniku napromieniowania, cukrzyca lub zapalenie watroby. W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3857951 opisano zastosowanie 2-merkaptopropionyloglicyny i jej soli z metalami alkalicznymi wleczeniu chorób ukladu oddechowego.

Podano, ze dozylne wstrzykniecie znieczulonym szczurom, wykazujacym normalne cisnienie krwi, 2-merkaptopropionyloglicyny, znanej jako czynnik ochrony wtroby, powoduje obnizenie sie cisnienia krwi [(Schulze, Arzneim, Forsch., 22, 1433 (1972)]. Jest to jednak model niepewny [Schwarts, Methods in . Pharmacology, 1.1,125 (1971), Berger, Selected Pharmacological, Testing Methods, t 3 171,194 (1968)].

Natomiast inni badacze donosza o braku wyraznego wplywu na cisnienie krwi, [Fujimura i wsp. Nippon Yakurigaku Zasshi, 60, 278-92 (1964]. Takze Ripa w Proc, Int. Symp. Thiola, Osaka, Japonia, 1970, str. 226—230 podal ze u szczurów wykazujacych normalne cisnienie krwi a-merkaptopropionyloglicyna podnosi poziom angiotensynogenu i obniza poziom reniny we krwi w oparciu o homeostatyczny mechanizm sprzezenia zwrotnego. * Obecnie stwierdzono, ze pewne merkaptoacylowe pochodne aminokwasów sa inhibitorami enzymu przeksztalcajacego anigotensyne i po poddaniu ssakom z nadcisnieniem redukuja lub lagodza nadcisnienie zalezne od angiotensyny.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowych merkaptoacylowych pochodnych aminokwasów, o ogólnym wzorze 1, w którym R^ oznacza rodnik niskoalkilowy, fenylo-niskoalkilenowy, hydroksy-niskoalkilenowy, hydroksyl- nyloniskoalkilowy, amino-niskoalkilenowy, guanidyno-niskoalkilenowy, indolilo-niskoalkiknowy, merkapto-nis- koalkilenowy, niskoalkilomerkapto-niskoalkilenowy lub karbamoilo-niskoalkilenowy, R2 oznacza atom,wodoru lub rodnik niskoalkilowy, R3 oznacza atom wodoru rodnik niskoalkilowy lub fenyloniskoalkilenowy, R4 oznacza atom wodoru, rodnik niskoalkanoilowy, benzoilowy lub ugrupowanie o wzorze 2 lub ich soli. We wzorze 1 gwiazdkami oznaczono centra asymetrii.

Stosowanie zwiazków wedlug wynalazku redukuje lub lagodzi nadcisnienie zalezne od ukladu renina-angi- otensyna u ssaków, takich jak szczury, psy i inne. Postaciami nadcisnienia zaleznego od ukladu renina-angiotensy- na sa na przyklad nadcisnienia naczyniowonerkowe i nadcisnienie zlosliwe. Ssakom cierpiacym na nadcisnienie zalezne od ukladu renina-angiotensyna, podaje sie skuteczna ilosc inhibiora enzymu przeksztalcajacego angiotensyne nalezacego do klasy zwiazków o wyzej okreslonym wzorze 1.

Odpowiednimi grupami niskoalkilowymi sa rodniki weglowodorowe o lancuchu prostym lub rozgalezio¬ nym, o nie wiecej niz 7 atmach wegla, takie jak rodnik metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, butylowy, izobutylowy Ill-rzed.-butylowy, pentylowy, izopentylowy, heksylowy, heptylowy itp. Tego samego rodzaju sa grupy niskoalkilenowe. Korzystnymi grupami sa grupy niskoalkilowe o 1—4 atomach wegla i grupy niskoalkileno- we o 1—4 atomach wegla, a zwlaszcza grupy niskoalkilowe o 1—2 atomach wegla i grupy niskoalkilenowe o 1—2 atomach wegla. Do grup fenyloniskoalkilenowych naleza wyzej omówione grupy niskoalkilenowe z przylaczona grupa fenylowa. Szczególnie korzystnymi grupami sa rodniki benzylowy i fenetylowy, a zwlaszcza benzylowy.

Odpowiednimi grupami niskoalkanoilowymi sa rodniki acetylowy, propionylowy, butyrylowy itp. Korzystnymi rodnikami sa rodniki o 2—4 atomach wegla.

Korzystnymi zwiazkami o wzorze ogólnym 1 sa zwiazki pochodzace od, lub zawierajace strukture, nastepujacych aminokwasów: alaniny, leucyny, fenyloalaniny, argininy, sarkozyny, seryny, asparaginy, lizyny, glutaminy, histydyny, tryptofanu, cysteiny, metroniny, treoniny, tyrozyny, elucyny, waliny, lub kwasu asparaginowego, a szczególnie korzystnie argininy, alaniny, fenyloalaniny i leucyny. Korzystnie R4 oznacza atom wodoru.

Doswiadczalnie udowodniono, ze sposród tych zwiazków najsilniejsze dzialanie wywieraja N to-2-metylopropionylo)-L-arginiana, N-a-(3-merkaptopropionylo)-L-arginina, N-(3-merkaptopropionylo)-L-feny- loalanina i N-(3-merkaptopropionylo)-L-leucyna. Zwiazki te stanowia szczególnie korzystna grupe zwiazków wedlug wynalazku o szczególnie korzystnym zastosowaniu.

Wynalazek obejmuje swym zakresem takze sole zwiazków o wzorze ogólnym 1 z róznymi zasadami nieorganicznymi lub organicznymi. Do soli tych naleza sole amonowe, sole metali alkalicznych, takie jak sól sodowa i potasowa, sole metali ziem alkalicznych, takie jak sól wapniowa i magnezowa, sole z zasadami organicznymi, takimi jak dwucykloheksyloamina, benzatyna, hydrabamina i N-metylo-D-glukamina.

Zwiazki wedlug wynalazku zawieraja jeden lub dwa asymetryczne atomy wegla, w zaleznosci od znaczenia podstawnika R3. W wyzej okreslonym wzorze 1 atomy te oznaczono gwiazdka. To tez zwiazki te wystepuja w postaci diastereoizomerów lub mieszanin racemicznych. Wynalazek obejmuje swym zakresem wszystkie te postacie powyzszych zwiazków.106 032 3 Stwierdzono ze dla osiagniecia wyzszego poziomu aktywnosci biologicznej, asymetryczny atom wegla, z którym zwiazany jest rodnik o symbolu Ri, powinien posiadac konfiguracje L, a wiec ten rodzaj stereospecy- fieznosej, który tm wydawal lic oczywisty w dotychczasowych doniesieniach dotyczacych zastosowan pochod¬ nych mefkaptoaeylowyeh aminokwasów. Zwiazki tego rodzaju sa korzystne.

Stopien zahamowania aktywnosci enzymu przeksztalcajacego angiotensyne przez zwiazki owsorze 1, mozna mtayc Jn vitro przy uzyciu enzymu przeksztalcajacego angiotensyne wyizolowanego z pluc królika metoda optaana przez Cuahmana i Cheunga w Biochem. Pharmacol, 20, 1637 (1971) i za pomoca izolowanego preparatu mietai gladkich [E.CKeefe i wsp., Federation Proc, 31,511 (1972)]. W próbach tych zwiazki wedlug wynalazku SiJnte hamuja skurcz powodowany przez angiotenysne I i pobudzaja skurcz powodowany przez bradykinlne.

Po podaniu srodka zawierajacego jeden lub kilka inhibitorów enzymu przeksztalcajacego angiotensyne, lub jego fizjologicznie dozwolonej soli, ssakowi cierpiacemu na nadcisnienie zalezne od angiotensyny, zwiazek ten wlacza sie w sekwencje renina ¦> angiotensyna I -? angiotensyna II, redukujac lub lagodzac objawy chorobo¬ we.

Do zredukowania podwyzszonego cisnienia krwi zaleznego od angiotensyny odpowiednia jest dawka pojedyncza, lub korzystnie, podzielona na 2-4 dziennie, wynoszaca okolo 1-1000 mg/kg/dzien, korzystnie okolo 10—500 mg/kg dzien, a zwlaszcza 30-300 mg/kg/dzien. Wzorem zastosowania pozytecznego modelu zwierzecego do tego rodzaju badan sa doswiadczenia opisane przez S.L-Engela, T.R. Schaefera, M.H.Waugha i R.

Rubina w Ptoc.Soc.Exp.Biol.Med., 143, 483 (1973). Korzystnie srodek podaje sie doustnie, ale mozna takze wykorzystac inne drogi wprowadzania, takie jak podawanie pozajelitowe, podskórne, domiesniowe, dozylne lub dootrzewnowe.

Zwiazki o wzorze ogólnym 1 mozna wytwarzac róznymi metodami. Tiokwas o wzorze Rs COSH, w którym R5 oznacza rodnik niskoalkilowy lub fenylowy, poddaje sie reakcji z kwasem akrylowym o wzorze 3. otrzymujac kwas o wzorze 4, który sprzega sie z aminokwasem o wzorze 5 otrzymujac zwiazek o wzorze 6, który poddaje sie amonolizie, otrzymujac zadany zwiazek o wzorze 7.

W przypadku gdy we wzorze 1, R5 oznacza ugrupowanie o wzorze 2 zwiazek ten stanowi dimer o wzorze 8, otrzymywany za pomoca utlenienia zwiazku o wzorze 7 alkoholowym roztworemjodu.

Zwiazki o wzorze 1 wykorzystuje sie w celu lagodzenia nadcisnienia zaleznego od angiotensyny przez wytworzenie srodka w postaci tabletki, kapsulki lub eliksiru do podawania doustnego. Do podawania pozajelito¬ wego mozna uzyc jalowych roztworów lub zawiesin. Okolo 10-500 mg zwiazku mieszaniny zwiazków o wzorze 1 lub fizjologicznie dozwolonej soli tego zwiazku, laczy sie z farmaceutycznie dozwolonym nosnikiem, zaróbka, lepiszczem, czynnikiem konserwujacym, stabilizatorem, substancja zapachowo-smakowa itp., nadajac postac dawki jednostkowej w sposób przyjety w praktyce farmaceutycznej. Stosuje sie taka ilosc substancji czynnej w srodku farmaceutycznym, która zapewnia otrzymanie dawki we wskazanym zakresie.

Przykladami adjuwantów, które mozna wlaczyc w sklad tabletek, kapsulek itp. sa lepiszcze, takie jak guma tragakantowa, guma arabska, skrobia kukurydziana lub zelatyna, zarobki takie jak jednowodorofosforan wapniowy, czynniki rozsadzajace, takie jak skiobia kukurydziana, skrobia ziemniaczana, kwas alginowy, tip., srodki poslizgowe, takie jak stearynian magnezowy, srodki slodzace, takie jak sacharoza, laktoza lub sacharyna, substancje zapachowo-smakowe, takie jak mieta, olejek z gaulterii rozeslanej lub wisniowy.

W przypadku, gdy postacia dawki jednostkowej jest kapsulka, moze ona poza tym zawierac ciekly nosnik taki jak olej jadalny. Rozmaitych innych substancji mozna uzyc jako substancji powlekajacych lub polepszaja¬ cych wyglad preparatu. Na przyklad tabletki mozna pokryc warstwa szelaku, cukru itp. Syrop lub eliksir moze zawierac zwiazek czynny, sachoroze jako srodek slodzacy, parabanian metylu lub etylu jako czynnik konserwujacy, oraz barwnik i substancje zapachowo-smakowa, taka jak aromat wisniowy lub pomaranczowy.

Srodki do wstrzykiwania w postaci jalowej mozna wytwarzac zgodnie ze zwykla praktyka farmaceutyczna, rozpuszczajac lub zawieszajac skladnik czynny w zwyklym nosniku, takim jak woda do injekcji, naturalny olej roslinny, taki jak olej sezamowy, kokosowy, olej arachidowy, olej z nasion bawelny itp. lub syntetycznym nosniku tluszczowym, takim jak oleinian etylu lub temu podobne. W przypadku koniecznosci mozna w sklad srodka wlaczyc bufory, czynniki konserwujace, przeciwutleniacze itp. Wynalazek objasniaja nastepujace przyklady, w których temperature podano w °C.

Przyklad I.N-(3-merkaptopropionylo)-L-alanina 4,2 g N-(3-benzoilotiopropionylo)-L-alaniny rozpuszczono w mieszaninie 7,5 ml wody i 6 ml stezonego roztworu wodorotlenku amonowego. Po uplywie 1 godziny otrzymana mieszanine rozcienczono woda i przesa¬ czono, po czym przesacz poddano ekstrakcji octanem etylu. Faze wodna zakwaszono stezonym kwasem solnym i poddano ekstrakcji octanem etylu. Faze organiczna przemyto woda, osuszono izatezono do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana pozostalosc poddano krystalizacji z mieszaniny octanu etylu i heksenu, otrzymujac 1,87 g N-(3-merkaptopropionylo)-L-alaniny o temperaturze topnienia 79-81°C.4 106 032 Przykladll. N-(3-merkaptopropionylo)-L-leucyna. Proces prowadzono w sposób jak opisano w przykladzie I, z ta róznica, ze zamiast N-(3-benzoilotiopropionylo)-L-alaniny uzyto 6,47 g N-(3-bcnzoilotiopro- pionylo)-L-leucyny, otrzymujac 2,75 g N-(3-merkaptopropionylo)-L-leucyny o temperaturze topnienia 131—132°C. Otrzymany zwiazek poddano krystalizacji z acetonitrylu.

P r z y k l,a d III. N-(3-merkaptopropionylo)-L-fenyloalanina. 1,7 g N-(3-benzoUotiopropionylo)-L-fenyloalaniny rozpuszczono w mieszaninie 20 ml wody i 5,5 ml 1 normal¬ nego roztworu wodorotlenku sodowego. Do otrzymanego roztworu dodano 20 ml stezonego roztworu wodoro¬ tlenku amonowego, a nastepnie 20 ml wody. Po uplywie 3 godzin mieszanine reakcyjna poddano ekstrakcji octanem etylu, zakwaszono stezonym kwasem solnym i ponownie poddano ekstrakcji octanem etylu. Drugi ekstrakt octanowy przemyto woda, osuszono siarczanem magnezowym i zatezono do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc poddano chromatografii na kolumnie wypelnionej zelem krzemionkowym przy uzyciu mieszaniny benzenu i kwasu octowego, otrzymujac 0,47 g N-(3-merkaptopropionylo)-L-fenyloalaniny o tempera¬ turze topnienia 106-107°C.

Przyklad IV.N-a-(3-merkaptopropionylo)-L-arginina. 1 g N-a-(3-benzoilotiopropionylo)-L-argininy rozpuszczono, energicznie mieszajac w mieszaninie 5 ml wo¬ dy i 5 ml stezonego roztworu wodorotlenku amonowego. Po uplywie 1 godziny otrzymany roztwór poddano ekstrakcji octanem etylu i zatezono do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc poddano chromatogra¬ fii na kolumnie zawierajacej 85 ml DEAE Sephadex, zywicy amonitowej pochodzacej od dekstranu (Mikes, Laboratory Handbook of Chromatographic Methods. Van Nostrand, 1961, str. 328), przy uzyciu buforu stanowiacego 0,005 molowy roztwór wodoroweglanu amonowego. Frakcje, w których wykazano obecnosc N-a-(merkaptopropionylo)-L-argininy na podstawie dodatniego wyniku reakcji tiolowej i Sakaguchi, polaczono i poddano liofilizacji w celu usuniecia wodoroweglanu amonowego, otrzymujac 200 mg zwiazku o temperaturze topnienia 230°C (poczatek rozkladu w temperaturze 200°C).

Przyklad V. N-(3-merkaptopropionylo)sarkozyna Proces prowadzono w sposób jak opisano w przykladzie I, z ta róznica ze zamiast N-(3-benzoilotiopropiony- lo)-L-alaniny uzyto 2,8 g N-(3-benzoilotiopropionylo)-sarkozyny Otrzymany zwiazek przeksztalcono w sól dwucykloheksyloamoniowa, otrzymujac 2,7 g tej soli o temperaturze topnienia 157-158°C, po czym oczyszczo¬ na sól przeksztalcono w wolny kwas, poddajac ja ekstrakcji mieszanina octanu etylu i 10% roztworu wodorosiar¬ czanu potasowego.

P x z y k l a d VI. N-a-(3-acetylotio-2-metybpropionylo)-L-arginina. 2,61 g argininy rozpuszczono w mieszaninie 3,2 g weglanu sodowego i 30 ml wody i otrzymany roztwór oziebiono na lazni z lodem, po czym dodano 2,7 g chlorku 3-acetylotio-2-metylopropionylu i otrzymana mieszanine reakcyjna mieszano w temperaturze pokojowej 1 1/2 godziny. Nastepnie do mieszaniny dodano 50 ml zywicy jonowymiennej AG 50 i otrzymana zawiesine naniesiono na kolumne zawierajaca 80 ml tej samej zywicy. Kolumne przemyto woda, po czym N-a-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-arginine wymyto buforem skladajacym sie z pirydyny i kwasu octowego o pH 6,5. Nastepnie rozpuszczalnik usunieto pod zmniejszonym cisnieniem a pozostalosc rozpuszczono eterem otrzymujac 3,86 g N-a(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-argini- ny o temperaturze topnienia 133°C.

P r z y k l a?d VII. N-a-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-arginina. 1 g N-a-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-argininy rozpuszczono w mieszaninie 5 ml wody i 5 ml stezo¬ nego roztworu wodorotlenku amonowego. Po uplywie 1 godziny w temperaturze pokojowej, otrzymany roztwór zatezono do objetosci 3 ml pod zmniejszonym cisnieniem bez ogrzewania i dodano do niego zywice jonowymien¬ na AG 50 W, az do uzyskania pN okolo 4. Otrzymana zawiesine naniesiono na kolumne zawierajaca te sama zywice i buforem zawierajacym pirydyne i octan o pN 6,5 wymyto N-a-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-argi- nine. Nastepnie usunieto rozpuszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc poddano liofilizacji, otrzymujac 0,86 g zadanego zwiazku o temperaturze topnienia 100°C.

Przyklad VIII. N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-walina. 88 g L-waliny i 40 g weglanu sodowego rozpuszczono w 1 1 wody i otrzymany roztwór, energicznie mieszajac oziebiono na lazni z lodem. Nastepnie dodano 135 g chlorku 3-acetylotio-2-metylopropionylu i roztwór 120 g weglanu sodowego w 500 ml wody w pieciu równych porcjach w ciagu 15 minut. Po uplywie 11/2 godziny otrzymana mieszanine reakcyjna poddano ekstrakcji octanem etylu, po czym faze wodna zakwaszono stezonym kwasem solnym i podano ekstrakcji octanem etylu. Faze organiczna przemyto woda, osuszono siarczanem magnezowym i zatezono do sucha, otrzymujac 190 g N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)- L-waliny.

Przyklad DC. N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-walina. g N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-waliny rozpuszczono w mieszaninie 46 ml wody i 31 ml stezo¬ nego roztworu wodorotlenku amonowego. Po uplywie 1 godziny w temperaturze pokojowej otrzymana106 032 5 mieszanine reakcyjna poddano ekstrakcji octanem etylu, po czym faze wodna zakwaszono stezonym kwasem solnym i poddano ekstrakcji octanem etylu. Nastepnie faze organiczna osuszono siarczanem magnezowym i zatezono do sucha pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 19 g N-(3-merkatpo-2-metylopropionylo)-L-waliny. >' • Przyklad X. N-(3-merkapto-2-metylopropionylo-L-fenyloalanina.

Proces prowadzono w sposób jak opisano w przykladzie VIII, z ta róznica, ze zamiast L-waliny uzyto L-fenyloalaniny, po czym otrzymany zwiazek poddano obróbce w sposób jak opisano w przykladzie IX, otrzymujac N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-fenyloalanine iN-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-fenyloal- anine.

Przyklad XI. N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-treonina.

Proces prowadzono w sposób jak wyzej opisano w przykladzie VIII, z ta róznica^e zamiast L-waliny uzyto L-treoniny, po czym otrzymany zwiazek poddano obróbce w sposób jak wyzej opisano w przykladzie IX, otrzymujac N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-treonine i N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-treonine.

Przyklad XII. N-(3-merkapto-2-metylopropionylo/-L-glutamina Proces prowadzono w sposób jak opisano w przykladzie VIII, z ta róznica, ze zamiast L-waliny uzyto L-glutaminy, po czym otrzymany zwiazek poddano obróbce w sposób jak wyzej opisano w przykladzie IX, otrzymujac N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-glutarnine i N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-glutamine.

Przyklad XIII.N-a-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-lizyna.

Proces prowadzono w sposób jak opisano w przykladzie VIII z ta róznica, ze zamiast L-waliny uzytoJ N-e-III-rzed.-butyloksykarbonylo-L-lizyny, po czym otrzymany zwiazek poddano obróbce w sposób jak wyzej opisano w przykladzie IX otrzymujac N-a-(3-acetylotio-2-metylopropionyk))-N-€-HI-rzed.-butyloksykarbonyk)- L-lizyne i N-a-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-N-€-III-rzed-butyloksykarbonylo-L-lizyne. Otrzymane zwiazki poddano w temperaturze pokojowej w ciagu 15 minut reakcji z kwasem trójfluorooctowym, otrzymujac N-a-(3- -acetylotio-2-metylopropionylo)-L-lizyne iN Przyklad XIV. N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-tyrozyna.

Proces prowadzono w sposób jak wyzej opisaiio w przykladzie VIII, z ta róznica, ze zamiast L-waHny uzyto L-tyrozyny, po czym otrzymany zwiazek poddano obróbce w sposób jak wyzej opisano w przykladzie IX, otrzymujac N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L- tyrozyne i N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-tyrozyne.

Przyklad XV. N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-tryptofan.

Proces prowadzono w sposób jak wyzej opisano w przykladzie VIII, z ta róznica, ze zamiast L-waliny uzyto L-tryptofanu, po czym otrzymany zwiazek poddano obróbce w sposób jak wyzej opisano w przykladzie IX, otrzymujac N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-tryptofan i N—(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L— trypto- fan.

Przyklad XVI. N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-metionina.

Proces prowadzono w sposób jak wyzej opisano w przykladzie VIII, z ta róznica, ze zamiast L-waliny uzyto L—metioniny, po czym otrzymany zwiazek poddano obróbce w sposób jak wyzej opisano w przykladzie IX, otrzymujac N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-L-metionine i N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-metionine.

Przyklad XVII. N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-N-metylo-L-fenyloalanina.

Proces prowadzono w sposób jak wyzej opisano w przykladzie VIII, z ta róznica, ze zamiast L-waliny uzyto N-metylo-L-fenyloalaniny, po czym otrzymany zwiazek poddano obróbce w sposób jak wyzej opisano w przykla¬ dzie IX, otrzymujac N-(3-acetylotio-2-metylopropionylo)-N-metylo)-L-fenyloalanine i N-(3-merkapto-2-metylo- propionylo)-N-metylo-L- fenyloalanine.

Przyklad XVIII. Chlorek kwasu 3-acetylotio-2-benzylopropionowego. 8,1 g kwasu 2-benzyloakrylowego zmieszano z5,3g kwasu tiooctowego i calosc ogrzewano na lazni parowej w ciagu 1 godziny, a nastepnie oziebiano do temperatury pokojowej i dodano 9,75 g chlorku tionylu, po czym otrzymana mieszanine pozostawiono przez noc w temperaturze pokojowej. Nastepnie usunieto pod zmniejszonym cisnieniem nadmiar chlorku tionylu, a pozostalosc poddano destylacji otrzymujac chlorek kwasu 3-acetylotio-2-benzylopropionowego o temperaturze wrzenia (0,05) 120-122°C.

Przyklad XIX.N-a-/3-acetylotio-2-benzylopropionylo/-L-arginina.

Proces prowadzono w sposób jak wyzej opisano w przykladzie VI, z ta róznica, ze zamiast kwasu 3-acetylotio-2-metylopropionowego uzyto chlorku kwasu 3-acetylotio-2-benzylopropionowego, otrzymujac N-a-(3- acetylotio-2-benzylopropionylo)-L-arginie o temperaturze topnienia 253-295°C.6 106 032 P r zy k l a d XX, NL*rginina.

Proce* prowadzono w sposób jak wyzej opisano w przykladzie VII, z ta róznica, ze zamiast N*a-(3-acetylo- tio-2-metylopropionylo)-L-argininy, uzyto N-a-(3-acetylotio-2-benzylo-propionylo)-L-argininy otrzymujac N-cK3-met fcipto«2*benzylopropionylo)-L-arginine o temperaturze topnienia 135°C.

Przyklad XXI. N-a-N-#'-[dwutio-3,3'-bis) 2-metylopropionylo)]-bis-L-arginina.

N-a-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L-arginine rozpuszczono w wodzie i pH otrzymanego roztworu dop¬ rowadzono do 7 za pomoca 1 normalnego roztworu wodorotlenku sodowego. Nastepnie wkroplono 0,5 molowy roztwór jodu w 95% etanolu, otrzymujac pH w zakresie 6-7 za pomoca ostroznego dodawania 1 normalnego roztworu wodorotlenku sodowego. Gdy mieszanina reakcyjna przybrala trwale zólte zabarwienie (5 minut), przerwano dodawanie roztworu jodu, mieszanine reakcyjna odbarwiono za pomoca dodania tiosiarczanu sodowego, po czym roztwór zageszczono pod zmniejszonym cisnieniem do 1/10 objetosci pierwotnej.

Otrzymany roztwór naniesiono na kolumne zawierajaca zywice jonowymienna Dowex 50 i N-a-N-a'^dwutio-3,3- bis-(2-metylopropionylo]-bis-L-arginine wymyto buforem zawierajacym pirydyne o octan o pH 6,5.

Przyklad XXII.N^'-[dwutio-3,3,-bis)2-metylopropionylo]-bis-L-walina.

N-(3-merkapto-2-metylopropionylo)-L^waline rozpuszczono w wodzie i pH otrzymanego roztworu dopro¬ wadzono do 7 za pomoca 1 normalnego roztworu wodorotlenku sodowego. Nastepnie wkroplono 0,5 molowy roztwór jodu w 95% etanolu, utrzymujac pH w zakresie 6-7 za pomoca ostroznego dodawania 1 normalnego roztworu wodorotlenku sodowego. Gdy mieszanina reakcyjna przybrala trwale zólte zabarwienie (5 minut) przerwano dodawanie roztworu jodu i mieszanine reakcyjna pozbawiono zóltego zabarwienia za pomoca dodania tiosiarczanu sodowego. Otrzymany roztwór wodno-alkoholowy zakwaszono 1 normalnym kwasem solnym i poddano ekstrakcji octanem etylu, otrzymujac NJ^'-[dwutio-3,3'-bis-(2-metylopropionylo]-bis-L-walinc.

Przyklad XXIII. Aczkolwiek przeksztalcenie angiotensyny I wangiotensyne II jest prawdopodobnie w patalogii nadcisnienia najwazniejsza reakcja powodowana przez enzym przeksztalcajacy angiotensyne, to aktywnosc izolowanego enzymu dogodniej i dokladniej oznacza sie przez pomiar szybkosci rozczepiania mniej skomplikowanego substratu peptydowego, a mianowicie hipurylo-L-histydylo-L-leucyny.

W celu okreslenia wartosci I50 (stezenie badanego zwiazku wyrazone w /ig/ml^w którym powoduje on • zahamowanie aktywnosci enzymu przeksztalcajacego angiotensyne w 50% do probówek 13 X 100 mm dodawa¬ no kazdy z badanych zwiazków, w róznych stezeniach, a nastepnie nizej wymienione skladniki, w takich stezeniach aby ich stezenia koncowe, w koncowej objetosci 0,25 ml byly równe wskazanym stezeniom 100 mM bufor zawierajacy fosforan potasowy, pH 8,3 300 nM chlorek sodowy, 5 mM hipurylo-L-histydylo-L-leucyna, oraz 5 milijednostek enzymu przeksztalcajacego angiotensyne z pluc królika. Próby kontrolne nie zawierajace inhibitora odpowiadaly 100% aktywnosci, a podobnie przygotowane" próby kontrolne zakwaszone przed dodaniem enzymu odpowiadaly 0% aktywnosci. Wszystkie reakcje enzymatyczne rozpoczely sie w chwili dodania skladnika enzymatycznego. Probówki inkubowano w ciagu 30 minut w 37°C. Zakonczenie reakcji nastepowalo po dodaniu 0,25 ml 1 normalnego roztworu kwasu solnego. Wytworzony z hipurylo-L-histydylo-L- -leucyny wskutek dzialania enzymu przeksztalcajacego angiotensyne kwas hipurowy ekstrahowano octanem etylu, odparowywano do sucha i rozpuszczano w wodzie, po czym mierzono absorbancje przy 228 nm. Procent zahamowania aktywnosci dla kazdego stezenia badanego zwiazku obliczono przez porównanie z próbami kontrolnymi oO i 100% aktywnosci. W tablicy 1 uwidoczniono stezenia reprezentatywnych zwiazków, w których hamowaly one aktywnosc enzymu przeksztalcajacego angiotensyne w 50%.

Tablica 1 ; 41 ^ Zwiazek wytworzonysposobem f opisanym w przykladzie I5 0//ig/ml) I 1,2 II 1,8 III 0,86 IV 0,17 V Uj Przyklad XXIV. Postepowanie przy ocenie zahamowania aktywnosci enzymu przeksztalcajacego angiotensyne I przy uzyciu wyizolowanego jelita swinki morskiej bylo nastepujace: dc plynu Krebsa106 032 7 stanowiacego kapiel o temperaturze 37°C, w której umieszczono wylizolowane jelito swinki morskiej dodano zwiazek badany w róznych stezeniach. Do kapieli tej wprowadzono mieszanine skladajaca sie z 95% C2 i 5% C02 • Po uplywie 2 minut dodano angiotensyne I (25 /ig/ml) i dokonywano pomiaru izotonicznego skurczu.

W tablicy 2 uwidoczniono stezenie reprezentatywnych zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wyna¬ lazku, w których hamowaly one skurczowa aktywnosc angiotensyny I w 50% (IC5 0).

Tablica 2 Zwiazek wytworzony sposobem opisanym w przykladzie Is 0pig/ml) I 0,94 II 2,0 III 0,52 IV 0,9 V 0,94 XX 44 Wzór 1 Ra R2 Ri -S-O-fe- CH-C0-N-CH-C00H Wzór 2 CH2=C-C00H Wzór 3 RsC0-S-CH2-CH-C00H R2 Ri HN-CH-C00H Wzór 5 R3 R2R1 r5co-s-ch2-ch-co-N-(:h-cooh Wzór 6 R3 R2R1 hs-ch2-Ch-co-n-ch-cooh Wzór 7 R3 R2 Ri [s-ch2-ch-co-n-ch-cooh].

Wzór B Prac. Poligraf. UP PRL. Naklad 120 + 18 Cena 45 zl.

Claims (7)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowych merkaptoacylowych pochodnych aminokwasów o wzorze ogólnym 1, w którym Ri oznacza rodnik niskoalkilowy, fenyloniskoalkilenowy, hydroksy-niskoalkilenowy, hydroksyfeny- lo-niskoalkilenowy, amino-niskoalkilenowy, guanidyno-niskoalkilenowy, indolilo-niskoalkilenowy, merkapto-nis- koalkilenowy, niskoalkilomerkapto-niskoalkilenowy lub karbamoilo-niskoalkilenowy, R2 oznacza atom wodoru lub rodnik niskoalkilowy, R3 oznacza atom wodoru, rodnik nisko-alkilowy lub fenylo-niskoalkilenowy, a R4 oznacza rodnik niskoalkanoilowylub benzoilowy, lub ich soli, znamienna tym ze zwiazek o wzorze ogólnym 4, w którym R5 oznacza rodnik niskoalkilowy lub fenylowy a R3 ma wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z aminokwasem o wzorze ogólnym 5, w którym Ri i R2 majj wyzej podane znaczenie i ewentualnie otrzymany zwiazek przeprowadza sie w sól.

2. Sposób wedlug zastrz. 1,znamienny tym, ze stosuje sie substraty w których Ri oznacza rodnik guanidynopropylowy, aminopropylowy, aminobutylowy, fenylometylowy lub izobutylowy, a R2, R3 i R5 maja znaczenie podane w zastrz. 1.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie substraty w których Ri oznacza rodnik fenylometylowy, R a^oznacza atom wodoru, a pozostale podstawniki posiadaja znaczenie podane w zastrz. 1.

4. Sposób wedlug zastrz. 1 znamienny tym, ze stosuje sie substraty, w których Ri oznacza rodnik izobutylowy, R3 oznacza atomwodoru, a pozostale podstawniki maja znaczenie podane w zastrz. 1.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, z n,a m i,e n n.y tym, ze stosuje sie substraty, w których R? oznacza rodnik guanidynopropylowy, R3 oznacza atom wodoru, a pozostale podstawniki maja znaczenie podane w zastrz. 1.

6. Sposób wytwarzania nowych merkaptoacylowych pochodnych aminokwasów o wzorze ogólnym 1, w którym Ri oznacza rodnik niskoalkilowy, fenylo-niskoalkilenowy, hydroksy-niskoalkilenowy, hydroksyfeny- lo-niskoalkilenowy, amino-niskoalkilenowy, guanidyno-niskoalkilenowy indolilo-niskoalkilenowy, merkapto-nis- koalkilenowy, niskoalkileno-merkapto-niskoalkilenowy lub karbamoilo-niskoalkilenowy, R2 oznacza atom wodo¬ ru lub rodnik niskoalkilowy, R3 oznacza atom wodoru, rodnik niskoalkilowy lub fenylo-niskoalkilenowy a R4 oznacza atom wodoru lub ich soli, znamknny tym, ze zwiazek o wzorze ogólnym 4,w którym R5 oznacza rodnik niskoalkilowy lub fenylowy aR3 ma wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z aminokwasem o wzorze ogólnym 5, w którym Ri iR2 maja wyzej podane znaczenie i otrzymany zwiazek poddaje sie amonolizde, otrzymujac zwiazek o wzorze 1 w którym R4 oznacza atom wodoru i ewentualnie otrzymany produkt przeprowadza sie w sól.

7. Sposób wytwarzania nowych merkaptoacylowych pochodnych aminokwasów o wzorze ogólnym 1, w którym Ri oznacza rodnik niskoalkilowy, fenylo-niskoalkilenowy, hydroksyniskoalkilenowy, hydroksyfeny- lo-niskoalkilenowy, amino-niskoalkilenowy, guanidyno-niskoalkilenowy indolilo-niskoalkilenowy, merkapto-nis- koalkilenowy niskoalkilomerkapto-niskoalkilenowy, lub karbamoilo-niskoalkilenowy, R2 oznacza atom wodoru lub rodnik niskoalkilowy, R3 oznacza atom wodoru, rodnik niskoalkilowy lub fenylo-niskoalkilenowy, a R4 oznacza ugrupowanie o wzorze 2, lub ich soli, z n a m i e n n,y tym, ze zwiazek o wzorze ogólnym 4;w którym R5 oznacza rodnik niskoalkilowy lub fenylowy aR3 ma wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z aminokwasem o wzorze ogólnym 5, w którym Ri iR2 maja wyzej podane znaczenie, i otrzymany zwiazek poddaje sie amonohzie i otrzymany zwiazek o wzorze 1, w którym R 4 oznacza atom uwodoru, utlenia sie alkoholowym roztworem jodu otrzymujac produkt o wzorze 1, w którym R. 4 oznacza ugrupowanie o wzorze 2 i ewentualnie otrzymany produkt przeprowadza sie w sól.106 032 R3 R2Ri R4-S-CHz-CH-C0-N-CH-C00H