NO850353L - Fremgangsmaate ved radioaktiv markering av diagnostiske og terapeutiske midler inneholdende et chelatiseringsmiddel - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter ved radioaktiv markering av diagnostiskeog terapeutiske reagenser og vedrører spesielt systemer hvori et metallion bindes til det markerte molekyl gjennom en chelatiserende gruppe.

Bruken av radioaktivt markerte diagnostiske og terapeutiske reagenser er blitt rutinemessig brukt i kliniske og analy-tiske laboratorier over hele verden. Slike radioaktivt markerte forbindelser brukes både in vitro (f.eks. i radioaktive immunologiske måle sy steine r) og in vivo (f. eks. både i diagnostiske billeddannelsesteknikker og i bestrålingstera-piteknikker). 1 begynnelsen var antallet av radioaktive isotoper som kunne knyttes sterkt tii de typiske organiske molekyler som brukes som diagnostiske og terapeutiske reagenser begrenset. Vanskeligheten ved å danne stabile karbon-metall-bindinger forhindret tidlig bruk av mange radioaktive metaller og begrenset gjerne radioaktive isotoper som brukes for å markere organiske molekyler til isotoper av fosfor, karbon, hydrogen og jod. Nylig har et nytt prinsipp gjort det mulig å markere slike reagenser-med metallioner. I dette prinsipp knyttes en chelatiserende rest kovalent til molekylet som er av interesse, og et radioaktivt ion chelatiseres så av de medvirkende grupper til chelatdanneren. Chelatiseringsrestene som generelt er blitt bruk for dette formål tidligere har vært analoger eller derivater av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), selv om mange variasjoner også har forekommet. F.eks. fore-slo i 1968, W.F. Bénisek og F.M. Richards kovalent binding av chelatiserende grupper basert på metylpikotinimidat til et proteinmolekyls aminofunksjon for å lette krystallogra-fisk undersøkelse av proteinstruktur for å binde et metall til chelatiseringspunktet på proteinet [J. Biol. Chem., 2 43, 4267-4271 (1968)]. Likeledes påstås i US-patent nr. 4.043.998 forbindelsen 1-(p-benzendiazonium)etylendiamin tetraeddiksyre, å være et sterkt chelatiseringsmiddel som kan bindes sterkt til proteiner gjennom diazoniumgruppen.

I Science, 209, 295-297 (1980), beskrev B.A. Khaw et al. bruken av et bifunksjonelt chelatiseringsmiddel, dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) for å markere et antistoff med en radioaktiv isotop og etterfølgende bruk av dette markerte antistoff for å gi et bilde av eksperimentelle myokardiale infarkter hos hunner. Metallbindingseffektivi-teten av de resulterende forbindelser var lav, imidlertid,

da tilknytningen foregikk gjennom én av karboksylatgruppe-ne som normalt ville ha tatt del i binding til metallionet. På lignende måte beskrev D.A. Schéinberg og O.A. Gansow i Science, 215 1511-1513 (1982) bruken av DTPA og EDTA analoger kovalent bundet til antistoffer for å gi et bilde av erytroidtumorer hos mus.

Uheldigvis led de radioaktivt markerte materialer som tidligere var tilgjengelige av flere ulemper. Dette gjaldt^spesielt billeddannélsesreagenser og andre molekyler markert med en isotop med høy spesifikk aktivitet. De korte halve-ringstidene for de radioaktive isotoper som brukes og den bestrålings-induserté nedbrytning av de markerte molekyler reduserte sterkt levetiden til disse materialer, og når billeddannélsesreagenser inngikkøktes sterkt graden av foreliggende bakgrunnsstråling. Videre gjorde helserisiko ved at laboranter håndterte disse materialer og risiko i forbindelse med kasting av avfall som oppsto i forskjellige trinn av syntetisk markerte forbindelser håndtering av radioaktivt markerte forbindelser vanskelig.

Typisk, som beskrevet av Schéinberg og Strand i ovennevnte artikkel, kobles gjerne et bifunksjonelt chelat til et mål-molekyl, hvoretter alle tilstedeværende metallioner ble fjernet ved dialyse, gjerne mot en løsning inneholdende che-latiseringsmolekyler med lav molekylvekt, såsom EDTA. De chelat-konjugerte molekyler ble deretter markert med en radioaktiv metall-løsning, hvoretter fritt metall ble fjer net, f.eks. ved ionebytterkromatografi. Det resulterende markerte produkt ble så lagret og senere brukt i den diagno-^stiske eller terapeutiske prosess. Under anvendelse av slike metoder forekom betydelig håndtering av det radioaktive materiale og dannelse av radioaktivt avfall, en ulempe som man ikke har kunnet overvinne ved det som tidligere er kjent.

Foreliggende oppfinnelse frembringer en universell metode som kan brukes for radioaktivt å markere alle diagnostiske eller terapeutiske reagenser med en ligandedel i seg som kan bindes til et radioaktivt metallion. Markeringen fore-går umiddelbart før anvendelsen av reagensen og gir lite eller ikke noe radioaktivt avfall.

Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for radioaktiv markering av et diagnostisk eller terapeutisk molekyl med et radioaktivt metallion, hvor man

(A) kontakter

(1) en ikke-markert terapeutisk eller diagnostisk rea-reagens omfattende

(a) en hovedsakelig ikke-metallisk chelatdel knyttet til (b) en chelatiserende del som hovedsakelig kan chelatisere med det radioaktive metallion, med (2) et ioneoverføringsmateriale som det radioaktive metallion er bundet til og med en bindingsaffinitét for chelatiseringsdelen til det radioaktive metallion, hvor chelatiseringsdelen løses før kontakten, eller chelati^seres med et annet metallion med en bindingsaffinitet til chelatiseringsdelen som er mindre enn bindingsaffiniteten til det radioaktive metallion, hvorved en radioaktivt markert terapeutisk eller diagnostisk reagens dannes ved kontakten, og (B) separerer den radioaktivt markerte terapeutiske eller diagnostiske reagens fra ioneoverføringsmaterialet.

Dertil kan den ovenfor beskrevne markeringsmetode brukes

som det første trinn i en diagnostisk eller terapeutisk prosess, hvoretter prosessens normale trinn utføres på vanlig måte. Slike fremgangsmåter er gjerne radioaktive immunologiske målinger og in vivo diagnostiske og terapeutiske teknikker.

Oppfinnelsen tilveiebringer i tillegg til ovenfornevnte fremgangsmåte forskjellige elementer og bestanddeler som kan brukes særlig i form av sett omfattende disse komponenter og andre komponenter som brukes i de forskjellige fremgangsmåter.

Hovedsakelig er oppfinnelsen basert på den oppdagelse at hvis betingelsene velges riktig, kan risiko som innbefatter radioaktivt avfall og radioaktive produkter reduseres ved å anvendelse en ioneoverføringsprosess som det siste trinn før den endelige bruk av et terapeutisk eller diagnostisk molekyl med en radioaktiv markør. Således unngås nødvendig-heten av å håndtere radioaktivt materiale under fremstil-lingen av et diagnostisk eller terapeutisk molekyl og ikke noe avfallsradioaktivitet dannes i kliniske eller analy-tiske laboratoriemiljøer. Bruk av fremgangsmåten, systemet og bestanddeler av foreliggende oppfinnelse er ubegrensete og innbefatter alle anvendelser av tidligere kjente teknikker som innbefatter radioaktivt markert diagnostiske og terapeutiske molekyler samt all anvendelse som her er beskrevet.

Uttrykkene "terapeutisk eller diagnostisk reagens" slik

de brukes i beskrivelsen og kravene i foreliggende søknad innbefatter enhver substans eller substanser enten alene eller i blandinger som, når de er markert med et radioaktivt metallion kan brukes ved behandlingen av en forstyrrelse i et animalsk legeme eller et menneskelegeme, i en in vivo diagnostisk teknikk som innbefatter et menneske- eller dy^relegeme, eller i en in vitro diagnostisk teknikk for en analytt man ønsker å påvise. Terapeutiske reagenser er gjerne radioaktive legemidler som inneholder 3_emitterende

radioaktive nuklider som brukes for terapeutiske formål. Disse reagenser lokaliseres i patologisk vev og ødelegger

det ved ioniserende stråling. In vivo diagnostiske reagenser er gjerne et gamma-emitterende nuklid som, på grunn av de fysiskalske eller metabolske egenskaper til den molekylært gjenkjennende del av reagenset lokaliseres i et spesifikt organ etter administrering. Diagnostiske bilder som viser organstruktur og/eller -funksjon kan så oppnås ved hjelp av påvisningsanordninger som påviser fordelingen av ioniserende stråling emittert av nuklidet. In vitro diagnostiske reagenser eksemplifiseres ved radioimmunologiske målereagen-ser som brukes meget klinisk. Disse reagenser brukes ved måling av ørsmå mengder av forskjellige biologiske substanser, såsom hormoner.

Diagnostiske og terapeutiske reagenser ifølge oppfinnelsen har to funksjonelt forskjellige deler av molekylet eller mo-lekylkonjugatet (selv om disse i det minste delvis kan ha samme strukturelle deler i noen molekyler). Disse deler er (a) en -hovedsakelig ikke^metallchelatiserende del knyttet til (b) en chelatiserende del som kan chelatisere med det radioaktive metallion som brukes. Med "hovedsakelig ikke-metallchelatiserende del" menes ikke bare molekyldeler som har ikkemetallchelatiserende grupper, men også molekyl^ deler som kan ha bestemte grupper med evne til metallcheta-tisering, men ikke chelatiserer med hovedsakelig mindre affinitet enn del (b), "chelatiseringsdelen".

Spesielt foretrukket blant det "hovedsakelig ikke-metallchelatiserende deler" (a) er slike som er molekylært gjenkjennelige deler. Uttrykket "molekylært gjenkjennelig del" angir enhver molekyldel i det totale molekyl som kan gjenkjennes av et komplementært system eller molekyl i systemet, hvori reagensen brukes. Molekylær gjenkjennelse, slik fagmannen vil oppfatte dette innbefatter ikke-kovalent binding i tre dimensjoner mellom komplementære deler av to molekyler. En molekylært gjenkjennelig del ved en reagens kan være av lav molekylvekt (ca. mindre enn molekylvekt 2.000) eller av høy molekylvekt. F.eks. kan det være en polynukleotid sekvens, slik som RNA eller DNA, som skal gjenkjennes ved sin komplementære sekvens; en antigendel (f.eks. et legemiddel, et pesticid, et metabolitt, en fysiologisk opptredende forbindelse) , som skal gjenkjennes ved sitt tilsvarende monoklonale eller polyklonale antistoff; en antistoffdel som skal gjenkjennes av sitt tilsvarende antigen; en lektindel som skal gjenkjennes av sitt sukker; en sukker-del som skal gjenkjennes av sitt lektin; en hormondel som skal gjenkjennes av sin reseptor; en reseptordel som skal gjenkjennes av sitt hormon; en inhibitordel som skal gjenkjennes av sitt enzym; en enzymdel som skal gjenkjennes av sin inhibitor; en kofaktordel som skal gjenkjennes av et kofaktoren zymbin-dende punkt; en kofaktorenzymbindingspunktdel som skal gjenkjennes av sin kofaktor; en bindingsligande som skal gjenkjennes av sitt substrat og vice versa (f.eks. biotin-avi^din); eller enhver permutasjon eller kombinasjon derav. Blant de vanligste molekylært gjenkjennelige deler er de tre-dimensjonale proteinanordninger i antigener og antistoffer av forskjellige typer, celleveggstrukturene som foreligger i forskjellige celler, og nukleinsyresekvensen som er tilstede i DNA'et og RNA<1>et av organismene. Det er foretrukket i mange omstendigheter at den molekylært gjenkjennelige del enten er en naturlig bestanddel av et biologisk system eller gjenkjennelig av en naturlig bestanddel i et biologisk system. Således vil, i en konkurrerende radioaktiv immunologisk måling som anvender et fast faseantistoff som bin-^der til en naturlig bestanddel tilstede i serumet til et menneske eller dyr, den molekylært gjenkjennelige del fortrinnsvis ha de samme strukturelle trekk som er tilstede i den naturlige bestanddel som den konkurrerte med for binding med antistoffet. I en terapeutisk reagens som er kon-struert for å konsentrere radioaktivitet i et spesifikt vev, ville den molekylært gjenkjennelige del være gjenkjennelig av en naturlig bestanddel av dette vev. Imidlertid er det funksjonen av å være molekylært gjenkjennelig som er viktig fremfor den faktiske struk-^tur. F.eks. kunne den molekylært gjenkjennelige del være en analog eller en kunstig bestanddel som binder sterkere enn enhver naturlig bestanddel i et biologisk system og derfor er mer selektivt for et spesielt vev eller annen bestanddel av et biologisk system. Dessuten kan både den molekylært gjenkjennelige del og bestanddelen som gjenkjenner denne del være fullstendig kunstig, spesielt i en in vitro diagnostisk måling. Som anvendt i foreliggende søknad betyr uttrykket "komplementær substans" den bestanddel som gjenkjenner den molekylært gjenkjennelige del av reagensen, enten den komplementære substans er av ktmstig eller biologisk opp-rinnelse.

Videre behøver den .molekylært gjenkjennelige del bare å være en liten del av de terapeutiske eller diagnostiske reagens og béhøvér videre ikke å svare til et helt molekyl tilstede i noe system. Når f.eks. den molekylært gjenkjennelige del er av proteinkarakter, kan den være en relativt kort se-

kvens av aminosyrer som finnes i en meget større sekvens av aminosyrer som ville være typiske for et hapten eller bindingspunkt som dannet en del av et stort molekyl.

Den andre vesentlige del av reagenset er "chelatiseringsdelen". Chelater ér koordinative komplekser som dannes mellom et metallion og en ligande som inneholder minst to elektron-avgi-vende grupper slik anordnet at en ringstruktur dannes ved koordinering. Spesielt stabile er chelater som inneholder 5- eller 6-leddete ringer. Typiske funksjonelle grupper som inngår i chelatdannelse er syre- eller aniongrupper som stam-mer fra karboksylsyrer, oksimer, hydroksylforbindelser, fe-noler, sulfonsyrer og merkaptaner. Uladete funksjonelle grupper som kan inngå i chelatisering er aminer (primære, sekundære og tertiære), karbonylgrupper, tiokarbonylgrupper, nitrosogrupper og cykliske aminer, slik som typisk foreligger i heterocykliske forbindelser. En ligande som inngår i kom-pleksering kan enten være ladet eller uladet.

Den chelatiserende del av reagensen vil typisk dannes ved omsetning av et derivat av et kjent chelatiseringsmiddel med et molekyl med en del som danner den hovedsakelig ikke-metalliske chelatiserende del av den ferdige terapeutiske eller diagnostiske reagens. Foretrukket er chelatiserende deler som omfatter et diamin, hvori de to amingrupper er substituert med to eddiksyrerester, idet de to aminogrupper og/eller de fire eddiksyregrupper kan avgi et elektronepar til det samme metallion. Aminogruppene vil gjerne være kovalent knyttet til tilstøtende karbonatomer. Foretrukket er derivater av etylendiamintetraeddiksyre og andre chelatiserende - grupper med en bindingskonstant for ethvert radioaktivt metallion som minst er så stort som EDTA's for det samme metallion. Etylendiamintetraeddiksyrederivatet 1,2-diaminocy-kloheksaneddiksyre og dets derivater og analoger er spesielt foretrukne. Med derivater og analoger menes forbindelser med den grunnleggende skjelettstruktur og funksjonelle grupper av disse forbindelser, men som har ytterligere funksjonelle grupper som ikke forhindrer de resulterende forbindelser i å funksjonere som chelatiserende grupper. Typiske chelatiserende molekyler som kan modifiseres under dannelse av den chelatiserende del av reagenset er DCTA, EDTA, vinsyre, a-benzoinoksim, 1,10-fenantrolin og lignende velkjente forbindelser.

Den hovedsakelig ikke-metallisk chelatiserende del av molekylet kan være avledet fra ethvert molekyl med liten eller stor molekylvekt, ethvert molekylkompleks, eller ethvert biologisk system (f.eks. en virus, en celle eller en gruppe av celler). Blant de vanlige molekyler som kan brukes som kilder er aminosyrer, sakkarider, nukleotider, proteiner, polysakkarider, lipopolysakkarider, proteinkomplekser, en-kelt- eller dobbeltkjedete nukleinsyrer eller segmenter derav, hele virus eller virale forbindelser slik som kjer-ner eller kapsler, bakterier, vevceller og lignende. Blant de vanligste proteiner er strukturproteinene, enzymer, immunoglobuliner og fragmenter derav. Blant de vanligste nukleinsyrer er DNA og RNA av forskjellige typer, slik som tRNA, mRNA, r RNA og lignende. Bakterier, enten hele eller fragmenter derav, slik som cellevegger eller andre gjenkjennelige deler, innbefatter både grampositive og gramnegative bakterier. Sopp, alger, virus og andre mikroorganismer (og fragmenter derav) ér også innbefattet i likhet med dyre-(f. eks. pattedyrs) celler innbefattet røde blodceller.

Pordi hovedaspektet ved foreliggende oppfinnelse ligger i

å markere et forutdannet terapeutisk eller diagnostisk molekyl bestående av en ikke-chelatiserende del og en chelatiserende del, er de generelle teknikker for fremstilling av slike molekyler ikke ansett som en del av foreliggende oppfinnelse, selv om visse typer chélatiseringsgrupper og -metoder for å knytte dem til ikke-chelatiserende deler av reagenser er omtalt i senere avsnitt av illustrerende grunner.

Som omtalt i den del av foreliggende søknad som vedrører tek-nikkens stand, er mange terapeutiske og diagnostiske reagenser med chelatiserende deler og ikke-chelatiserende deler allerede kjente. F.eks. beskriver Hnatowich et al., Science, 220, 613-615 (1983) en fremgangsmåte ved kovalent kobling av chelatdannéren dietylentriaminpentaeddiksyre (DPTA) til proteiner, slik som immunoglobuliner. Generelt omsettes et dianhydrid av DTPA med et molekylært gjenkjennelig protein under ukompliserte betingelser. Denne fremgangsmåte kan brukes for å knytte en ligande til ethvert molekyl med en araino- eller hydroksylgruppe eller en lignende nukleofil gruppe. Da mange molekyler allerede inneholder én av disse grupper (og resten generelt lett kan modifiseres slik at de gjør dette), gir dette en generell metode for å knytte en chelatiserende gruppe til ethvert molekyl av interesse. Mange lignende metoder, slik som de som er beskrevet i de angitte henvisninger i avsnittet av søknaden vedrørende tek-nikkens stand, beskriver ytterligere ligander og fremgangsmåter for å modifisere andre molekyler med dem.

I tillegg til disse reagenser som tidligere er kjente kan mange andre diagnostiske og terapeutiske reagenser med en molekylært gjenkjennelig del og en chelatiseringsdel synte-tiseres ved standardteknikker innen organisk kjemi. Som allerede tidligere omtalt i forbindelse med knytting av chelatiserende grupper til proteiner er det f.eks. også mulig å knytte chelatiserende grupper til ikke-proteintype-molekyler av interesse, såsom lipider, hormoner og sukre. Selv om chelatiserende grupper ikke tidligere er knyttet til slike molekyler, er mange derivater av disse forskjellige klas-ser av biologiske forbindelser kjente som har kovalente bindinger dannet gjennom et karbon-, oksygen-, nitrogen eller svovelatom til en organisk rest som ikke normalt er en del av forbindelsen. Små variasjoner av teknikkene som brukes for å syntetisere disse kjente forbindelser kan brukes for å knytte chelatiserende grupper til de gjenkjennelige molekyler.

Likeledes kan chelatiserende molekyler modifiseres ved kjemiske standardteknikker til å gi en funksjonell gruppe hvorigjennom tilknytning til det gjenkjennelige molekyl kan finne sted. Flere fremgangsmåter er beskrevet for chelatise-ringen av grupper som tidligere er modifisert for tilknytning til proteiner, som tidligere omtalt. Da mange chelatiserende molekyler inneholder minst én rest avledet fra ed-diksyre, kan disse molekyler lett modifiseres ved bruk av standardteknikker og gi en funksjonell gruppe på a-karbon-atomet hvorigjennom tilknytning til det gjenkjennelige molekyl kan finne sted. De korrekt funksjonaliserte gjenkjennelige molekyler og chelatiserende grupper kan lett knyttes til hverandre ved standardreaksjoner innen organisk kjemi, selv om selvfølgelig alle de resulterende forbindelser ikke vil falle innenfor klassen av reagenser som viser den sterkest foretrukne bindingsaffinitet.

Chelatiserende grupper som er analoger til 1,2-diaminocyklo-heksaneddiksyre foretrekkes spesielt for utøvelse av foreliggende oppfinnelse. Den chelatiserende gruppe er kovalent bunnet, generelt, om ikke nødvendigvis gjennom en passende brodannelsesenhet, til et diagnostisk eller terapeutisk molekyl av interesse som gir anvendelige reagenser for ut-øvelse av oppfinnelsen. Den chelatiserende del gir et sterkt bindingspunkt for metallioner, og ved valg av passende bindingsstruktur kan den kobles til en rekke punkter på et stort område molekyler.

En fordel ved 1,2-diaminocykloheksaneddiksyreanaloger er

at de med hell kan brukes med polynukleotider og nukleinsyrer, til forskjell fra visse tidligere kjente aromatiske chelatiserende grupper som ikke normalt kan brukes med polynukleotider på grunn av innskyting. De cykloheksan-baserte dicykloheksantetraeddiksyre (DCTA) analoger griper generelt ikke inn i noen normale reaksjoner for markerte polynukleotider eller nukleinsyrer og kan i tillegg brukes med enhver av de andre molekylært gjenkjennelige deler som her er beskrevet. DCTA-analogene har også bindingsaffiniteter tii metallioner som er flere ganger større enn tilsvarende for

EDTA.

Eksempler på terapeutiske og diagnostiske reagenser som

kan brukes i foreliggende oppfinnelse er også beskrevet og omtalt i den samtidig innsendte søknad - av Y. Stavrianopolous med tittel "Påviselige molekyler, frem--. gangsmåte for fremstilling og bruk".

Den kjemiske struktur for de foretrukne chelatiseringsgrupper i en diagnostisk eller terapeutisk reagens som her er beskrevet eksemplifiseres ved den følgende strukturformel:

hvor R er den hovedsakelige ikke-metalliske chelatiseringsdel av den terapeutiske eller diagnostiske reagens, R"*" er

C1-C4alkyl eller er -CH2COOM, M er H eller et kationisk metall eller en negativ ladning, og A er enten en direkte kovalent binding eller en brodannende enhet, så som f.eks. av den type som er omtalt i den parallelle søknad. Da rom-virkningen er hovedtrekket fremfor strukturen av den brodannende enhet, er den brodannende enhets kjemiske struktur uviktig og ikke begrenset så lenge - bl.a. - molekylær gjenkjennelse ikke hindres utillatelig.

Det foretrekkes å bruke en brodannende enhet for å koble det ikke-chelatiserende molekyl til det chelatiserende molekyl fra hvilket den chelatiserende del er avledet. Valget av brodannelsesenhet varieres selvfølgelig avhengig av typen molekyler som inngår, antallet og karakteren til de tilgjengelige bindingspunkter, reaksjonstypene som den markerte reagens gjennomløper, og andre faktorer som er kjent for en fagmann. Bindingsgruppene kan skreddersys for spe-sifikke typer reagenser, f.eks. nukleotider, proteiner, aminosyrer, enzymer, etc, for å passe behovet for spesiell påvisning, billeddannelse eller terapeutisk teknikk.

Eksempler på generelt anvendelige bindingsgrupper er 3~tiopropionsyrehydrazid, (3-tioetylamin og isotiocyanat. Spesielt er (3-tiopropionsyrehydrazid funnet å være meget egnet for å knytte chelatiserende grupper til aminoholdige molekyler under milde betingelser. Den foretrukne brodannelsesenhet for et spesielt ikke-chelatiserende molekyl avhenger av de reaktive funksjonelle grupper som er tilstede i molekylet. F.eks. kan molekyler med en fri aminogruppe (så som proteiner og peptider med én eller flere lysinrester) omsettes med et karbonylazid under dannelse av en peptidbinding. Molekyler med en fri hydroksylgruppe (så som proteiner med en tyrosinrest) kan omsettes med et isotiocyanat eller kan oppvarmes i nærvær av azidet (som omdannes til et isocyanat) tinder dannelse et tiouretan eller uretan. Molekyler med en karbonylgruppe kan danne en Schiff's base med en aminogruppe av et modifisert chelati serende molekyl, som så kan reduseres hvis ønsket til et sekundært amin. Mange varianter av disse bindingsteknikker foreligger og kan anvendes etter ønske.

Eksempler på reagenser som kan brukes ved utøvelse av oppfinnelsen er slike hvori en molekylært gjenkjennelig del er avledet fra et nukleotid eller beslektet forbindelse. Metoder for å danne slike forbindelser er beskrevet i de-talj og krevet i US-søknad nr. 391.441 av 23. juni 1982. Følgelig kan reagenser hvis molekylært gjenkjennelig del

er avledet fra DNA, RNA, et nukleotid, et deoksynukleotid, nukleosid, eller et deoksynukleosid lett fremstilles ved bruk av metoder som der er beskrevet for modifisering av nukleotidet eller beslektet molekyl, sammen med de fremgangsmåter som her er beskrevet for kobling til chelatiserende grupper.

Forholdet mellom den ikke-chelatiserende del av reagensen til den chelatiserende del behøver ikke nødvendigvis å være 1:1. Det kan være mange flere chelatiserende deler enn ikke-chelatiserende deler eller vice versa. I det tilfelle hvor forholdet av chelatiserende deler til ikke-chelatiserende deler er større enn 1, f.eks. 5-10 til 1 eller til og med større, forsterker systemet bestrålingen som frembringes av det primære gjenkjennelsesforløp med en faktor lik forholdet.

Det bør igjen bemerkes at aspektet ved foreliggende oppfinnelse som vedrører markering av en reagens som allerede inneholder en chelatiserende del, på ingen måte avhenger av strukturen til molekylene som manipuleres, men derimot avhenger av deres chelatiserende evne og deres evne til å gjenkjennes i molekylær skala i et biologisk eller biokje-misk systera. Så lenge chelatisering med radioaktivt metallion er mulig, kan molekylær gjenkjennelse finne sted, og et ioneoverføringsmateriale foreligger som har en lavere bindingsevne for det radioaktive metall enn den chelatiserende del til reagensen, slik at oppfinnelsen kan utøves

uavhengig av molekylets struktur.

Likeledes er ioneoverføringsmaterialets struktur uviktig så lenge bindingsaffiniteten (dvs. bindingsfunksjonen) ligger innenfor de beskrevne grenser. Selv om det generelt er tilstrekkelig for utøvelsen av oppfinnelsen å bruke et ioneoverføringsmateriale hvis bindingsaffinitet til det radioaktive metallion bare er mindre enn bindingsaffiniteten til den terapeutiske eller diagnostiske reagens for det samme ion, er det foretrukket at forholdet av bindingsaffiniteter er mindre enn 0,1, helst mindre enn 0,01, og aller helst mindre enn 0,001, for å sikre effektiv overføring av det radioaktive metallion fra ioneoverføringsmaterialet til reagensen.

Egnete ioneoverføringsmaterialer er både uorganiske og syntetiske og organiske produkter. Uorganiske ioneoverførings-materialer innbefatter både naturlig forekommende materialer (f.eks. mineralzeolitter såsom sodalitt og klinopti-lolitt, grønn sand og leirer såsom montmorillonittgruppen) og syntetiske produkter såsom gelzeolitter, dehydroksyder av polyvalente metaller såsom hydratisert zirkoniumoksyd og de uløselige salter av flerbasiske syrer med flerverdi-ge metaller såsom zirkoniumfosfat. Fortrukne ioneoverfø-ringsmaterialer er de syntetiske organiske kationeutbytter-harpikser. Disse innbefatter svak-syre, kationbytterhar-pikser og sterk-syre harpikser. Svak-syre harpiksene er generelt basert på akryl- eller metakrylsyre som er kryss-bundet med en difunksjonell vinylmonomer, såsom divinylbenzen. Andre svak-syre grupper, såsom fenoliske eller fosfon-funksjonelle grupper kan også brukes. Svak-syre harpiksene brukes generelt ved en pH over 4. Sterk-syre harpiksene er generelt basert på sulfonerte kopolymerer av styren og divinylbenzen. Disse materialer foretrekkes spesielt på grunn av sin evne til å bytte ut kationer over hele pH-området. De sterkest foretrukne ionebyttermateri-aler er tilstrekkelig porøse til å gi et stort overflate-område hvorpå utbyttingen kan finne sted. Porestørrelsene er fortrinnsvis tilstrekkelig til å muliggjøre en lett pas-sasje av reagensen gjennom porene og er helst flere ganger den største diameteren til det aktuelle molekyl. Hvis imidlertid den diagnostiske eller terapeutiske reagens er spesielt stor, kan overføring bare finne sted på utvendige overflater.

Mange i handelen tilgjengelige ioneoverføringsmaterialer er kjente og kan brukes ved utøvelse av foreliggende oppfinnelse hvis de her anførte retningslinjer følges. F.eks.

er "Dowex 50" og materialer med lignende egenskaper spesielt egnet.

Genrelt utføres markeringsprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse ved å bringe den terapeutiske eller diagnostiske reagens som her er definert i kontakt med et ioneover-føringsmateriale som det radioaktive element er bundet til. Kontakten kan enten bestå i at en løsning inneholdende reagensen føres gjennom en kolonne av ioneoverføringsmateri-ale eller ved å oppslemme ioneoverføringsmaterialet i en løsning av reagensen. Selv om disse metoder for kontakter er foretrukket, er enhver annen metode for grundig kontakt av en løsning inneholdende reagensen med ioneoverførings-materialet egnet. Mengden av radioaktivitet bundet til ioneoverføringsmaterialet, kontakttidens varighet og forholdet av mengden diagnostisk reagens til mengden ione-overf øringsmateriale , samt andre betingelser, varierer avhengig av mengden radioaktivitet som kreves for den spesiell situasjon hvor reagensen skal anvendes, hvilket vil være åpenbart for en fagmann. Hvis betingelsene og kontakt-tiene ikke er kjente, kan de lett bestemmes ved enkle eks-perimenter. Etter en tilstrekkelig kontakttid skilles den radioaktive reagens fra ioneoverføringsmaterialet ved en egnet teknikk. Ioneoverføringsmaterialet vil gjerne fore-ligge i form av en kolonne, og reagensen kan skilles fra ved eluering. Eluering kan finne sted ved bruk av løsnings-midlet, hvori kontakten fant sted, eller en andre eluent kan anvendes hvis slik behandling lettere løsner reagen sen fra ioneoverføringsmaterialet. Hvis slike ikke allerede er kjente kan egnete elueringsmidler bestemmes ved enkel eksperimentering, da eluering av radioaktivitet er lett å følge. Det er spesielt foretrukket at en eluent ik-ke permanent forandrer en molekylært gjenkjennelig del av reagensen slik at gjenkjennelsesforløpet ikke lenger kan finne sted. Imidlertid bevirker den temporære forandring, f. eks. i konformasjon ingen skade hvis den gjenkjennelige struktur senere kan gjenvinnes. Således er elueringer med løsningsmidler eller løsninger, eller under betingelser som fører til en reversibel konformasjonsforandring i strukturen til et peptid, f.eks. akseptabelt. Ikke desto mindre foretrekkes elueringer av reagenser av biologisk opprinnel-se ved eller nær fysiologiske betingelser (f.eks. pH ione-styrke, temperatur, etc), spesielt hvis eluenten skal være direkte i én av de diagnostiske eller terapeutiske fremgangsmåter som skal omtales senere.

Ethvert radioaktivt metallion som kan gi et terapeutisk eller diagnostisk resultat i et menneskelig eller dyrelegeme eller i en in vitro diagnostisk måling kan brukes ved utø-velse av foreliggende oppfinnelse. Egnete ioner innbefatter de følgende:

Det følgende ikke-begrensende eksempel illustrerer fremstil-lingen av en diagnostisk eller terapeutisk reagens under bruk av en "Dowex 50"-kolonne. Kolonnen ekvilibreres først med en fortynnet løsning av en puffer, f. eks. 0,05 -M ammo-niumacetat og tilføres så et radioaktivt ion, f.eks. nikkel-63, ved at en løsning av ionet føres gjennom kolonnen. Etter at kolonnen er fremstilt (når den foreligger i form av et sett som senere beskrevet, ville kolonnen være fremstilt av en annen enn den endelige forbruker under fremstilling av settét) t føres reagensen som har en chelatiserende del gjennom kolonnen og elueres som det radioaktivt markerte metallchelat.

Markeringsforløpet som er beskrevet ovenfor er spesielt anvendelig i kombinasjon med utprøvde terapeutiske og diagnostiske teknikker som anvender en reagens med de egenskaper som er beskrevet i foreliggende søknad. F.eks. kan en diagnostisk reagens som er anvendelig i radioaktiv immunologisk måling (RIA) markeres umiddelbart før bruk, hvilken således sterkt reduserer ikke-spesifikk binding be-virket av strålingsskade som kunne opptre på reagensen som først var blitt markert og lagret over et lengere tidsrom. RIA er en velkjent teknikk og skal ikke beskrives detal-jert her. F.eks. henvises det til Chard, "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques," North-Holland Publishing Company, 1978. Alle de mange variasjoner av RIA kan anvendes, såsom homogen fase RIA, heterogen eller fast fase RIA, enkel eller dobbelt antistoffmetoder, og direkte (fremad) eller revers sandwich-måling. Spesielt foretrekkes fast-fasesystemer hvor antistoffet (IgG eller IgM) er kovalent koblet til en uoppløselig bærer slik at både antistoffet og det bundne kompleks etter inkuberingen lett kan separeres fra den oppløselige frie fraksjon. En lang rekke fast-fasebærere er beskrevet som inneholder partikler av dekstran eller cellulose, kontinuerlige overflater såsom polystyren-eller polypropylenskiver, vegger av plast-rør, glass-skiver, glasspartikler og lignende. Partikkel-formete faste faser brukes meget for en rekke forskjelllige målinger og kan brukes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse. Antistoffene er knyttet til partiklene ved hvilke som helst av mange kjente teknikker utviklet for å gi en ikke-reversibel kovalent eller ikke-kovalent binding mellom protein og partikkel, f,eks. direkte eller ved cyan-bromidaktivering. Andre alternativer er bruken av antistoffer fanget inn i mellomrom i en polyakrylamidgel eller bundet til magnetiske partikler. Et prøverør settes opp som inneholder enten prøve eller standard, sammen med traceren og en passende mengde fast-fase-bundet antistoff, pluss en detergent for å forhindre aggregering av partiklene og ikke-spesifikk absorpsjon av traceren. Etter en inkuberings-periode hvorunder rørene blandes kontinuerlig sedimenteres den faste fase ved sentrifugering, og supernatanten fjer-nes og den faste fase vaskes to eller flere ganger med puffer for å fjerne fri tracer innfanget i og mellom partiklene . Tellingene på den faste fase (bunnet fraksjon) måles deretter. Immunologiske radiometriske målinger, som beskrevet i Chard på side 423 kan også brukes. Når et andre antistoff brukes, kan det andre antistoff enten være IgM eller IgG. Foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til noen spesielle av disse teknikker.

På lignende måte kan fremgangsmåten anvendes på in vivo diagnostiske og terapeutiske teknikker ved markering av reagensen umiddelbart før bruk. Dette aspekt av oppfinnel sen er spesielt viktig på grunn av de høye radioaktivitets-nivåer i forbindelse med slike reagenser, spesielt terapeutiske reagenser, som fører til rask nedbrytning av enhver molekylært gjenkjennelig del av molekylene og tap av spesifisitet.Ved å bruke teknikken i foreliggende oppfinnelse i kombinasjon med anerkjente in vivo teknikker for bruk av radioaktive reagenser, reduserer sterkt ødeleggel-sen av alle molekylært gjenkjennelige deler i reagensen, hvilken reagerer med en komplementær substans i et menneske- eller dyrelegemé og bevirker selektiv lokalisering i et måleområde. Følgelig er det mulig i mange tilfeller å bruke en lavere totalmengde av den radioaktive isotop i en diagnostisk teknikk på grunn av øket spesifisitet. Denne teknikk er særlig egnet for bruk med monoklonale antistoffer som en chelatiserende gruppe er knyttet til.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør lett fremstilling av sett omfattende ett eller flere av de nødvendige elementer for å utføre markeringsprosessen. Således kan et sett omfatte en bærer som, er^rominhdelt, for i lukket tilstand å motta én eller flere beholderanordninger eller serier av beholder-anordningér, såsom prøverør, glass, flasker, sprøyter eller lignende. En første beholderanordning eller serie av beholderanordninger kan inneholde den terapeutiske eller diagnostiske reagens som her er beskrevet. En andre beholderanordning eller serier av beholderanordninger kan inneholde et ioneoverføringsmateriale med evne til å binde det radioaktive metallion av interesse for den aktuelle anvendelse. To utførelsesformer for den andre beholderanordning er mulig med hensyn til selve det radioaktive metall. I første utførelsesform bindes ionet til ioneover-føringsmaterialet under fremstillingsprosessen av settet. Brukeren av et slikt sett behøver derfor ikke å håndtere radioaktivt materiale i flytende form på noe tidspunkt før han får den diagnostiske eller terapeutiske reagens i elueringsvæsken, som kan velges slik at den kan brukes øye-blikkelig. Alternativt kan settet gi et ioneoverførings- materiale som ikke er tilknyttet noe radioaktivt bundet metallion. Dette forenkler sterkt fremstilling , lagring og håndtering av selve settet. Det radioaktive metallion bindes så til ioneoverføringsmaterialet av bruker av settet. Ioneoverføringsmaterialet kan deretter anvendes til å markere flere doser eller alikvoter av den terapeutiske eller diagnostiske reagens. Et slikt sett og fremgangsmåte er spesielt egnet for isotoper med meget kort levetid,

slik som ofte brukes i in vivo metoder. Medisinske laboranter som normalt ville bruke løsningskjemi til å markere en terapeutisk reagens omfattende en chelatiserende del av et antistoff, kan f.eks. oppnå samme resultat ved bruk av teknikken ifølge av foreliggende oppfinnelse og et sett tilpasset denne bruk med mindre radioaktivt avfall og kon-taiminert glassutstyr.

Det er foretrukket at den andre beholderanordning er utstyrt med væskeinnløp og utløpsanordninger, hvorved reagensen (ikke markert med radioaktivitet), når den innføres i inn-løpsanordningene, kommer i tett kontakt med ioneoverfø-ringsmaterialet under gjennomløpet eller kontaktes inne i beholderanordningen før utløpet gjennom utløpsanordningene. Det foretrkkes spesielt at innløps- og utløpsanordningene er utstyrt med begrensningsanordninger, såsom sikt, som forhindrer utløp av ioneoverføringsmaterialet fra beholde-ren. I en spesielt foretrukken utførelsesform av foreliggende oppfinnelse er den andre beholderanordning som inneholder ioneoverføringsmaterialet med det radioaktive ion bundet til seg av kolonne- eller rørform med innløp og ut-løp av motsatte ender av røret. Således kan bruker lett markere enhver diagnostisk eller terapeutisk reagens med en chelatiserende del på seg ved å tilsette reagensen gjennom innløpet og fjerne reagensen ettersom den kommer ut gjennom utløpet. Passasjen av reagensen gjennom behol-deren vil gjerne foregå i løsning, hvorved reagensen ville komme i tett kontakt med ioneoverføringsmaterialet. Den radioaktivt markerte reagens kan gjenvinnes enten ved trykk-kraft eller sug eller får renne ut fra nedre utløp eller ved å føre en elueringsvæske gjennom kolonnen, som velkjent for enhver fagmann. Én egnet teknikk ville være å bruke en engangssprøyte eller andre administreringsred-skaper egnet for bruk i diagnostiske eller terapeutiske metoder som en radioaktiv reagens er ønsket for, hvilke er utstyrt med forbindelsesorganer med hvilke den kan knyttes til utløpet av ioneoverføringsmaterialbeholderen. Reagensen kan så trekkes inn i sprøyten med minimal fare for tap eller kontaminéring. Settet vil gjerne også inneholde en tredje beholder med en egnet eluent for eluering av reagensen fra kolonnen. Hvis settet er laget for en spesiell in vitro diagnostisk teknikk, f.eks. en konkurrerende radioaktiv immunologisk målemetode, kan en fjerde beholder inneholde en komplementerende substans som kan binde med enhver molekylært gjenkjennelig del av reagensen, f.eks. et fast fase antistoff som kan bindes både til analytten og den diagnostiske reagens. Hvis den ikke-markerte reagens er tilstede i tørr form (f.eks. frysetørket) kan en femte beholder inneholdende et løsningsmiddel fore-ligge. Et typisk fullstendig sett ifølge oppfinnelsen vil inneholde minst to beholdere og substanser i forbindelse med disse og kan eventuelt inneholde alle andre beslektede materialer som er anvendelige for den aktuelle metode.

Claims (12)

1. Fremgangsmåte ved markering av en terapeutisk eller diagnostisk reagens med et radioaktivt metallion,karakterisert vedat man kontakter (1) den . ikke-markerte reagens som omfatter (a) en hovedsakelig ikke-metallisk chelatiseringsdel knyttet til (b) en chelatiserende del som kan hovedsakelig chelatisere med og har en bindingsaffinitet til, det radioaktive metallion, med (2) et ioneoverføringsmateriale som metallionet er bundet til og har en bindingsaffinitet til metallionet mindre enn bindingsaffiniteten til den chelatiserende del; danner en radioaktivt markert, terapeutisk eller diagnostisk reagens ved overføring av metallionet fra forbindelsen med ioneoverføringsmaterialet til forbindelsen med reagensen; adskiller de radioaktivt markerte terapeutiske eller diagnostiske reagens fra ioneoverføringsmaterialet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den chelatiserende del avchelatiseres før kontakttrinnet.

3. Premgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat man før kontakttrinnet knytter den chelatiserende del til et andre metallion, hvilken del har en bindingsaffinitet til det andre ion mindre enn bindings-af f initeten til delen for det radioaktive metallion.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den hovedsakelige ikke-metalliske chelatiserende del av reagensen velges fra gruppen bestå ende av en naturlig bestanddel av et biologisk system, en molekylært gjenkjennelig del, en proteinholdig bestanddel, en nukleinsyrebestanddel, en sakkaridholdig bestanddel, en hormonholdig bestanddel, et antigen, et antistoff, en hor-monreseptor, en virus, en virusbestanddel, en bakterie, en bakteriell forbindelse, en celle eller en cellulær bestanddel.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den chelatiserende del omfatter et diamin med fire eddiksyrerester knyttet til de to aminogrupper i diaminet.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat man som chelatiserende del anvender et derivat eller anlog av etylendiamintetraeddiksyre eller trans-1,2-diaminocykloheksaneddiksyre.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat man som chelatiserende del anvender en rest med formelen

hvor R<1>er CH2-COQM eller et C1~C4alkyl og M er hydrogen, et kationmetall eller en negativ ladning.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat man anvender fraksjonen med bindingsaffinitet til ioneoverføringsmaterialet for det radioaktive metallion sammenlignet med bindingsaffiniteten til chelatiseringsdelen for det radioaktive ion mindre enn 0,1.

9. Radioaktiv immunologisk målemetode,karakterisert vedat man danner en diagnostisk reagens markert ved et radioaktivt metallion iføl-ge fremgangsmåten fra krav 1, idet den hovedsakelig ikke-metall-chelatdannende del er molekylært gjenkjennelig og i stand til å ta del i en antigen-antistoff-bindingsreak-sjon, og anvender reagensen i en radioaktiv immunologisk målemetode .

10. In vivo diagnostisk :metodekarakterisertved at den består av trinnene: dannelse av en diagnostisk reagens markert med et radioaktivt metallion ifølge fremgangsmåten fra krav 1; administrering av reagensen til et dyr eller menneske; lokalisering av reagensen i et måleområde hos mennesket eller dyret ved gjensidig påvirkning av en molekylært gjenkjennelig del av reagensen med en komplementær substans i måleområdet; og påvisning av bestråling emittert av det radioaktive metallion .

11. Terapeutisk fremgangsmåte for konsentrering av stråling fra et radioaktivt metallion i et måleområde,karakterisert vedat man danner en terapeutisk reagens markert med et radioaktivt metallion ifølge fremgangsmåten fra krav 1; administrering av reagensen til et menneske eller dyr; og selektiv lokalisering av reagensen i måleområdet hos menne sket eller dyret ved gjensidig virkning av en molekylært gjenkjennelig del av reagenset med en komplementær substans i måleområdet.

12. Sett for dannelse av en terapeutisk eller diagnostisk reagens markert med et radioaktivt metallion,karakterisert vedat det består av: bæreranordninger oppdelt i seksjoner uten innvendig forbindelse, for i tett innesperring deri å motta én eller flere beholdere) en første beholder innesperret i bæreren og inneholdende en terapeutisk eller diagnostisk reagens omfattende en hovedsakelig ikke-metall-chelatiserende del knyttet til en chelatiserende del som kan chelatisere med og ha bin-dingsaf f initet til det radioaktive metallion; og en andre beholder innesperret i bæreren og inneholdende et ioneoverføringsmateriale med det radioaktive metallion bundet til seg, og med en bindingsaffinitet til det radioaktive metallion mindre enn bindingsaffiniteten til den chelatiserende del for dette.