JPH05273214A - 固相免疫測定用リガンドの固相化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、リガンドとしての抗原又は抗体の
固相量を増加させることができ、各種材料に対して汎用
性、及び安全性が高く、かつ担体表面処理を容易に行う
ことができる固相化方法を提供することを目的とする。 【構成】 固相免疫測定法でリガンドとして機能する抗
原または抗体を固体担体上に固相化する方法において、
表面領域の少なくとも一部にバルサムを露出させた固体
担体を調製する工程と、前記抗原または抗体を前記バル
サムに結合する工程とを具備することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は固相免疫測定法に関し、
より具体的には、該測定法でリガンドとして用いられる
抗原または抗体を固相化する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、臨床医学の分野およびバイオテク
ノロジー分野において、免疫学的分析手法が用いられて
いる。免疫学的分析手法は感染症やアレルギーの診断、
血中薬物濃度の測定、癌の血清学的診断、細菌やウイル
ス等の同定、その他各種生理活性物質の検出に特に有用
である。

【０００３】免疫学的分析手法の具体例としては、免疫
拡散法、電気泳動法、補体結合反応、凝集反応、蛍光抗
体法、或いは各種イムノアッセイ等が挙げられる。これ
ら免疫学的分析手法は、原理的には、液相免疫測定法お
よび固相免疫測定法の２つに分類される。液相免疫測定
法は可溶性の抗原および抗体を用いるものであり、これ
に対して固相免疫測定法は、抗原又は抗体の何れか一方
を種々のプラスチック、又はガラスのような固体担体に
結合させて用いる。

【０００４】このうち、固相免疫測定法は高感度で特異
性に優れるのみならず、免疫反応後の所謂Ｂ／Ｆ分離を
洗浄により達成できるため、未反応遊離抗原と結合抗原
との区別、または未反応遊離抗体と結合抗体との区別を
より正確かつ効率よく行うことができる。この固相免疫
測定法における効果をより向上させるためには、抗原ま
たは抗体を固体表面に多量に、かつ安定に固相化するこ
とが必要である。従って、これに関して従来種々の工夫
がなされてきた。

【０００５】従来、固体担体としては、ポリスチレン、
ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ナイ
ロン、ＡＢＳ樹脂、セルロース、ポリメチルメタアクリ
レート、シリコンゴム、テフロン等のプラスチック或い
はガラスなど種々の材料が用いられてきた。しかし、単
にこれらの固体物質をそのまま担体として用いるのみで
は、抗原又は抗体の固相量、或いは固相後の固相状態の
安定性等が不十分であった。

【０００６】これらの問題点を解決する方法として、例
えば、固体表面に抗原又は抗体を固相化する際に、タン
ニン酸やレクチンのようなバインダーを用いる方法が知
られている。しかし、これらバインダーは化学的架橋を
介して結合するものであるため、適合できる材質が限定
されてしまうという欠点があった。

【０００７】また、特開昭５９−８４１６１号には、ポ
リスチレン系ポリマーからなる固体表面を無水硫酸で処
理し、スルホン酸を導入することにより固相化量を増大
させる方法が開示されている。しかし、これもバインダ
ーを用いる方法と同様、適用できる材料が限定されるた
め、汎用性に乏しい問題がある。

【０００８】上記以外にも、特開昭５９−８０４４２号
には、固体表面をプラズマ処理することによって抗体等
の結合量を増大させる方法が開示されている。更に、特
開昭６２−２４２８５７号には、固体表面を酸、アルカ
リ若しくは過酸化物で処理し、或いはコロナ放電処理、
低温プラズマ処理、電子線もしくはガンマー線照射を行
うことによって酸化処理を施し、抗原或いは抗体の吸着
固定性の向上を図る方法が開示されている。加えて、Ｕ
ＳＰ３６５２７６１号には、無機固体表面をシランカッ
プリング剤、即ち、（Ｙ´Ｒ´）_nＳｉＲ_4-n（ここで、
Ｙ´＝アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、イソ
シアノ基、ジアゾ基、イソチオシアノ基、ニトロ基、ス
ルフィドリル基またはハロカルボニル基；Ｒ´＝低級ア
ルキル基、低級アルキルフェニル基またはフェニル基；
Ｒ＝低級アルコキシ、フェノキシまたはハロゲン；ｎ＝
１、２、３である）の化学式で表される物質を用いて化
学処理し、蛋白質等を固相化する方法が開示されてい
る。しかしながら、これらの技術は何れも酸、アルカ
リ、過酸化物、シラン化合物等の危険な化学物質、或い
はガンマー線を使用しなければならず、また高価な設備
を必要とするという欠点があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、リガンドとしての抗原又は抗体の固相量を増加させ
ることができ、しかも各種の固体担体材料に対する汎用
性および安全性が高く、かつ固体担体表面の必要な処理
を容易に行うことができる固相化方法を提供することに
ある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
の手段として、本発明者らは、草木や樹木から採取され
る樹液に注目した。樹液は、草木や樹木の損傷箇所を修
復する機能があるため、草木や樹木の構成成分との親和
性（接着性）が期待される。しかも、草木や樹木は水分
を含んでおり、この状態で、草木や樹木の構成成分であ
るセルロースや蛋白質等と高い親和性を示すことから、
抗原又は抗体の固相化に適用できると考えられる。特に
針葉樹から分泌される樹脂性の樹液であるバルサムは、
固形樹脂が揮発性油に溶解しており、揮発性油を除くと
固化する。従って、固相免疫測定法を遂行するに当たっ
て用いられる固体担体表面のコーティングに最適である
と考えた。

【００１１】従って、本発明によれば、固相免疫測定法
でリガンドとして機能する抗原または抗体を固体担体上
に固相化する方法であって、表面領域の少なくとも一部
にバルサムを露出させた固体担体を調製する工程と、前
記抗原または抗体を前記バルサムに結合する工程とを具
備することを特徴とする方法が提供される。以下本発明
を詳細に説明する。

【００１２】本発明において、固体担体表面に固相化さ
れる抗原または抗体は、固相免疫測定法におけるリガン
ドとして使用され得るものであれば特に限定されない。
即ち、固相免疫測定法の分析対象物であるアナライトに
応じて、種々の抗原又は抗体を用いることができる。特
に、抗原は蛋白質に限らず、ペプチド、細胞、細菌、ウ
イルス、酵素、色素、或いは水溶性ポリマー等も含まれ
る。

【００１３】本発明における固体担体としては、有機物
質または無機物質の何れの材質のものを用いてもよい。
有機物質としては、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナ
イロン、ＡＢＳ樹脂、ポリメチルメタアクリレート等の
プラスチック、濾紙等の紙、木などが挙げられる。ま
た、無機物質としては、ガラス、シリコン、セラミッ
ク、金属等が挙げられる。しかし、ポリスチレン、濾
紙、或いはガラスを用いることが好ましい。本発明で用
いる担体の形状は特に制限されず、試験管状、マイクロ
プレート、ビーズ、板、パイプ等、用途に応じていずれ
の形状のものを用いてもよい。好ましく用いられるのは
試験管、或いはマイクロプレートである。

【００１４】本発明の特徴は、リガンドとしての上記抗
原または抗体を上記固体担体表面に結合して固相化する
ために、バルサムを用いる点にある。このバルサムとし
ては、Ｂａｌｓａｍ Ｃａｎａｄａ、Ｂａｌｓａｍ Ｍ
ｅｃｃａ、Ｂａｌｓａｍ Ｐｅｒｕ、Ｂａｌｓａｍ Ｔ
ｏｌｕ、Ｂａｌｓａｍ Ｔｒａｕｍａｔｉｃ等いずれの
針葉樹から分泌されるバルサムを用いることもできる。
しかし、カナダバルサム（Ｂａｌｓａｍ Ｃａｎａｄ
ａ）を用いることが好ましい。カナダバルサムは、マツ
科Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ（Ｌ．）Ｍｉｌｌ．の
樹皮より分泌されるものである。

【００１５】本発明においては、まず、表面領域の少な
くとも一部にバルサムを露出させた固体担体を調製す
る。その方法としては、上記固体担体表面にバルサムを
塗布または吸着する方法を用いることができる。また、
上記固体担体の材料に予めバルサムを混入しておき、こ
のバルサムを混入した材料を用いて固体担体を調製する
方法を用いてもよい。しかし、塗布により行うことが好
ましい。

【００１６】塗布は、バルサムを有機溶媒に溶解し、乾
燥することによって行われる。その場合、バルサムを溶
解するための有機溶媒は、各種バルサムの溶解性、及び
担体の有機溶媒に対する耐性、なじみ具合、安全性等の
観点から、適宜選択することが可能である。具体的に
は、例えばメタノール、エタノール、ブタノール、アセ
トン、クロロホルム、テトラヒドロフラン、エーテル等
を用いることができる。バルサムの溶解濃度は、５０〜
０．００１％が好ましく、５〜０．１％が特に好まし
い。

【００１７】また、塗布表面のイオン化学的性質、或い
は親水性疎水性のコントロール等の観点から、バルサム
を溶解した溶液に、ポリエチレンイミン、ポリビニルア
ルコール、カルボキシメチルセルロース等各種のポリマ
ーを添加してもよい。これらのポリマーのいずれを添加
するかは、固相化する物質の性質、或いはその物質の固
相化方法（例えば吸着、イオン結合又は共有結合など）
に応じて適宜選択することができる。例えば、ポリエチ
レンイミンを添加すると、固体担体表面は細胞等に対し
て良好な吸着性を示すようになる。更に、担体として無
機物質を用いる場合は、バルサム塗布層の安定性を高め
るために、シランカップリング剤を混合添加することも
できる。塗布後の乾燥は、自然乾燥、減圧乾燥、加熱乾
燥等を適宜選択して行うことができる。

【００１８】一方、特に担体の材料としてプラスチック
を用いる場合には、混入、即ちバルサムをプラスチック
に練り込んで成形することにより担体表面に露出させる
方法を好ましく用いることができる。この方法を用いる
と、成形後に塗布する手間を省くことができる。また、
紙、或いは木を用いる場合は、バルサムを吸着すること
も可能であり、かつ好ましい。バルサムを吸収させるこ
とにより、蛋白質等の吸着効率のみならず、耐水性或い
は機械的強度も向上させることができるからである。

【００１９】次に、上記のようにして調製された固体担
体表面に露出している前記バルサムに、前記リガンドと
しての抗原又は抗体を結合させる。その方法としては、
吸着、或いはイオン結合、又は共有結合などの化学結合
等を利用したいずれの方法を用いてもよい。一般的には
吸着による方法が用いられている。しかし、この方法に
よると、一度吸着されてもその後脱離が生じる場合もあ
る。従って、可能である場合は化学結合を用いて結合さ
せることが好ましい。

【００２０】固体担体表面にリガンドとしての抗原又は
抗体を結合させた後、ブロッキング処理を施してもよ
い。ブロッキングを行うことによって、固相免疫測定法
を遂行する際のアナライトの固体担体表面への非特異的
結合を防ぐことができる。ブロッキングは、ＢＳＡや血
清、核酸、ゼラチン等、一般に知られているいずれのも
のによっても行うことができる。以上の方法によって固
相化された固体担体は、直ぐに固相免疫測定法に用いて
もよく、氷室或いは加湿容器内で保存することもでき
る。

【００２１】本発明により、上記のようにして抗原また
は抗体を固相化された固体担体は、固相免疫測定法に用
いられる。そこで、本発明の前提となる固相免疫測定法
について以下に概説する。

【００２２】固相免疫測定法とは、リガンドとしての抗
原又は抗体を結合させた固体担体表面にサンプル中に存
在するアナライトを結合させることによって、該アナラ
イトを分析する方法である。この場合、固体担体表面に
固相化されたリガンドとの間で抗原抗体反応を起こし得
るいずれ物質も、アナライトとなり得る。一般に医学分
野においては、各種の抗原或いは抗体蛋白質、ホルモ
ン、アレルゲン等のアナライトの分析に対して、固相免
疫測定法が適用される。多くの場合、アナライトを含む
サンプルは、特に処理を施さなくても、採取後そのまま
測定可能である。しかし、アナライトの濃度が希薄であ
る場合、或いは反応干渉物質、アナライトと交差反応を
示す物質、又はアナライトを分解・変性する物質等が含
まれている場合には、濃縮、或いは防護剤の添加等の処
理を施す必要がある。

【００２３】サンプル中に存在するアナライトは、固体
担体表面に存在するリガンドとの間の抗原抗体反応によ
ってリガンドに結合し、捕獲される。この捕獲されたア
ナライトを検出するために、ラジオアイソトープ、蛍光
物質、発光物質或いは酵素等の種々の標識物質が用いら
れる。その標識物質の種類に応じて、個々の固相免疫測
定法はラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イ、或いはルミネッセンスイムノアッセイ等と称され
る。この標識物質は、通常は該標識物質が結合された二
次抗体又は二次抗原として添加されるが、これらはアナ
ライトと同時に添加されてもよく、また逐次的に添加さ
れてもよい。何れにしても、固相免疫測定法では抗原抗
体反応を行った後、前記固体表面を洗浄することによっ
て、反応物と未反応物の分離（いわゆるＢ／Ｆ分離）を
行うことができるので、その操作が容易である。そし
て、固体表面に結合した標識物質、又は結合しなかった
標識物質を測定することによって測定対象の抗原、抗体
の存在或いは量を測定することができる。

【００２４】

【作用】本発明の固相化方法は、バルサムの有する親和
性を利用するため、リガンドとしての抗原又は抗体を多
量に固相化することができる。また、いずれの材質から
なる固体担体にも適用することができ、汎用性、及び安
全性が高い。更に、バルサムは、塗布、吸着、或いは混
入等により、容易に固体担体表面に露出させることがで
き、経済性が高い。

【００２５】

【実施例】以下本発明の実施例を詳細に説明する。 実施例１： （バルサムコーティング前後の蛋白質の吸着性の比較）

【００２６】１−ブタノールを用いてカナダバルサム
（メルク社製）を２％に調整し、これをポリスチレン製
のマイクロプレートに添加することにより、プレート表
面に塗布した。塗布後、余剰の溶液を除き、室温で２時
間減圧乾燥し、バルサムコーティングマイクロプレート
を得た。

【００２７】一方、ヒトＩｇＧを０．０１Ｍ ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）を用いて０．４μｇ／ｍｌに調整し、更
に０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて倍倍希釈
した。これにより得られた溶液を、前記マイクロプレー
トに１００μｌずつ添加して室温で１５分間固相化し、
固相化終了後、生理食塩水２５０μｌで３回洗浄した。
洗浄後ゼラチン０．３％を含む０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐ
Ｈ７．４）を用いてブロッキングした。次に５００倍に
希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＫＰＬ社
製）を１００μｌ添加し、室温で３０分間反応させた。
反応終了後、生理食塩水２５０μｌで６回洗浄した後、
０．５ｍｇ／ｍｌＯＰＤを含む基質溶液１００μｌを添
加し、室温で１５分間発色させた。発色後、２Ｎ 硫酸
１００μｌを添加することにより反応を停止させ、ＵＶ
メーターを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。その
結果を表１に示す。

【００２８】

【表１】 上記表１から分かるようにコーティング後の吸光度が上
昇しており、吸着効率が高くなったことを示している。 実施例２： （バルサムコーティング前後の蛋白質の吸着性の比較）

【００２９】１−ブタノールを用いてカナダバルサム
（メルク社製）の１０％溶液を調整し、これを濾紙に浸
した。その後、余剰の溶液を除き、室温で２時間減圧乾
燥し、更に８０℃で４時間加熱乾燥することによりバル
サムコーティングペーパーを得た。

【００３０】一方、ヒトＩｇＧを０．０１Ｍ ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）を用いて１μｇ／ｍｌに調整し、これを
前記ペーパーに添加して室温で１５分間固相化した。固
相化終了後、生理食塩水２ｍｌで３回洗浄した後、ゼラ
チン０．３％を含む０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を
用いてブロッキングした。次に５００倍に希釈したペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＫＰＬ社製）溶液に浸
し、室温で３０分間反応させた。反応終了後、生理食塩
水２ｍｌで６回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍｌＯＰＤを
含む基質溶液５００μｌ中で、室温で１５分間発色させ
た。発色後、２Ｎ 硫酸５００μｌを添加することによ
り反応を停止させ、ＵＶメーターを用いて４２９ｎｍの
吸光度を測定した。その結果を表２に示す。

【００３１】

【表２】 上記表２から分かるようにコーティング後の吸光度はバ
ックグラウンドが低く、特異性が高いことが分かる。 実施例３： （バルサムコーティング前後の蛋白質の吸着性の比較）

【００３２】１−ブタノールを用いてカナダバルサム
（メルク社製）の２％溶液を調整し、これに更にエポキ
シシラン（日本ユニカー社製）を０．１％になるように
添加した。こうして得られた溶液をガラス製試験管内に
注入し、ことにより試験管内面に塗布した。塗布後、余
剰の溶液を除き、８０℃で２時間乾燥することによりバ
ルサムコーティング試験管を得た。

【００３３】一方、ヒトＩｇＧを０．０１Ｍ ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）を用いて５μｇ／ｍｌに調整し、これを
前記試験管に２００μｌずつ添加して室温で１５分間固
相化した。固相化終了後、生理食塩水２ｍｌで３回洗浄
した後、ゼラチン０．３％を含む０．０１Ｍ ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）を用いてブロッキングした。次に５００
倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（ＫＰ
Ｌ社製）２００μｌを添加し、室温で３０分間反応させ
た。反応終了後、生理食塩水２ｍｌで６回洗浄した後、
０．５ｍｇ／ｍｌＯＰＤを含む基質溶液５００μｌを添
加し、室温で１５分間発色させた。発色後、２Ｎ 硫酸
５００μｌを添加することにより反応を停止させ、ＵＶ
メーターを用いて４２９ｎｍの吸光度を測定した。その
結果を表３に示す。

【００３４】

【表３】 上記表３から分かるようにコーティング後に吸光度が上
昇しており、吸着効率が高くなったことを示している。 実施例４： （バルサムコーティング前後の蛋白質の吸着性の比較）

【００３５】１−ブタノールを用いてカナダバルサム
（メルク社製）を０．２％に調整しし、これに更にポリ
エチレンイミンを０．０３％になるように添加した。こ
うして得られた溶液をポリスチレン製マイクロプレート
に注入することにより、マイクロプレート表面に塗布し
た。塗布後、余剰の溶液を除き、室温で２時間減圧乾燥
することによりバルサム・ポリエチレンイミンコーティ
ングマイクロプレートを得た。このマイクロプレートも
同様に細胞等に対して良好な吸着性能を示す。

【００３６】

【発明の効果】本発明の固相化方法は、バルサムの有す
る親和性を利用するため、リガンドとしての抗原又は抗
体を多量に固相化することができる。また、いずれの材
質からなる固体担体をも用いることができ、汎用性、及
び安全性が高い。更に、バルサムは、塗布、吸着、或い
は混入等により、容易に固体担体表面に露出させること
ができ、経済性が高い。従って、本発明の固相化方法に
よって得られた担体を用いると、固相免疫測定法におけ
る測定の感度を向上させることができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固相免疫測定法でリガンドとして機能す
   る抗原または抗体を固体担体上に固相化する方法であっ
   て、表面領域の少なくとも一部にバルサムを露出させた
   固体担体を調製する工程と、前記抗原または抗体を前記
   バルサムに結合する工程とを具備することを特徴とする
   方法。