JP3078575B2 - キレート試薬結合化合物を精製する方法 - Google Patents
キレート試薬結合化合物を精製する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は生物分子を標識することに係わる。特に本発
明は、標識反応に次いで、標識生物分子を未結合の標識
試薬から分離することに係わる。本発明は、生物分子が
タンパク質であり、標識試薬が放射性核種である場合に
特に適している。特に用途があるのは、免疫診断及び免
疫療法の分野である。
明は、標識反応に次いで、標識生物分子を未結合の標識
試薬から分離することに係わる。本発明は、生物分子が
タンパク質であり、標識試薬が放射性核種である場合に
特に適している。特に用途があるのは、免疫診断及び免
疫療法の分野である。
発明の背景 生物分子は、放射性核種、毒素、ビタミン、蛍光化合
物及びキレート化剤を含む種々の試薬のいずれかで標識
することができる。標識試薬は、例えば代謝標識または
ニックトランスレーションによって生物分子の構成要素
として取り込むこともできるし、共有結合または他の分
子間力によって生物分子に付着することもできる。後者
のカテゴリーの標識方法の例としては、蛍光色素のイソ
チオシアネート誘導体を使用して抗体を蛍光性にするこ
と、ビオチンの光活性誘導体を使用して核酸を標識する
こと、及び酸化的反応または酵素仲介反応を使用してタ
ンパク質上のチロシン残基のところにヨウ素を結合する
ことを挙げることができる。標識操作は、生物分子と標
識試薬を混合するだけの簡単なものとし得る。
物及びキレート化剤を含む種々の試薬のいずれかで標識
することができる。標識試薬は、例えば代謝標識または
ニックトランスレーションによって生物分子の構成要素
として取り込むこともできるし、共有結合または他の分
子間力によって生物分子に付着することもできる。後者
のカテゴリーの標識方法の例としては、蛍光色素のイソ
チオシアネート誘導体を使用して抗体を蛍光性にするこ
と、ビオチンの光活性誘導体を使用して核酸を標識する
こと、及び酸化的反応または酵素仲介反応を使用してタ
ンパク質上のチロシン残基のところにヨウ素を結合する
ことを挙げることができる。標識操作は、生物分子と標
識試薬を混合するだけの簡単なものとし得る。
米国特許第4,707,352号は、生物分子に結合させたキ
レート化剤からなる非標識化合物を、放射性金属を結合
させたイオン輸送材料と接触させるステップを含む標識
方法を開示している。前記イオン輸送材料の放射性金属
に対する親和性は前記キレート化剤の前記金属に対する
親和性よりも低い。実施例においては、63Niが付加され
たイオン交換樹脂を含むカラムが使用されている。キレ
ート試薬結合体をカラムに通し、放射性標識キレート試
薬結合体として溶出させる。標識方法を実施するための
成分はキット内に含むことができる。
レート化剤からなる非標識化合物を、放射性金属を結合
させたイオン輸送材料と接触させるステップを含む標識
方法を開示している。前記イオン輸送材料の放射性金属
に対する親和性は前記キレート化剤の前記金属に対する
親和性よりも低い。実施例においては、63Niが付加され
たイオン交換樹脂を含むカラムが使用されている。キレ
ート試薬結合体をカラムに通し、放射性標識キレート試
薬結合体として溶出させる。標識方法を実施するための
成分はキット内に含むことができる。
標識反応の結果として、全ての反応物質、特に未反応
標識試薬を、標識生物分子、即ち生成物から分離するこ
とにより、生成物を精製することが望ましいことが多
い。未結合標識試薬の存在は、無関係な分子と会合する
ことにより（非特異的結合）またはバックグラウンドの
一因となることにより、結果を混乱させ得る。
標識試薬を、標識生物分子、即ち生成物から分離するこ
とにより、生成物を精製することが望ましいことが多
い。未結合標識試薬の存在は、無関係な分子と会合する
ことにより（非特異的結合）またはバックグラウンドの
一因となることにより、結果を混乱させ得る。
多くの標識試薬は小分子または元素であるため、生成
物を未結合試薬から分離する一般的方法は、サイズまた
は重量の分別に依存する。即ち、サイズ排除クロマトグ
ラフィーまたは透析を使用することができる。生成物と
反応物質との間に電荷の差があるときには、イオン交換
クロマトグラフィーが適した分離方法である。
物を未結合試薬から分離する一般的方法は、サイズまた
は重量の分別に依存する。即ち、サイズ排除クロマトグ
ラフィーまたは透析を使用することができる。生成物と
反応物質との間に電荷の差があるときには、イオン交換
クロマトグラフィーが適した分離方法である。
イオン交換樹脂とサイズ排除樹脂とを組み合わせた放
射線標識抗体を精製する方法が、米国特許第4,454,106
号に開示されている。9cmのカラムは、粒子を質量で1,5
00〜25,000ダルトンに分画し得るゲル過媒体7mlの上
に200〜400メッシュカチオン交換樹脂1mlを重ね、更に
その上にイオン遅滞樹脂1mlを重ねて製造されている。
カラムは、200mM塩化ナトリウム及び10mM MESからなるp
H6.0の緩衝液で平衡化されている。関連米国特許第4,47
2,509号において、テクネチウム標識抗体を精製するの
に適した床は、カチオン交換樹脂の下方で且つゲル過
媒体の上方にアニオン交換樹脂1mlを含むように改良さ
れた上述の３成分床である。
射線標識抗体を精製する方法が、米国特許第4,454,106
号に開示されている。9cmのカラムは、粒子を質量で1,5
00〜25,000ダルトンに分画し得るゲル過媒体7mlの上
に200〜400メッシュカチオン交換樹脂1mlを重ね、更に
その上にイオン遅滞樹脂1mlを重ねて製造されている。
カラムは、200mM塩化ナトリウム及び10mM MESからなるp
H6.0の緩衝液で平衡化されている。関連米国特許第4,47
2,509号において、テクネチウム標識抗体を精製するの
に適した床は、カチオン交換樹脂の下方で且つゲル過
媒体の上方にアニオン交換樹脂1mlを含むように改良さ
れた上述の３成分床である。
Mukkala（Anal Biochem（1989）176:319−325）は、
架橋キレート試薬を使用し、IgGをEu3+で標識した。反
応混合物を、1.5×5cm Sephadex G−50（Pharmacia Fi
ne Chemicals;デキストランビーズ）カラムと1.5×30c
m Trisacryl GF2000（Reactifs IBF;ポリアクリルア
ミドビーズ）カラムとを組合せたものに通すことによ
り、標識抗体生成物を反応物質から精製した。
架橋キレート試薬を使用し、IgGをEu3+で標識した。反
応混合物を、1.5×5cm Sephadex G−50（Pharmacia Fi
ne Chemicals;デキストランビーズ）カラムと1.5×30c
m Trisacryl GF2000（Reactifs IBF;ポリアクリルア
ミドビーズ）カラムとを組合せたものに通すことによ
り、標識抗体生成物を反応物質から精製した。
Estebanら（J.Nucl Med（1987）28:861−870）は、
111In標識抗体を精製する４つのプロトコルを標識操作
の終了時点において比較した。彼らは、単一の標識調製
物を４つの等量部分に分割した。１つのアリコートは過
剰なEDTA溶液で処理し、そのあと分離することはしなか
った。別のアリコートは、１×8cmゲル排除（Sephadex
Ｇ−50 fine）カラムに通した。第３のアリコートは
7.5mm×30cm HPLC（TSK3000）カラムに注入し、最後の
アリコートは、まずG50カラムで、次いでTSK3000カラム
で順次処理した。EDTA処理において最低の結果が得ら
れ、Ｇ−50カラムではかろうじてそれよりよい結果が得
られ、HPLC精製した標識抗体は、EDTA精製アリコートの
３倍の腫瘍：肝比を有し、Ｇ−50/TSK3000の組合せにお
いて最高の結果が得られた。Estebanらは、広範囲に使
用されているEDTA法は、夾雑物を含まない調製物を生成
する上で無効であり、バックグラウンドを最小化してい
ならば他の精製方法を考慮すべきであると結論した。
111In標識抗体を精製する４つのプロトコルを標識操作
の終了時点において比較した。彼らは、単一の標識調製
物を４つの等量部分に分割した。１つのアリコートは過
剰なEDTA溶液で処理し、そのあと分離することはしなか
った。別のアリコートは、１×8cmゲル排除（Sephadex
Ｇ−50 fine）カラムに通した。第３のアリコートは
7.5mm×30cm HPLC（TSK3000）カラムに注入し、最後の
アリコートは、まずG50カラムで、次いでTSK3000カラム
で順次処理した。EDTA処理において最低の結果が得ら
れ、Ｇ−50カラムではかろうじてそれよりよい結果が得
られ、HPLC精製した標識抗体は、EDTA精製アリコートの
３倍の腫瘍：肝比を有し、Ｇ−50/TSK3000の組合せにお
いて最高の結果が得られた。Estebanらは、広範囲に使
用されているEDTA法は、夾雑物を含まない調製物を生成
する上で無効であり、バックグラウンドを最小化してい
ならば他の精製方法を考慮すべきであると結論した。
米国特許第4,775,638号は、抗体を放射性標識するた
めの単一バイアル方法を開示している。該方法は、内側
表面を触媒で被覆した密封容器内に放射性同位元素を導
入し、前記容器内に抗体を導入し、混合物をインキュベ
ートし、抗体に結合しなかった放射性同位元素を吸収す
るイオン交換樹脂を前記容器中に導入し、混合物を取り
出し、樹脂を上清から分離することからなる。好ましい
樹脂は、AG 1−X8（Bio−Rad）のようなアニオン交換体
である。この方法は主に放射性ヨウ素化方法に向いてい
るが、発明者らは、放射性同位元素の抗体への触媒仲介
結合及びその後の前記標識抗体の精製は、キレート化に
よる67Ga及び111In標識に適用し得ると推測した。
めの単一バイアル方法を開示している。該方法は、内側
表面を触媒で被覆した密封容器内に放射性同位元素を導
入し、前記容器内に抗体を導入し、混合物をインキュベ
ートし、抗体に結合しなかった放射性同位元素を吸収す
るイオン交換樹脂を前記容器中に導入し、混合物を取り
出し、樹脂を上清から分離することからなる。好ましい
樹脂は、AG 1−X8（Bio−Rad）のようなアニオン交換体
である。この方法は主に放射性ヨウ素化方法に向いてい
るが、発明者らは、放射性同位元素の抗体への触媒仲介
結合及びその後の前記標識抗体の精製は、キレート化に
よる67Ga及び111In標識に適用し得ると推測した。
当業者が使用可能な分離方法は多様であるにもかかわ
らず、全般的な制約によって、高感度を要求する方法に
おいて標識生物分子を使用することは制限される。この
制約とは、当分野における多くの現行方法の未結合標識
試薬を除去する効率が幾分低いことである。明らかな例
は、ラジオイムノシンチグラフィーとして公知の方法で
ある、悪性細胞成長をその場で検出するために放射性標
識抗癌抗体を使用することである。本発明には直接関与
しない種々の理由により、少量の抗体しか悪性細胞に結
合しないことが多い。従って、理想的な条件下でさえシ
グナルを識別するのは困難である。高バックグラウンド
のために診断が不可能となることも珍しくはない。従っ
て、検出を保証または増強する１つの方法は、未結合放
射性核種を有意に含まない標識抗体を使用することであ
る。
らず、全般的な制約によって、高感度を要求する方法に
おいて標識生物分子を使用することは制限される。この
制約とは、当分野における多くの現行方法の未結合標識
試薬を除去する効率が幾分低いことである。明らかな例
は、ラジオイムノシンチグラフィーとして公知の方法で
ある、悪性細胞成長をその場で検出するために放射性標
識抗癌抗体を使用することである。本発明には直接関与
しない種々の理由により、少量の抗体しか悪性細胞に結
合しないことが多い。従って、理想的な条件下でさえシ
グナルを識別するのは困難である。高バックグラウンド
のために診断が不可能となることも珍しくはない。従っ
て、検出を保証または増強する１つの方法は、未結合放
射性核種を有意に含まない標識抗体を使用することであ
る。
ゲル排除クロマトグラフィーの使用に対する別の制約
は、IgM抗体がカラムマトリックスに非特異的に、また
ときには不可逆的に結合する傾向にある。例えばHalper
n et al.,J.Nucl Med（1988）29:1688−1696を参照
されたい。
は、IgM抗体がカラムマトリックスに非特異的に、また
ときには不可逆的に結合する傾向にある。例えばHalper
n et al.,J.Nucl Med（1988）29:1688−1696を参照
されたい。
別の制約は、ほとんどの方法が長時間を要することで
ある。放射性核種、特に放射性金属の多くは、数日でな
ければ多くは数時間という短い半減期を有する。従っ
て、迅速に精製すれば、標識生物分子調製物の特異的活
性は高くなる。
ある。放射性核種、特に放射性金属の多くは、数日でな
ければ多くは数時間という短い半減期を有する。従っ
て、迅速に精製すれば、標識生物分子調製物の特異的活
性は高くなる。
更に、前出の分離方法は他の欠点がないわかではな
い。多くは高価な装置や熟練した技術者を必要とし、生
物学的夾雑物を含み易く、精密なモニタリングを必要と
し、大規模化の余地がないなどの欠点がある。かかる装
置は、放射性漏洩の場合には汚染除去が困難でありしか
もコストがかかり得る。
い。多くは高価な装置や熟練した技術者を必要とし、生
物学的夾雑物を含み易く、精密なモニタリングを必要と
し、大規模化の余地がないなどの欠点がある。かかる装
置は、放射性漏洩の場合には汚染除去が困難でありしか
もコストがかかり得る。
上記問題点の解決が動機となって本発明が提供され
た。本明細書に開示するのは、現行方法を使用して得ら
れるより高い割合で、標識生成物を未結合反応物質から
分離する方法である。本発明の方法は、単純であること
及び安価であることを含む幾つかの理由により有利であ
る。更に該方法は、生物学的夾雑物を含みにくく、生物
分子の生物学的活性に影響せず、高い集約収率を与え、
標準的な病院内検査室において看護スタッフが使用し
得、使用後の廃棄が容易であり、長期保存寿命を有し、
種々の標識試薬及び生物分子との使用に適用可能であ
る。
た。本明細書に開示するのは、現行方法を使用して得ら
れるより高い割合で、標識生成物を未結合反応物質から
分離する方法である。本発明の方法は、単純であること
及び安価であることを含む幾つかの理由により有利であ
る。更に該方法は、生物学的夾雑物を含みにくく、生物
分子の生物学的活性に影響せず、高い集約収率を与え、
標準的な病院内検査室において看護スタッフが使用し
得、使用後の廃棄が容易であり、長期保存寿命を有し、
種々の標識試薬及び生物分子との使用に適用可能であ
る。
発明の要約 本発明は、標識反応後、標識生物分子、即ち生成物を
全ての未結合または弱結合標識試薬から分離する方法に
係わる。本発明は、前記未結合標識試薬を捕獲するため
にキレート試薬付着マトリックスを使用することを教示
する。この方法は、単純であること、未結合標識試薬の
除去が高感度に効率的であること、及び経済的であるこ
とを含む幾つかの利点を与える。本発明を実施するため
の試薬は、病院及び核医学研究所において応用場面に使
用されるキット形態に容易に適応可能である。
全ての未結合または弱結合標識試薬から分離する方法に
係わる。本発明は、前記未結合標識試薬を捕獲するため
にキレート試薬付着マトリックスを使用することを教示
する。この方法は、単純であること、未結合標識試薬の
除去が高感度に効率的であること、及び経済的であるこ
とを含む幾つかの利点を与える。本発明を実施するため
の試薬は、病院及び核医学研究所において応用場面に使
用されるキット形態に容易に適応可能である。
図面の簡単な説明 図１は、本発明を実施するための複数の容器の使用を
示す。
示す。
図２は、複数の隔室を有する単一容器を含む別の実施
形態を示す。
形態を示す。
図３は、キレート試薬付着マトリックスエを製造する
方法を示す。
方法を示す。
図４は、キレート試薬付着マトリックスを製造する別
の方法を示す。
の方法を示す。
発明の詳細 本明細書及びクレイムに使用される全ての用語は当業
者には周知である。しかしながら、かかる用語に与えら
れる範囲を含む本明細書及びクレイムの明確で且つ一貫
性のある理解のために、以下の定義を与える： 生物分子：生物学的実在物中でまたはそれと適合性の
エレメントまたは化合物。
者には周知である。しかしながら、かかる用語に与えら
れる範囲を含む本明細書及びクレイムの明確で且つ一貫
性のある理解のために、以下の定義を与える： 生物分子：生物学的実在物中でまたはそれと適合性の
エレメントまたは化合物。
結合：生物分子への標識試薬の物理的付着。
キレート試薬：高親和性で金属イオンを結合する試
薬。
薬。
キレート化剤としても公知である。
結合体（conjugate）：組成物。動詞としては、結合
する。
する。
誘導する：親物質を修飾すること。
標識試薬：生物分子と反応させると、生物分子が検
出、追跡またはモニターされ得るように生物分子上に付
加特性を賦与する物質。
出、追跡またはモニターされ得るように生物分子上に付
加特性を賦与する物質。
ポリアミノポリカルボキシレート：複数のアミノ基及
び複数のカルボキシル基を特徴とする、しばしばキレー
ト化剤として使用される化合物。
び複数のカルボキシル基を特徴とする、しばしばキレー
ト化剤として使用される化合物。
生成物：反応物質間の反応により得られる物質。
反応物質：反応の成分。例えば生物分子を標識試薬と
混合して結合体を生成する場合、生物分子及び標識試薬
は反応の２つの反応物質であり、結合体は生成物であ
る。
混合して結合体を生成する場合、生物分子及び標識試薬
は反応の２つの反応物質であり、結合体は生成物であ
る。
未結合反応物質：別の物質に物理的に結合しなかった
反応物質。
反応物質。
本発明は、未結合標識試薬を捕獲するために、不活性
マトリックス、好ましくは粒状マトリクックスに結合さ
せたキレート試薬またはキレート化ポリマーを使用する
ことに係わる。キレート化剤は、多くの標識試薬がそう
である低分子量化合物に対して高い結合活性及び高い親
和性を有するものが選択される。適当なキレート化剤と
しては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレン
トリアミン五酢酸（DTPA）、ポリアザ大環状化合物、ベ
ンジルDTPA、ベンジルEDTA、LiLo、IDAC、ポリアミノポ
リカルボキシレートの他の活性化誘導体、ある種の抗生
物質、クラウンエーテル、他の大環状化合物、例えばト
ランスフェリン、アポフェリチン及びメタロチオネイン
のような天然キレート化タンパク質、並びにジアゾ化芳
香族アミンを挙げることができる。キレート化ポリマー
及び他の多官能キレート試薬は、上述のものよりずっと
有効となり得る。
マトリックス、好ましくは粒状マトリクックスに結合さ
せたキレート試薬またはキレート化ポリマーを使用する
ことに係わる。キレート化剤は、多くの標識試薬がそう
である低分子量化合物に対して高い結合活性及び高い親
和性を有するものが選択される。適当なキレート化剤と
しては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレン
トリアミン五酢酸（DTPA）、ポリアザ大環状化合物、ベ
ンジルDTPA、ベンジルEDTA、LiLo、IDAC、ポリアミノポ
リカルボキシレートの他の活性化誘導体、ある種の抗生
物質、クラウンエーテル、他の大環状化合物、例えばト
ランスフェリン、アポフェリチン及びメタロチオネイン
のような天然キレート化タンパク質、並びにジアゾ化芳
香族アミンを挙げることができる。キレート化ポリマー
及び他の多官能キレート試薬は、上述のものよりずっと
有効となり得る。
適当なマトリックスとしては、ガラス、ポリスチレ
ン、アミン誘導ポリマー、シリカ、アガロース、シリカ
プロピルアミン、コポリマー及び他の樹脂を挙げること
ができる。所定のマトリックス−キレート試薬の組合せ
を用いると、キレート化剤をマトリックスに付着させる
のに複雑な反応を必要としない。例えばポリスチレン及
びガラスは、小分子、タンパク質などに対する固有結合
能を有する。しかしながら、アミン誘導ポリマービーズ
またはアミン誘導ポリマー被覆ガラスビーズの場合に
は、キレート試薬はビーズに化学的に結合され得る。
ン、アミン誘導ポリマー、シリカ、アガロース、シリカ
プロピルアミン、コポリマー及び他の樹脂を挙げること
ができる。所定のマトリックス−キレート試薬の組合せ
を用いると、キレート化剤をマトリックスに付着させる
のに複雑な反応を必要としない。例えばポリスチレン及
びガラスは、小分子、タンパク質などに対する固有結合
能を有する。しかしながら、アミン誘導ポリマービーズ
またはアミン誘導ポリマー被覆ガラスビーズの場合に
は、キレート試薬はビーズに化学的に結合され得る。
キレート試薬はマトリックス上で合成することができ
る。例を挙げると、まず、市販のアミン誘導ビーズをカ
ラムに充填する。ビーズを単純なカルボキシメチル化に
よってイミノ二酢酸基に結合し、カラムを緩衝液でフラ
ッシュする。ビーズをアンモニアで処理し、カラムをフ
ラッシュし、もう一度カルボキシメチル化ステップを実
施する。所望の数のカルボキシレート基が得られるまで
上記過程を繰り返す。
る。例を挙げると、まず、市販のアミン誘導ビーズをカ
ラムに充填する。ビーズを単純なカルボキシメチル化に
よってイミノ二酢酸基に結合し、カラムを緩衝液でフラ
ッシュする。ビーズをアンモニアで処理し、カラムをフ
ラッシュし、もう一度カルボキシメチル化ステップを実
施する。所望の数のカルボキシレート基が得られるまで
上記過程を繰り返す。
本発明は、金属で標識した生物分子を必要とする方法
に特に適している。キレート化剤の架橋を使用して生物
分子を標識すること、即ち、キレート化剤を生物分子に
結合し、次いで結合体に金属を、金属がキレート化剤に
よって結合されるように付加することは珍しくない。適
当な金属としては、α線及びβ線放射性核種、γ放射
体、ｘ線放射体、陽電子放射体、常磁性金属イオン、発
光金属及び蛍光金属を挙げることができる。使用し得る
元素及び同位体の範囲を更に例示するために、適当な候
補として、56Fe、54Fe、55Co、52Fe、43Sc、44Sc、47S
c、123I、125I、130I、131I、133I、135I、86Rb、134C
s、101Rh、203Pb、137Cs、133Ba、88Y、90Y、152Eu、67
Ga、68GA、51Cr、225Ac、32P、72As、153Sm、186Re、
199Au、105Rh、72Se、97Ru、100Pd、109Pd、119Sb、128
Ba、197Hg、211At、212Bi、212Pb、213Bi、188Re、142P
r、107As、111In、67Cu、75Br、77Br、11C、14C、13N、
15O、35S、18F、Pr、Nd、0159Gd、166Ho、194Ir、Sm、E
u、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、99mTc、192Ir、及び
291Amを挙げることができるが、キレート試薬を使用す
る場合には種がカチオンであるのが好ましい。
に特に適している。キレート化剤の架橋を使用して生物
分子を標識すること、即ち、キレート化剤を生物分子に
結合し、次いで結合体に金属を、金属がキレート化剤に
よって結合されるように付加することは珍しくない。適
当な金属としては、α線及びβ線放射性核種、γ放射
体、ｘ線放射体、陽電子放射体、常磁性金属イオン、発
光金属及び蛍光金属を挙げることができる。使用し得る
元素及び同位体の範囲を更に例示するために、適当な候
補として、56Fe、54Fe、55Co、52Fe、43Sc、44Sc、47S
c、123I、125I、130I、131I、133I、135I、86Rb、134C
s、101Rh、203Pb、137Cs、133Ba、88Y、90Y、152Eu、67
Ga、68GA、51Cr、225Ac、32P、72As、153Sm、186Re、
199Au、105Rh、72Se、97Ru、100Pd、109Pd、119Sb、128
Ba、197Hg、211At、212Bi、212Pb、213Bi、188Re、142P
r、107As、111In、67Cu、75Br、77Br、11C、14C、13N、
15O、35S、18F、Pr、Nd、0159Gd、166Ho、194Ir、Sm、E
u、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、99mTc、192Ir、及び
291Amを挙げることができるが、キレート試薬を使用す
る場合には種がカチオンであるのが好ましい。
同種のキレート化剤を生物分子及びマトリックスの両
方に結合させると、特定の利点が発揮される。親和性に
差がないので、一旦生物分子に結合した標識試薬が分離
操作によって引き離される可能性はわずかしかない。キ
レート試薬をマトリックス及び生物分子に結合する組合
せを具体的に説明する助けとするために、式： BM−Ａ−Ｌ Ｍ−Ｂ−Ｌ 〔式中、BMは生物分子であり、 Ｍはマトリックスであり、 Ａは第１のキレート試薬であり、 Ｂは第２のキレート試薬であり、 Ｌは標識である〕 を考える。
方に結合させると、特定の利点が発揮される。親和性に
差がないので、一旦生物分子に結合した標識試薬が分離
操作によって引き離される可能性はわずかしかない。キ
レート試薬をマトリックス及び生物分子に結合する組合
せを具体的に説明する助けとするために、式： BM−Ａ−Ｌ Ｍ−Ｂ−Ｌ 〔式中、BMは生物分子であり、 Ｍはマトリックスであり、 Ａは第１のキレート試薬であり、 Ｂは第２のキレート試薬であり、 Ｌは標識である〕 を考える。
Ｋは結合親和性を表わすとすると、下記のような幾つ
かの比較条件が表わされ得る。
かの比較条件が表わされ得る。
（１）Ａ＝Ｂ （２）Ａ≠Ｂ 且つ KA＝KB （３）KA＞KB （４）KA＞KB 捕獲方法の別の実施態様においては、 Ｍ−Ｃ−Ｌ 〔式中、Ｃは第３のキレート試薬である〕 で表される追加成分をあわせて３種のキレート試薬が使
用され、BM−Ａ−Ｌ、Ｍ−−Ｌ及びＭ−Ｃ−Ｌは該方法
においては同時に使用される。キレート試薬Ｂ及びＣ
は、両方が同じマトリックスに結合されるか、または各
々が別個のマトリックスに結合されるかのいずれかであ
る。後者の実施態様に係わる比較条件としては下記のも
のを挙げることができる。
用され、BM−Ａ−Ｌ、Ｍ−−Ｌ及びＭ−Ｃ−Ｌは該方法
においては同時に使用される。キレート試薬Ｂ及びＣ
は、両方が同じマトリックスに結合されるか、または各
々が別個のマトリックスに結合されるかのいずれかであ
る。後者の実施態様に係わる比較条件としては下記のも
のを挙げることができる。
（５）Ａ＝Ｂ 且つ KC＜KA （６）KB＜KA 且つ KC＜KA （７）KB＝KA 且つ KC＜KA 上述したように、同じキレート試薬が生物分子及びマ
トリックスに結合している比較条件（１）は好ましい組
合せである。比較条件（２）は比較条件（１）と機能的
に等価である。比較条件（３）によって表される精製効
率は、KBがKAよりどのくらい低いかに従う。Ｍ−Ｂ−Ｌ
の量の増加とともに、見掛けの不足が補填され得る。比
較条件（４）は、KAがKBよりずっと小さいのでなければ
容認可能である。比較条件（５）、（６）及び（７）
は、所定のキレート試薬を用いると予想外の利益がもた
らされ得る。
トリックスに結合している比較条件（１）は好ましい組
合せである。比較条件（２）は比較条件（１）と機能的
に等価である。比較条件（３）によって表される精製効
率は、KBがKAよりどのくらい低いかに従う。Ｍ−Ｂ−Ｌ
の量の増加とともに、見掛けの不足が補填され得る。比
較条件（４）は、KAがKBよりずっと小さいのでなければ
容認可能である。比較条件（５）、（６）及び（７）
は、所定のキレート試薬を用いると予想外の利益がもた
らされ得る。
標識操作は、１つ以上の密封反応容器内または複数の
隔室をもつ単一反応容器内で実施することができる。図
１は、第１の反応バイアルと、キレート試薬付着マトリ
ックスを含む第２のバイアルと、第３の生成物バイアル
とを含む複数の容器を必要とする実施態様を示す。放射
性標識は第１のバイアル内で行われ、反応混合物は第２
のバイアルに移され、そこで混合物はキレート試薬−マ
トリックス結合体と接触し、次いで例えばシリンジによ
って上清が取り出され、その上清は、場合によっては
過して、第３のバイアル内に収集される。
隔室をもつ単一反応容器内で実施することができる。図
１は、第１の反応バイアルと、キレート試薬付着マトリ
ックスを含む第２のバイアルと、第３の生成物バイアル
とを含む複数の容器を必要とする実施態様を示す。放射
性標識は第１のバイアル内で行われ、反応混合物は第２
のバイアルに移され、そこで混合物はキレート試薬−マ
トリックス結合体と接触し、次いで例えばシリンジによ
って上清が取り出され、その上清は、場合によっては
過して、第３のバイアル内に収集される。
図２は、複数の隔室を有する単一容器が表されている
別の実施態様を示す。前記隔室は、第１の隔室（Ｉ）か
ら、キレート試薬付着マトリックスを含む隣り合った第
２の隔室（II）への反応混合物の移送を可能にする手段
によって相互に分離されている。この実施態様において
は、例えば止めコックのような弁デバイスが隔室を分離
している。止めコックの等価物としては、破裂可能な非
透過性膜、可動ストッパー及び切込み線入りガラス（sc
ored glass）を挙げることができる。未結合反応試薬
がキレート試薬−マトリックス結合体によって反応混合
物から除去された後にその反応混合物を受取る第３の隔
室（III）を前記第２の隔室に取り付けることができ
る。
別の実施態様を示す。前記隔室は、第１の隔室（Ｉ）か
ら、キレート試薬付着マトリックスを含む隣り合った第
２の隔室（II）への反応混合物の移送を可能にする手段
によって相互に分離されている。この実施態様において
は、例えば止めコックのような弁デバイスが隔室を分離
している。止めコックの等価物としては、破裂可能な非
透過性膜、可動ストッパー及び切込み線入りガラス（sc
ored glass）を挙げることができる。未結合反応試薬
がキレート試薬−マトリックス結合体によって反応混合
物から除去された後にその反応混合物を受取る第３の隔
室（III）を前記第２の隔室に取り付けることができ
る。
第３の隔室は、密封２隔室容器を使用する（本発明に
使用し得る密封２隔室容器の例は、In responnoble,16
0 USPQ 237に示されている）。標識反応は第１の隔室
内で行われるが、そこには例えばシリンジによって反応
物質が導入される。第２の隔室は、キレート試薬−マト
リックスを含んでいる。標識反応が完了したら、第１の
隔室と第２の隔室とを分離しているストッパー手段を破
壊し、第２の隔室内で反応物質をキレート試薬−マトリ
ックスと接触させる。未結合標識がキレート試薬−マト
リックスによって捕獲されるのに十分な時間の後、上清
中の標識生物分子をシリンジを使用して取り出すことが
できる。操作全体が密封された無菌容器内で行われるが
故に、上清は患者に直接投与することができる。キレー
ト試薬に結合させるマトリックス、例えばポリマービー
ズの寸法は、大きすぎてシリンジに入らないように選択
する。
使用し得る密封２隔室容器の例は、In responnoble,16
0 USPQ 237に示されている）。標識反応は第１の隔室
内で行われるが、そこには例えばシリンジによって反応
物質が導入される。第２の隔室は、キレート試薬−マト
リックスを含んでいる。標識反応が完了したら、第１の
隔室と第２の隔室とを分離しているストッパー手段を破
壊し、第２の隔室内で反応物質をキレート試薬−マトリ
ックスと接触させる。未結合標識がキレート試薬−マト
リックスによって捕獲されるのに十分な時間の後、上清
中の標識生物分子をシリンジを使用して取り出すことが
できる。操作全体が密封された無菌容器内で行われるが
故に、上清は患者に直接投与することができる。キレー
ト試薬に結合させるマトリックス、例えばポリマービー
ズの寸法は、大きすぎてシリンジに入らないように選択
する。
適当なマトリックスを選択し、キレート化剤と結合さ
せる。図３は、間接的結合によってビーズを調製する例
である。ヒト血清アルブミン（HSA）とジエチレントリ
アミン五酢酸（DTPA）とを結合させる。HSA−DTPA結合
体を粒状ポリマーマトリックス（Ｐ）に付着させてＰ−
HSA−DTPAを形成する。別の反応バイアルにおいて、キ
レート試薬（CHL）、この実施例においては好ましくはD
TPAをモノクローナル抗体（MoAb）と結合させる。MoAb
−CHL結合体をインジウム（In（111））で標識する。図
中、未結合標識試薬はIn（111）と示してあり、標識抗
体はMoAb−CHL−In（111）と示してある。Ｐ−HSA−DTP
Aを反応混合物に加え、In（111）をキレート化によって
捕獲する。
せる。図３は、間接的結合によってビーズを調製する例
である。ヒト血清アルブミン（HSA）とジエチレントリ
アミン五酢酸（DTPA）とを結合させる。HSA−DTPA結合
体を粒状ポリマーマトリックス（Ｐ）に付着させてＰ−
HSA−DTPAを形成する。別の反応バイアルにおいて、キ
レート試薬（CHL）、この実施例においては好ましくはD
TPAをモノクローナル抗体（MoAb）と結合させる。MoAb
−CHL結合体をインジウム（In（111））で標識する。図
中、未結合標識試薬はIn（111）と示してあり、標識抗
体はMoAb−CHL−In（111）と示してある。Ｐ−HSA−DTP
Aを反応混合物に加え、In（111）をキレート化によって
捕獲する。
図４は、ビーズとキレート試薬とを直接結合させる別
の実施態様である。アルキルアミン誘導の粒状ポリマー
マトリックス（Ｐ−NH…）をDTPAと結合してAM−DTPAを
形成する。図３に示したのと同様に、AM−DTPAは反応混
合物からIn（111）を捕獲する。
の実施態様である。アルキルアミン誘導の粒状ポリマー
マトリックス（Ｐ−NH…）をDTPAと結合してAM−DTPAを
形成する。図３に示したのと同様に、AM−DTPAは反応混
合物からIn（111）を捕獲する。
マトリックスへの非特異的結合を更に最小化するため
に、結合体を、タンパク質または炭水化物材料に暴露し
て非特異的部位をブロックすることもできる。適当なブ
ロック物質としては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清ア
ルブミン、血清、ポリビニルピロリドン、デキストラン
及びフィコールを挙げることができる。キレート試薬−
マトリックス結合体を完全に洗浄し、適当な量を第１の
容器または前記複数隔室付き容器の隔室内に入れる。
に、結合体を、タンパク質または炭水化物材料に暴露し
て非特異的部位をブロックすることもできる。適当なブ
ロック物質としては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清ア
ルブミン、血清、ポリビニルピロリドン、デキストラン
及びフィコールを挙げることができる。キレート試薬−
マトリックス結合体を完全に洗浄し、適当な量を第１の
容器または前記複数隔室付き容器の隔室内に入れる。
生物分子は、好ましくはマトリックスに結合させたの
と同種のキレート化剤と結合させる。結合ステップに次
いで、生物分子を、例えば沈澱またはゲル排除クロマト
グラフィーによって未結合キレート化剤から分離する。
得られた溶液を第２の容器または前記複数隔室付き容器
の別の隔室に入れる。通常は市販業者から購入される標
識試薬を生物分子含有溶液中に導入し、適当なインキュ
ベーション条件下でキレート化を進行させる。次のステ
ップにおいては、標識試薬溶液を、キレート試薬−マト
リックス結合体を含む容器または隔室に移す。最終混合
物を周期的に混合しながらインキュベートする。標識生
物分子を含む上清を取り出す。
と同種のキレート化剤と結合させる。結合ステップに次
いで、生物分子を、例えば沈澱またはゲル排除クロマト
グラフィーによって未結合キレート化剤から分離する。
得られた溶液を第２の容器または前記複数隔室付き容器
の別の隔室に入れる。通常は市販業者から購入される標
識試薬を生物分子含有溶液中に導入し、適当なインキュ
ベーション条件下でキレート化を進行させる。次のステ
ップにおいては、標識試薬溶液を、キレート試薬−マト
リックス結合体を含む容器または隔室に移す。最終混合
物を周期的に混合しながらインキュベートする。標識生
物分子を含む上清を取り出す。
或いは、エフェクター分子として作用する生物分子、
例えば抗体または核酸プローブは、それ自体が検出可能
な物質で標識する必要はない。代わりに、前記エフェク
ター分子を第１の結合パートナー分子で標識し、検出可
能な標識物質を第２の結合パートナー分子に結合させ、
前記第１及び第２の結合パートナー分子を相互に反応さ
せて結合体を形成する。この別の標識方法はプレターゲ
ット（pretargeting）として公知である。例えば、組織
反応ストレプトアビジン結合抗体は、放射性標識ビオチ
ンを使用して可視化することができ、ポリＡテールを含
むハイブリダイズ核酸プローブは、アルカリ性ホスファ
ターゼ結合ポリＴオリゴヌクレオチドや、NBT/BCIPのご
とき適当なホスファターゼ基質を用いて可視化すること
ができる。第１の抗体例においてはストレプトアビジン
及びビオチンが第１及び第２の結合パートナー分子であ
り、第２の核酸例においてはポリＡ及びポリＴポリヌク
レオチドが第１及び第２の結合パートナー分子である。
結合パートナー分子として使用し得るポリマーとして
は、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル、ポリエチレンオキシド、並びに、ポリアクリル酸及
びポリメタクリル酸と反応するポリ−Ｎ−ビニルピリジ
ンを挙げることができる。
例えば抗体または核酸プローブは、それ自体が検出可能
な物質で標識する必要はない。代わりに、前記エフェク
ター分子を第１の結合パートナー分子で標識し、検出可
能な標識物質を第２の結合パートナー分子に結合させ、
前記第１及び第２の結合パートナー分子を相互に反応さ
せて結合体を形成する。この別の標識方法はプレターゲ
ット（pretargeting）として公知である。例えば、組織
反応ストレプトアビジン結合抗体は、放射性標識ビオチ
ンを使用して可視化することができ、ポリＡテールを含
むハイブリダイズ核酸プローブは、アルカリ性ホスファ
ターゼ結合ポリＴオリゴヌクレオチドや、NBT/BCIPのご
とき適当なホスファターゼ基質を用いて可視化すること
ができる。第１の抗体例においてはストレプトアビジン
及びビオチンが第１及び第２の結合パートナー分子であ
り、第２の核酸例においてはポリＡ及びポリＴポリヌク
レオチドが第１及び第２の結合パートナー分子である。
結合パートナー分子として使用し得るポリマーとして
は、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル、ポリエチレンオキシド、並びに、ポリアクリル酸及
びポリメタクリル酸と反応するポリ−Ｎ−ビニルピリジ
ンを挙げることができる。
以下の非限定的な実施例によって本発明の態様を更に
説明する。
説明する。
実施例１ ２ステップ法において、ポリスチレンビーズをDTPAと
結合させた。50mMリン酸緩衝溶液,pH7.2中のヒト血清ア
ルブミン（HSA）を100倍モル過剰のDTPA二無水物と一緒
に室温で15分間インキュベートした。混合物をＧ−50カ
ラムに通すことにより、未結合のDTPAを除去した。
結合させた。50mMリン酸緩衝溶液,pH7.2中のヒト血清ア
ルブミン（HSA）を100倍モル過剰のDTPA二無水物と一緒
に室温で15分間インキュベートした。混合物をＧ−50カ
ラムに通すことにより、未結合のDTPAを除去した。
HSA−DTPA溶液を14mg/mlに調整し、約40個の1/4イン
チ球状非多孔質ビーズを溶液に加えた。混合物を静かに
振盪しながら室温で２時間インキュベートした。液体を
デカントし、ビーズを蒸留水で洗浄し、真空下に乾燥し
た。
チ球状非多孔質ビーズを溶液に加えた。混合物を静かに
振盪しながら室温で２時間インキュベートした。液体を
デカントし、ビーズを蒸留水で洗浄し、真空下に乾燥し
た。
実施例２ 乾燥クロロホルム中の0.1mg/ml DTPA無水物溶液を調
製し、所望の量のDTPAを含むアリコートを反応容器に加
えた。室温で窒素ガスを用いて蒸発させることによりク
ロロホルムを除去した。0.05M重炭酸緩衝液中の抗体
（約0.5mg）溶液,pH7.0を前記反応容器に加え、無水物
対タンパク質のモル比を7:1とした。溶液を振盪しなが
ら１分間インキュベートし、Sephadex G−50カラムに通
すことにより結合抗体を回収した。
製し、所望の量のDTPAを含むアリコートを反応容器に加
えた。室温で窒素ガスを用いて蒸発させることによりク
ロロホルムを除去した。0.05M重炭酸緩衝液中の抗体
（約0.5mg）溶液,pH7.0を前記反応容器に加え、無水物
対タンパク質のモル比を7:1とした。溶液を振盪しなが
ら１分間インキュベートし、Sephadex G−50カラムに通
すことにより結合抗体を回収した。
実施例３ 1.Mアセテートを使用し、最終pH6.0を有するアセテー
ト中0.5Mの放射性核種溶液を調製した。放射性核種溶液
を抗体−DTPA結合体に、0.1mlの25％ヒト血清アルブミ
ンと一緒に加え、混合物を頻繁に振盪しながら５〜30分
間インキュベートした。
ト中0.5Mの放射性核種溶液を調製した。放射性核種溶液
を抗体−DTPA結合体に、0.1mlの25％ヒト血清アルブミ
ンと一緒に加え、混合物を頻繁に振盪しながら５〜30分
間インキュベートした。
実施例４ 総容積0.75mlの酢酸／クエン酸緩衝液中に111Inを含
む溶液にHSA−DTPAビーズを約30分間で加えた。溶液を
除去し、ビーズに結合した放射能を測定した。
む溶液にHSA−DTPAビーズを約30分間で加えた。溶液を
除去し、ビーズに結合した放射能を測定した。
ビーズ数 放射能（μCi） ５ 22 12 30 20 62 ビーズ数と結合した放射能の量とには正の相関があ
る。更に1M HClでビーズを洗浄すると、結合した全ての
放射能が除去され、ビーズを再使用することができた。
る。更に1M HClでビーズを洗浄すると、結合した全ての
放射能が除去され、ビーズを再使用することができた。
実施例５ HSA−DTPAを、前述のごときクエン酸／酢酸緩衝液中
の111Inで標識した。アリコートを取り出し、過剰のDTP
Aで処理した。前記DTPA処理したアリコートを薄層クロ
マトグラフィーで分析し、遊離111Inの割合を測定し
た。アリコートは12.2％の遊離111Inを含んでいた。５
つのHSA−DTPAビーズをHSA−DTPA−111In溶液に加え、
混合物を室温で30分間インキュベートした。この混合物
からアリコートを取り出し、過剰のDTPAで処理し、遊離
111InをTLCによって分析した。前記第２のアリコートは
3.9％の遊離111Inを含んでいた。
の111Inで標識した。アリコートを取り出し、過剰のDTP
Aで処理した。前記DTPA処理したアリコートを薄層クロ
マトグラフィーで分析し、遊離111Inの割合を測定し
た。アリコートは12.2％の遊離111Inを含んでいた。５
つのHSA−DTPAビーズをHSA−DTPA−111In溶液に加え、
混合物を室温で30分間インキュベートした。この混合物
からアリコートを取り出し、過剰のDTPAで処理し、遊離
111InをTLCによって分析した。前記第２のアリコートは
3.9％の遊離111Inを含んでいた。
実施例６ LiLoは、OTC/Bionetics Research instituteで開発
された新規のキレート試薬であり、係属米国特許出願第
07/358917号に記載されている。このキレート試薬をア
ミン誘導（AM）ビーズに、水またはリン酸緩衝溶液,pH
7.2中に調製したLiLo飽和溶液5mlに60個のAMビーズを暴
露することにより付着させた。NaOHを使用して混合物の
pHを7.5〜8.5に調整した。溶液を室温で一晩撹拌した。
液体をデカントし、1M HClをビーズに加えた。混合物を
室温で10分間インキュベートした。このステップで、Li
Lo結合AMビーズに結合した遊離金属が除去される。ビー
ズを0.1M HClを用いて繰り返し濯いだ。次いで蒸留水を
用いて、洗液がpHペーパーに対して中性になるまで濯い
だ。ビーズを真空下に乾燥し、デシケーター内に保管し
た。
された新規のキレート試薬であり、係属米国特許出願第
07/358917号に記載されている。このキレート試薬をア
ミン誘導（AM）ビーズに、水またはリン酸緩衝溶液,pH
7.2中に調製したLiLo飽和溶液5mlに60個のAMビーズを暴
露することにより付着させた。NaOHを使用して混合物の
pHを7.5〜8.5に調整した。溶液を室温で一晩撹拌した。
液体をデカントし、1M HClをビーズに加えた。混合物を
室温で10分間インキュベートした。このステップで、Li
Lo結合AMビーズに結合した遊離金属が除去される。ビー
ズを0.1M HClを用いて繰り返し濯いだ。次いで蒸留水を
用いて、洗液がpHペーパーに対して中性になるまで濯い
だ。ビーズを真空下に乾燥し、デシケーター内に保管し
た。
実施例７ 酸洗浄した反応バイアル内で、200μCiの塩化インジ
ウムを、15μｌの酢酸緩衝液（0.6M,pH5.5）及び15μｌ
のクエン酸緩衝液（0.06M,pH5.5）と混合した。この溶
液に抗体−DTPA結合体（リン酸緩衝溶液,pH7.2中に157
μｇ）を加え、混合物を室温で約30分間インキュベート
した。次いで、約1mlのリン酸緩衝溶液（0.05M,pH7.2）
を加えた。反応混合物のアリコートを過剰のDTPA溶液で
処理し、反応混合物中の未結合のインジウム−111の割
合を測定した。残りの反応溶液に、８つのAM−LiLoビー
ズを加えた。ビーズと一緒に30分間インキュベートした
後、反応溶液のアリコートを過剰のDTPAで処理した。ク
ロマトグラフィー分析を実施して、未結合のインジウム
−111の割合を測定した。結果は下記の通りである。
ウムを、15μｌの酢酸緩衝液（0.6M,pH5.5）及び15μｌ
のクエン酸緩衝液（0.06M,pH5.5）と混合した。この溶
液に抗体−DTPA結合体（リン酸緩衝溶液,pH7.2中に157
μｇ）を加え、混合物を室温で約30分間インキュベート
した。次いで、約1mlのリン酸緩衝溶液（0.05M,pH7.2）
を加えた。反応混合物のアリコートを過剰のDTPA溶液で
処理し、反応混合物中の未結合のインジウム−111の割
合を測定した。残りの反応溶液に、８つのAM−LiLoビー
ズを加えた。ビーズと一緒に30分間インキュベートした
後、反応溶液のアリコートを過剰のDTPAで処理した。ク
ロマトグラフィー分析を実施して、未結合のインジウム
−111の割合を測定した。結果は下記の通りである。
実施例８ IDAC−２は、OTC/BRIで開発された新規のキレート試
薬であり、係属米国特許出願第07/358917号に記載され
ている。実施例７に記載の方法に従って、IDAC−２をAM
ビーズに結合した。
薬であり、係属米国特許出願第07/358917号に記載され
ている。実施例７に記載の方法に従って、IDAC−２をAM
ビーズに結合した。
上記開示内容は、可能性及び好ましい実施態様を説明
することで本発明を詳細に記載したが、本発明の範囲及
び主旨から逸脱せずとも、変更、改良がなされ得、また
他の用途も可能であることは当業者には明らかであろ
う。本発明の範囲は添付のクレイムによって示され、ク
レイムと等価の意味及び範囲内にあるいかなる変更も本
発明の範囲内に含まれる。
することで本発明を詳細に記載したが、本発明の範囲及
び主旨から逸脱せずとも、変更、改良がなされ得、また
他の用途も可能であることは当業者には明らかであろ
う。本発明の範囲は添付のクレイムによって示され、ク
レイムと等価の意味及び範囲内にあるいかなる変更も本
発明の範囲内に含まれる。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 501 G01N 33/543 525 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (29)
- 【請求項１】キレート試薬を介して金属と結合している
生物分子および非結合金属を含む生物分子の標識用反応
混合物から非結合金属を捕獲する方法であって、金属の
生物分子への結合が実質的に完了した後に、該反応混合
物を、非結合金属に結合し得る不溶性キレート試薬−マ
トリックス結合体に接触させるステップを含み、該ステ
ップにより非結合金属がキレート試薬−マトリックスに
結合し反応混合物から分離され、不溶性キレート試薬−
マトリックス中のキレート試薬がLiLoまたはIDAC−２で
あることを特徴とする前記方法。 - 【請求項２】不溶性キレート試薬−マトリックス中のキ
レート試薬がLiLoである請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】金属がInまたはＹである請求項１に記載の
方法。 - 【請求項４】金属がInである請求項２に記載の方法。
- 【請求項５】生物分子に結合するキレート試薬のうち少
なくとも１つがLiLoである請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】前記生物分子がペプチドあるいはタンパク
質である請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】前記タンパク質が免疫グロブリンあるいは
免疫グロブリンのフラグメントである請求項６に記載の
方法。 - 【請求項８】前記生物分子が核酸、オリゴヌクレオチド
あるいはポリヌクレオチドである請求項１に記載の方
法。 - 【請求項９】前記金属が放射性核種である請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１０】前記金属が放射性核種である請求項３に
記載の方法。 - 【請求項１１】前記マトリックスが粒子状である請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１２】前記マトリックスがアミン誘導体化され
ている請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】前記マトリックスが容器の内部表面から
成る請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】前記マトリックスが膜である請求項１に
記載の方法。 - 【請求項１５】キレート試薬を介して金属と結合してい
る生物分子および非結合金属を含む生物分子の標識用反
応混合物から非結合金属を捕獲する方法であって、金属
の生物分子への結合が実質的に完了した後に、該反応混
合物を、非結合金属に結合し得る不溶性キレート試薬−
マトリックス結合体に接触させるステップを含み、該ス
テップにより非結合金属がキレート試薬−マトリックス
に結合し反応混合物から分離され、不溶性キレート試薬
−マトリックス中のキレート試薬が生物分子に結合する
キレート試薬のうち少なくとも１つと同じキレート試薬
であることを特徴とする前記方法。 - 【請求項１６】不溶性キレート試薬中のキレート試薬が
LiLoあるいはIDAC−２である請求項15に記載の方法。 - 【請求項１７】請求項１に記載の方法を実施するための
キットであり、LiLo−マトリックス結合体を含む滅菌容
器、キレート試薬免疫グロブリン結合体を含む第２の容
器、２つの結合体を接触させる手段および接触後２つの
結合体を分離する手段を含む前記キット。 - 【請求項１８】複数の隔室、１つの隔室中のキレート試
薬−マトリックス結合体および第２の隔室中のキレート
試薬−免疫グロブリン結合体を有する滅菌容器を含むキ
ットであり、キレート試薬−マトリックス中のキレート
試薬がLiLoであることを特長とする前記キット。 - 【請求項１９】キレート試薬−免疫グロブリン複合体が
LiLoである請求項18に記載のキット。 - 【請求項２０】実質的に非結合金属を含まない、金属で
標識された滅菌生物分子組成物の調製方法であって、 （ａ）生物分子キレート化成分結合体を、滅菌容器中の
反応混合物中において金属と接触させ、キレート化成分
を介して金属を生物分子に結合させるステップ、および （ｂ）ステップ（ａ）の混合物を、非結合金属に結合し
得る不溶性キレート試薬−マトリックス結合体であっ
て、実質的に全非結合金属に結合するのに十分な量の該
結合体と接触させるステップであり、キレート試薬−マ
トリックス結合体中のキレート試薬がLiLoであり、該ス
テップにより、結合金属を含む固相および標識化生物分
子を含む液相とを生成し、相分離により液相と固相から
分離することを特徴とするステップからなることを特徴
とする前記調製方法。 - 【請求項２１】前記金属がInあるいはＹである請求項20
に記載の方法。 - 【請求項２２】前記生物分子が免疫グロブリンである請
求項21に記載の方法。 - 【請求項２３】InあるいはＹが放射活性である請求項21
に記載の方法。 - 【請求項２４】生物分子キレート化成分結合体中のキレ
ート試薬がLiLoである請求項20に記載の方法。 - 【請求項２５】標識化生物分子を含む液相をシリンジに
より固相から分離し、キレート試薬−マトリックス複合
体が大きすぎてシリンジから出ないことを特徴とする請
求項20に記載の方法。 - 【請求項２６】ステップ（ａ）および（ｂ）を別個の反
応容器中で実施し、反応物質をシリンジを用いて導入及
び回収する請求項20に記載の方法。 - 【請求項２７】ステップ（ａ）および（ｂ）を１つの容
器中の別個の隔室内で実施し、該隔室が隔室間で内容物
の移送を可能にする手段により相互に連結されているこ
とを特徴とする請求項20に記載の方法。 - 【請求項２８】更に、前記第２の隔室に連結されている
第３の隔室を含み、該第２および第３の隔室が隔室間で
内容物の移送を可能にする手段により相互に連結されて
いることを特徴とする請求項27に記載の方法。 - 【請求項２９】前記隔室間の内容物の移送を可能にする
手段が、脱着自在の遮断手段によって遮断されている請
求項27に記載の方法。
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