PT95574B

PT95574B - Processo para purificar compostos conjugados com agente quelante

Info

Publication number: PT95574B
Application number: PT95574A
Authority: PT
Inventors: Ramaswamy Subramanian
Original assignee: Akzo Nv
Priority date: 1989-10-11
Filing date: 1990-10-11
Publication date: 1997-08-29
Also published as: DK48892D0; AU656717B2; ES2097156T3; JPH05503354A; WO1991006008A1; EP0495878A4; FI921579A0; ATE145560T1; KR920704139A; US5244816A; EP0495878B1; EP0495878A1; ZA908095B; JP3078575B2; KR100206060B1; FI921579A; PT95574A; CA2069303A1; DE69029274D1; DK48892A

Description

CAMPO DO INVENTO

O invento refere-se à marcação de biomoléculas. Mais especificamente, o invento refere-se à separação de biomoléculas marcadas a partir de reagente marcador não ligado, a seguir à reacção de marcação. 0 invento tem especial relevância quando a biomolécula é uma proteína e o reagente marcador é um radionuclideo. As aplicações especiais caem nos campos dos imunodiagnósticos e da imunoterapia.

ANTECEDENTES DO INVENTO

As biomoléculas podem ser marcadas com qualquer um de uma diversidade de reagentes, incluindo radionuclideos toxinas, vitaminas, compostos fluorescentes e agentes de que 1ação. Um reagente marcador pode ser incorporado como constituinte de uma biomolécula, por exemplo por marcação metabólica ou por tradução por corte ou pode ser ligado a uma biomolécula através de uma ligação covalente ou de outra força intermolecular. Os exemplos desta última categoria de processo de marcação incluem a utilização de derivados isotiocianato de fluorocromos, para tornar os anticorpos fluorescentes, a utilização de derivados fotoactivos da biotina, para marcar ácidos nucleicos, e a utilização de reacções oxidativas ou mediadas por enzimas, para ligar iodo a proteínas, nos resíduos de tirosina. 0 processo de marcação pode ser tão simples como misturar uma biomolécula e um reagente marcador.

A patente n2 4 707 352 dos Estados Unidos apresenta um processo de marcação que compreende o passo de pôr em contacto um composto não marcado, que consiste num agente de quelação conjugado com uma biomolécula, com um material transferidor de iões, ao qual está ligado um radiometal . A afinidade do dito material transferidor de iões para o radiometal é menor do que a afinidade do dito agente de quelação pelo dito metal. No exemplo, usa-se uma coluna que contém uma resina de permuta xónica carregada com ®^Nx . Passa-se um conjugado de agente queIante através da coluna e elui-se na forma de conjugado de agente quelante radiomarcado. Os componentes para o processo de marcação podem

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-3—

estar incorporados sm conjuntos.

No final de uma reacção de marcação é, frequentemente, desejável purificar a biomolécula marcada, o produto, separando qualquer dos reagentes, particularmente o reagente marcador que não reagiu, do dito produto. A presença de reagente marcador não ligado pode confundir os resultados, associando-se a moléculas irrelevantes (ligação não específica) ou contribuindo para o ruído de fundo.

Uma vez que muitos reagentes marcadores são moléculas pequenas ou elementos, os processos comuns para separar o produto do reagente que não reagiu fundamentam-se em diferenciais de tamanho ou de peso. Portanto, podem usar-se diálise ou cromatografia de exclusão de tamanho. Se houver uma diferença de carga entre o produto e o reagente, a cromatografia de permuta iónica é um processo de separação adequado.

Na patente E.U.A. nQ 4 454 106 apresenta—se um processo para purificar anticorpos radiomarcados por combinação de resinas de permuta iónica e de exclusão de tamanho. Constitui-se uma coluna de 9 cm, que compreende 1 ml de uma resina.retardante de iões, sobre 1 ml de resina de permuta catiónica de 200-400 mesh, sobre 7 ml de meio de filtração de gel capaz de proporcionar partículas de 1.500-25.000 dalton de peso. Equilibra-se a coluna com um tampão que consiste em cloreto de sódio 200 mM e em MES 10 mM, a pH 6. Na patente U.S.nS 4 472 509 relacionada, o leito preferido para purificar anticorpos marcados com tecnécio é o leito de três componentes descrito acima, modificado pela inclusão de 1 ml de uma resina de permuta aniónica, situada abaixo da resina de permuta catiónica e acima do meio de filtração de gel.

Mukkala et al. (Anal. Biochem. (1989) 176:319-325) marcaram IgG com Eu³⁺ usando agentes quelantes que estabelecem pontes. 0 produto anticorpo marcado foi purificado a partir dos reagentes, passando a mistura reaccional numa coluna Sephadex G-50 de l,5x x5cm (Pharmacia Fine Chemical; pérolas de dextrano) combinada com uma coluna Trisacryl GF2000 de 1,5x30 cm (Reactifs IBF; pérolas de poliacrilamida).

•X

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Esteban et al. (J. Nucl. Med.. (1987) 28:861-870) compararam quatro protocolos para a purificação de anticorpos marcados com ¹¹²-In, no final do processo de marcação. Dividiram uma única preparação de marcação em quatro porções iguais. Uma alíquota foi tratada com excesso de EDTA em solução, sem separação subsequente. Outra aliquota foi passada por uma coluna de gel de exclusão (Sephadex G-50 fina) com 1x8 cm. Ά terceira aliquota foi injectada numa coluna de HPLC (TSK 3000) com 7,5 mm x 30 cm e a última aliquota foi tratada sequencialmente na coluna 650 e, depois, na coluna TSK 3000. Os resultados mais fracos foram obtidos com o tratamento com EDTA, a coluna G-50 foi ligeiramente melhor, o anticorpo marcado purificado por HPLC teve uma razão tumor:fígado três vezes maior do que a aliquota purificada com EDTA e os melhores resultados foram obtidos com a combinação G-50/TSK 3000. Os autores concluíram que o processo com EDTA, amplamente usado, era ineficaz na produção de preparações limpas e que deveriam considerar-se outros processos de purificação se se quisesse minimizar o ruído de fundo.

A patente E.U.A. nS 4 775 638 apresenta uma técnica num só frasco para radiomarcar anticorpos. 0 processo compreende introduzir o radioisótopo num recipiente fechado, cuja superfície interior está revestida com um cataiizador; introduzir o anticorpo no dito recipiente; incubar a mistura; introduzir no dito recipiente uma resina de permuta iónica que absorva o radioisótopo não ligado ao anticorpo; escoar a mistura; e separar a resina do sobrenadante. A resina preferida é um permutador aniónico tal como o AG 1-X8 (Bio—Rad). Apesar de o método se dirigir em primeiro lugar para processos de radioiodação, o inventor supõe que a ligação, mediada por catalisador, do radioisótopo ao anticorpo e a purificação subsequente do dito anticorpo marcado, possam ser adaptadas a marcação com ⁶⁷Ga e -^^In por quelação.

Não obstante a diversidade de processos de separação disponíveis para o perito na arte, .uma limitação . sistemática constrange a utilização de biomoléculas marcadas em processos que requeiram sensibilidade elevada. Essa limitação é a, por vezes

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baixa eficácia da remoção do reagente marcador não ligado, de muitos dos processos actuais da arte. Um exemplo claro é o uso in situ de anticorpos anti-cancro radiornarcados, para a detecção de tumores malignos, processo conhecido por radioimunocintigrafia. Por diversas razões, não directamente relacionadas com o presente invento, frequentemente apenas uma pequena quantidade de anticorpo se liga às células malignas. Portanto, é difícil distinguir o sinal, mesmo em condições ideais. Não é incomum o diagnóstico tornar-se impossível devido ao elevado ruído de fundo. Assim, um modo para assegurar ou intensificar a detecção é usar um anticorpo marcado que esteja significativamente isento de radionuclídeos não ligados.

Outra limitação à utilização de cromatografia de exclusão em gel é a propensão dos anticorpos IgM para se ligarem não-especificamente e, por vezes, irreversivelmente, à matriz da coluna. Veja-se, por exemplo Halpern et al., J. Nucl.Med. (1988) 29:1688-1696).

Outra limitação diz respeito à demora da maior parte dos processos. Muitos dos radionuclídeos e, particularmente, os radiometais, têm uma semi-vida curta que, se não é de dias, é frequentemente de uma questão de horas. Portanto, uma purificação rápida aumenta a actividade específica de uma preparação de biomoléculas marcadas.

Para além disso, os processos de separação referidos acima não deixam de ter defeitos. Muitos exigem equipamento dispendioso e técnicos experientes, são propensos a contaminação biológica, exigem controlo apertado, não são passíveis de aumento de escala, e similares. 0 equipamento pode ser de descontaminação difícil e dispendiosa, na eventualidade de derrames radioactivos.

A resolução dos problemas acima mencionados foi a motivação para o presente invento. Aqui é descrito um processo para se obter um grau de separação mais elevado, do produto marcado do reagente não ligado, de que o conseguido usando processos correntes. 0 presente processo é vantajoso por diversas razões, incluindo simplicidade e baixo custo. Adicionalmente, o processo

não é propenso a contaminação biológica, não afecta a bioactividade da biomolécula, proporciona produtos muito concentrados, pode ser usado num laboratório padrão de hospital por pessoal de enfermagem, é fácil de deitar fora depois da utilização, tem um tempo de prateleira longo e é adaptável à utilização com uma diversidade de reagentes marcadores e de biomoléculas.

SUMARIO DO INVENTO presente invento refere-se a um processo para separar o produto, biomoléculas marcadas depois de uma reacção de marcação, de qualquer reagente marcador não ligado ou fracamente ligado. 0 invento ensina a utilizar matrizes com agentes quelantes ligados para remover o dito reagente marcador não ligado. 0 processo oferece diversas vantagens, incluindo simplicidade, remoção muito eficiente do reagente marcador não ligado e economia. Os reagentes para a execução do invento são rapidamente adaptáveis à forma de conjunto, para uso em cenários de aplicação, como em hospitais e farmácias nucleares.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa a utilização de uma pluralidade de recipientes na execução da reacção.

A Figura 2 representa outra concretização, compreendendo um único recipiente com uma pluralidade de compartimentos.

A Figura 3 representa um processo para produzir uma matriz com agente queXante ligado.

A Figura 4 representa um processo alternativo para preparar uma matriz com agente que1ante ligado.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DO INVENTO

Todos os termos usados na especificação e nas reivindicações são conhecidos dos que têm um conhecimento médio da arte. No entanto, para assegurar um entendimento claro e consistente da especificação e das reivindicações, incluindo o âmbito dado a esses termos, proporcionam-se as definições seguintes;

Biomolécula:

Elemento ou composto compatível numa ou com

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ΤΟ/3279-573 uma entidade biológica

Ligação: Ligação

cuia.

Ãgente gue1ante: Reagente que liga iões metálicos com elevada afinidade. Também conhecido como agente de que 1ação.

Conjugado: Uma combinação. Sendo verbo, significa unir.

Converter em derivados: Modificar uma substância-mãe.

Reagente marcador: Substância que vai reagir com uma biomoiécula e que confere uma propriedade adicional à dita biomolécula, através da qual se pode detectar, seguir ou controlar a dita biomolécula.

Poliaminopolicarboxilato: Composto usado frequentemente como agente quelatante, caracterizado por uma pluralidade de grupos amino e uma pluralidade de grupos carboxilo.

Produto: A substância resultante de uma reacção entre ou com reagentes.

Reagente: Ingrediente de uma reacção, por exemplo, mistura-se uma biomolécula com um reagente marcador para produsir um conjugado, sendo a dita biomolécula e o dito reagente marcador dois reagentes dessa reacção e sendo produto o dito conjugado.

Reagente não ligado: Reagente que não está fisicamente ligado a outra substância.

invento inicia a utilização de agentes quelantes ou de polímeros de quelação conjugados com uma matriz inerte, de preferência com uma matriz de partículas, para eliminar reagente marcador não ligado. 0 agente de quelação é seleccionado para ter grande apetência e elevada afinidade para compostos de baixa massa molecular, como são muitos reagentes marcadores. Os agentes quelantes adequados incluem ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTÃ), ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPÃ), poliazamacrocíclicos, benzil-DTPÃ, benzil-EDTA, LiLo, IDAC, outros derivados activados de poliaminopolicarboxilatos, alguns antibióticos, éteres de corôa, outros compostos macrocíclicos, proteínas que71 667 ΤΟ/3279-573

-8lantes naturais, tais como transferrina, apoferritina β metalotioneína s aminas aromáticas diasotadas. Os polímeros de quelação e outros quelantes muiti-funcionais podem revelar-se ainda mais eficazes do que os mencionados acima.

As matrizes adequadas incluem vidro, poliestireno, polímeros derivados com aminas, sílica, agarose, propilamina de sílica, copolímeros e outras resinas. Com determinadas combinações matriz-agente quelante, a ligação do agente de quelação à matriz não requer uma reacção complexa. O poliestireno e o vidro, por exemplo, têm uma capacidade de ligação inerente para moléculas pequenas, proteínas e similares. Contudo, no caso de pérolas de polímero derivado de aminas ou de pérolas de vidro revestido com polímero derivado de aminas, os agentes quelantes podem estar quimicamente ligados às pérolas.

Os agentes quelantes podem ser sintetizados sobre uma matriz. Como exemplo, as pérolas derivadas de aminas, disponíveis no mercado, estão empacotadas numa coluna. As pérolas são acopladas a grupos iminodiacetato por carboximetilação simples e a coluna é lavada com tampão. As pérolas são tratadas com amoníaco, a coluna é lavada e, a seguir, é submetida ao passo de carboximeti lação. Repete-se o processo até se obter o número pretendido de grupos carboxilato.

invento é particularmente adequado para processos que requeiram biomoléculas marcadas com metais. Não é invulgar que as biomoléculas sejam marcadas utilizando uma fonte de agente de quelação i.e., o agente de quelação é conjugado com a biomolécula e, a seguir, o conjugado é carregado com um metal, ligando-se o metal através do agente quelante. Os metais adequados incluem radionuclídeos emissores α e 13, emissores γ, emissores de raios-X, emissores de positrões, iões metálicos paramagnéticos, metais luminescentes e fluorescentes. Para exemplificar melhor a gama de elementos e de isótopos que podem ser usados, os canditados ipropriados incluem ⁵⁶Fe, ⁵⁴Fe, ⁵⁵Co, ⁵²Fe, ⁴³Sc, ⁴⁴Sc, ⁴⁷Sc,

V) ^z*As_;

I, 133-q-, .lju _r .

bm,

130·]·, 131j, 133·]· 135_χ ⁸⁸Rb, ^³⁴Cs,

101

Rh,

203

88_Y>'Re,

90_v ¹⁵²Eu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga,

Cr,

225

Ac,

Pb,

P, ¹⁹⁹Au, ¹⁰⁵Rh, ⁷²Se, ⁹⁷Ru, ¹⁰⁰Pd, ¹⁰⁹Pd, ¹¹⁹Sb,

125

I,

123

137,

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		-9-
¹²⁸Ba,	¹⁹⁷Hg, ²¹¹At, ²¹²Bi, ²	¹²Pb,	²¹³Bi, ¹⁸⁸Re,	142·
ⁱⁿm,	^õ7Cu, ⁷⁵Br, ⁷⁷Br, ⁿC,	¹⁴c,	13_N; 15_0/ 35_S/	18_f
0159(2^	¹⁶⁶Ho, ¹⁹⁴Ir, Sm, Eu,	Gd,	Tb, Dy, Ho, Er,	Tm,

Pr, rígp — ......

.07:

F, Pr, Nd, ), ^99mTc,

192τ_{Γ e} 291_Am^ Qmbora. seja preferível que a espécie seja um catião quando se usar um agente quelante.

Consegue-se uma vantagem especial quando se conjuga a mesma espécie de agente de quelação com a biomolécula e com a matriz. Devido à inexistência de diferença na afinidade, é pequena a probabilidade de que o processo de separação remova o reagente marcador, uma vez ligado à biomolécula. Para ajudar a visualizar algumas das combinações nas quais se conjugam agentes quelantes com a matriz e com a biomolécula, considerem-se as fórmulas seguintes:

BM-A-L

M-B-L nas quais BM é uma biomolécula;

M é uma matriz;

A é um primeiro agente quelante;

B é um segundo agente quelante; e L é um marcador.

Representando K a afinidade de ligação, podem simbolizar-se diversas comparações do modo seguinte:

(1) A = B

C2) A * B s K_A = Kg (3) K_A > Kg (4) K_A < Kg

Noutra concretização do processo de remoção, usam-se três agentes quelantes com o componente adicional, designado por:

M-C-L em que C é um terceiro agente quelante e BM-A-L, M-B-L e M-C-L são usados simultaneamente no processo. Os agentes quelantes B e

C ou estão conjugados com a mesma matriz ou cada um deles está conjugado com uma matriz distinta. As comparações que dizem

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-10respeito à ultima concretização incluem:

(5) A = B e K_c < K_A (6) K_B < K_A e K_c < K_A (7) K_B = K_A e K_c < K_A

Tal como se referiu acima, a comparação (1), em que o mesmo agente quelante está conjugado com a hiomolécula e com a matriz, é uma comparação preferida. A comparação (2) é funcionalmente equivalente à comparação (1). A eficiência da purificação representada pela comparação (3), depende de quanto mais baixo é K_B em relação a K_A. As deficiências que surjam podem ser remediadas com quantidades crescentes de M-B-L. A comparação (4) é aceitável se K_A não for muito menor do que K_B. As comparações (5), (6) e (7) podem proporcionar benefícios não esperados com determinados agentes que 1antes.

O processo de marcação pode ser executado em um ou mais recipientes de reacção fechados ou num único recipiente de reacção com compartimentos múltiplos. A Figura 1 esquematiza uma concretização que requer recipientes múltiplos, compreendendo um primeiro recipiente de reacção, um segundo recipiente que contém um agente quelante ligado a uma matriz e um terceiro recipiente para o produto. A radiomarcação ocorre no primeiro recipiente,· remove-se a mistura reaccional para o segundo recipiente, onde a dita mistura contacta com o conjugado agente quelante-matriz; a seguir, remove-se o sobrenadante, por exemplo por meio de uma seringa e reune-se o dito sobrenadante, que pode ser filtrado, no terceiro recipiente.

A Figura 2 ilustra outra concretização em que se representa um único recipiente com compartimentos múltiplos. Os ditos compartimentos estão separados entre si de um modo que permite transferir a mistura reaccional de um primeiro compartimento (I) para um segundo compartimento (II) adjacente, que contém agente quelante ligado à matriz. Nesta concretização, um dispositivo de válvula, e.g. uma torneira, separa os compartimentos. Os equivalentes à torneira incluem membranas não permeáveis que se possam romper, tampas móveis e vidro ranhurado. 0 terceiro compartimento a

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(III), que recebe a mistura reaccional depois de se ter removido o reagente marcador não ligado da mistura reaccional, através do conjugado agente quelante-matris, pode estar ligado ao dito segundo compartimento.

Uma terceira concretização utiliza um recipiente de dois compartimentos fechado. (Em In re Sponnoble, 150 USPQ 237 apresentam-se exemplos de recipientes de dois compartimentos fechados que podem ser usados no invento). A reacção de marcação é conduzida no primeiro compartimento, no qual se introduzem os reagentes, por exemplo por meio de uma seringa. O segundo compartimento contém um agente quelante-matriz, Depois de a reacção de marcação estar completa, abre-se um dispositivo de fecho que separa o primeiro do segundo compartimento e os reagentes são postos em contacto com o agente quelante-matriz, no segundo compartimento. Depois de um tempo suficiente para a captura do marcador não ligado pelo agente quelante-matriz, pode remover-se do sobrenadante a biomolécula marcada, usando uma seringa. Uma vez que todo o processo decorre num recipiente fechado estéril, pode administrar-se o sobrenadante directamente a um paciente. 0 tamanho da matriz ligada ao agente quelante, e.g. pérolas de polímero, deve ser seleccionado de modo a serem demasiado grandes para entrarem na seringa.

As matrizes adequadas são seleccionadas e conjugam-se com um agente de quelação. A Figura 3 é um exemplo da preparação de pérolas por acoplamento indirecto. Conjugam-se albumina de soro humano (HSA) e dietilenotriaminapenta-acetato (DTPA). Líga-se o conjugado HSA-DTPA a uma matriz polimerica em partículas (P), para formar P-HSA-DTPA. Num outro recipiente de reacção, conjuga-se um agente quelante (CHL), neste exemplo preferencialmente DTPA, com um anticorpo monoclonal (MoAb). Marca-se o conjugado MoAb-CHL com índio (¹¹¹In). Na Figura, o reagente marcador não ligado é assinalado por In(lll) e o anticorpo marcado por MoAb-CHL-In(lll). Adiciona-se P-HSA-DTPA à mistura reaccional para remoção do ^^·*·Ιη por quelação.

A Figura 4 é outra concretização em que as pérolas e o agente quelante são acopladas directamente. Conjuga-se matriz

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-12— polimérica derivada de alquilamina, era partículas (P-NH...), com DTPA, para formar AM-DTPA. De um modo semelhante ao representado na Figura 3, o AM-DTPA elimina o In(lll) da mistura reaccional.

Para minimizar ainda mais a ligação não específica à matriz, podem expôr-se os conjugados a um material proteináceo ou de hidrato de carbono para bloquear esses locais não específicos. Os agentes de bloqueamento adequados incluem albumina de soro bovino, albumina de soro humano, soros, polivinilpirrolidona, dextrano e ficol. Lavam-se muito bem os conjugados agente quelante matriz e coloca-se uma quantidade apropriada num primeiro recipiente ou numa câmara do dito recipiente de múltiplas câmaras .

A biomolécula é conjugada com um agente de quelação, de preferência com a mesma espécie conjugada com a matriz. A seguir ao passo de conjugação, separa-se a biomolécula do agente de quelação não conjugado, por exemplo através de precipitação ou de cromatografia de exclusão em gel. A solução resultante é colocada num segundo recipiente ou numa câmara separada do dito recipiente de múltiplas câmaras. A seguir, introduz-se o reagente marcador que, em gel, se adquire a vendedores comerciais, na solução que contém as biomoléculas e deixa-se continuar a quelação sob condições de incubação adequadas. No passo seguinte, remove-se a solução da reacção de marcação, para o recipiente ou câmara que contém o conjugado agente quelante-matriz. A mistura final é incubada, com mistura periódica. Remove-se o sobrenadante que contém a biomolécula marcada.

Em alternativa, a biomolécula que serve de molécula efectora, por exemplo o anticorpo ou a sonda de ácido nucleico, não precisa de ser marcada com um agente que seja detectável em si mesmo. Em vez disso, a dita molécula efectora é marcada com uma primeira molécula-parceira de ligação e o agente marcador detectável é conjugado com uma segunda molécula-parceira de ligação, em que as ditas primeira e segunda moléculas-parceiras de ligação reagem uma com a outra para formarem um conjugado. Este processo alternativo de marcação é conhecido por pré-alvejamento. Por exemplo, pode visualizar-se anticorpo conjugado com estreptavidiTO/3279-573

na reagido com tecidos, utilizando hiotina radiomarcada e pode visualizar-se uma sonda de ácido nucleíco hibridada, que contenha uma cauda poli-A, com um poli-T oligonucleótido conjugado com fosfatase alcalina e substrato de fosfatase adequado, tal como NBT/BCIP. No primeiro exemplo, do anticorpo, a estreptavidina e a biotina são a primeira e a segunda moléculas-parceiras de ligação e no segundo exemplo, do ácido nucleico, os polinucleótidos poli-A e poli-T são a primeira e a segunda moléculas-parceiras de ligação. Os polímeros que podem ser usados como moléculasparceiras, de ligação, incluem poli-N-vinilpirrolidona, poli(álcoois vinilicos), poli(óxido de etileno) e poli-N-viniIpiridina que reage com poli(ácidos acrílicos) e poli(ácidos metacri1icos).

Os exemplos não-limitativos seguintes ilustram e mostram aspectos do presente invento.

EXEMPLO 1

Conjugaram-se pérolas de poliestireno com DTPA por um processo em dois passos. Incubou-se albumina de soro humano (HSA) em solução salina tamponada com fosfato 50 mM, com pH 7,2, com um excesso molar de 100 vezes de dianidrido de DTPA, durante 15 minutos, à temperatura ambiente. Removeu-se o DTPA não conjugado, passando a mistura numa coluna G-50.

Ajustou-se a solução de HSA-DTPA a 14 mg/ml e adicionaram-se-lhe cerca de 40 pérolas esféricas, não porosas, com 0,635 cm (um quarto de polegada). Incubou-se a mistura com agitação suave, à temperatura ambiente, durante 2 horas. Decantou-se o líquido, lavaram-se as pérolas com água destilada e secaram-se sob vácuo.

EXEMPLO 2

Preparou-se uma solução de 0,1 mg/ml de anidrido de DTPA em clorofórmio seco e adicionou-se uma alíquota contendo a quantidade desejada de DTPA a um recipiente de reacção. Removeu-se o clorofórmio por evaporação com azoto gasoso, à temperatura ambiente. Adicionou-se uma solução do anticorpo (aproximadamente 0,5 mg) em tampão bicarbonato 0,05 M, com pH 7,0, ao dito reci piente de reacção, produzindo-se uma razão molar de 7:1 entre

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-14· anidrido e proteína. Incubou-se a solução com agitação, durante um minuto e recuperou-se o anticorpo acoplado, por passagem numa coluna Sephadex G-50.

EXEMPLO 3

Tornou-se o radionuclídeo 0,5 M em acetato, usando acetato 1,0 M, com um pH final de 6,0. Adicionou-se a solução do radionucl ídeo ao conjugado anticorpo-DTPA, juntamente com 0,1 ml de albumina de soro humano a 25%, e incubou-se a mistura durante 5— -30 minutos, com agitação frequente.

EXEMPLO 4

Adicionaram-se pérolas com HSA-DTPA a uma solução de ^11:1·Ιη em tampão acetato/citrato, num volume total de 0,75 ml, durante cerca de 30 minutos. Removeu-se a solução e determinou-se a radioactividade ligada às pérolas.

Número de pérolas Radioactividade, em uCi

22 12 30 20 62

Existe uma correlação directa entre o número de pérolas e a quantidade de radioactividade ligada. Além disso, a lavagem das pérolas com HC1 1 M removeu toda a radioactividade ligada, possibilitando a reutilização das pérolas.

EXEMPLO 5

111

Marcou-se HSA-DTPA com ‘•-‘-'-In em tampão citrato/acetato, como descrito acima. Retirou-se uma alíquota e tratou-se com um excesso de DTPA. Analisou-se a dita alíquota tratada com DTPA, através de cromatografia em camada fina, para determinar a percentagem de 3-Hln livre. A alíquota continha 12,2% de livre. Adicionaram-se cinco pérolas com HSA-DTPA à solução de HSA-DTPA—In e incubou-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos. Retirou-se uma alíquota dessa mistura, tratou-se com um excesso de DTPA e analisou-se por TLC quanto a ¹¹¹In livre. A dita segunda alíquota continha 3,9% de -¹··¹-·¹In livre.

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EXEMPLO '6

LiLo é um novo agente quelante desenvolvido no OTC/Bionetics Research Institute e é descrito na Patente dos E.U.A. nQ 07/358917, co-pendente. Ligou-se o agente quelante a pérolas derivadas de amina (AM), expondo 60 pérolas AM a 5 ml de uma solução saturada de LiLo, preparada em água ou em solução salina tamponada por fosfato, com pH 7,2. Ajustou-se o pH da mistura a 7,5-8,5, usando NaOH. Agitou-se a solução durante a noite, à temperatura ambiente. Decantou-se o líquido e adicionou-se HC1 1M às pérolas. Incubou-se a mistura à temperatura ambiente, durante 10 minutos. Este passo removeu o metal livre ligado às pérolas AM conjugadas com LiLo. Lavaram-se as pérolas repetidamente, com HC1 0,1 M. Seguiram-se lavagens com água destilada até que a água de lavagem se tornou neutra ao papel de pH. Secaram-se as pérolas sob vácuo e conservaram-se num exsicador.

EXEMPLO 7

Combinaram-se duzentos microcurie de cloreto de índio com 15 Ul de tampão acetato (0,6 M; pH 5,5) e 15 ul de tampão citrato (0,06 M; pH 5,5), num recipiente de reacção lavado com ácido. Adicionou-se conjugado anticorpo-DTPA (157 ug em solução salina tamponada por fosfato, com pH 7,2) à solução e incubou-se a mistura à temperatura ambiente, durante cerca de 30 minutos. À seguir, adicionou-se cerca de 1 ml de solução salina tamponada por fosfato (0,05 M; pH 7,2). Tratou-se uma aliquota da mistura reaccional comum excesso de solução de DTPA, para determinar a percentagem de ^-^In não ligado na mistura reaccional. Ã solução reaccional remanescente, adicionaram-se oito pérolas AM-LiLo. Depois de se incubar com as pérolas durante cerca de 30 minutos, tratou-se uma aliquota da solução reaccional com um excesso de DTPA. Executou-se uma análise cromatográfica, para se determinar a percentagem de •^LJ-^±In não ligado, com os resultados seguintes:

Processo	Percentagem de -^^In ligado ao anticorpo
Antes das pérolas	83,0%
Depois das pérolas	99,7%
(AM-LiLo)

EXEMPLO 8

J

O IDAC-2 é um novo agente que1ante desenvolvido na OTC/BRI e descrito na Patente dos E.U.A. nQ 07/358917, co-pendente.. Conjugou-se IDAC-2 com pérolas AM, de acordo com o processo descrito no Exemplo 7.

Apesar de a descrição precedente descrever o presente invento em pormenor por meio de ilustração, para fins de habilitação e de concretizações preferidas, uma pessoa com experiência média da arte saberá que podem fazer-se e estão acessíveis mudanças, alterações e outros usos, sem afastamento do âmbito e do espírito do invento. Portanto, o âmbito do invento é indicado pelas reivindicações anexas e qualquer mudança que caia dentro do significado e da gama de equivalência das reivindicações ficará incluído no seu âmbito.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para eliminar reagente marcador não ligado de uma composição, compreendendo reagente marcador ligado e não ligado, caracterizado por compreender o passo de fazer contactar a referida composição com um conjugado de agente quelante-matris capaz de ligar reagente marcador não ligado.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido reagente marcador ligado, da referida composição, estar ligado a uma biomolécula ou a um polímero.

3. Processo de acordo com a reivindicaação 2, caracterizado por a referida biomolécula ser um péptido ou proteína.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida proteína ser uma imunoglobulina ou um fragmento de imunog1obu1i na.

5. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a refereida biomolécula ser um ácido nucleico, um oligonucleótido ou um polinucleótido.

õ.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido reagente marcador ser um radionuclídeo.

7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido reagente marcador ser fluorescente, luminescente ou paramagnético.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido agente quelante ser um poliaminopolicarboxilato ou um ciclopoliazacarboxilato.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido agente quelante ser uma biomolécula.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida matriz estar em partículas.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida matriz ser convertida em derivados.

12. Processo de acordo com a reivindicação caracterizado

71 657

ΤΟ/3279-573

13. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida matriz ser uma membrana.

14. Processo de preparação de um conjunto caracterizado por compreender introduzir um conjugado de agente quelante-matriz num recipiente.

15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender introduzir um conjugado de agente quelante-imunoglobulina num segundo recipiente.

16. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o recipiente ter uma pluralidade de câmaras e por o referido conjugado de agente quelante-matriz ser introduzido numa câmara e se introduzir um conjugado de agente quelante—imunoglobulina numa segunda câmara.

17. Processo para preparar uma composição de biomolécula marcada essencialmente e isenta de reagente marcador não ligado por remoção do reagente marcador não ligado, caracterizado por compreender os passos de:

(a) fazer contactar uma biomolécula com reagente marcador numa mistura reaccional; e (b) fazer contactar a mistura do passo (a) com um conjugado de agente quelante-matriz capaz de ligar reagente marcador não ligado, numa quantidade suficiente para ligar essencialmente todo o reagente marcador não ligado, produzindo-se, assim, uma fase sólida contendo reagente marcador ligado a uma fase líquida contendo biomoléculas marcadas.

18. Processo de acordo com a reivindicação 17, por a referida biomolécula ser uma imunoglobulina.

-18' por a referida matriz compreender a superfície interior de um recipiente.

19. Processo de acordo com a reivindicação 17, por o referido reagente marcador ser um radiometal.

caracterizado caracterizado

20. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado

ΤΟ/3279-573

-19por ο referido conjugado de agente quelante-matriz compreender um polímero aminopolicarboxilato ligado a um material em partículas.

21. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a fase líquida contendo biomoléculas marcadas ser separada da fase sólida por meio de uma seringa.

22. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por os passos (a) e (b) serem realizados em recipientes reaccionais separados e por os reagentes serem introduzidos e retirados com uma seringa.

23. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por os passos (a) e (b) serem realizados em compartimentos separados de um único recipiente e por os referidos compartimentos estarem interligados por um meio que permite a transferência dos conteúdos, entre os compartimentos.

24. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por compreender ainda um terceiro compartimento que está ligado ao referido segundo compartimento, estando os referidos segundo e terceiro compartimentos interligados por um meio que permite a transferência dos conteúdos, entre os compartimentos.

25. Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o meio que permite a transferência de conteúdos entre compartimentos ser bloqueado por um meio bloqueador removível.