NO340137B1

NO340137B1 - En fremgangsmåte, anordning og system for volumetrisk opptelling av hvite blodceller

Info

Publication number: NO340137B1
Application number: NO20074564A
Authority: NO
Inventors: Johnny Svensson; Stellan Lindberg
Original assignee: Hemocue Ab
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2007-09-10
Publication date: 2017-03-13
Also published as: US20060210428A1; MX2007011104A; NO20074564L; RU2365919C2; ZA200707425B; KR20080003337A; KR101244234B1; AU2006221130B2; CN101137904A; JP4642893B2; CA2599747C; DK1701150T3; RU2007137654A; JP2008533466A; MY143768A; CA2599747A1; CN101137904B; EP1701150B1; BRPI0608340B8; BRPI0608340B1

Description

Teknisk område

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en prøveopptakingsanordning, en fremgangsmåte og et system for volumetrisk opptelling av hvite blodceller i en blodprøve.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Bestemmelse av antall hvite blodceller er ofte viktig i forbindelse med å behandle en pasient. Denne analysen kan være nødvendig for å diagnostisere for eksempel leukemi, eller infeksiøse eller inflammatoriske sykdommer, eller for å overvåke behandlinger. Det er ønskelig å gjøre det mulig å oppnå analyseresultater så raskt som mulig for å minimere ventetider for pasienter og gjøre en lege i stand til å gjøre en beslutning om behandling og diagnose direkte når det gjøres en første undersøkelse av pasienten. Det vil derfor være å foretrekke å tilveiebringe en analysefremgangsmåte som hurtig kan utføres av legen eller en sykepleier, uten å være nødt til å sende en test bort til et laboratorium.

I dag oppnås antallet hvite blodceller normalt gjennom en manuell prosedyre ved å farge en blodprøve og mikroskopisk observere prøven i et spesielt tellekammer, for eksempel et Burker-kammer. Tellekammeret tilveiebringes med et rutenett som deler kammeret inn i veldefinerte, små volumer. De hvite blodcellene tillates å avsette seg ved bunnen av tellekammeret for å muliggjøre at mikroskopet fokuserer på alle cellene i kammeret og, således, legge til rette fortelling. Således har prøven behov for å bunnfelle i flere minutter før tellingen utføres. Antallet hvite blodceller kan deretter bestemmes ved å telle antallet blodceller per rute i rutenettet. Antallet hvite blodceller oppnås manuelt av en analytiker, som må ha erfaring i å utføre analysen for å kunne være i stand til å utføre en pålitelig analyse.

Denne analysen er tidkrevende. Videre kan, siden den utføres manuelt, analyseresultatene variere avhengig av personen som utfører analysen.

Det finnes noen få eksisterende automatiserte analysefremgangsmåter for å bestemme antall hvite blodceller. Antallet hvite blodceller kan bestemmes ved hjelp av Coulter-prinsippet, som er basert på å bestemme cellestørrelse og derved celletypen ved å føle en impedans. En fremgangsmåte for å telle hvite blodceller ved hjelp av Coulter-prinsippet er beskrevet i US 5,262,302.

Coulter-prinsippet er den dominerende, automatiserte analysefremgangsmåte som i dag anvendes. Dog finnes det noen få andre fremgangsmåter som er beskrevet. En slik fremgangsmåte for å bestemme antall hvite blodceller er beskrevet i US 5,585,246. Her må en blodprøve prepareres ved å blandes med et fluorescerende fargestoff og ligandkompleks som merker de hvite blodcellene. Prøven introduseres inn i et kapillær og bestråles av en laserkilde som skanner over prøven i kapillæret. Fluorescensen måles for å kunne bestemme antallet av hvite blodceller. En lignende fremgangsmåte er beskrevet i WO 97/02482, ved anvendelse av et fluorescerende fargestoff og en laserkilde som skanner over et kapillær. Denne fremgangsmåten er tilpasset for opptelling av hvite blodceller i afereseprodukter inneholdende et lavt antall av hvite blodceller. Her er kapillæret ganske tykt og det er nødvendig å vente inntil de hvite blodcellene har avsatt seg ved bunnen av kapillæret før kapillæret kan skannes.

I WO 99/45384 vises et prøveinneholdende kammer som har varierende tykkelse. Den varierende tykkelsen skiller forskjellige forbindelser i blod. Blodprøven farges med et fargestoff for å differensielt fremheve minst tre forskjellige hvite blodcelletyper i blodprøven. De hvite blodcellene kan tallfestes ved anvendelse av et optisk skanneinstrument for å se en del av kammeret.

Det er fortsatt et behov for å fremskynde og forenkle eksisterende automatiserte fremgangsmåter for å bestemme et antall hvite blodceller slik at analyse kan tilveiebringes ved pleiestedet. Videre vil, siden antallet hvite blodceller er en så vanlig utført analyse, enhver forbedring i analysefremgangsmåten ha en stor betydning for pasientpleien. En analysefremgangsmåte tilveiebringende en mulighet for å oppnå resultater ved pleiestedet ville være særskilt fordelaktig.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Det er et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe en enkel analyse for å bestemme en volumetrisk opptelling av hvite blodceller. Det er et videre formål med oppfinnelsen å tilveiebringe en hurtig analyse uten behov av kompliserte apparater eller ekstensive prøveprepareringer.

Disse formålene er delvis eller helt oppnådd ved en prøveopptakingsanordning, en fremgangsmåte og et system i henhold til de uavhengige krav. Foretrukne utførelsesformer er åpenbare fra de avhengige krav.

Således tilveiebringes en prøveopptakingsanordning for volumetrisk opptelling av hvite blodceller i en blodprøve. Prøveopptakingsanordningen omfatter en målekavitet for å motta en blodprøve. Målekaviteten har en forutbestemt fast tykkelse. Prøveopptakingsanordningen omfatter videre en reagens, som er arrangert i en tørket form på en overflate definerende målekaviteten, og reagensen omfatter et hemolyserende middel for å lysere røde blodceller i blodprøven, og et fargemiddel for å selektivt farge hvite blodceller i blodprøven.

Prøveopptakingsanordningen tilveiebringer en mulighet for å direkte oppnå en helblodprøve i målekaviteten og tilveiebringe den for analyse. Det er ikke behov for prøve pre pa rat. Faktisk kan blodprøven suges inn i målekaviteten direkte fra en stukket finger av en pasient. Å tilveiebringe prøveopptakingsanordningen med en reagens, muliggjør en reaksjon innen prøveopptakingsanordningen som gjør prøven klar for analyse. Reaksjonen initieres når blodprøven kommer i kontakt med reagensen. Således er det intet behov for å manuelt preparere prøven, hvilket gjør analysen særskilt passende å utføres direkte i et undersøkelsesrom mens pasienten venter.

Siden reagensen tilveiebringes i en tørket form, kan prøveopptakingsanordningen transporteres og lagres i lang tid uten å påvirke anvendbarheten av prøveopptakingsanordningen. Således kan prøveopptakingsanordningen med reagensen fremstilles og forberedes lenge før analysen av en blodprøve gjøres.

Mens mange eksisterende fremgangsmåter er i stand til å telle forskjellige blodceller og til og med undergrupper av blodceller, er prøveopptakingsanordningen i henhold til oppfinnelsen spesifikt tilpasset å utføre volumetrisk opptelling av hvite blodceller. Reagensen omfatter et hemolyserende middel som vil lysere de røde blodcellene i blodprøven. Dette ødelegger mulighetene til å tallfeste de røde blodcellene i prøven. På den annen side forenkler lyseringen av de røde blodcellene atskillelsen og identifiseringen av de hvite blodcellene i blodprøven.

Fargemiddelet tilveiebringer en markering av de individuelle hvite blodcellene. Dette muliggjør at de hvite blodcellene individuelt kan betraktes eller påvises. De hvite blodcellene kan for eksempel påvises ved å skanne målekaviteten eller oppnå et bilde av målekaviteten. Antallet hvite blodceller kan således oppnås ved å summere antallet av individuelt påviste hvite blodceller i et definert volum. Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for volumetrisk opptelling av hvite blodceller i en blodprøve. Fremgangsmåten omfatter å oppnå en blodprøve i en målekavitet av en prøveopptakingsanordning, hvor målekaviteten inneholder en reagens omfattende et hemolyserende middel og et fargemiddel for å reagere med prøven slik at de hvite blodcellene farges, bestråle prøven med de fargede hvite blodcellene, oppnå et digitalt bilde av en forstørrelse av den bestrålte prøven i målekaviteten, hvori hvite blodceller skilles ved selektiv farging av fargemiddelet, og digital analyse av det digitale bildet for å identifisere hvite blodceller og bestemme antallet hvite blodceller i prøven.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre et system for volumetrisk opptelling av hvite blodceller i en blodprøve. Systemet omfatter en prøveopptakingsanordning som beskrevet ovenfor. Systemet omfatter videre et måleapparat omfattende en prøveopptakingsanordningsholder arrangert for å motta prøveopptakingsanordningen som inneholder en blodprøve i målekaviteten, og en lyskilde arrangert for å bestråle blodprøven. Måleapparatet omfatter videre et bildesystem, omfattende et forstørrelsessystem og et digitalbilde oppnåelsesmiddel for å oppnå et digitalt bilde av en forstørrelse av den bestrålede prøven i målekaviteten, hvori hvite blodceller atskilles i det digitale bildet ved selektiv farging av fargemiddelet. Måleapparatet omfatter også en bildeanalysator arrangert for å analysere det oppnådde digitale bildet for å identifisere hvite blodceller og bestemme antallet hvite blodceller i blodprøven.

Fremgangsmåten og systemet av oppfinnelsen tilveiebringer en svært enkel analyse av en blodprøve for å bestemme antall hvite blodceller. Analysen krever ikke komplisert måleutstyr eller avanserte trinn som skal utføres av en operatør. Derfor kan den utføres i direkte forbindelse med undersøkelse av en pasient, uten behov for en kvalifisert tekniker. Måleapparatet anvender egenskapene av prøveopptakingsanordningen for å gjøre en analyse på en prøve av ufortynnet helblod som er direkte oppnådd inn i målekaviteten. Måleapparatet er arrangert for å avbilde et volum av prøven for å gjøre en volumetrisk opptelling av de hvite blodcellene fra det ene bildet.

Blodprøven tillates å blandes med reagensen i målekaviteten. Innen noen få minutter eller mindre vil reaksjonen av blodprøven med reagensen ha hemolysert de røde blodcellene og farget de hvite blodcellene slik at prøven er klar for å presenteres forden optiske målingen. Blodprøven kan blandes med reagensen ved foreksempel dispersjon eller diffusjon av reagensen inn i blodprøven eller ved å aktivt vibrere eller bevege prøveopptakingsanordningen slik at en omrøring forårsakes i målekaviteten.

Prøveopptakingsanordningen kan omfatte et kroppsmedlem som har to planare overflater for å definere den nevnte målekaviteten. De planare overflatene kan arrangeres ved en forutbestemt avstand fra hverandre for å bestemme en prøvetykkelse for en optisk måling. Dette impliserer at prøveopptakingsanordningen tilveiebringer en veldefinert tykkelse til den optiske målingen, som kan anvendes for å nøyaktig bestemme antallet hvite blodceller per volumetrisk enhet av blodprøven. Et volum av en analysert prøve vil være veldefinert ved tykkelsen av målekaviteten og et område av prøven som avbildes. Således kan det veldefinerte volumet anvendes for å assosiere antallet hvite blodceller til volumet av blodprøven slik at volumetrisk hvite blodcelleantall bestemmes.

Målekaviteten har fortrinnsvis en uniform tykkelse av 50-170 mikrometer. En tykkelse på minst 50 mikrometer innebærer at målekaviteten ikke tvinger blodprøven til å smøres utover i et monolag tillatende et større blodvolum å analyseres over et mindre tverrsnittsområde. Således kan et tilstrekkelig stort volum av blodprøven for å kunne gi pålitelige verdier av antallet hvite blodceller analyseres ved anvendelse av et relativt mindre bilde av blodprøven. Tykkelsen er mer fortrinnsvis minst 100 mikrometer, hvilket tillater et enda mindre tverrsnittsområde å analyseres eller et større prøvevolum å analyseres. Videre forenkler tykkelsen på minst 50 mikrometer og mer fortrinnsvis 100 mikrometer også fremstilling av målekaviteten med en veldefinert tykkelse mellom to planare overflater.

For de fleste prøver arrangert i en kavitet med en tykkelse av ikke mer enn 170 mikrometer, er antallet hvite blodceller så lavt at det kun vil være mindre avvik på grunn av hvite blodceller som arrangeres overlappende av hverandre. Dog vil effekten av slike avvik være relatert til antallet hvite blodceller og kan således, i det minste i et visst omfang, håndteres ved hjelp av å statistisk korrigere resultater i det minste for større verdier av antallet hvite blodceller. Denne statistiske korrigeringen kan være basert på kalibreringer av måleapparatet. Avviket vil være enda mindre for en målekavitet med en tykkelse av ikke mer enn 150 mikrometer, hvorved en enklere kalibrering kan brukes. Denne tykkelsen kan til og med ikke behøve noen som helst kalibrering for overlappende blodceller.

Videre er tykkelsen av målekaviteten tilstrekkelig liten for å muliggjøre måleapparatet til å oppnå et digitalt bilde slik at den fullstendige dybden av målekaviteten kan analyseres samtidig. Siden et forstørrelsessystem skal anvendes i måleapparatet, er det ikke enkelt å oppnå en stor dybdeskarphet. Derfor vil tykkelsen av målekaviteten fortrinnsvis ikke overskride 150 mikrometer for at den fullstendige tykkelsen samtidig kan analyseres i et digitalt bilde. Dybden av feltet kan arrangeres for å håndtere en tykkelse av målekaviteten av 170 mikrometer.

Det digitale bildet kan oppnås med en dybdeskarphet minst korresponderende til tykkelsen av målekaviteten. Dette innebærer at et tilstrekkelig fokus oppnås av den fullstendige prøvetykkelsen slik at den fullstendige tykkelsen av målekaviteten samtidig kan analyseres i det digitale bildet av prøven. Således er det ikke behov for å vente til de hvite blodcellene avsetter seg i målekaviteten, hvorved tiden for å gjøre en analyse reduseres. Ved å velge å ikke fokusere svært skarpt på en spesifikk del av prøven, oppnås et tilstrekkelig fokus av den fullstendige prøvetykkelsen for å tillate identifisering av antallet av hvite blodceller i prøven. Dette innebærer at en hvit blodcelle kan være noe utydelig og fortsatt anses å være i fokuset av dybdeskarpheten.

Prøveopptakingsanordningen kan tilveiebringes med en reagens som appliseres til overflaten oppløst i en flyktig væske som evaporeres for å etterlate reagensen i en tørket form.

Det er erkjent at reagensen med fordel oppløses i en flyktig væske før den settes inn i målekaviteten. Dette innebærer at væsken på en effektiv måte kan evaporeres fra det trange området av målekaviteten under tillaging og forberedelse av prøveopptakingsanordningen.

Reagensen kan fortrinnsvis oppløses i et organisk løsemiddel og mer fortrinnsvis oppløses i metanol. Slike løsningsmidler er flyktige og kan passende anvendes for å tørke reagensen på en overflate av målekaviteten.

Fargemiddelet kan arrangeres for å selektivt farge kjernen av de hvite blodcellene. Dette innebærer at de hvite blodcellene kan identifiseres som fargede prikker og derfor lett kan telles i et digitalt bilde.

Fargemiddelet kan være hvilket som helst i gruppen av hematoksylin, metylenblå, metylengrønn, metylenasur, kresylfiolettacetat, toluidinblå, gentianfiolett, sudananaloger, gallocyanin, og fuchsinanaloger, eller enhver kombinasjon derav. Dog skal det verdsettes at fargemiddelet ikke begrenses til denne gruppen, men mange andre substanser kan kontempleres.

Det hemolyserende middelet kan være et kvarternært ammoniumsalt, et saponin, en gallesyre, slik som deoksykolinsyre, et digitoksin, en slangegift, et glukopyranosid eller en ikke-ionisk detergent av type triton. Dog skal det verdsettes at det hemolyserende middelet ikke begrenses til denne gruppen, men mange andre substanser kan kontempleres.

prøveopptakingsanordningen kan videre omfatte en prøveåpning som kommuniserer målekaviteten med det ytre av prøveopptakingsanordningen, hvor nevnte åpning arrangeres for å oppnå en blodprøve. Prøveåpningen kan arrangeres for å dra opp en blodprøve ved en kapillærkraft og målekaviteten kan videre dra blod fra åpningen inn i kaviteten. Som et resultat kan blodprøven med letthet oppnås inn i målekaviteten ved enkelt bevege prøveåpningen i kontakt med blod. Deretter vil kapillærkreftene av prøveåpningen og målekaviteten dra opp en veldefinert mengde av blod inn i målekaviteten. Alternativt kan blodprøven suges eller dras inn i målekaviteten ved hjelp av å applisere en ekstern pumpende kraft på prøveopptakingsanordningen. I henhold til et annet alternativ, kan blodprøven oppnås inn i en pipette og deretter introduseres inn i målekaviteten ved hjelp av pipetten.

Prøveopptakingsanordningen kan være engangs, dvs. den er arrangert for å brukes kun en gang. Prøveopptakingsanordningen tilveiebringer et kit for å utføre en hvit blodcelle-telling, siden prøveopptakingsanordningen er i stand til å motta en blodprøve og inneholder alle reagenser nødvendige for å kunne presentere prøven for celletelling. Dette er særskilt muliggjort siden prøveopptakingsanordningen er tilpasset for kun en anvendelse og kan være formet uten betraktning av mulighetene for å rengjøre prøveopptakingsanordningen og reapplisere en reagens. Også kan prøveopptakingsanordningen kan støpes i plastikkmateriale og derved fremstilles ved et lav prisforhold. Således kan det fremdeles være kosteffektivt å anvende en engangs- prøveopptakingsanordning.

Prøven kan bestråles av lys av en bølgelengde korresponderende til en topp i absorbanse av fargemiddelet. Som en konsekvens av dette vil de fargede hvite blodcellene som inneholder en akkumulering av fargemiddel påvises ved en lav lystransmisjonsgrad.

Bestrålingen kan utføres ved hjelp av en laserkilde. Laserkilden kan tilveiebringe lys av en veldefinert bølgelengde passende absorbansen av fargemiddelet. Videre tilveiebringer laserkilden kollimert lys, minimerende forstyrrelser av strølys, slik at et punkt av lav lystransmisjon skarpt vil utskilles.

Bestrålingen kan alternativt utføres ved hjelp av en lysemitterende diode. Denne lyskilden kan fremdeles tilveiebringe tilstrekkelig bestrålingsbetingelser for å på ordentlig måte skille hvite blodceller fra annet materiale i prøven.

Det digitale bildet kan oppnås ved anvendelse av en forstørrelsesstyrke av 3-200x, mer fortrinnsvis 3-10x. Innen disse områdene av forstørrelsesstyrke er de hvite blodcellene tilstrekkelig forstørret til å kunne påvises, mens dybdeskarpheten kan arrangeres for å dekke prøvetykkelsen. En lav forstørrelsesstyrke innebærer at en stor dybdeskarphet kan oppnås. Dog kan, hvis en lav forstørrelsesstyrke anvendes, de hvite blodcellene være vanskelige å påvise. En lavere forstørrelsesstyrke kan brukes ved å øke antallet av piksler i det oppnådde bildet, det vil si ved å forbedre oppløsningen av det digitale bildet. På denne måten har det vært mulig å anvende en forstørrelsesstyrke av 3-4x, men fortsatt muliggjøre de hvite blodcellene å påvises.

Analysen omfatter å identifisere områder av høy lysabsorbanse i det digitale bildet. Analysen kan videre omfatte å identifisere sorte eller mørke prikker i det digitale bildet. Siden fargemidlene kan akkumuleres i kjernen av de hvite blodcellene, kan absorbansen av lyset ha topper ved separate punkter. Disse punktene vil forme sorte prikker i det digitale bildet.

Analysen kan videre omfatte elektronisk forstørrelse av det oppnådde digitale bildet. Mens prøven forstørres for å oppnå et forstørret digitalt bilde av prøven, kan det oppnådde digitale bildet selv være elektronisk forstørret for å forenkle atskillelse mellom objekter som avbildes svært nære hverandre i det oppnådde digitale bildet.

Kort beskrivelse av te<g>nin<g>er

Oppfinnelsen vil nå beskrives i videre detalj gjennom eksempel med referanse til de vedlagte tegninger.

Figur 1 er en skjematisk skisse av en prøveopptakingsanordning i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen. Figur 2 er en skjematisk skisse av en prøveopptakingsanordning i henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen. Figur 3 er en skjematisk skisse av et måleapparat i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen. Figur 4 er et flytskjema av en fremgangsmåte i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen. Figur 5 er et digitalt bilde av en blodprøve som skal anvendes for volumetrisk opptelling av hvite blodceller.

Detaljert beskrivelse av en foretrukken utførelsesform

Refererende nå til figur 1 vil en prøveopptakingsanordning 10 i henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen beskrives. Prøveopptakingsanordningen 10 er en engangsanordning og skal kastes etter å ha blitt anvendt for analyse. Dette innebærer at prøveopptakingsanordningen 10 ikke fordrer komplisert håndtering. Prøveopptakingsanordningen 10 er fortrinnsvis formet i et plastikkmateriale og kan være fremstilt ved sprøytestøpning. Dette gjør fremstilling av prøveopptakingsanordningen 10 enkel og billig, hvorved kostnadene av prøveopptakingsanordningen 10 kan holdes lave.

Prøveopptakingsanordningen 10 omfatter et kroppsmedlem 12, som haren base 14, hvilket kan berøres av en operatør uten å forårsake noen interferens i analyseresultater. Basen 14 kan også ha projeksjoner 16 som kan inneholde en holder i et analyseapparat. Projeksjonene 16 kan arrangeres slik at prøveopptakingsanordningen 10 korrekt vil posisjoneres i analyseapparatet.

Prøveopptakingsanordningen 10 omfatter videre en prøveåpning 18. Prøveåpningen 18 defineres mellom motstående vegger innen prøveopptakingsanordningen 10, veggene er arrangert så nære hverandre slik at en kapillærkraft kan skapes i prøveåpningen 18. Prøveåpningen 18 kommuniserer med det ytre av prøveopptakingsanordningen 10 for å tillate blod å dras inn i prøveopptakingsanordningen 10. Prøveopptakingsanordningen 10 omfatter videre et kammer for å telle hvite blodceller i form av en målekavitet 20 arrangert mellom motstående vegger inne i prøveopptakingsanordningen 10. Målekaviteten 20 arrangeres i kommunikasjon med prøveåpningen 18. Veggene definerende målekaviteten 20 arrangeres nærmere hverandre enn veggene av prøveåpningen 18, slik at en kapillærkraft kan dra blod fra prøveåpningen 18 inn i målekaviteten 20.

Veggene av målekaviteten 20 arrangeres ved en avstand fra hverandre av 50-170 mikrometer. Målekaviteten 20 er mer fortrinnsvis minst 100 mikrometer tykk. Videre er målekaviteten 20 mer fortrinnsvis ikke mer enn 150 mikrometer tykk. Avstanden er uniform over den fullstendige målekaviteten 20. Tykkelsen av målekaviteten 20 definerer blodvolum som undersøkes. Siden analyseresultatet skal sammenlignes med volumet av blodprøven som undersøkes, må tykkelsen av målekaviteten 20 være svært nøyaktig, dvs. kun svært små variasjoner i tykkelsen tillates innen målekaviteten 20 og mellom målekavitetene 20 av forskjellige prøveopptakingsanordninger 10. Tykkelsen tillater et relativt stort prøvevolum å analyseres i et lite område av kaviteten. Tykkelsen tillater teoretisk hvite blodceller å arrangeres ovenfor hverandre innen målekaviteten 20. Dog er mengden av hvite blodceller i blod så lav at sannsynligheten for at dette forekommer er svært lav.

Prøveopptakingsanordningen 10 er typisk tilpasset for å måle antall hvite blodceller over 0,5 x IO<9>celler/liter blod. Ved lavere antall hvite blodceller, vil prøvevolumet være for lite til å tillate statistisk signifikante mengder av hvite blodceller å telles. Videre vil, når antallet hvite blodceller overskrider 12 x IO<9>celler/liter blod, effekten av blodceller som arrangeres overlappende hverandre begynne å være signifikant i det målte antallet hvite blodceller. Ved dette antallet hvite blodceller, vil de hvite blodcellene dekke omtrent 8 % av tverrsnittet av prøven som bestråles, hvis tykkelsen av målekaviteten er 140 mikrometer. Således, for å kunne oppnå korrekt antall hvite blodceller, vil denne effekten måtte redegjøres for. Derfor kan en statistisk korrigering av verdier av antallet hvite blodceller over 12 x IO<9>celler/liter blod brukes. Denne statistiske korrigeringen vil være økende for økende antall hvite blodceller, siden effekten av overlappende blodceller vil være større for høyere antall hvite blodceller. Den statistiske korrigeringen kan bestemmes ved hjelp av kalibrering av et måleapparat. Som et alternativ kan den statistiske korrigeringen bestemmes ved et generelt nivå for å oppsette måleapparater som skal anvendes i forbindelse med prøveopptakingsanordningen 10. Denne statistiske korrigeringen er av lignende størrelse som statistiske korrigeringer som i dag utføres i analyseapparater som anvender Coulter-prinsippet. Det kontempleres at prøveopptakingsanordningen 10 kan anvendes for å analysere antall hvite blod celler så høyt som 50 x IO<9>celler/liter blod.

En overflate av en vegg av målekaviteten 20 er minst delvis belagt med en reagens 22. Reagensen 22 kan frysetørkes, varmetørkes eller vakuumtørkes og appliseres på overflaten av målekaviteten 20. Når en blodprøve oppnås i målekaviteten 20, vil blodet komme i kontakt med den tørkede reagensen 22 og initiere en reaksjon mellom reagensen 22 og blodet.

Reagensen 22 appliseres ved å sette inn reagensen 22 i målekaviteten 20 ved anvendelse av en pipette eller dispenser. Reagensen 22 oppløses i en flyktig væske, for eksempel et organisk løsemiddel slik som metanol, når satt inn i målekaviteten 20. Løsningsmiddelet med reagensen 22 kan fylle målekaviteten 20. Deretter utføres tørking slik at løsningsmiddelet vil evaporere og reagensen 22 vil tilknyttes til overflatene av målekaviteten 20.

Siden reagensen skal tørkes på en overflate av et smalt rom, vil væsken ha en svært liten overflate i kontakt med ambient atmosfære, hvorved evaporasjon av væsken er mer vanskelig. Således er det fordelaktig å anvende en flyktig væske, slik som metanol, hvilket gjør væsken i stand til å evaporeres på en effektiv måte fra det smale rommet av målekaviteten.

I henhold til en alternativ fremstillingsfremgangsmåte, kan

prøveopptakingsanordningen 10 formes ved å tilknytte to deler til hverandre, mens en del former bunnveggen av målekaviteten 20 og den andre delen former toppveggen av målekaviteten 20. Dette tillater en reagens 22 å tørkes på en åpen overflate før de to delene tilknyttes til hverandre. Således, kan reagensen 22 oppløses i vann, siden løsningsmiddelet ikke behøver å være flyktig.

Reagensen 22 omfatter et hemolyserende middel og et fargemiddel. Det hemolyserende middelet kan være et kvarternært ammoniumsalt, et saponin, en gallesyre, slik som deoksykolinsyre, et digitoksin, en slangegift, et glukopyranosid eller en ikke-ionisk detergent av type triton. Fargemiddelet kan være hematoksylin, metylenblå, metylengrønn, metylenasur, kresylfiolettacetat, toluidinblå, gentianfiolett, en sudananalog, gallocyanin, eller en fuchsinanalog, eller enhver kombinasjon derav. Når en blodprøve kommer i kontakt med reagensen 22, vil det hemolyserende middelet virke for å lysere de røde blodcellene slik at de lyserte røde blodcellene blandes med blodplasmaet. Videre vil fargemiddelet akkumulere i nukleusene av de hvite blodcellene. Reagensen 22 burde inneholde tilstrekkelige mengder av fargemiddel for å distinktivt farge alle nukleusene av de hvite blodcellene. Således vil det ofte være et overskudd av fargemiddel, hvilket vil blandes inn i blodplasmaet. Overskuddet av fargemiddelet vil gi et homogent, lavt bakgrunnsnivå av fargemiddel i blodplasmaet. Det akkumulerte fargemiddelet i de hvite blodcellene vil være atskillelig høyere enn bakgrunnsnivået av fargemiddelet.

Reagensen 22 kan også omfatte andre bestanddeler, hvilket kan være aktive, dvs. ta del i den kjemiske reaksjonen med blodprøven, eller ikke-aktiv, dvs. ikke ta del i den kjemiske reaksjonen med blodprøven. De aktive bestanddelene kan for eksempel arrangeres for å katalysere den hemolyserende eller fargende virkningen. De ikke-aktive bestanddelene kan for eksempel arrangeres for å forbedre tilknytning av reagensen 22 til overflaten av en vegg av målekaviteten 20.

Innen noen få minutter, vil blodprøven ha reagert med reagensen 22, slik at de røde blodcellene lyseres og fargemiddelet akkumuleres i nukleusene av de hvite blodcellene.

Refererende til figur 2, vil en annen utførelsesform av prøveopptakingsanordningen beskrives. Prøveopptakingsanordningen 110 omfatter et kammer 120 formende målekaviteten. Prøveopptakingsanordningen 110 haren åpning 118 inn i kammeret 120 for å transportere blod inn i kammeret 120. Kammeret 120 er knyttet til en pumpe (ikke vist) via et sugerør 121. Pumpen kan applisere en sugekraft i kammeret 120 via sugerøret 121 slik at blod kan suges inn i kammeret 120 gjennom åpningen 118. Prøveopptakingsanordningen 110 kan kobles fra pumpen før målingen utføres. Lik målekaviteten 20 av prøveopptakingsanordningen 10 i henhold til den første utførelsesform, har kammeret 120 en veldefinert tykkelse definerende tykkelsen av prøven som skal undersøkes. Videre appliseres en reagens 122 til vegger av kammeret 120 for å reagere med blodprøven.

Refererende nå til figur 3, vil et apparat 30 for volumetrisk opptelling av hvite blodceller beskrives. Apparatet 30 omfatter en prøveholder 32 for å motta en prøveopptakingsanordning 10 med en blodprøve. Prøveholderen 32 arrangeres for å motta prøveopptakingsanordningen 10 slik at målekaviteten 20 av prøveopptakingsanordningen 10 korrekt posisjoneres innen apparatet 30. Apparatet 30 omfatter en lyskilde 34 for å illuminere blodprøven innen

prøveopptakingsanordningen 10. Lyskilden 34 kan være en hvitglødende lampe, som utstråler lys i hele det synlige spekteret. Fargemiddelet som akkumuleres i

nukleusene av de hvite blodcellene vil absorbere lys av spesifikke bølgelengder, slik at nukleusene av de hvite blodcellene vil tre frem i et digitalt bilde av prøven. Hvis et fargebilde oppnås, vil de hvite blodcellene tre frem som spesifikt fargede prikker. Hvis et sort og hvitt bilde oppnås, vil de hvite blodcellene tre frem som mørke flekker mot en lysere bakgrunn.

Lyskilden 34 kan alternativt være en laser eller en lysemitterende diode. Dette kan brukes for å øke kontrast i bildet slik at de hvite blodcellene med større letthet kan påvises. I dette tilfelle arrangeres lyskilden 34 for å utstråle elektromagnetisk bestråling av en bølgelengde som samsvarer med en absorpsjonstopp av fargemiddelet. Bølgelengden bør videre velges slik at absorpsjonen av blodforbindelsene er relativt lav. Videre bør veggene av prøveopptakingsanordningen 10 i all vesentlighet være transparente til bølgelengden. Foreksempel, hvor metylenblå anvendes som fargemiddelet, kan lyskilden 34 arrangeres for å utstråle lys som har en bølgelengde av 667 nm.

Apparatet 30 omfatter videre et avbildningssystem 36, som arrangeres på en motstående side av prøveholderen 32 relativt til lyskilden 34. Således arrangeres avbildningssystemet 36 for å motta bestråling som er transmittert gjennom blodprøven. Avbildningssystemet 36 omfatter et forstørrelsessystem 38 og et bildeoppnåelsesmiddel 40. Forstørrelsessystemet 38 arrangeres for å tilveiebringe en forstørrelsesstyrke av 3-200x, mer fortrinnsvis 3-100x, og mest foretrukket 3-4x. Innen disse områdene av forstørrelsesstyrke, er det mulig å atskille de hvite blodcellene. Bildet kan oppnås med en forbedret oppløsning for å kunne tillate lavere forstørrelsesstyrke å anvendes. Videre kan dybdeskarpheten av forstørrelsessystemet 38 fortsatt arrangeres for å minst korrespondere til tykkelsen av målekaviteten 20.

Forstørrelsessystemet 38 omfatter en objektivlinse eller linsesystem 42, som arrangeres nært til prøveholderen 32, og en okulærlinse eller linsesystem 44, som arrangeres ved en avstand fra objektivlinsen 42. Objektivlinsen 42 tilveiebringer en første forstørrelse av prøven, hvilket videre forstørres av den okulære linsen 44. Forstørrelsessystemet 38 kan omfatte ytterligere linser for oppnå en passende forstørrelse og avbildning av prøven. Forstørrelsessystemet 38 arrangeres slik at prøven i målekaviteten 20, når plassert i prøveholderen 32, vil fokuseres på et bildeplan av bildoppnåelsesmiddelet 40.

Bildeoppnåelsesmiddelet 40 arrangeres for å oppnå et digitalt bilde av prøven. Bildoppnåelsesmiddelet 40 kan være en hvilken som helst type av digitalt kamera, slik som et CCD-kamera. Pikselstørrelsen av det digitale kameraet setter en begrensning på avbildningssystemet 36 slik at uskarphetssirkelen i bildeplanet ikke behøver å overskride pikselstørrelsen innen dybdeskarpheten. Dog kan de hvite blodcellene fremdeles påvises selv om de til en viss grad er uskarpe og, derfor kan uskarphetssirkelen tillates å overskride pikselstørrelsen mens den betraktes innen dybdeskarpheten. Det digitale kameraet 40 vil oppnå et digitalt bilde av prøven i målekaviteten 20, hvori den fullstendige prøvetykkelsen er tilstrekkelig fokusert i det digitale bildet for å telle de hvite blodcellene. Avbildningssystemet 36 vil definere et område av målekaviteten 20, hvilket vil avbildes i det digitale bildet. Flaten som avbildes sammen med tykkelsen av målekaviteten 20 definerer volumet av prøven som avbildes. Avbildningssystemet 36 er satt opp til å passe avbildning av blodprøver i prøveopptakingsanordninger 10. Det er ingen behov for å endre oppsettet av avbildningssystemet 36. Fortrinnsvis arrangeres avbildningssystemet 36 innen et deksel slik at oppsettet ikke tilfeldigvis endres.

Apparatet 30 omfatter videre en bildeanalysator 46. Bildeanalysatoren 46 knyttes til det digitale kameraet 40 for å motta digitale bilder oppnådd ved det digitale kameraet 40. Bildeanalysatoren 46 arrangeres for å identifisere mønstre i det digitale bildet som korresponderer til en hvit blodcelle fortelling av antallet av hvite blodceller som er tilstede i det digitale bildet. Således kan bildeanalysatoren 46 arrangeres for å identifisere mørke flekker på en lysere bakgrunn. Bildeanalysatoren 46 kan arrangeres for å først elektronisk forstørre det digitale bildet før analyse av det digitale bildet. Dette innebærer at bildeanalysatoren 46 kan være istand til å lettere atskille hvite blodceller som avbildes nær hverandre, selv om den elektroniske forstørrelsen av det digitale bildet vil gjøre det digitale bildet noe uskarpt.

Bildeanalysatoren 46 kan beregne antallet av hvite blodceller per blodvolum ved å dele antallet av hvite blodceller som identifiseres i det digitale bildet med volumet av blodprøven, hvilket er veldefinert som beskrevet ovenfor. Volumetrisk antall hvite blodceller kan presenteres på et display av apparatet 30.

Bildeanalysatoren 46 kan realiseres som en prosesseringsenhet, som omfatter koder for å utføre bildeanalysen.

Refererende til figur 4, vil en fremgangsmåte for volumetrisk opptelling av hvite blodceller beskrives. Fremgangsmåten omfatter å oppnå en blodprøve i en prøveopptakingsanordning, steg 102. En ufortynnet prøve av helblod oppnås i prøveopptakingsanordningen. Prøven kan oppnås fra kapillærblod eller venøst blod. En prøve av kapillærblod kan dras inn i målekaviteten direkte fra en stukket finger av en pasient. Blodprøven gjør kontakt med en reagens i prøveopptakingsanordningen initierende en reaksjon. De røde blodcellene vil lyseres og et fargemiddel akkumuleres i nukleusene av de hvite blodcellene. Innen noen få minutter fra oppnåelse av blodprøven, er prøven klar til å analyseres. Prøveopptakingsanordningen plasseres i et analyseapparat, steg 104. En analyse kan initieres ved å trykke på en knapp av analyseapparatet. Alternativt initieres analysen automatisk av apparatet ved påvisning av tilstedeværelse av prøveopptakingsanordningen.

Prøven bestråles, steg 106, og et digitalt bilde av en forstørrelse av prøven oppnås, steg 108. Prøven bestråles med elektromagnetisk stråling av en bølgelengde korresponderende til en absorpsjon stopp av fargemiddelet. Dette innebærer at det digitale bildet vil inneholde sorte eller mørkere prikker i posisjonene av de hvite blodcellenukleusene.

Det oppnådde digitale bildet overføres til en bildeanalysator, som utfører bildeanalyse, steg 110, for å telle antallet av sorte prikker i det digitale bildet.

I figur 5 vises et eksempel på et digitalt bilde for å indikere muligheten for å identifisere hvite blodceller i en blodprøve som er hemolysert og farget. Dette digitale bildet ble oppnådd av en prøveopptakingsanordning med en kavitetstykkelse av 140 um og ved anvendelse av 50 ganger forstørrelse. Lyskilden utstråler hvitt lys, hvilket indikerer at de hvite blodcellene kan identifiseres selv om bestrålningen ikke spesifikt er tilpasset en absorpsjonstopp av fargemiddelet. Fargemiddelet anvendt var metylenblå. Distinkte sorte prikker fremtrer i figur 5 indikerende hvite blodceller. Bildet vist i figur 5 er en sort og hvit versjon av et fargebilde. Kontrasten mellom de hvite blodcellene og bakgrunnen fremtrer tydeligere i fargebildet enn i det sorte og hvite bildet reprodusert her. De sorte prikkene kan med letthet telles av en bildeanalysator.

I manuelle fremgangsmåter for å telle hvite blodceller, telles typisk omtrent 200 celler for å bestemme antallet hvite blodceller av blodprøven. Fremgangsmåten og apparatet presentert her kan for eksempel arrangeres for å telle omtrent 2000 celler, hvilket gir bedre statistisk sikkerhet av de oppnådde resultatene. En normal, frisk voksen har et antall hvite blodceller av 4-5 x IO<9>celler/liter blod. Dette innebærer at 2000 celler finnes i prøver som har et volum av 0,4- 0,5 ul. For eksempel, hvis et område av 1,5 x 1,5 mm i målekaviteten som har en tykkelse av 140 um avbildes, er volumet som avbildes 0,315 ul. En del av det oppnådde bildet kan velges for analyse. Således kan det oppnådde bildet først grovt analyseres slik at ingen uregelmessigheter tillates i delen som anvendes for å bestemme antallet hvite blodceller. Delen av det oppnådde bildet valgt for analyse kan være valgt innehaende en passende størrelse slik at et tilstrekkelig volum av blodprøven vil analyseres.

Det skal fremheves at de foretrukne utførelsesformer beskrevet heri på ingen måte er begrensende og at mange alternative utførelsesformer er mulige innen omfanget av beskyttelse definert ved de vedlagte patentkrav.

Claims

1. Prøveopptakingsanordning for volumetrisk opptelling av hvite blodceller i en blodprøve, karakterisert vedat prøveopptakingsanordningen omfatter: en målekavitet for å motta en blodprøve, hvor målekaviteten har en forutbestemt fast tykkelse på 100-150 mikrometer, en reagens, som er anordnet i en tørket form på en overflate som definerer målekaviteten, hvor reagensen omfatter et hemolyserende middel for å lysere røde blodceller i blodprøven, og et fargemiddel for selektiv farging av hvite blodceller i blodprøven.

2. Prøveopptakingsanordning ifølge krav 1, hvori prøveopptakingsanordningen omfatter et legemselement som har to plane overflater for definering av målekaviteten.

3. Prøveopptakingsanordning ifølge krav 2, hvori de plane overflatene anordnet på en forutbestemt avstand fra hverandre for bestemmelse av en prøvetykkelse for en optisk måling.

4. Prøveopptakingsanordning ifølge hvilke som helst av de foregående patentkrav, hvori fargemiddelet er anordnet for å selektivt farge de hvite blodcellenes kjerner.

5. Prøveopptakingsanordning ifølge hvilke som helst av de foregående patentkrav, hvori fargemiddelet er et hvilket som helst i gruppen av hematoksylin, metylenblå, metylengrønn, toluidinblå, gentianafiolett, sudananaloger, gallocyanin, og fuchsinanaloger.

6. Prøveopptakingsanordning ifølge hvilke som helst av de foregående patentkrav, hvori det hemolyserende middelet er et kvarternært ammoniumsalt, et saponin, en gallesyre, et digitoksin, en slangegift, en glukopyranosid eller en ikke-ionisk detergent av type triton.

7. Prøveopptakingsanordning ifølge hvilke som helst av de foregående patentkrav, videre omfattende et prøveinnløp som setter målekaviteten i forbindelse med prøveopptakingsanordningens ytre, hvor innløpet er anbrakt for å oppta en blodprøve.

8. Fremgangsmåte for volumetrisk opptelling av hvite blodceller i en blodprøve,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: å oppta en blodprøve inn i en målekavitet med en prøveopptakingsanordning, hvilken målekavitet haren forhåndsbestemt, fastsatt tykkelse på 100-150 mikrometer og hvilken målekavitet inneholder en reagens, hvilket er anbrakt i tørket form på en overflate som definerer målekaviteten, hvori reagensen omfatter et hemolyserende middel og et fargemiddel for å reagere med prøven slik at de hvite blodcellene farges, bestråle prøven med de fargede hvite blodcellene, oppta et digitalt bilde av en forstørrelse av den bestrålte prøven i målekaviteten, hvori hvite blodceller atskilles ved selektiv farging av fargemiddelet, og digitalt analysere det digitale bildet for å identifisere hvite blodceller og bestemme antallet av hvite blodceller i prøven.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, hvori blodprøven blandes med reagensen i målekaviteten.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8 eller 9, hvori det digitale bildet opptas med en dybdeskarphet tilsvarende i det minste en tredjedel av målekavitetens tykkelse.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, hvori et volum av en analysert prøve er veldefinert av målekavitetens tykkelse og et område av prøven som avbildes.

12. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 8-11, hvori prøven bestråles med lys med en bølgelengde tilsvarende en topp i fargemiddelets absorbans.

13. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 8-12, hvori nevnte bestråling utføres ved hjelp av en laserkilde.

14. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 8-12, hvori bestrålingen utføres ved hjelp av en lysdiode.

15. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 8-14, hvori det digitale bildet opptas ved anvendelse av en forstørrelsesstyrke av 10-200x, ytterligere foretrukket 40-100x.

16. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 8-15, hvori nevnte analyse omfatter å identifisere områder med høy lysabsorbanse i det digitale bildet.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, hvori nevnte analyse omfatter å identifisere sorte prikker i det digitale bildet.

18. Fremgangsmåte ifølge hvilke som helst av kravene 8-17, hvori nevnte analyse omfatter å elektronisk forstørre det opptatte digitale bildet.

19. System for volumetrisk opptelling av hvite blodceller i en blodprøve,karakterisert vedat systemet omfatter: en prøveopptakingsanordning ifølge til hvilke som helst av kravene 1-7, og et måleapparat, som omfatter: en holder for en prøveopptakingsanordning, hvilken er anbrakt for å motta prøveopptakingsanordningen som holder en i målekaviteten anbrakt blodprøve, en lyskilde, som er anbrakt for å bestråle blodprøven, et avbildningssystem, som omfatter et forstørrelsessystem og et organ for mottak av et digitalt bilde for oppnåelse av et digitalt bilde med en forstørrelse av den bestrålte i målekaviteten anbrakte prøven, hvori hvite blodceller adskilles i det digitale bildet gjennom selektiv farging av fargemiddelet, og en bildeanalysator, som er anbrakt for å analysere det opptatte digitale bildet for identifisering av hvite blodceller og for bestemmelse av antallet hvite blodceller i blodprøven.

20. System ifølge krav 19, hvori forstørrelsessystemet er anbrakt med en dybdeskarphet på i det minste en tredjedel av tykkelsen på prøveopptakingsanordningens målekavitet.

21. System ifølge krav 19 eller 20, hvori et volum av den analyserte prøven er veldefinert av målekavitetens tykkelse og et område av prøven som avbildes.

22. System ifølge hvilke som helst av kravene 19-21, hvori lyskilden er anbrakt for å utstråle lys med en bølgelengde som tilsvarer en topp i fargemiddelets absorbans.

23. System ifølge hvilke som helst av kravene 19-22, hvori lyskilden omfatter en laserkilde.

24. System ifølge hvilke som helst av kravene 19-22, hvori lyskilden omfatter en lysdiode.

25. System ifølge hvilke som helst av kravene 19-24, hvori forstørrelsessystemet har en forstørrelsesstyrke på 10-200x, og ytterligere foretrukket 40-100x.

26. System ifølge hvilke som helst av kravene 19-25, hvori bildeanalysatoren er anbrakt for å identifisere områder av høy lysabsorbanse i det digitale bildet.

27. System ifølge krav 26, hvori bildeanalysatoren er anbrakt for å identifisere sorte prikker i det digitale bildet.

28. System ifølge hvilke som helst av kravene 19-27, hvori bildeanalysatoren er anbrakt for elektronisk å forstørre det opptatte digitale bildet.