BRPI0608340B1

BRPI0608340B1 - Dispositvo de obtenção de amostras, método e sistema para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas

Info

Publication number: BRPI0608340B1
Application number: BRPI0608340-4A
Authority: BR
Inventors: Stellan Lindberg; Johnny Svensson
Original assignee: Hemocue Ab
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2019-04-02
Also published as: KR101244234B1; AU2006221130B2; US8092758B2; SE0500549L; KR20080003337A; CA2599747A1; CA2599747C; AU2006221130A1; PL1701150T3; US7521243B2; NO20074564L; BRPI0608340B8; LT1701150T; MY143768A; US20060210428A1; SE528697C2; BRPI0608340A2; JP4642893B2; CN101137904B; RU2365919C2

Abstract

método, dispositivo e sistema para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas. a presente invenção refere-se a um dispositivo de obtenção de amostras para enumeração volumétrica de células sangúíneas brancas em uma amostra de sangue que compreende uma cavidade de medição para receber uma amostra de sangue. a cavidade de medição tem uma espessura fixa predeterminada. o dispositivo de obtenção de amostras compreende, ainda, um reagente, que está disposto em uma forma seca sobre uma superfície que define a cavidade de medição. o reagente compreende um agente de hemólise para lisar células sangúíneas vermelhas na amostra de sangue. um sistema compreende o dispositivo de obtenção de amostras e um aparelho de medição. o aparelho de medição compreende um suporte de dispositivo de obtenção de amostras, uma fonte de luz e um sistema de formação de imagens para obter uma imagem digital de uma ampliação da amostra. o aparelho de medição compreende, ainda, um analisador de imagens, previsto para analisar a imagem digital obtida para determinar o número de células sangúineas brancas na amostra de sangue.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para DISPOSITIVO DE OBTENÇÃO DE AMOSTRAS, MÉTODO E SISTEMA PARA A ENUMERAÇÃO VOLUMÉTRICA DE CÉLULAS SANGUÍNEAS BRANCAS.

Campo Técnico [001] A presente invenção refere-se a um dispositivo para obtenção de amostras, a um método e a um sistema para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue.

Antecedentes da Invenção [002] Determinar uma contagem de células sanguíneas brancas muitas vezes é importante em conexão com o tratamento de um paciente. Essa análise pode ser necessária para diagnosticar, por exemplo, leucemia, ou doenças infecciosas ou inflamatórias ou para monitorar tratamentos. É desejável possibilitar que os resultados da análise sejam obtidos o mais rapidamente possível, a fim de minimizar tempos de espera para os pacientes e possibilitar a um médico tomar uma decisão de tratamento e diagnóstico diretamente ao fazer o primeiro exame do paciente. Seria preferível, portanto, obter um método de análise que possa ser realizado rapidamente pelo médico ou por uma enfermeira, sem a necessidade de enviar o teste para um laboratório.

[003] Atualmente, uma contagem de células sanguíneas brancas normalmente é obtida através de um procedimento manual, marcando uma amostra de sangue e examinando microscopicamente a amostra em uma câmara de contagem especial, por exemplo, uma câmara Büerker. A câmara de contagem está dotada de uma grade que divide a câmara em volumes pequenos bem definidos. As células sanguíneas brancas são deixadas assentar-se no fundo da câmara de contagem, a fim de possibilitar que o microscópio focalize todas as células na câmara e, desse modo, facilite a contagem. Desse modo, a amostra precisa assentar-se por diversos minutos, antes de ser realizada a contagem. Depois, a contagem das células sanguíneas brancas pode ser

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2/25 determinada contando o número de células sanguíneas por compartimento da grade. A contagem das células sanguíneas brancas é obtida manualmente por um analista, que precisa ter experiência em realizar a análise, a fim de ser capaz de realizar uma análise confiável.

[004] Essa análise envolve gasto de tempo. Além disso, como ela é realizada manualmente, os resultados da análise podem variar, dependendo da pessoa que realiza a análise.

[005] Há poucos métodos de análise automáticos existentes para determinar uma contagem de células sanguíneas brancas. A contagem das células sanguíneas brancas pode ser determinada por meio do princípio de Coulter, que está baseado na determinação do tamanho das células e, com isso, o tipo da célula, por percepção de uma impedância. Um método para contagem de células sanguíneas brancas pelo princípio de Coulter está descrito no documento US 5.262.302.

[006] O princípio de Coulter é o método de análise automático predominante usado atualmente. Mas, existem alguns outros métodos que foram descritos. Um desses métodos para determinar uma contagem de células sanguíneas brancas está descrito no documento US 5.585.246. Aqui, uma amostra de sangue tem de ser preparada por mistura com um corante fluorescente e um complexo de ligante, que marca as células sanguíneas brancas. A amostra é introduzida em um tubo capilar e é irradiada com uma fonte de laser, que esquadrinha a amostra no tubo capilar. A fluorescência é medida, a fim de determinar o número de células sanguíneas brancas. Um método semelhante está descrito no documento WO 97/02482, usando um corante fluorescente e uma fonte de laser para esquadrinhar um tubo capilar. Esse método está adaptado para enumeração de células sanguíneas brancas em produtos de aférise que contêm um número baixo de células sanguíneas brancas. Aqui, o tubo capilar é bastante grosso e é necessário que as células sanguíneas brancas tenham se assentado no fundo do tubo capilar, antes que o tubo capilar possa ser esquadrinhado.

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3/25 [007] No documento WO 99/45384 é mostrada uma câmara que contém a amostra, com uma espessura variável. A espessura variável separa diferentes compostos de sangue. A amostra de sangue é marcada com um corante para realçar diferencialmente pelo menos três tipos diferentes de células sanguíneas brancas na amostra de sangue. As células sanguíneas brancas podem ser enumeradas usando um instrumento de esquadrinhamento óptico para examinar uma parte da câmara.

[008] Ainda existe a necessidade de acelerar e simplificar os métodos automáticos existentes para determinar uma contagem de células sanguíneas brancas, de modo que a análise possa ser obtida no local do atendimento. Além disso, como a contagem de células sanguíneas brancas é uma análise realizada tão comumente, qualquer aperfeiçoamento no método de análise teria um grande impacto no atendimento dos pacientes. Um método de análise que ofereça uma possibilidade de obter resultados no local de atendimento seria particularmente vantajoso.

[009] O documento WO 97/02482 descreve um método e um sistema para enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas em produtos de sangue aférese. As células sanguíneas brancas da amostra são coradas com um corante intercalante fluorescente e as plaquetas são lisadas por um segundo reagente adicionado. Um sal de amônio quaternário é adicionado para evitar que as plaquetas lisadas se agreguem. A amostra é, então, colocada em um capilar de volume fixo, de forma retangular e com uma espessura de 300 pm. As células sanguíneas brancas são deixadas para assentar no fundo do capilar e uma medição é depois realizada pela exploração de um feixe de laser da amostra e subsequente medição da fluorescência emitida.

[0010] Por sua vez, o documento US5674457 uma microcuveta capilar integral com uma cavidade definida por duas superfícies internas opostas substancialmente paralelas. A cavidade é preenchida com um reagente compreendendo desoxicolato de sódio, azida sódica e

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4/25 nitrito de sódio. A cuveta é seca ao ar e depois preenchida com sangue total, EDTA e um agente anticoagulante e é efetuada uma determinação espectrofotométrica da hemoglobina.

[0011] O problema a ser resolvido pela presente invenção é fornecer um dispositivo de aquisição de amostras para enumeração volumétrica rápida e fácil de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue e sem a necessidade de um usuário treinado para obter um resultado. Isto é conseguido pelo dispositivo de aquisição de amostras da presente invenção, proporcionando o reagente em uma superfície dentro da cavidade de medição, em que a amostra de sangue é diretamente adquirida na cavidade de medição sem necessidade de pré-tratamento, e em que a análise pode ocorrer diretamente, sem esperar que as células se instalem no fundo do capilar.

[0012] Um técnico no assunto não encontraria qualquer solução para o problema objetivo no documento WO9702482. Um capilar usado por WO9702482 tem 300 pm de profundidade, 3 mm de largura e 40 mm de comprimento e afirma-se que é importante usar um volume de amostra suficientemente grande para tornar os resultados estatisticamente significativos, uma vez que o documento WO9702482 não direciona o técnico no assunto a usar um pequeno volume de amostra. A profundidade do capilar de em WO9702482 pode variar entre 200 e 400 pm, e usar um capilar com uma profundidade inferior a 200 pm não forneceria um volume de amostra suficientemente grande para a análise. As células sanguíneas brancas são, de acordo com WO9702482, escaneadas depois de se depositarem no fundo da parede interna do capilar. Dessa forma, um técnico no assunto não é direcionado para usar um capilar com uma espessura menor, pois, para alcançar resultados estatisticamente significativos, uma área maior deve ser escaneada e o tempo para uma análise aumentaria.

[0013] Com os ensinamentos de WO9702482, tendo em mente o problema a ser resolvido, o técnico no assunto não encontraria uma solução para o problema se, surpreendentemente, se voltasse para o

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US5674457. Não existe nada em WO9702482 que dirija o técnico no assunto a utilizar um capilar alongado com um volume de amostra suficientemente grande para varrer a amostra e medir a fluorescência emitida.

[0014] Um técnico no assunto não encontraria a solução em US5674457, uma vez que a camada líquida na cavidade é fina e a mistura completa necessária no método de WO9702482 não seria possível. Além disso, o volume da amostra seria demasiado pequeno para um resultado estatisticamente significativo se o técnico no assunto tentasse medir o número de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue em uma cuveta do documento US5674457 designada para utilização na determinação espectrofotométrica de conteúdo de hemoglobina em uma amostra de sangue.

[0015] Assim, não há nada no documento US5674457 que sugira que a medição possa ser feita de qualquer outra maneira que não seja a determinação espectrofotométrica. A utilização de um método que consiste em adquirir uma imagem de uma amostra irradiada é um método muito diferente do que adquirir a absorvância de uma amostra. Sumário da Invenção [0016] A invenção refere-se a um método para pôr à disposição uma análise simples para determinar uma enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas. É um outro objeto da invenção pôr à disposição uma análise rápida, sem a necessidade de aparelhos complicados ou longas preparações das amostras.

[0017] Esses objetos são alcançados em parte ou totalmente por um dispositivo de obtenção de amostras, por um método e um sistema de acordo com as reivindicações independentes. Modalidades preferidas evidenciam-se das reivindicações dependentes.

[0018] Desse modo, é posto à disposição um dispositivo de obtenção de amostras para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue. O dispositivo de obtenção de amostras compreende uma cavidade de medição para receber uma

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6/25 amostra de sangue. A cavidade de medição tem uma espessura fixa, predeterminada. O dispositivo de obtenção de amostras compreende, ainda, um reagente, que está disposto em forma seca sobre uma superfície que define a cavidade de medição, sendo que o referido reagente compreende um agente de hemólise para lisar células sanguíneas vermelhas na amostra de sangue, e um agente de marcação para marcar seletivamente células sanguíneas brancas na amostra de sangue.

[0019] O dispositivo de obtenção de amostras oferece a possibilidade de obter diretamente uma amostra de sangue integrar na cavidade de medição e pôr a mesma à disposição para análise. Não há necessidade de preparação da amostra. Na verdade, a amostra de sangue pode ser aspirada para a cavidade de medição diretamente de um dedo puncionado de um paciente. Dotar o dispositivo de obtenção de amostras de um reagente possibilita uma reação dentro do dispositivo de obtenção de amostras, que torna a amostra pronta para análise. A reação é iniciada quando a amostra de sangue entra em contato com o reagente. Desse modo, não há necessidade de preparar manualmente a amostra, o que torna a análise especialmente apropriada para ser realizada direção em uma sala de exames enquanto o paciente está esperando.

[0020] Como o reagente é posto à disposição em uma forma seca, o dispositivo de obtenção de amostras pode ser transportado e armazenado por um longo tempo, sem afetar a usabilidade do dispositivo de obtenção de amostras. Desse modo, o dispositivo de obtenção de amostras com o reagente pode ser produzido e preparado muito tempo antes de ser realizada a análise de uma amostra de sangue.

[0021] Embora muitos métodos existentes sejam capazes de contar diferentes células sanguíneas e mesmo subgrupos de células sanguíneas, o dispositivo de obtenção de amostras de acordo com a invenção está especificamente adaptado para realizar uma enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas. O reagente compreende

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7/25 um agente de hemólise, que lisa as células sanguíneas vermelhas na amostra de sangue. Isso destrói as possibilidades de se enumerar as células sanguíneas vermelhas na amostra. Por outro lado, a lise das células sanguíneas vermelhas simplifica a distinção e identificação de células sanguíneas brancas dentro da amostra de sangue.

[0022] O agente de marcação possibilita uma marcação das células sanguíneas brancas individuais. Isso permite que as células sanguíneas brancas sejam examinadas ou detectadas individualmente. As células sanguíneas brancas podem ser detectadas, por exemplo, esquadrinhando a cavidade de medição ou obtendo uma imagem da cavidade de medição. Desse modo, a contagem de células sanguíneas brancas pode ser obtida somando o número de células sanguíneas brancas detectadas individualmente em um volume definido.

[0023] A invenção também põe à disposição um método para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue. O método compreende obter uma amostra de sangue em uma cavidade de medição de um dispositivo de obtenção de amostras, sendo que a referida cavidade de medição contém um reagente, que compreende um agente de hemólise e um agente de marcação para reagir com a amostra, de modo que as células sanguíneas brancas são marcadas, irradiar a amostra com as células sanguíneas brancas marcadas, obter uma imagem digital ou uma ampliação da amostra irradiada na cavidade de medição, sendo que as células sanguíneas brancas são distinguidas por marcação seletiva pelo agente de marcação, e analisar digitalmente a imagem digital para identificar células sanguíneas brancas determinar o número de células sanguíneas brancas na amostra.

[0024] A invenção, além disso, põe à disposição um sistema para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue. O sistema compreende um dispositivo de obtenção de amostras, tal como descrito acima. O sistema compreende, ainda, um aparelho de medição, que compreende um suporte de disPetição 870180133274, de 24/09/2018, pág. 14/44

8/25 positivo de obtenção de amostras, para receber o dispositivo de obtenção de amostras, que contém uma amostra de sangue na cavidade de medição, e uma fonte de luz configurada para irradiar a amostra de sangue. O aparelho de medição compreende, ainda, um sistema de formação de imagens, que compreende um sistema de ampliação e um meio de obtenção de imagens digitais, para obter uma imagem digital de uma ampliação da amostra irradiada na cavidade de medição, sendo que as células sanguíneas brancas são distinguidas na imagem digital por marcação seletiva pelo agente de marcação. O aparelho de medição também compreende um analisador de imagens, configurado para analisar a imagem digital obtida, para identificar células sanguíneas brancas e determinar o número de células sanguíneas brancas na amostra de sangue.

[0025] O método e sistema de invenção proporcionam uma análise muito simples de uma amostra de sangue, para determinar uma contagem de células sanguíneas brancas. A análise não necessita de aparelhos de medição complicados nem de etapas avançadas a serem realizadas por um operador. Portanto, ela pode ser realizada em conexão direta com o exame de um paciente, sem a necessidade de um técnico qualificado. O aparelho de medição utiliza as propriedades do dispositivo de obtenção de amostras para fazer uma análise em uma amostra de sangue integral, não diluído, que foi obtida diretamente na cavidade de medição. O aparelho de medição está configurado para formar uma imagem de um volume da amostra, para realizar uma enumeração volumétrica das células sanguíneas brancas de uma imagem.

[0026] A amostra de sangue é deixada misturar-se com o regente na cavidade de medição. Dentro de alguns minutos ou menos, a reação da amostra de sangue com o reagente hemolisou as células sanguíneas vermelhas e marcou as células sanguíneas brancas, de modo que a amostra está pronta para se apresentar à medição óptica. A amostra de sangue pode ser misturada com o reagente, por exemplo,

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9/25 por dispersão ou difusão do reagente na amostra de sangue ou agitando ou movendo ativamente o dispositivo de obtenção de amostras, de modo que é causada uma agitação na cavidade de medição.

[0027] O dispositivo de obtenção de amostras pode compreender um elemento de corpo com duas superfícies planas, para definir a referida cavidade de medição. As superfícies planas podem estar dispostas a uma distância predeterminada uma da outra, para determinar a espessura de uma amostra para uma medição óptica. Isso indica que o dispositivo de obtenção de amostras proporciona uma espessura bem definida para a medição óptica, que pode ser usada para determinar precisamente a contagem de células sanguíneas brancas por unidade volumétrica da amostra de sangue. Um volume de uma amostra analisada é bem definido pela espessura da cavidade de medição e por uma área da amostra da qual está sendo formada a imagem. Desse modo, o volume bem definido pode ser usado para associar o número de células sanguíneas brancas ao volume da amostra de sangue, de modo que é determinada a contagem volumétrica das células sanguíneas brancas.

[0028] A cavidade de medição tem, de preferência, uma espessura uniforme de 50-170 micrômetros. Uma espessura de pelo menos 50 micrômetros indica que a cavidade de medição não força a amostra de sangue a ser esfregada em uma camada única, possibilitando que um volume de sangue maior seja analisado sobre uma área de secção transversal pequena. Desse modo, um volume suficientemente grande da amostra de sangue, a fim de dar valores confiáveis da contagem de células sanguíneas brancas, pode ser analisado usando uma imagem relativamente pequena da amostra de sangue. A espessura é, de modo particularmente preferido, de pelo menos 100 micrômetros, que permite que uma área de secção transversal ainda menor seja analisada ou um volume de amostra maior seja analisado. Além disso, a espessura de pelo menos 50 micrômetros e, de modo particularmente preferido, 100 micrômetros, também simplifica a produção da cavidade

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10/25 de medição com uma espessura bem definida entre duas superfícies planas.

[0029] Para a maioria das amostras disposta em uma cavidade com uma espessura de não mais de 170 micrômetros, a contagem de células sanguíneas brancas é tão baixa que há apenas desvios menores, devido ao fato de que as células sanguíneas brancas estão dispostas sobrepostas umas às outras. Mas, o efeito desses desvios é relacionado à contagem das células sanguíneas brancas e, desse modo, pode, pelo menos até um certo ponto, ser administrado por meio de resultados de correção estatística, pelo menos para valores grandes da contagem de células sanguíneas brancas. Essa correção estatística pode estar baseada em calibrações do aparelho de medição. Os desvios são ainda menores para uma cavidade de medição com uma espessura de não mais do que 150 micrômetros, sendo que pode ser usada uma calibração mais simples. Essa espessura pode até mesmo não necessitar de nenhuma calibração para células sanguíneas sobrepostas.

[0030] Além disso, a espessura da cavidade de medição é suficientemente pequena para possibilitar que o aparelho de medição obtenha uma imagem digital, de modo que toda a profundidade da cavidade pode ser analisada simultaneamente. Como um sistema de ampliação é usado no aparelho de medição, não é simples obter um campo de profundidade grande. Portanto, a espessura da cavidade de medição, de preferência, não excede 150 micrômetros, para que toda a espessura seja analisada simultaneamente em uma imagem digital. A profundidade de campo pode ser configurada para lidar com uma espessura da cavidade de medição de 170 micrômetros.

[0031] A imagem digital pode ser obtida com uma profundidade de campo pelo menos correspondente à espessura da cavidade de medição. Isso indica que um foco suficiente é obtido de toda a espessura da amostra, de modo que a espessura total da cavidade de medição pode ser analisada simultaneamente na imagem digital da amostra.

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Desse modo, não há necessidade de esperar que as células sanguíneas brancas se assentem na cavidade de medição, com o que o tempo para fazer uma análise é reduzido. Optando por não focalizar muito nitidamente uma parte específica da amostra, um foco suficiente é obtido de toda a espessura da amostra, para permitir a identificação do número de células sanguíneas brancas na amostra. Isso implica em que uma célula sanguínea branca pode estar um tanto indistinta e ainda ser considerada como estando no foco da profundidade de campo.

[0032] O dispositivo de obtenção de amostras pode estar dotado de um reagente, que foi aplicado à superfície dissolvido em um líquido volátil, que evaporou para deixar o reagente em uma forma seca.

[0033] Foi constatado que o reagente é dissolvido vantajosamente em um líquido volátil, antes de ser inserido na cavidade de medição. Isso indica que o líquido pode ser evaporado de modo eficiente do espaço estreito da cavidade de medição durante a produção e preparação do dispositivo de obtenção de amostras.

[0034] O reagente pode, de preferência, ser dissolvido em um solvente orgânico e, de modo particularmente preferido, ser dissolvido em metanol. Esses solventes são voláteis e podem ser usados apropriadamente para secar o reagente sobre uma superfície da cavidade de medição.

[0035] O agente de marcação pode ser configurado para marcar seletivamente o núcleo das células sanguíneas brancas. Isso implica no fato de que as células sanguíneas brancas podem ser identificadas como pontos coloridos e, portanto, contadas facilmente em uma imagem digital.

[0036] O agente de marcação pode ser qualquer um no grupo de hematoxilina, azul de metileno, verde de metileno, azul-celeste de metileno, acetato de violeta de cresila, azul de toluidina, violeta genciana, análogos de sudano, galocianina e análogos de fucsina, ou qualquer combinação dos mesmos. Mas, deve ser entendido que o agente de marcação não está limitado a esse grupo, mas que muitas outras

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12/25 substâncias podem ser consideradas.

[0037] O agente de hemólise pode ser um sal de amônio quaternário, uma saponina, um ácido biliar, tal como ácido deoxicólico, uma digitoxina, um veneno de cobra, uma glucopiranosida ou um detergente não iônico do tipo Triton. Mas, deve ser entendido que o agente de hemólise não está limitado a esse grupo, mas muitas outras substâncias podem ser consideradas.

[0038] O dispositivo de obtenção de amostras pode ainda compreender uma entrada de amostra, que liga a cavidade de medição com o exterior do dispositivo de obtenção de amostras, sendo que a referida entrada está configurada para adquirir uma amostra de sangue. A entrada de amostra pode estar configurada para aspirar uma amostra de sangue por uma força capilar e a cavidade de medição pode ainda aspirar sangue da entrada para a cavidade. Como resultado, a amostra de sangue pode ser obtida facilmente na cavidade de medição, simplesmente movendo a entrada de amostra para contato com sangue. Depois, as forças capilares da entrada de amostra e da cavidade de medição aspiram uma quantidade bem definida de sangue para a cavidade de medição. Alternativamente, a amostra de sangue pode ser sugada ou aspirada na cavidade de medição por meio da aplicação de uma força de bombeamento externa ao dispositivo de obtenção de amostras. De acordo com outra alternativa, a amostra de sangue pode ser obtida em uma pipeta e depois introduzida na cavidade de medição por meio da pipeta.

[0039] O dispositivo de obtenção de amostras pode ser descartável, isto é, está configurado para ser usado apenas uma vez. O dispositivo de obtenção de amostras oferece um kit para realizar uma contagem de células sanguíneas brancas, uma vez que o dispositivo de obtenção de amostras é capaz de receber uma amostra de sangue e contém todos os regentes necessários, a fim de preparar a amostra para a contagem das células. Isso é particularmente possibilitado pelo fato de que o dispositivo de obtenção de amostras está adaptado para

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13/25 uso apenas por uma vez e pode ser formado sem consideração da possibilidade de limpar o dispositivo de obtenção de amostras e reaplicar um reagente. O dispositivo de obtenção de amostras também pode ser moldado em material plástico e, portanto, ser produzido a um preço baixo. Desse modo, pode ainda ser eficiente em custos usar um dispositivo de obtenção de amostras descartável.

[0040] A amostra pode ser irradiada por luz com um comprimento de onda correspondente a um pico de absorção do agente de marcação. Consequentemente, as células sanguíneas brancas marcadas, que contêm uma acumulação de agente de marcação, são detectadas por uma luz de baixa transmissão.

[0041] A irradiação pode ser realizada por meio de uma fonte de laser. A fonte de laser pode fornecer luz com um comprimento de onda bem definido, adequado à absorção do agente de marcação. Além disso, a fonte de laser fornece luz colimada, minimizando distúrbios de luz dispersa, de modo que um ponto de baixa transmissão de luz é distinguido nitidamente.

[0042] A irradiação pode ser realizada alternativamente, por meio de um diodo emissor de luz. Essa fonte de luz pode ainda obter condições de irradiação suficientes para distinguir corretamente células sanguíneas brancas de outras substâncias na amostra.

[0043] A imagem digital pode ser obtida usando uma potência de ampliação de 3-200x, de modo particularmente preferido, 3-10x. Dentro desses âmbitos de potência de ampliação, as células sanguíneas brancas são suficientemente ampliadas a fim de serem detectadas, enquanto a profundidade de campo pode ser configurada para cobrir a espessura da amostra. Uma potência de ampliação baixa indica que uma grande profundidade de campo pode ser obtida. Mas, se for usada uma potência de ampliação baixa, as células sanguíneas brancas podem ser difíceis de serem detectadas. Uma potência de ampliação baixa pode ser usada aumentando o número de pixels na imagem obtida, isto é, melhorando a resolução da imagem digital. Desse modo,

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14/25 tem sido possível usar uma potência de ampliação de 3-4z, possibilitando que as células sanguíneas brancas ainda sejam detectadas. [0044] A análise compreende identificar áreas de alta absorção de luz na imagem digital. A análise pode ainda compreender a identificação de pontos pretos ou escuros na imagem digital. Como os agentes de marcação podem estar acumulados no núcleo das células sanguíneas brancas, a absorção de luz pode ter picos em locais separados. Esses locais formam pontos pretos na imagem digital.

[0045] A análise compreende, ainda, a ampliação eletrônica da imagem digital obtida. Enquanto a amostra está sendo ampliada para obter uma imagem digital da amostra, a própria imagem digital obtida pode ser ampliada eletronicamente para simplificar a distinção entre objetos que são representados muito próximos uns dos outros na imagem digital obtida.

Descrição Resumida dos Desenhos [0046] A invenção é descrita agora em maiores detalhes por meio de um exemplo, sob referência aos desenhos anexos.

[0047] Figura 1 é uma vista esquemática de um dispositivo de obtenção de amostras de acordo com uma modalidade da invenção. [0048] Figura 2 é uma vista esquemática de um dispositivo de obtenção de amostras de acordo com outra modalidade da invenção. [0049] Figura 3 é uma vista esquemática de um aparelho de medição de acordo com uma modalidade da invenção.

[0050] Figura 4 é um diagrama de operações de um método de acordo dom uma modalidade da invenção.

[0051] Figura 5 é uma imagem digital de uma amostra de sangue a ser usada para enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas.

Descrição Detalhada de uma Modalidade Preferida [0052] Com referência, agora, à figura 1, é descrito um dispositivo de obtenção de amostras 10 de acordo com uma modalidade da invenção. O dispositivo de obtenção de amostras 10 é descartável e de

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15/25 ve ser jogado fora depois de ter sido usado para análise. Isso significa que o dispositivo de obtenção de amostras não necessita de um manuseio complicado. O dispositivo de obtenção de amostras 10 é formado, de preferência, em um material plástico e pode ser produzido por moldagem por injeção. Isso torna a produção do dispositivo de obtenção de amostras 10 simples e barata, com o que os custos do dispositivo de obtenção de amostras 10 podem ser mantidos baixos.

[0053] O dispositivo de obtenção de amostras 10 compreende um elemento de corpo 12, que tem uma base 14, que pode ser tocada por um operador, sem causar qualquer interferência nos resultados de análise. A base 14 também pode ter saliências que podem encaixar-se em m suporte em um aparelho de análise. As saliências 16 podem estar configuradas de tal modo que o dispositivo de obtenção de amostras 10 é posicionado corretamente no aparelho de análise.

[0054] O dispositivo de obtenção de amostras 10 compreende, ainda, uma entrada de amostra 18. A entrada de amostra 18 está definida entre paredes opostas dentro do dispositivo de obtenção de amostras 10, sendo que as paredes estão dispostas de tal modo próximas uma à outra que uma fora capilar pode ser criada na entrada de amostra 18. A entrada de amostra 18 está em ligação com o exterior do dispositivo de obtenção de amostras 10 para possibilitar que sangue seja aspirado no dispositivo de obtenção de amostras 10. O dispositivo de obtenção de amostras 10 compreende, ainda, uma câmara para contar células sanguíneas brancas na forma de uma cavidade de medição 20, disposta entre paredes opostas dentro do dispositivo de obtenção de amostras 10. A cavidade de medição 20 está disposta em comunicação com a entrada de amostra 18. As paredes que definem a cavidade de medição 20 estão dispostas mais próximas umas das outras do que as paredes da entrada de amostra 18, de modo que uma força capilar pode aspirar sangue da entrada de amostra 18 para a cavidade de medição 20.

[0055] As paredes da cavidade de medição 20 estão dispostas a

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16/25 uma distância uma da outra de 50-170 micrômetros. A cavidade de medição 20 tem, de modo particularmente preferido, pelo menos 100 micrômetros de espessura. Além disso, a cavidade de medição tem, de modo particularmente preferido, não mais do que 150 micrômetros de espessura. A distância é uniforme sobre toda a cavidade de medição 20. A espessura da cavidade de medição 20 define o volume de sangue que está sendo examinado. Como o resultado da análise deve ser comparado com o volume da amostra de sangue que está sendo examinada, a espessura da cavidade de medição 20 tem de ser muito precisa, isto é, apenas variações muito pequenas na espessura são permitidas dentro da cavidade de medição 20 e entre cavidades de medição 20 de diferentes dispositivos de obtenção de amostras 10. A espessura permite que um volume de amostra relativamente grande seja analisado em uma área pequena da cavidade. A espessura teoricamente permite que células sanguíneas brancas sejam dispostas umas em cima de outras dentro da cavidade de medição 20. Mas, a quantidade de células sanguíneas brancas dentro do sangue é tão baixa que a probabilidade de isso ocorrer é muito baixa.

[0056] O dispositivo de obtenção de amostras 10 está tipicamente adaptado para medir contagens de células sanguíneas brancas acima de 0,5 x 10⁹ células/litro de sangue. A contagens de células sanguíneas brancas mais baixas, o volume de amostra é pequeno demais para permitir que sejam contadas quantidades de células sanguíneas brancas estatisticamente significativas. Além disso, quando a contagem de células sanguíneas brancas excede 12 x 10⁹ células/litro de sangue, o efeito das células sanguíneas dispostas uma em cima da outra começa a ser significativo na contagem de células sanguíneas brancas medidas. Nessa contagem de células sanguíneas brancas, as células sanguíneas brancas cobrem aproximadamente 8% da secção transversal da amostra que está sendo irradiada, se a espessura da cavidade de medição for de 140 micrômetros. Desse modo, a fim de obter contagens corretas de células sanguíneas brancas, esse efeito

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17/25 precisa ser levado em consideração. Portanto, pode ser usada uma correção estatística de valores da contagem de células sanguíneas brancas acima de 12 x 10⁹ células/litros de sangue. Essa correção estatística aumenta por contagens de células sanguíneas brancas crescente, uma vez que o efeito de sobreposição de células sanguíneas é maior para contagens de células sanguíneas brancas maiores. A correção estatística pode ser determinada por meio de calibração de um aparelho de medição. Como alternativa, a correção estatística pode ser determinada em um nível geral para configurar aparelhos de medição a ser usados em conexão com o dispositivo de obtenção de amostras 10. Essa correção estatística é de tamanho semelhante às correções estatísticas que estão sendo realizadas atualmente no aparelho de análise que usa o princípio de Coulter. Considera-se que o dispositivo de obtenção de amostras 10 pode ser usado para analisar contagens de células sanguíneas brancas tão grandes quanto 50 x 10⁹ células/litro de sangue.

[0057] Uma superfície de uma parede da cavidade de medição 20 está pelo menos parcialmente revestida com um reagente 22. O reagente 22 pode ser secado por congelação, secado por calor ou secado por vácuo e aplicado à superfície da cavidade de medição 20. Quando uma amostra de sangue é obtida na cavidade de medição 20, o sangue entra em contato com o reagente seco 22 e inicia uma reação entre o reagente 22 e o sangue.

[0058] O reagente 22 é aplicado inserindo o reagente 22 na cavidade de medição 20 usando uma pipeta ou dispositivo de distribuição. O reagente 22 é dissolvido em um líquido volátil, por exemplo, um solvente orgânico, tal como metanol, quando inserido na cavidade de medição 20. O solvente com o reagente 22 precisa preencher a cavidade de medição 20. Depois, a secagem é realizada de tal modo que o solvente é evaporado e o reagente 22 fica aderido nas superfícies da cavidade de medição 20.

[0059] Como o reagente deve ser secado sobre uma superfície de

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18/25 um espaço estreito, o líquido tem uma superfície muito pequena em contato com a atmosfera ambiente, com o que a evaporação do líquido é tornada mais difícil. Desse modo, é vantajoso usar um líquido volátil, tal como metanol, que possibilita que o líquido seja evaporado de modo eficiente do espaço estreito da cavidade de medição.

[0060] De acordo com um método de produção alternativo, o dispositivo de obtenção de amostras 10 pode ser formado unindo duas peças uma à outra, com o que uma peça forma a parede de fundo da cavidade de medição 20 e a outra peça forma a parede superior da cavidade de medição 20. Isso permite que um reagente 22 seja secado sobre uma superfície aberta, antes que as duas peças sejam unidas uma à outra. Desse modo, o reagente 22 pode ser dissolvido em água, uma vez que o solvente não precisa ser volátil.

[0061] O reagente 22 compreende um agente de hemólise e um agente de marcação. O agente de hemólise pode ser um sal de amônio quaternário, uma saponina, um ácido biliar, tal como ácido deoxicólico, uma digitoxina, um veneno de cobra, uma glucopiranosida ou um detergente não iônico do tipo Triton. O agente de marcação pode ser hematoxilina, azul de metileno, verde de metileno, azul-celeste de metileno, acetato de violeta de cresila, azul de toluidina, violeta de genciana, um análogo de sudano, galocianina e um análogo de fucsina, ou qualquer combinação dos mesmos. Quando uma amostra de sangue entra em contato com o reagente 22, o agente de hemólise age para lisar as células sanguíneas vermelhas, de modo que as células sanguíneas vermelhas lisadas são misturadas com o plasma sanguíneo. Além disso, o agente de marcação acumula-se nos núcleos das células sanguíneas brancas. O reagente 22 deve conter quantidades suficientes de agente de marcação para marcar nitidamente todos os núcleos das células sanguíneas brancas. Desse modo, frequentemente há um excesso de agente de marcação, que é misturado no plasma sanguíneo. O excesso de agente de marcação dá um nível de fundo baixo, homogêneo, de agente de marcação no plasma sanguíneo. O

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19/25 agente de marcação acumulado nas células sanguíneas brancas pode ser distinguido sobre o nível de fundo de agente de marcação.

[0062] O reagente 22 também pode compreender outros componentes, que podem ser ativos, isto é, participam da reação química com a amostra de sangue, ou não ativos, isto é, não participam da reação química com a amostra de sangue. Os componentes ativos podem, por exemplo, ser configurados para catalisar a ação de hemólise ou marcação. Os componentes não ativos podem, por exemplo, estar configurados para aperfeiçoar a união do reagente 22 à superfície de uma parede da cavidade de medição 20.

[0063] Dentro de alguns minutos, a amostra de sangue reagiu com o reagente 22, de modo que as células sanguíneas vermelhas foram lisadas e o agente de marcação acumulou-se nos núcleos das células sanguíneas brancas.

[0064] Com referência à figura 2, é descrita outra modalidade do dispositivo de obtenção de amostras. O dispositivo de obtenção de amostras 110 compreende uma câmara 120, que forma a cavidade de medição. O dispositivo de obtenção de amostras 110 tem uma entrada 118 para uma câmara 120 para transportar sangue para a câmara 120. A câmara 120 está ligada a uma bomba (não mostrada) por meio de um tubo de sucção 121. A bomba pode aplicar uma força de sucção na câmara 120 por meio do tubo de sucção 121, de modo que sangue pode ser sugado para a câmara 120 através da entrada 118. O dispositivo de obtenção de amostras 110 pode ser desligado da bomba antes de ser realizada a medição. Tal como a cavidade de medição 20 do dispositivo de obtenção de amostras 10 de acordo com a primeira modalidade, a câmara 120 tem uma espessura bem definida, que define a espessura da amostra a ser examinada. Além disso, um reagente 122 é aplicado a paredes da câmara 120 para reagir com a amostra de sangue.

[0065] Com referência, agora, à figura 3, é descrito um aparelho para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas. O

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20/25 aparelho 30 compreende um suporte de amostra 32, para receber um dispositivo de obtenção de amostras 10 com uma amostra de sangue. O suporte de amostra 32 está disposto para receber o dispositivo de obtenção de amostras 10, de modo que a cavidade de medição 20 do dispositivo de obtenção de amostras 10 está posicionada corretamente dentro do aparelho 30. O aparelho 30 compreende uma fonte de luz 34 para iluminar a amostra de sangue dentro do dos 10. A fonte de luz 34 pode ser uma Lâmpada incandescente, que irradia luz em todo o espectro visível. O agente de marcação que está acumulado nos núcleos das células sanguíneas brancas absorve luz com comprimentos de onda específicos, de modo que os núcleos das células sanguíneas brancas emergem em uma imagem digital da amostra. Se for obtida uma imagem colorida, as células sanguíneas brancas emergem como pontos especificamente coloridos. Se for obtida uma imagem em preto e branco, as células sanguíneas brancas emergem como pontos escuros contra um fundo mais claro.

[0066] A fonte de luz 34 pode ser, alternativamente, um laser ou um diodo emissor de luz. A mesma pode ser usada para aumentar o contraste na imagem, de modo que as células sanguíneas brancas possam ser detectadas mais facilmente. Nesse caso, a fonte de luz 34 está prevista para irradiar radiação eletromagnética com um comprimento de onda que corresponde a um pico de absorção do agente de marcação. O comprimento de onda deve ainda ser escolhido de tal modo que a absorção dos compostos de sangue seja relativamente baixa. Além disso, as paredes do dispositivo de obtenção de amostras 10 devem ser essencialmente transparentes para o comprimento de onda. Por exemplo, quando é usado azul de metileno como o agente de marcação, a fonte de luz 34 pode estar prevista para irradiar luz com um comprimento de onda de 667 nm.

[0067] O aparelho 30 compreende, ainda, um sistema de formação de imagens 36, que está disposto em um lado oposto do suporte de amostra 32 com relação à fonte de luz 34. Desse modo, o sistema de

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21/25 formação de imagens 36 está previsto para receber radiação que foi transmitida através da amostra de sangue. O sistema de formação de imagens 36 compreende um sistema de ampliação 38 e um dispositivo de obtenção de amostras 40. O sistema de ampliação 38 está previsto para fornecer uma potência de ampliação de 3-200xm de modo particularmente preferido, 3-100x, e de modo especialmente preferido, 34x. Dentro desses âmbitos de potência de ampliação, é possível distinguir as células sanguíneas brancas. A imagem pode ser obtida com uma resolução aperfeiçoada, a fim de permitir que seja usada uma potência de ampliação mais baixa. Além disso, a profundidade de campo do sistema de ampliação 38 pode ainda estar prevista para pelo menos corresponder à espessura da cavidade de medição 20.

[0068] O sistema de ampliação 38 compreende uma lente de objetiva ou sistema de lente 42, que está disposta próxima ao suporte de amostra 32, e uma lente ocular ou sistema de lente 44, que está disposta a uma distância da lente de objetiva 42. A lente de objetiva 42 produz uma primeira ampliação da amostra, que é ampliada adicionalmente pela lente ocular 44. O sistema de ampliação 38 pode compreender outras lentes para realizar uma ampliação apropriada e formação de imagens da amostra. O sistema de ampliação 38 está disposto de tal modo que a amostra na cavidade de medição 20, quando colocada no suporte de amostra 32, é focalizado sobre um plano de imagem do dispositivo de obtenção de amostras 40.

[0069] Os meios de obtenção de imagens 40 está previsto para obter uma imagem digital da amostra. Os meios de obtenção de imagens 40 pode ser qualquer tipo de câmera digital, tal como uma câmera de CCD. O tamanho de pixel da câmera digital estabelece uma restrição ao sistema de formação de imagens 36, de modo que o círculo de confusão no plano de imagem não pode exceder o tamanho de pixel dentro da profundidade de campo. Mas, as células sanguíneas brancas ainda podem ser detectadas mesmo se estiverem um tanto borradas e, portanto, o círculo de confusão pode ser deixado exceder

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22/25 o tamanho de pixel, enquanto é considerado dentro da profundidade de campo. A câmera digital 40 obtém uma imagem digital da amostra na cavidade de medição 20, sendo que toda a espessura da amostra é focalizada suficientemente na imagem digital para contar as células sanguíneas brancas. O sistema de formação de imagens 36 define uma área da cavidade de medição 20, que é representada na imagem digital. A área que está sendo representada, junto com a espessura da cavidade de medição 20, define o volume da amostra que está sendo representada. O sistema de formação de imagens 36 está previsto para encaixar amostras de sangue para formação de imagens em dispositivo de obtenção de amostras 36. De preferência, o sistema de imagens 36 está disposto dentro de uma carcaça, de tal modo que a estrutura não seja modificada acidentalmente.

[0070] O aparelho 30 compreende, ainda, um analisador de imagens 46. O analisador de imagens 46 está ligado à câmera digital 40 para receber imagens digitais obtidas pela câmera digital 40. O analisador de imagens 46 está previsto para identificar padrões na imagem digital que correspondem a uma célula sanguínea branca, para contar o número de células sanguíneas brancas presentes na imagem digital. Desse modo, o analisador de imagens 46 pode estar previsto para identificar pontos escuros em um fundo mais claro. O analisador de imagens 46 pode estar previsto para primeiramente ampliar eletronicamente a imagem digital, antes de analisar a imagem digital. Isso significa que o analisador de imagens 46 pode ser capaz de distinguir mais facilmente células sanguíneas brancas que estão representadas próximas umas das outras, mesmo que a ampliação eletrônica da imagem digital torne a imagem digital um tanto borrada.

[0071] O analisador de imagens 46 pode calcular o número de células sanguíneas brancas por volume de sangue dividindo o número de células sanguíneas brancas identificadas na imagem digital com o volume da amostra de sangue, que está bem definida, tal como descrito acima. A contagem volumétrica das células sanguíneas brancas

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23/25 pode ser exibida em um dispositivo de exibição do aparelho 30.

[0072] O analisador de imagens 46 pode ser realizado como uma unidade de processamento, que compreende códigos para realizar a análise das imagens.

[0073] Com referência à figura 4, é descrito um método para enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas. O método compreende adquirir uma amostra de sangue em um dispositivo de obtenção de amostras, etapa 102. Uma amostra não diluída de sangue integral é obtida no dispositivo de obtenção de amostras. A amostra pode ser adquirida de sangue capilar ou de sangue venoso. Uma amostra de sangue capilar pode ser aspirada para dentro da cavidade de medição diretamente de um dedo puncionado de um paciente. A amostra de sangue entra em contato com um reagente no dispositivo de obtenção de amostras, iniciando uma reação. As células sanguíneas vermelhas podem ser lisadas e um agente de marcação é acumulado nos núcleos de células sanguíneas brancas. Dentro de alguns minutos após adquirir a amostra de sangue, a amostra está pronta para ser analisada. O dispositivo de obtenção de amostras é colocado em um aparelho de análise, etapa 104. Uma análise pode ser iniciada pressionando um botão do aparelho de análise. Alternativamente, a análise é iniciada automaticamente pelo aparelho que detecta a presença do dispositivo de obtenção de amostras.

[0074] A amostra é irradiada, etapa 106, e uma imagem digital de uma ampliação da amostra é obtida, etapa 108. A amostra está sendo irradiada com radiação eletromagnética com um comprimento de onda correspondente a um pico de absorção do agente de marcação. Isso significa que a imagem digital contém pontos pretos ou mais escuros nas posições dos núcleos das células sanguíneas brancas.

[0075] A imagem digital obtida é transferida para um analisador de imagens, que realiza a análise da imagem, etapa 110, a fim de contar o número de pontos pretos na imagem digital.

[0076] Na figura 5, um exemplo de uma imagem digital é mostrado

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24/25 para indicar a possibilidade de identificar células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue, que é hemolisada e marcada. Essa imagem digital foi obtida de um dispositivo de obtenção de amostras com uma espessura de cavidade de 140 μm e usando uma ampliação de 50 vezes. A fonte de luz irradia luz branca, indicando que as células sanguíneas brancas podem ser identificadas, embora a irradiação não esteja adaptada especificamente a um pico de absorção do agente de marcação. O agente de marcação suado foi azul de metileno. Pontos pretos nítidos aparecem na figura 5 indicando células sanguíneas brancas. A imagem mostrada na figura 5 é uma versão em preto e branco de uma imagem colorida. O contraste entre as células sanguíneas brancas e o fundo aparece mais nitidamente na imagem colorida do que na imagem em preto e branco reproduzida no presente. Os pontos pretos podem ser facilmente contados por um analisador de imagens.

[0077] Em métodos manuais de contagem de células sanguíneas brancas, aproximadamente 200 células são contadas, tipicamente, para determinar a contagem de células sanguíneas brancas na amostra de sangue. O método e aparelho apresentados aqui podem ser previstos, por exemplo para contar aproximadamente 2000 células, o que dá uma certeza estatística melhor dos resultados obtidos. Um adulto saudável, normal, tem uma contagem de células sanguíneas brancas de 4-5 x 10⁹ células/litro de sangue. Isso significa que 2000 células são encontradas em amostras com um volume de 0,5-0,5 μΚ Por exemplo, se uma área de 1,5 x 1,5 mm na cavidade de medição com uma espessura de 140 μm for representada, o volume representado é de 0,315 μ. Uma parte da imagem obtida pode ser selecionada para análise. Desse modo, a imagem obtida pode ser primeiramente analisada grosseiramente, de modo que não sejam permitidas anomalias na parte que está sendo usada para determinar a contagem de células sanguíneas brancas. A parte da imagem obtida selecionada para análise pode ser selecionada com um tamanho apropriado, de modo que um

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25/25 volume suficiente da amostra de sangue é analisado.

[0078] Deve ser ressaltado que as modalidades preferidas descritas no presente não são de modo algum restritivas e que muitas modalidades alternativas são possíveis dentro do alcance de proteção definido pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo de obtenção de amostras (10) para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue, o referido dispositivo de obtenção de amostras (10) compreendendo:

uma cavidade de medição (20) para receber uma amostra de sangue, em que a amostra de sangue é todo sangue não-diluído, a qual foi diretamente adquirida na cavidade de medição (20), a referida cavidade de medição (20) tem uma espessura fixa, predeterminada, medida de tal forma que a referida espessura, quando o dispositivo está em uso, em combinação com uma área da amostra onde a imagem está sendo formada define um volume de amostra analisada;

caracterizado pelo fato de que o dispositivo de obtenção de amostra (10) ainda compreende:

um reagente (22), que está disposto em uma forma seca sobre uma superfície que define a cavidade de medição (20), o referido reagente (22) compreendendo um agente de hemólise para lisar células sanguíneas vermelhas na amostra de sangue, e um agente de marcação, para marcar seletivamente células sanguíneas brancas na amostra de sangue;

uma entrada de amostra (18), a qual é definida entre paredes opostas dentro do dispositivo de obtenção de amostra (10), as referidas paredes sendo dispostas tão próximas uma da outra que uma força capilar pode ser ciada na entrada de amostra (18);

a referida cavidade de medição (20) sendo disposta em comunicação com a referida entrada de amostra (18); e um elemento de corpo (12) tendo duas superfícies planas para definir a referida cavidade de medição (20), em que as superfícies planas são dispostas a uma distância predeterminada uma da outra para determinar uma amostra de espessura para uma medição ótica, e em que as superfícies planas da referida cavidade de medição (20) são dispostas mais próximas uma da outra do que as referidas

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2/7 paredes da entrada de amostra (18), de modo que uma força capilar pode atrair sangue a partir da entrada de amostra (18) para dentro da cavidade de medição (20);

em que as superfícies planas são dispostas a uma distância uma da outra, para determinar uma espessura de amostra de 50-170 micrômetros para uma medição óptica.

2. Dispositivo de obtenção de amostras (10), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as superfícies planas são dispostas a uma distância uma da outra para determinar uma espessura uniforme de pelo menos 100 micrômetros para uma medição óptica.
3. Dispositivo de obtenção de amostras (10), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as superfícies planas são dispostas a uma distância uma da outra para determinar uma espessura uniforme de não mais do que 150 micrômetros para uma medição óptica.
4. Dispositivo de obtenção de amostras (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o reagente (22) foi aplicado à superfície dissolvido em um líquido volátil, que evaporou para deixar o reagente (22) em uma forma seca.
5. Dispositivo de obtenção de amostras (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o agente de marcação está previsto para marcar seletivamente o núcleo das células sanguíneas brancas.
6. Dispositivo de obtenção de amostras (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o agente de marcação é qualquer um no grupo de hematoxilina, azul de metileno, verde de metileno, azul-celeste de metileno, acetato de violeta de cresila, azul de toluidina, violeta de genciana, análogos de sudano, galocianina e análogos de fucsina, ou qualquer combinação dos mesmos.

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7. Dispositivo de obtenção de amostras (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o agente de hemólise é um sal de amônio quaternário, uma saponina, um ácido biliar, uma digitoxina, um veneno de cobra, uma glucopiranosida ou um detergente não iônico do tipo Triton.
8. Dispositivo de obtenção de amostras (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma entrada de amostra (18) que comunica a cavidade de medição (20) com o exterior do dispositivo de obtenção de amostras (10), a referida entrada (18) sendo disposta para obter uma amostra de sangue.
9. Dispositivo de obtenção de amostras (10), de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de obtenção de amostras (10) é descartável.
10. Método para a enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue, o referido método compreendendo:

obter uma amostra de sangue em uma cavidade de medição (20) de um dispositivo de obtenção de amostras (20), irradiar a amostra, adquirir uma imagem digital de uma ampliação da amostra irradiada na cavidade de medição (20), e analisar digitalmente a imagem digital para identificar células sanguíneas brancas e determinar o número de células sanguíneas brancas na amostra;

o método caracterizado pelo fato de que o dispositivo de obtenção de amostra (10) possui uma entrada da amostra (18), a qual é definida entre paredes opostas dentro do dispositivo de obtenção de amostra (10), em que as referidas paredes são dispostas tão próximas uma da outra que uma força capilar pode ser criada na entrada de amostra (18);

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4/7 a referida cavidade de medição (20) sendo disposta em comunicação com a referida entrada de amostra (18);

a referida cavidade de medição (20) sendo definida por duas superfícies planas, em que as referidas superfícies planas são dispostas a uma distância predeterminada uma da outra para determinar uma espessura de amostra para uma medição óptica, e em que as superfícies planas das referidas cavidades de medição (20) são dispostas mais próximas uma da outra que as referidas paredes da entrada de amostra (18), de modo que uma força capilar pode atrair sangue da entrada de amostra (18) para dentro da cavidade de medição (20);

em que a cavidade de medição (20) tem uma espessura de 50-170 micrômetros, e a referida imagem digital é obtida com uma profundidade de campo pelo menos correspondente à espessura da cavidade de medição (20); e a referida cavidade de medição (20) mantém uma reagente (22), o qual é disposto em uma forma seca em uma superfície definindo a cavidade de medição (20), compreendendo uma agente de hemólise para lisar células sanguíneas vermelhas e um agente de marcação para reagir com a amostra tal que as células sanguíneas brancas são marcadas, em que as células sanguíneas brancas são diferenciadas pela marcação seletiva do agente de marcação.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a amostra de sangue é misturada com o reagente (2)2 na cavidade de medição (20).
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um volume de uma amostra analisada é bem definido pela espessura da cavidade de medição (20) e uma área da amostra cuja imagem está sendo formada.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a amostra é irradiada por luz com um comprimento de onda correspondente a um pico de absorção do agente de marcação.

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14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a referida irradiação é realizada por meio de uma fonte de laser.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo fato de que a referida irradiação é realizada por meio de um diodo emissor de luz.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo fato de que a imagem digital é obtida usando uma potência de ampliação de 3-200x, mais preferencialmente de 3-10x.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pelo fato de que a referida análise compreende identificar áreas de alta absorção de luz na imagem digital.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a referida análise compreende identificar pontos pretos na imagem digital.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 18, caracterizado pelo fato de que a referida análise compreende a ampliação eletrônica da imagem digital obtida.
20. Sistema para enumeração volumétrica de células sanguíneas brancas em uma amostra de sangue, o referido sistema compreendendo:

um dispositivo de obtenção de amostras (10), e um aparelho de medição (30) compreendendo:

um suporte de dispositivo de obtenção de amostras (32), disposto para receber o dispositivo de obtenção de amostras (10), que contém uma amostra de sangue em uma cavidade de medição (20), uma fonte de luz (34) disposta para irradiar a amostra de sangue, um sistema de formação de imagens (36) que compreende um sistema de ampliação (38) e meios de obtenção de imagem digital (40), para adquirir uma imagem digital de uma ampliação da amostra

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6/7 irradiada na cavidade de medição (20), em que as células sanguíneas brancas são distinguidas na imagem digital por marcação seletiva do agente de marcação, e um analisador de imagens (46) disposto para analisar a imagem digital obtida para identificar células sanguíneas brancas e determinar o número de células sanguíneas brancas na amostra de sangue;

o referido sistema caracterizado pelo fato de que o referido dispositivo de obtenção de amostra (10) é um dispositivo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
21. Sistema, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o sistema de ampliação (38) é disposto com uma profundidade de campo com pelo menos a espessura da cavidade de medição (20) do dispositivo de obtenção de amostras (10).
22. Sistema, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que um volume de uma amostra analisada está bem definido pela espessura da cavidade de medição (20) e uma área da amostra cuja imagem está sendo formada.
23. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que a fonte de luz é disposta para irradiar luz com um comprimento de onda correspondente a um pico de absorção do agente de marcação.
24. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que a fonte de luz compreende uma fonte de laser.
25. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que a fonte de luz compreende um diodo emissor de luz.
26. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado pelo fato de que o sistema de ampliação (38) tem uma potência de ampliação de 3-200x, mais preferencialmente de 3-10x.

Petição 870190001976, de 08/01/2019, pág. 10/15

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27. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo fato de que o analisador de imagens (46) é disposto para identificar áreas de alta absorção de luz na imagem digital.
28. Sistema, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o analisador de imagens (46) é disposto para identificar pontos pretos na imagem digital.
29. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, caracterizado pelo fato de que o analisador de imagens (46) é disposto para ampliar eletronicamente a imagem digital obtida.