MX2007011104A - Metodo, dispositivo y sistema para enumeracion volumetrica de globulos blancos. - Google Patents

Metodo, dispositivo y sistema para enumeracion volumetrica de globulos blancos.

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MX2007011104A
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Abstract

Un dispositivo de adquisicion de muestras para enumeracion volumetrica de globulos blancos en una muestra sanguinea comprende una cavidad de medicion para recibir una muestra sanguinea; la cavidad de medicion tiene un grosor fijo predeterminado; el dispositivo de adquisicion de muestras comprende adicionalmente un reactivo, que esta dispuesto en una forma seca en una superficie que define la cavidad de medicion; el reactivo comprende un agente de hemolisis para lisar globulos rojos en la muestra sanguinea, y un agente de tincion para tenir selectivamente globulos blancos en la muestra sanguinea; un sistema comprende el dispositivo de adquisicion de muestras y un aparato de medicion; el aparato de medicion comprende un soporte del dispositivo de adquisicion de muestras, una fuente de luz, y un sistema de formacion de imagenes para adquirir una imagen digital de una amplificacion de la muestra; el aparato de medicion comprende adicionalmente un analizador de imagenes dispuesto para analizar la imagen digital adquirida para determinar el numero de globulos blancos en la muestra sanguinea.

Description

MÉTODO, DISPOSITIVO Y SISTEMA PARA ENUMERACIÓN VOLUMÉTRICA DE GLÓBULOS BLANCOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un dispositivo para adquirir muestras, un método y un sistema para enumeración volumétrica de glóbulos blancos en una muestra sanguínea.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La determinación de un conteo de glóbulos blancos a menudo es importante con respeto al tratamiento de un paciente. Este análisis puede ser necesario para diagnosticar por ejemplo, leucemia o enfermedades infecciosas o inflamatorias o para monitorear los tratamientos. Es aconsejable permitir que se obtengan resultados de análisis lo más rápido posible con el fin de reducir al mínimo los tiempos de espera para los pacientes y permitir que un médico tome una decisión de tratamiento y diagnóstico directamente al momento de hacer un primer examen del paciente. Por lo tanto, sería preferible proveer un método de análisis el cual se pueda ser realizado rápidamente por el médico o por una enfermera sin la necesidad de enviar una prueba a un laboratorio.
Actualmente, un conteo de glóbulos blancos normalmente se obtiene a través de un procedimiento manual al teñir una muestra sanguínea y visualizar microscópicamente la muestra en una cámara de conteo especial, por ejemplo, una cámara Bürker. La cámara de conteo está provista con una rejilla que divide la cámara en volúmenes pequeños bien definidos. Los glóbulos blancos se dejan sedimentar en el fondo de la cámara de conteo con el fin de permitir que el microscopio enfoque todas las células en la cámara y de esta manera, facilitar el conteo. Así, la muestra necesita sedimentar durante vahos minutos antes de realizar el conteo. El conteo de glóbulos blancos puede ser determinado entonces al contar el número de células sanguíneas por caja en la rejilla. El conteo de glóbulos blancos lo obtiene manualmente un analista, el cual necesita tener experiencia en la realización del análisis con el fin poder llevar a cabo un análisis confiable. Este análisis es tardado. Además, debido a que se realiza manualmente, los resultados del análisis pueden variar dependiendo de la persona que realiza el análisis. Hay un número reducido de métodos de análisis automatizados existentes para determinar un conteo de glóbulos blancos. El conteo de glóbulos blancos puede ser determinado por medio del principio de Coulter, el cual se basa en determinar el tamaño de la célula y a través de esto, el tipo celular al detectar una impedancia. Un método para contar glóbulos blancos por medio del principio de Coulter se describe en el documento US 5,262,302.
El principio de Coulter es el método de análisis automatizado dominante que se utiliza actualmente. Sin embargo, existen otros cuantos métodos que han sido descritos. Uno de esos métodos para determinar un conteo de glóbulos blancos se describe en el documento US 5,585,246. Aquí, se tiene que preparar una muestra sanguínea al mezclarla con un colorante fluorescente y complejo de ligando el cual etiqueta los glóbulos blancos. La muestra se introduce en un tubo capilar y es irradiada con una fuente de láser la cual escanea la muestra en el tubo capilar. La fluorescencia se mide con el fin de determinar el número de glóbulos blancos. Un método similar se describe en el documento WO 97/02482, utilizando un colorante fluorescente y una fuente de láser que escanea un tubo capilar. Este método está adaptado para la enumeración de glóbulos blancos en productos de aféresis que contienen un bajo número de glóbulos blancos. Aquí, el tubo capilar es muy grueso y es necesario esperar hasta que los glóbulos blancos hayan sedimentado en el fondo del tubo capilar antes de que se pueda escanear el tubo capilar. En el documento WO 99/45384, se provee una cámara que contiene muestra que tiene un grosor variable. El grosor variable separa diferentes compuestos de sangre. La muestra sanguínea se tíñe con un colorante para resaltar de manera diferencial por lo menos tres tipos de glóbulos blancos diferentes en la muestra sanguínea. Los glóbulos blancos pueden ser enumerados al utilizar un instrumento de escaneo óptico para visualizar una porción de la cámara.
Existe aún la necesidad de acelerar y simplificar los métodos automatizados existentes para determinar un conteo de glóbulos blancos con el fin de que el análisis se pueda proveer en el sitio de cuidado. Además, debido a que el conteo de glóbulos blancos es un análisis tan comúnmente realizado, cualquier mejora en el método de análisis tendría un gran impacto en el cuidado del paciente. Un método de análisis que provea una posibilidad de obtener resultados en el sitio de cuidado sería particularmente ventajoso.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de la invención proveer un análisis simple para determinar una enumeración volumétrica de glóbulos blancos. Es un objeto adicional de la invención proveer un rápido análisis sin la necesidad de aparatos complicados o extensas preparaciones de muestras. Estos objetivos se consiguen parcial o totalmente a través de un dispositivo de adquisición de muestras, un método y un sistema de acuerdo con las reivindicaciones independientes. Las modalidades preferidas son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes. De esta manera, se provee un dispositivo de adquisición de muestras para enumeración volumétrica de glóbulos blancos en una muestra sanguínea. El dispositivo de adquisición de muestras comprende una cavidad de medición para recibir una muestra sanguínea. La cavidad de medición tiene un grosor fijo predeterminado. El dispositivo de adquisición de muestras comprende además un reactivo, el cual está dispuesto en una forma seca sobre una superficie que define la cavidad de medición, dicho reactivo comprende un agente de hemolisis para lisar glóbulos rojos en la muestra sanguínea, y un agente de tinción para teñir selectivamente glóbulos blancos en la muestra sanguínea. El dispositivo de adquisición de muestras provee una posibilidad de obtener directamente una muestra de sangre entera en la cavidad de medición y proveerla para análisis. No hay necesidad de preparación de muestra. De hecho, la muestra sanguínea puede ser succionada hacia la cavidad de medición directamente desde un dedo pinchado de un paciente. La acción de proveer el dispositivo de adquisición de muestras con un reactivo permite una reacción dentro del dispositivo de adquisición de muestras la cual pone a disposición la muestra para análisis. La reacción inicia cuando la muestra sanguínea entra en contacto con el reactivo. De esta manera, no hay necesidad de preparar manualmente la muestra, la cual hace que el análisis sea especialmente adecuado para ser realizado directamente en un consultorio mientras el paciente espera. Debido a que el reactivo se provee en una forma seca, el dispositivo de adquisición de muestras puede ser transportado y almacenado durante un tiempo prolongado sin afectar la capacidad de uso del dispositivo de adquisición de muestras. De esta forma, el dispositivo de adquisición de muestras con el reactivo puede ser fabricado y preparado mucho antes de realizar el análisis de una muestra sanguínea.
En tanto que muchos métodos son capaces de contar diferentes células sanguíneas e incluso subgrupos de células sanguíneas, el dispositivo de adquisición de muestras de acuerdo con la invención está específicamente adaptado para realizar la enumeración volumétrica de glóbulos blancos. El reactivo comprende un agente de hemolisis el cual lisará los glóbulos rojos en la muestra sanguínea. Esto destruye las posibilidades de enumerar los glóbulos rojos en la muestra. Por otro lado, el lisado de los glóbulos rojos simplifica la diferenciación e identificación de los glóbulos blancos dentro de la muestra sanguínea. El agente de tinción provee una marca de los glóbulos blancos individuales. Este permite que los glóbulos blancos sean individualmente visualizados o detectados. Los glóbulos blancos pueden ser por ejemplo detectados al escanear la cavidad de medición u obtener una imagen de la cavidad de medición. El conteo de glóbulos blancos se puede obtener, por lo tanto, al sumar el número de glóbulos blancos individualmente detectados en un volumen definido. La invención también provee un método para la enumeración volumétrica de glóbulos blancos en una muestra sanguínea. El método comprende adquirir una muestra sanguínea en una cavidad de medición de un dispositivo de adquisición de muestras, dicha cavidad de medición retiene un reactivo que comprende un agente de hemolisis y un agente de tinción para hacer reacción con la muestra de manera que se tiñen los glóbulos blancos, irradiar la muestra con los glóbulos blancos teñidos, adquirir una imagen digital de una amplificación de la muestra irradiada en la cavidad de medición, en donde los glóbulos blancos se distinguen mediante tinción selectiva del agente de tinción y analizar digitalmente la imagen digital para identificar glóbulos blancos y determinar el número de glóbulos blancos en la muestra. La invención provee además un sistema para la enumeración volumétrica de glóbulos blancos en una muestra sanguínea. El sistema comprende un dispositivo de adquisición de muestra según lo antes descrito. El sistema comprende adicionalmente un aparato de medición que comprende un soporte de dispositivo de adquisición de muestras dispuesto para recibir el dispositivo de adquisición de muestras el cual retiene una muestra sanguínea en la cavidad de medición, y una fuente de luz dispuesta para irradiar la muestra sanguínea. El aparato de medición comprende además un sistema de formación de imágenes, que comprende un sistema de amplificación y un medio de adquisición de imágenes digitales para adquirir una imagen digital de una amplificación de la muestra irradiada en la cavidad de medición, en donde los glóbulos blancos se distinguen en la imagen digital mediante la tinción selectiva del agente de tinción. El aparato de medición comprende también un analizador de imágenes dispuesto para analizar la imagen digital adquirida para identificar glóbulos blancos y determinar el número de glóbulos blancos en la muestra sanguínea. El método y sistema de la invención proveen un análisis muy simple de una muestra sanguínea para determinar un conteo de glóbulos blancos. El análisis no requiere un aparato de medición complicado o que un operador realice pasos avanzados. Por lo tanto, el análisis se puede realizar en conexión directa con el examen de un paciente, sin la necesidad de un técnico calificado. El aparato de medición utiliza las propiedades del dispositivo de adquisición de muestras para hacer un análisis sobre una muestra de sangre entera no diluida que ha sido directamente adquirida en la cavidad de medición. El aparato de medición está dispuesto para formar imágenes de un volumen de la muestra para hacer una enumeración volumétrica de los glóbulos blancos a partir de esa imagen. Se deja que la muestra sanguínea se mezcle con el reactivo en la cavidad de medición. En unos cuantos minutos, la reacción de la muestra sanguínea con el reactivo habrá hemolizado los glóbulos rojos y teñido los glóbulos blancos de manera que la muestra está lista para ser presentada a la medición óptica. La muestra sanguínea se puede mezclar con el reactivo por ejemplo mediante dispersión o difusión del reactivo en la muestra sanguínea o al hacer vibrar activamente o mover el dispositivo de adquisición de muestras de manera que se origine una agitación en la cavidad de medición. El dispositivo de adquisición de muestras puede comprender un elemento de cuerpo que tiene dos superficies planas para definir dicha cavidad de medición. Las superficies planas pueden estar dispuestas a una distancia predeterminada una de la otra para determinar un grosor de muestra para una medición óptica. Esto implica que el dispositivo de adquisición de muestras provee un grosor bien definido para la medición óptica, el cual se puede utilizar para determinar de manera precisa el conteo de glóbulos blancos por unidad volumétrica de la muestra sanguínea. Un volumen de una muestra analizada estará bien definido a través del grosor de la cavidad de medición y un área de la muestra que está siendo formada en imágenes. De esta manera, el volumen bien definido se puede utilizar para asociar el número de glóbulos blancos con el volumen de la muestra sanguínea a manera de que se determine el conteo volumétrico de glóbulos blancos. La cavidad de medición de preferencia tiene un grosor uniforme de 50-170 micrómetros. Un grosor de por lo menos 50 micrómetros implica que la cavidad de medición no hace que la muestra sanguínea se embarre en una monocapa permitiendo que se analice un volumen más grande de sangre sobre un área transversal pequeña. De esta manera y con el fin de dar valores confiables del conteo de glóbulos blancos, se puede analizar un volumen suficientemente grande de la muestra sanguínea utilizando una imagen relativamente pequeña de la muestra sanguínea. El grosor de preferencia es de al menos 100 micrómetros, lo cual permite que incluso un área transversal más pequeña sea analizada o que se analice un volumen de muestra más grande. Además, el grosor de por lo menos 50 micrómetros y preferiblemente 100 micrómetros, también simplifica la fabricación de la cavidad de medición que tiene un grosor bien definido entre dos superficies planas. Para la mayoría de las muestras dispuestas en una cavidad que tiene un grosor de no más de 170 micrómetros, el conteo de glóbulos blancos en tan bajo que solamente habrá desviaciones menores debido a que los glóbulos blancos están dispuestos de manera traslapante unos con otros. Sin embargo, el efecto de tales desviaciones estará relacionado con el conteo de glóbulos blancos y por lo tanto, al menos en alguna medida, puede ser manejado por medio de resultados estadísticamente correctivos al menos para valores grandes del conteo de glóbulos blancos. Esta corrección estadística se puede basar en calibraciones del aparato de medición. Las desviaciones serán incluso menores para una cavidad de medición que tiene un grosor de no más de 150 micrómetros, con lo cual se puede utilizar una calibración más simple. Este grosor puede incluso no requerir ninguna calibración para células sanguíneas traslapantes. Además, el grosor de la cavidad de medición es suficientemente pequeño para permitir que el aparato de medición obtenga una imagen digital para que toda la profundidad de la cavidad de medición pueda ser analizada de manera simultánea. Debido a que se utilizará un sistema de amplificación en el aparato de medición, no es fácil obtener una gran profundidad de campo. Por lo tanto, el grosor de la cavidad de medición de preferencia no excede los 150 micrómetros para que todo el grosor sea analizado simultáneamente en una imagen digital. La profundidad de campo puede estar dispuesta para manejar un grosor de la cavidad de medición de 170 micrómetros. La imagen digital puede ser adquirida con una profundidad de campo que al menos corresponda al grosor de la cavidad de medición. Esto implica que se obtiene un foco suficiente de todo el grosor de la muestra para que todo el grosor de la cavidad de medición se pueda analizar de manera simultánea en la imagen digital de la muestra. Por consiguiente, no hay necesidad de esperar que los glóbulos blancos sedimenten en la cavidad de medición, con lo cual se reduce el tiempo para hacer un análisis. Al elegir no enfocar de manera muy definida una parte específica de la muestra, se obtiene un foco suficiente de todo el grosor de la muestra para permitir la identificación del número de glóbulos blancos en la muestra. Esto implica que un glóbulo blanco puede estar algo borroso y aun así ser considerado en foco de la profundidad de campo. El dispositivo de adquisición de muestras puede estar provisto con un reactivo que ha sido aplicado a la superficie en solución en líquido volátil el cual se ha evaporado para dejar en forma seca el reactivo. Se ha demostrado que el reactivo ventajosamente se coloca en solución en un líquido volátil antes de ser insertado en la cavidad de medición.
Esto implica que el líquido puede ser evaporado, de una manera efectiva, desde el estrecho espacio de la cavidad de medición durante la fabricación y preparación del dispositivo de adquisición de muestras. El reactivo de preferencia se puede colocar en solución en un solvente orgánico y preferiblemente se puede colocar en solución en metanol. Tales solventes son volátiles y pueden ser utilizados de manera adecuada para secar el reactivo sobre una superficie de la cavidad de medición. El agente de tinción se puede disponer para teñir selectivamente el núcleo de los glóbulos blancos. Esto implica que los glóbulos blancos pueden ser identificados como puntos de color y por lo tanto, pueden ser fácilmente contados en una imagen digital. El agente de tinción puede ser cualquiera en el grupo de hematoxilina, azul de metileno, verde de metileno, azul celeste de metileno, acetato de violeta de cresilo, azul de toluídina, violeta de genciana, análogos de Sudán, galocianina, y análogos de fucsina, o cualquier combinación de los mismos. Sin embargo, se debe apreciar que el agente de tinción no está limitado a este grupo, sino que se pueden contemplar otras muchas sustancias. El agente de hemolisis puede ser una sal de amonio cuaternario, una saponina, un ácido biliar, tal como ácido desoxícólico, una dígítoxina, un veneno de serpiente, un glucopiranósído o un detergente no ¡ónico de tipo Tritón. Sin embargo, se debe apreciar que el agente de hemolisis no está limitado a este grupo, sino que se pueden contemplar otras muchas sustancias. El dispositivo de adquisición de muestras puede comprender además una entrada de muestra que comunica la cavidad de medición con el exterior del dispositivo de adquisición de muestras, dicha entrada está dispuesta para adquirir una muestra sanguínea. La entrada de muestra puede estar dispuesta para extraer una muestra sanguínea a través de una fuerza capilar y la cavidad de medición puede extraer además sangre desde la entrada hacia la cavidad. Como resultado, la muestra sanguínea se puede adquirir muy fácilmente en la cavidad de medición simplemente al mover la entrada de muestra hacia contacto con la sangre. Posteriormente, las fuerzas capilares de la entrada de muestra y la cavidad de medición extraerán una cantidad bien definida de sangre hacia la cavidad de medición. Alternativamente, la muestra sanguínea puede ser succionada o extraída hacia la cavidad de medición por medio de la aplicación de una fuerza de bombeo externa en el dispositivo de adquisición de muestras. De acuerdo con otra alternativa, la muestra sanguínea se puede adquirir en una pipeta y posteriormente introducirse en la cavidad de medición por medio de la pipeta. El dispositivo de adquisición de muestras puede ser desechable, es decir, está dispuesto para ser utilizado solamente una vez. El dispositivo de adquisición de muestras provee un equipo para realizar un conteo de glóbulos blancos, debido a que el dispositivo de adquisición de muestras es capaz de recibir una muestra sanguínea y retener todos los reactivos necesarios con el fin de presentar la muestra para el conteo celular. Esto se permite particularmente debido a que el dispositivo de adquisición de muestras está adaptado para un sólo uso y se puede formar sin la consideración de posibilidades de limpiar el dispositivo de adquisición de muestras y volver a aplicar el reactivo. Además, el dispositivo de adquisición de muestras puede ser moldeado en material de plástico y con esto, puede ser fabricado a un índice de precio bajo. De esta manera, puede ser incluso rentable utilizar un dispositivo de adquisición de muestras desechable. La muestra puede ser irradiada con luz de una longitud de onda que corresponde a un pico en absorbancia del agente de tinción. En consecuencia, los glóbulos blancos teñidos que contienen una acumulación de agente de tinción serán detectados a través de una baja transmitancia de luz. La irradiación se puede realizar por medio de una fuente de láser. La fuente de láser puede proveer luz de una longitud de onda bien definida que se ajusta a la absorbancia del agente de tinción. Además, la fuente de láser provee luz colimada, reduciendo al mínimo las alteraciones de luz dispersa, de manera que se distinguirá de forma definida un sitio de baja transmitancia de luz. La irradiación se puede realizar alternativamente por medio de un diodo emisor de luz. Esta fuente de luz puede incluso proveer condiciones de irradiación suficientes para distinguir adecuadamente glóbulos blancos de otra materia en la muestra. La imagen digital se puede adquirir utilizando una potencia de amplificación de 3-200x, preferiblemente 3-1 Ox. Dentro de estas escalas de potencia de amplificación, los glóbulos blancos son amplificados de manera suficiente con el fin de ser detectados, mientras que la profundidad de campo se puede disponer para cubrir el grosor de la muestra. Una baja potencia de amplificación implica que se puede obtener una gran profundidad de campo. Sin embargo, si se utiliza una baja potencia de amplificación, puede ser difícil detectar los glóbulos blancos. Se puede utilizar una potencia de amplificación menor al incrementar el número de píxeles en la imagen adquirida, esto es al mejorar la resolución de la imagen digital. De esta manera, ha sido posible utilizar una potencia de amplificación de 3-4x, y al mismo tiempo permitir la detección de los glóbulos blancos. El análisis comprende identificar áreas de alta absorbancia de luz en la imagen digital. El análisis puede comprender además identificar puntos negros u obscuros en la imagen digital. Debido a que los agentes de tinción se pueden acumular en el núcleo de los glóbulos blancos, la absorbancía de la luz puede tener picos en sitios separados. Estos sitios formarán puntos negros en la imagen digital. El análisis puede comprender adicionalmente amplificar de manera electrónica la imagen digital adquirida. Aunque la muestra es amplificada para adquirir una imagen digital amplificada de la muestra, la propia imagen digital adquirida puede ser electrónicamente amplificada para simplificar la diferenciación entre objetos que son formados en imágenes de manera muy cercana entre sí en la imagen digital adquirida.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La ¡nvención se describirá ahora con más detalle a manera de ejemplo de acuerdo con la referencia a los dibujos anexos. La figura 1 es una vista esquemática de un dispositivo de adquisición de muestras de acuerdo con una modalidad de la invención; la figura 2 es una vista esquemática de un dispositivo de adquisición de muestras de acuerdo con otra modalidad de la ¡nvención; la figura 3 es una vista esquemática de un aparato de medición de acuerdo con una modalidad de la invención; la figura 4 es un diagrama de flujo de un método de acuerdo con una modalidad de la invención; y la figura 5 es una imagen digital de una muestra sanguínea que será utilizada para enumeración volumétrica de glóbulos blancos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE UNA MODALIDAD PREFERIDA Haciendo referencia ahora a la figura 1 , se describirá un dispositivo de adquisición de muestras 10 de acuerdo con una modalidad de la invención. El dispositivo de adquisición de muestras 10 es desechable y será eliminado después de haber sido utilizado para análisis. Esto implica que el dispositivo de adquisición de muestras 10 no requiere un manejo complicado. El dispositivo de adquisición de muestras 10 de preferencia está formado en un material de plástico y puede ser fabricado mediante moldeo por inyección. Esto hace que la fabricación del dispositivo de adquisición de muestras 10 sea simple y económica, con lo cual se pueden mantener bajos los costos del dispositivo de adquisición de muestras 10. El dispositivo de adquisición de muestras 10 comprende un elemento de cuerpo 12, el cual tiene una base 14, la cual puede ser tocada por un operador sin ocasionar interferencia alguna en los resultados del análisis. La base 14 también puede tener proyecciones 16 que se pueden ajustar en un soporte en un aparato de análisis. Las proyecciones 16 pueden estar dispuestas para que el dispositivo de adquisición de muestras 10 sea colocado correctamente en el aparato de análisis. El dispositivo de adquisición de muestras 10 comprende además una entrada de muestra 18. La entrada de muestra 18 está definida entre paredes opuestas dentro del dispositivo de adquisición de muestras 10, las paredes están dispuestas muy cerca una de la otra de manera que se puede crear una fuerza capilar en la entrada de muestra 18. La entrada de muestra 18 se comunica con el exterior del dispositivo de adquisición de muestras 10 para permitir que la sangre sea extraída hacia el dispositivo de adquisición de muestras 10. El dispositivo de adquisición de muestras 10 comprende adicionalmente una cámara para contar glóbulos blancos en forma de una cavidad de medición 20 dispuesta entre paredes opuestas dentro del dispositivo de adquisición de muestras 10. La cavidad de medición 20 está dispuesta en comunicación con la entrada de muestra 18. Las paredes que definen la cavidad de medición 20 están dispuestas de manera más cercana que las paredes de la entrada de muestra 18, de manera que una fuerza capilar pueda extraer sangre desde la entrada de muestra 18 hacia la cavidad de medición 20. Las paredes de la cavidad de medición 20 están dispuestas a una distancia una de la otra de 50-170 micrómetros. La cavidad de medición 20 de preferencia tiene por lo menos 100 mícrómetros de grosor. Además, la cavidad de medición 20 de preferencia no tiene más de 150 micrómetros de grosor. La distancia es uniforme sobre toda la cavidad de medición 20. El grosor de la cavidad de medición 20 define el volumen de sangre que es analizada. Debido a que el resultado del análisis será comparado con el volumen de la muestra sanguínea que está siendo analizada, el grosor de la cavidad de medición 20 necesita ser muy preciso, es decir, solamente se permiten variaciones muy pequeñas en el grosor dentro de la cavidad de medición 20 y entre cavidades de medición 20 de diferentes dispositivos de adquisición de muestras 10. El grosor permite que se analice un volumen de muestra relativamente grande en un área pequeña de la cavidad. Teóricamente, el grosor permite que los glóbulos blancos estén dispuestos uno encima del otro dentro de la cavidad de medición 20. Sin embargo, la cantidad de glóbulos blancos dentro de la sangre es tan baja que la probabilidad de que esto ocurra es muy baja. El dispositivo de adquisición de muestras 10 por lo general está adaptado para medir conteos de glóbulos blancos superiores a 0.5 x 109 células/litro de sangre. A conteos de glóbulos blancos más bajos, el volumen de muestra será demasiado pequeño para permitir que se cuenten cantidades estadísticamente importantes de glóbulos blancos. Además, cuando el conteo de glóbulos blancos excede 12 x 109 células/litro de sangre, el efecto de las células sanguíneas que están dispuestas de manera traslapante entre sí empezará a ser importante en el conteo de glóbulos blancos medidos. En este conteo de glóbulos blancos, los glóbulos blancos abarcarán aproximadamente 8% de la sección transversal de la muestra que está siendo irradiada, si el grosor de la cavidad de medición es de 140 micrómetros. De esta manera, con el fin de obtener conteos correctos de glóbulos blancos, este efecto necesitará ser justificado. Por lo tanto, se puede utilizar una corrección estadística de valores del conteo de glóbulos blancos superior a 12 x 109 células/litro de sangre. Esta corrección estadística incrementará para conteos de glóbulos blancos crecientes, debido a que el efecto de células sanguíneas traslapantes será mayor para conteos más grandes de glóbulos blancos. La corrección estadística puede ser determinada por medio de calibración de un aparato de medición. Como una alternativa, la corrección estadística puede determinarse a un nivel general para configurar los aparatos de medición a utilizarse en relación con el dispositivo de adquisición de muestras 10. Esta corrección estadística es de magnitud similar que las correcciones estadísticas que se realizaron en la actualidad en el aparato de análisis que utiliza el principio de Coulter. Se contempla que el dispositivo de adquisición de muestras 10 puede utilizarse para analizar conteos de glóbulos blancos tanto como 50 x 109 de células/litro de sangre. Una superficie de una pared de la cavidad de medición 20 se reviste al menos parcialmente con un reactivo 22. El reactivo 22 puede secarse por congelamiento, secarse por calor o secarse al vacío y aplicarse a la superficie de la cavidad de medición 20. Cuando se adquiere una muestra sanguínea en la cavidad de medición 20, la sangre hará contacto con el reactivo seco 22 e iniciará una reacción entre el reactivo 22 y la sangre.
El reactivo 22 se aplica al insertar el reactivo 22 en la cavidad de medición 20 utilizando una pipeta o surtidor. El reactivo 22 se pone en solución en un líquido volátil, por ejemplo, un solvente orgánico tal como metanol, cuando se inserta en la cavidad de medición 20. El solvente con el reactivo 22 puede llenar la cavidad de medición 20. Posteriormente, se realiza el secado de manera que el solvente se evaporará y el reactivo 22 se fijará a las superficies de la cavidad de medición 20. Ya que el reactivo debe secarse en una superficie de un espacio angosto, el líquido tendrá una superficie muy pequeña en contacto con la atmósfera, con lo cual la evaporación de líquido se hace más difícil. De este modo, es útil utilizar un líquido volátil, tal como metanol, que permita al líquido evaporarse en una manera efectiva desde el espacio angosto de la cavidad de medición. De acuerdo con un método de fabricación alternativo, el dispositivo de adquisición de muestras 10 puede formarse al fijar dos piezas entre sí, con lo cual una pieza forma la pared infepor de la cavidad de medición 20 y la otra pieza forma a la pared supepor de la cavidad de medición 20. Esto permite a un reactivo 22 secarse en una superficie abierta antes de que las dos piezas se fijen entre sí. De este modo, el reactivo 22 puede resolverse en agua, ya que el solvente no necesita ser volátil. El reactivo 22 comprende un agente de hemolisis y un agente de tinción. El agente de hemolisis puede ser una sal de amonio cuaternario, una saponina, un ácido biliar, tal como un ácido desoxicólíco, una digítoxina, veneno de serpiente, glucopiranósido o un detergente no iónico de tipo Tritón. El agente de tinción puede ser hematoxilina, azul de metileno, verde de metileno, celeste de metileno, acetato de violeta de cresilo, azul de toluidina, violeta de genciana, un análogo de sudan, galocianina, o un análogo de fucsina, o cualquier combinación de los mismos. Cuando una muestra sanguínea hace contacto con el reactivo 22, el agente de hemolisis actuará para lisar los glóbulos rojos de manera que los glóbulos rojos lisados se mezclen con el plasma de sangre. Además, el agente de tinción se acumulará en los núcleos de los glóbulos blancos. El reactivo 22 debe contener suficientes cantidades de agente de tinción para teñir de manera distinta todos los núcleos de los glóbulos blancos. De este modo, siempre habrá un excedente de agente de tinción, que se intermezclará en el plasma de sangre. El excedente del agente de tinción dará un nivel de fondo bajo y homogéneo, del agente de tinción en plasma de sangre. El agente de tinción acumulado en los glóbulos blancos se distinguirá sobre el nivel de fondo del agente de tinción. El reactivo 22 también puede comprender otros constituyentes, que pueden ser activos, es decir, que toman parte en la reacción química con la muestra sanguínea, o no activos, es decir, que no toman parte en la reacción química con la muestra sanguínea. Los constituyentes activos pueden, por ejemplo, disponerse para catalizar la acción de hemolisis o de tinción. Los constituyentes no activos pueden, por ejemplo, disponerse para mejorar la fijación del reactivo 22 a la superficie de una pared de la cavidad de medición 20. Dentro de pocos minutos, la muestra sanguínea habrá reaccionado con el reactivo 22 de manera que los glóbulos rojos se hayan lisado y el agente de tinción tenga acumulado en los núcleos los glóbulos blancos. Con relación a la figura 2, se describirá otra modalidad del dispositivo de adquisición de muestras. El dispositivo de adquisición de muestras 110 comprende una cámara 120 que forma la cavidad de medición. El dispositivo de adquisición de muestras 1 10 tiene una entrada 118 en la cámara 120 para transportar sangre en la cámara 120. La cámara 120 se conecta a una bomba (no mostrada) por medio de un tubo de succión 121. La bomba puede aplicar una fuerza de succión en la cámara 120 por medio del tubo de succión 121 de manera que la sangre pueda succionarse en la cámara 120 a través de la entrada 118. El dispositivo de adquisición de muestras 110 puede desconectarse de la bomba antes de que se realice la medición. Como la cavidad de medición 20 del dispositivo de adquisición de muestras 10 de conformidad con la primera modalidad, la cámara 120 tiene un grosor bien definido que define el grosor de la muestra a ser examinada. Además, un reactivo 122 se aplica a las paredes de la cámara 120 para reaccionar con la muestra sanguínea. Con relación ahora a la figura 3, se describirá un aparato 30 para enumeración volumétrica de glóbulos blancos. El aparato 30 comprende un soporte de muestras 32 para recibir un dispositivo de adquisición de muestras 10 con una muestra sanguínea. El soporte de muestras 32 se dispone para recibir el dispositivo de adquisición de muestras 10 de manera que la cavidad de medición 20 del dispositivo de adquisición de muestras 10 se coloque correctamente dentro del aparato 30. El aparato 30 comprende una fuente de luz 34 para iluminar la muestra sanguínea dentro del dispositivo de adquisición de muestras 10. La fuente de luz 34 puede ser una lámpara incandescente, que irradia luz en el espectro visible total. El agente de tinción que se acumula en los núcleos de los glóbulos blancos absorberá luz de las longitudes de onda específicas, de manera que los núcleos de los glóbulos blancos emergerán en una imagen digital de la muestra. Si se adquiere una imagen de color, los glóbulos blancos emergerán como puntos específicamente de color. Si se adquiere una imagen negra y blanca, los glóbulos blancos emergerán como puntos negros contra un fondo más claro. La fuente de luz 34 puede ser alternativamente un diodo emisor de luz o láser. Este puede utilizarse para incrementar el contraste en la imagen de manera que los glóbulos blancos puedan detectarse más fácilmente. En este caso, la fuente de luz 34 se dispone para irradiar radiación electromagnética de una longitud de onda que corresponde con el pico de absorción del agente de tinción. La longitud de onda debe además elegirse de manera que la absorción de los compuestos de sangre sea relativamente baja. Además, las paredes del dispositivo de adquisición de muestras 10 deben ser transparentes esencialmente para la longitud de onda. Por ejemplo, en donde se utiliza el azul de metileno como el agente de tinción, la fuente de luz 34 puede disponerse para irradiar luz con una longitud de onda de 667 nm. El aparato 30 además comprende un sistema de formación de imágenes 36, que se dispone en un lado opuesto del soporte de muestra 32 con relación a la fuente de luz 34. De este modo, el sistema formador de imágenes 36 se dispone para recibir la radiación que ha sido transmitida a través de la muestra sanguínea. El sistema formador de imágenes 36 comprende un sistema de amplificación 38 y un medio de adquisición de imágenes 40. El sistema de amplificación 38 se dispone para proporcionar una potencia de amplificación de 3-200x, más preferiblemente 3-1 OOx, y más preferiblemente 3-4x. Dentro de estas escalas de potencia de amplificación, es posible distinguir los glóbulos blancos. La imagen puede adquirirse con una resolución mejorada con el fin de permitir que se utilice una potencia de amplificación inferior. Además, la profundidad del campo del sistema de amplificación 38 puede incluso disponerse para corresponder al menos al grosor de la cavidad de medición 20. El sistema de amplificación 38 comprende una lente del objetivo o sistema de lentes 42, que se disponen cerca del soporte de muestra 32, y una lente ocular o sistema de lentes 44 que se dispone a una distancia desde las lentes del objetivo 42. Las lentes del objetivo 42 proporcionan una primera amplificación de la muestra, que además se amplifica mediante la lente ocular 44. El sistema de amplificación 38 puede comprender lentes adicionales para lograr una amplificación apropiada y formación de imágenes de la muestra. El sistema de amplificación 38 se dispone de manera que la muestra en la cavidad de medición 20 cuando se coloca en el soporte de muestra 32 se enfoque en un plano de imagen del medio de adquisición de imágenes 40. El medio de adquisición de imágenes 40 se dispone para adquirir una imagen digital de la muestra. El medio de adquisición de imágenes 40 puede ser cualquier tipo de cámara digital, tal como una cámara CCD. El tamaño del píxel de la cámara digital establece una restricción en el sistema formador de imágenes 36 de manera que el círculo de confusión en el plano de imagen no exceda el tamaño del píxel dentro de la profundidad del campo. Sin embargo, los glóbulos blancos pueden incluso detectarse aún si están algo borroso y, por lo tanto, el círculo de confusión puede exceder el tamaño del píxel mientras se considera dentro de la profundidad del campo. La cámara digital 40 adquirirá una imagen digital de la muestra en la cavidad de medición 20, en donde el grosor de muestra total se enfoca suficientemente en la imagen digital para contar los glóbulos blancos. El sistema formador de imágenes 36 definirá un área de la cavidad de medición 20, que formará la imagen en la imagen digital. El área que forma la imagen junto con el grosor de la cavidad de medición 20 define el volumen de la muestra a ser formada en imágenes. El sistema formador de imágenes 36 se fija para ajustar las muestras de sangre de procesamiento de imágenes en los dispositivos de adquisición las muestras 10. No hay necesidad de cambiar la configuración del sistema formador de imágenes 36. Preferiblemente, el sistema formador de imágenes 36 se dispone dentro de un alojamiento de manera que la configuración no cambie accidentalmente. El aparato 30 además comprende un analizador de imágenes 46. El analizador de imágenes 46 se conecta a la cámara digital 40 para recibir imágenes digitales adquiridas por la cámara digital 40. El analizador de imágenes 46 se dispone para identificar patrones en la imagen digital que correspondan con los glóbulos blancos para contar el número de glóbulos blancos presentes en la imagen digital. De este modo, el analizador de imágenes 46 puede disponerse para identificar puntos negros en un fondo más claro. El analizador de imágenes 46 puede disponerse para magnificar electrónicamente primero la imagen digital antes de analizar la imagen digital. Esto implica que el analizador de imágenes 46 pude ser capaz de distinguir más fácilmente los glóbulos blancos que se forman cercanamente entre sí, incluso aunque la amplificación electrónica de la imagen digital hará la imagen digital algo borrosa. El analizador de imágenes 46 puede calcular el número de glóbulos blancos por volumen de sangre al dividir el número de glóbulos blancos identificados en la imagen digital con el volumen de la muestra sanguínea, que se define bien como se describe anteriormente. El conteo de glóbulos blancos volumétrico puede presentarse en una pantalla del aparato 30. El analizador de imágenes 46 puede realizarse como una unidad de procesamiento, que comprende códigos para realizar el análisis de imagen.
Con relación a la figura 4, se describirá un método para enumeración volumétrica de glóbulos blancos. El método comprende adquirir una muestra sanguínea en un dispositivo para de sangre en un dispositivo de adquisición de muestras, paso 102. Una muestra no diluida de la sangre entera se adquiere en el dispositivo de adquisición de muestras. La muestra puede adquirirse de sangre capilar o sangre venosa. Una muestra sanguínea capilar puede extraerse en la cavidad de medición directamente desde un dedo pinchado de un paciente. La muestra sanguínea hace contacto con un reactivo en el dispositivo de adquisición de muestras iniciando una reacción. Los glóbulos rojos se usarán y un agente de tinción se acumulará en los núcleos de los glóbulos blancos. Pocos minutos después de adquirir la muestra sanguínea, la muestra está lista para analizarse. El dispositivo de adquisición de muestras se coloca en un aparato de análisis, paso 104. Un análisis puede iniciarse al presionar un botón del aparato de análisis. Alternativamente, el análisis iniciará automáticamente mediante el aparato detectando la presencia del dispositivo de adquisición de muestras. La muestra se irradia, paso 106, y un imagen digital de una amplificación de la muestra se adquiere, paso 108. La muestras se irradía con radiación electromagnética de una longitud de onda que corresponde con el pico de absorción del agente de de tinción. Esto implica que la imagen digital tendrá puntos negros o más obscuros en las posiciones de los núcleos de glóbulos blancos.
La imagen digital adquirida se transfiere a un analizador de imagen, que realiza un análisis de imagen, paso 110, con el fin de contar el número de puntos negros en la imagen digital. En la figura 5, se muestra un ejemplo de una imagen digital para indicar la posibilidad de identificar glóbulos blancos en una muestra sanguínea que se hemoliza y se tiñe. La imagen digital se obtiene de un dispositivo de adquisición de muestras que tiene un grosor de cavidad de 140 µim y utiliza una amplificación de 50 veces. La fuente de luz irradia luz blanca, indicando que los glóbulos blancos pueden ser identificados aunque la radicación no se adapta específicamente a un pico de absorción del agente de tinción. El agente de tinción utilizado fue azul de metileno. Diferentes puntos negros aparecen en la figura 5 indicando los glóbulos blancos. La imagen mostrada en a figura 5 es una versión en blanco y negro de una imagen de color. El contraste entre los glóbulos blancos y el fondo aparece más claro en la imagen de color más que en la imagen en blanco y negro reproducida aquí. Los puntos negros pueden contarse fácilmente mediante el analizador de imagen. En métodos manuales de conteo de glóbulos blancos, aproximadamente 200 células se cuentan típicamente para determinar el conteo de glóbulos blancos de la muestra sanguínea. El método y aparatos presentados aquí por ejemplo pueden disponerse para contar aproximadamente 2000 células, lo cual da una certeza estadística mejor de los resultados obtenidos. Un adulto saludable normal tiene un conteo de glóbulos blancos de 4-5 x 109 células/litro de sangre. Esto implica que se encontraron 2000 células en muestra con un volumen de 0.4-0.5 µl. Por ejemplo, si un área de 1.5 x 1.5 mm en la cavidad de medición con un grosor de 140 µm se forma en imágenes, el volumen que se forma en imágenes es de 0.315 µl. Una parte de la imagen adquirida puede seleccionarse para análisis. De este modo, la imagen adquirida puede analizarse ppmero de manera ordinaria de manera que no se permitan anormalidades en la parte que se utiliza para determinar el conteo de glóbulos blancos. La parte de la imagen adquirida seleccionada para análisis puede seleccionarse con un tamaño apropiado de manera que un volumen suficiente de muestra sanguínea se analizará. Debe enfatizarse que las modalidades preferidas descritas en la presente de ninguna manera son limitativas y que muchas modalidades alternativas son posibles dentro del alcance de protección definido por las reivindicaciones anexas.

Claims (33)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un dispositivo de adquisición de muestras para enumeración volumétrica de glóbulos blancos en una muestra sanguínea, dicho dispositivo de adquisición de muestras comprende: una cavidad de medición para recibir una muestra sanguínea, dicha cavidad de medición tiene un grosor fijo predeterminado, un reactivo, que se dispone en una forma seca en una superficie que define la cavidad de medición, dicho reactivo comprende un agente de hemolisis para lisar los glóbulos rojos en la muestra sanguínea, y un agente de tinción para teñir selectivamente los glóbulos blancos en la muestra sanguínea.
2.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el dispositivo de adquisición de muestras comprende un elemento corporal que tiene dos superficies planas para definir dicha cavidad de medición.
3.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque las superficies planas se disponen a una distancia predeterminada entre sí para determinar un grosor de muestra para una medición óptica.
4.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque la cavidad de medición tiene un grosor uniforme de 50-170 micrómetros.
5.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la cavidad de medición tiene un grosor uniforme de al menos 100 micrómetros.
6.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con la reivindicación 4 ó 5, caracterizado además porque la cavidad de medición tiene un grosor uniforme de no más de 150 mícrómetros.
7.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el reactivo ha sido aplicado a la superficie en solución en un líquido volátil que se ha evaporado para dejar el reactivo en forma seca.
8.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el agente de tinción se dispone para teñir selectivamente el núcleo de los glóbulos blancos.
9.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el agente de tinción es cualquiera en el grupo de hematoxilína, azul de metileno, verde de metileno, celeste de metileno, acetato violeta de cresilo, azul de toluidina, violeta de genciana, análogos de sudan, galocianina, y análogos fucsina, o cualquier combinación de los mismos.
10.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el agente de hemolisis es una sal de amonio cuaternario, una saponina, un ácido biliar, una digitoxina, un veneno de serpiente, una glucopiranósido o un detergente no iónico del tipo Tritón.
11.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque comprende adicionalmente una entrada de la muestra que comunica la cavidad de medición con el exterior del dispositivo de adquisición de muestras, la entrada dispuesta para adquirir una muestra sanguínea.
12.- El dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el dispositivo de adquisición de muestras es desechable.
13.- Un método para enumeración volumétrica de glóbulos blancos en una muestra sanguínea, dicho método comprende: colocar una muestra sanguínea en una cavidad de medición de un dispositivo de adquisición de muestras, dicha cavidad de medición mantiene un reactivo que comprende un agente de hemolisis y un agente de tinción para reaccionar con la muestra de manera que se tiñan los glóbulos blancos, irradiar la muestra con los glóbulos blancos teñidos, adquirir una imagen digital de una amplificación de la muestra irradiada en la cavidad de medición, en donde los glóbulos blancos se distinguen por tinción selectiva del agente de tinción, y analizar digitalmente la imagen digital para identificar glóbulos blancos y determinar el número de glóbulos blancos en la muestra.
14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la muestra sanguínea se mezcla con el reactivo en la cavidad de medición.
15.- El método de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque la cavidad de medición tiene un grosor de 50-170 micrómetros, y dicha imagen digital se adquiere con una profundidad de campo al menos correspondiendo con el grosor de la cavidad de medición.
16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caractepzado además porque el volumen de la muestra analizada se define bien por el grosor de la cavidad de medición y un área de la muestra que se forma en imágenes.
17.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque la muestra se irradia por luz de una longitud de onda que corresponde con un pico en absorbancia del agente de tinción.
18.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17, caracterizado además porque dicha irradiación se realiza por medio de una fuente de láser.
19.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17, caractepzado además porque dicha irradiación se realiza por medio de un diodo emisor de luz.
20.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-19, caracterizado además porque la imagen digital se adquiere utilizando una potencia de amplificación de 3-200x, más preferiblemente 3-1 Ox.
21.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-20, caracterizado además porque dicho análisis comprende identificar áreas de absorbancia de luz alta en la imagen digital.
22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho análisis comprende identificar puntos negros en la imagen digital.
23.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-22, caracterizado además porque dicho análisis comprende amplificar electrónicamente la imagen digital adquirida.
24.- Un sistema para enumeración volumétrica de glóbulos blancos en una muestra sanguínea, dicho sistema comprende: un dispositivo de adquisición de muestras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, y un aparato de medición que comprende: un soporte del dispositivo de adquisición de muestras dispuesto para recibir el dispositivo de adquisición de muestras que sostiene una muestra sanguínea en la cavidad de medición, una fuente de luz dispuesta para irradiar la muestra sanguínea, un sistema formador de imágenes, que comprende un sistema de amplificación y medios de adquisición de imágenes digitales para adquirir una imagen digital de una amplificación de la muestra irradiada en la cavidad de medición, en donde los glóbulos blancos se distinguen en la imagen digital al teñir selectivamente un agente de tinción, y un analizador de imágenes dispuesto para analizar la imagen digital adquirida para identificar glóbulos blancos y determinar el número de glóbulos blancos en la muestra sanguínea.
25.- El sistema de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque el sistema de amplificación se dispone con una profundidad de campo de al menos el grosor de la cavidad de medición del dispositivo de adquisición de muestras.
26.- El sistema de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizado además porque el volumen de la muestra analizada es bien definido por el grosor de la cavidad de medición y un área de la muestra que se forma en imágenes.
27.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-26, caracterizado además porque la fuente de luz se dispone para irradiar luz de una longitud de onda que corresponde con un pico en absorbancia del agente de tinción.
28.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-27, caracterizado además porque la fuente de luz comprende una fuente de láser.
29.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-27, caracterizado además porque la fuente de luz comprende un diodo emisor de luz.
30.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-29, caracterizado además porque el sistema de amplificación tiene una potencia de amplificación de 3-200x, más preferiblemente 3-1 Ox.
31.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-30, caracterizado además porque el analizador de imágenes se dispone para identificar áreas de alta absorbancia de luz en la imagen digital.
32.- El sistema de conformidad con la reivindicación 31 , caractepzado además porque el analizador de imágenes se dispone para identificar puntos negros en la imagen digital.
33.- El sistema de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-32, caracterizado además porque el analizador de imágenes se dispone para amplificar electrónicamente la imagen digital adquirida.
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