NO337096B1 - Debrideringspreparat fra bromelain og fremgangsmåter for fremstilling derav samt anvendelse derav - Google Patents
Debrideringspreparat fra bromelain og fremgangsmåter for fremstilling derav samt anvendelse derav Download PDFInfo
- Publication number
- NO337096B1 NO337096B1 NO20073115A NO20073115A NO337096B1 NO 337096 B1 NO337096 B1 NO 337096B1 NO 20073115 A NO20073115 A NO 20073115A NO 20073115 A NO20073115 A NO 20073115A NO 337096 B1 NO337096 B1 NO 337096B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- bromelain
- debridement
- preparation
- suspension
- kda
- Prior art date
Links
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 title claims description 196
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims description 142
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 title claims description 138
- 238000001804 debridement Methods 0.000 title claims description 104
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 94
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 32
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 59
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 51
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 50
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 43
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 41
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 41
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 claims description 31
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 28
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 28
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 27
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 27
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 26
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 22
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 20
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 17
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 13
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 13
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 12
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 12
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 11
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N caprylic alcohol Natural products CCCCCCCCO KBPLFHHGFOOTCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 claims description 9
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N n-Octanol Natural products CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 4
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 claims description 4
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 claims description 3
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000528 Pilonidal Sinus Diseases 0.000 claims description 3
- 206010035043 Pilonidal cyst Diseases 0.000 claims description 3
- 206010042496 Sunburn Diseases 0.000 claims description 3
- 208000006374 Uterine Cervicitis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008100 Vaginitis Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002266 amputation Methods 0.000 claims description 3
- 206010008323 cervicitis Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims description 3
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 claims description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 3
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 claims 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 44
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 36
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 13
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 10
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101710142965 Bromelain inhibitor Proteins 0.000 description 8
- 206010051814 Eschar Diseases 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 231100000333 eschar Toxicity 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 241000234671 Ananas Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 5
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 5
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 108010001587 escharase Proteins 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JCIIKRHCWVHVFF-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-thiadiazol-5-amine;hydrochloride Chemical compound Cl.NC1=NC=NS1 JCIIKRHCWVHVFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000886 Ananain Proteins 0.000 description 2
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 239000010425 asbestos Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000000963 caseinolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940096826 phenylmercuric acetate Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000310 rehydration solution Substances 0.000 description 2
- 229910052895 riebeckite Inorganic materials 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 2
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1-piperidin-4-ylpyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CC(O)CN1C1CCNCC1 HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101000609447 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P25 Proteins 0.000 description 1
- 239000004358 Butane-1, 3-diol Substances 0.000 description 1
- 239000004322 Butylated hydroxytoluene Substances 0.000 description 1
- NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N Butylhydroxytoluene Chemical compound CC1=CC(C(C)(C)C)=C(O)C(C(C)(C)C)=C1 NLZUEZXRPGMBCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010007247 Carbuncle Diseases 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229960004217 benzyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 1
- 235000010354 butylated hydroxytoluene Nutrition 0.000 description 1
- 229940095259 butylated hydroxytoluene Drugs 0.000 description 1
- 229940085237 carbomer-980 Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 108010033856 comosain Proteins 0.000 description 1
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229940001501 fibrinolysin Drugs 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036074 healthy skin Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- XUGNVMKQXJXZCD-UHFFFAOYSA-N isopropyl palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(C)C XUGNVMKQXJXZCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001530 keratinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 108010034248 pinguinain Proteins 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 108090000346 stem bromelain Proteins 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 description 1
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036575 thermal burns Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/4873—Cysteine endopeptidases (3.4.22), e.g. stem bromelain, papain, ficin, cathepsin H
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår et debrideringspreparat oppnådd fra bromelain, fremgangsmåter for fremstilling av dette samt anvendelse derav. Særlig angår oppfinnelsen et debrideringspreparat oppnådd fra bromelain omfattende proteolytiske enzymer med molekylvekter rundt 23 kDa, som i det vesentlige er frie for bromelaininhibitorer, samt farmasøytiske preparater omfattende disse. Preparatene og de farmasøytiske preparater omfattende disse er spesielt nyttige ved utvidelse av escharvev og ved sårheling.
Oppfinnelsens bakgrunn
Betydelige forsøk har vært gjort på å utvikle "debridement" preparater som er i stand til å fjerne devitalisert vev uten kirurgi. Devitalisert vev dannes i alle sykdomsprosesser som er assosiert med hudtrauma, som dekubitøse ulcere, trykknekroser, innsnitt og brannsår. Effektivt debridement er vesentlig fordi det vitaliserte vev er et utmerket kulturmedium for opportunistiske infeksjoner. Septicemia som skyldes infeksjoner er hovedårsaken til død for den vesentlige andel av alvorlig forbrente pasienter.
Bruk av proteolytiske enzymer og kjemiske midler for å bevirke tidlig debridement av devitaliserte vev har ikke ført til tilfredsstillende debridement. De kjemiske midler som tanninsyre, salicylsyre og pyruvinsyre ble funnet å forårsake ytterligere skade på allerede skadet vev.
Proteolytiske enzymer inkludert papain, pinguinain, trypsin, fibrinolysin og streptokinase har vært beskrevet som debrideringsmidler. US 5,505,943 beskriver preparater som inneholder en protease fremstilt av mikroorganismer av genus Vibrio for behandling av sår ved hydrolysering av komponenter av nekrotiske vev.
Imidlertid lider debridement ved rensede, proteolytiske enzymer av forskjellige mangler da de rensede enzymer krever tallrike applikasjoner over et langt tidsrom, viser dårlig effektivitet, har toksiske bivirkninger og har ingen selektivitet.
Ekstrakter avledet fra stammen av ananasplanten (Ananas comosus) er funnet selektivt å fjerne devitalisert vev. Slike ekstrakter, også kalt bromelain, inneholder forskjellige proteolytiske og hydrolytiske enzymer.
US 4,197,291 beskriver et enzymprodukt som oppnås fra bromelain som er i stand til debridement av devitalisert vev fra en pattedyrvert, idet enzymproduktet omfatter et vannoppløselig, varmelabilt protein som er fritt for kaseinolytisk aktivitet og har et topp-isoelektrisk punkt på rundt 6. Proteinet omfatter minst to subenheter, hver av hvilke har en molekylvekt fra rundt 14,3 til 15 kDa med en karakteristisk absorpsjonstopp i det ultrafiolette området av spektret ved 280 nm. Prosedyren for å fremstille slikt enzymprodukt er beskrevet i US 4,197,291 og omfatter proteinpresipitering med aceton, ekstrahering av presipitatet med acetatbuffer inneholdende tioglykolsyre, filtrering av oppløsningen gjennom en membran med en molekylvektsperregrense på rundt 50 kDa, gelfiltrering av filtratet og isoelektrisk fokusering. Enzymproduktet som fremstilles på denne måte inneholder minst to, og mest sannsynlig tre, subenheter med en molekylvekt på 14,3 til 15 kDa. US 4,226,854 beskriver en fremgangsmåte for debridement av devitalisert vev ved bruk av enzymproduktet som beskrevet i US 4,197,291.
US 4,329,430 beskriver videre en proteolytisk enzymblanding avledet fra bromelain som er brukbar for å dissektere og digestere devitalisert vev. Den proteolytiske enzymblanding som er varmelabil og vannoppløselig inneholder escharase, et hydrolytisk enzym som er fritt for kaseinolytisk aktivitet med et isoelektrisk punkt rundt 6, og som omfatter minst to subenheter, hver av hvilke har en molekylvekt fra rundt 14,3 til 15 kDa. Alle komponentene i den proteolytiske enzymblanding har en nativ molekylvekt rundt 30 til 50 kDa når enzymblandingen filtreres gjennom en membran med en molekylvektsperregrense på 50 kDa og konsentreres over en membran med en molekylvektsperregrense på 30 kDa. De reproduserbare resultater som oppnås med den proteolytiske enzymblanding angis å skyldes det faktum at enzymblandingen ikke inneholder noen inhibitor, noe som åpenbart var til stede i de tidligere publiserte proteolytiske enzympreparater. Imidlertid er det intet kriterium for detektering av aktiviteten av denne inhibitor.
US 4,307,081 beskriver en fremgangsmåte for å dissektere og digestere devitalisert vev, omfattende å bringe vevet i kontakt med den proteolytiske enzymblanding som er beskrevet i US 4,329,430.
For eksempel beskriver US 5,106,621 rensede cysteinproteinaser avledet fra ananasplantemateriale med en molekylvekt rundt 25 kDa og som viser aktivitet mot et kumarylamidsubstrat. Spesielt angår US 5,106,621 cysteinproteinasene ananain og comosain, som viser forskjellige fysiokjemiske karakteristika distinkte for stammen bromelain. En renset tiolaktivert protease med en molekylvekt på rundt 17 kDa til 21 kDa, kalt oc-Bromelain, er beskrevet i US 5,387,517, og er påvist å ha debridement-aktivitet. I tillegg inneholder bromelain en sur fosfatase og en peroksidase og kan inneholde amylase- og cellulaseaktivitet. US 6,335,427 beskriver rensing av et 25 kDa protein fra bromelain, der proteinet er funnet å ha anticanceraktivitet.
Perlstein og Kezdy (J. Supramol. Struct. 1: 249-254, 1973) identifiserte syv nær beslektede proteaseinhibitorer, dvs. bromelaininhibitor I-Vn, fra kommersielt
bromelainacetonepulver. Inhibitorene ble påvist å ha molekylvekt på 5000-6000 dalton og å inneholde 50 aminosyrerester og fem disulfidbindinger (Perlstein og Kezdy, ibid). Primær strukturanalyse av en av de syv inhibitorer avdekket utstrakt mikroheterogenitet (Reddy, M.N. et al. J. Biol. Chem. 250: 1741-1750, 1975).
US 5,830,739 beskriver metoder for å fremstille en stabil blanding av escharase og andre protelytiske enzymer fra bromelain, som omfatter å ekstrahere bromelain med en fortynnet askorbinsyreoppløsning, fulgt av presipitering av escharase og andre proteolytiske enzymer med ammoniumsulfat. US 5,830,739 beskriver videre at ammoniumsulfatpresipitatet kan vaskes md destillert vann over et 10 kDa ultrafilter. Metoden for fremstilling av den stabile blanding av escharase er funnet å gi høyere mengder av escharase. Imidlertid er det ingen indikasjon på at blandingen er fri for bromelaininhibitorer.
WO 93/10811 Al beskriver fremgangsmåter for isolering av en proteolytisk blanding fra bromelain.
Rensede distinkte enzymer som er isolert fra bromelain ble funnet ikke å være så effektive ved debridement av ikke-levedyktig vev som en protelytisk enzymblanding oppnådd fra bromelain. Imidlertid ble proteolytiske enzymblanding oppnådd fra bromelain, som inneholder proteineer med molekylvekter på opp til 50 kDa inkludert bromelaininhibitorer, funnet ikke å være så effektive ved debridement av ikke-levedyktig vev som en enzymblanding oppnådd fra bromelainholdige proteiner med molekylvekter på 30 til 50 kDa, som antagelig er fri for inhibitorer.
Fordi slike enzymblandinger er ment for human klinisk bruk, er det et utilfredsstilt behov for å oppnå biokjemisk karakteriserte enzymblandinger fra bromelain, som har distinkte og reproduserbare biokjemiske trekk, i det vesentlige frie for bromelaininhibitorer og inneholdende de fleste proteolytiske enzymer av bromelain, slik at forskjellig debridement av ikke-levedyktig vev oppnås.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et debrideringspreparat oppnådd fra bromelain som er i stand til å debridere ikke-levedyktig vev og har distinkte biokjemiske trekk. Spesielt tilveiebringer oppfinnelsen en debriderende blanding oppnådd fra bromelain, biokjemiskkarakterisertsom i det vesentlig fri for bromelaininhibitorer mens den omfatter de fleste av de proteolytiske enzymer av bromelain. Enzymsammensetningen som oppnås på denne måten er meget effektiv ved debridering av ikke-levedyktig vev.
Det er nå, for første gang, beskrevet at et enzympreparat oppnådd fra bromelain med de fleste proteolytiske enzymer av bromelain, men i det vesentlige fri for bromelaininhibitorer, har en overlegen debrideringsaktivitet i forhold til bromelain. Det beskrives nedenfor at mens bromelain inneholder minst tre hovedproteintopper med molekylvekter rundt 6, 17,5 henholdsvis 23 kDa ved eluering fra en HPLC størrelses-eksklusjonskolonne, omfatter enzymblandingen ifølge oppfinnelsen overveiende en proteintopp med molekylvekter rundt 23 kDa anvendt på samme HPLC størrelses-eksklusjonskolonne. Enzympreparatet er meget reproduserbart når det gjelder proteininnhold og er derfor fordelaktig for klinisk bruk.
Fremgangsmåten for fremstilling av enzympreparatet ifølge oppfinnelsen omfatter å ekstrahere kommersielt tilgjengelig bromelainpulver med en sur oppløsning som eventuelt omfatter en antioksidant, tilsetning av et filterhjelpemiddel, filtrering av suspensjonen for å fjerne uoppløselige komponenter, presipitering av de proteolytiske enzymer ved tilsetting av ammoniumsulfatsalt til oppløsningen, oppløsning av ammoniumsulfatpresipitatet med en sur oppløsning som eventuelt omfatter en antioksidant og å filtrere oppløsningen slik at proteolytiske enzymer med molekylvekter over rundt 10 kDa holdes tilbake.
I henhold til et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelsen et debrideringspreparat oppnådd fra bromelain, der debrideringspreparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter rundt 23 kDa, der preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer. Uttrykket "i det vesentlige fritt" henviser til preparater som omfatter høyst restmengder av bromelaininhibitorer sammenlignet med mengden som er til stede i de urene bromelainekstrakter.
I henhold til noen utførelsesformer er bromelaininhibitorene til stede i en mengde mindre enn 10 vekt-% av proteininnholdet av debrideringsblandingen. Fortrinnsvis er bromelaininhibitorene til stede i en mengde mindre enn 5 vekt-% av proteininnholdet av debrideringsblandingen, og helst er innholdet mindre enn 2 vekt-%, helt spesielt er innholdet mindre enn 1 vekt-% av proteininnholdet av debrideringsblandingen.
I henhold til et ytterligere trekk består debrideringsblandingen i det vesentlige av en enkelt proteintopp etter eluering fra en HPLC størrelseseksklusjonskolonne TSK-Gel 3000Swxl, der enkeltproteintoppen er proteiner med molekylvekter rundt 23 kDa.
Videre kan den enkelte proteintopp oppnås i et utbytte på minst 50 vekt-% av proteininnholdet av debrideringsblandingen som bringes på HPLC størrelseseksklusjonskolonnen. Hovedproteintoppen kan oppnås i et utbytte på minst 60 vekt-% av proteininnholdet av debrideringsblandingen. Proteintoppen kan videre oppnås i et utbytte på minst 70 vekt-% av proteininnholdet av debrideringspreparatet som anvendes på kolonnen.
I henhold til ytterligere utførelsesformer omfatter debrideringspreparatet som oppnås fra bromelain ifølge oppfinnelsens prinsipper i tillegg en farmasøytisk akseptabel bærer.
I henhold til et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å oppnå et debrideringspreparat fra bromelain, der debrideringspreparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter rundt 23 kDa, der preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer og der fremgangsmåten omfatter de følgende trinn: (a) suspendering av bromelain med en sur oppløsning eventuelt omfattende en antioksidant der den sure oppløsning har en pH-verdi i området rundt 2,4 til rundt 4; (b) justering av suspensjonen fra (a) til en pH-verdi i området rundt 2,5 til rundt 3,5; (c) tilsetning av et filterhjelpestoff til suspensjonen fra (b); (d) filtrering av suspensjonen fra (c) for å fjerne uoppløselige komponenter; (e) tilsetning til den filtrerte oppløsning fra (d) av ammoniumsulfatsalt for å gi mettethet av ammoniumsulfat i området rundt 40 til rundt 50%; (f) justering av suspensjonen fra (e) til en pH-verdi fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (g) inkubering av suspensjonen fra (f) ved 3 til 10°C; (h) sentrifugering av suspensjonen fra (g) for å gi et ammoniumsulfatprepisitat;
(i) oppløsning av ammoniumsulfatpresipitatet i en sur oppløsning som eventuelt
omfatter en antioksidant med en pH-verdi i området rundt 2,4 til rundt 4;
(j) filtrering av oppløsningen fra (i) slik at proteolytiske enzymer med
molekylvekter over rundt 10 kDa beholdes; og
(k) lyofilisering av den tilbakeholdte oppløsning fra (j).
I henhold til en i dag foretrukken utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å oppnå et debrideringspreparat fra bromelain, der blandingene eller preparatene omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter rundt 23 kDa, og der preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer, og der fremgangsmåten omfatter de følgende trinn: (a) suspendering av bromelain med 0,3 M eddiksyre omfattende 1% askorbinsyre og n-oktanol med en pH-verdi fra rundt 2,4 til rundt 2,6; (b) justering av suspensjonen fra (a) til en pH-verdi i området fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (c) tilsetning av et filterhjelpemiddel omfattende silika til suspensjonen fra (b); (d) filtrering av suspensjonen fra (c) gjennom en filterpresse for å fjerne uoppløselige komponenter; (e) tilsetning til den filtrerte oppløsning fra (d) av ammoniumsulfatsalt (285 g/L) for å gi 40% mettethet av ammoniumsulfat; (f) justering av suspensjonen fra (e) til en pH-verdi fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (g) inkubering av suspensjonen fra (f) i rundt 12-24 timer ved en temperatur rundt 4°C; (h) sentrifugering av suspensjonen fra (g) for å gi et ammoniumsulfatpresipitat;
(i) oppløsning av ammoniumsulfatpresipitatet i 0,3 M eddiksyre omfattende 1%
askorbinsyre med en pH-verdi fra rundt 2,4 til rundt 2,6;
(j) filtrering av oppløsningen fra (i) gjennom et 10 kDa ultrafilter, slik at de
proteolytiske enzymer med molekylvekter over rundt 10 kDa holdes tilbake;
(k) filtrering av den tilbakeholdte oppløsning fra (j) for å gi en steril oppløsning;
og
(1) lyofilisering av den filtrerte oppløsning fra (k).
I henhold til et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes det en anvendelse av et debrideringspreparat i henhold til prinsippene ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et medikament for behandling av et sår ved debridering av ikke-levedyktig vev.
I henhold til noen utførelsesformer kan et vidt spektrum av sår heles ved de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen som inkluderer, men ikke er begrenset til, full- og partialtykkelses brannsår, solbrenthet, frostskader; ulcerative lesjoner som trykk (dekubitøse) ulcere og varicose-, stasis- og trofiske ulcere; sår forbundet med kirurgiske prosedyrer som amputering, oppskjæring, omskjæring og episiotomi; traumatiske og pyogeniske sår; vaginitt; cervicitt; pilonidal cyste sår og katarakt arrvev. De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er også brukbare for fremstilling av hudpodingsseter.
Disse og andre utførelsesformer av oppfinnelsen vil forstås bedre i forbindelse med figurene, beskrivelsen, eksemplene og kravene som følger.
Kort beskrivelse av figurene
FIG. 1 viser et skjema for fremgangsmåten for fremstilling av Debrase fra bromelain. FIG. 2 viser et størrelseseksklusjonskromatogram for en råekstrakt av bromelain. Bromelainpulver ble ekstrahert med fosfatbuffer pH 6,1 mettet med fenyl-kvikksølvacetat og så sentrifugert. Supernatanten ble lagt på en preparativ størrelses-eksklusjons HPLC-kolonne og eluert med den samme buffer. Fraksjoner ble samlet. Kvadrater viser absorbans ved 280 nm og sirkler representerer % av inhibering av Debrase esterolytisk aktivitet. FIG. 3 viser størrelses eksklusjonskromatogrammer av Debrase (øvre plate) og bromelain (nedre plate). Bromelain ble underkastet størrelseseksklusjonskromatografi og tre proteintopper (dvs. toppene merket 1, 2 og 3) opptrer ved rundt 32, 35 henholdsvis 40 minutter (nedre plate). Debrase var underkastet samme størrelseseksklusjonskromatografi og kun en proteintopp opptrådte ved rundt 32 minutter (øvre plate). Toppene 2 og 3, som opptrer i kromatogrammet av bromelain, var ikke detekterbare i Debrase-kromatogrammet. Topp nr. 3 ble identifisert som bromelain-inhibitor, og topp nr. 2 ble betraktet enten som en kontaminant eller en inhibitor. FIG. 4 viser debrideringsaktiviteten av to preparater av Debrase på svineørehud. Avrivningstiden for svineørehudstykkene ble målt som en funksjon av Debrase-konsentrasjoner. FIG. 5 viser debrideringsaktiviteten av to preparater av bromelain på svineørehud. Avrivningstiden for svineørehudstykkene ble målt som en funksjon av bromelainkonsentrasj oner. FIG. 6 viser debrideringsaktiviteten for Debrase og bromelain på svineørehud. Avrivningstiden for svineørehudstykkene ble målt som en funksjon av Debrase- og bromelainkonsentrasj onene. FIG. 7 viser en todimensjonal gelelektroforese av Debrase oppnådd fra bromelain. Debrase ble isolert fra bromelain (se Eksempel 1 nedenfor) og underkastet todimensjonal gelelektroforese. Fire proteinflekker angitt med 1 til 4 ble identifisert ved Ms/MS analyse. Fig. 8 viser en todimensjonal gelelektroforese av en proteolytisk blanding oppnådd fra bromelain. En proteolytisk blanding ble fremstilt fra bromelain i henhold til prosedyren som beskrevet i US 5,830,739. Blandingen ble underkastet todimensjonal gelelektroforese og fem proteinflekker nummerert 5 til 9 ble identifisert ved MS/MS analyse.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en debrideringsblanding oppnådd fra bromelain, der blandingen eller preparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekt rundt 23 kDa, i det vesentlige frie for bromelaininhibitorer. Oppfinnelsen tilveiebringer videre metoder for å oppnå nevnte debrideringspreparater og anvendelse av disse.
Det er nå for første gang beskrevet at en kombinasjon av to trinn, dvs. tilsetning av filterhjelpemiddel og filtrering, til metoden for å fremstille en proteolytisk blanding fra bromelain som beskrevet i US 5,830,739, gjør det mulig å oppnå debrideringspreparat med forbedrede biokjemiske og biologiske trekk. Debrideringspreparatet ifølge oppfinnelsen inneholder de fleste av de proteolytiske enzymer fra bromelain, dvs. enzymer med molekylvekter over rundt 10 kDa, men er i det vesentlige fri for lavmolekylvektsproteiner, dvs. bromelaininhibitorer med molekylvekter rundt 5-6 kDa. Preparatene har overlegen debrideringsaktivitet utover den til bromalin og viser reproduserbart proteininnhold.
I henhold til et aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringer den et debrideringspreparat som er oppnådd fra bromelain, der debrideringspreparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter rundt 23 kDa og der preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer.
Som benyttet i beskrivelsen og i kravene, henviser uttrykket "bromelain" til et hvilket som helst antall av i dag tilgjengelige bromelainpulverpreparater. Eksempler på produsenter av bromelain inkluderer, men er ikke begrenset til, Sigma og Challenge Bioproducts Co. Ltd., Taiwan. Bromelain fremstilles fra stammen av ananasplanten. En typisk prosedyre for oppnåelse av bromelain er som følger: Saften fra stammen av ananasplanten justeres først til en pH-verdi rundt 3 eller 4 med fosforsyre, og natriumhydrid eller natriumsulfhydrid settes til for å beskytte mot sulfhydryloksidasjon. Inert materiale presipiteres med rundt 30% aceton og, etter filtrering, blir den klarede væske presipitert med 70% aceton. Dette presipitat samles ved sentrifugering og blir enten gjenoppløst i vann inneholdende natriumhydrid eller natriumsulfhydrid som er surgjort med fosforsyre og så represipitert, eller tørket i vakuumovn direkte. Hvis materialet represipiteres, benyttes 70% aceton. Det tørkede materiale fra hver prosess er egnet som utgangsmateriale for å oppnå debrideringspreparatet ifølge oppfinnelsen.
En tidligere publisert metode for å oppnå proteolytisk blanding fra bromelain, der metoden omfatter konsentrering av oppløsningen over 30 kDa terskelmembraner, ble foreslått for å eliminere bromelaininhibitorer (se US 4,329,430). Da imidlertid metoden som beskrevet i US 4,329,430 omfatter konsentrering av oppløsningen over 30 kDa terskelmembraner, ble andre proteiner med molekylvekter opp til 30 kDa antagelig fjernet ved konsentrer ingen i tillegg. En annen tidligere publisert metode omfatter et trinn med filtrering av ekstraktet gjennom 10 kDa terskelmembraner (se US 5,830,739), imidlertid ble ingen indikasjon på fravær av bromelaininhibitoraktivitet tilveiebrakt. I motsetning til den kjente teknikk, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse midler for ytterligere å rense et debrideringspreparat for bromelain og biokjemisk å karakterisere debrideringspreparatet. Som sådant er debrideringspreparatet som oppnås i henhold til prinsippene ifølge oppfinnelsen påvist i det vesentlige å være frie for bromelaininhibitorer og er mere aktive i debridering av ikke-levedyktig vev enn det som tidligere er oppnådd.
Bromelaininhibitorer er polypeptider med molekylvekter på rundt 5-6 kDa (se for eksempel Perlstein, S. H. og Kezdy, F. J., Supramol. Struct. 1: 249-254, 1973). I henhold til eksemplene som er gitt nedenfor, omfatter debrideringspreparatene som oppnås fra bromelain ifølge prinsippene ifølge oppfinnelsen proteiner med tilsynelatende molekylvekter utover rundt 10 kDa, der preparatene i det vesentlige er frie for bromelaininhibitorer. Uttrykket "rundt" når det gjelder molekylvekter for et protein er ment å inkludere 2 kDa over eller under proteinets molekylvekt. Hvis for eksempel et protein har en molekylvekt rundt 10 kDa, betyr dette at molekylvekten for proteinet kan ligge fra 8 kDa til 12 kDa.
Uttrykket "i det vesentlige fri for" henviser til preparater som omfatter høyst restmengder av bromelaininhibitorer sammenlignet med mengden som er til stede i uren bromelainekstrakt, dvs. utgangsmaterialet hvorfra debrideringspreparatet ifølge oppfinnelsen oppnås. Uttrykket "restmengde" som benyttet her er ment å indikere at bromelaininhibitorene utgjør ikke mer enn 10 vekt-% av proteininnholdet av debrideringspreparatet. Fortrinnsvis utgjør bromelaininhibitorene ikke mer enn 5 vekt-% av proteininnholdet av debrideringspreparatet, og spesielt ikke mer enn 2 vekt-%, helst ikke mer enn 1 vekt-% av proteininnholdet av debrideringspreparatet.
I henhold til et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å oppnå et debrideringspreparat fra bromelain der preparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter rundt 23 kDa, der preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer, og der fremgangsmåten omfatter følgende trinn: (a) å suspendere bromelain med en sur oppløsning med en pH-verdi i området rundt 2,4 til rundt 4; (b) å justere suspensjonen fra (a) til et pH-område fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (c) tilsetning av et filterhjelpemiddel til suspensjonen fra (b); (d) filtrering av suspensjonen fra (c) for å fjerne uoppløselige komponenter; (e) tilsetning av ammoniumsulfatsalt til den filtrerte oppløsning fra (d) for å gi metning av ammoniumsulfat i området rundt 40% til rundt 50%; (f) å justere suspensjonen fra (e) til en pH-verdi fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (g) inkubering av suspensjonen fra (f) ved 3°C - 10°C; (h) sentrifugering av suspensjonen fra (g) for å gi et ammoniumsulfatpresipitat;
(i) oppløsning av ammoniumsulfatpresipitatet i en sur oppløsning eventuelt
omfattende en antioksidant med en pH-verdi i området rundt 2,4 til rundt 4;
(j) filtrering av oppløsningen fra (i) slik at proteolytiske enzymer med
molekylvekter utover rundt 10 kDa holdes tilbake; og
(k) lyofilisering av den tilbakeholdte oppløsning fra (j).
I henhold til oppfinnelsen blir suspendering av bromelain gjennomført i en hvilken som helst oppløsning med en pH-verdi mellom rundt 2,4 og 4. Eksempler på sure oppløsninger eller buffere som kan benyttes ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, eddiksyre i vann, acetatbuffer og acetatbuffer inneholdende 1% tioglykolsyre, med pH-verdi 2,4-4.1 henhold til visse eksempelutførelsesformer, er den sure oppløsning valgt blant buffere og oppløsninger som beskrevet i US 5,830,739 og 4,197,291.
Den sure oppløsning kan eventuelt omfatte en antioksidant. Eksempler på antioksidanter inkluderer, men er ikke begrenset til, askorbinsyre, dihydroquinon, butylert hydroksytoluen og ditiotreitol. Antioksidanten kan tilsettes i en konsentrasjon rundt 0,5 til rundt 2%, fortrinnsvis 1%.
Den sure oppløsning kan videre omfatte et fuktemiddel. Eksempler på fuktemidler inkluderer, men er ikke begrenset til, n-oktanol.
pH-verdien for den sure oppløsning, som eventuelt omfatter en antioksidant, bør ligge innen området rundt 2,4 til rundt 4.1 henhold til en foretrukken utførelsesform, ligger pH-verdien for den sure oppløsning, som eventuelt omfatter en antioksidant, fra rundt 2,4 til rundt 2,6. Uttrykket "rundt" når det henviser til en pH-verdi i en oppløsning eller suspensjon, er ment å antyde 0,1 pH-enheter over eller under den antydede pH-verdi innenfor rammen av oppfinnelsen.
I henhold til oppfinnelsen blir et filterhjelpemiddel satt til suspensjonen av (a). I henhold til en utførelsesform omfatter filterhjelpemidlet silika. Fortrinnsvis er filterhjelpemidlet naturlig diatoméjord som er kalsinert slik at det oppnås høyere strømningshastigheter.
Presipitering av de ønskede proteiner gjennomføres ved til den filtrerte oppløsning fra trinn (d) å sette ammoniumsulfatsalt. Ammoniumsulfatsalt kan settes til for å gi mettethet av ammoniumsulfat i et område mellom rundt 40% og rundt 50%. Fortrinnsvis kan ammoniumsulfatsaltet tilsettes for å gi 40% mettethet av ammoniumsulfat.
Suspensjonen fra trinn (f) blir å inkubert ved en temperatur mellom 3° og 10°C. Fortrinnsvis blir suspensjonen i trinn (f) inkubert i minst 10 timer ved temperaturer mellom 3° og 10°C. Helst blir suspensjonen i trinn (f) inkubert ved 12-24 timer ved 4°C.
Ved slutten av inkuberingen blir suspensjonen i trinn (g) sentrifugert for å presipitere de ønskede proteiner, dvs. de proteolytiske enzymer. Presipitatet blir så oppløst i sur oppløsning eventuelt omfattende en antioksidant. I henhold til et eksempel på en utførelsesform blir suspensjonen inkubert i minst 10 timer ved 4°C.
Oppløsningen i trinn (i) underkastes et trinn med filtrering for å bibeholde protelytiske enzymer med molekylvekter over rundt 10 kDa. I henhold til en foretrukken utførelsesform blir oppløsningen fra trinn (i) filtrert gjennom et membranfilter med en molekylsperregrense på rundt 10 kDa. Det skal være klart at et hvilket som helst filtermembran som er i stand til å fjerne bromelaininhibitorer og andre kontaminanter under bibeholdelse av proteolytiske enzymer med molekylvekter utover 10 kDa er omfattet av oppfinnelsen.
Debrideringspreparatet kan lyofiliseres etter filtrering, kan vaskes med destillert vann og så lyofiliseres, eller kan filtreres og så lyofiliseres. I henhold til en vanlig foretrukken utførelsesform blir debrideringspreparatet filtrert gjennom et filtermembran med en porestørrelse på minst rundt 0,5 um for å oppnå en steril oppløsning, som så lyofiliseres og lagres. Typisk blir debrideringspreparatet lagret tørt, da det er mindre stabilt i nærvær av fuktighet. Debrideringspreparatet oppløses før bruk.
I henhold til en i dag foretrukken utførelsesform omfatter metoden for å oppnå debrideringspreparatet fra bromelain de følgende trinn: (a) suspendering av bromelain med 0,3M eddiksyre omfattende 1% askorbinsyre og n-oktanol med en pH-verdi fra rundt 2,4 til rundt 2,6; (b) justering av suspensjonen fra (a) til å gi et pH-område på rundt 2,5 til rundt 3,5; (c) tilsetning av et filterhjelpemiddel omfattende silika til suspensjonen fra (b); (d) filtrering av suspensjonen fra (c) gjennom en filterpresse for å fjerne
uoppløselige komponenter;
(e) tilsetning av ammoniumsulfatsalt (285 g/L) til den filtrerte oppløsning fra (d)
for å gi 40% metning av ammoniumsulfat
(f) justering av suspensjonen fra (e) til en pH-verdi fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (g) inkubering av suspensjonen fra (f) i rundt 12-24 timer ved 4°C; (h) sentrifugering av suspensjonen fra (g) for å gi et ammoniumsulfatpresipitat;
(i) oppløsning av ammoniumsulfatpresipitatet i 0,3M eddiksyre omfattende 1%
askorbinsyre med en pH-verdi fra rundt 2,4 til rundt 2,6;
(j) filtrering av oppløsningen fra (i) gjennom et 10 kDa ultrafilter, slik at proteolytiske enzymer med molekylvekter utover rundt 10 kDa holdes tilbake;
(k) filtrering av den tilbakeholde oppløsning fra (j) for å gi en steril oppløsning;
og
(1) lyofilisering av den filtrerte oppløsning fra (k).
Farmasøytiske preparater
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et debrideringspreparat som er oppnådd fra bromelain, der preparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter utover rundt 10 kDa, og der preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer.
I henhold til noen utførelsesformer kan debrideringspreparatet ifølge oppfinnelsen videre omfatte en farmasøytisk akseptabel bærer for å gi et farmasøytisk preparat.
Utrykket "farmasøytisk akseptabel bærer" henviser til en vehikkel som gir de aktive bestanddeler til det tilsiktede mål og som ikke forårsaker skade på humane eller andre resipiente organismer. Som benyttet her, skal uttrykket "farmasøytisk" forstås til å omfatte både human- og animalfarmasøytika. Brukbare bærere inkluderer for eksempel vann, aceton, etanol, etylenglykol, propylenglykol, butan-1, 3-diol, isopropylmyristat, isopropylpalmitat eller mineralolje. Metodologi og komponenter for formulering av farmasøytiske preparater er velkjente på området, og kan for eksempel finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. utgave, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. EastonPa., 1990.
Det farmasøytisk preparat kan formuleres i en hvilken som helst form som er egnet for applikering til pasienter. Den generelt fortrukne vei for administrering er ved topisk applikering til setet som skal behandles. I henhold til dette, kan det farmasøytisk preparat formuleres i en form som er egnet for topisk applikasjon, for eksempel i oppløsninger, suspensjoner, kremer, lotioner, geler, skum, spray, tørrpulvere og lignende. Det farmasøytisk preparat kan applikeres direkte på det skadede vev eller kan applikeres i form av en inert dressing, som bandasje eller tilsvarende, og så legges på det skadede vev.
De farmasøytiske preparater kan også omfatte andre eventuelle materialer, som kan velges avhengig av bæreren. Ytterligere komponenter inkluderer, men er ikke begrenset til, preserveringsmidler som Thimerosal, benzylalkohol eller parabener, fortykningsmidler som polyetylenglykol, hyaluronsyre, karbapol eller glycerol, antimikrobielle midler som antibiotika eller antifungalika, og massegivende stoffer som laktose eller mannitol. Et keratinolytisk middel som urea kan settes til for å understøtte dissekering av escharvevet.
Terapeutisk anvendelse av debrideringspreparatet
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av debrideringspreparatet i henhold til oppfinnelsens prinsipper for fremstilling av et medikament for behandling av et sår ved debridering av ikke-levedyktig vev.
I henhold til en utførelsesform tilveiebringes en anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av et debrideringspreparat for fremstilling av et medikament for behandling av sår ved debridering av ikke-levedyktig vev, der debrideringspreparatet ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.
Preparatet ifølge oppfinnelsen er nyttig ved behandling av sår. Særlig er debrideringspreparatet nyttig ved sårdebridering og sårheling. Egenskapene kan påvises i et antall testsituasjoner, inkludert kliniske dyre- og humanforsøk. Den hyppigst benyttede prøve er en partiell tykkelses brannsårprøve på svin som beskrevet av Mertz et al. (Journal Surgical Research (1990) 48:245-248).
For sårdebridering bestemmes effektiviteten, blant andre indikasjoner, ved fravær, mykgjøring eller oppløsning av eschar; ikke-hydrolyse av levedyktige vevskomponenter; og/eller ikke-irritasjon i sår. For topisk sårheling bestemmes effektiviteten, blant andre indikasjoner, av sårkontraktur, øket grad av heling og/eller forbedret heling (dvs. opprettholdelse av respons på taktil stimulus, mindre arrdannelse, forbedret neovaskularisering, osv.). Således henviser utrykket "terapeutisk effektiv mengde" til den mengde av debrideringspreparatet som er nødvendig for å eliminere eller redusere escharvev og/eller å fremme sårheling.
Et vidt spektrum av sår kan behandles med de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen inkludert, men er ikke begrenset til, full og partiell tykkelses brannsår; ulcerative lesjoner, prinsipalt trykk (dekubitøse) ulcere og varicose; stasis og trofiske ulcere; kirugiske sår som amputasjons-, insisjonelle, traumatiske og pyogeniske sår; behandling av vaginitt, cervicitt, circumcisjoner, episiotomi, pilonidal cystesår, karbunkler, solbrenthet, frostskade og katarakte arrvev.
Debridering av ikke-levedyktig vev ved hjelp av debrideringspreparatene som farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres ved enkel applikasjon på escharvevet eller ved flere applikasjoner så lenge debridering er ønsket. Anvendelsen av debrideringspreparatet for debridering av escharvev ifølge oppfinnelsen kan gjennomføres i kombinasjon med andre kjente debrideringsmetoder.
De følgende eksempler skal gi en mer fullstendig forståelse av oppfinnelsen. De spesifikke teknikker, betingelser, materialer, andeler og rapporterte data er angitt for å illustrere oppfinnelsens prinsipper og er eksempler og skal ikke tolkes som begrensende for oppfinnelsen.
EKSEMPEL 1
Fremstilling av Debrase
Suspensjon av bromelain
Bromelain SP (4 kg pulver; Challenge Bioproducts Co. Ltd., Taiwan) ble suspendert i 40 liter av en suspensjonsoppløsning inneholdende 0,3M eddiksyre, 1% askorbinsyre og 70 mg/ml n-oktanol, pH 2,4-2,6 og konduktivitet 1,0-1,2 mS som følger: Suspensjons-oppløsningen ble nyfremstilt (ikke mer enn en dag før bruk) og ble avkjølt i forkant til 3-5°C. Bromelain ble langsomt satt til den foravkjølte suspensjonsoppløsning under omrøring. Etter 10 minutter ble pH-verdien i suspensjonen målt og justert til 2,5 - 3,5 med IM eddiksyre eller 0,1M natriumhydroksid. Suspensjonen ble omrørt kontinuerlig ved 3-5°C, over natten (FIG. 1).
Filtrering gjennom filterpresse
Etter inkubering over natten, ble suspensjonen fortynnet med et likt volum av en fortynningsoppløsning inneholdende 0,3M eddiksyre og 1% askorbinsyre (pH 2,4-2,6). Et filterhjelpemiddel, Celite Hyfly (60 g/L; Merck, Tyskland), ble langsomt satt til den fortynnede suspensjon under kontinuerlig omrøring i minst 15 minutter. Suspensjonen ble så filtrert gjennom en filterpresse (Celatom, Difenbach, Italia) utstyrt med filterputer IF 350 (?) og CRESPASTE 110 (Industrialfiltro, Italia) for å fjerne uoppløselige komponenter. Etter den første filtreringsrunde, ble proteinoppløsningen (filtratet) resirkulert gjennom filterpressen, og det klare filtratet ble samlet og foravkjølt til 3-5°C. Ved slutten av filtreringen ble filterpressen skyllet med 20 liter fortynningsoppløsning og spylt med luft for å fjerne restproteiner fra filteret. Oppløsningen inneholdende restproteinene fra filteret ble kombinert med filtratet og omrørt kontinuerlig ved 4-6°C.
Presipitering med ammoniumsulfat
Ammoniumsulfat (285 g/L) ble langsomt satt til det omrørte filtratet. pH-verdien for den resulterende oppløsning ble justert til 2,5-3,5 med IM eddiksyre eller 0,1M natriumhydroksid. Etter 10-15 minutter, ble omrøringen stanset og oppløsningen inkubert over natten ved 3-5°C.
Sentrifugering
Proteinoppløsningen inneholdende ammoniumsulfat ble separert ved sentrifugering ved 14.000 g. Supernatanten ble kassert og presipitatet samlet.
Proteinoppløsning
Presipitatet ble resuspendert over natten ved 3-5°C i 40 liter av en nyfremstilt fortynningsoppløsning inneholdende 0,3M eddiksyre og 1% askorbinsyre, pH 2,4-2,6, under omrøring som følger: Fortynningsoppløsningen ble fremstilt og foravkjølt til 3-5°C. Presipitatet ble langsomt satt til fortynningsoppløsningen i løpet av rundt 15 minutter under kontinuerlig omrøring. Suspensjonen ble omrørt ved 3-5°C over natten.
Ultrafiltrering ( konsentrering og dialyse)
Suspensjonen ble forfiltrert gjennom et 0,5 um Milligard filter (Millipore, Frankrike). Filtratet ble samlet. Ved slutten av filtreringen ble filteret spylt med luft for å fjerne restproteiner. Den filtrerte oppløsning ble så dia-filtrert gjennom en ultrafiltreringsenhet inneholdende 4 membraner med 10 kD molekylvektterskel (Millipore; Pelicon-2; 10 KD). Det totale ultrafiltreringssystem ble forskyllet med destillert vann og så ekvilibrert med en dialyseoppløsning inneholdende 0,1M eddiksyre og 1 g/l ammoniumsulfat. Proteinoppløsningen ble først konsentrert til en proteinkonsentrasjon på rundt 100 g/l (rundt 10 liter) og dialysert mot 4,5-5 volumer dialysebuffer for å nå en konduktivitet på
< 3,8 mS og en pH-verdi på 3 ±0,2. Oppløsningen ble omrørt ved < 15°C. Ved slutten av diafiltreringen ble volumet i retentatet redusert til rundt 5 liter. Ultrafiltreringsmembraner ble så vasket med dialyseoppløsningen opp til et sluttvolum på 10 liter.
Steril filtrering og frysetørking
Den diafiltrerte oppløsning ble filtrert gjennom et 0,5 um Milligard pre-filter og så gjennom et absolutt 0,22 um Millidisk 40 filter (Millipore, Frankrike). Filtratet ble samlet i rustfrie lyofiliseringsstålkar og lyofilisert i en frysetørker (USIFROID, Frankrike). Den lyofiliserte debrideringsblanding eller -preparat som ble fremstilt på denne måte er her angitt med navnet Debrase.
Fylling
Fylling av det lyofiliserte Debrase-pulver ble gjennomført i henhold til en på forhånd bestemt vekt. Debrase ble fylt i pyrogenfrie glassflasker (30 ml fra Saint-Gobain, Frankrike) og lukket med plastikklokk. Fylte flasker ble lagret i en fryser ved -20°C. Mengden Debrase-pulver som ble fremstilt fra 4 kg bromelain var 720-750 g per sats.
EKSEMPEL 2
Debrase er fri for bromelaininhibitorer
Rensing av bromelaininhibitorer
2,5 g bromelainpulver ble suspendert i 10 ml 0,1M kaliumfosfatbuffer pH 6,1 mettet med fenylkvikksølvacetat i 10 minutter. Etter sentrifugering i 10 minutter (3500 rpm), ble 1 ml av supernatanten lagt på en gelfiltreringskromatograifkolonne på en HiLoad 16/60 Superdex 75 HPLC prepareringskvalitetkolonne, ekvilibrert og eluert med den samme buffer. Fraksjoner på 5 ml ble samlet 30 minutter etter prøveapplikering. For hver av de eluerte fraksjoner ble tre parametere målt: (i) absorbans ved 280 nm (A28o);
(ii) esterolytisk aktivitet; og (iii) inhibering av Debrase esterolytisk aktivitet.
Den esterolytiske aktivitet for bromelainfraksjonene ble analaysert spektrofotometrisk ved pH 4,6 ved bruk av det kromogeniske substrat p-nitrofenyl Noc-benzyloksykarbonyl-L-lysinat (CLN) som følger: En milliliter natriumacetatbuffer (10 mM) inneholdende 0,1 M KC1 og 1 mM L-cystein, pH 4,6, ble anbrakt i en plastikk-kyvette ved 25°C. Ett hundre ul av de eluerte fraksjoner (ved en konsentrasjon på 2,5 mg/ml) ble titlsatt. Oppløsningen ble inkubert i 2 minutter og deretter ble 50 ul CLN-oppløsning (2,5 mM i acetonitril 10% vann) tilsatt. Kyvetten ble blandet og økningen i absorbans ved 317 nm ble fulgt i 5 minutter. Den spontane hydrolyse av substratet ble overvåket i nærvær av buffer i stedet for de eluerte fraksjoner.
Inhiberingen av den esterolytiske aktiviteten av Debrase ble målt som følger: 20 ul Debrase (0,25 mg/ml) ble inkubert med de forskjellige HPLC-fraksjoner og den esterolytiske aktiviteten av Debrase ble analysert spektrofotometrisk ved pH 4,6 ved bruk av CLN som beskrevet ovenfor.
Som vist i FIG. 2, ble stamme Bromelain eluert i fraksjonene 5-13 og 14-20. Imidlertid ble bromelaininhibitorer, som viste inhibering av Debrase esterolytisk aktivitet, eluert i fraksjonene 22-29.
Tabell 1 viser den esterolytiske aktivitet av Debrase i fravær eller nærvær av eluerte fraksjoner nr. 20-30. Slik man kan se i Tabell 1, inhiberte fraksjonenen 22-29 Debrase esterolytisk aktivitet. Den mest utpregede inhibering ble oppnådd med fraksjonene 23-25. Den tilsynelatende molekylvekt for den inhibitoriske aktivitet ble påvist å være rundt 5-6 kDa, og indikerte derfor at bromelaininhibitorer eluerte i fraksjonene 23-25.
HPLC- analyse av Debrase
Størrelseseksklusjonskromatografi av Debrase og dets utgangsmateriale bromelain ble gjennomført for å karakterisere og analysere differansene mellom disse to enzymatiske blandinger. Debrase og bromelain ble hver brakt på en TSK gel 3000swxiHPLC kolonne og kolonnen ble kjørt ved en strømningshastighet på 0,4 ml/min av 40 mM fosfatbuffer inneholdende 130 mM NaCl. FIG. 3 viser at mens i Debrase ble det ved kromatografi kun oppnådd en proteintopp (øvre plate), ble det i bromelainkromatografien oppnådd tre topper (nedre plate). To av hovedtoppene i bromelain ble identifisert: Topp nr. 1 ble identifisert som stamme Bromelain, mens topp nr. 3 ble identifisert som bromelaininhibitor. Slik det fremgår av FIG. 3, var bromelaininhibitorene i det vesentlige fraværende fra Debrase, og indikerte derved at metoden for fremstilling av Debrase muliggjør fjerning av bromelaininhibitorer, for derved å gi inhibitorfrie enzympreparater.
SDS-polyakrylamidgelelektroforese fulgt av massespektrometri av proteinene som er til stede i Debrase og i en proteolytisk blanding fremstilt i henhold til US 5,830,739, ansett som del av foreliggende beskrivelse, viste at den proteolytiske blanding som fremstilt i henhold til US 5,830,739 inneholdt stamme bromelain, stamme bromelain forløper, ananain og anan anaco forløper så vel som bromelaininhibitor 2 segment 2, mens Debrase inneholdt alle disse enzymer og enzymforløpere, men var fri for bromelaininhibitor. Disse resultater antyder derfor at metoden for fremstilling av Debrase er meget effektiv med henblikk på å eliminere bromelaininhibitorer.
EKSEMPEL 3
Partial identifisering av proteiner i Debrase
Debrase og en proteolytisk blanding fremstilt i henhold til US 5,830,739 ble begge underkastet isoelektrisk fokusering og SDS-PAGE som følger: Prøver av Debrase eller av den proteolytiske blanding ble suspendert i 200 ul 5% trifluoreddiksyre (TFA) i vann i noen minutter ved romtemperatur under blanding. Prøvene ble så sentrifugert ved 20.000xg ved 4°C i 30 minutter, og supernatantene ble samlet. Proteinkonsentratene ble bestemt ved metoden i henhold til Bradford. Prøver på supernatanter inneholdende 100 ug protein ble lyofilisert og oppløseliggjort igjen i en gel rehydratiseringsoppløsning (8 M urea; 2 M tio-urea; 5,2 ul/ml Pharmalites (pH 3-10); 10 mg/ml CHAPS (Sigma Chemicals Co.) og 2 mg/ml DTT) og ble lastet på immobilisert pH-gradient (IPG) strimler (18 cm, 3-10 lineær pH-gradient) for isoelektrisk fokusering ved inkubering av strimlene i den proteinholdige rehydratiseringsoppløsning i 24 timer. Den isoelektriske fokusering ble gjennomført i fire trinn: 1) 0 - 500 volt gradient i 1000 volt timer (Vh); 2) en konstant spenning på 500 volt i 2500 Vh; 3) 500 - 3500 volt gradient i 10,000 Vh og 4) en konstant spenning på 3.500 volt i 35.000 Vh. Den andre dimensjon var SDS-PAGE gel av 12,5% akrylamid, 2,6% bisakrylamid. Ved slutten av SDS-PAGE var gelene farget med kolloid Coomassie blått.
FIG. 7 viser en Coomassie-blå farget SDS-PAGE av Debrase.
FIG. 8 viser en Coomassie-blå farget SDS-PAGE av den proteolytiske blanding fremstilt i henhold til US 5,830,739. Som beskrevet ovenfor, ble Debrase og den proteolytiske blanding først underkastet elektrofokusering og så SDS-PAGE.
Proteinidentifisering
Flekker ble skåret fra hver av de Coomassie-blå fargede SDS-PAGE geler og vasket i 30 minutter i 200 ul 200 mM NH4NCO3-50% CH3CN ved 37°C. De vaskede flekker ble så tørket, rehydratisert med digesteringsoppløsning (0,02 ug ml"<1>Trypsin (Promega); 40 mM NH4NCO3(pH 8,1); 10% CH3CN) og inkubert i 16 timer ved 37°C. Peptider ble ekstrahert ved sonikering i 10% CH3CN og de ekstraherte peptider ble lastet på en POROS 50 R2 (PerSeptive Biosystems) mikrokolonne for avsalting. Peptidene ble eluert direkte til en Q-STAR (Applied Biosystems) nål og ble målt og analysert ved bruk av Analyst QS software (Applied Biosystems). Sekvenser avledet fra MS/MS analysen ble benyttet for kort BLAST-søk i NCBI databasen.
Tabell 5 oppsummerer identiteten for proteinflekkene angitt som 1-4 henholdsvis 5-9 i
FIG. 7 henholdsvis 8.
Slik man kan se fra Tabell 5, ble tre typer bromelaininhibitor (bromelaininhibitor - ananas, bromelaininhibitor VI og VII) identifisert i den proteolytiske blanding, men ikke i Debrase. Disse resultater antyder at Debrase i det vesentlige er fri for inhibitorer.
EKSEMPEL 4
Li vivo aktivitet av Debrase
In vivo svinebrannsårmodellen for bedømmelse av debrideringseffektiviteten for Debrase ble benyttet. På grunn av den nære sammenheng mellom ung svinehud og den til mennesker, er in vivo svinebrannsårmodellen kjent for å være en akseptert modell for kutane termiske brannsår hos mennesker.
Brannpåvirkede innretninger bestående av en modifisert elektrisk strålingsoppvarmings-anordning innelukket i et metallhus ble justert til 400°C i et tidsrom på 15 sekunder for å skape dype brannsår på symmetriske dermatomer på 3 cm langs sentral (spinal) -linjen. Størrelsen på brannsåret ble kontrollert ved å plassere en asbestsjablon med et 4,5 cm x 4,5 cm kvadratisk hull, holdt mot det projiserte brannsårsetet på svinehuden, og branninfliktoren ble festet ved hullet ved en standardavstand fra huden. Nabohuden ble beskyttet av asbestskjermen. Et likt antall på 5 til 14 par (etter behov) av dype brannsår ble infliktert på hver side. Etter at alle brannsårene var påført, ble toppkeratinsjiktet av eschar fjernet ved overstrykning med normal saltoppløsningsdynkede Skleaner™ svamper inntil den rene, eksponerte dermis ble avdekket. Alle brannsårområdene ble så hydratisert ved å legge på saltoppløsningsdynkede bandasjesvamper på hvert brannsår i rundt 1 time, mens det konstant ble påført saltoppløsning for å sikre at brannsårområdene ikke tørket ut.
Etter rundt 1 times hydratisering, ble en adhesivbarriere plassert rundt hvert brannsårområde på den omgivende, friske hud. Fem ml av en gelvehikkel inneholdende Carbomer 980 og dibasisk natriumfosfat i vann, pH 7,4, ble så blandet med 0,5 g Debrase-pulver og påført over såret til den indre kant av adhesivbarrieren og dekket derved et område på 5 cm x 5 cm. I kontrollseter ble kun 5 ml gel benyttet. Hele såret, dekket med sjiktet av gel og omgitt av adhesivbarrieren, ble så dekket med en okklusiv film som adherte til adhesivbarrieren. Den okklusive film adherte umiddelbart til gelen slik at ingen luft ble fanget under filmen. En liten temperatursonde ble innført gjennom adhesivbarrieren for å følge temperaturen i gelen i kammeret, som ble holdt ved 37°C til 40°C ved bruk av en oppvarmingslampe. Hele ryggen ble dekket med myk bomulls- bandasje (Kerlix eller lignende) for å stabilisere alle de okklusive bandasjene på de forskjellige seter. Bandasjene ble latt være i 4 timer. Deretter ble de fjernet, gelen med oppløst eschar ble strøket av med en tretungedepressor og sårleiet ble vasket med Skleaner inntil alt løst eller oppløst vev var fjernet. Etter rensing av sårene, ble sårene bløtt opp med saltoppløst bandasje i ytterligere 1 time og evaluert visuelt.
Som vist i Tabell 2, ble Debrase funnet å være mer effektiv i debridering av et brannsår enn bromelain. For eksempel ga 0,5 g Debrase en midlere visuell bedømmelse (VAS) på 4,75 (den høyeste er 5) sammenlignet med en midlere VAS på 2,25 for den samme mengde bromelain. I tillegg debriderte 0,25 g Debrase brannsår meget bedre enn bromelain (VAS 4 sammenlignet med VAS 2).
EKSEMPEL 5
Ex-vivo aktivitet av Debrase
Ex- vivo analyse basert på digestering av svinehud vevsprøvestykker av Debrase ble gjennomført. Stykker av svineørehud (ca. 1 cm i diameter) ble brent og underkastet Debrase proteolyse. Avrivningstiden for vev med Debrase ble fulgt. Analysen ble gjennomført som følger: Svineørehud ble preparert ved å separere huden fra brusk og fjerne overskytende fett. Svineørehudstykker ble kokt i 20 sekunder og plassert i bunnen av en hudholder med 5 ml PD-Tip over og den øvre hudholder festet på toppen. Debrase eller bromelain ble blandet med en vandig fase (f. eks. Gel, Silverol eller buffer) og brakt på bunnen av cellen ved bruk enten av en sprøyte utstyrt med et plastrør eller en pipette. Avrivningstiden for ørehudstykkene ble målt.
Resultater
Tabellene 3 og 4 viser ex vivo aktivitetsforskj ellen mellom Debrase og bromelain. Tabell 3 og FIG. 4 viser at Debrase i en konsentrasjon på 12,5 mg/ml i buffer debriderte forbrent svineørehud i løpet av 56,7 ± 9,81 minutter. Høyere konsentrasjoner av Debrase resulterte ikke i noen hurtigere debridering. Lavere konsentrasjoner av Debrase forårsaket debridering i lengre tidsrom. Grensen for detektering for Debrase var 3,125 mg/ml (115,35 ± 15,5 min).
Resultatene viser også at Debrase er mer effektiv i vevdebridering ved lave konsentrasjoner enn sitt utgangsmateriale, bromelain (se FIG. 4 versus FIG. 5). Som vist i FIG. 6, viste lave (0-5 mg/ml) og høye (20-50 mg/ml) konsentrasjoner av Debrase og bromelain tilsvarende avrivningstider. Ved konsentrasjoner på 5-20 mg/ml ble imidlertid Debrase påvist å være to ganger så hurtig som bromelain ved avrivning av svineørehud.
Fagmannen på området vil erkjenne at oppfinnelsen ikke er begrenset til det som spesielt er vist og beskrevet ovenfor, men at rammen for oppfinnelsen er definert av de vedlagte krav.
Claims (17)
1.
Debrideringspreparat,karakterisert vedat det er oppnådd fra bromelain, der debrideringspreparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter rundt 23 kDa og der preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer.
2.
Debrideringspreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat bromelaininhibitorene er mindre enn 10 vekt-% av proteininnholdet i debrideringspreparatet.
3.
Debrideringspreparat ifølge krav 2,karakterisert vedat bromelaininhibitorene er mindre enn 5 vekt-% av proteininnholdet i debrideringspreparatet.
4.
Debrideringspreparat ifølge krav 3,karakterisert vedat bromelaininhibitorene er mindre enn 2 vekt-% av proteininnholdet i debrideringspreparatet.
5.
Debrideringspreparat ifølge krav 4,karakterisert vedat bromelaininhibitorene er mindre enn 1 vekt-% av proteininnholdet i debrideringspreparatet.
6.
Debrideringspreparat ifølge krav 1,karakterisert vedat det i det vesentlige består av en enkelt proteintopp etter eluering fra en HPLC størrelseseksklusjonskolonne TSK-Gel 3000SWXL, der enkeltproteintoppen bestående av proteiner har molekylvekter på rundt 23 kDa.
7.
Debrideringspreparat ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6,karakterisert vedat det videre omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.
8.
Fremgangsmåte for å oppnå et debrideringspreparat fra bromelain, der debrideringspreparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter på rundt 23 kDa og der preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer,karakterisert vedat den omfatter de følgende trinn: (a) suspendering av bromelain med en sur oppløsning eventuelt omfattende en antioksidant idet den sure oppløsning har en pH-verdi i området fra rundt 2,4 til rundt 4; (b) justering av suspensjonen fra (a) til en pH-verdi i området fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (c) tilsetning av et filterhjelpestoff til suspensjonen fra (b); (d) filtrering av suspensjonen fra (c) for å fjerne uoppløselige komponenter; (e) tilsetning av ammoniumsulfatsalt til den filtrerte oppløsning fra (d) for å gi mettethet av ammoniumsulfat i området fra rundt 40% til rundt 50%; (f) justering av suspensjonen fra (e) til en pH-verdi fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (g) inkubering av suspensjonen fra (f) ved 3 til 10°C; (h) sentrifugering av suspensjonen fra (g) for å gi et ammoniumsulfatprepisitat; (i) oppløsning av ammoniumsulfatpresipitatet i en sur oppløsning som eventuelt omfatter en antioksidant med en pH-verdi i området fra rundt 2,4 til rundt 4; (j) filtrering av oppløsningen fra (i) slik at proteolytiske enzymer med molekylvekter utover rundt 10 kDa bibeholdes; og (k) lyofilisering av den tilbakeholdte oppløsning fra (j).
9.
Fremgangsmåte for å oppnå et debrideringspreparat fra bromelain ifølge krav 8,karakterisert vedtrinnene: (a) suspendering av bromelain med 0,3 M eddiksyre omfattende 1% askorbinsyre og n-oktanol med en pH-verdi fra rundt 2,4 til rundt 2,6; (b) justering av suspensjonen fra (a) til en pH-verdi i området fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (c) tilsetning av et filterhjelpemiddel omfattende silika til suspensjonen fra (b); (d) filtrering av suspensjonen fra (c) gjennom en filterpresse for å fjerne uoppløselige komponenter; (e) tilsetning av ammoniumsulfatsalt (285 g/L) til den filtrerte oppløsning fra (d) for å gi 40% mettethet av ammoniumsulfat; (f) justering av suspensjonen fra (e) til en pH-verdi fra rundt 2,5 til rundt 3,5; (g) inkubering av suspensjonen fra (f) i rundt 12-24 timer ved 4°C; (h) sentrifugering av suspensjonen fra (g) for å gi et ammoniumsulfatpresipitat; (i) oppløsning av ammoniumsulfatpresipitatet i 0,3 M eddiksyre omfattende 1% askorbinsyre med en pH-verdi fra rundt 2,4 til rundt 2,6; (j) filtrering av oppløsningen fra (i) gjennom et 10 kDa ultrafilter, slik at de proteolytiske enzymer med molekylvekter utover rundt 10 kDa bibeholdes; (k) filtrering av den tilbakeholdte oppløsning fra (j) for å gi en steril oppløsning;
og (1) lyofilisering av den filtrerte oppløsning fra (k).
10.
Anvendelse av et debrideringspreparat oppnådd fra bromelain for fremstilling av et medikament for behandling av et sår ved å debridere ikke-levedyktig vev, der debrideringspreparatet omfatter proteolytiske enzymer med molekylvekter rundt 23 kDa, idet preparatet i det vesentlige er fritt for bromelaininhibitorer.
11.
Anvendelse ifølge krav 10, der bromelaininhibitorene er til stede i en mengde av mindre enn 10 vekt-% av proteininnholdet i debrideringspreparatet.
12.
Anvendelse ifølge krav 11, der bromelaininhibitorene er til stede i en mengde av mindre enn 5 vekt-% av proteininnholdet i debrideringspreparatet.
13.
Anvendelse ifølge krav 12, der bromelaininhibitorene er til stede i en mengde av mindre enn 2 vekt-% av proteininnholdet i debrideringspreparatet.
14.
Anvendelse ifølge krav 13, der bromelaininhibitorene er til stede i en mengde av mindre enn 1 vekt-% av proteininnholdet i debrideringspreparatet.
15.
Anvendelse ifølge krav 10, der debrideringspreparatet i det vesentlige består av en enkelt proteintopp etter eluering fra en HPLC størrelseseksklusjonskolonne TSK-Gel 3000swxl, der enkeltproteintoppen består av proteiner med molekylvekter rundt 23 kDa.
16.
Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 15, der debrideringspreparatet videre omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer.
17.
Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 16, der såret er valgt fra gruppen bestående av full- og partialtykkelses brannsår, solbrenthet, frostsår, ulcerative lesjoner, trykk (dekubitøse) ulcere, varicose ulcere, stasis ulcere, trofiske ulcere; sår forbundet med kirurgiske prosedyrer, amputering, insisjon, omskjæring og episiotomi; traumatiske og pyogeniske sår; vaginitt; cervicitt; pilonidal cyste sår, katarakt arrvev- og hudpodingssår.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IL16533404A IL165334A0 (en) | 2004-11-22 | 2004-11-22 | Debriding composition from bromelain and methods of producing same |
PCT/IL2005/001236 WO2006054309A2 (en) | 2004-11-22 | 2005-11-22 | Debriding composition from bromelain |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20073115L NO20073115L (no) | 2007-08-13 |
NO337096B1 true NO337096B1 (no) | 2016-01-18 |
Family
ID=36407550
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20073115A NO337096B1 (no) | 2004-11-22 | 2007-06-18 | Debrideringspreparat fra bromelain og fremgangsmåter for fremstilling derav samt anvendelse derav |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8119124B2 (no) |
EP (1) | EP1824775B1 (no) |
JP (1) | JP5053096B2 (no) |
KR (1) | KR101235544B1 (no) |
CN (1) | CN101297033B (no) |
AU (1) | AU2005305461B2 (no) |
BR (1) | BRPI0518050A (no) |
CA (1) | CA2587951C (no) |
DK (1) | DK1824775T3 (no) |
ES (1) | ES2389810T3 (no) |
HK (1) | HK1124639A1 (no) |
IL (2) | IL165334A0 (no) |
MX (1) | MX2007006074A (no) |
NO (1) | NO337096B1 (no) |
PL (1) | PL1824775T3 (no) |
PT (1) | PT1824775E (no) |
WO (1) | WO2006054309A2 (no) |
ZA (1) | ZA200704821B (no) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT2585104T (pt) * | 2010-06-25 | 2019-10-30 | Shire Human Genetic Therapies | Métodos e composições de arilsulfatase a para a administração no snc |
US20140154235A1 (en) | 2011-05-12 | 2014-06-05 | Smith & Nephew Orthopaedics Ag | Wound debridement compositions containing seaprose and methods of wound treatment using same |
GB201110783D0 (en) | 2011-06-24 | 2011-08-10 | Aqua Bio Technology Asa | Methods and uses |
GB201110777D0 (en) * | 2011-06-24 | 2011-08-10 | Aqua Bio Technology Asa | Methods and uses |
RU2625726C2 (ru) | 2011-07-20 | 2017-07-18 | Медиваунд Лтд. | Экстракт бромелаина с протеолитической активностью для лечения заболеваний соединительных тканей |
US10058596B2 (en) * | 2011-12-20 | 2018-08-28 | Kci Licensing, Inc. | Composition for enzymatic debridement |
AU2013259360B2 (en) | 2012-05-11 | 2017-07-13 | Smith & Nephew, Inc. | Use of Seaprose to remove bacterial biofilm |
AU2013344659B2 (en) * | 2012-11-14 | 2017-10-05 | Smith & Nephew, Inc. | Stable thermolysin hydrogel |
LT6177B (lt) | 2014-10-10 | 2015-07-27 | Uab "Biocentras" | Fermentų kompleksų išskyrimas iš steptomyces gougerotii 101, daugiafermentinių biopreparatų ruošimas bei taikymas |
US20160101166A1 (en) | 2014-10-10 | 2016-04-14 | Rochal Industries, Llp | Compositions and kits for treating pruritus and methods of using the same |
US10238719B2 (en) | 2014-10-10 | 2019-03-26 | Rochal Industries, Llc | Compositions and kits for enzymatic debridement and methods of using the same |
US9592280B2 (en) | 2014-10-10 | 2017-03-14 | Rochal Industries Llc | Compositions and kits for enzymatic debridement and methods of using the same |
CN104857187A (zh) * | 2015-04-28 | 2015-08-26 | 李正 | 一种菠萝蛋白酶烧伤组织愈合药物 |
CN108884453B (zh) * | 2016-01-31 | 2022-07-29 | 麦迪伍德有限公司 | 用于治疗伤口的清创组合物 |
EP3445389B1 (en) * | 2016-04-18 | 2022-10-26 | Mediwound Ltd | Formulations for debridement of chronic wounds |
JP7127013B2 (ja) | 2016-07-27 | 2022-08-29 | スミス アンド ネフュー インコーポレイテッド | 表面から細菌バイオフィルムを低減または除去するためのサーモリシンの使用 |
CN107913401A (zh) * | 2016-10-08 | 2018-04-17 | 江阴市本特塞缪森生命科学研究院有限公司 | 胰蛋白酶产品及治疗妇科炎症的应用 |
US11413300B2 (en) | 2017-01-30 | 2022-08-16 | Smith & Nephew, Inc. | Synergistic combination of thermolysin and an antibacterial agent to reduce or eliminate bacterial biofilms from surfaces |
US10799614B2 (en) | 2018-10-05 | 2020-10-13 | Xenotherapeutics, Inc. | Xenotransplantation products and methods |
US10883084B2 (en) | 2018-10-05 | 2021-01-05 | Xenotherapeutics, Inc. | Personalized cells, tissues, and organs for transplantation from a humanized, bespoke, designated-pathogen free, (non-human) donor and methods and products relating to same |
WO2020198397A1 (en) | 2019-03-25 | 2020-10-01 | Xenotherapeutics, Inc. | Personalized cells, tissues, and organs for transplantation from a humanized, bespoke, designated-pathogen free, (non- human) donor and methods and products relating to same |
US20230255880A1 (en) * | 2022-02-16 | 2023-08-17 | Guild Associates Inc. | Immobilized enzyme-based wound debridement |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993010811A1 (en) * | 1991-12-03 | 1993-06-10 | Klein Gerold K V | Proteolytic mixture containing escharase and method of isolating same |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4307081A (en) * | 1974-01-08 | 1981-12-22 | Gerold K. V. Klein | Enzyme mixture |
US4226854A (en) | 1974-01-08 | 1980-10-07 | Gerold K. V. Klein | Debridement of devitalized tissue with hydrolytic enzyme product |
US4197291A (en) | 1974-01-08 | 1980-04-08 | Gerold K. V. Klein | Hydrolytic enzyme material |
US4329430A (en) * | 1979-06-04 | 1982-05-11 | Klein Gerold K V | Enzyme mixture |
US4320120A (en) | 1979-10-22 | 1982-03-16 | Zenyaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Extracts of Marsdenia cundurango Reichenbach fil |
US4286064A (en) * | 1979-11-05 | 1981-08-25 | Riker Laboratories, Inc. | Process for isolating active debriding agent from bromelain |
US4361551A (en) | 1979-11-05 | 1982-11-30 | Riker Laboratories, Inc. | Method of enzymatic debridement |
JPS56501453A (no) | 1979-11-05 | 1981-10-08 | ||
GB8724728D0 (en) | 1987-10-22 | 1987-11-25 | Genzyme Corp | Cysteine proteinase |
CA2046802C (en) | 1990-08-15 | 2007-05-22 | Donald Zane Fortney | Compositions containing protease produced by vibrio and method of use in debridement and wound healing |
IL103969A (en) * | 1991-12-03 | 1997-01-10 | Gerold K V Klein | Proteolytic mixture containing escharase and method of isolating same |
NZ253748A (en) * | 1992-06-30 | 1997-06-24 | Cortecs Ltd | Use of enzymes especially proteolytic enzymes in the management or treatment of diarrhoea |
GB9313188D0 (en) * | 1993-06-25 | 1993-08-11 | Cortecs Ltd | Medical use of enzymes |
US5387517A (en) * | 1994-03-23 | 1995-02-07 | Ethicon, Inc. | Thiol activated protease from stem bromelain for treating devitalized tissue |
US5858964A (en) | 1995-04-14 | 1999-01-12 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Pharmaceutical compositions comprising synthetic peptide copolymer for prevention of GVHD |
US5830793A (en) | 1995-12-28 | 1998-11-03 | Micron Technology, Inc. | Method of selective texfturing for patterned polysilicon electrodes |
US20020102253A1 (en) * | 1997-02-25 | 2002-08-01 | Mynott Tracey Lehanne | Component of bromelain |
CN1252101A (zh) * | 1997-02-25 | 2000-05-03 | 科特克斯(英国)有限公司 | 菠萝蛋白酶成分 |
CA2333252C (en) * | 1998-07-15 | 2008-11-25 | Ursapharm Arzneimittel Gmbh | Use of bromelain proteases for inhibiting blood coagulation |
GB9819138D0 (en) * | 1998-09-02 | 1998-10-28 | Cortecs Uk Ltd | Nucleic acids and proteins from pineapple stem |
US20030026794A1 (en) | 2001-07-31 | 2003-02-06 | Howard Fein | Selective enzyme treatment of skin conditions |
AU2003262141A1 (en) | 2002-04-15 | 2003-10-27 | Sun Pharmaceutical Industries Limited | Preperation of desloratatine |
ES2393672T3 (es) | 2002-04-23 | 2012-12-27 | Mediwound, Ltd. | Aparato y procedimientos para su uso en escarotomía enzimática en síndrome de compartimento inducido por quemaduras |
WO2008021543A2 (en) * | 2006-08-17 | 2008-02-21 | Monsanto Technology, Llc | Transgenic plants with enhanced agronomic traits |
EP2036978A1 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-18 | URSAPHARM Arzneimittel GmbH & Co. KG | Recombinant preparation of selected bromelain fractions |
-
2004
- 2004-11-22 IL IL16533404A patent/IL165334A0/xx unknown
-
2005
- 2005-11-22 AU AU2005305461A patent/AU2005305461B2/en active Active
- 2005-11-22 DK DK05804486.8T patent/DK1824775T3/da active
- 2005-11-22 EP EP05804486A patent/EP1824775B1/en active Active
- 2005-11-22 WO PCT/IL2005/001236 patent/WO2006054309A2/en active Application Filing
- 2005-11-22 JP JP2007542509A patent/JP5053096B2/ja active Active
- 2005-11-22 PL PL05804486T patent/PL1824775T3/pl unknown
- 2005-11-22 PT PT05804486T patent/PT1824775E/pt unknown
- 2005-11-22 CA CA2587951A patent/CA2587951C/en active Active
- 2005-11-22 ES ES05804486T patent/ES2389810T3/es active Active
- 2005-11-22 KR KR1020077013257A patent/KR101235544B1/ko active IP Right Grant
- 2005-11-22 BR BRPI0518050-3A patent/BRPI0518050A/pt not_active Application Discontinuation
- 2005-11-22 US US11/719,586 patent/US8119124B2/en active Active
- 2005-11-22 MX MX2007006074A patent/MX2007006074A/es active IP Right Grant
- 2005-11-22 ZA ZA200704821A patent/ZA200704821B/xx unknown
- 2005-11-22 CN CN2005800398592A patent/CN101297033B/zh active Active
-
2007
- 2007-05-14 IL IL183184A patent/IL183184A/en active IP Right Grant
- 2007-06-18 NO NO20073115A patent/NO337096B1/no unknown
-
2009
- 2009-04-27 HK HK09103888.0A patent/HK1124639A1/xx unknown
-
2012
- 2012-02-06 US US13/366,954 patent/US8540983B2/en active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993010811A1 (en) * | 1991-12-03 | 1993-06-10 | Klein Gerold K V | Proteolytic mixture containing escharase and method of isolating same |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2006054309A3 (en) | 2009-04-30 |
CN101297033A (zh) | 2008-10-29 |
EP1824775A4 (en) | 2011-01-26 |
IL183184A0 (en) | 2007-09-20 |
HK1124639A1 (en) | 2009-07-17 |
JP5053096B2 (ja) | 2012-10-17 |
EP1824775A2 (en) | 2007-08-29 |
PL1824775T3 (pl) | 2012-12-31 |
BRPI0518050A (pt) | 2008-10-28 |
JP2008520651A (ja) | 2008-06-19 |
MX2007006074A (es) | 2007-10-04 |
DK1824775T3 (da) | 2012-09-24 |
KR101235544B1 (ko) | 2013-02-21 |
EP1824775B1 (en) | 2012-06-13 |
CN101297033B (zh) | 2012-05-30 |
US20090148429A1 (en) | 2009-06-11 |
NO20073115L (no) | 2007-08-13 |
PT1824775E (pt) | 2012-09-19 |
ES2389810T3 (es) | 2012-10-31 |
AU2005305461B2 (en) | 2011-01-27 |
CA2587951C (en) | 2015-03-31 |
CA2587951A1 (en) | 2006-05-26 |
US8540983B2 (en) | 2013-09-24 |
ZA200704821B (en) | 2008-11-26 |
WO2006054309A2 (en) | 2006-05-26 |
US20120171187A1 (en) | 2012-07-05 |
AU2005305461A1 (en) | 2006-05-26 |
IL183184A (en) | 2015-09-24 |
IL165334A0 (en) | 2006-01-15 |
KR20070091285A (ko) | 2007-09-10 |
US8119124B2 (en) | 2012-02-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO337096B1 (no) | Debrideringspreparat fra bromelain og fremgangsmåter for fremstilling derav samt anvendelse derav | |
NO327283B1 (no) | Serinproteaser fra torsk og deres farmasoytiske og kosmetiske anvendelser. | |
Carone et al. | A new l-amino acid oxidase from Bothrops jararacussu snake venom: Isolation, partial characterization, and assessment of pro-apoptotic and antiprotozoal activities | |
EP2343370B1 (en) | A throbin-like enzyme of agkistrodon acutus | |
US4197291A (en) | Hydrolytic enzyme material | |
US4329430A (en) | Enzyme mixture | |
EP0472011A1 (en) | Composition containing protease produced by vibrio and method of use in debridement and wound healing | |
CN107849551A (zh) | 新型胰蛋白酶同功异型物和其用途 | |
US4307081A (en) | Enzyme mixture | |
US5945102A (en) | Crustacean and fish derived multifunctional enzyme | |
US5145681A (en) | Compositions containing protease produced by vibrio and method of use in debridement and wound healing | |
EP0674001A2 (en) | Novel protease for treating devitalized tissue | |
EP0988374B1 (en) | Hydrophilic composition containing protease produced by vibrio proteolyticus | |
Mezhlumyan et al. | Proteinases from Carica papaya latex | |
RU2236460C1 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
RU2535053C2 (ru) | Фармацевтическая композиция, содержащая лизин и ферменты: лизоцим, дезоксирибонуклеазу и/или пероксидазу для наружного лечения и профилактики инфекций, вызванных вирусом герпеса типа 1,2 и бактериальных осложнений, вызываемых герпетической инфекцией | |
CN109890835B (zh) | 制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法及通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒 | |
RU2814729C2 (ru) | Новая изоформа трипсина и ее применение | |
Arefin et al. | A Review on Purification Methods of Bromelain from Pineapple Stems: Bromelain Purification Methods | |
CA1077837A (en) | Hydrolytic enzyme material | |
ES2352924B1 (es) | Endoquitinasa ácida activa a bajas temperaturas, procedimiento de obtención y usos. | |
NO165093B (no) | Enzymsammensetning for rensing, bruken av den og framstilling av sammensetningen. | |
WO2002074329A1 (en) | Pharmaceutical composition applied to the treatment of the peyronie disease and corresponding obtention process | |
JPH05958A (ja) | アンジオテンシン変換酵素阻害物質とこれを用いた阻害方法 |