CN101297033A - 由菠萝蛋白酶获得的清创组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由菠萝蛋白酶获得的清创组合物及制备所述清创组合物的方法。特别地，本发明涉及一种由菠萝蛋白酶获得的含有分子量约23kDa的蛋白水解酶且基本不含菠萝蛋白酶抑制剂的清创组合物及含有所述清创组合物的药物组合物。所述清创组合物和含有所述清创组合物的药物组合物可特别用于对焦痂组织进行清创和创伤愈合。
Description
技术领域
本发明涉及一种由菠萝蛋白酶获得的清创组合物及制备所述清创组合物的方法。特别地，本发明涉及一种由菠萝蛋白酶获得的清创组合物及含有所述清创组合物的药物组合物，所述清创组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，基本不含菠萝蛋白酶抑制剂。所述清创组合物和含有所述清创组合物的药物组合物可特别用于对焦痂组织进行清创和创伤愈合。
背景技术
已作出了大量努力来开发能够不使用外科手术而去除失活组织的清创制剂。失活组织在所有与皮肤创伤例如褥疮、压迫性坏死、切口及烧伤有关的疾病过程中产生。由于失活组织是机会性感染的优良培养基，有效的清创是必要的。感染引起的败血症是大多数严重烧伤患者的主要死亡原因。
使用蛋白水解酶和化学制剂进行失活组织的早期清创尚未产生令人满意的清创。发现化学制剂例如鞣酸、柳酸及丙酮酸可对已受损组织产生进一步的破坏。
已有描述将蛋白水解酶包括番木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶及链激酶作为清创剂。美国专利第5,505,943号公开了含有一种由弧菌属(Vibrio)微生物产生的蛋白酶、用于通过水解坏死组织组分治疗创伤的组合物。
然而，使用纯化的蛋白水解酶进行的清创具有多种缺点，这是因为纯化的酶需要长期大量应用、显示差的效力、具有毒副作用且无选择性。
已发现来自菠萝植物(Ananas comosus)茎的提取物可选择性去除失活组织。这样的提取物(也称为菠萝蛋白酶)含有多种蛋白水解酶和水解酶。
美国专利第4,197,291号公开了一种由菠萝蛋白酶获得的能够对哺乳动物宿主的失活组织进行清创的酶制品，所述酶制品含有一种无酪蛋白水解活性且峰值等电点为约6的水溶性不耐热蛋白。所述蛋白包括至少两个亚单位，其中各亚单位分子量约为14.3-15kDa，在280nm的光谱紫外区具有特征吸收峰。如美国专利第4,197,291号所公开的制备这种酶制品的程序包括使用丙酮进行蛋白质沉淀、使用含巯醋酸的醋酸盐缓冲液提取沉淀、通过约50kDa的分子量截留的膜过滤溶液、凝胶过滤滤液并进行等电聚焦。由此所制备的酶制品包括至少两个，最可能三个分子量为14.3-15kDa的亚单位。美国专利第4,226,854号公开了一种使用美国专利第4,197,291号公开的酶制品对失活组织进行清创的方法。
美国专利第4,329,430号还公开了一种来自菠萝蛋白酶的可用于裂解和消化失活组织的蛋白水解酶混合物。这种不耐热和水溶性的蛋白水解酶混合物含有焦痂酶(escharase)(一种无酪蛋白水解活性等电点为约6的水解酶)，其包括至少两个亚单位，其中各亚单位分子量为约14.3-15kDa。由于所述酶混合物通过50kDa分子量截留的膜被过滤，并在30kDa分子量截留的膜上被浓缩，所以该蛋白水解酶混合物的所有组分的天然分子量为约30-50kDa。据称使用蛋白水解酶混合物获得的可重现的结果归因于这样的事实，即所述酶混合物不含有明显存在于先前公布的蛋白水解酶制剂中的抑制剂。然而，尚无用于检测所述抑制剂活性的标准。
美国专利第4,307,081号公开了一种裂解和消化失活组织的方法，其包括将所述组织接触美国专利第4,329,430号公开的蛋白水解酶混合物。
菠萝植物已为多种蛋白水解酶的来源。例如，美国专利第5,106,621号公开了由菠萝植物材料获得的分子量约25kDa并表现有对香豆酰基酰胺底物的活性的纯化的半胱氨酸蛋白酶。特别地，美国专利第5,106,621号涉及半胱氨酸蛋白酶ananain和comosain，其表现与茎菠萝蛋白酶不同的物理化学特征。分子量约17kDa-21kDa，名为α-菠萝蛋白酶的纯化的巯基激活的蛋白酶于美国专利第5,387,517号中公开，显示具有清创活性。另外，菠萝蛋白酶包含酸性磷酸酶和过氧化物酶，并可包含淀粉酶和纤维素酶活性。美国专利第6,335,427号教导了纯化来自菠萝蛋白酶的25kDa蛋白质，发现该蛋白质具有抗癌活性。
Perlstein和Kezdy(J.Supramol.Struct.1：249-254，1973)从商品化的菠萝蛋白酶丙酮粉末中鉴定了七种密切相关的蛋白酶抑制剂，即菠萝蛋白酶抑制剂I-VII。这些抑制剂显示具有5000-6000Da的分子量并含有50个氨基酸残基和5个二硫键(Perlstein和Kezdy，同前)。七种抑制剂中一种的一级结构分析揭露了广泛的微观不均一性(Reddy，M.N.et al.J.Biol.Chem.250：1741-1750，1975)。
美国专利第5,830,739号公开了用于由菠萝蛋白酶制备焦痂酶和其他蛋白水解酶的稳定混合物的方法，其包括使用稀释抗坏血酸溶液提取菠萝蛋白酶，然后使用硫酸铵沉淀焦痂酶和其他蛋白水解酶。美国专利第5,830,739号还教导了可使用蒸馏水在10kDa超滤器上清洗硫酸铵沉淀。发现用于制备焦痂酶的稳定混合物的方法可产生较高量的焦痂酶。然而，无证据提示所述混合物不含菠萝蛋白酶抑制剂。
发现由菠萝蛋白酶分离的纯化的不同酶对无活力组织的清创不如由菠萝蛋白酶获得的蛋白水解酶混合物有效。然而，发现由菠萝蛋白酶获得的含有分子量不超过50kDa的蛋白质(包括菠萝蛋白酶抑制剂)的蛋白水解酶混合物，对无活力组织的清创不如由含有分子量为30至50kDa的蛋白质的菠萝蛋白酶获得且推测不含抑制剂的酶混合物有效。
由于这样的酶混合物意于用于人的临床使用，由菠萝蛋白酶获得具有生物化学特征的酶混合物尚为未满足的需要，所述酶混合物具有独特的和可重现的生物化学特征，基本不含菠萝蛋白酶抑制剂，并含有菠萝蛋白酶的大多数水解酶，以致可获得对无活力组织有效的清创。
发明概述
本发明提供了一种由菠萝蛋白酶获得的能够对无活力组织进行清创并具有独特的生物化学特征的清创组合物。特别地，本发明提供了一种由菠萝蛋白酶获得的清创组合物，其生物化学特征为基本不含菠萝蛋白酶抑制剂同而含有菠萝蛋白酶的大多数蛋白水解酶。由此获得的酶组合物可高效用于对无活力组织的清创。
现在首次公开，由菠萝蛋白酶获得的具有菠萝蛋白酶的大多数蛋白水解酶但基本不含菠萝蛋白酶抑制剂的酶组合物，具有超过菠萝蛋白酶的清创活性。本文下文公开，尽管当菠萝蛋白酶从HPLC尺寸排除(sizeexclusion)色谱柱被洗脱时包括至少三个分子量约6、17.5及23kDa的主要蛋白质峰，本发明的酶组合物主要包括当应用于相同的HPLC尺寸排除色谱柱时分子量约23kDa的一个蛋白质峰。所述酶组合物在蛋白质含量上是高度可再现的，并因此有利于临床使用。
根据本发明方法用于制备所述酶组合物的方法包括下述步骤：使用任选含有抗氧化剂的酸性溶液提取可商购获得的菠萝蛋白酶粉末、添加助滤剂、过滤悬浮液以去除不溶解的组分、通过添加硫酸铵盐至溶液沉淀蛋白水解酶、使用选择性含有抗氧化剂的酸性溶液溶解硫酸铵沉淀，以及过滤溶液，以使分子量超过约10kDa的蛋白水解酶得以保留。
根据一个方面，本发明提供了由菠萝蛋白酶获得的清创组合物，所述清创组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂。术语“基本不含”是指组合物至多含有与存在于菠萝蛋白酶粗提取物中的量相比残留量的菠萝蛋白酶抑制剂。
根据一些实施方案，菠萝蛋白酶抑制剂少于清创组合物的蛋白质含量的10％w/w。优选地，菠萝蛋白酶抑制剂少于清创组合物的蛋白质含量的5％w/w，更优选地，菠萝蛋白酶抑制剂少于清创组合物的蛋白质含量的2％w/w，最优选地，菠萝蛋白酶抑制剂少于清创组合物的蛋白质含量的1％w/w。
根据另一个实施方案，所述清创组合物基本由从HPLC尺寸排除柱TSK-GeI 3000SWXL洗脱的单一蛋白质峰组成，构成所述单一蛋白质峰的蛋白质的分子量为约23kDa。
根据另一个实施方案，以应用于HPLC尺寸排除色谱柱的清创组合物的蛋白质含量的至少50％w/w的收率，获得了单一蛋白质峰。根据另一个实施方案，以清创组合物的蛋白质含量的至少60％w/w的收率，获得了主要的蛋白质峰。根据另一个实施方案，以清创组合物的蛋白质含量的至少70％w/w的收率，获得了主要的蛋白质峰。
根据其他实施方案，根据本发明的原则由菠萝蛋白酶获得的清创组合物还可含有一种药学上可接受的载体。
根据另一方面，本发明提供了一种用于由菠萝蛋白酶获得清创组合物的方法，所述清创组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂，所述方法包括以下步骤：
(a)使用选择性含有抗氧化剂的一种酸性溶液悬浮菠萝蛋白酶，所述酸性溶液pH范围为从约2.4至约4；
(b)调整步骤(a)的悬浮液至pH范围为从约2.4至约4；
(c)添加助滤剂至步骤(b)的悬浮液；
(d)过滤步骤(c)的悬浮液以去除不溶解的组分；
(e)向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐以得到硫酸铵饱和度范围在从约40％至约50％；
(f)调整步骤(e)的悬浮液至pH范围为从约2.5至约4；
(g)在3℃-10℃温育步骤(f)的悬浮液；
(h)离心步骤(g)的悬浮液以得到硫酸铵沉淀；
(i)将硫酸铵沉淀溶解于选择性含有抗氧化剂且pH范围为从约2.4至约4的酸性溶液；
(j)过滤步骤(i)的溶液使得保留分子量大于约10kDa的蛋白水解酶；并且
(k)冻干步骤(j)的保留溶液。
根据当前的优选实施方案，本发明提供了一种用于从菠萝蛋白酶获得清创组合物的方法，所述清创组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂，所述方法包括以下步骤：
(a)使用含1％抗坏血酸和正辛醇pH为约2.4至约2.6的0.3M醋酸悬浮菠萝蛋白酶；
(b)调整步骤(a)的悬浮液至pH范围为从约2.5至约3.5；
(c)添加含二氧化硅的助滤剂至步骤(b)的悬浮液；
(d)通过压滤器过滤步骤(c)的悬浮液以去除不溶解的组分；
(e)向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐(285g/L)以得到40％的硫酸铵饱和度；
(f)调整步骤(e)的悬浮液至pH为从约2.5至约3.5；
(g)在4℃温育步骤(f)的悬浮液约12-24小时；
(h)离心步骤(g)的悬浮液以得到硫酸铵沉淀；
(i)将硫酸铵沉淀溶解于含1％坏血酸pH为从约2.4至约2.6的0.3M醋酸中；
(j)通过10kDa超滤器过滤步骤(i)的溶液使得保留分子量大于约10kDa的蛋白水解酶；
(k)过滤步骤(j)的保留溶液以得到无菌溶液；并且
(l)冻干步骤(k)的过滤溶液。
根据另一方面，本发明提供了一种通过对无活力组织进行清创而治疗创伤的方法，其包括根据本发明的原则向创伤应用一种清创组合物。
根据一些实施方案，可使用本发明的药物组合物治疗多种创伤，所述多种创伤包括、但不限于：全部和部分皮层烧伤，晒伤，冻伤；溃疡性病损例如压迫性(褥疮)溃疡和静脉曲张性溃疡，淤滞溃疡和营养不良性溃疡；与外科手术操作例如截肢术、切口、包皮环切术和外阴切开术有关的创伤；外伤性创伤和化脓性创伤；阴道炎；宫颈炎；潜毛性囊肿创伤；以及白内障疤痕组织。本发明的药物组合物还可用于皮肤移植部位的预处理。
参考下述的附图、说明书、实施例和权利要求书可以更好地理解本发明的这些和其他实施方案。
附图简述
图1显示了用于由菠萝蛋白酶制备清创酶(Debrase)的方法的图示。
图2显示了菠萝蛋白酶粗提取物的尺寸排除色谱图。使用以醋酸苯汞饱和的pH 6.1的磷酸盐缓冲液提取菠萝蛋白酶粉末并对其进行离心。将上清液应用于尺寸排除HPLC制备柱并使用相同的缓冲液洗脱。收集馏份。正方形代表在280nm的吸光度，圆圈代表清创酶酯水解活性的抑制％。
图3显示了清创酶(上图)和菠萝蛋白酶(下图)的尺寸排除色谱图。将菠萝蛋白酶经受尺寸排除色谱，三个蛋白质峰(即，1、2和3号峰)分别在约32、35和40分钟出现(下图)。将清创酶经受相同的尺寸排除色谱，仅一个蛋白质峰在约32分钟出现(上图)。在清创酶色谱中未检出于菠萝蛋白酶色谱中出现的2和3号峰。将3号峰鉴定为菠萝蛋白酶抑制剂，认为第2号峰是污染物或抑制剂。
图4显示了两种清创酶制剂在猪耳皮肤上的清创活性。将猪耳皮片的裂解时间作为清创酶浓度的函数来测量。
图5显示了两种菠萝蛋白酶制剂在猪耳皮肤上的清创活性。将猪耳皮片的裂解时间作为菠萝蛋白酶浓度的函数来测量。
图6显示了清创酶和菠萝蛋白酶在猪耳皮肤上的清创活性。将猪耳皮片的裂解时间作为清创酶和菠萝蛋白酶浓度的函数来测量。
图7显示了由菠萝蛋白酶获得的清创酶的双向凝胶电泳。由菠萝蛋白酶分离清创酶(见下述的实施例1)，并将清创酶经受双向凝胶电泳。通过MS/MS分析鉴定四个标记为1-4的蛋白质斑点。
图8显示了由菠萝蛋白酶获得的蛋白水解混合物的双向凝胶电泳。根据美国5,830,739所述的方法由菠萝蛋白酶制备蛋白水解混合物。将所述混合物经受双向凝胶电泳，并通过MS/MS分析鉴定了五个标记为5-9的蛋白质斑点。
发明详述
本发明提供了一种由菠萝蛋白酶获得的清创组合物，所述组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶且基本不含菠萝蛋白酶抑制剂。本发明还提供了获得所述清创组合物的方法及其使用方法。
现在首次公开了将两个新步骤即添加助滤剂和过滤组合入美国专利第5,830,739号所述的用于从菠萝蛋白酶制备蛋白水解混合物的方法能够获得具有改进的生物化学和生理学特征的清创组合物。本发明的清创组合物含有菠萝蛋白酶的大多数蛋白水解酶，即分子量大于约10kDad的酶，但基本不含低分子量蛋白质，即分子量约5-6kDa的菠萝蛋白酶抑制剂。所述组合物具有超过菠萝蛋白酶的高清创活性并显示可重现的蛋白质含量。
根据一方面，本发明提供了由菠萝蛋白酶获得的清创组合物，所述清创组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，其中所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂。
如整个说明书和权利要求书中所使用，术语“菠萝蛋白酶”是指任何数量的目前可商购获得的菠萝蛋白酶粉末制剂。菠萝蛋白酶制造商的例子包括，但不限制于，Sigma和台湾挑战生物制品有限公司(ChallengeBioproducts Co.Ltd.)。由菠萝植物茎制备菠萝蛋白酶。获得菠萝蛋白酶的一般程序如下：首先使用磷酸将来自菠萝植物茎的汁液调整至pH约3或4，添加氢化钠或硫氢化钠以免受硫氢基氧化。使用30％丙酮沉淀惰性材料，在过滤之后，使用70％丙酮沉淀澄清的液体。通过离心收集该沉淀，并将其溶于已使用磷酸酸化的含有氢化钠或硫氢化钠的水中并再次沉淀，或直接于真空烤箱中干燥。如果再次沉淀所述材料，则使用70％丙酮。从任一方法获得的干燥材料适于作为获得本发明的清创组合物的一种原料。
过去建议先前公布的用于由菠萝蛋白酶获得蛋白水解混合物的方法(包括于30kDa截留膜上浓缩溶液的步骤)消除萝蛋白酶抑制剂(参见美国专利第4,329,430号)。然而，由于美国专利第4,329,430号所述的方法包括于30kDa截留膜上浓缩溶液的步骤，所以推测分子量不超过30kDa的其他蛋白质也由浓缩去除。另一种先前公布的方法包括通过10kDa截留膜过滤提取物的步骤(参见美国专利第5,830,739)，然而没有提供关于无菠萝蛋白酶抑制剂活性的证据。与现有技术不同，本发明提供了进一步纯化由菠萝蛋白酶获得的清创组合物和生物化学表征所述清创组合物的方法。这样，根据本发明的原则获得的所述清创组合物显示基本不含菠萝蛋白酶抑制剂并对无活力组织的清创要比先前公布的方法更有效。
菠萝蛋白酶抑制剂是分子量约5-6kDa的多肽(参见，例如，Perlstein，S.H.和Kezdy，FJ.，Supramol.Struct.1：249-254，1973)。根据此处下文公开的实施例，根据本发明的原则由菠萝蛋白酶获得的清创组合物含有分子量大于约10kDa的蛋白质，所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂。术语“约”当是指蛋白质的分子量时意为包括在蛋白质的所述分子量之下或之上2kDa。例如，如果一种蛋白质分子量约10kDa，意为该蛋白质的分子量范围为从8kDa至12kDa。
术语“基本不含”是指与菠萝蛋白酶粗提取物中菠萝蛋白酶抑制剂的量相比，组合物至多含有残留量的菠萝蛋白酶抑制剂，其中所述菠萝蛋白酶粗提取物是获得本发明清创组合物的原料。本发明使用的术语“残留量”意为表示菠萝蛋白酶抑制剂并不构成超过10％w/w的清创组合物的蛋白质含量。优选地，菠萝蛋白酶抑制剂并不构成超过5％w/w的清创组合物的蛋白质含量，更优选地，并不构成超过2％w/w的清创组合物的蛋白质含量，最优选地，并不构成超过1％w/w的清创组合物的蛋白质含量。
根据另一方面，本发明提供了一种由菠萝蛋白酶获得清创组合物的方法，所述组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂，所述方法包括以下步骤：
(a)使用pH范围为从约2.4至约4的一种酸性溶液悬浮菠萝蛋白酶；
(b)调整步骤(a)的悬浮液至pH范围为从约2.4至约4；
(c)添加助滤剂至步骤(b)的悬浮液；
(d)过滤步骤(c)的悬浮液以去除不溶解的组分；
(e)向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐以得到硫酸铵饱和度范围在从约40％到约50％；
(f)调整步骤(e)的悬浮液至pH范围为从约2.5至约4；
(g)在3℃-10℃温育步骤(f)的悬浮液；
(h)离心步骤(g)的悬浮液以得到硫酸铵沉淀；
(i)将硫酸铵沉淀溶解于选择性含有抗氧化剂pH范围为从约2.4至约4的的酸性溶液；
(j)过滤步骤(i)的溶液使得保留分子量大于约10kDa的蛋白水解酶；并且
(k)冻干步骤(j)的保留溶液。
根据本发明，悬浮菠萝蛋白酶可在pH约2.4到4的任何酸性溶液中进行。根据本发明可使用的酸性溶液或缓冲液的例子包括，但不限制于，溶于水的醋酸，醋酸盐缓冲液和pH2.4～4的含有1％巯醋酸的醋酸盐缓冲液。根据某些典型实施方案，所述酸性溶液选自美国专利第5,830,739号和第4,197,291号所述的缓冲液和溶液，这两个专利的内容通过引用并入本文，如同在本文完整描述。
所述酸性溶液可选择性含有抗氧化剂。抗氧化剂的例子包括，但不限制于，抗坏血酸、二氢醌、丁羟甲苯和二硫苏糖醇。抗氧化剂可以约0.5％至约2％，优选1％的浓度添加。
所述酸性溶液还含有润湿剂。润湿剂的例子包括，但不限制于正辛醇。
任选含有抗氧化剂的所述酸性溶液的pH应在从约2.4至约4的范围。根据某一优选实施方案，任选含有抗氧化剂的所述酸性溶液的pH在从约2.4至约2.6的范围。术语“约”当是指溶液或悬浮液的pH时意为在本发明的范围内在指定的pH之下或之上0.1pH单位。
根据本发明，向步骤(a)的悬浮液添加助滤剂。根据一个实施方案，所述助滤剂包括二氧化硅。优选地，所述助滤剂是被煅烧以便获得较快流速的天然硅藻土。
通过向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐来沉淀所需蛋白质。可添加硫酸铵盐以产生范围在约40％至约50％的硫酸铵饱和度。优选地，可添加硫酸铵产生40％的硫酸铵饱和度。
然后在3℃-10℃的温度温育步骤(f)的悬浮液。优选地，在3℃-10℃的温度温育步骤(f)的悬浮液至少10个小时。更优选地，在4℃温育步骤(f)的悬浮液12-24小时。
在温育结束时，离心步骤(g)的悬浮液以沉淀所需的蛋白质，即水解蛋白酶。然后将沉淀溶于任选含有抗氧化剂的酸性溶液。根据一个示例性实施方案，在4℃温育悬浮液至少10小时。
将步骤(i)的溶液经受过滤步骤以保留分子量大于约10kDa的蛋白水解酶。根据一优选实施方案，通过分子量截留约10kDa的膜滤器过滤步骤(i)的溶液。应该理解，本发明包括能够去除菠萝蛋白酶抑制剂和其他污染物而保留分子量超过10kDa的蛋白水解酶的任何滤膜。
可于过滤之后冻干清创组合物，可使用蒸馏水清洗，然后冻干，或可过滤并然后冻干。根据目前的一个优选实施方案，通过孔径至少约0.5μm的滤膜过滤清创组合物以获得无菌溶液，然后将其冻干并贮存。通常，清创组合物干燥贮存，这是因为其在湿气存在下较不稳定。可仅于使用前溶解清创组合物。
根据当前的一个优选实施方案，由菠萝蛋白酶获得清创组合物的方法包括以下步骤：
(a)使用选择性含有1％抗坏血酸和正辛醇pH为约2.4至约2.6的0.3M醋酸悬浮菠萝蛋白酶；
(b)调整步骤(a)的悬浮液至pH范围为从约2.5至约3.5；
(c)添加含有二氧化硅的助滤剂至步骤(b)的悬浮液；
(d)通过压滤器过滤步骤(c)的悬浮液以去除不溶解的组分；
(e)向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐(285g/L)以产生约40％的硫酸铵饱和度；
(f)调整步骤(e)的悬浮液至pH为从约2.5至约3.5；
(g)在4℃温育步骤(f)的悬浮液约12-24小时；
(h)离心步骤(g)的悬浮液以得到硫酸铵沉淀；
(i)将硫酸铵沉淀溶解于含1％坏血酸pH为从约2.4至约2.6的0.3M醋酸；
(j)通过10kDa超滤器过滤步骤(i)的溶液使得保留分子量大于约10kDa的蛋白水解酶；
(k)过滤步骤(j)的保留溶液以得到无菌溶液；并且
(l)冻干步骤(k)的过滤溶液。
药物组合物
本发明提供了一种由菠萝蛋白酶获得的清创组合物，所述组合物含有分子量大于约10kDa的蛋白水解酶，其中所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂。
根据一些实施方案，本发明的清创组合物还含有一种药学上可接受的载体以产生药物组合物。
术语“药学上可接受的载体”是指将活性组分递送至预期靶且不对人类或其他受体生物体造成损害的载体。本文所使用的“药学”应该理解为同时包括人类药学和动物药学。有用的载体包括，例如，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯或矿物油。药物组合物制剂的方法和组分为公知的，可见于，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，Eighteenth Edition，A.R.Gennaro，Ed.，MackPublishing Co.Easton Pa.，1990。
所述药物组合物可以任何适于对患者应用的剂型而配制。通常优选的给药途径是通过局部应用于待治疗部位。因此，所述药物组合物可以适于局部应用的剂型配制，例如溶液、悬浮液、乳剂、洗涤剂、凝胶剂、泡沫、喷雾剂、干粉等。所述药物组合物可直接应用于损伤组织，或可应用于惰性敷料如纱布垫并然后应用于损伤组织。
所述药物组合物还可包括其他任选的材料，所述其他任选的材料可根据载体而选择。其他组分包括，但不限制于，防腐剂例如硫柳汞、苯甲醇或对羟苯甲酸酯、增稠剂例如聚乙二醇，透明质酸、carbapol或丙三醇、抗菌剂例如抗生素或抗真菌剂，和充填物质例如乳糖或甘露醇。可添加角蛋白水解剂例如尿素以有助于裂解焦痂组织。
清创组合物的治疗用途
本发明提供了一种用于对无活力组织进行清创的方法，其包括向所述无活力组织应用治疗有效量的根据本发明原则的清创组合物。
根据一个实施方案，用于对无活力组织进行清创的方法包括应用治疗有效量的清创组合物，其中所述清创组合物还含有一种药学上可接受的载体。
本发明的清创组合物可用于治疗创伤。特别地，本发明的清创组合物可用于对创伤进行清创和创伤愈合应用。所述特性可于多个检测情况得以证明，包括动物和人的临床试验。最为广泛使用的分析方法是由Mertz等(Journal Surgical Research(1990)48：245-248)所述的猪的部分皮层烧伤。
对于创伤清创，除了其他指征外，通过焦痂的消失、软化或溶解、对活力组织组分无水解和/或对创伤无刺激确定效果。对于局部创伤愈合，除了其他指征外，通过伤口挛缩、提高的治愈率和/或改善的治疗(即，保持对触觉刺激反应、疤痕形成较少、新生血管形成改善等)。因此，术语“治疗有效量”是指去除焦痂组织和/或促进创伤愈合所需的清创组合物的量。
可使用本发明药物组合物治疗的多种创伤包括，但不限于，全部和部分皮层烧伤创面；溃疡性病损，主要是压迫性(褥疮)溃疡和静脉曲张性溃疡、淤滞溃疡和营养不良性溃疡；外科手术创伤例如截肢、切开、外伤性和化脓性创伤；阴道炎、宫颈炎、包皮环切术，外阴切开术，潜毛性囊肿创伤，痈，晒伤，冻疮以及白内障疤痕组织的治疗。
由本发明的清创组合物或药物组合物对无活力组织进行的清创可单独应用于焦痂组织或通过几种应用进行，只要可实现清创。根据本发明对焦痂组织进行清创的方法可联合其他已知的清创方法进行。
以下提供的实施例提供了对本发明的更完整的理解。所列出用于说明本发明原则的具体技术、条件、材料、比例和记录数据为示例性，并不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1
清创酶的制备
菠萝蛋白酶悬浮液
如下将菠萝蛋白酶SP(4Kg粉末，台湾挑战生物制品有限公司)悬浮于40升pH2.4～2.6和电导性1.0-1.2mS的含0.3M醋酸、1％抗坏血酸和70mg/ml正辛醇的悬浮溶液：悬浮溶液新鲜配制(使用前不超过一天)并预冷至3-5℃。于搅拌下将菠萝蛋白酶缓慢添加至预冷的悬浮溶液中。在10分钟以之后，检测该悬浮溶液的pH，并使用1M醋酸或0.1M氢氧化钠将其调整至2.5-3.5。于3-5℃过夜连续搅拌该悬浮溶液(图1)。
通过压滤器过滤
过夜温育之后，使用相同体积含有0.3M醋酸和1％抗坏血酸的稀释溶液(pH2.4-2.6)稀释上述悬浮液。持续搅拌至少15分钟将助滤剂Celite Hyflo(60g/L；德国，默克)缓慢添加至该稀释悬浮液。然后通过装配有滤板IF 350和CRESPASTE 110(Indastrialfiltro，意大利)的压滤器(Celatom，Difenbach，意大利)过滤该悬浮液以去除不能溶解的组分。在第一轮过滤之后，蛋白质溶液(滤出液)被再循环通过压滤器，收集澄清滤出液并将其预冷至3-5℃。在过滤结束时，使用约20L稀释溶液清洗压滤器，并使用空气进行清洁以从过滤器去除残留蛋白质。将来自过滤器的含残留蛋白质的溶液与滤出液合并并于4-6℃持续搅拌。
使用硫酸铵沉淀
将硫酸铵(285g/L)缓慢添加至搅拌的滤出液。使用1M醋酸或0.1M氢氧化钠将结果产生的溶液的pH调整至2.5-3.5。在10-15分钟之后，停止搅拌，并于3-5℃过夜温育该溶液。
离心
通过于14,000g离心分离含有硫酸铵的蛋白质溶液。弃掉上清液并收集沉淀。
蛋白质溶解
如下在搅拌下于3-5℃过夜将沉淀重新悬浮于新鲜配制的含有0.3M醋酸和1％抗坏血酸的稀释溶液(pH2.4-2.6)：制备稀释溶液并将其预冷至3-5℃。持续搅拌下将沉淀缓慢添加至稀释溶液约15分钟。于3-5℃过夜搅拌悬浮液。
超滤(浓缩和透析)
通过0.5μm Milligard过滤器(Millipore，法国)预过滤悬浮液。收集滤出液。在过滤结束时，使用空气清洁过滤器以去除残留的蛋白质。然后通过含有10kD分子量截留的4膜超滤元件(Millipore；Pelicon-2；10KD)透析过滤滤出的溶液。使用蒸馏水预先清洗装配的超滤系统，然后使用含有0.1M醋酸和1g/l的透析溶液平衡。首先将蛋白质溶液浓缩至约100g/l(约10升)的蛋白质含量并使用4.5-5体积的透析缓冲液透析达到≤3.8mS电导率和pH 3±0.2。于≤15℃搅拌该溶液。在透析过滤结束时，保留液体的体积减小至约5L。然后使用终体积为10L的透析溶液清洗超滤膜。
无菌过滤和冷冻干燥
通过0.5μm Milligard的预过滤器然后通过绝对的0.22μm Millidisk 40过滤器(Millipore，法国)过滤透析过滤的溶液。将滤出液收集至冻干不锈钢托盘并在冻干机(USIFROID，法国)中冻干。将由此制备的冻干清创组合物命名为本发明中的清创酶(Debrase)。
填装
根据预定重量进行冻干的清创酶粉末的填装。将清创酶装入无热原玻璃瓶(30ml，Saint-Gobain，法国)中并使用塑料帽封闭。于-20℃将填装的瓶子贮存于冰箱中。由4Kg菠萝蛋白酶制备的清创酶粉末的量为每批720-750g。
实施例2
清创酶不含菠萝蛋白酶抑制剂
菠萝蛋白酶抑制剂的纯化
将菠萝蛋白酶粉末(2.5g)悬浮于10ml使用醋酸苯汞饱和10分种的0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.1)。离心(3500rpm)10分钟之后，在HiLoad 16/60Superdex 75HPLC制备级柱上，将1ml上清液应用于凝胶过滤色谱，使用相同的缓冲液平衡和洗脱。在上样后30分钟收集5ml馏份。对于每一洗脱的馏份，检测下述三个参数：(i)在280nm的吸光度(A280)；(ii)酯水解活性；及(iii)清创酶酯水解活性的抑制。
按如下方法使用显色底物P-硝基苯基Na-苄氧羰基-L-赖氨酸盐(CLN)在pH4.6下分光光度计检测菠萝蛋白酶馏份的酯水解活性：
于25℃将1ml将含有0.1M KCl和1mM L-半胱氨酸的醋酸钠缓冲液(pH4.6)(10mM)置于塑料容器中。添加100μl的洗脱馏份(在2.5mg/ml浓度)。温育溶液2分钟并然后添加50μl CLN溶液(2.5mM，溶于10％乙腈水溶液)。混合容器，并监测于317nm的持续5分种的吸光度的增加。仅于缓冲液而非洗脱馏份的存在下监测到底物的自发水解。
清创酶的酯水解抑制按如下方法检测：使用各HPLC馏份温育20μl清创酶(0.25mg/ml)，并使用上述的CLN于pH 4.6分光光度计检测清创酶的酯水解活性。
如图2所示，于馏份5-13及14-20洗脱茎菠萝蛋白酶。然而，于馏份22-29洗脱显示有清创酶酯水解活性的抑制的菠萝蛋白酶抑制剂。
表1显示了在不存在或存在洗脱馏份#20-30的情况下清创酶的酯水解活性。如表1所示，馏份22-29抑制了清创酶的酯水解活性。在23-25的馏份获得了最显著的抑制。抑制活性的表观分子量显示为约5-6kDa，由此表明菠萝蛋白酶抑制剂于馏份23-25被洗脱。
表1：在菠萝蛋白酶馏份存在下清创酶的酯水解活性
| 化合物 | 蛋白水解活性 | ％抑制 |
| 清创酶 | 945 | 0 |
| +1mM碘乙酰胺 | 593 | 37.0 |
| +馏份20(5μg) | 938 | 0.7 |
| +馏份21(5μg) | 860 | 9.0 |
| +馏份22(5μg) | 732 | 22.5 |
| +馏份23(5μg) | 172 | 81.7 |
| +馏份24(5μg) | 185 | 80.4 |
| +馏份25(5μg) | 164 | 82.6 |
| +馏份26(5μg) | 457 | 51.6 |
| +馏份27(5μg) | 587 | 37.8 |
| +馏份28(5μg) | 710 | 24.8 |
| +馏份29(5μg) | 802 | 15.1 |
| +馏份30(5μg) | 920 | 2.6 |
清创酶的HPLC分析
进行清创酶和其原料菠萝蛋白酶的尺寸排除色谱以表征和分析这两种酶混合物的区别。将清创酶和菠萝蛋白酶各自应用于TSK凝胶3000SWXLHPLC柱上，在0.4ml/min流速的含130mM NaCl的40mM磷酸盐缓冲液跑柱。
图3显示了在清创酶色谱中仅获得一个蛋白质峰(上图)，而在菠萝蛋白酶色谱中获得了三个峰(下图)。鉴定了菠萝蛋白酶的两个主峰：1号峰被鉴定为茎菠萝蛋白酶，而3号峰被鉴定为菠萝蛋白酶抑制剂。如图3所示，菠萝蛋白酶抑制剂基本无清创酶，因此表明用于制备清创酶的方法能够去除菠萝蛋白酶抑制剂，由此产生无抑制剂的酶组合物。
对于清创酶和根据美国专利第5,830,739号(其内容通过引用并入如同完整描述于本文)制备的蛋白水解混合物所提供的蛋白质进行的SDS聚丙烯酰胺胶凝电泳及之后的质谱分析，显示根据美国专利第5,830,739号制备的蛋白水解混合物含有茎菠萝蛋白酶、茎菠萝蛋白酶前体、ananain、ananain前体以及菠萝蛋白酶抑制剂2片段2，而清创酶含有所有这些酶和酶前体，但不含菠萝蛋白酶抑制剂。因此，这些结果表明制备清创酶的方法可高效去除菠萝蛋白酶抑制剂。
实施例3
清创酶中蛋白质的部分鉴定
按如下方法将清创酶和根据美国专利第5,830,739号制备的蛋白水解混合物各自经受等电聚焦和SDS-PAGE：
在室温将清创酶或蛋白水解混合物的样品悬浮于200μl 5％溶于水的三氟醋酸(TFA)几分钟并同时混合。然后将样品在40℃20,000xg离心30分钟，收集上清液。通过Bradford方法测定蛋白质浓度。将含有100μg蛋白质的上清液样品进行冻干，并使用凝胶再水合溶液(8M尿素；2M硫尿素；5.2μl/ml Pharmalite(pH 3-10)；10mg/ml CHAPS(Sigma化学试剂公司)和2mg/ml DTT)重新溶解，并将其上样于固定化的pH梯度(IPG)条(18cm，3-10线性pH梯度)用于通过于含蛋白质的再水合溶液中温育所述条24小时进行等电聚焦。以下述四个步骤进行等电聚焦：1)0-500伏特梯度1000伏特小时(Vh)；2)500伏特恒电势2500Vh；3)500-3500伏特梯度10000Vh以及4)3500伏特恒电势35000Vh。第二个维度是12.5％丙烯酰胺，2.6％双丙烯酰胺的SDS-PAGE凝胶。在SDS-PAGE结束时，使用胶态考马斯蓝对凝胶进行染色。
图7显示了清创酶的SDS-PAGE的考马斯蓝染色。
图8显示了根据美国专利第5,830,739号制备的蛋白水解混合物的SDS-PAGE的考马斯蓝染色。如上文所述，将清创酶和蛋白水解混合物首先经受电聚焦并然后经受SDS-PAGE。
蛋白质鉴定
从每个考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶切下斑点并于37℃在200μl的200mM NH4NCO3-50％CH3CN中清洗30分钟。然后干燥所清洗的斑点，使用消化溶液(0.02μg ml-1胰蛋白酶(Promega)；40mM NH4NCO3(pH 8.1)；10％CH3CN)再水合，并在37℃温育16小时。通过声裂法于10％CH3CN中提取肽并将提取的肽上样于POROS 50R2(PerSeptive生物系统)微柱进行脱盐。将所述肽直接洗脱至Q-STAR (Applied Biosystems，应用生物系统公司)针并使用Analyst QS软件(Applied Biosystems)测量和分析。从MS/MS分析获得的序列用于在NCBI数据库进行短BLAST搜索。
表5列出了在图7和8中分别标记为1-4和5-9的蛋白质斑点的鉴定。
表5：于清创酶和蛋白水解混合物中鉴定的蛋白水解酶和菠萝蛋白酶抑制剂
如表5中所示，在蛋白水解混合物中但非清创酶中鉴定出三种类型的菠萝蛋白酶抑制剂(菠萝蛋白酶抑制剂-菠萝、菠萝蛋白酶抑制剂VI和VII)。这些结果表明清创酶基本不含抑制剂。
实施例4
清创酶的体内活性
使用了用于评估清创酶的清创效果的体内猪烧伤模型。由于幼龄猪皮肤近似于人的皮肤，已知体内猪烧伤模型为可接受的用于人类表皮热烧伤的模型。
将由包于金属套内的改良的电热辐射元件组成的施以烧伤的装置调整至400℃持续15分钟，以对对称的植皮区沿其中心(脊柱)线3cm造成深度烧伤。通过对着猪皮肤上的凸出的烧伤部位放置带4.5×4.5cm的方形孔的石棉板控制烧伤的尺寸，并且在距离皮肤的标准距离将烧伤施加器连接于所述孔。通过石棉隔板保护邻近的皮肤。在每一边施以5-14对(根据需要)相同数目的深度烧伤。一旦施以了所有烧伤，使用生理盐水浸湿的SkleanerTM海绵擦拭去除焦痂的上部角蛋白层直到显示清洁的暴露的真皮。然后通过将生理盐水浸湿的纱布海绵应用于每个烧伤约1小时的时间对所有烧伤面进行水合，持续重复应用生理盐水以确保烧伤面不干燥。
在大约水合1个小时之后，在周围的健康皮肤上围绕每个烧伤面放置粘性的屏障。然后将5ml溶于水的含有卡波姆(Carbomer)980和磷酸氢二钠的凝胶载体(pH7.4)与0.5g清创酶粉末混合并将其应用于延伸至粘性屏障的内缘且覆盖面积5×5cm的创伤之上。在对照部位，仅使用5ml的凝胶。然后，使用粘着至粘性屏障的封闭薄膜覆盖使用凝胶层覆盖并由粘性屏障围绕的整个创伤。所述封闭薄膜紧密附着于凝胶以致在薄膜下无空气存留。将小温度探针被插入穿过粘性屏障以检测腔室中凝胶的温度，所述温度通过使用加热灯控制在37℃-40℃。整个背面用软棉(纱布)敷料(Kerlix或类似物)覆盖以稳定在不同部位的所有封闭敷料。保留敷料4小时。然后，去除敷料，使用木质压舌板擦拭带有溶解焦痂的凝胶，使用Skleaner洗涤创伤床直至去除所有疏松或溶解的组织。在清洗创伤之后，使用生理盐水浸湿的纱布再浸湿创伤1小时并目测进行评价。
表2：菠萝蛋白酶和清创酶的体内活性
| 清创底物 | 量(g) | 使用的载体 | 量(g) | 终评分 |
| 菠萝蛋白酶(批号0603) | 0.5 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 2.5 |
| 菠萝蛋白酶(批号0603) | 0.5 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 2 |
| 菠萝蛋白酶(批号0603) | 0.25 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 2 |
| 菠萝蛋白酶(批号0603) | 0.25 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 2 |
| 菠萝蛋白酶(批号0603) | 0.125 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 1.5-2 |
| 菠萝蛋白酶(批号0603) | 0.125 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 2 |
| 菠萝蛋白酶(批号0603) | 0.0625 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 1-1.5 |
| 菠萝蛋白酶(批号0603) | 0.0625 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 1.5 |
| 清创酶MD2/D01-04 | 0.5 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 5 |
| 清创酶MD2/D01-04 | 0.5 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 4.5 |
| 清创酶MD2/D01-04 | 0.25 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 4 |
| 清创酶MD2/D01-04 | 0.25 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 4 |
| 清创酶MD2/D01-04 | 0.125 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 3.5 |
| 清创酶MD2/D01-04 | 0.125 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 3.5-4 |
| 清创酶MD2/D01-04 | 0.0625 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 3 |
| 清创酶MD2/D01-04 | 0.0625 | Gel MG20/C05-08 | 0.5 | 3.5 |
如表2所示，发现清创酶在清创烧伤中较菠萝蛋白酶更为有效。例如，0.5g的清创酶产生4.75的平均视觉评分(VAS)(最高得分是5)，与之相比，相同量的菠萝蛋白酶的平均VAS为2.25。另外，0.25g的清创酶对于烧伤的清创明显优于菠萝蛋白酶(各自为VAS 4与VAS 2)。
实施例5
清创酶的体外活性
进行了由清创酶的基于猪皮肤组织碎片消化的体外分析。将猪耳皮片(约直径1cm)烧伤并将其经受清创酶蛋白水解作用。监测由清创酶对组织的裂解时间。根据如下方法进行分析：
通过将皮肤与软骨分离并去除多余脂肪制备猪耳皮肤。煮沸猪耳皮片20分钟并将其放置于持皮器底部，并上面使用5ml PD-Tip，在顶部固定上方的持皮器。将清创酶或菠萝蛋白酶与水相(例如，Gel、Silverol或缓冲液)混合并使用装配有塑料管的注射器或吸量管将其应用于细胞底部。检测猪耳皮肤的裂解时间。
结果
表3：清创酶的体外清创活性
表4：菠萝蛋白酶的体外清创活性
表3和4显示了清创酶与菠萝蛋白酶之间的体外活性差异。表3和图4显示了在清创酶溶于缓冲液12.5mg/ml的浓度下于56.7±9.81分钟内对烧伤的猪耳皮肤进行了清创。较高浓度的清创酶没有产生较快速的清创。较低浓度的清创酶在较长的时间段产生清创。用于清创酶的检测限为3.15mg/ml(115.35±15.5分钟)。
结果还显示在组织清创中较低浓度清创酶较其原料菠萝蛋白酶更有效(见图4和图5)。如图6所示，低浓度(0-5mg/ml)和高浓度(20-50mg/ml)清创酶和菠萝蛋白酶表现有相似的裂解时间。然而，在对猪耳皮肤的裂解中，在5-20mg/ml的浓度清创酶显示较菠萝蛋白酶快一倍。
本领域技术人员应该理解本发明不受上述特别显示和描述的内容的限制。而本发明的范围由下述的权利要求所限定。
Claims (17)
1.一种由菠萝蛋白酶获得的清创组合物，所述清创组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的清创组合物，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的10％w/w。
3.根据权利要求2所述的清创组合物，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的5％w/w。
4.根据权利要求3所述的清创组合物，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的2％w/w。
5.根据权利要求4所述的清创组合物，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的1％w/w。
6.根据权利要求1所述的清创组合物，其基本由从HPLC尺寸排除柱TSK-Gel 3000SWXL洗脱的单一蛋白质峰组成，所述单一蛋白质峰构成具有分子量为约23kDa的蛋白质。
7.根据权利要求1至6任一项所述的清创组合物，其还含有一种药学上可接受的载体。
8.一种由菠萝蛋白酶获得清创组合物的方法，所述清创组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂，所述方法包括以下步骤：
(a)使用选择性含有抗氧化剂的一种酸性溶液悬浮菠萝蛋白酶，所述酸性溶液pH范围为从约2.4至约4；
(b)调整步骤(a)的悬浮液至pH范围为从约2.4至约4；
(c)添加助滤剂至步骤(b)的悬浮液；
(d)过滤步骤(c)的悬浮液以去除不溶解的组分；
(e)向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐以得到范围在从约40％到约50％的硫酸铵饱和度；
(f)调整步骤(e)的悬浮液至pH范围为从约2.5至约4；
(g)在3℃-10℃温育步骤(f)的悬浮液；
(h)离心步骤(g)的悬浮液以得到硫酸铵沉淀；
(i)将所述硫酸铵沉淀溶解于选择性含有抗氧化剂pH范围为从约2.4至约4的酸性溶液；
(j)过滤步骤(i)的溶液使得保留分子量大于约10kDa的蛋白水解酶；并且
(k)冻干步骤(j)的保留溶液。
9.根据权利要求8所述的由菠萝蛋白酶获得清创组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使用选择性含有1％抗坏血酸和正辛醇pH为约2.4至约2.6的0.3M醋酸悬浮菠萝蛋白酶；
(b)调整步骤(a)的悬浮液至pH范围为从约2.5至约3.5；
(c)添加包括二氧化硅的助滤剂至步骤(b)的悬浮液；
(d)通过压滤器过滤步骤(c)的悬浮液以去除不溶解的组分；
(e)向步骤(d)的过滤溶液添加硫酸铵盐(285g/L)以得到约40％的硫酸铵饱和度；
(f)调整步骤(e)的悬浮液至pH为从约2.5至约3.5；
(g)在4℃温育步骤(f)的悬浮液约12-24小时；
(h)离心步骤(g)的悬浮液以得到硫酸铵沉淀；
(i)将所述硫酸铵沉淀溶解于含1％坏血酸pH为从约2.4至约2.6的0.3M醋酸；
(j)通过10kDa超滤器过滤步骤(i)的溶液使得保留分子量大于约10kDa的蛋白水解酶；
(k)过滤步骤(j)的保留溶液以得到无菌溶液；并且
(l)冻干步骤(k)的过滤溶液。
10.一种通过对无活力组织进行清创而治疗创伤的方法，其包括向所述创伤应用治疗有效量的由菠萝蛋白酶获得的清创组合物，所述清创组合物含有分子量约23kDa的蛋白水解酶，所述组合物基本不含菠萝蛋白酶抑制剂。
11.根据权利要求10所述的治疗创伤的方法，其中所述菠萝蛋白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的10％w/w。
12.根据权利要求11所述的治疗创伤的方法，其中所述的菠萝蛋白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的5％w/w。
13.根据权利要求12所述的治疗创伤的方法，其中所述的菠萝蛋白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的2％w/w。
14.根据权利要求13所述的治疗创伤的方法，其中所述的菠萝蛋白酶抑制剂少于所述清创组合物的蛋白质含量的1％w/w。
15.根据权利要求10所述的治疗创伤的方法，其中所述清创组合物基本由从HPLC尺寸排除柱TSK-Gel 3000SWXL洗脱的单一蛋白质峰组成，所述单一蛋白质峰构成分子量为约23kDa的蛋白质。
16.根据权利要求10至15任一项所述的治疗创伤的方法，其中所述清创组合物还含有一种药学上可接受的载体。
17.根据权利要求10至16任一项所述的治疗创伤的方法，其中所述创伤选自下述组成的组：全部和部分皮层烧伤创面，晒伤，冻伤，溃疡性病损，压迫性(褥疮)溃疡，静脉曲张性溃疡，淤滞溃疡，营养不良性溃疡，与外科手术操作、截肢术、切开、包皮环切术和外阴切开术有关的创伤，外伤性创伤和化脓性创伤，阴道炎，宫颈炎，潜毛性囊肿创伤，白内障疤痕组织以及皮肤移植部位。
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