KR101235544B1

KR101235544B1 - 브로멜라인으로부터 획득된 괴사조직제거 조성물 및 이의생산 방법

Info

Publication number: KR101235544B1
Application number: KR1020077013257A
Authority: KR
Inventors: 마리안 고렉키; 아미르 토렌
Original assignee: 메디운드 리미티드
Priority date: 2004-11-22
Filing date: 2005-11-22
Publication date: 2013-02-21
Also published as: JP5053096B2; MX2007006074A; IL183184A; AU2005305461A1; CA2587951A1; HK1124639A1; JP2008520651A; ES2389810T3; EP1824775A2; BRPI0518050A; DK1824775T3; WO2006054309A2; WO2006054309A3; US8119124B2; CA2587951C; US20120171187A1; PT1824775E; PL1824775T3; IL183184A0; US20090148429A1

Abstract

본 발명은 브로멜라인(bromelain)으로부터 획득된 괴사조직제거 조성물(debriding composition) 및 이를 생산하는 방법에 관계한다. 구체적으로, 본 발명은 브로멜라인으로부터 획득되고 대략 23 kDa의 분자량을 갖는 단백분해 효소를 함유하며 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는 괴사조직제거 조성물 및 이를 함유하는 제약학적 조성물에 관계한다. 괴사조직제거 조성물 및 이를 함유하는 제약학적 조성물은 건조 가피(eschar) 조직의 괴사조직제거 및 상처 치유에 특히 유용하다.

브로멜라인(bromelain)

Description

브로멜라인으로부터 획득된 괴사조직제거 조성물 및 이의 생산 방법{DEBRIDING COMPOSITION FROM BROMELAIN AND METHODS OF PRODUCTION THEREOF}

수술 없이, 활력을 잃은 조직을 제거할 수 있는 괴사조직제거 제제를 개발하기 위한 많은 노력이 있어 왔다. 활력을 잃은 조직은 모든 질병 과정에서 형성되는데, 이런 과정은 피부 병소, 예를 들면, 욕창(decubitus ulcers), 압박 괴사(pressure necrosis), 절개, 화상에 연관된다. 효과적인 괴사조직제거가 필수적인데, 그 이유는 활력을 잃은 조직이 기회적 감염(opportunistic infection)의 우수한 배양 매체이기 때문이다. 감염에 기인한 패혈증(septicemia)은 대부분의 심한 화상 환자에서 주요 사망 원인이다.

활력을 잃은 조직의 효과적인 조기 괴사조직제거를 달성하기 위한 단백분해 효소와 화학 작용제의 이용은 만족스런 괴사조직제거를 산출하지 못하였다. 타닌산(tannic acid), 살리실산(salicylic acid), 피루빈산(pyruvic acid)과 같은 화학 작용제는 이미 손상된 조직에 추가적인 손상을 유발하는 것으로 밝혀졌다.

파파인(papain), 핀구이나인(pinguinain), 트립신(trypsin), 피브리노리신(fibrinolysin), 스트렙토키나아제(streptokinase)를 비롯한 단백분해 효소가 괴사조직제거 작용제로서 보고되었다. U.S. Patent No. 5,505,943에서는 괴사 조직의 구성요소를 가수분해함으로써 상처를 치료하는, 비브리오(Vibrio) 속의 미생물에 의해 생산된 프로테아제를 함유하는 조성물을 기술한다.

하지만, 정제된 단백분해 효소에 의한 괴사조직제거는 다양한 단점이 발생하는데, 그 이유는 이들 정제된 효소가 장기간 동안 여러 번의 적용을 필요로 하고, 효능이 불량하고, 독성 부작용을 나타내고, 선택성이 없기 때문이다.

파인애플 나무(Ananas comosus)의 줄기로부터 유래된 추출물은 활력을 잃은 조직을 선택적으로 제거하는 것으로 밝혀졌다. 브로멜라인(bromelain)이라고 하는 이들 추출물은 다양한 단백분해와 가수분해 효소를 함유한다.

U.S. Patent No. 4,197,291에서는 포유동물 호스트로부터 활력을 잃은 조직을 제거할 수 있는, 브로멜라인으로부터 획득된 효소 산물을 기술하는데, 상기 효소 산물은 카세인분해 활성(caseinolytic activity)이 없고 대략 6의 피크 등전점(peak isoelectric point)을 보유하는 수용성 열불안정성 단백질을 함유한다. 상기 단백질은 적어도 2개의 아단위를 포함하는데, 이들 각각은 대략 14.3 내지 15 kDa의 분자량을 갖고 자외선 스펙트럼 영역 내에 280 nm에서 특징적인 흡수 피크를 보유한다. U.S. Patent No. 4,197,291에 기술된 바와 같은 효소 산물을 제조하는 절차는 아세톤으로 단백질 침전, 티오글리콜산(thioglycolic acid)을 포함하는 아세트산염 완충액으로 상기 침전물의 추출, 대략 50 kDa의 분자량 컷오프(molecular weight cut off)를 갖는 막을 통한 상기 용액의 여과, 여과액의 겔 여과, 등전 집중(isoelectric focusing)을 포함한다. 이렇게 제조된 효소 산물은 14.3 내지 15 kDa의 분자량을 갖는 적어도 2개, 아마도 3개의 아단위를 보유한다. U.S. Patent No. 4,226,854에서는 U.S. Patent No. 4,197,291에 기술된 효소 산물을 이용한, 활력을 잃은 조직의 괴사조직제거 방법을 기술한다.

더 나아가, U.S. Patent No. 4,329,430에서는 활력을 잃은 조직을 절개하고 분해하는데 유용한, 브로멜라인으로부터 유래된 단백분해 효소 혼합물을 기술한다. 이러한 열분안정성 수용성 단백분해 효소 혼합물은 카세인분해 활성이 없고 대략 6의 등전점을 보유하는 가수분해 효소인 에스카라제(escharase)를 함유하는데, 이는 적어도 2개의 아단위를 포함하고, 이들 각각은 대략 14.3 내지 15 kDa의 분자량을 갖는다. 이러한 단백분해 효소 혼합물의 모든 구성요소는 대략 30 내지 50 kDa의 고유 분자량을 갖는데, 그 이유는 상기 효소 혼합물이 50 kDa의 분자량 컷오프를 보유하는 막을 통하여 여과되고 30 kDa의 분자량 컷오프를 보유하는 막 상에 농축되기 때문이다. 단백분해 효소 혼합물로 획득된 이러한 재현가능성 결과는 상기 효소 혼합물이 기존에 공개된 단백분해 효소 제조물 내에 명백하게 존재했던 저해물질을 함유하지 않는다는 사실에 기인하는 것으로 생각된다. 하지만, 이러한 저해물 질의 활성의 검출을 위한 기준이 없다.

U.S. Patent No. 4,307,081에서는 활력을 잃은 조직을 절개하고 분해하는 방법을 기술하는데, 상기 방법은 U.S. Patent No. 4,329,430에 기술된 단백분해 효소 혼합물과 상기 조직을 접촉시키는 단계를 포함한다.

파인애플 나무은 다양한 단백분해 효소의 공급원이다. 가령, U.S. Patent No. 5,106,621에서는 대략 25 kDa의 분자량을 갖고 코우마릴아마이드(coumarylamide) 기질(substrate)에 대한 활성을 나타내며 파인애플 나무로부터 유래되는 정제된 시스테인 단백분해효소를 기술한다. 특히, U.S. Patent No. 5,106,621은 시스테인 단백분해효소 아나나인(ananain)과 코모사인(comosain)에 관계하는데, 이들은 줄기 브로멜라인과 상이한 물리화학적 특성을 나타낸다. 대략 17 kDa 내지 21 kDa의 분자량을 갖는 정제된 티올 활성화된 프로테아제(α-브로멜라인)가 U.S. Patent No. 5,387,517에서 기술되는데, 이는 괴사조직제거 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 브로멜라인은 산성 인산효소(acid phosphatase)와 과산화효소(peroxidase)를 포함하고 아밀라아제(amylase)와 셀룰라아제(cellulase) 활성을 보유한다. U.S. Patent No. 6,335,427에서는 브로멜라인으로부터 25 kDa 단백질의 정제를 교시하는데, 상기 단백질은 항암 활성을 보유하는 것으로 밝혀졌다.

Peristein과 Kezdy(J. Supramol. Struct. 1: 249-254, 1973)는 상업적 브로멜라인 아세톤 분말로부터 7개의 밀접하게 관련된 프로테아제 저해물질, 다시 말하면, 브로멜라인 저해물질 I-VII을 확인하였다. 이들 저해물질은 5000-6000 Dalton 의 분자량을 갖고 50개 아미노산 잔기와 5개의 이황화결합을 보유하는 것으로 밝혀졌다(Peristein and Kezdy, ibid). 7개의 저해물질 중에서 하나의 일차 구조 분석에서 광범위한 미세불균일성(microheterogeneity)이 확인되었다(Reddy, M.N. et al. J. Biol. Chem. 250: 1741-1750, 1975).

U.S. Patent No. 5,830,739에서는 브로멜라인으로부터 에스카라제와 다른 단백분해 효소의 안정한 혼합물을 제조하는 방법을 기술하는데, 상기 방법은 브로멜라인을 희석된 아스코르브산 용액으로 추출하고, 에스카라제와 다른 단백분해 효소를 황산암모늄으로 처리하는 단계를 포함한다. 더 나아가, U.S. Patent No. 5,830,739에서는 이러한 황산암모늄 침전물이 10 kDa 한외필터 상에서 증류수로 세척될 수 있다고 교시한다. 에스카라제의 안정적인 혼합물을 제조하는 이러한 방법은 더욱 많은 양의 에스카라제를 산출하는 것으로 밝혀졌다. 하지만, 이러한 혼합물에서 브로멜라인 저해물질이 존재하지 않는다는 증거가 없다.

브로멜라인으로부터 분리된 정제된 다른 효소는 비-생존 조직의 괴사조직제거에서, 브로멜라인으로부터 획득된 단백분해 효소 혼합물만큼 유효하지 않은 것으로 밝혀졌다. 하지만, 브로멜라인으로부터 획득되고 브로멜라인 저해물질을 비롯한 최대 50 kDa의 분자량의 단백질을 함유하는 단백분해 효소는 비-생존 조직의 괴사조직제거에서, 브로멜라인으로부터 획득되고 30 내지 50 kDa 분자량의 단백질을 함유하는 효소 혼합물만큼 유효하지 않은 것으로 밝혀졌는데, 상기 효소 혼합물에는 이들 저해물질이 존재하지 않는 것으로 생각된다.

이와 같은 효소 혼합물은 인간 임상 용도를 목적하기 때문에 브로멜라인으로 부터 생화학적으로 특성화된 새로운 효소 혼합물을 수득하는 것이 여전히 요구되는데, 상기 혼합물은 독특하고 재현가능한 생화학적 특징을 보유하고, 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않으며, 브로멜라인의 단백분해 효소의 대부분을 함유하고, 따라서 비-생존 조직의 효과적인 괴사조직제거가 달성된다.

본 발명의 요약

본 발명은 브로멜라인으로부터 획득되고 비-생존 조직을 제거할 수 있으며 독특한 생화학적 특징을 보유하는 괴사조직제거 조성물을 제시한다. 구체적으로, 본 발명은 브로멜라인으로부터 획득되고 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는 것으로 생화학적으로 특성화되며 브로멜라인의 단백분해 효소의 대부분을 함유하는 괴사조직제거 조성물을 제시한다. 이렇게 획득된 효소 조성물은 비-생존 조직의 괴사조직제거에 매우 효과적이다.

브로멜라인으로부터 획득되고 브로멜라인의 단백분해 효소의 대부분을 함유하지만 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는 효소 조성물이 브로멜라닌보다 우수한 괴사조직제거 활성을 보유한다는 것은 본 발명에서 최초로 개시된다. 브로멜라인은 HPLC 크기 배제 칼럼으로부터 용리될 때, 대략 6, 17.5, 23 kDa의 분자량을 갖는 적어도 3개의 주요 단백질 피크를 보유하는 반면, 본 발명의 효소 조성물은 동일한 HPLC 크기 배제 칼럼에 적용될 때, 대략 23 kDa의 분자량을 갖는 1개의 유력한 단백질 피크를 포함하는 것으로 후술된다. 이러한 효소 조성물은 단백질 함량에서 재현성이 높고, 따라서 임상 용도에 유리하다.

본 발명에 따른 효소 조성물을 제조하는 방법은 항-산화제를 선택적으로 함 유하는 산성 용액으로 상업적으로 구입가능한 브로멜라인 분말을 추출하고, 필터 보조물질을 추가하고, 현탁액을 여과하여 불용성 성분을 제거하고, 용액에 황산암모늄 염을 추가함으로써 단백분해 효소를 침전시키고, 항-산화제를 선택적으로 함유하는 산성 용액으로 황산암모늄 침전물을 용해시키고, 용액을 여과하여 대략 10 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 존속시키는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 브로멜라인으로부터 획득된 괴사조직제거 조성물을 제시하는데, 이러한 괴사조직제거 조성물은 대략 23 kDa의 분자량을 갖는 단백분해 효소를 함유하고 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는다. “실질적으로 존재하지 않는”은 정제되지 않은 브로멜라인 추출물 내에 존재하는 양에 비하여 미미한 양의 브로멜라인 저해물질을 함유하는 조성물을 지시한다.

일부 구체예에서, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 10% w/w 이하의 단백질 함량으로 존재한다. 바람직하게는, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 5% w/w 이하의 단백질 함량으로 존재하고, 더욱 바람직하게는, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 2% w/w 이하의 단백질 함량으로 존재하고, 가장 바람직하게는, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 1% w/w 이하의 단백질 함량으로 존재한다.

다른 구체예에서, 괴사조직제거 조성물은 HPLC 크기 배제 칼럼 TSK-Gel 3000_SWXL로부터 용리이후 단일 단백질 피크를 포함하고, 상기 단일 단백질 피크는 대략 23 kDa의 분자량을 갖는 단백질에 상응한다.

다른 구체예에서, 단일 단백질 피크는 HPLC 크기 배제 칼럼에 적용된 괴사조직제거 조성물의 단백질 함량의 적어도 50% w/w의 수율에서 획득된다. 다른 구체예에서, 주요 단백질 피크는 괴사조직제거 조성물의 단백질 함량의 적어도 60% w/w의 수율에서 획득된다. 다른 구체예에서, 주요 단백질 피크는 상기 칼럼에 적용된 괴사조직제거 조성물의 단백질 함량의 적어도 70% w/w의 수율에서 획득된다.

다른 구체예에서, 본 발명의 원리에 따라 브로멜라인으로부터 획득된 괴사조직제거 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체를 더욱 함유한다.

다른 측면에서, 본 발명은 브로멜라인으로부터 괴사조직제거 조성물을 획득하는 방법을 제시하는데, 상기 괴사조직제거 조성물은 대략 23 kDa의 분자량을 갖는 단백분해 효소를 함유하고 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않으며, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:

(a) 항-산화제를 선택적으로 함유하는 산성 용액으로 브로멜라인을 현탁시키고, 상기 산성 용액은 대략 2.4 내지 4 범위의 pH를 보유하고;

(b) (a)의 현탁액을 대략 2.4 내지 4 범위의 pH로 조정하고;

(c) 필터 보조물질을 (b)의 현탁액에 추가하고;

(d) (c)의 현탁액을 여과하여 불용성 성분을 제거하고;

(e) (d)의 여과된 용액에 황산암모늄 염을 추가하여 대략 40% 내지 50% 범위에서 황산암모늄의 포화를 유도하고;

(f) (e)의 현탁액을 대략 2.5 내지 4 범위의 pH로 조정하고;

(g) (f)의 현탁액을 3℃-10℃에서 항온처리하고;

(h) (g)의 현탁액을 원심분리하여 황산암모늄 침전물을 산출하고;

(i) 항-산화제를 선택적으로 함유하고 대략 2.4 내지 4 범위의 pH를 보유하는 산성 용액에 황산암모늄 침전물을 용해시키고;

(j) (i)의 용액을 여과하여 대략 10 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 존속시키고;

(k) (j)의 존속된 용액을 냉동 건조시킨다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 브로멜라인으로부터 괴사조직제거 조성물을 획득하는 방법을 제시하는데, 상기 괴사조직제거 조성물은 대략 23 kDa의 분자량을 갖는 단백분해 효소를 함유하고 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않으며, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다::

(a) 1% 아스코르브산과 n-옥탄올을 함유하고 대략 2.4 내지 2.6의 pH를 보유하는 0.3 M 아세트산으로 브로멜라인을 현탁시키고;

(b) (a)의 현탁액을 대략 2.5 내지 3.5 범위의 pH로 조정하고;

(c) 실리카를 포함하는 필터 보조물질을 (b)의 현탁액에 추가하고;

(d) 필터 프레스(filter press)를 통하여 (c)의 현탁액을 여과하여 불용성 성분을 제거하고;

(e) (d)의 여과된 용액에 황산암모늄 염(285 g/ℓ)을 추가하여 황산암모늄의 40% 포화를 유도하고;

(f) (e)의 현탁액을 대략 2.5 내지 3.5 범위의 pH로 조정하고;

(g) (f)의 현탁액을 4℃에서 대략 12-24시간동안 항온처리하고;

(i) 1% 아스코르브산을 함유하고 대략 2.4 내지 2.6의 pH를 보유하는 0.3 M 아세트산에 황산암모늄 침전물을 용해시키고;

(j) 10 kDa 한외-필터를 통하여 (i)의 용액을 여과하여 대략 10 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 존속시키고;

(k) (j)의 존속된 용액을 여과하여 무균 용액을 산출하고;

(l) (k)의 여과된 용액을 냉동 건조시킨다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 비-생존 조직을 제거(debridement)함으로써 상처를 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은 본 발명의 원리에 따른 괴사조직제거 조성물을 이들 조직에 적용하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 전층이나 부분층 화상 상처, 일광화상, 동상; 궤양 병소, 예를 들면, 압창(욕창), 정맥류성 궤양(varicose ulcer), 정체성 궤양(stasis ulcer), 영양성 궤양(trophic ulcer); 외과 절차, 예를 들면, 절단, 절개, 포경수술과 회음절개술(episiotomy)과 연관된 상처; 외상성과 화농성 상처; 질염; 자궁경관염; 모소낭(pilonidal cyst) 상처; 백내장 상처 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 상처가 본 발명의 제약학적 조성물로 치료될 수 있다. 본 발명의 제약학적 조성물은 피부 이식 부위의 제조에도 유용하다.

본 발명의 이들 구체예는 아래의 도면, 상세한 설명, 실시예, 특허청구범위를 참조하면 더욱 명확하게 이해될 것이다.

도 1에서는 브로멜라인으로부터 Debrase를 제조하는 방법의 개요를 도시한다.

도 2에서는 브로멜라인의 정제되지 않은 추출물의 크기 배제 크로마토그램을 도시한다. 브로멜라인 분말은 페닐 수은 아세테이트로 포화된 인산염 완충액 pH 6.1로 추출하고 원심분리하였다. 상층액은 예비 크기 배제 HPLC 칼럼에 적용하고 동일한 완충액으로 용리하였다. 분획물은 회수하였다. 사각형은 280 nm에서 흡광도를 나타내고, 원은 Debrase 에스테르분해 활성(esterolytic activity)의 저해 %를 나타낸다.

도 3에서는 Debrase(위쪽 패널)와 브로멜라인(아래쪽 패널)의 크기 배제 크로마토그램을 도시한다. 브로멜라인은 크기 배제 크로마토그래피를 수행하면, 각각, 32분, 35분, 40분에 3개의 단백질 피크(즉, 피크 1, 2, 3)가 나타났다(아래쪽 패널). Debrase은 동일한 크기 배제 크로마토그래피를 수행하면, 대략 32분에 1개의 단백질 피크만 나타났다(위쪽 패널). 브로멜라인의 크로마토그래피에서 나타난 피크 2와 3은 Debrase 크로마토그램에서는 검출되지 않았다. 피크 3은 브로멜라인 저해물질로서 확인되었고, 피크 2는 오염물질 또는 저해물질인 것으로 생각되었다.

도 4에서는 돼지 귀 피부에 대한 2가지 Debrase 제제의 괴사조직제거 활성을 도시한다. 돼지 귀 피부 조각의 찢어짐 시간(tear off time)은 Debrase 농도의 함수로서 측정되었다.

도 5에서는 돼지 귀 피부에 대한 2가지 브로멜라인 제제의 괴사조직제거 활성을 도시한다. 돼지 귀 피부 조각의 찢어짐 시간(tear off time)은 브로멜라인 농 도의 함수로서 측정되었다.

도 6에서는 돼지 귀 피부에 대한 Debrase와 브로멜라인의 괴사조직제거 활성을 도시한다. 돼지 귀 피부 조각의 찢어짐 시간(tear off time)은 Debrase와 브로멜라인 농도의 함수로서 측정되었다.

도 7에서는 브로멜라인으로부터 획득된 Debrase의 2차원 겔 전기영동을 도시한다. Debrase는 브로멜라인(하기 실시예 1 참조)으로부터 분리하고 2-차원 겔 전기영동을 수행하였다. 1-4로 지정된 4개의 단백질 반점(spot)은 MS/MS 분석으로 확인하였다.

도 8에서는 브로멜라인으로부터 획득된 단백분해 혼합물의 2차원 겔 전기영동을 도시한다. 단백분해 혼합물은 US 5,830,739에 기술된 절차에 따라 브로멜라인으로부터 제조하였다. 상기 혼합물은 2-차원 겔 전기영동을 수행하고, 5-9로 지정된 5개의 단백질 반점(spot)은 MS/MS 분석으로 확인하였다.

본 발명은 브로멜라인으로부터 획득된 괴사조직제거 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 대략 23 kDa의 분자량의 분자량을 갖는 단백분해 효소를 함유하고 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는다. 더 나아가, 본 발명은 상기 괴사조직제거 조성물을 획득하는 방법 및 이의 이용 방법을 제시한다.

U.S. Patent No. 5,830,739에 기술된 바와 같은, 브로멜라인으로부터 단백분해 혼합물을 제조하는 방법에 2가지 새로운 단계, 다시 말하면, 필터 보조물질과 여과의 추가가 개선된 생화학적/생물학적 특징을 갖는 괴사조직제거 조성물의 획득을 가능하게 한다는 것은 본 발명에서 최초로 개시된다. 본 발명의 괴사조직제거 조성물은 브로멜라인의 단백분해 효소, 다시 말하면, 대략 10 kDa를 초과하는 분자량을 갖지만 저분자량 단백질, 다시 말하면, 대략 5-6 kDa의 분자량을 갖는 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는 효소의 대부분을 함유한다. 이러한 조성물은 브로멜라인보다 우수한 괴사조직제거 활성을 나타내고 재현가능한 단백질 함량을 보인다.

한 측면에서, 본 발명은 브로멜라인으로부터 획득되는 괴사조직제거 조성물을 제시하는데, 상기 괴사조직제거 조성물은 대략 23 kDa의 분자량을 갖는 단백분해 효소를 함유하고 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는다.

본 명세서와 특허청구범위에서, “브로멜라인”은 현재 상업적으로 구입가능한 브로멜라인 분말 제제를 지시한다. 브로멜라인 제조업체의 예에는 Sigma and Challenge Bioproducts Co. Ltd.(Taiwan)가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 브로멜라인은 파인애플 나무의 줄기로부터 제조된다. 브로멜라인을 획득하는 전형적인 절차는 아래와 같다: 파인애플 나무의 줄기로부터 분비액은 먼저, 인산(phosphoric acid)으로 대략 3 또는 4의 pH로 조정하고, 나트륨 하이드리드(sodium hydride) 또는 나트륨 설피드리드(sodium sulfhydride)를 첨가하여 설피드릴 산화로부터 보호한다. 불활성 물질은 대략 30% 아세톤에서 침전시키고, 여과이후, 정화된 액체는 70% 아세톤으로 침전시켰다. 침전물은 원심분리로 회수하고, 이후 인산으로 산성화된 나트륨 하이드리드 또는 나트륨 설피드리드를 함유하는 물에 재용해시키고 재침전시키거나, 또는 진공 오븐 내에서 직접 건조시킨다. 상기 물질이 재첨전되는 경우에, 70% 아세톤이 사용된다. 이러한 공정으로 생성된 건조 물질은 본 발명의 괴사조직제거 조성물을 획득하기 위한 출발 물질로서 적합하다.

30 kDa 컷-오프(cut-off) 막 상에서 용액을 농축시키는 단계를 포함하는, 브로멜라인으로부터 단백분해 혼합물을 획득하는 기존에 공개된 방법이 브로멜라인 저해물질을 제거하는 것으로 제안되었다(참조: U.S. Patent No. 4,329,430). 하지만, U.S. Patent No. 4,329,430에 기술된 방법은 30 kDa 컷-오프 막 상에서 용액을 농축시키는 단계를 포함하기 때문에, 최대 30 kDa의 분자량을 갖는 다른 단백질 역시 이러한 농축에 의해 제거되었다. 다른 기존에 공개된 방법은 10 kDa 컷-오프 막을 통하여 추출물을 여과하는 단계를 포함하지만(참조: U.S. Patent No. 5,830,739), 브로멜라인 저해물질 활성의 부재에 대한 증거가 제시되지 않았다. 선행 기술과 대조적으로, 본 발명에서는 브로멜라인으로부터 괴사조직제거 조성물을 더욱 정제하고 괴사조직제거 조성물을 생화학적으로 특성화하는 수단을 제시한다. 이런 이유로, 본 발명의 원리에 따라 획득된 괴사조직제거 조성물은 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않고 비-생존 조직의 괴사조직제거에서 기존에 공개된 방법보다 더욱 우수한 것으로 밝혀졌다.

브로멜라인 저해물질은 대략 5-6 kDa의 분자량을 갖는 폴리펩티드이다(참조: Perlstein, S.H. and Kezdy, F.J., Suprarmol. Struct. 1: 249-254, 1973). 아래에 기술된 실시예에서, 본 발명의 원리에 따라 브로멜라인으로부터 획득되는 괴사조직제거 조성물은 대략 10 kDa를 초과하는 겉보기 분자량(apparent molecular weight)을 갖고 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는다. 단백질의 분자량과 관련하여 “대략”은 상기 단백질의 분자량의 2 kDa 초과 또는 미만을 의미한다. 가령, 단백질이 대략 10 kDa의 분자량을 갖는 경우에, 상기 단백질의 분자량은 8 kDa 내지 12 kDa 범위일 수 있다.

“실질적으로 존재하지 않는”은 정제되지 않은 브로멜라인 추출물, 다시 말하면, 본 발명의 괴사조직제거 조성물이 획득되는 출발 물질 내에 존재하는 양에 비하여 미미한 양의 브로멜라인 저해물질을 함유하는 조성물을 지시한다. 본 명세서에서 “미미한 양”은 브로멜라인 저해물질이 괴사조직제거 조성물의 단백질 함량의 10% w/w 이하가 된다는 것을 의미한다. 적절하게는, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 단백질 함량의 5% w/w 이하, 더욱 바람직하게는, 괴사조직제거 조성물의 단백질 함량의 2% w/w 이하, 가장 바람직하게는, 괴사조직제거 조성물의 단백질 함량의 1% w/w 이하가 된다.

(a) 대략 2.4 내지 4 범위의 pH를 보유하는 산성 용액으로 브로멜라인을 현탁시키고;

(b) (a)의 현탁액을 대략 2.4 내지 4 범위의 pH로 조정하고;

(c) 필터 보조물질을 (b)의 현탁액에 추가하고;

(d) (c)의 현탁액을 여과하여 불용성 성분을 제거하고;

(f) (e)의 현탁액을 대략 2.5 내지 4 범위의 pH로 조정하고;

(g) (f)의 현탁액을 3℃-10℃에서 항온처리하고;

(k) (j)의 존속된 용액을 냉동 건조시킨다.

본 발명에 따라, 브로멜라인의 현탁은 대략 2.4 내지 4 사이의 pH를 보유하는 임의의 산성 용액에서 수행된다. 본 발명에 사용될 수 있는 산성 용액이나 완충액의 실례에는 물에 녹인 아세트산, 아세트산염 완충액, 1% 티오글리콜산을 함유하는 아세트산염 완충액, pH 2.4-4가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 전형적인 구체예에 따라, 산성 용액은 U.S. Patent No. 5,830,739와 4,197,291에서 기술된 완충액과 용액에서 선택된다.

산성 용액은 선택적으로, 항-산화제를 함유할 수 있다. 항-산화제의 실례에는 아스코르브산, 디하이드로퀴논(dihydroquinon), 부틸화된 하이드록시톨루엔(hydroxytoluene), 디티오트레이톨(dithiothreitol)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 항-산화제는 대략 0.5% 내지 2%, 바람직하게는, 1%의 농도로 추가될 수 있다.

산성 용액은 습윤제(wetting agent)를 더욱 함유할 수 있다. 습윤제의 실례에는 n-옥탄올이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

항-산화제를 선택적으로 함유하는 산성 용액의 pH는 대략 2.4 내지 4의 범위이다. 바람직한 구체예에서, 항-산화제를 선택적으로 함유하는 산성 용액의 pH는 대략 2.4 내지 2.6의 범위이다. 용액이나 현탁액의 pH와 관련하여, “대략”은 지정된 pH의 0.1 pH 단위 초과 또는 미만이 본 발명의 범위 내에 속한다는 것을 지시한다.

본 발명에 따라, 필터 보조물질(filter aid)이 (a)의 현탁액에 추가된다. 한 구체예에서, 필터 보조물질은 실리카를 포함한다. 적절하게는, 필터 보조물질은 하소되는 천연 규조토(diatomite)이고, 따라서 더욱 빠른 유속이 달성된다.

원하는 단백질의 침전은 단계 (d)의 여과된 용액에 황산암모늄 염을 추가함으로써 수행된다. 황산암모늄 염은 대략 40% 내지 50% 사이의 범위에서 황산암모늄의 포화를 유도하기 위하여 추가될 수 있다. 적절하게는, 황산암모늄 염은 황산암모늄의 40% 포화를 유도하기 위하여 추가될 수 있다.

이후, 단계 (f)의 현탁액은 3℃ 내지 10℃ 사이의 온도에서 항온처리된다. 적절하게는, 단계 (f)의 현탁액은 3℃ 내지 10℃ 사이의 온도에서 적어도 10 시간동안 항온처리된다. 더욱 적절하게는, 단계 (f)의 현탁액은 4℃에서 12-24 시간동안 항온처리된다.

항온처리의 종결 시점에서, 단계 (g)의 현탁액은 원하는 단백질, 다시 말하면, 단백분해 효소를 침전시키기 위하여 원심분리된다. 이후, 침전물은 항-산화제를 선택적으로 함유하는 산성 용액에 용해된다. 전형적인 구체예에서, 현탁액은 4℃에서 적어도 10시간동안 항온처리된다.

단계 (i)의 용액은 대략 10 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 존속시키기 위하여 여과 단계가 수행된다. 바람직한 구체예에서, 단계 (i)의 용액은 대략 10 kDa의 분자량 컷-오프를 보유하는 막 필터를 통하여 여과된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 10 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 존속시키면서 브로멜라인 저해물질과 다른 오염물질을 제거할 수 있는 임의의 필터 막이 본 발명에 포함된다.

괴사조직제거 조성물은 여과이후 냉동 건조되거나, 증류수로 세척되고 냉동 건조되거나, 또는 여과되고 냉동 건조될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 괴사조직제거 조성물은 무균 용액을 얻기 위하여 적어도 0.5 ㎛의 구멍 크기를 갖는 필터 막을 통하여 여과되는데, 상기 무균 용액은 이후, 냉동 건조되고 보관된다. 전형적으로, 괴사조직제거 조성물은 수분의 존재에서 다소 불안정하기 때문에, 건조 상태로 보관된다. 괴사조직제거 조성물은 사용 직전에 용해된다.

바람직한 구체예에서, 브로멜라인으로부터 괴사조직제거 조성물을 획득하는 방법은 아래의 단계를 포함한다:

(b) (a)의 현탁액을 대략 2.5 내지 3.5 범위의 pH로 조정하고;

(f) (e)의 현탁액을 대략 2.5 내지 3.5 범위의 pH로 조정하고;

(g) (f)의 현탁액을 4℃에서 대략 12-24시간동안 항온처리하고;

(k) (j)의 존속된 용액을 여과하여 무균 용액을 산출하고;

(l) (k)의 여과된 용액을 냉동 건조시킨다.

제약학적 조성물

본 발명은 브로멜라인으로부터 획득되는 괴사조직제거 조성물을 제시하는데, 상기 조성물은 대략 10 kDa를 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 함유하고 브로멜라인 저해물질이 실질적으로 존재하지 않는다.

일부 구체예에서, 본 발명의 괴사조직제거 조성물은 제약학적 조성물을 산출하기 위하여 제약학적으로 허용되는 담체를 더욱 함유할 수 있다.

“제약학적으로 허용되는 담체”는 활성 성분을 의도된 표적에 전달하고 인간이나 다른 수용자 생물체에 해를 입히지 않는 운반제를 지시한다. 본 명세서에서, “제약학적”은 인간과 동물 약제를 포괄한다. 유용한 담체는 예로써, 물, 아세톤, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부탄-1,3-디올, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 또는 광유이다. 제약학적 조성물의 조제를 위한 방법과 성분은 널리 공지되어 있고, 예로써, Remington's Pharmaceutical Sciences, Eighteenth Edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa., 1990에서 찾아볼 수 있다.

제약학적 조성물은 환자에 적용을 위한 적합한 형태로 조제될 수 있다. 일반적으로 선호되는 투여 경로는 치료되는 부위에 국소 적용이다. 따라서, 제약학적 조성물은 국소 적용에 적합한 형태, 예를 들면, 용액, 현탁액, 크림, 로션, 겔, 거품, 스프레이, 건조 분말 등으로 조제될 수 있다. 제약학적 조성물은 손상된 부위에 직접적으로 적용되거나, 또는 불활성 드레싱, 예를 들면, 거즈 패드에 적용되고, 이후 손상된 조직에 적용될 수 있다.

또한, 제약학적 조성물은 담체에 따라 선택될 수 있는 다른 선택적 물질을 함유할 수 있다. 부가적인 성분에는 보존제, 예를 들면, 치메로살(Thimerosal), 벤질 알코올 또는 파라벤; 농후제(thickening agent), 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 히알루론산(hyaluronic acid), 카바폴(carbapol) 또는 글리세롤; 항균제(antimicrobial agent), 예를 들면, 항생제 또는 항진균제; 충전 물질(bulking substance), 예를 들면, 락토오스 또는 만니톨이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 건조 가피 조직을 절개하는데 도움이 되도록 요소와 같은 케라틴분해제(keratinolytic agent)가 추가될 수도 있다.

괴사조직제거 조성물의 치료 용도

본 발명은 비-생존 조직을 제거하기 위한 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본 발명의 원리에 따른 괴사조직제거 조성물의 치료 효과량을 상기 조직에 적용하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 비-생존 조직을 제거하는 방법은 괴사조직제거 조성물의 치료 효과량을 적용하는 단계를 포함하는데, 여기서 괴사조직제거 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체를 더욱 함유한다.

본 발명의 괴사조직제거 조성물은 상처를 치료하는데 유용하다. 구체적으로, 괴사조직제거 조성물은 상처 괴사조직제거 및 상처 치유에 유용하다. 이들 특성은 동물과 인간 임상 시험을 비롯한 다수의 검사 상황에서 증명될 수 있다. 가장 널리 이용되는 검사법은 Mertz 등(Journal Surgical Research (1990) 48:245-248)에 의해 기술된, 돼지에서 부분층 화상 상처이다.

상처 괴사조직제거의 경우에, 효능은 특히, 건조 가피의 부재, 연화 또는 해소; 생존 조직 성분의 비-가수분해; 및/또는 상처의 비-자극에 의해 결정된다. 국소 상처 치유의 경우에, 효능은 특히, 상처 경축(contracture), 증가된 치유 속도 및/또는 개선된 치유(즉, 촉각 자극(tactile stimulus)에 대한 반응 유지, 줄어든 흉터, 개선된 신혈관형성(neovascularization) 등)에 의해 결정된다. 따라서, “치료 효과량”은 건조 가피 조직을 소멸 또는 감소시키고 및/또는 상처 치유를 촉진하는데 요구되는 괴사조직제거 조성물의 양을 지시한다.

전층이나 부분층 화상 상처; 궤양 병소, 예를 들면, 압창(욕창), 정맥류성 궤양(varicose ulcer), 정체성 궤양(stasis ulcer), 영양성 궤양(trophic ulcer); 외과 상처, 예를 들면, 절단, 절개, 외상성과 화농성 상처; 질염, 자궁경관염, 포경수술, 회음절개술, 모소낭(pilonidal cyst) 상처, 뾰루지, 일광화상, 동상, 백내장 상처 조직이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다양한 상처가 본 발명의 제약학적 조성물로 치료될 수 있다.

본 발명의 괴사조직제거 조성물 또는 제약학적 조성물에 의한 비-생존 조직의 제거는 건조 가피 조직에 1회 적용으로, 또는 괴사조직제거가 달성될 때까지 수회 적용으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른, 건조 가피 조직의 괴사조직제거 방법은 다른 공지된 괴사조직제거 방법과 공동으로 수행될 수 있다.

아래의 실시예는 본 발명의 더욱 완전한 이해를 제공하기 위하여 제시된다. 본 발명의 원리를 설명하기 위하여 열거된 특정 기술, 조건, 물질, 비율 및 보고된 데이터는 예시이며, 본 발명의 범위를 결코 한정하지 않는다.

실시예 1: Debrase의 제조

브로멜라인의 현탁액

브로멜라인 SP(4 ㎏ 분말; Challenge Bioproducts Co. Ltd., Taiwan)는 0.3M 아세트산, 1% 아스코르브산, 70 ㎎/㎖ n-옥탄올, pH 2.4-2.6을 함유하고 전도도 1.0-1.2 mS를 보유하는 40 ℓ의 현탁액 용액 내에 아래와 같이 현탁시켰다: 상기 현탁액 용액은 새로 제조하고(사용전 1일 이하) 3-5℃로 미리-냉각시켰다. 브로멜라인은 교반 하에, 미리-냉각된 현탁 용액에 천천히 추가하였다. 10분후, 현탁액의 pH를 측정하고 1M 아세트산 또는 0.1M 수산화나트륨으로 2.5 - 3.5로 조정하였다. 현탁액은 3-5℃에서 하룻밤동안 연속적으로 교반하였다(도 1).

필터 프레스를 통한 여과

하룻밤 배양이후, 현탁액은 0.3M 아세트산과 1% 아스코르브산(pH 2.4-2.6)을 함유하는 동등 부피의 희석 용액으로 희석하였다. 필터 보조물질, Celite Hyflo(60 g/ℓ; Merck, Germany)는 적어도 15분간 지속적으로 교반하면서, 희석된 현탁액에 천천히 추가하였다. 이후, 현탁액은 여과 패드(filtering pad) IF 350과 CRESPASTE 110(Indastrialfiltro, Italy)이 구비된 필터 프레스(Celatom, Difenbach, Italy)를 통하여 여과하여 불용성 성분을 제거하였다. 1차 여과이후, 단백질 용액(여과액)은 필터 프레스를 통하여 재순환시키고, 투명한 여과액은 회수하고 3-5℃로 미리-냉각하였다. 여과의 종결 시점에서, 필터 프레스는 대략 20 ℓ의 희석 용액으로 씻어내고, 질소로 정화하여 필터로부터 잔류 단백질을 제거하였다. 필터로부터 잔류 단백질을 함유하는 용액은 여과액과 혼합하고, 4-6℃에서 지속적으로 교반하였다.

황산암모늄으로 침전

황산암모늄(285 g/ℓ)은 교반된 여과액에 천천히 추가하였다. 생성된 용액의 pH는 1M 아세트산 또는 0.1M 수산화나트륨으로 2.5-3.5로 조정하였다. 10-15분후, 교반을 중단하고, 용액은 3-5℃에서 항온처리하였다.

원심분리

황산암모늄을 함유하는 단백질 용액은 14,000g에서 원심분리로 분리하였다. 상층액은 따라버리고, 침전물은 회수하였다.

단백질 용해

침전물은 교반 하에, 0.3M 아세트산과 1% 아스코르브산, pH 2.4-2.6을 함유하는 40 ℓ의 새로 제조된 희석 용액 내에 3-5℃에서 하룻밤동안 아래와 같이 재-현탁시켰다: 상기 희석 용액은 제조하고 3-5℃로 미리-냉각하였다. 침전물은 지속적으로 교반하면서, 대략 15분간 희석 용액에 천천히 첨가하였다. 현탁액은 3-5℃에서 하룻밤동안 교반하였다.

한외 여과(농축과 투석)

현탁액은 0.5 ㎛ Milligard 필터(Millipore, France)를 통하여 미리-여과하였다. 여과액은 회수하였다. 여과의 종결 시점에서, 필터는 공기로 정화하여 잔류 단백질을 제거하였다. 여과된 용액은 10 kD MW 컷-오프를 갖는 4개의 막을 보유하는 한외 여과 단위(Millipore; Pelicon-2; 10 KD)를 통하여 정용-여과하였다. 조립된 한외-여과 장치는 증류수로 미리 씻어내고, 이후 0.1M 아세트산과 1 g/ℓ 황산암모늄을 함유하는 투석 용액으로 평형화시켰다. 단백질 용액은 먼저, 대략 100 g/ℓ(대략 10 ℓ)의 단백질 농도로 농축하고, ≤ 3.8 mS의 전도도와 pH 3?.2에 도달하기 위하여 4.5 - 5 부피의 투석 완충액에서 투석하였다. 용액은 ≤ 15℃에서 교반하였다. 정용-여과의 종결 시점에서, 보유액(retentate)의 부피는 대략 5 ℓ로 감소하였다. 이후, 한외 여과 막은 10 ℓ의 최종 부피까지 투석 용액으로 씻어냈 다.

무균 여과와 냉동-건조

정용-여과된 용액은 0.5 ㎛ Milligard 프리-필터(pre-filter)를 통하여 여과하고, 이후 절대 0.22 ㎛ Millidisk 40 필터(Millipore, France)를 통하여 여과하였다. 여과액은 냉동 건조 스테인리스 스틸 접시로 회수하고 냉동-건조기(USIFROID, France)에서 냉동 건조시켰다. 이렇게 제조된 냉동 건조된 괴사조직제거 조성물은 이후, Debrase라 한다.

충전

냉동 건조된 Debrase 분말의 충전은 미리 설정된 중량에 따라 수행되었다. Debrase는 발열원-없는 유리병(30 ㎖(Saint-Gobain, France)) 내로 충전하고 플라스틱 캡으로 차단하였다. 충전된 병은 냉동기 내에 -20℃에서 보관하였다. 4 ㎏ 브로멜라인으로부터 생산된 Debrase 분말의 양은 배치(batch)당 720-750 g이었다.

실시예 2: Debrase는 브로멜라인 저해물질이 존재하지 않는다

브로멜라인 저해물질의 정제

브로멜라인 분말(2.5 g)은 페닐 수은 아세테이트로 포화된 10 ㎖의 0.1M 인산칼륨 완충액 pH 6.1에서 10분간 현탁하였다. 10분간 원심분리(3500 rpm)이후, 1 ㎖의 상층액은 HiLoad 16/60 Superdex 75 HPLC 제조 등급 칼럼 상에서 겔 여과 크로마토그래피를 수행하고, 평형화시키고, 동일한 완충액으로 용리하였다. 샘플 적용후 30분 시점에 5 ㎖의 분획물을 회수하였다. 각 용리된 분획물에서, 3가지 파라 미터를 측정하였다: (i) 280 nm(A₂₈₀)에서 흡광도; (ii) 에스테르분해 활성; (iii) Debrase 에스테르분해 활성의 저해.

브로멜라인 분획물의 에스테르분해 활성은 비색 기질(chromogenic substrate) p-니트로페닐 Na-벤질옥시카르보닐-L-리시네이트(CLN)를 이용하여 pH 4.6에서 분광광도법으로 아래와 같이 평가하였다:

0.1 M KCl과 1 mM L-시스테인, pH 4.6을 포함하는 1 ㎖의 아세트산나트륨 완충액(10 mM)은 25℃에서 플라스틱 큐벳 내에 위치시켰다. 100 ㎕의 용리된 분획물(2.5 ㎎/㎖의 농도에서)을 추가하였다. 용액은 2분간 항온처리하고, 이후 50 ㎕의 CLN 용액(아세토니트릴 10% 물에서 2.5 mM)을 추가하였다. 큐벳은 혼합하고, 317 nm에서 흡광도 증가를 5분간 모니터하였다. 상기 기질의 자발적 가수분해는 용리된 분획물 대신에, 완충액 단독의 존재에서 모니터하였다.

Debrase의 에스테르분해 활성의 저해는 아래와 같이 측정하였다: 20 ㎕의 Debrase(0.25 ㎎/㎖)는 다양한 HPLC 분획물과 함께 항온처리하고, Debrase의 에스테르분해 활성은 앞서 기술된 바와 같이, CLN을 이용하여 pH 4.6에서 분광광도법으로 평가하였다.

도 2에 도시된 바와 같이, 줄기 브로멜라인은 분획물 5-13 및 14-20에서 용리되었다. 하지만, Debrase 에스테르분해 활성의 저해를 보이는 브로멜라인 저해물질은 분획물 22-29에서 용리되었다.

표 1에서는 용리된 분획물 #20-30의 존재 또는 부재에서 Debrase의 에스테르 분해 활성을 제시한다. 표 1에서 확인되는 바와 같이, 분획물 22-29는 Debrase 에스테르분해 활성을 저해하였다. 가장 현저한 저해는 분획물 23-25에서 달성되었다. 이러한 저해 활성의 겉보기 분자량(apparent molecular weight)은 대략 5-6 kDa인 것으로 밝혀졌는데, 이는 브로멜라인 저해물질이 분획물 23-25 내에 용리된다는 것을 암시한다.

브로멜라인 분획물의 존재에서 Debrase의 에스테르분해 활성의 결과

화합물	단백분해 활성	저해 %
Debrase	945	0
+ 1mM 요도아세트아마이드	593	37.0
+ 분획물 20(5 ㎍)	938	0.7
+ 분획물 21(5 ㎍)	860	9.0
+ 분획물 22(5 ㎍)	732	22.5
+ 분획물 23(5 ㎍)	172	81.7
+ 분획물 24(5 ㎍)	185	80.4
+ 분획물 25(5 ㎍)	164	82.6
+ 분획물 26(5 ㎍)	457	51.6
+ 분획물 27(5 ㎍)	587	37.8
+ 분획물 28(5 ㎍)	710	24.8
+ 분획물 29(5 ㎍)	802	15.1
+ 분획물 30(5 ㎍)	920	2.6

Debrase의 HPLC 분석

Debrase와 이의 출발 물질, 브로멜라인의 크기 배제 크로마토그래피는 이들 2가지 효소 혼합물 사이에 차이를 특성화하고 분석하기 위하여 수행하였다. Debrase와 브로멜라인은 각각, TSK 겔 3000_swxL HPLC 칼럼 상에 적용하였는데, 상기 칼럼은 130 mM NaCl을 포함하는 40 mM 인산염 완충액의 0.4 ㎖/min의 유속으로 이동되었다.

도 3에서는 Debrase 크로마토그래피(위쪽 패널)에서 하나의 피크만 획득되는 반면 브로멜라인 크로마토그래피(아래쪽 패널)에서 3개의 피크가 획득된다는 것을 보여준다. 브로멜라인에서 2개의 주요 피크가 확인되었다: 피크 1은 줄기 브로멜라인으로 확인되었고, 피크 3은 브로멜라인 저해물질로 확인되었다. 도 3에서 확인되는 바와 같이, 브로멜라인 저해물질은 Debrase로부터 본질적으로 부재하는데, 이는 Debrase를 제조하는 방법이 브로멜라인 저해물질의 제거를 가능하게 하여 이러한 저해물질이 존재하지 않는 효소 조성물을 생산한다는 것을 암시한다.

Debrase 및 U.S. Pat. No. 5,830,739에 따라 제조된 단백분해 혼합물 내에 존재하는 단백질의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동과 질량 분광분석은 U.S. Pat. No. 5,830,739에 따라 제조된 단백분해 혼합물이 줄기 브로멜라인, 줄기 브로멜라인 전구물질, 아나나인(ananain), 아난 아나코(anan anaco) 전구물질뿐만 아니라 브로멜라인 저해물질 2 분절 2를 포함하는 반면, Debrase는 이들 효소와 효소 전구물질을 모두 포함하지만 브로멜라인 저해물질이 결여된다는 것을 입증하였다. 이런 이유로, 이들 결과는 Debrase를 제조하는 방법이 브로멜라인 저해물질을 제거하는데 매우 효과적이라는 것을 암시한다.

실시예 3: Debrase 내에서 단백질의 부분적인 확인

Debrase 및 U.S. Pat. No. 5,830,739에 따라 제조된 단백분해 혼합물은 아래와 같이 등전 집중(isoelectric focusing)과 SDS-PAGE를 수행하였다.

Debrase 또는 단백분해 혼합물의 샘플은 혼합하면서 실온에서 수분간, 물에 녹인 200 ㎕의 5% 트리플루오르산(trifluoric acid, TFA)에 현탁시켰다. 이들 샘플은 4℃에서 30분간 20,000xg로 원심분리하고 상층액을 회수하였다. 단백질 농도는 Bradford 방법으로 측정하였다. 100 ㎍ 단백질을 포함하는 상층액의 샘플은 냉동 건조시키고, 겔 재수화 용액(8 M 요소; 2 M 티오-요소; 5.2 ㎕/㎖ Pharmalites(pH 3-10); 10 ㎎/㎖ CHAPS(Sigma Chemicals Co.), 2 ㎎/㎖ DTT)에 재용해시키고, 단백질-함유 재수화 용액 내에서 24시간동안, 고정된 pH 구배(IPG) 조각(18 ㎝, 3-10 선형 pH 구배)의 항온처리로, 등전 집중을 위한 이들 조각 상에 적하하였다. 등전 초점은 4 단계로 수행되었다: 1) 1000 볼트 시간(Volt hour, Vh)의 경우, 0 - 500 볼트 구배(volt gradient); 2) 2500 Vh의 경우, 500 볼트의 일정한 전위; 3) 10,000 Vh의 경우, 500-3500 볼트; 4) 35,000 Vh의 경우, 3,500 볼트의 일정한 전위. 두 번째 국면은 12.5% 아크릴아마이드, 2.6% 비사크릴아마이드(bisacrylamide)의 SDS-PAGE 겔이었다. SDS-PAGE의 종결 시점에서, 겔은 콜로이드성 Coomassie Blue로 염색하였다.

도 7에서는 Debrase의 Coomassie-blue 염색된 SDS-PAGE를 도시한다.

도 8에서는 U.S. Pat. No. 5,830,739에 따라 제조된 단백분해 혼합물의 Coomassie-blue 염색된 SDS-PAGE를 도시한다. 앞서 기술된 바와 같이, Debrase와 상기 단백분해 혼합물은 등전 집중 및 SDS-PAGE가 순차적으로 수행되었다.

단백질 확인

반점은 Coomassie-Blue 염색된 SDS-PAGE 겔 각각으로부터 잘라내고 37℃에서 30분간 200 ㎕의 200 mM NH₄NC0₃-50 % CH₃CN에서 세척하였다. 세척된 반점은 건조시키고, 용해 용액(0.02 ㎍㎖^-1 트립신(Promega); 40 mM NH₄NCO₃(pH 8.1); 10 % CH₃CN)으로 재수화시키고, 37℃에서 16시간동안 항온처리하였다. 펩티드는 10 % CH₃CN 내에서 초음파처리로 추출하고, 추출된 펩티드는 탈염(desalting)을 위하여 POROS 50 R2(PerSeptive Biosystems) 마이크로 칼럼 상에 적하하였다. 이들 펩티드는 Q-STAR(Applied Biosystems) 바늘 내로 직접적으로 용리하고 Analyst QS 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 측정하고 분석하였다. MS/MS 분석으로부터 유래된 서열은 NCBI 데이터베이스에서 단축 BLAST 검색에 이용하였다.

표 5에서는 도 7과 8에서 각각, 1-4와 5-9로 지정된 단백질 반점의 실체를 제시한다.

Debrase 또는 단백분해 혼합물에서 확인된 단백분해 효소와 브로멜라인 저해물질.

Debrase		단백분해 혼합물
반점 번호와 서열	단백질	반점 번호와 서열	단백질
#1 AFEFIISNKG	줄기 브로멜라인 EC 3.4.22.32	#5 QDEYKCYC	브로멜라인 저해물질 - 파인애플 XBPI
#2 IDWRDSGAVTS	아나나인 EC 3.4.22.31	#6 CPGFCKTCKAE	브로멜라인 저해물질 VI S66609
#3 YPYKAAKGTCKTDG	브로멜라인 줄기 P14518	#7 CVCADTYSDC	브로멜라인 저해물질 VII P01068_2
#4 SRDEPSDPMMK	시스테인 프로테이나아제 전구물질 CAA08861	#8 ATVESIYK GEAGYIR	FBSB 전구물질 BAA22544
		#9 GSSWGEGGYVR	과일 브로멜라인 EC 3.4.22.33

표 5에서 확인되는 바와 같이, 3가지 유형의 브로멜라인 저해물질(브로멜라인 저해물질 - 파인애플, 브로멜라인 저해물질 VI과 VII)은 단백분해 혼합물에서만 관찰되고 Debrase에서는 전혀 관찰되지 않았다. 이들 결과는 Debrase에서 저해물질이 본질적으로 존재하지 않는다는 것을 암시한다.

실시예 4: Debrase의 생체내 활성

Debrase의 괴사조직제거 효능의 평가를 위하여 생체내 돼지 화상 상처 모형을 이용하였다. 어린 돼지의 피부가 인간의 피부에 매우 유사하기 때문에, 생체내 돼지 화상 상처 모형은 인간에서 피부 열 화상에 대한 확립된 모형으로 공지되어 있다.

금속 케이스에 둘러싸인 변형된 전기 반사 가열 장치(electric radiant heating element)로 구성되는 화상-유발 장치는 15초동안 400℃로 조정하여 중심(척추)선을 따라 대칭 피부분절(dermatome) 상에 3 ㎝ 깊이의 화상을 유발하였다. 4.5X4.5 ㎝ 정사각형 구멍이 있는 아스베스토스 템플레이트(asbestos template)를 돼지 피부 상에서 예정된 화상 부위에 배치함으로써 화상 크기를 통제하고, 피부로부터 표준 거리에서 화상 유발 장치를 상기 구멍에 부착하였다. 인접 피부는 아스베스토스 실드로 보호하였다. 동등한 수의 5-14개 쌍(필요에 따라)의 깊은 화상을 각 면에 유발하였다. 모든 화상이 유발된 이후, 건조 가피의 상부 케라틴 층은 깨끗한 진피가 노출될 때까지, 통상적인 염수에 적셔진 Skleaner^TM 스펀지로 닦아냄으로써 제거하였다. 이후, 모든 화상 부위는 대략 1시간 동안, 염수에 적셔진 거즈 스펀지를 각 화상 부위에 적용하고, 화상 부위가 마르지 않도록 염수를 지속적으로 재적용함으로써 수화시켰다.

대략 1시간의 수화이후, 각 화상 부위 주변의 건강한 피부 상에 접착 장벽(adhesive barrier)을 배치하였다. 이후, Carbomer 980을 포함하는 5 ㎖의 겔 운반제 및 물에 녹인 이염기성 인산나트륨, pH 7.4를 0.5 gr의 Debrase 분말과 혼합하고 상처 위에서 접착 장벽의 내부 모서리까지 확대 적용하여 5x5 ㎝ 부위를 덮었다. 대조 부위에서는 5 ㎖의 겔만 사용하였다. 그 다음, 겔 층으로 덮여지고 접착 장벽에 의해 둘러싸인 전체 상처는 상기 접착 장벽에 부착된 폐쇄 필름(occlusive film)으로 덮었다. 상기 폐쇄 필름은 필름 아래에 공기가 갇혀있지 않도록 겔에 밀착시켰다. 가열램프를 이용하여 37℃ 내지 40℃로 유지된 챔버 내에서 겔의 온도를 모니터하기 위하여 접착 장벽을 통하여 소형 온도 프로브를 삽입하였다. 여러 부위에서 모든 폐쇄 드레싱(occlusive dressing)을 안정화시키기 위하여 등 전체를 부드러운 면화(거즈) 드레싱(Kerlix 등)으로 덮었다. 드레싱은 4시간동안 방치하였다. 이후, 드레싱은 제거하고, 용해된 건조 가피가 포함된 겔은 목제 압설자(wooden tongue depressor)로 닦아내고, 상처면(wound bed)은 모든 느슨하거나 용해된 조직이 제거될 때까지 Skleaner로 문질러 닦아냈다. 이들 상처는 깨끗하게 한 이후, 염수에 적셔진 거즈로 대략 1시간동안 적시고 시각적으로 평가하였다.

브로멜라인과 Debrase의 생체내 활성

괴사조직제거 기질	양(g)	사용된 담체	양(g)	최종 스코어
브로멜라인(배치 06 03)	0.5	Gel MG2O/C05-08	0.5	2.5
브로멜라인(배치 06 03)	0.5	Gel MG2O/C05-08	0.5	2
브로멜라인(배치 06 03)	0.25	Gel MG2O/C05-08	0.5	2
브로멜라인(배치 06 03)	0.25	Gel MG2O/C05-08	0.5	2
브로멜라인(배치 06 03)	0.125	Gel MG2O/C05-08	0.5	1.5-2
브로멜라인(배치 06 03)	0.125	Gel MG2O/C05-08	0.5	2
브로멜라인(배치 06 03)	0.0625	Gel MG2O/C05-08	0.5	1-1.5
브로멜라인(배치 06 03)	0.0625	Gel MG2O/C05-08	0.5	1.5
Debrase MD2/D01-04	0.5	Gel MG2O/C05-08	0.5	5
Debrase MD2/D01-04	0.5	Gel MG2O/C05-08	0.5	4.5
Debrase MD2/D0l-04	0.25	Gel MG2O/C05-08	0.5	4
Debrase MD2/D01-04	0.25	Gel MG2O/C05-08	0.5	4
Debrase MD2/DOl-04	0.125	Gel MG2O/C05-08	0.5	3.5
Debrase MD2/D01-04	0.125	Gel MG2O/C05-08	0.5	3.5-4
Debrase MD2/D01-04	0.0625	Gel MG2O/C05-08	0.5	3
Debrase MD2/DOl-04	0.0625	Gel MG2O/C05-08	0.5	3.5

표 2에 도시된 바와 같이, Debrase는 화상 상처의 괴사조직을 제거하는데 있어 브로멜라인보다 효과적인 것으로 밝혀졌다. 가령, 0.5 g의 Debrase는 동일량의 브로멜라인의 2.25의 평균 시각 평가 득점(Visual Assessment Scoring, VAS)과 비교하여 4.75의 평균 VAS를 산출하였다. 이에 더하여, 0.25 g의 Debrase는 브로멜라인보다 더욱 효과적으로 화상 상처의 괴사조직을 제거하였다(각각, VAS 4 vs. VAS 2).

실시예 5: Debrase의 체외 활성

Debrase에 의한 돼지 피부 조직 조각의 분해에 기초한 체외 검사를 수행하였다. 돼지 귀 피부(ca. 1 ㎝ 직경)의 조각은 불에 태우고 Debrase 단백분해를 수행하였다. Debrase에 의한 조직의 찢어짐 시간(tear off time)을 모니터하였다. 검사는 아래와 같이 수행되었다:

돼지 귀 피부는 상기 피부를 연골로부터 분리하고 잉여 지방을 제거함으로써 준비하였다. 돼지 귀 피부 조각은 20초동안 끓이고 위쪽에 5 ㎖ PD-Tip이 달린 피부 홀더(skin holder)의 하부에 위치시키며, 피부 홀더의 상부는 위쪽을 팽팽하게 하였다. Debrase 또는 브로멜라인은 수상(aqueous phase)(가령, 겔, 실베롤(silverol) 또는 완충액)과 혼합하고, 플라스틱 튜브가 구비된 주사기 또는 피펫을 이용하여 상기 세포의 하부에 적용하였다. 귀 피부 조각의 찢어짐 시간을 측정하였다.

결과

표 3과 4에서는 Debrase와 브로멜라인 사이에 체외 활성 차이를 보여준다. 표 3과 도 4에서는 완충액 내에 12.5 ㎎/㎖의 농도에서 Debrase가 56.7± 9.81 min 내에, 불에 태워진 돼지 귀 피부의 괴사조직을 제거한다는 것을 입증한다. 더욱 높은 농도의 Debrase가 더욱 빠른 괴사조직제거를 유도하지는 못하였다. 더욱 낮은 농도의 Debrase는 괴사조직제거에 더욱 오랜 시간이 소요되었다. Debrase에 대한 검출 한계는 3.125 ㎎/㎖(115.35± 15.5 min)이었다.

이들 결과는 또한, 낮은 농도에서 Debrase가 출발 물질(즉, 브로멜라인)보다 괴사조직제거에서 더욱 유효하다는 것을 입증한다(참조: 도 4 vs 도 5). 도 6에 도시된 바와 같이, 낮은 농도(0-5 ㎎/㎖)와 높은 농도(20-50 ㎎/㎖)의 Debrase와 브로멜라인은 유사한 찢어짐 시간을 나타냈다. 하지만, 5-20 ㎎/㎖의 농도에서 Debrase는 돼지 귀 피부를 브로멜라인보다 2배나 빨리 찢는 것으로 밝혀졌다.

당업자가 인지하는 바와 같이, 본 발명은 앞서 기술되고 도시된 특정 구체예에 의해 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된다.

Claims

서열 번호: 1-4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 아나나인(ananain), 줄기 브로멜라인(stem bromelain) 및 시스테인 프로테이나아제 전구물질(cysteine proteinase precursor)을 포함하며 23 kDa±2 kDa의 분자량을 갖는 브로멜라인(bromelain)으로부터 획득된 괴사조직제거 조성물(debriding composition)에 있어서, 이 조성물은 조성물내 단백질 함량의 10% w/w 미만의 양으로 브로멜라인 저해물질을 포함하는 괴사조직제거 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 5% w/w 미만의 단백질 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 괴사조직제거 조성물.
제 3항에 있어서, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 2% w/w 미만의 단백질 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 괴사조직제거 조성물.
제 4항에 있어서, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 1% w/w 미만의 단백질 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 괴사조직제거 조성물.
제 1항에 있어서, HPLC 크기 배제 칼럼 TSK-Gel 3000_SWXL로부터 용리이후 단일 단백질 피크를 포함하고, 상기 단일 단백질 피크는 23 kDa±2kDa의 분자량을 갖는 단백질에 상응하는 것을 특징으로 하는 괴사조직제거 조성물.
제 1항, 3항 내지 6항중 어느 한 항에 있어서, 제약학적으로 허용되는 담체를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 괴사조직제거 조성물.
브로멜라인으로부터 괴사조직제거 조성물을 획득하는 방법에 있어서, 상기 괴사조직제거 조성물은 23 kDa±2kDa의 분자량을 갖는 단백분해 효소를 함유하고, 이 조성물은 조성물내 단백질 함량의 10% w/w 미만의 양으로 브로멜라인 저해물질을 포함하며, 상기 방법은 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 괴사조직제거 조성물의 획득 방법:

(a) 항-산화제를 포함하거나 또는 포함하지 않는 산성 용액으로 브로멜라인을 현탁시키고, 상기 산성 용액은 2.4 내지 4 범위의 pH를 보유하고;

(b) (a)의 현탁액을 2.4 내지 4 범위의 pH로 조정하고;

(c) 실리카를 포함하는 필터 보조물질을 (b)의 현탁액에 추가하고;

(d) (c)의 현탁액을 여과하여 불용성 성분을 제거하고;

(e) (d)의 여과된 용액에 황산암모늄 염을 추가하여 40% 내지 50% 범위에서 황산암모늄의 포화를 유도하고;

(f) (e)의 현탁액을 2.5 내지 4 범위의 pH로 조정하고;

(g) (f)의 현탁액을 3℃-10℃에서 항온처리하고;

(h) (g)의 현탁액을 원심분리하여 황산암모늄 침전물을 산출하고;

(i) 항-산화제를 포함하거나 또는 포함하지 않으며, 2.4 내지 4 범위의 pH를 보유하는 산성 용액에 황산암모늄 침전물을 용해시키고;

(j) (i)의 용액을 여과하여 10 kDa±2kDa을 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 존속시키고;

(k) (j)의 존속된 용액을 냉동 건조시킨다.
제 8항에 있어서, 아래의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 괴사조직제거 조성물의 획득 방법:

(a) 1% 아스코르브산과 n-옥탄올을 함유하고 2.4 내지 2.6의 pH를 보유하는 0.3 M 아세트산으로 브로멜라인을 현탁시키고;

(b) (a)의 현탁액을 2.5 내지 3.5 범위의 pH로 조정하고;

(c) 실리카를 포함하는 필터 보조물질을 (b)의 현탁액에 추가하고;

(d) 필터 프레스(filter press)를 통하여 (c)의 현탁액을 여과하여 불용성 성분을 제거하고;

(e) (d)의 여과된 용액에 황산암모늄 염(285 g/ℓ)을 추가하여 황산암모늄의 40% 포화를 유도하고;

(f) (e)의 현탁액을 2.5 내지 3.5 범위의 pH로 조정하고;

(g) (f)의 현탁액을 4℃에서 12-24시간동안 항온처리하고;

(h) (g)의 현탁액을 원심분리하여 황산암모늄 침전물을 산출하고;

(i) 1% 아스코르브산을 함유하고 2.4 내지 2.6의 pH를 보유하는 0.3 M 아세트산에 황산암모늄 침전물을 용해시키고;

(j) 10 kDa 한외-필터를 통하여 (i)의 용액을 여과하여 10 kDa±2kDa을 초과하는 분자량을 갖는 단백분해 효소를 존속시키고;

(k) (j)의 존속된 용액을 여과하여 무균 용액을 산출하고;

(l) (k)의 여과된 용액을 냉동 건조시킨다.
23 kDa±2 kDa의 분자량을 갖는 단백질 분해효소를 포함하는 브로멜라인(bromelain)으로부터 획득한 괴사조직제거 조성물(debriding composition)에 있어서 조성물내 단백질 함량의 10% w/w 미만의 양으로 브로멜라인 저해물질을 포함하며, 비-생존 조직을 제거(debridement)하는 상처 치료에 이용되는 조성물.
삭제
제 10항에 있어서, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 5% w/w 이하미만의 단백질 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12항에 있어서, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 2% w/w 이하미만의 단백질 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13항에 있어서, 브로멜라인 저해물질은 괴사조직제거 조성물의 1% w/w 미만의 단백질 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항에 있어서, 괴사조직제거 조성물은 HPLC 크기 배제 칼럼 TSK-Gel 3000_SWXL로부터 용리이후 단일 단백질 피크를 포함하고, 상기 단일 단백질 피크는 23 kDa±2kDa의 분자량을 갖는 단백질에 상응하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항, 12항 내지 15항중 어느 한 항에 있어서, 괴사조직제거 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항에 있어서, 상처는 전층이나 부분층 화상 상처, 일광화상, 동상, 궤양 병소, 압창(욕창), 정맥류성 궤양, 정체성 궤양, 영양성 궤양; 외과 절차, 절단, 절개, 포경수술과 회음절개술(episiotomy)과 연관된 상처, 외상성과 화농성 상처, 질염, 자궁경관염, 모소낭(pilonidal cyst) 상처, 백내장 상처 조직, 피부 이식 부위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.