PT1824775E

PT1824775E - Composição de desbridamento a partir de bromelina e métodos de produção da mesma

Info

Publication number: PT1824775E
Application number: PT05804486T
Authority: PT
Inventors: Marian Gorecki; Amir Toren
Original assignee: Mediwound Ltd
Priority date: 2004-11-22
Filing date: 2005-11-22
Publication date: 2012-09-19
Also published as: EP1824775A2; KR101235544B1; DK1824775T3; ES2389810T3; US8119124B2; ZA200704821B; JP5053096B2; MX2007006074A; CN101297033B; CN101297033A; IL165334A0; AU2005305461B2; AU2005305461A1; IL183184A; IL183184A0; EP1824775A4; US20090148429A1; WO2006054309A2; CA2587951A1; HK1124639A1

Description

ΕΡ1824775Β1

DESCRIÇÃO

COMPOSIÇÃO DE DESBRIDAMENTO A PARTIR DE BROMELINA E MÉTODOS

DE PRODUÇÃO DA MESMA

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina e a métodos de produzir a mesma. Em particular, a presente invenção refere-se a uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina que compreende enzimas proteoliticas tendo pesos moleculares de cerca de 23 kDa, estando essencialmente desprovidas de inibidores de bromelina, e a composições farmacêuticas que compreendem as mesmas. As composições de desbridamento e as composições farmacêuticas que as compreendem são particularmente úteis em desbridar tecidos de escaras e na cura de feridas.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO Têm sido feitos esforços consideráveis para desenvolver preparações de desbridamento que são capazes de remover tecido desvitalizado sem cirurgia. 0 tecido desvitalizado é formado em todos os processos de doença, que estão associados com trauma dérmico, tais como úlceras decubitus, necroses de pressão, incisões e queimaduras. 0 desbridamento eficiente é essencial uma vez que o tecido desvitalizado é um excelente meio de cultura para infeções oportunistas. A septicémia resultante de infeções é a causa de morte principal para a maioria dos pacientes com queimaduras graves. A utilização de enzimas proteoliticas e agentes químicos para efetuar o desbridamento precoce do tecido desvitalizado não conduziu a desbridamento satisfatório. Verificou-se que os agentes químicos tais como ácido 1 ΕΡ1824775Β1 tânico, ácido salicílico e ácido pirúvico, causavam ainda mais danos a tecidos já lesados.

As enzimas proteoliticas incluindo papaína, pinguinaina, tripsina, fibrinolisina e estreptoquinase foram descritas como agentes desbridantes. A patente U.S. N.° 5505943 revela composições contendo uma protease produzida por microorganismos do género Vibrio para tratar feridas hidrolizando componentes de tecido necrótico.

Contudo, o desbridamento por enzimas proteoliticas purificadas padece de várias desvantagens já que as enzimas purificadas requerem numerosas aplicações durante um período de tempo longo, exibem baixa eficácia, têm efeitos secundários tóxicos e não têm seletividade.

Verificou-se que os extratos derivados a partir do talo da planta do ananás (Ananas comosus) removiam seletivamente o tecido desvitalizado. Tais extratos, também chamados bromelina, contêm várias enzimas proteoliticas e hidrolíticas. A patente U.S. N.° 4197291 revela um produto de enzima obtido a partir da bromelina capaz do desbridamento do tecido desvitalizado de um hospedeiro mamífero, o produto de enzima compreende uma proteína termicamente lábil, solúvel em água que é livre de atividade caseinolítica e tem um pico do ponto isoelétrico de cerca de 6. A proteína compreende, pelo menos, duas subunidades, cada das quais tem um peso molecular de cerca de 14,3 a 15 kDa com um pico de absorção característico na região do ultravioleta do espectro a 280 nm. O procedimento para preparar tal produto de enzima como revelado na patente U.S. N.° 4197291 compreende precipitação da proteína com acetona, extração do precipitado com tampão acetato contendo ácido tioglicólico, filtração da solução através de uma membrana 2 ΕΡ1824775Β1 com um ponto de corte do peso molecular de cerca de 50 kDa, filtração em gel do filtrado, e focagem isoelétrica. O produto de enzima assim preparado contém, pelo menos dois, mais provavelmente três, subunidades com um peso molecular de 14,3 a 15 kDa. A patente U.S. N.° 4226854 revela um método para desbridamento do tecido desvitalizado utilizando o produto de enzima revelado na patente U.S. N.° 4197291. A patente U.S. N.° 4329430 revela ainda uma mistura de enzima proteolitica derivada da bromelina útil para dissecar e digerir tecido desvitalizado. A mistura de enzima proteolitica que é termicamente lábil e solúvel em água contém escarase, uma enzima hidrolítica livre de atividade caseinolitica com um ponto isoelétrico de cerca de 6, que compreende, pelo menos, duas subunidades, cada uma das quais tem um peso molecular de cerca de 14,3 a 15 kDa. Todos os componentes da mistura de enzima proteolitica têm um peso molecular nativo de cerca de 30 a 50 kDa já que a mistura de enzima é filtrada através de uma membrana com um ponto de corte do peso molecular de 50 kDa e concentrada sobre uma membrana com um ponto de corte do peso molecular de 30 kDa. Os resultados replicáveis obtidos com a mistura de enzima proteolitica são supostamente devidos ao facto de que a mistura de enzima não contém um inibidor, que estava aparentemente presente nas preparações de enzima proteolitica previamente publicadas. Contudo, não existe critério para a deteção da atividade deste inibidor. A patente U.S. N.° 4307081 revela um método de dissecar e digerir tecido desvitalizado, que compreende contactar o tecido com a mistura de enzima proteolitica revelada na patente U.S. N.° 4329430. A planta do ananás tem sido a fonte de várias enzimas proteoliticas. Por exemplo, a patente U.S. N.° 5106621 3 ΕΡ1824775Β1 revela proteínases de cisteína purificadas derivadas do material da planta do ananás com um peso molecular de cerca de 25 kDa e exibindo atividade em direção a substrato de coumarilamida. Em particular, a patente U.S. N.° 5106621 refere-se às proteínases de cisteína ananaína e comosaína, que exibem diferentes características físico-químicas distintas da bromelina do talo. Uma bromelina do talo protease ativada tiol purificada com um peso molecular de cerca de 17 kDa a 21 kDa, chamada a-Bromelina, é revelada na patente U.S. N.° 5387517, e mostrou-se ter atividade de desbridamento. Além disso, a bromelina contém uma fosfatase ácida e uma peroxidase e pode conter atividade amilase e celulase. A patente U.S. N.° 6335427 ensina a purificação de uma proteína com25 kDa da bromelina, verificou-se que a proteína tem atividade anticancerígena.

Perlstein e Kezdy (J. Supramol. Struct. 1:249-254,1973) identificaram sete inibidores de protease estreitamente relacionados, isto é, inibidor da bromelina 1-VII, do pó de acetona bromelina comercial. Verificou-se que os inibidores têm pesos moleculares de 5000-6000 Dalton e que contêm 50 resíduos de aminoácido e cinco ligações dissulfido (Perlstein e Kezdy, ibid). A análise estrutural primária de um dos sete inibidores revelou micro heterogeneidade extensa (Reddy, M.N. et al. J. Biol. Chem. 250: 1741-1750, 1975). A patente U.S. N.° 5830739 revela métodos para preparar uma mistura estável de escarase e outras enzimas proteolíticas a partir da bromelina, que compreendem extrair bromelina com uma solução de ácido ascórbico diluído, seguido de precipitar a escarase e outras enzimas proteolíticas com sulfato de amónio. A patente U.S. N.° 5830739 ensina ainda que o precipitado de sulfato de amónio pode ser lavado com água destilada sobre um ultra filtro de 10 kDa. Verificou-se que o método para preparar a mistura 4 ΕΡ1824775Β1 estável de escarase produz quantidades superiores de escarase. Contudo, não existe qualquer indicação de que a mistura é desprovida de inibidores da bromelina.

Verificou-se que enzimas distintas purificadas isoladas da bromelina não eram tão eficientes no desbridamento de tecidos não viáveis como uma mistura de enzima proteolitica obtida a partir da bromelina. Contudo, verificou-se que a mistura de enzima proteolitica obtida a partir da bromelina, que contém proteínas de pesos moleculares de até 50 kDa incluindo inibidores da bromelina não eram tão eficazes no desbridamento de tecidos não viáveis como uma mistura de enzima obtida a partir da bromelina contendo proteínas de pesos moleculares de 30 a 50 kDa, que presumivelmente estava desprovida dos inibidores.

Uma vez que tais misturas de enzima são pretendidas para uso clínico humano, existe uma necessidade não correspondida de obter uma mistura de enzima caracterizada bioquimicamente da bromelina, que tem características bioquímicas distintas e replicáveis, essencialmente desprovida de inibidores da bromelina e contendo a maior parte das enzimas proteolíticas da bromelina, de modo que o desbridamento eficiente de tecidos não viáveis seja obtido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção providencia uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina capaz do desbridamento de tecidos não viáveis e tendo características bioquímicas distintas. Em particular, a presente invenção providencia uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina, caracterizada bioquimicamente como sendo essencialmente desprovida de inibidores da bromelina enquanto compreendendo a maior 5 ΕΡ1824775Β1 parte das enzimas proteolíticas da bromelina. A composição da enzima assim obtida é altamente eficiente no desbridamento de tecidos não viáveis. É agora revelado, pela primeira vez, que uma composição de enzima obtida a partir da bromelina tendo a maior parte das enzimas proteolíticas da bromelina, mas essencialmente desprovida dos inibidores da bromelina, tem atividade de desbridamento superior em relação à da bromelina. É revelado aqui a seguir que enquanto a bromelina contém, pelo menos, três picos principais de proteina com pesos moleculares de cerca de 6,17,5 e 23 kDa quando eluida a partir de uma coluna de HPLC por exclusão de tamanho, a composição de enzima da presente invenção compreende predominantemente um pico proteico com pesos moleculares de cerca de 23 kDa quando aplicado à mesma coluna de HPLC por exclusão de tamanho. A composição de enzima é altamente replicável em conteúdo proteico e é, assim, vantajosa para uso clinico. 0 método para preparar a composição de enzima de acordo com a presente invenção compreende as etapas de extrair pó de bromelina comercialmente disponível com uma solução acídica opcionalmente compreendendo um anti-oxidante, adicionando um auxiliar de filtração, filtrar a suspensão de modo a remover componentes insolúveis, precipitar as enzimas proteolíticas adicionando sal de sulfato de amónio à solução, dissolvendo o precipitado de sulfato de amónio com uma solução acídica opcionalmente compreendendo um anti-oxidante, e filtrando a solução, de modo que as enzimas proteolíticas com pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa sejam retidas.

De acordo com um aspeto, a presente invenção providencia uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina, a composição de desbridamento compreendendo 6 ΕΡ1824775Β1 enzimas proteolíticas com pesos moleculares de cerca de 23 kDa, dita composição sendo substancialmente desprovida de inibidores da bromelina. 0 termo "substancialmente desprovida" refere-se a composições compreendendo no máximo quantidades residuais de inibidores da bromelina comparado com a quantidade presente nos extratos crus da bromelina.

De acordo com algumas modalidades, os inibidores da bromelina são menos de 10% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento. Preferencialmente, os inibidores da bromelina são menos de 5% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento, mais preferencialmente os inibidores da bromelina são menos de 2% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento, e mais preferencialmente os inibidores da bromelina são menos de 1% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento.

De acordo com uma modalidade adicional, a composição de desbridamento consiste essencialmente num único pico proteico após eluição a partir de uma coluna de HPLC por exclusão de tamanho TSK-Gel 3000Swxl/· o único pico proteico constituindo proteínas com pesos moleculares de cerca de 23 kDa.

De acordo ainda com modalidades adicionais, o único pico proteico é obtido numa produtividade de, pelo menos, 50% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento aplicado à coluna de HPLC por exclusão de tamanho. De acordo com outra modalidade, o pico proteico principal é obtido numa produtividade de, pelo menos, 60% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento. De acordo com uma modalidade adicional, o pico proteico principal é obtido numa produtividade de, pelo menos, 70% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento aplicado à coluna. 7 ΕΡ1824775Β1

De acordo com modalidades adicionais, a composição de desbridamento obtida a partir da bromelina de acordo com os princípios da presente invenção compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

De acordo com outro aspeto, a presente invenção providencia um método para obter uma composição de desbridamento da bromelina, a composição de desbridamento compreendendo enzimas proteolíticas com pesos moleculares de cerca de 23 kDa, dita composição sendo substancialmente desprovida de inibidores da bromelina, o método compreendendo as etapas seguintes: (a) suspender bromelina com uma solução acídica opcionalmente compreendendo um anti-oxidante, a solução acídica tendo um pH no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4; (b) ajustara suspensão de (a) para um pH no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4; (c) adicionar um auxiliar de filtração à suspensão de (b) ; (d) filtrar a suspensão de (c) para remover componentes insolúveis; (e) adicionar à solução filtrada de (d) sal de sulfato de amónio para produzir saturação de sulfato de amónio no intervalo de cerca de 40% acerca de 50%; (f) ajustar a suspensão de (e) a um pH de cerca de 2,5 acerca de 4; (g) incubar a suspensão de (f) a 3°C-10°C; (h) centrifugar a suspensão de (g) para produzir precipitado de sulfato de amónio; (i) dissolver o precipitado de sulfato de amónio numa solução acídica opcionalmente compreendendo um anti-oxidante tendo um pH no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4; (j) filtrar a solução de (i) de modo que as enzimas 8 ΕΡ1824775Β1 proteolíticas tendo pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa são retidas; e (k) liofilizar a solução retida de (j).

De acordo com uma modalidade atualmente preferida, a presente invenção providencia um método para obter uma composição de desbridamento da bromelina, a composição de desbridamento compreendendo enzimas proteolíticas tendo pesos moleculares de cerca de 23 kDa, dita composição sendo substancialmente desprovida de inibidores da bromelina, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) suspender a bromelina com 0,3 M ácido acético compreendendo 1 % de ácido ascórbico e n-octanol tendo um pH de cerca de 2,4 acerca de 2,6; (b) ajustar a suspensão de (a) para um pH no intervalo de cerca de 2,5 acerca de 3,5; (c) adicionar um auxiliar de filtração compreendendo sílica para a suspensão de (b); (d) filtrar a suspensão de (c) através de um filtro prensa para remover componentes insolúveis; (e) adicionar à solução filtrada de (d) sal de sulfato de amónio (285 g/L) para produzir 40% de saturação de sulfato de amónio; (f) ajustar a suspensão de (e) para um pH de cerca de 2,5 acerca de 3,5; (g) incubar a suspensão de (f) durante aproximadamente 12-24 horas a 4°C; (h) centrifugar a suspensão de (g) para produzir um precipitado de sulfato de amónio; (i) dissolver o precipitado de sulfato de amónio em 0,3 M ácido acético compreendendo 1% ácido ascórbico tendo um pH de cerca de 2,4 acerca de 2,6; (j) filtrar a solução de (i) através de um ultra filtro com 10 kDa, de modo que as enzimas proteolíticas com pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa sejam 9 ΕΡ1824775Β1 retidas; (k) filtrar a solução retida de (j) para produzir uma solução estéril; e (l) liofilizar a solução filtrada de (k).

De acordo com um aspeto adicional, a presente invenção providencia a utilização de uma composição de desbridamento de acordo com os princípios da presente invenção para o fabrico de um medicamento para tratar uma ferida desbridando tecidos não viáveis.

De acordo com algumas modalidades, uma ampla variedade de feridas pode ser tratada com a composição farmacêutica da invenção incluindo, mas não limitado a, queimaduras de espessura total e parcial, queimaduras solares, enregelamento; lesões ulcerativas tais como úlceras de pressão (decubitus) e varicosas, úlceras de estase e tróficas; feridas associadas com procedimentos cirúrgicos tais como amputação, incisão, circuncisão e episiotomia; feridas traumáticas e piogénicas; vaginite; cervicite; feridas de cisto pilonidal; e tecido cicatrizante de cataratas. As composições farmacêuticas da invenção também são úteis para a preparação de locais para enxertos dérmicos.

Estas e outras modalidades da presente invenção serão melhor entendidas em relação às figuras, descrição, exemplos, e reivindicações que se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIGURA 1 mostra um esquema do método para preparar Debrase a partir da bromelina. A FIGURA 2 mostra um cromatograma por exclusão de tamanho de um extrato cru da bromelina. 0 pó da bromelina 10 ΕΡ1824775Β1 foi extraído com tampão fosfato pH 6,1 saturado com acetato de fenilmercúrio e centrifugado. 0 sobrenadante foi aplicado a uma coluna preparativa de HPLC por exclusão de tamanho e eluído com o mesmo tampão. As frações foram recolhidas. Os quadrados representam a absorvência a 280 nm e os círculos representam a % de inibição da atividade esterolítica de Debrase. A FIGURA 3 mostra cromatogramas por exclusão de tamanho de Debrase (painel superior) e bromelina (painel inferior). A bromelina foi sujeita a cromatografia por exclusão de tamanho e três picos proteicos (isto é, picos numerados 1, 2 e 3) apareceram aos, aproximadamente, 32,35 e 40 minutos, respetivamente (painel inferior). Debrase foi sujeito à mesma cromatografia por exclusão de tamanho e apenas um pico proteico apareceu, aproximadamente, aos 32 minutos (painel superior). Os picos n.° 2 e 3, que apareceram no cromatograma da bromelina, foram indetetáveis no cromatograma de Debrase. O pico n.° 3 foi identificado como inibidor da bromelina, e o pico n.° 2 foi considerado ou um contaminante ou um inibidor. A FIGURA 4 mostra a atividade desbridante de duas preparações de Debrase na pele de orelha de porco. O tempo para rasgar das peças de pele de orelha de porco foi medido como uma função das concentrações de Debrase. A FIGURA 5 mostra a atividade desbridante de duas preparações da bromelina na pele de orelha de porco. O tempo para rasgar das peças de pele de orelha de porco foi medido como uma função das concentrações da bromelina. A FIGURA 6 mostra a atividade desbridante de Debrase e bromelina na pele de orelha de porco. O tempo para rasgar das peças de pele de orelha de porco foi medido como uma função das concentrações de Debrase e da bromelina. 11 ΕΡ1824775Β1 A FIGURA 7 mostra uma eletroforese bidimensional em gel de Debrase obtida a partir da bromelina. 0 Debrase foi isolado a partir da bromelina (ver Exemplo 1 aqui a seguir) e sujeito a uma eletroforese bidimensional em gel. Quatro locais de proteína designados 1-4 foram identificados por análise MS/MS. A FIGURA 8 mostra uma eletroforese bidimensional em gel de uma mistura proteolítica obtida a partir da bromelina. Uma mistura proteolítica foi preparada a partir da bromelina de acordo com o procedimento descrito na patente U.S. N.° 5830739. A mistura foi sujeita a eletroforese bidimensional em gel cinco locais de proteína designados 5-9 foram identificados por análise MS/MS.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAINVENÇÃO A presente invenção providencia uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina, a composição compreendendo enzimas proteolíticas tendo pesos moleculares de cerca de 23 kDa, sendo substancialmente desprovida de inibidores da bromelina. A invenção providencia ainda métodos para obter dita composição de desbridamento e método de utilizar a mesma. É agora revelado, pela primeira vez, que combinando duas etapas, isto é, adição de auxiliar de filtração e filtração, ao método para preparar uma mistura proteolítica a partir da bromelina como revelado na Patente U.S. N.° 5830739, permite obter uma composição de desbridamento com características bioquímicas e biológicas melhoradas. A composição de desbridamento da presente invenção contém a maior parte das enzimas proteolíticas da bromelina, isto é, enzimas tendo pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa, mas é essencialmente desprovida de proteínas de baixo peso molecular, isto é, inibidores da bromelina tendo pesos 12 ΕΡ1824775Β1 moleculares de cerca de 5-6 kDa. A composição tem atividade de desbridamento superior à da bromelina e mostra conteúdo proteico replicável.

De acordo com um aspeto, a presente invenção providencia uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina, a composição de desbridamento compreendendo enzimas proteoliticas tendo pesos moleculares de cerca de 23 kDa, em que dita composição é substancialmente desprovida de inibidores da bromelina.

Como baseado ao longo da especificação e reivindicações, o termo "bromelina" refere-se a qualquer de um número de preparações de pó de bromelina atualmente comercialmente disponíveis. Exemplos de fabricantes de bromelina incluem, mas não estão limitados a, Sigma e Challenge Bioproducts Co. Ltd., Taiwan. A bromelina é preparada a partir do talo da planta do ananás. Um procedimento típico para obter a bromelina é como se segue: o sumo do talo da planta do ananás é primeiro ajustado a um pH de cerca de 3 ou 4 com ácido fosfórico, e hidreto de sódio ou sulfidreto de sódio é adicionado para proteger contra a oxidação por sulfidrilo. 0 material inerte é precipitado acerca de acetona a 30% e, após filtração, o fluído clarificado é precipitado com acetona a 70%. Este precipitado é colhido por centrifugação e ou redissolvido em água contendo hidreto de sódio ou sulfidreto de sódio que foi acidificado com ácido fosfórico e reprecipitado, ou seco num forno de vácuo diretamente. Se o material é reprecipitado, acetona a 70% é utilizada. O material seco de qualquer um destes processos é adequado como material de partida para conter a composição de desbridamento da presente invenção.

Um método previamente publicado para obter uma mistura proteolítica a partir da bromelina, cujo método 13 ΕΡ1824775Β1 compreendendo uma etapa de concentrar a solução sobre membranas com pontos de corte de30 kDa, foi sugerido eliminar inibidores da bromelina (ver patente U.S. N.° 4329430). Contudo, como o método revelado na patente U.S. N.° 4329430 compreende a etapa de concentrar a solução sobre membranas com pontos de corte de30 kDa, outras proteínas com pesos moleculares de até 30 kDa foram também presumivelmente removidas pela concentração. Outro método previamente publicado compreende uma etapa de filtrar o extrato através de membranas com pontos de corte de 10 kDa (ver patente U.S. N.° 5830739), contudo não foi providenciada indicação para a ausência da atividade de inibidor da bromelina. Em contraste com a arte antecedente, a presente invenção providencia meios para purificar ainda mais uma composição de desbridamento a partir da bromelina e para caracterizar bioquimicamente a composição de desbridamento. Como tal, a composição de desbridamento obtida de acordo com os princípios da presente invenção é mostrada como sendo substancialmente desprovida de inibidores da bromelina e é mais ativa no desbridamento de tecidos não viáveis do que métodos publicados previamente.

Os inibidores da bromelina são polipéptidos com pesos moleculares de aproximadamente 5-6 kDa (ver, por exemplo, Perlstein, S.H. e Kezdy, F.J., Supramol. Struct. 1:249-254,1973). De acordo com os Exemplos revelados aqui a seguir, a composição de desbridamento obtida a partir da bromelina de acordo com os princípios da presente invenção, compreende proteínas com pesos moleculares aparente sem excesso de cerca de 10 kDa, cuja composição sendo essencialmente desprovida de inibidores da bromelina. O termo "cerca de" quando se refere a um peso molecular de uma proteína pretende-se que inclua 2 kDa para cima e para baixo do peso molecular da proteína. Por exemplo, se uma proteína tem um peso molecular de cerca de 10 kDa, significa que o peso molecular da proteína pode oscilar 14 ΕΡ1824775Β1 entre 8 kDa e 12 kDa. 0 termo "substancialmente desprovida" refere-se a composições compreendendo no máximo quantidades residuais de inibidores da bromelina comparadas com a quantidade presente no extrato cru da bromelina, isto é, o material de partida a partir do qual a composição de desbridamento da invenção é obtida. 0 termo "quantidade residual" como utilizado aqui pretende-se que indique que os inibidores da bromelina constituem não mais de 10% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento. Preferencialmente, os inibidores da bromelina constituem não mais de 5% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento, mais preferencialmente não mais de 2% p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento, e mais preferencialmente não mais de 1 % p/p do conteúdo proteico da composição de desbridamento.

De acordo com outro aspeto, a presente invenção providencia um método para obter uma composição de desbridamento a partir da bromelina, a composição compreendendo enzimas proteoliticas tendo pesos moleculares de cerca de 23 kDa, dita composição sendo substancialmente desprovida de inibidores da bromelina, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) suspender a bromelina com uma solução acídica tendo um pH no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4; (b) ajustar a suspensão de (a) para um pH no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4; (c) adicionar um auxiliar da filtração à suspensão de (b) ; (d) filtrar a suspensão de (c) para remover componentes insolúveis; (e) adicionar à solução filtrada de (d) sal de sulfato de amónio para produzir saturação de sulfato de amónio no 15 ΕΡ1824775Β1 intervalo de cerca de 40% acerca de 50%; (f) ajustar a suspensão de (e) para um pH de cerca de 2,5 acerca de 4; (g) incubar a suspensão de (f) a 3°C - 10°C; (h) centrifugar a suspensão de (g) para produzir um precipitado de sulfato de amónio; (i) dissolver o precipitado de sulfato de amónio numa solução acidica opcionalmente compreendendo um anti-oxidante tendo um pH no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4; (j) filtrar a solução de (i) de modo que as enzimas proteoliticas tendo pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa sejam retidas; e (k) liofilizar a solução retida de (j).

De acordo com a invenção, suspender a bromelina é realizada em qualquer solução acidica tendo um pH entre cerca de2,4 a 4. Exemplos de soluções acídicas ou tampões que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a, ácido acético em água, tampão acetato e tampão acetato contendo ácido tioglicólico a 1%, pH 2,4-4. De acordo com certas modalidades exemplares, a solução acidica é selecionada dos tampões e soluções reveladas nas patentes U.S. N.°s 5830739 e 4197291, o conteúdo das quais é incorporado por referência como se totalmente estabelecido aqui. A solução acidica pode opcionalmente compreender um anti-oxidante. Exemplos de antioxidantes incluem, mas nao se limitam a, ácido ascórbico, dihidroquinona, hidroxitolueno butilado e ditiotreitol. 0 anti- -oxidante pode ser adicionado a uma concentração de cerca de 0,5% acerca de 2%, preferencialmente a 1 %. A solução acidica pode ainda compreender um agente humidificante. Exemplos de agentes humidificantes incluem, 16 ΕΡ1824775Β1 mas não se limitam a, n-octanol. 0 pH da solução acídica, que opcionalmente compreende um anti-oxidante, deveria estar no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4. De acordo com uma certa modalidade preferida, o pH da solução acídica, que opcionalmente compreende um anti-oxidante, oscila de cerca de 2,4 acerca de 2,6. 0 termo "cerca de" quando se refere a um pH de uma solução ou suspensão pretende-se que indique que 0,1 unidades de pH para baixo ou para cima do pH indicado estão dentro do âmbito da presente invenção.

De acordo com a invenção, uma uxiliar de filtração é adicionado à suspensão de (a) . De acordo com uma modalidade, o auxiliar de filtração compreende sílica.

Preferencialmente, o auxiliar de filtração é diatomite natural que é calcinada de modo a que sejam conseguidas taxas de fluxo mais rápidas.

Precipitar as proteínas desejadas é realizado adicionando à solução filtrada da etapa (d) sal de sulfato de amónio. 0 sal de sulfato de amónio pode ser adicionado para produzir saturação de sulfato de amónio num intervalo entre cerca de 40% acerca de 50%. Preferencialmente, o sal de sulfato de amónio pode ser adicionado para produzir 40% de saturação de sulfato de amónio. A suspensão da etapa (f) é depois incubada a uma temperatura entre 3°C a 10°C. Preferencialmente, a suspensão da etapa (f) é incubada durante, pelo menos, 10 horas a temperaturas entre 3°C a 10°C. Mais preferencialmente, a suspensão da etapa (f) é incubada durante 12-24 horas a 4°C.

No final da incubação, a suspensão da etapa (g) é centrifugada para precipitar as proteínas desejadas, isto 17 ΕΡ1824775Β1 é, as enzimas proteolíticas. 0 precipitado é então dissolvido numa solução acidica opcionalmente compreendendo um anti-oxidante. De acordo com uma modalidade exemplar, a suspensão é incubada durante, pelo menos,10 horas a 4o C. A solução da etapa (i) é sujeita a uma etapa de filtração para reter as enzimas proteolíticas com pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa. De acordo com uma modalidade preferida, a solução da etapa (i) é filtrada através de uma membrana filtrante com um ponto de corte do peso molecular de cerca de 10 kDa. Será para ser entendido que qualquer membrana fitrante que é capaz de remover os inibidores da bromelina e outros contaminantes enquanto retém as enzimas proteolíticas com pesos moleculares em excesso de 10 kDa é abrangida na presente invenção. A composição de desbridamento pode ser liofilizada após filtração pode ser lavada com água destilada e depois liofilizada ou pode ser filtrada e depois liofilizada. De acordo com uma modalidade atualmente preferida, a composição de desbridamento é filtrada através de uma membrana filtrante com um tamanho do poro de, pelo menos, cerca de 0,5 pm para obter uma solução estéril, que é depois liofilizada e armazenada. Tipicamente, a composição de desbridamento é armazenada seca, já que é menos estável na presença de humidade. A composição de desbridamento é dissolvida apenas antes de utilização.

De acordo com uma modalidade atualmente preferida, o método para obter a composição de desbridamento a partir da bromelina compreende as seguintes etapas: (a) suspender a bromelina com 0,3 M ácido acético compreendendo 1 % ácido ascórbico e n-octanol tendo um pH de cerca de 2,4 acerca de 2,6; (b) ajustar a suspensão de (a) para produzir um pH no 18 ΕΡ1824775Β1 intervalo de cerca de 2,5 acerca de 3,5; (c) adicionar um auxiliar de filtração compreendendo sílica à suspensão de (b); (d) filtrar a suspensão de (c) através de um filtro prensa para remover componentes insolúveis; (e) adicionar à solução filtrada de (d) sal de sulfato de amónio (285 g/L) para produzir 40% saturação de sulfato de amónio; (f) ajustar a suspensão de (e) para um pH de cerca de 2,5 acerca de 3,5; (g) incubar a suspensão de (f) durante aproximadamente 12-24 horas a 4°C; (h) centrifugar a suspensão de (g) para produzir um precipitado de sulfato de amónio; (i) dissolver o precipitado de sulfato de amónio em 0,3 M ácido acético compreendendo 1% ácido ascórbico tendo um pH de cerca de 2,4 acerca de 2,6; (j) filtrar a solução de (i) através de um ultra filtro de 10 kDa, de modo que as enzimas proteolíticas com pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa sejam retidas; (k) filtrar a solução retida de (j) para produzir uma solução estéril; e (l) liofilizar a solução filtrada de (k).

Composição farmacêutica A presente invenção providencia uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina, cuja composição compreendendo enzimas proteolíticas tendo pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa, em que dita composição é essencialmente desprovida de inibidores da bromelina.

De acordo com algumas modalidades, a composição de desbridamento da presente invenção pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para produzir uma composição farmacêutica. 19 ΕΡ1824775Β1 0 termo "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo que entrega os componentes ativos ao alvo pretendido e que não causa dano a humanos ou a outros organismos recetores. Como utilizado aqui, "produto farmacêutico" será entendido que abrange produtos farmacêuticos ambos humanos e animais. Veículos úteis incluem, por exemplo, água, acetona, etanol, etileno glicol, propileno glicol, butano-1,3-diol, isopropilo miristat, isopropilo palmitato, ou óleo mineral. A metodologia e componentes para formulação de composições farmacêuticas são bem conhecidos, e podem ser encontrados, por exemplo, na Pharmaceutical Sciences de Remington, 18a Edição, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Co. Easton Pa., 1990. A composição farmacêutica pode ser formulada em qualquer forma apropriada para aplicação a pacientes. A via geralmente preferida de administração é por aplicação tópica ao local a ser tratado. Em conformidade, a composição farmacêutica pode ser formulada numa forma adequada para aplicação tópica, por exemplo, em soluções, suspensões, cremes, loções, géis, espumas, vaporizadores, pó seco, e afins. A composição farmacêutica pode ser aplicada diretamente ao tecido lesado ou pode ser aplicada a uma preparação inerte, tal como gaze, e depois aplicada ao tecido lesado.

As composições farmacêuticas também podem compreender outros materiais opcionais, que podem ser escolhidos dependendo do veículo. Componentes adicionais incluem, mas não se limitam a, conservantes tais como timerosal, álcoolbenzil ou parabenos, agentes espessantes tais como polietileno glicol, ácido hialurónico, carbapol ou glicerol, agentes antimicrobianos tais como antibióticos ou agentes antifúngicos, e substâncias de volume tais como lactose ou manitol. Um agente queratinolítico tal como 20 ΕΡ1824775Β1 ureia pode ser adicionado para auxiliar na dissecação do tecido de escaras. A utilização terapêutica da composição de desbridamento A presente invenção providencia a utilização de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de desbridamento de acordo com os princípios da invenção para o fabrico de um medicamento para tratar uma ferida desbridando tecidos não viáveis.

De acordo com uma modalidade, o método para desbridar tecidos não viáveis compreende aplicar uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de desbridamento, em que a composição de desbridamento compreende ainda um veiculo farmaceuticamente aceitável. A composição de desbridamento da invenção é útil no tratamento de feridas. Em particular, a composição de desbridamento é útil em aplicações de desbridamento de feridas e de cura de feridas. As propriedades podem ser demonstradas num número de situações teste, incluindo ensaios clinicos animais e humanos. 0 ensaio mais amplamente utilizado é uma queimadura de espessura parcial em porcos descrita por Mertz et al. (Journal Surgical Research (1990) 48:245-248).

Para o desbridamento da ferida, a eficácia é determinada, entre outras indicações, pela ausência, amolecimento ou dissolvência da escara; a não hidrólise de componentes de tecido viável; e/ou não-irritação da ferida. Para cura da ferida tópica, a eficácia é determinada, entre outras indicações, por contratura da ferida, taxa aumentada de cura e/ou cura melhorada (isto é, manter a resposta a estímulos táteis, menos cicatrizes, neovascularização melhorada, etc.). Assim, o termo "quantidade 21 ΕΡ1824775Β1 terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade da composição de desbridamento necessária para eliminar ou reduzir o tecido de escaras/ou promover a cura da ferida.

Uma grande variedade de feridas pode ser tratada com a composição farmacêutica da invenção incluindo, mas não limitante a, queimaduras de espessura total e parcial; lesões ulcerativas, principalmente úlceras de pressão (decubitus) e varicosas, estase e úlceras tróficas; feridas cirúrgicas tais como amputação, incisional, feridas traumáticas e piogénicas; tratamento de vaginite, cervicite, circuncisões, episiotomia, feridas de cisto pilonidal, carbúnculos, queimadura solar, enregelamento, e tecido cicatrizante de cataratas. 0 desbridamento de tecidos não viáveis pelas composições de desbridamento ou pelas composições farmacêuticas da invenção pode ser realizado por aplicação única no tecido escara ou por aplicações várias desde que o desbridamento seja conseguido. 0 método de desbridamento do tecido de escara de acordo com a presente invenção pode ser realizado em combinação com outros métodos de desbridamento conhecidos.

Os seguintes exemplos são apresentados para providenciar um entendimento mais completo da invenção. As técnicas, condições, materiais, proporções e dados reportados específicos estabelecidos para ilustrar os princípios da invenção são exemplares e não devem ser interpretados como limitantes do âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Preparação de Debrase

Suspensão da bromelina 22 ΕΡ1824775Β1 A bromelina SP (4 Kg de pó; Challenge Byproducts Co. Ltd., Taiwan) foi suspensa em 40 litros de uma solução suspensão contendo 0,3M ácido acético, 1% ácido ascórbico, e 70 mg/ml n-octanol, pH 2,4-2,6 e condutividade 1,0-1,2 mS como se segue: a solução suspensão foi preparada de fresco (não mais de um dia antes do uso) e foi pré-arrefecida a 3-5°C. A bromelina foi adicionada lentamente à solução suspensão pré-arrefecida sob agitação. Após 10 minutos o pH da suspensão foi medido e ajustado para 2,5 - 3,5 com 1M ácido acético ou 0,1 M hidróxido de sódio. A suspensão foi continuamente agitada a 3-5°C, durante a noite (FIGURA 1).

Filtração através de filtro prensa

Após incubação durante a noite, a suspensão foi diluída com um volume igual de uma solução de diluição contendo 0,3M ácido acético e 1 % ácido ascórbico (pH 2,4-2,6). Um auxiliar de filtração, Celite Hyflo (60g/L; Merck, Alemanha), foi adicionado lentamente à suspensão diluída com agitação contínua durante, pelo menos, 15 minutos. A suspensão foi depois filtrada através de um filtro prensa (Celatom, Difenbach, Itália) equipado com almofadas filtradoras IF 350 e CRESPASTE 110 (Indastrialfiltro,

Itália) para remover componentes insolúveis. Após a primeira ronda de filtração, a solução proteica (filtrado) foi recirculada através do filtro prensa, e o filtrado limpo foi recolhido e pré-arrefecido a 3-5°C. No final da filtração, o filtro prensa foi enxaguado com cerca de 20 L da solução de diluição e purgado com ar para remover proteínas residuais do filtro. A solução contendo as proteínas residuais do filtro foi combinada com o filtrado e agitada continuamente a 4-6°C.

Precipitação com sulfato de amónio O sulfato de amónio (285 g/L) foi adicionado 23 ΕΡ1824775Β1 lentamente ao filtrado agitado. 0 pH da solução resultante foi ajustado para 2,5-3,5 com 1M ácido acético ou 0,1M hidróxido de sódio. Após 10-15 minutos, a agitação foi parada e a solução foi incubada durante a noite a 3-5°C.

Centrifugação A solução proteica contendo sulfato de amónio foi separada por centrifugação a 14,000g. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi recolhido.

Dissolução da proteína O precipitado foi ressuspenso durante a noite a 3-5°C em 40 L de uma solução de diluição preparada de fresco contendo 0,3M ácido acético e 1 % ácido ascórbico, pH 2,4-2,6 sob agitação como se segue: a solução de diluição foi preparada e pré-arrefecida a 3-5°C. O precipitado foi adicionado lentamente à solução de diluição durante cerca de 15 minutos com agitação contínua. A suspensão foi agitada a 3-5°C durante a noite.

Ultrafiltração (concentração e diálise) A suspensão foi pré-filtrada através de um filtro Milligard com 0,5 pm (Millipore, França). O filtrado foi recolhido. No final da filtração, o filtro foi purgado com ar para remover proteínas residuais. A solução filtrada foi depois diafiltrada através de uma unidade de ultrafiltração contendo 4 membranas com ponto de corte do peso molecular de 10 kD (Millipore; Pelicon-2; 10 KD) . O sistema de ultrafiltração reunido foi pré-enxaguado com água destilada e depois equilibrado com uma solução de diálise contendo 0,1M ácido acético e 1 g/1 sulfato de amónio. A solução proteica foi primeiro concentrada para uma concentração de proteína de cerca de 100 g/1 (cerca de 10 litros) e 24 ΕΡ1824775Β1 dialisada contra 4,5-5 volumes do tampão de diálise para atingir uma condutividade de < 3,8 mS e pH 3±0,2. A solução foi agitada a < 15°C. No final da diafiltração, o volume do retentado foi reduzido acerca de 5 L. As membranas de ultrafiltração foram depois enxaguadas com a solução de diálise até um volume final de 10 L.

Filtração estéril e liofilização A solução diafiltrada foi filtrada através de um pré-filtro Milligard com 0,5 pm e depois através de um filtro Minidisk 40 com 0,22 pm absoluto(Millipore, França). O filtrado foi recolhido em bandejas de aço inoxidável de liofilização e liofilizado num liofilizador (USIFROID, França). A composição de desbridamento liofilizada assim preparada é chamada aqui Debrase.

Preenchimento O preenchimento do pó Debrase liofilizado foi realizado de acordo com um peso pré-estabelecido. Debrase foi preenchido em garrafas de vidro livres de pirogénio (30 ml (Saint-Gobain, França) e fechadas com roscas de plástico. As garrafas cheias foram armazenadas num congeladora -20°C. A quantidade de pó de Debrase produzida a partir de 4 Kg da bromelina foi 720-750 g por lote. EXEMPLO 2

Debrase é desprovido de inibidores da bromelina

Purificação dos inibidores da bromelina Pó de bromelina (2,5 g) foi suspenso em 10 ml de 0,1 M tampão de fosfato de potássio pH 6, 1 saturado com acetato de fenilmercúrio durante 10 minutos. Após centrifugação 25 ΕΡ1824775Β1 durante 10 minutos (3500 rpm), 1 ml do sobrenadante foi aplicado à cromatografia por filtração em gel numa coluna de preparação em série HPLC Hi Load 16/60 Superdex 75, equilibrada e eluida com o mesmo tampão. Foram recolhidas frações de 5 ml 30 minutos depois da aplicação da amostra. Para cada das frações eluidas, foram medidos três parâmetros: (i) absorvância a 280 nm (A2so) ; (ii) atividade esterolitica; e (iii) inibição da atividade esterolitica de Debrase. A atividade esterolitica das frações de bromelina foi testada por espectrofotometria a pH 4,6 utilizando o substrato cromogénico p-nitrofenilo Ncx-benziloxicarbonil-L-lisinato (CLN) como se segue:

Um mililitro de tampão de acetato de sódio (10 mM) contendo 0,1 M KCI e 1 mM L-cisteína, pH 4,6 foi colocado numa cuvete de plástico a 25°C. CempL de fração eluida (a uma concentração de 2,5 mg/ml) foram adicionados. A solução foi incubada durante 2 minutos e depois 50 μΐ de solução CLN (2,5 mM em acetonitrilo 10 % água) foram adicionados. A cuvete foi misturada e o aumento na absorvância a 317 nm foi monitorizado durante 5 minutos. A hidrólise espontânea do substrato foi monitorizada na presença de tampão apenas em vez de frações eluidas. A inibição da atividade esterolitica de Debrase foi medida como se segue: vinte pL de Debrase (0,25 mg/ml)foram incubados com as várias frações de HPLC e a atividade esterolitica de Debrase foi testada por espectrofotometria a um pH 4,6 utilizando CLN como descrito anteriormente.

Como mostrado na FIGURA 2, a bromelina do talo foi eluida nas frações 5-13 e 14-20. Contudo, os inibidores da bromelina, que mostram inibição da atividade esterolitica de Debrase, foram eluidos nas frações 22-29. 26 ΕΡ1824775Β1 0 quadro 1 mostra a atividade esteroliticade Debrase na ausência ou presença das frações eluidas #20-30. Como observado no quadro 1, as frações 22-29 inibiram a atividade esterolitica de Debrase. A inibição mais pronunciada foi obtida com as frações 23-25. Verificou-se que o peso molecular aparente da atividade inibidora era cerca de 5-6 kDa, indicando assim que os inibidores da bromelina eluiram nas frações 23-25.

Quadro 1: Resultados da atividade esteroliticade Debrase na presença de frações de bromelina.__

Composto Atividade Proteolitica % Inibição Debrase 945 0 + lmM Iodoacetamida 593 37, 0 + Fração 20 (5 yg) 938 0,7 (continuação) Composto Atividade Proteolitica % Inibição + Fração21 (5 yg) 860 9, 0 + Fração22 (5 yg) 732 22,5 + Fração23 (5 yg) 172 81,7 + Fração24 (5 yg) 185 80,4 + Fração25 (5 yg) 164 82, 6 + Fração26 (5 yg) 457 51, 6 + Fração27 (5 yg) 587 37,8 + Fração28 (5 yg) 710 24,8 + Fração29 (5 yg) 802 15, 1 + Fração30 (5 yg) 920 2, 6

Análise HPLC de Debrase

Foi realizada uma cromatografia por exclusão de tamanho de Debrase e do seu material de partida, a bromelina, de modo a caracterizar e analisar as diferenças entre estas duas misturas enzimáticas. Debrase e bromelina foram cada aplicados numa coluna de HPLC TSK gel 3000Swxl e a coluna foi corrida a uma taxa de fluxo de 0,4 ml/min de 27 ΕΡ1824775Β1 40 mM tampão fosfato contendo 130 mM NaCl. A FIGURA 3 mostra que enquanto na cromatoqrafia de

Debrase apenas um pico de proteína foi obtido (painel superior), na cromatografia da bromelina foram obtidos três picos (painel inferior). Dois dos picos principais na bromelina foram identificados: o pico n.° 1 foi identificado como bromelina do talo enquanto o pico n.° 3 foi identificado como o inibidor da bromelina. Como observado na FIGURA 3, os inibidores da bromelina estiveram essencialmente ausentes de Debrase, indicando assim que o método para preparar Debrase permite a remoção dos inibidores da bromelina, produzindo assim composição de enzima livre de inibidor. A eletroforese com gel de SDS-poliacrilamida seguida de espectrometria de massa das proteínas presentes em Debrase e na mistura proteolítica preparada de acordo com a patente U.S. N.° 5830739, o conteúdo da qual está incorporado por referência como se totalmente estabelecido aqui, mostraram que a mistura proteolítica preparada de acordo com a patente U.S. N.° 5830739 continha bromelina do talo, precursor da bromelina do talo, ananaína, e precursor do anan anaco bem como segmento 2 do inibidor 2 da bromelina, enquanto Debrase continha todas as enzimas e precursores de enzima, mas estava desprovido de inibidor da bromelina. Estes resultados, portanto, indicam que o método de preparar Debrase é altamente eficiente em eliminar inibidores da bromelina. EXEMPLO 3

Identificação parcial de proteínas em Debrase

Debrase e uma mistura proteolítica preparada de acordo com a patente U.S. N.° 5830739 foram sujeitas a focagem 28 ΕΡ1824775Β1 isoelétrica e SDS-PAGE como se segue:

Amostras de Debrase ou da mistura proteolítica foram suspensas em 200 pLde 5% ácido trifluórico (TFA) em água durante alguns minutos à temperatura ambiente enquanto misturava. As amostras foram depois centrifugadas a 20,000xg a 4°C durante 30 minutos e os sobrenadantes recolhidos. As concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Bradford. Amostras dos sobrenadantes contendo 100 pg de proteína foram liofilizadas e ressolubilizadas numa solução gel de rehidratação (8 M ureia; 2 M tio-ureia; 5,2 μΐ/ml Pharmalites (pH 3-10); 10 mg/ml CHAPS (Sigma Chemicals Co. ) e 2 mg/ml DTT)e foram carregadas em tiras de gradiente de pH imobilizado (IPG) (18 cm, 3-10 gradiente de pH linear) para focagem isoelétrica por incubação das tiras na solução de rehidratação contendo a proteína durante 24 horas. A focagem isoelétrica foi realizada em quatro passos: 1) gradiente deO- 500 volt para 1000 Volt hora (Vh) ; 2) um potencial constante de 500 volts para 2500 Vh; 3) gradiente de500- 3500 volt para 10,000 Vh e 4) um potencial constante de 3,500 volts para 35,000 Vh. A segunda dimensão foram geis SDS-PAGE de acrilamida 12,5%, bisacrilamida 2,6%. No final da SDS-PAGE, os geis foram corados com Azul de

Coomassie coloidal. A FIGURA 7 mostra o SDS-PAGE de Debrase corado com Azul de Coomassie. A FIGURA 8 mostra um SDS-PAGE da mistura proteolítica corado de Azul de Coomassie preparado de acordo com a patente U.S. N.° 5830739. Como descrito aqui anteriormente, Debrase e a mistura proteolítica foram primeiro sujeitos a focagem isoelétrica e depois a SDS-PAGE. 29 ΕΡ1824775Β1

Identificação da proteína

Locais foram cortados de cada dos géis SDS-PAGE corados com Azul de Coomassie e lavados durante30 minutos em 200 pl de 200mM NH4NCO3-50 % CH3CN a 37°C. Os locais lavados foram depois secos, rehidratados com solução de digestão (0,02 pg ml-1 Tripsina (Promega) ; 40 mM NH4NC03 (pH 8,1); 10 % CH3CN) e incubados durante 16 horas a 37°C. Os péptidos foram extraídos por sonicação em 10 % CH3CN e os péptidos extraídos foram carregados numa microcoluna POROS 50 R2 (PerSeptive Biosystems) para dessalinizar. Os péptidos foram eluídos diretamente numa agulha Q-STAR (Applied Biosystems) e foram medidos e analisados utilizando o programa Analyst QS (Applied Biosystems) . As sequências derivadas da análise MS/MS foram utilizadas para pesquisa BLAST breve na base de dados NCBI. O quadro 5 lista a identidade dos locais da proteína designados 1-4 e 5-9 nas FIGURAS 7 e 8, respetivamente.

Quadro 5. Enzimas proteolíticas e inibidores da bromelina identificados em Debrase ou na mistura proteolítica._

Debrase A Mistura Proteolítica Número do local e Sequência Proteína Número do local e Sequência Proteína #1 AFEFIISNKG bromelina do talo EC 3.4.22.32 #5 QDEYKCYC inibidor de bromelina - XBPI ananás #2 IDWRDSGAVTS Ananaína EC 3.4.22.31 #6 CPGFCKTCKAE inibidor de Bromelina VI S 6 6 6 0 9 30 ΕΡ1824775Β1 (continuação) Debrase A Mistura Proteolitica #3 YPYKAAKGTCKTDG Bromelina dotaloP14518 #7 CVCADTYSDC inibidor de Bromelina VII P01068_2 #4 SRDEPSDPMMK precursor da proteínase da cisteína CAA08861 #8 ATVESIYK GEAGYIR precursor FBSB BAA22544 #9 GS SWGEGGYVR Bromelina de fruto EC 3.4.22.33

Como observado no quadro 5, foram identificados três tipos de inibidor de bromelina (inibidor de bromelina -ananás, inibidor de bromelina VI e VII) na mistura proteolitica, mas não em Debrase. Estes resultados indicam que Debrase é essencialmente desprovido de inibidores. EXEMPLO 4

Atividade in-vivo de Debrase 0 modelo in-vivo de queimadura no porco para a avaliação da eficácia de desbridamento de Debrase foi utilizado. Devido à semelhança estreita da pele de porcos jovens com a dos humanos, sabe-se que o modelo in-vivo da queimadura no porco é um modelo aceite para queimaduras térmicas cutâneas em humanos.

Um dispositivo que inflige queimadura consistindo num elemento de aquecimento radiante elétrico modificado encerrado num revestimento metálico foi ajustado para 400°C durante um período de 15 segundos para criar queimaduras profundas em dermatomas simétricos 3 cm ao longo da sua linha central (espinal). O tamanho da queimadura foi 31 ΕΡ1824775Β1 controlado colocando um molde de amianto com um buraco quadrado com 4,5X4,5 cm, colocado contra o local projetado da queimadura na pele do porco e o infligidor de queimaduras foi anexado ao buraco a uma distância padrão da pele. A pele adjacente foi protegida por escudos de amianto. Um número igual de 5 -14 pares (dependendo da necessidade) de queimaduras profundas foi infligido em cada lado. Quando todas as queimaduras foram infligidas, a camada superior de queratina da escara foi removida esfregando com esponjas Skleaner™ normais empapadas em solução salina até a derme limpa exposta ser revelada. Toda a área queimada foi depois hidratada aplicando esponjas de gaze empapadas em solução salina a cada queimadura durante um período de aproximadamente 1 hora, re-aplicando constantemente solução salina para assegurar que as áreas queimadas não secavam.

Após cerca de 1 hora de hidratação, foi colocada uma barreira adesiva em torno de cada área queimada na pele saudável circundante. Cinco ml de um veículo gel contendo Carbomer 980 e fosfato de sódio dibásico em água, pH 7,4, foram depois misturados com 0,5 gr de pó de Debrase e aplicados sobre a ferida extendendo-se desde o limite interno da barreira adesiva, cobrindo uma área de 5x5 cm. Nos locais controlo, apenas 5 ml do gel forma utilizados. A ferida inteira, coberta com a camada do gel e rodeada pela barreira adesiva, foi depois coberta comum filme oclusivo que aderiu à barreira adesiva. O filme oclusivo aderiu infimamente ao gel de modo que não ficou qualquer arde baixo do filme. Uma sonda de baixa temperatura foi inserida através da barreira adesiva para monitorizar a temperatura do gel na câmara, que foi mantida a 37°C a 40°C utilizando uma lâmpada de aquecimento. A traseira inteira foi coberta com uma preparação de algodão suave (gaze) (Kerlix ou afim) de modo a estabilizar todas as preparações oclusivas nos vários locais. A preparação foi deixada durante quatro 32 ΕΡ1824775Β1 horas. Depois, a preparação foi removida, o gel com a escara dissolvida foi esfregado com um depressor lingual de madeira e a cama da ferida esfregada com o Skleaner até todo o tecido solto ou dissolvido foi removido. Depois de limpar as feridas, as feridas foram empapadas com gaze empapada em solução salina durante outra hora e avaliada visualmente.

Quadro 2: Atividade In Vivo da Bromelina e Debrase

Substrato desbridante Quantidade Veiculo utilizado Quantidade Classificação (g) (g) Final Bromelina (lote 06 0, 5 Gel MG20/C05-08 0,5 2,5 03) Bromelina (lote 06 0, 5 Gel MG20/C05-08 0,5 2 03) Bromelina (lote 06 0,25 Gel MG20/C05-08 0,5 2 03) Bromelina (lote 06 0,25 Gel MG20/C05-08 0, 5 2 03) Bromelina (lote 06 0, 125 Gel MG2 0/C05-08 0, 5 1,5-2 03) Bromelina (lote 06 0, 125 Gel MG20/C05-08 0, 5 2 03) Bromelina (lote 06 0,0625 Gel MG20/C05-08 0, 5 1-1,5 03) Bromelina (lote 06 0,0625 Gel MG20/C05-08 0, 5 1,5 03) Debrase MD2/D01-04 0,5 Gel MG20/C05-08 0,5 5 Debrase MD2/D01—04 0,5 Gel MG20/C05-08 0, 5 4,5 Debrase MD2/D01—04 0,25 Gel MG20/C05-08 0,5 4 Debrase MD2/D01-04 0,25 Ge 1 MG20/C05-08 0, 5 4 Debrase MD2/D01-04 0,125 Gel MG20/C05-08 0,5 3,5 Debrase MD2/D01-04 0, 125 Gel MG20/C05-08 0, 5 3,5-4 Debrase MD2/D01-04 0,0625 Gel MG20/C05-08 0, 5 3 Debrase MD2/D01-04 0,0625 Gel MG20/C05-08 0, 5 3,5 33 ΕΡ1824775Β1

Como mostrado no quadro 2, verificou-se que Debrase era mais eficiente no desbridamento de uma queimadura do que a bromelina. Por exemplo, 0,5 g de Debrase produziram uma média de Pontuação para Avaliação Visual (VAS) de 4,75 (a classificação mais alta é 5) comparado com um VAS médio de 2,25 para a mesma quantidade de bromelina. Além disso, 0,25 g de Debrase desbridaram as queimaduras muito melhor do que a bromelina (VAS 4 comparado com VAS 2, respetivamente). EXEMPLO 5

Atividade ex-vivo de Debrase

Foi realizado um teste ex-vivo baseado na digestão de peças de tecido de pele de porco por Debrase. As peças de pele de orelha de porco (cerca de 1 cm em diâmetro) foram queimadas e sujeitas à proteólise por Debrase. O tempo para rasgar do tecido pela Debrase foi monitorizado. O ensaio foi realizado como se segue:

Pele de orelha de porco foi preparada separando a pele da cartilagem e removendo o excesso de gordura. Peças de pele de orelha de porco foram fervidas durante 20 segundos e colocadas no fundo de um suporte de pele com 5 ml de PD-Tip por cima e o cimo do suporte de pele é apertado no topo. Debrase ou bromelina foram misturados com uma fase aquosa (por exemplo, Gel, Silverol ou tampão) e aplicada no fundo da célula utilizando ou uma seringa ajustada com um tubo de plástico ou uma pipeta. O tempo para rasgar das peças de pele de orelha foi medido. 34 ΕΡ1824775Β1

Resultados

Quadro 3: Atividade desbridante ex vivo de Debrase. MD5/C07-45 MD2/D01-45 mg/ml 1 2 3 Média 1 2 3 Média D .P 0,375 181 272 272 241,7 265 270 236 257,0 18,36 0,75 263 200 237 233,3 216 261 144 207,0 59, 02 1,56 193 101 163 152,3 132 131 168 143,7 21,08 3,125 127 128 131 128,7 118 103 87 102,7 15,50 6,25 74 61 30 55, 0 56 78 68 67,3 11,02 12,5 62 57 60 59, 7 48 65 48 53,7 9, 81 25 43 16 33 30,7 44 42 49 45, 0 3, 61 50 88 21 55 54 33 52 22 35, 67 15, 18

Quadro 4:Atividade desbridante ex vivo da bromelina BSP 05 03 BSP 06 03 mg/ml I 2 3 Média I 2 3 Média 0,375 232 232 231 231,7 231 230 229 230, 0 0,75 144 240 136 173, 3 240 240 171 217, 0 1,56 149 180 141 156, 7 240 160 133, 3 3, 125 114 161 229 168,0 110 97 160 122,3 6,25 142 121 105 122,7 80 110 106 98,7 12,5 64 139 195 132,7 102 134 83 106, 3 25 36 104 53 64,3 34 58 63 51,7 50 37 35 72 48, 00 56 55 32 47, 67

Os quadros 3 e 4 mostram a diferença de atividade ex-vivo entre Debrase e bromelina. 0 quadro 3 e a FIGURA 4 mostram que Debrase a uma concentração de 12,5 mg/ml em tampão desbridou a pele de orelha de porco queimada em 56,7 ± 9,81 minutos. Concentrações mais elevadas de Debrase não resultaram num desbridamento mais rápido. Concentrações mais baixas de Debrase causaram desbridamento durante períodos de tempo mais longos. 0 limite de deteção para Debrase foi 3,125 mg/ml (115,35 ± 15,5 minutos). 35 ΕΡ1824775Β1

Os resultados também mostraram que Debrase é mais eficiente no desbridamento de tecido a baixas concentrações do que o seu material de partida, a bromelina (ver FIGURA 4 vs FIGURA 5) . Como mostrado na FIGURA 6, concentrações baixas (0-5 mg/ml) e altas (20-50 mg/ml) de Debrase e bromelina exibem tempos para rasgar semelhantes. Contudo, a concentrações de 5-20 mg/ml verificou-se que Debrase era duas vezes mais rápido do que a bromelina em rasgar a pele de orelha de porco.

Será apreciado por pessoas habilitadas na arte que a presente invenção não está limitada pelo que foi mostrado em particular e descrito aqui anteriormente. Em vez disso, o âmbito da invenção é definido pelas reivindicações que se seguem. 36 ΕΡ1824775Β1

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões. • US 5505943 A [0004] • US 4197291 A [0007] [0037] • US 4226854 A [0007] • US 4329430 A [0008] [0009] [0033] • US 4307081 A [0009] • US 5106621 A [0010] • US 5387517 A [0010] • US 6335427 B [0010] • US 5830739 A [0012] [0028] [0030] [0033] [0037] [0076] [0077] [0080]

Documentos de patente referidos na descrição • PERLSTEIN ; KEZDY. J. Supramol. Struct, 1973, vol. 1,249-254 [0011] • REDDY, M.N. et al. J. Biol. Chem., 1975, vol. 250, 1741-1750 [0011] • PERLSTEIN, S.H.; KEZDY, F.J. Supramol. Struct, 1973, vol. 1, 249-254 [0034] • Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co, 1990 [0050] • MERTZ et al. Journal Surgical Research, 1990, vol. 48, 245-248 [0055]

Lisboa, 12 de Setembro de 2012 37

Claims

ΕΡ1824775Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina, a composição de desbridamento compreendendo enzimas proteoliticas tendo pesos moleculares de cerca de 23 kDa, dita composição sendo substancialmente desprovida de inibidores da bromelina.
2. A composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 1, em que os inibidores da bromelina são menos de 10% p/p do conteúdo proteico de dita composição de desbridamento.
3. A composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 2, em que os inibidores da bromelina são menos de 5% p/p do conteúdo proteico de dita composição de desbridamento.
4. A composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 3, em que os inibidores da bromelina são menos de 2% p/p do conteúdo proteico de dita composição de desbridamento.
5. A composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 4, em que os inibidores da bromelina são menos de 1% p/p do conteúdo proteico de dita composição de desbridamento.
6. A composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 1 consistindo essencialmente de um único pico de proteina após eluição da coluna de HPLC por exclusão de tamanho TSK-Gel 3000Swxl, o único pico de proteina constituindo proteínas com pesos moleculares de cerca de 23 kDa.
7. A composição de desbridamento de acordo com qualquer 1 ΕΡ1824775Β1 uma das reivindicações 1 a 6 compreendendo ainda um veiculo farmaceuticamente aceitável.
8. Um método de obter a composição de desbridamento a partir da bromelina, a composição de desbridamento compreendendo enzimas proteoliticas tendo pesos moleculares de cerca de 23 kDa, dita composição sendo substancialmente desprovida de inibidores da bromelina, o método compreendendo as seguintes etapas: (a) suspender a bromelina com uma solução acidica opcionalmente compreendendo um anti-oxidante, a solução acidica tendo um pH no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4; (b) ajustar a suspensão de (a) para um pH no intervalo de cerca de 2,5 acerca de 3,5; (c) adicionar um auxiliar de filtração à suspensão de (b) ; (d) filtrar a suspensão de (c) para remover componentes insolúveis; (e) adicionar à solução filtrada de (d) sal de sulfato de amónio para produzir saturação de sulfato de amónio no intervalo de cerca de 40% acerca de 50%; (f) ajustar a suspensão de (e) para um pH de cerca de 2,5 acerca de 43,5; (g) incubar a suspensão de (f) a 3°C-10°C; (h) centrifugar a suspensão de (g) para produzir um precipitado de sulfato de amónio; (i) dissolver o precipitado de sulfato de amónio numa solução acidica opcionalmente compreendendo um anti-oxidante tendo um pH no intervalo de cerca de 2,4 acerca de 4; (j) filtrar a solução de (i) de modo que as enzimas proteoliticas tendo pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa sejam retidas; e (k) liofilizar a solução retida de (j). 2 ΕΡ1824775Β1 9. 0 método de obter uma composição de desbridamento a partir da bromelina de acordo com a reivindicação 8 compreendendo as seguintes etapas: (a) suspender a bromelina com 0,3 M ácido acético compreendendo 1% ácido ascórbico e n-octanol tendo um pH de cerca de 2,4 acerca de 2,6; (b) ajustar a suspensão de (a) para um pH no intervalo de cerca de 2,5 acerca de 3,5; (c) adicionar um auxiliar de filtração compreendendo silica à suspensão de (b); (d) filtrar a suspensão de (c) através de um filtro prensa para remover componentes insolúveis; (e) adicionar à solução filtrada de (d) sal de sulfato de amónio (285 g/L) para produzir 40% saturação de sulfato de amónio; (f) ajustar a suspensão de (e) para um pH de cerca de 2,5 a cerca de 3,5; (g) incubar a suspensão de (f) durante aproximadamente 12-24 horas a 4°C; (h) centrifugar a suspensão de (g) para produzir um precipitado de sulfato de amónio; (i) dissolver o precipitado de sulfato de amónio em 0,3 M ácido acético compreendendo 1% ácido ascórbico tendo um pH de cerca de 2,4 acerca de 2,6; (j) filtrar a solução de (i) através de um ultra filtro com 10 kDa, de modo que as enzimas proteolíticas tendo pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa sejam retidas; (k) filtrar a solução retida de (j) para produzir uma solução estéril; e (l) liofilizar a solução filtrada de (k).
10. A utilização de uma composição de desbridamento obtida a partir da bromelina para o fabrico de um medicamento para 3 ΕΡ1824775Β1 tratar uma ferida desbridando tecidos não viáveis, a composição de desbridamento compreende enzimas proteoliticas tendo pesos moleculares de cerca de 23 kDa, sendo dita composição substancialmente desprovida de inibidores da bromelina.
11. A utilização da composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 10, em que os inibidores da bromelina são menos de 10% p/p do conteúdo proteico de dita composição de desbridamento.
12. A utilização da composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 11, em que os inibidores da bromelina são menos de 5% p/p do conteúdo proteico de dita composição de desbridamento.
13. A utilização da composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 12, em que os inibidores da bromelina são menos de 2% p/p do conteúdo proteico de dita composição de desbridamento.
14. A utilização da composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 13, em que os inibidores da bromelina são menos de 1% p/p do conteúdo proteico de dita composição de desbridamento.
15. A utilização da composição de desbridamento de acordo com a reivindicação 10, em que a composição de desbridamento consiste essencialmente num único pico de proteína após eluição a partir de uma coluna de HPLC por exclusão de tamanho TSK-Gel 3000SWXl, o único pico de proteína constituindo proteínas com pesos moleculares de cerca de 23 kDa.
16. A utilização da composição de desbridamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, em que a 4 ΕΡ1824775Β1 composição de desbridamento compreende ainda um veiculo farmaceuticamente aceitável.
17. A utilização da composição de desbridamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, em que a ferida é selecionada a partir do qrupo que consiste em queimaduras de espessura total e parcial, queimaduras solares, enregelamento, lesões ulcerativas, úlceras de pressão (decubitus), úlceras varicosas, úlceras de estase, úlceras tróficas, feridas associadas com procedimentos cirúrgicos, amputação, incisão, circuncisão e episiotomia, feridas traumáticas e piogénicas, vaginite, cervicite, feridas de cisto pilonidal, tecido cicatrizante de cataratas, e locais para enxerto dérmico. Lisboa, 12 de Setembro de 2012 5