NO165093B - Enzymsammensetning for rensing, bruken av den og framstilling av sammensetningen. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører framgangsmåte for framstilling av en enzymsammensetning som har til formål å fjerne biologiske forurensninger, spesielt forurensninger som inneholder både peptider og lipider.

Brukt i beskrivelsen og i kravene betyr begrepet "enzym" et aktivt enzym hvis ikke annet er spesifisert.

Oppfinnelsen vedrører både terapeutisk rensing av pattedyr og ikke-terapeutisk rensing generelt. Begrepet rensing blir her brukt i sin videste betydning, dvs. rensing av dødt så vel som levende materiale så som forskjellige typer tekstiler, hår, pelsverk, hud, plast, lær, negler, ører, speil, glass, proselen, gebiss, metaller, steiner, tenner, fasader, ganger, kunstarbeider så som malerier, osv. Rensing inkluderer også rensing av mennesker og dyr ved å fjerne substanser så som materie (utsondring av "verk"), fibrin, koagulert blod, "blod-skorper" og dødt vev. Denne siste typen rensing er særlig viktig for behandling av sår, brannsår og utslett, f.eks. for såkalt enzymatisk fjerning av et sykt, dødt eller forurenset vev, men kan også utføres på andre områder av kroppen hvor forurensninger kan opptre. Urinrøret og urinblæra er eksempler på slike andre områder.

Den normale fordøyelsesbefordrende effekten av enzymer

i dyrene så vel som deres autolytiske virkning i dyrene post mortem, er ikke inkludert i begrepet rensing.

I krill (som tilhører ordenen Euphausiaceae) eksisterer en blanding av forskjellige enzymer, så som f.eks. proteinaser (med surt eller nøyt talt-ti1-alkalisk pH-optimum), peptidaser (exo- og endopeptidaser), lipaser, fosfolipaser, amylaser og andre karbonhydrat-degraderingsenzymer, fosfater, nukleaser, nukleotidaser og esteraser (T.E. Ellingsen; Biokjemiske studier over Antarktisk krill; Dr.ing. avhandling. Institutt for Teknisk Biokjemi, Norges Tekniske Høgskole, Trondheim (1982)). Den proteolytiske (trypsinliknende) aktiviteten som eksisterer i vannekstrakt fra krill er studert og beskrevet (C-S. Chen et al. J. Food Biochem. 2 (1978) s. 349-669). Forskjellige ptotease-aktiviteter i vannekstrakter fra lodde er også beskrevet tidligere (A.Gilberg; Autolysis of fich tissue - General Aspects; Thesis; Institute of Fisheries, Universitetet i Tromsø, Norge (1982)).

J. Fod. Biochem. (1988) beskriver isolering av ulike polysakkaridaseog glykosidaseaktiviteter. Chem. Abs. l'76748w/1982 (Agri. Biol. Chem. vol. 46 side 691- 696) beskriver isolering og rensing av to ribonukleaser fra krill. Chem. Abs. 1782S5g/1982 (J. Fod. Biochem. vol. 2, 1978, side 349-366) beskriver rensing av tryptosinliknende enzymer og et karboksypeptidas-A-enzym fra krill.

Felles for den kjente teknikken er en idé, som strider direkte mot den oppfinne riske idé, nemlig å isolere og rense de enkelte enzymer hver for seg fra krill. I følge den foreliggende oppfinnelsen isoleres en blanding av kr i 1lenzymer, hvorved det et vesentlig at det deri inngår såvel endosom exopeptidaser. 1 de anførte publikasjonene angis eller antydes ingen andre anvendelsesområder av kr i 11/kr i 1lenzymer enn som "en ny kilde for proteinføde for mennesker" respektive for tilvirking av industrielle enzymer (hver for seg) med utgangspunkt i krill. Ingen av skriftene antyder på noen måte, at denne blanding av enzymer fra krill skulle være generelt anvendbar til rengjøringsformå1, og enda mindre gir teknikkens stand noen som helst ledetråd om at enzymblandinger i følge oppfinnelsen skulle være svært anvendbare som biologiske rengjøringsmidler uten noen skadelige bivirkninger.

US-A-3,003,917 beskriver en spesifikk blanding av relaxin, visse angitte proteolytiske enzymer og alfa- eller beta-amylase. Knzymblandingen kan anvendes til rensing av sår. Det er ikke oppgitt noe om enzymets opphav. Det skal bemerkes at et enzyms egenskaper beror på dets opphav.

US-A- 3,409,719 angår et debrideringsmiddel i form av et spesielt enzym framstilt gjennom dyrking av en spesifikk baktet iekultu r.

GB-A-1,293,613 beskriver et flytende vaskemiddel som består av en kombinasjon av i og tor seg kjente kommersielt tilgjengelige enzymer (uten opplysninger om enzymets opphav) med flytende vaskemidler.

Så tidlig som i 1913 ble det gjort forsøk på bruk av enzymer i detergenter. Enzymsammensetninger for rensing av dødt materiale, f.eks. som vaskemidler, er tidligere basert på forskjellige mikrobielle proteaser fra slekten Bacillus. En slik protease som er vanlig brukt er subtilisin dannet fra Bacillus subtilis og markedsført blandt annet under navnet Alcalase® (Novo Industri, København, Danmark). Forskjellige lipaser er også blitt brukt til rensing, særlig for å oppnå degradering av lipider. 1 tillegg til enzymer har slike sammensetninger også inneholdt forskjellige anioniske, kationiske og nøytrale detergenter sammen med blekemidler, så som perboratet. Enzymene som hittil er brukt har, som enzymer generelt, vætt relativt ustabile.

Den viktigste enzymsammensetningen på markedet for fjerning av komponentene nevnt ovenfor er

St reptokinase- streptodornase (Varidase<®>, Lederle Lab., American Cyanamid Company, Waynem New Jersey, USA), stabilisert krystallinsk trypsin (Trypuré<®>, Novo Industri, København, Danmark) og bovin fibrinolysin kombinert med deoksyribonuklease (Elase^, Parke Davis & Company,

Detroit, Michigan, USA). Stteptokinase virker på dødt materiale hovedsaklig ved dets effekt på DNA, og streptodornase har en spesifikk fibrinolytisk effekt. Trypsin virker proteolytisk og ekstraheres fra bukspyttkjertel hos okse eller ku. Fibrinolysin-deoksyribonuklease er en kombinasjon av to enzymer - et fibrindegraderingsenzym og et som virker på deoksyribonukleinsyre som er en viktig komponent i materie.

Et spesifikt pepsinliknende enzym (pepsin I) fra Mallotus villosus (lodde) er foreslått brukt ved medisinsk behandling av brannsår (Gildberg, A; sitert ovenfor,, s. 89-90). Bruken av et spesifikt enzym som virker på en type substrat vil trolig gi bare en begrenset nedbryting av forurensningene som er tilstede i sårene. Imidlertid er ingen kombinasjon av dette pepsinliknende enzymet med andre enzymer foreslått for den terapeutiske rensingen hos mennesker.

Enzympreparatene nevnt ovenfor har flere ulemper. Alle er relativt ustabile, noe som fører til raskt avtakende aktivitet, enten i løpet av lagting eller bruk. Deres aktivitet er ofte begrenset til et spesielt pH-område, f.eks. nøytral til moderat alkalisk pH-verdi. Aktiviteten er også i mange tilfeller begrenset til spesielle temperatur-intervaller. Ved en temperatur over SO °C er et raskt tap av aktivitet observert, og ved romtemperatur eller normale utendøtstemperaturer er aktiviteten lav. Effekten av Varidase<®>, Trypure® og Elase® er relativt dårlig.

Bare en moderat fjetningseffekt er vanligvis oppnådd etter en behandling over en periode på tre uker.

Et hovedformål med oppfinnelsen er å komme fram til en framgangsmåte for framstilling av en forbedret enzymsammensetning som skal brukes til fjerning av forurensninger som inneholder substanser av biologisk opprinnelse eller degraderings-produkter fra slike substanser, særlig forurensninger som inneholder både proteiner og lipider. Den skal kunne brukes for fjerning av fibrin, koagulert blod og devitalisert vev ved degradering av disse bestanddelene og derved fremme fjerning av dem uten synlig øking i deres vanninnhold.

Oppfinnelsen er basert på sammensetninger som har mer effektive enzymer enn tidligere kjente sammensetninger. Dette er gyldig for den totale enzymatiske effekten av den forurensingen det er spørsmål om.

Oppfinnelsens hovedformål kan oppnås ved å gå fram som angitt i den karakteriserende delen av patentkrav 1.

Enzymblandinger fra disse dyrene kan oppnåes i høyt utbytte og på en enkel måte. Dyr fra ordenen Euphausiaceae kan f.eks. være antarktisk krill (Euphausia superba), Euphausia crystallorophias, og beslektede slekter og andre slekter av krill, inkludert Meganycliphanes norvegica, Tysanoessa inermis og andre beslektede sLektec. Det kan også brukes fisk som tilhører slekten Mallotus, særlig slekten Mallotus villosus (lodde). Blant andre kilder kan makrell nevnes.

De enzymaktivitetene som er viktigst for oppfinnelsen opptrer i fordøyelseskanalen hos dyrene. Den komplekse blandingen av forskjellige enzymaktiviteter oppnådd fra dyrene er trolig forklaringen på hvorfor sammensetningen gir en overraskende rask degradering av biologiske forurensninger uavhengig av deres opprinnelse. Enzymene er aktive i alkalisk, nøytralt og sutt medium og kan være egnet i rensesammensetninger sammen med forskjellige overflateaktive stoffer (tensider og emulgatorer), og/eller komponenter så som bærere og additiver. Det faktum at sammensetningen kan inneholde en blanding av enzymer gjør den egnet for fjerning av forurensninger som inneholder blandinger av substanser valgt fra gruppen bestående av lipider, fosfolipider, biopolymere så som proteiner, peptider, nukleinsyrer, mucopolysakkarider og polysakkardier, og degraderingsprodukter fra slike forbindelser. Disse forbindelsene er til stede i materie, "blod-skorper" og dødt vev.

I samsvar med oppfinnelsen blir særlig gode resultatet oppnådd dersom enzymene som blir brukt har molekylvekter innenfor området på 15000 til 80000 Dalton eller aktive aggregater av slike enzymer. Særlig er enzymer med molekylevekter fra omtrent 20000 til omtrent 40000 Dalton foretrukket. Disse områdene anvendes på enzymer oppnådd ved en vannekstraksjon av de homogeniserte dyrene, dvs. særlig på enzymer som er vannløselige under ekstraksjonen.

Den nye sammensetningen kan være i form av en salve, et pudder, en pasta, en krem, en spray, en gele, en flytende salve, en bandasje, en olje, en tablett, en saft, et korn, en kapsel, osv.

I utførelsesformen som nå er mest foretrukket er enzymene i preparatet som blir brukt vannløselige og/eller har molekylvekter i området nevnt ovenfor.

Tidsperioden som trengs for å degradere og/eller løse opp forurensningene varierer fra tilfelle til tilfelle, men bør velges tilstrekkelig lang til å la enzymene degradere og/eller løse opp forurensningene. Behandlingen kan om nødvendig gjentas.

Enzympreparatet som brukes kan inneholde mange forskjellige enzymer. F.eks. av typene nevnt ovenfor. 1 samsvar med oppfinnelsen er det mulig å benytte sammensetninger der en eller flere av disse enzymene er blitt fjernet ved metoder kjent per se, f.eks. ved tilsats av en inhibitor spesifikk for et enzym eller ved å fjerne vedkommende enzym.

Den proteolytiske aktiviteten ved optimal temperatur er høy i pH-verdi - området 5-10. Optimal pH-verdi er i området 7-9. Temperaturområdet for god proteolytisk aktivitet er 25-70°C, og den optimale temperaturen er innenfor området 30-5b°C. Aktivitet oppnås ned til 0°C.

Temperatur-, og pH-områdene gitt ovenfor kan alle benyttes for forskjellige anvendelser av enzymsammensetningen, selv om det ved spesielle potensielle utførelsesformer også kan benyttes andre områder.

Framstillingen av enzymene fra dyrene utføres ved velkjente metoder. Friskt eller friskt fryst dyr kan slik homogeniseres og ekstraheres med vandig medium (f.eks. vann). Ekstraktet som oppnås kan frysetørres og lagres. Ekstraktet kan bli videre renset f.eks. ved ekstraksjon med et lipid - løsende løsningsmiddel for å ekstrahere lipider. Dersom videre rensning er nødvendig, kan gel- ,ultra- eller membranfilttering utføres. Andre rensetrinn, som er potensielt egnet, er ionebytter- og affinitetskromatografi. Ekst raksjonen og homogeniseringen bør utføres kaldt, under el ler nær S°C.

Enzympreparatene som oppnås ved en vannekstraksjon kan brukes direkte eller, om nødvendig, renses videre. 1 de fleste tilfeller er det fordelaktig å frysetørre et preparat fra hvilket lipider er blitt ekstrahert. 1 slike tilfeller kan pulveret som oppnås, lagres i lang tid. Hvert bruksfelt krever spesifikke sammensetninger ellet former av disse. Slike former er kjente per se. Slike vedrører oppfinnelsen enzymsammensetninger av forskjellige fysikalske former, så som frysetørrete enzymer, homogene vandige løsninger eller enzymsammensetninger nevnt ovenfor og som er nye. Den eksakte mengden enzymer i hver sammensetning varierer fra tilfelle til tilfelle - fra det tene frysetørrete ekstraktet til svært komplekse detergentsammensetninger. Enzymmengden bør være effektiv ved degradering og/eller oppløsning av de aktuelle forurensningene uten å gi unødvendige ugunstige effekter på materialet forurensningene skal fjernes fra. De andre komponentene i den nye rensesammensetningen bør velges ut slik at de ikke vil virke ugunstig inn på den under betingelsen som er nødvendig for bruken av den.

Mengden av enzympreparat som finnes i sluttsammensetningen kan variere fra 0,0001 vekt% opp til 100 vekt%. Med hensyn til protease aktivitet kan sluttsammensetningen inneholde fra 0.0001 til 0.1 enzymenheter pr. mg. Avhengig av renheten av enzympreparatet som benyttes, kan andre områder anvendes. Enzymenhetene ovenfor er gitt som mol tyrosin ekvivalenter pr. min med kasein som substrat.

I sammensetningen i samsvar med oppfinnelsen kan forskjellige additiver og bærere inkorporeres. Egnete bærere kan være sterile, vandige og fysiologisk akseptable salt løsninger, organiske og uorganiske geldannende materialer, f.eks. polymere, silikonoljer og andre substanser og blandinger av disse som gir de ønskete fysikalske egenskapene av sammensetningen. Blant additivene kan antimikrobielle additiver, parfymer, forskjellige anioniske, kationiske, zwitterioniske og nøytrale overflate aktive stoffer (tensidet og emulgatorer) nevnes. Slike komponenter er allerde kjent per se i forbindelse med andre enzymsammensetninger for rensing eller enzymatisk fjerning av sykt, dødt eller forurenset vev, se f.eks. tysk patent-søknad 2 130 838, GB patent skrift 1 280 497, 1 296 901 og 1 573 964 og US patent skrift 3 627 688, 4 242 219, 4 287 082, 4 305 837 og 4 307 081.

For behandling av skadet levende vev, et det fordelaktig å bcuke en sammensetning som inneholder en fysiologisk og farmasøytisk akseptabel bærer eller ingen bærer idet hele tatt. En slik sammensetning kan være steril. Sterilisasjon kan utføres f.eks. ved steril filtrering når sammensetningen er en løsning. Sterile sammensetninger kan også oppnås ved å blande sterile komponenter under aseptiske bet ingeiser.

De forskjellige utførelseformene av oppfinnelsen vil framgå videre fra de vedlagte kravene. I det følgende vil oppfinnelsen bli illustrert ved forskjellige ikke-begrensende eksempler.

EKSEMPEL 1

A. Framstilling av et krillekstrakt

Krill, Euphausia superba, fanget i løpet av den antarktiske sommeren, frosset øyeblikkelig og lagret i omtrent to år ved omtrent -80°C, er plassert i et rom ved omtrent 5°C. Idet krillen er nesten tint, blir 25 g krill blandet med 50 ml deionisert vann med temperatur 0°C. Blandingen blir homogenisert og deretter sentrifugert i kulde (omtrent 0°C) i en halv time ved 12500g. Den røde øverste fasen blir dekantert og oppbevart. Bunnfallet blir resuspendert i 50 ml deionisert vann og sentrifugert som ovenfor. Den øverste fasen blir dekantert og kombinert med den øverste fasen fra den første ekstraksjonen.

For å fjerne lipider fra ekstraktet blir 20 ml CCl^ tilsatt den "kombinerte øverste fasen" og homogeniser'; i kulde (0°C). Blandingen blir sentrifugert ved 2500 g i 15 min i kulde. Vannfasen fjernes og ekstraheres en gang til med CC14 og sentrifugeres som beskrevet ovenfor. Vannfasen blir brukt i samsvar med IB, hvor alt blir referert til som vannekstraktet.

B. Videre rensing ved qelkromatoqrafi

20 ml av vannekstraktet fra A blir kromatografert på Sephadex® G-100 (dextran kryssbundet med epiklorohydrin.

Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) i en kolonne med diameter 3.1 cm og en høyde på 69 cm. Kollonen ble brakt i likevekt og eluert (30ml pr. time) med Tris-HCl buffer (0.05M, pH 7.5) ved 5°C. Fraksjonene ble samlet. Elueringsprofi len ble bestemt spektroftometrisk ved å måle UV-adsorpsjonen ved 280 pm, og den proteolytiske aktiviteten av fraksjonen ble bestemt separat. De enzymatisk aktive fraksjonene ble samlet og dialysert mot deionisert vann. Til slutt ble de samlete fraksjonene frysetrørret og brukt i samsvar med oppfinnelsen.

Den proteolytiske aktiviteten i fraksjonene og i det frysetørrete preparatet ble bestemt ved å bruke hemoglobin og/eller kasein som substrat (Rick, W.I; "Methods of Enzymatic analysis; Ed Bergmeyer, HV; Vol 2, p. 1013-23

(1974); Academic Press, New York). Ved å utføre gelkromato-grafi er enzymaktiviteten hovedsaklig funnet fra fraksjoner korresponderende til molekylvektene på 20000 til 40000 Dalton.

EKSEMPEL 2

Framstilling av lodde- ekstrakt

Lodde (Mallotus villosus), fanget ved Finnmarkskysten (Norge) i september måned ble frosset og lagret ved -20°C i et år. Den fryste lodda ble så plassert ved 5°C. Etter 24 timer ble innvollene inkludert fordøyelseskanalen fjernet fra den delvis tinte lodda. 25 g av innvollene ble blandet med 50 ml deionisert vann og homogenisert ved 0°C. Blandingen ble så sentrifugert ved 12500 g i en halv time. Den delvis uklare øverste fasen ble dekantert og oppbevart. Bunnfallet ble resuspendert i 50 ml deionisert vann og sentrifugert som ovenfor. Den nye øverste fasen ble dekantert og kombinert med den øverste fasen fra den første ekstraksjonen.

For å fjerne lipider fra ekstraktet ble 20 ml CC14 tilsatt til den "kombinerte" øvre fasen og homogenisert i kulde (0°C). Blandingen ble sentrifugert ved 2500 g i 15 min i kulde. Vannfasen ble fjernet og ekstrahert en gang til med karbontetraklorid og sentrifugert som beskrevet ovenfor. Vannfasen ble tilslutt frysetørret.

EKSEMPEL 3

Sammensetninger som inneholder enzymer fra Mallotus villosus A 10 mg frysetørret enzympreparat fra lodde (i samsvar med eksempel 2) blandes med 0.4 mg kalsiumacetat og amylum resorb til 1 g (Biosorbw; Arbrook, Kirkton Campus, Livingston, Scotland).

Den homogene pulveret som ble oppnådd slik, blir rørt ut i 10 g fysiologisk natriumklorid løsning (saltoppløsning) og kan brukes til å fukte bandasjer.

B 10 mg frysetørret lodde preparat (fra eksempel 2)

15 blandes med en polyetylenglykolgel (inneholdende like deler Macrogol 600 og Macrogol 800 (Holchst, Forbundsrepublikken Tyskland)) til 1 g. En 1%-enzymsammensetning med en semifast, homogen konsistens ble oppnådd.

EKSEMPEL 4

Sammensetning som inneholder krillenzymer i en løsning

10 mg frysetørret enzympreparat (fra eksempel IB) blandes med 0.4 mg kalsiumacetat og amylum resorb til lg. Det homogene pulveret som slik oppnås ristes med 10 g saltoppløsning og sammensetningen som oppnås brukes for å fukte en steril kompress med størrelse 3x3 cm og inneholdende fire lag gas. Den våte kompressen påføres et dødt sår. Et gasbind tvinnes to ganget rundt kompressen for å feste den. Denne bandasjen blir så videre festet med et plaster. Kompressen fuktes med sammensetningen hver fjerde time. For å begrense påføringen bare til den delen av kompressen som dekker såret, blir blandingen påført ved å bruke en injeksjonskanyle med en grov spiss. En gang om dagen blir hele bandasjen fjernet og erstattet med en ny bandasje. I, løpet av denne operasjonen må degraderte og disintegrerte døde partier fjernes mekanisk. Ved den spesifikke behandlingen som ble utført, viste såret seg å være rent etter en uke.

EKSEMPEL 5

Effekt av krillenzymer på dødt materiale

For å undersøke effekten av krillenzymer på dødt materiale som finnes på menneskets hud, ble følgende eksperiment utført: Dødt materiale ble påført den intakte huden på oversiden av høyre hånd på to personer. Det døde materiale var fra et sår på et ben. Materialet besto av devitalisert kollagen-vev, koagulert blod, fibrin, materie og "skorper". Mengden som ble påført hver person var 0.5 g.

Det døde materialet ble på hver person dekket med en kompress (med areal 10 cm 2), som var blitt fuktet med krill enzymblandingen framstilt som i eksempel 4. Hver kompress ble dekket med gas. Etter fire timer var begge kompressene nesten fullstendig tørre, og derfor måtte mer av enzymsammensetningen tilføres. Etter tolv timer ble kompressene fjernet og det døde materialet som var igjen på hver hånd ble veid separat. Materialet viste karakteristiske tegn på degradering og hadde avtatt i vekt med omtrent 25%. Huden som var i kontakt med det døde materialet under forsøket var upåvirket. Forsøkspersonene viste ingen negative symptomer.

EKSEMPEL 6

In vivo forsøk med en person med et mindre dødt sår

En person med et mindre sår inneholdende dødt materiale på sin høyre pekefinger, behandlet seg selv over en periode på 5 dager med daglig påføring av 1% krill en2ymløsning (laget som i eksempel 4). Sårområdet tålte enzymsammensetningen godt og viste en signifikant tendens til å bli rent og til å gro. Ingen ugunstig effekt ble observert.

EKSEMPEL 7

Renseeffekten på lipidrik abnorme fettutsondringer i huden med krillenzymer kombinert med et amfotært tensid En konvensjonell detergent som ble brukt besto av 18.00 vekt% alkylimidazolin, 1,90 vekt% lauryl-polypeptidkondensat, 1.70 vekt% undecylenyl-polypeptidkondensat, 28 vekt% modifisert alkyletersulfat buffret med fettsubstanser (lanolin), 1.40 vekt% kokosnøtt-aminsarcosinat, 1.90 vekt% undecylensyre, 2.00 vekt% undecylen-monoetanolamid sulforavsyreester, en passende mengde melkesyre til pH 6.4, og destillert vann til 100.00 vekt%

En viss mengde frysetørret krillenzympreparat (fra eksempel IB) ble tilsatt detergenten for dannelse av en 1 vekt% enzym detergentsammensetning. Et område på 10 cm<2>

hud ved brystbeinet på to personer med synlig abnorme fettutsondringer i denne hudregionen, ble valgt ut til forsøk. Områdene ble vasket to ganger daglig i fem dager med enzymdetergentsammensetningen. Prøver fra det samme området ble tatt både før og etter vaskeperioden. Prøvene ble samlet og analysert fotometrisk i samsvar med Schaeffer, H. og Kuhn-Bussius H. (Arch, Klin. u. exper. Dermatol. 238 (1970) s. 429).

Resultatet viste en signifikant minking i transmisjonsverdien for begge personene som ble undersøkt. Dette indikerer dermed en degradering av lipider på huden ved enzymsammensetningen som ble brukt. Til sammenlikning ble svært liten effekt oppnådd da to personer brukte bare detergent uten enzymer.

EKSEMPEL 8

Sammenliknende vaskeeksperimenter på tekstil. En sammenlikning mellom enzymer fra E. superba ( krill), AlcalaseR og destillert vann.

Like stykker (5x5 cm) ble skåret fra en homogen del av et tøystykke. Tøystykket var dobbelt med en side av silke og den andce av islett bestående av en blanding av bomull og syntetiske fibre. Seks av stykkene ble stenket med blod. seks med melk og seks med tusj. Til hver av seks Ehrlenmeyerkolber ble 100 ml av en vandig løsning (0,5% vekt/volum) frysetørret krillenzym tilsatt (frysetørret krillenzym ble oppnådd fra eksempel IB). Til hver av seks andre Ehrlenmeyerkolber ble 100 ml av 0.5% (vekt/volum)

(R)

Alcalase^ (Novo Industri, København, Danmark) løsning i destillert vann tilsatt. 100. ml destillert vann ble tilsatt seks andre Ehrlenmeyerkolber.

Til hver av to kolber inneholdende krillenzym-løsningen, til hver av to kolber inneholdende Alcalasé-'-løsningen og til hver av to kolber inneholdende destillert vann ble et av stykkene stenket med blod tilført. Analogt ble de andre stenkete stykkene tilført de resterende kolbene, slik at bare et tøystykke var tilstede i hver kolbe. Dette betyr at hver av sammensetningene kunne virke dobbelt på tøystykkene stenket med blod, melk og tusj. Deretter ble kolbene ristet i vannbad i en time ved 45°C. Etter denne behandlingen ble vaskevæsken dekantert og 100 ml destillert vann ble tilsatt hver kolbe. Kolbene ble så lukket med en gummikork og ristet voldsomt i et minutt. Deretter ble tøystykkene samlet og vasket rolig i rennende vann fra kranen i 10 minutter. Stykkene ble foldet i rene hvite håndklær og tørket.

Effekten av vaskingen, dvs. renheten av tøystykkene, ble så bestemt ved e.i dobbel blind-test, dvs. at personen som utførte testen ikke visste hvilken vaskesammensetning hvert stykke var behandlet med. Vaskeeffekten, dvs. renheten av tøystykket ble evakuert visuelt i rekkefølge; 0=fullstendig rent tøy; l=ubetydelige mengder av gjenværende smuss; 2=moderate mengder av gjenværende smuss; 3=betraktelige mengder gjenværende smuss. Resultatet fra vaskingen er presentert i tabell 1.

Tabell 1

Vaskeeffekten av 0.5% (vekt/volum) krillenzym i destillert vann, 0.5% (vekt/volum) Alcalase<®> i destillert vann; og destillert vann uten tilsats av enzymer.

Cr)

0.5% krillenzym i 0.5% Alcalase^ dest. vann

Fra tabell 1 ser en at enzymsammensetningen fra krill er mer effektiv enn Alcalase-^ eller destillert vann. Liknende forsøk kan utføres med en analog sammensetning inneholdende loddeenzymer.

EKSEMPEL 9

Degradering av fibrin, dødt materiale og koagulert blod A. Fibrin

Fibrin ble dissekert i biter med varierende vekt fra 0.2-0.3g. For hver enzymsammensetning som ble brukt, ble 20 reagensrør nummerert og hvert av dem ble tilført det på forhånd veide fibrin. Til de 20 rørene for hver sammensetning ble det tilsatt like mengde av enzymsammen-

(R)

setningen. Varidasew ble brukt i en fortynning på 1:20 (vekt/volum basert på det kommersielle preparatet) i destillert vann. Trypure ® ble brukt i en konsentrasjon på 1:15 (vekt/volum basert på det kommersielle prepararet) i saltoppløsning. Preparatene av de andre enzymene som ble brukt ble fortynnet i saltoppløsning og konsentrasjonene av sammensetningen som slik ble oppnådd er gitt i tabell 2. Kr i 1lenzymene og lodde-enzymene som ble brukt var de fryse-tørrete preparatene oppnådd i samsvar med henholdsvis eksempel IB og 2. Studiet ble utført ved en temperatur på 33°C, som er den samme som temperaturen i sår. Etter henholdsvis 12 og 24 timer ble reaksjonene stoppet, og gjenværende fibrin ble samlet og oppbevart på et vått filterpapir i 60 sekunder og så veid. Papain, Ficin og Pankreatin var alle fått fra E. Merck, Darmstadt, Tyskland.

Fibrin ble oppløst på kortest tid med sammen- setningen inneholdende krillenzymer, lodde-enzymer og Trypuré®, den

(R) (8)

gitte rekkefølgen. Varidasew og Alcalase^ var like med ficin, og papin hadde svakest effekt.

B. Degradering av dødt materiale.

Dødt materiale ble dissekert i stykker på 0.2-0.3g. For hver enzymsammensetning som ble brukt ble 20 reagensrør nummerert og til hver av disse ble et stykke av på forhånd veid dødt materiale tilsatt. Til de 20 reagensrørene med hver sammensetning, ble like mengder av hver enzymsammensetning tilført. Sammensetningene som ble brukt er gitt i tabell 3 og konsentrasjonene er gitt i % (vekt/volum) i saltoppløsning. Varidasé^ og Trypure-^ ble fortynnet i samsvar med eksempel 8A. Etter tidsintervaller på 12, 24, 36 og 72 timer, ble degraderingen stoppet og det døde materialet ble samlet og veid.

TABELL 3

Influeringen av forskjellige enzytnblandinger på dødt materiale. Konsentrasjonene i % er beregnet på en vekt/volum-bas is.

(R)

Det visec seg at Alcalase^, krillenzymer og lodde-enzymer er godt istand til å løse opp dødt materiale

(R)

og øker ikke vanninnholdet i dette som i Varidase^, Trypure og saltoppløsning. Når en imidlertid ser på deres influering på dødt materiale, viser Papin og Pankreatin® de samme tendensene som sammensetningene på markedet, dvs. en økning i vekt som skyldes en økning i vanninnhold. Ficin har en effekt som likner, men er svakere enn Alcalase , knllenzymene og loddeenzymene.

C. Degradering av koagulert blod.

Koagulert blod ble dissekert og fordelt i reagens-rør arrangert som i eksempel 9A og B. Rnzympreparatene som ble brukt ble løst i saltoppløsningen og konsentrasjonene (% vekt/volum) av sammensetningene som ble oppnådd slik er gitt i tabell 4. Etter tidsintervall på henholdsvis 12 og

Fra tabell 4 framgår at for koagulert blod er kr i 1lenzymene bedre enn enzymene, som begge viser en effekt bedte enn de andre enzymsammensetningen© som er undersøkt.

EKSEMPEL 10

Studier av forskjellige enzymsammen setninger på frisk hud.

Forskjellige løsninger av ficin, papain, AlcalascPK

(r)

Pankreatin^, krillenzymer og lodde-enzymer - alle med konsentrasjon på 1% (vekt/volum) - ble påført (0.3 ml) den friske huden til to forsøkspersoner og dekket med en tynn bandasje. Ingen tegn på angrep eller betennelse kunne observeres på huden etter 12 timer. Den samme observasjonen ble gjort ved bruk av Varidase<®>og Trypure®. ?:nzymene synes dermed bare å angripe dødt vev i konsentrasjons-områdene brukt i forsøkene.

Claims (2)

1. Framgangsmåte for framstilling av en enzymsammensetning, som har til formål å fjerne biologiske forurensninger, spesielt forurensninger som inneholder både peptider og lipider, karakterisert ved at: dyr av typen Euphausiaceae homogeniseres, fortrinnsvis ved E>°C eller lavere, der homogenisatet eventuelt fjernes for eventuelle lipider; og at det gjennom ekstraksjon, fortrinnsvis ved 5°C eller lavere, med et løsningsmiddel, som helt eller delvis beståt av vann, isoleres en enzymsammensetning som inneholder en blanding av enzymer, som har en molekylvekt fra 15 000 til 80 000 Dalton eller er aktive aggregat av slike enzymer., deri såvel endo- som exopeptidaser inngår, der den isolerte enzymblandingen inneholder enzymer som har evne til å løse opp og fjerne urenheter inneholdende blandinger av substanser som lipider, fosfolipider, proteiner, peptider, nukleinsyrer, polysakkarider, mucopolysakkarider samt nedbrytningsprodukter av disse stoffene, og; at enzymsammensetningen eventuelt steriliseres.

2. Framgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at lipider fjernes fra enzymsammensetningen og at denne lyofi 1 iseres.