NO165093B

NO165093B - ENZYME COMPOSITION FOR CLEANING, USING IT AND PREPARING THE COMPOSITION.

Info

Publication number: NO165093B
Application number: NO84842497A
Authority: NO
Inventors: Lars Gustav Inge Hellgren; Jan Gustav Vincent; Viggo Mohr
Original assignee: Hellgren Lars G I; Jan Gustav Vincent; Viggo Mohr
Priority date: 1982-10-25
Filing date: 1984-06-21
Publication date: 1990-09-17
Also published as: BR8307587A; NO842497L; NO165093C

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører framgangsmåte for framstilling av en enzymsammensetning som har til formål å fjerne biologiske forurensninger, spesielt forurensninger som inneholder både peptider og lipider. The present invention relates to a method for producing an enzyme composition which has the purpose of removing biological contaminants, in particular contaminants containing both peptides and lipids.

Brukt i beskrivelsen og i kravene betyr begrepet "enzym" et aktivt enzym hvis ikke annet er spesifisert. As used in the description and in the claims, the term "enzyme" means an active enzyme unless otherwise specified.

Oppfinnelsen vedrører både terapeutisk rensing av pattedyr og ikke-terapeutisk rensing generelt. Begrepet rensing blir her brukt i sin videste betydning, dvs. rensing av dødt så vel som levende materiale så som forskjellige typer tekstiler, hår, pelsverk, hud, plast, lær, negler, ører, speil, glass, proselen, gebiss, metaller, steiner, tenner, fasader, ganger, kunstarbeider så som malerier, osv. Rensing inkluderer også rensing av mennesker og dyr ved å fjerne substanser så som materie (utsondring av "verk"), fibrin, koagulert blod, "blod-skorper" og dødt vev. Denne siste typen rensing er særlig viktig for behandling av sår, brannsår og utslett, f.eks. for såkalt enzymatisk fjerning av et sykt, dødt eller forurenset vev, men kan også utføres på andre områder av kroppen hvor forurensninger kan opptre. Urinrøret og urinblæra er eksempler på slike andre områder. The invention relates to both therapeutic cleansing of mammals and non-therapeutic cleansing in general. The term cleansing is used here in its broadest sense, i.e. cleansing of dead as well as living material such as different types of textiles, hair, fur, skin, plastic, leather, nails, ears, mirrors, glass, porcelain, dentures, metals, stones, teeth, facades, corridors, works of art such as paintings, etc. Purification also includes the purification of humans and animals by removing substances such as matter (discharge of "works"), fibrin, coagulated blood, "blood crusts" and dead loom. This last type of cleansing is particularly important for the treatment of wounds, burns and rashes, e.g. for the so-called enzymatic removal of a diseased, dead or contaminated tissue, but can also be carried out in other areas of the body where contamination can occur. The urethra and urinary bladder are examples of such other areas.

Den normale fordøyelsesbefordrende effekten av enzymer The normal digestive effect of enzymes

i dyrene så vel som deres autolytiske virkning i dyrene post mortem, er ikke inkludert i begrepet rensing. in the animals as well as their autolytic action in the animals post mortem, are not included in the concept of purification.

I krill (som tilhører ordenen Euphausiaceae) eksisterer en blanding av forskjellige enzymer, så som f.eks. proteinaser (med surt eller nøyt talt-ti1-alkalisk pH-optimum), peptidaser (exo- og endopeptidaser), lipaser, fosfolipaser, amylaser og andre karbonhydrat-degraderingsenzymer, fosfater, nukleaser, nukleotidaser og esteraser (T.E. Ellingsen; Biokjemiske studier over Antarktisk krill; Dr.ing. avhandling. Institutt for Teknisk Biokjemi, Norges Tekniske Høgskole, Trondheim (1982)). Den proteolytiske (trypsinliknende) aktiviteten som eksisterer i vannekstrakt fra krill er studert og beskrevet (C-S. Chen et al. J. Food Biochem. 2 (1978) s. 349-669). Forskjellige ptotease-aktiviteter i vannekstrakter fra lodde er også beskrevet tidligere (A.Gilberg; Autolysis of fich tissue - General Aspects; Thesis; Institute of Fisheries, Universitetet i Tromsø, Norge (1982)). In krill (belonging to the order Euphausiaceae) there exists a mixture of different enzymes, such as e.g. proteinases (with acidic or strictly speaking-alkaline pH optimum), peptidases (exo- and endopeptidases), lipases, phospholipases, amylases and other carbohydrate-degrading enzymes, phosphates, nucleases, nucleotidases and esterases (T.E. Ellingsen; Biochemical studies over the Antarctic krill; PhD thesis. Department of Technical Biochemistry, Norwegian Technical University, Trondheim (1982)). The proteolytic (trypsin-like) activity that exists in water extract from krill has been studied and described (C-S. Chen et al. J. Food Biochem. 2 (1978) pp. 349-669). Different ptotease activities in water extracts from capelin have also been described previously (A.Gilberg; Autolysis of fish tissue - General Aspects; Thesis; Institute of Fisheries, University of Tromsø, Norway (1982)).

J. Fod. Biochem. (1988) beskriver isolering av ulike polysakkaridaseog glykosidaseaktiviteter. Chem. Abs. l'76748w/1982 (Agri. Biol. Chem. vol. 46 side 691- 696) beskriver isolering og rensing av to ribonukleaser fra krill. Chem. Abs. 1782S5g/1982 (J. Fod. Biochem. vol. 2, 1978, side 349-366) beskriver rensing av tryptosinliknende enzymer og et karboksypeptidas-A-enzym fra krill. J. Foot. Biochem. (1988) describe the isolation of various polysaccharides and glycosidase activities. Chem. Abs. l'76748w/1982 (Agri. Biol. Chem. vol. 46 pages 691-696) describes the isolation and purification of two ribonucleases from krill. Chem. Abs. 1782S5g/1982 (J. Fod. Biochem. vol. 2, 1978, pages 349-366) describes the purification of tryptosine-like enzymes and a carboxypeptidase-A enzyme from krill.

Felles for den kjente teknikken er en idé, som strider direkte mot den oppfinne riske idé, nemlig å isolere og rense de enkelte enzymer hver for seg fra krill. I følge den foreliggende oppfinnelsen isoleres en blanding av kr i 1lenzymer, hvorved det et vesentlig at det deri inngår såvel endosom exopeptidaser. 1 de anførte publikasjonene angis eller antydes ingen andre anvendelsesområder av kr i 11/kr i 1lenzymer enn som "en ny kilde for proteinføde for mennesker" respektive for tilvirking av industrielle enzymer (hver for seg) med utgangspunkt i krill. Ingen av skriftene antyder på noen måte, at denne blanding av enzymer fra krill skulle være generelt anvendbar til rengjøringsformå1, og enda mindre gir teknikkens stand noen som helst ledetråd om at enzymblandinger i følge oppfinnelsen skulle være svært anvendbare som biologiske rengjøringsmidler uten noen skadelige bivirkninger. Common to the known technique is an idea, which directly contradicts the invented risky idea, namely to isolate and purify the individual enzymes separately from krill. According to the present invention, a mixture of kr and 1l enzymes is isolated, whereby it is essential that it includes endosomal exopeptidases as well. In the listed publications, no other areas of application of NOK in 11/NOK in 1lenzymes are stated or implied than as "a new source of protein food for humans" respectively for the production of industrial enzymes (each separately) based on krill. None of the writings suggest in any way that this mixture of enzymes from krill should be generally applicable for cleaning purposes1, and even less does the state of the art give any clue whatsoever that enzyme mixtures according to the invention should be very usable as biological cleaning agents without any harmful side effects.

US-A-3,003,917 beskriver en spesifikk blanding av relaxin, visse angitte proteolytiske enzymer og alfa- eller beta-amylase. Knzymblandingen kan anvendes til rensing av sår. Det er ikke oppgitt noe om enzymets opphav. Det skal bemerkes at et enzyms egenskaper beror på dets opphav. US-A-3,003,917 describes a specific mixture of relaxin, certain specified proteolytic enzymes and alpha- or beta-amylase. The enzyme mixture can be used to clean wounds. Nothing is stated about the origin of the enzyme. It should be noted that the properties of an enzyme depend on its origin.

US-A- 3,409,719 angår et debrideringsmiddel i form av et spesielt enzym framstilt gjennom dyrking av en spesifikk baktet iekultu r. US-A-3,409,719 relates to a debriding agent in the form of a special enzyme produced through the cultivation of a specific bacterial culture.

GB-A-1,293,613 beskriver et flytende vaskemiddel som består av en kombinasjon av i og tor seg kjente kommersielt tilgjengelige enzymer (uten opplysninger om enzymets opphav) med flytende vaskemidler. GB-A-1,293,613 describes a liquid detergent which consists of a combination of known commercially available enzymes (without information on the origin of the enzyme) with liquid detergents.

Så tidlig som i 1913 ble det gjort forsøk på bruk av enzymer i detergenter. Enzymsammensetninger for rensing av dødt materiale, f.eks. som vaskemidler, er tidligere basert på forskjellige mikrobielle proteaser fra slekten Bacillus. En slik protease som er vanlig brukt er subtilisin dannet fra Bacillus subtilis og markedsført blandt annet under navnet Alcalase® (Novo Industri, København, Danmark). Forskjellige lipaser er også blitt brukt til rensing, særlig for å oppnå degradering av lipider. 1 tillegg til enzymer har slike sammensetninger også inneholdt forskjellige anioniske, kationiske og nøytrale detergenter sammen med blekemidler, så som perboratet. Enzymene som hittil er brukt har, som enzymer generelt, vætt relativt ustabile. As early as 1913, attempts were made to use enzymes in detergents. Enzyme compositions for cleaning dead material, e.g. as detergents, were previously based on various microbial proteases from the genus Bacillus. One such protease that is commonly used is subtilisin formed from Bacillus subtilis and marketed, among other things, under the name Alcalase® (Novo Industri, Copenhagen, Denmark). Various lipases have also been used for purification, in particular to achieve degradation of lipids. In addition to enzymes, such compositions have also contained various anionic, cationic and neutral detergents together with bleaching agents, such as the perborate. The enzymes that have been used so far have, like enzymes in general, been relatively unstable.

Den viktigste enzymsammensetningen på markedet for fjerning av komponentene nevnt ovenfor er The most important enzyme composition on the market for the removal of the components mentioned above is

St reptokinase- streptodornase (Varidase<®>, Lederle Lab., American Cyanamid Company, Waynem New Jersey, USA), stabilisert krystallinsk trypsin (Trypuré<®>, Novo Industri, København, Danmark) og bovin fibrinolysin kombinert med deoksyribonuklease (Elase^, Parke Davis & Company, St reptokinase- streptodornase (Varidase<®>, Lederle Lab., American Cyanamid Company, Waynem New Jersey, USA), stabilized crystalline trypsin (Trypuré<®>, Novo Industri, Copenhagen, Denmark) and bovine fibrinolysin combined with deoxyribonuclease (Elase^ , Parke Davis & Company,

Detroit, Michigan, USA). Stteptokinase virker på dødt materiale hovedsaklig ved dets effekt på DNA, og streptodornase har en spesifikk fibrinolytisk effekt. Trypsin virker proteolytisk og ekstraheres fra bukspyttkjertel hos okse eller ku. Fibrinolysin-deoksyribonuklease er en kombinasjon av to enzymer - et fibrindegraderingsenzym og et som virker på deoksyribonukleinsyre som er en viktig komponent i materie. Detroit, Michigan, USA). Streptokinase acts on dead material mainly by its effect on DNA, and streptodornase has a specific fibrinolytic effect. Trypsin acts proteolytically and is extracted from the pancreas of an ox or cow. Fibrinolysin deoxyribonuclease is a combination of two enzymes - a fibrin degrading enzyme and one that acts on deoxyribonucleic acid which is an important component of matter.

Et spesifikt pepsinliknende enzym (pepsin I) fra Mallotus villosus (lodde) er foreslått brukt ved medisinsk behandling av brannsår (Gildberg, A; sitert ovenfor,, s. 89-90). Bruken av et spesifikt enzym som virker på en type substrat vil trolig gi bare en begrenset nedbryting av forurensningene som er tilstede i sårene. Imidlertid er ingen kombinasjon av dette pepsinliknende enzymet med andre enzymer foreslått for den terapeutiske rensingen hos mennesker. A specific pepsin-like enzyme (pepsin I) from Mallotus villosus (flounder) has been proposed for use in the medical treatment of burns (Gildberg, A; cited above, pp. 89-90). The use of a specific enzyme that acts on a type of substrate will probably give only a limited breakdown of the contaminants present in the wounds. However, no combination of this pepsin-like enzyme with other enzymes has been proposed for the therapeutic purification in humans.

Enzympreparatene nevnt ovenfor har flere ulemper. Alle er relativt ustabile, noe som fører til raskt avtakende aktivitet, enten i løpet av lagting eller bruk. Deres aktivitet er ofte begrenset til et spesielt pH-område, f.eks. nøytral til moderat alkalisk pH-verdi. Aktiviteten er også i mange tilfeller begrenset til spesielle temperatur-intervaller. Ved en temperatur over SO °C er et raskt tap av aktivitet observert, og ved romtemperatur eller normale utendøtstemperaturer er aktiviteten lav. Effekten av Varidase<®>, Trypure® og Elase® er relativt dårlig. The enzyme preparations mentioned above have several disadvantages. All are relatively unstable, which leads to rapidly decreasing activity, either during layering or use. Their activity is often limited to a particular pH range, e.g. neutral to moderately alkaline pH value. In many cases, the activity is also limited to special temperature intervals. At a temperature above SO °C, a rapid loss of activity is observed, and at room temperature or normal outside temperatures, the activity is low. The effect of Varidase<®>, Trypure® and Elase® is relatively poor.

Bare en moderat fjetningseffekt er vanligvis oppnådd etter en behandling over en periode på tre uker. Only a moderate fattening effect is usually achieved after a treatment over a period of three weeks.

Et hovedformål med oppfinnelsen er å komme fram til en framgangsmåte for framstilling av en forbedret enzymsammensetning som skal brukes til fjerning av forurensninger som inneholder substanser av biologisk opprinnelse eller degraderings-produkter fra slike substanser, særlig forurensninger som inneholder både proteiner og lipider. Den skal kunne brukes for fjerning av fibrin, koagulert blod og devitalisert vev ved degradering av disse bestanddelene og derved fremme fjerning av dem uten synlig øking i deres vanninnhold. A main purpose of the invention is to arrive at a method for producing an improved enzyme composition to be used for the removal of contaminants that contain substances of biological origin or degradation products from such substances, particularly contaminants that contain both proteins and lipids. It should be able to be used for the removal of fibrin, coagulated blood and devitalized tissue by degrading these components and thereby promoting their removal without a visible increase in their water content.

Oppfinnelsen er basert på sammensetninger som har mer effektive enzymer enn tidligere kjente sammensetninger. Dette er gyldig for den totale enzymatiske effekten av den forurensingen det er spørsmål om. The invention is based on compositions that have more effective enzymes than previously known compositions. This is valid for the total enzymatic effect of the contamination in question.

Oppfinnelsens hovedformål kan oppnås ved å gå fram som angitt i den karakteriserende delen av patentkrav 1. The main purpose of the invention can be achieved by proceeding as indicated in the characterizing part of patent claim 1.

Enzymblandinger fra disse dyrene kan oppnåes i høyt utbytte og på en enkel måte. Dyr fra ordenen Euphausiaceae kan f.eks. være antarktisk krill (Euphausia superba), Euphausia crystallorophias, og beslektede slekter og andre slekter av krill, inkludert Meganycliphanes norvegica, Tysanoessa inermis og andre beslektede sLektec. Det kan også brukes fisk som tilhører slekten Mallotus, særlig slekten Mallotus villosus (lodde). Blant andre kilder kan makrell nevnes. Enzyme mixtures from these animals can be obtained in high yield and in a simple way. Animals from the order Euphausiaceae can e.g. be Antarctic krill (Euphausia superba), Euphausia crystallorophias, and related genera and other genera of krill, including Meganycliphanes norvegica, Tysanoessa inermis and other related sLektec. Fish belonging to the genus Mallotus can also be used, especially the genus Mallotus villosus (head minnow). Among other sources, mackerel can be mentioned.

De enzymaktivitetene som er viktigst for oppfinnelsen opptrer i fordøyelseskanalen hos dyrene. Den komplekse blandingen av forskjellige enzymaktiviteter oppnådd fra dyrene er trolig forklaringen på hvorfor sammensetningen gir en overraskende rask degradering av biologiske forurensninger uavhengig av deres opprinnelse. Enzymene er aktive i alkalisk, nøytralt og sutt medium og kan være egnet i rensesammensetninger sammen med forskjellige overflateaktive stoffer (tensider og emulgatorer), og/eller komponenter så som bærere og additiver. Det faktum at sammensetningen kan inneholde en blanding av enzymer gjør den egnet for fjerning av forurensninger som inneholder blandinger av substanser valgt fra gruppen bestående av lipider, fosfolipider, biopolymere så som proteiner, peptider, nukleinsyrer, mucopolysakkarider og polysakkardier, og degraderingsprodukter fra slike forbindelser. Disse forbindelsene er til stede i materie, "blod-skorper" og dødt vev. The enzyme activities that are most important for the invention occur in the digestive tract of the animals. The complex mixture of different enzyme activities obtained from the animals is probably the explanation why the composition provides a surprisingly rapid degradation of biological pollutants regardless of their origin. The enzymes are active in alkaline, neutral and sweet medium and can be suitable in cleaning compositions together with various surfactants (surfactants and emulsifiers), and/or components such as carriers and additives. The fact that the composition may contain a mixture of enzymes makes it suitable for the removal of contaminants containing mixtures of substances selected from the group consisting of lipids, phospholipids, biopolymers such as proteins, peptides, nucleic acids, mucopolysaccharides and polysaccharides, and degradation products from such compounds. These compounds are present in matter, "blood crusts" and dead tissue.

I samsvar med oppfinnelsen blir særlig gode resultatet oppnådd dersom enzymene som blir brukt har molekylvekter innenfor området på 15000 til 80000 Dalton eller aktive aggregater av slike enzymer. Særlig er enzymer med molekylevekter fra omtrent 20000 til omtrent 40000 Dalton foretrukket. Disse områdene anvendes på enzymer oppnådd ved en vannekstraksjon av de homogeniserte dyrene, dvs. særlig på enzymer som er vannløselige under ekstraksjonen. In accordance with the invention, particularly good results are obtained if the enzymes used have molecular weights within the range of 15,000 to 80,000 Dalton or active aggregates of such enzymes. In particular, enzymes with molecular weights from about 20,000 to about 40,000 Daltons are preferred. These areas are applied to enzymes obtained by a water extraction of the homogenized animals, i.e. in particular to enzymes which are water-soluble during the extraction.

Den nye sammensetningen kan være i form av en salve, et pudder, en pasta, en krem, en spray, en gele, en flytende salve, en bandasje, en olje, en tablett, en saft, et korn, en kapsel, osv. The novel composition may be in the form of an ointment, a powder, a paste, a cream, a spray, a gel, a liquid ointment, a bandage, an oil, a tablet, a juice, a grain, a capsule, etc.

I utførelsesformen som nå er mest foretrukket er enzymene i preparatet som blir brukt vannløselige og/eller har molekylvekter i området nevnt ovenfor. In the embodiment which is now most preferred, the enzymes in the preparation used are water-soluble and/or have molecular weights in the range mentioned above.

Tidsperioden som trengs for å degradere og/eller løse opp forurensningene varierer fra tilfelle til tilfelle, men bør velges tilstrekkelig lang til å la enzymene degradere og/eller løse opp forurensningene. Behandlingen kan om nødvendig gjentas. The time period needed to degrade and/or dissolve the contaminants varies from case to case, but should be chosen sufficiently long to allow the enzymes to degrade and/or dissolve the contaminants. The treatment can be repeated if necessary.

Enzympreparatet som brukes kan inneholde mange forskjellige enzymer. F.eks. av typene nevnt ovenfor. 1 samsvar med oppfinnelsen er det mulig å benytte sammensetninger der en eller flere av disse enzymene er blitt fjernet ved metoder kjent per se, f.eks. ved tilsats av en inhibitor spesifikk for et enzym eller ved å fjerne vedkommende enzym. The enzyme preparation used can contain many different enzymes. E.g. of the types mentioned above. 1 in accordance with the invention, it is possible to use compositions where one or more of these enzymes have been removed by methods known per se, e.g. by adding an inhibitor specific for an enzyme or by removing the enzyme in question.

Den proteolytiske aktiviteten ved optimal temperatur er høy i pH-verdi - området 5-10. Optimal pH-verdi er i området 7-9. Temperaturområdet for god proteolytisk aktivitet er 25-70°C, og den optimale temperaturen er innenfor området 30-5b°C. Aktivitet oppnås ned til 0°C. The proteolytic activity at the optimum temperature is high in the pH value - the range 5-10. Optimal pH value is in the range 7-9. The temperature range for good proteolytic activity is 25-70°C, and the optimum temperature is within the range 30-5b°C. Activity is achieved down to 0°C.

Temperatur-, og pH-områdene gitt ovenfor kan alle benyttes for forskjellige anvendelser av enzymsammensetningen, selv om det ved spesielle potensielle utførelsesformer også kan benyttes andre områder. The temperature and pH ranges given above can all be used for different applications of the enzyme composition, although in particular potential embodiments other ranges can also be used.

Framstillingen av enzymene fra dyrene utføres ved velkjente metoder. Friskt eller friskt fryst dyr kan slik homogeniseres og ekstraheres med vandig medium (f.eks. vann). Ekstraktet som oppnås kan frysetørres og lagres. Ekstraktet kan bli videre renset f.eks. ved ekstraksjon med et lipid - løsende løsningsmiddel for å ekstrahere lipider. Dersom videre rensning er nødvendig, kan gel- ,ultra- eller membranfilttering utføres. Andre rensetrinn, som er potensielt egnet, er ionebytter- og affinitetskromatografi. Ekst raksjonen og homogeniseringen bør utføres kaldt, under el ler nær S°C. The production of the enzymes from the animals is carried out by well-known methods. Fresh or freshly frozen animals can thus be homogenised and extracted with an aqueous medium (e.g. water). The extract obtained can be freeze-dried and stored. The extract can be further purified, e.g. by extraction with a lipid-dissolving solvent to extract lipids. If further purification is necessary, gel, ultra or membrane filtration can be carried out. Other purification steps, which are potentially suitable, are ion exchange and affinity chromatography. The extraction and homogenization should be carried out cold, below or close to S°C.

Enzympreparatene som oppnås ved en vannekstraksjon kan brukes direkte eller, om nødvendig, renses videre. 1 de fleste tilfeller er det fordelaktig å frysetørre et preparat fra hvilket lipider er blitt ekstrahert. 1 slike tilfeller kan pulveret som oppnås, lagres i lang tid. Hvert bruksfelt krever spesifikke sammensetninger ellet former av disse. Slike former er kjente per se. Slike vedrører oppfinnelsen enzymsammensetninger av forskjellige fysikalske former, så som frysetørrete enzymer, homogene vandige løsninger eller enzymsammensetninger nevnt ovenfor og som er nye. Den eksakte mengden enzymer i hver sammensetning varierer fra tilfelle til tilfelle - fra det tene frysetørrete ekstraktet til svært komplekse detergentsammensetninger. Enzymmengden bør være effektiv ved degradering og/eller oppløsning av de aktuelle forurensningene uten å gi unødvendige ugunstige effekter på materialet forurensningene skal fjernes fra. De andre komponentene i den nye rensesammensetningen bør velges ut slik at de ikke vil virke ugunstig inn på den under betingelsen som er nødvendig for bruken av den. The enzyme preparations obtained by a water extraction can be used directly or, if necessary, further purified. In most cases it is advantageous to lyophilize a preparation from which lipids have been extracted. In such cases, the powder obtained can be stored for a long time. Each field of application requires specific compositions or forms thereof. Such forms are known per se. Such the invention relates to enzyme compositions of different physical forms, such as freeze-dried enzymes, homogeneous aqueous solutions or enzyme compositions mentioned above and which are new. The exact amount of enzymes in each composition varies from case to case - from the thin freeze-dried extract to very complex detergent compositions. The amount of enzyme should be effective in degrading and/or dissolving the pollutants in question without causing unnecessary adverse effects on the material from which the pollutants are to be removed. The other components of the new cleaning composition should be selected so that they will not adversely affect it under the condition necessary for its use.

Mengden av enzympreparat som finnes i sluttsammensetningen kan variere fra 0,0001 vekt% opp til 100 vekt%. Med hensyn til protease aktivitet kan sluttsammensetningen inneholde fra 0.0001 til 0.1 enzymenheter pr. mg. Avhengig av renheten av enzympreparatet som benyttes, kan andre områder anvendes. Enzymenhetene ovenfor er gitt som mol tyrosin ekvivalenter pr. min med kasein som substrat. The amount of enzyme preparation present in the final composition can vary from 0.0001% by weight up to 100% by weight. With regard to protease activity, the final composition may contain from 0.0001 to 0.1 enzyme units per mg. Depending on the purity of the enzyme preparation used, other areas can be used. The enzyme units above are given as moles of tyrosine equivalents per min with casein as substrate.

I sammensetningen i samsvar med oppfinnelsen kan forskjellige additiver og bærere inkorporeres. Egnete bærere kan være sterile, vandige og fysiologisk akseptable salt løsninger, organiske og uorganiske geldannende materialer, f.eks. polymere, silikonoljer og andre substanser og blandinger av disse som gir de ønskete fysikalske egenskapene av sammensetningen. Blant additivene kan antimikrobielle additiver, parfymer, forskjellige anioniske, kationiske, zwitterioniske og nøytrale overflate aktive stoffer (tensidet og emulgatorer) nevnes. Slike komponenter er allerde kjent per se i forbindelse med andre enzymsammensetninger for rensing eller enzymatisk fjerning av sykt, dødt eller forurenset vev, se f.eks. tysk patent-søknad 2 130 838, GB patent skrift 1 280 497, 1 296 901 og 1 573 964 og US patent skrift 3 627 688, 4 242 219, 4 287 082, 4 305 837 og 4 307 081. In the composition according to the invention, various additives and carriers can be incorporated. Suitable carriers can be sterile, aqueous and physiologically acceptable salt solutions, organic and inorganic gel-forming materials, e.g. polymers, silicone oils and other substances and mixtures thereof which give the desired physical properties of the composition. Among the additives, antimicrobial additives, perfumes, various anionic, cationic, zwitterionic and neutral surfactants (surfactants and emulsifiers) can be mentioned. Such components are already known per se in connection with other enzyme compositions for cleansing or enzymatic removal of diseased, dead or contaminated tissue, see e.g. German patent application 2,130,838, GB patent specification 1,280,497, 1,296,901 and 1,573,964 and US patent specification 3,627,688, 4,242,219, 4,287,082, 4,305,837 and 4,307,081.

For behandling av skadet levende vev, et det fordelaktig å bcuke en sammensetning som inneholder en fysiologisk og farmasøytisk akseptabel bærer eller ingen bærer idet hele tatt. En slik sammensetning kan være steril. Sterilisasjon kan utføres f.eks. ved steril filtrering når sammensetningen er en løsning. Sterile sammensetninger kan også oppnås ved å blande sterile komponenter under aseptiske bet ingeiser. For the treatment of damaged living tissue, it is advantageous to use a composition containing a physiologically and pharmaceutically acceptable carrier or no carrier at all. Such a composition may be sterile. Sterilization can be carried out e.g. by sterile filtration when the composition is a solution. Sterile compositions can also be obtained by mixing sterile components under aseptic conditions.

De forskjellige utførelseformene av oppfinnelsen vil framgå videre fra de vedlagte kravene. I det følgende vil oppfinnelsen bli illustrert ved forskjellige ikke-begrensende eksempler. The various embodiments of the invention will further appear from the attached claims. In the following, the invention will be illustrated by various non-limiting examples.

EKSEMPEL 1 EXAMPLE 1

A. Framstilling av et krillekstrakt A. Preparation of a krill extract

Krill, Euphausia superba, fanget i løpet av den antarktiske sommeren, frosset øyeblikkelig og lagret i omtrent to år ved omtrent -80°C, er plassert i et rom ved omtrent 5°C. Idet krillen er nesten tint, blir 25 g krill blandet med 50 ml deionisert vann med temperatur 0°C. Blandingen blir homogenisert og deretter sentrifugert i kulde (omtrent 0°C) i en halv time ved 12500g. Den røde øverste fasen blir dekantert og oppbevart. Bunnfallet blir resuspendert i 50 ml deionisert vann og sentrifugert som ovenfor. Den øverste fasen blir dekantert og kombinert med den øverste fasen fra den første ekstraksjonen. Krill, Euphausia superba, caught during the Antarctic summer, flash frozen and stored for about two years at about -80°C, are placed in a room at about 5°C. As the krill is almost thawed, 25 g of krill are mixed with 50 ml of deionized water at a temperature of 0°C. The mixture is homogenised and then centrifuged in the cold (approximately 0°C) for half an hour at 12500g. The red upper phase is decanted and stored. The precipitate is resuspended in 50 ml of deionized water and centrifuged as above. The upper phase is decanted and combined with the upper phase from the first extraction.

For å fjerne lipider fra ekstraktet blir 20 ml CCl^ tilsatt den "kombinerte øverste fasen" og homogeniser'; i kulde (0°C). Blandingen blir sentrifugert ved 2500 g i 15 min i kulde. Vannfasen fjernes og ekstraheres en gang til med CC14 og sentrifugeres som beskrevet ovenfor. Vannfasen blir brukt i samsvar med IB, hvor alt blir referert til som vannekstraktet. To remove lipids from the extract, 20 ml CCl^ is added to the "combined upper phase" and homogenize'; in the cold (0°C). The mixture is centrifuged at 2500 g for 15 min in the cold. The aqueous phase is removed and extracted once more with CC14 and centrifuged as described above. The water phase is used in accordance with IB, where everything is referred to as the water extract.

B. Videre rensing ved qelkromatoqrafi B. Further purification by chromatography

20 ml av vannekstraktet fra A blir kromatografert på Sephadex® G-100 (dextran kryssbundet med epiklorohydrin. 20 ml of the water extract from A is chromatographed on Sephadex® G-100 (dextran cross-linked with epichlorohydrin.

Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) i en kolonne med diameter 3.1 cm og en høyde på 69 cm. Kollonen ble brakt i likevekt og eluert (30ml pr. time) med Tris-HCl buffer (0.05M, pH 7.5) ved 5°C. Fraksjonene ble samlet. Elueringsprofi len ble bestemt spektroftometrisk ved å måle UV-adsorpsjonen ved 280 pm, og den proteolytiske aktiviteten av fraksjonen ble bestemt separat. De enzymatisk aktive fraksjonene ble samlet og dialysert mot deionisert vann. Til slutt ble de samlete fraksjonene frysetrørret og brukt i samsvar med oppfinnelsen. Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden) in a column with a diameter of 3.1 cm and a height of 69 cm. The column was brought to equilibrium and eluted (30ml per hour) with Tris-HCl buffer (0.05M, pH 7.5) at 5°C. The factions were united. The elution profile was determined spectrophotometrically by measuring the UV adsorption at 280 pm, and the proteolytic activity of the fraction was determined separately. The enzymatically active fractions were collected and dialyzed against deionized water. Finally, the collected fractions were freeze stirred and used in accordance with the invention.

Den proteolytiske aktiviteten i fraksjonene og i det frysetørrete preparatet ble bestemt ved å bruke hemoglobin og/eller kasein som substrat (Rick, W.I; "Methods of Enzymatic analysis; Ed Bergmeyer, HV; Vol 2, p. 1013-23 The proteolytic activity in the fractions and in the freeze-dried preparation was determined using hemoglobin and/or casein as substrate (Rick, W.I; "Methods of Enzymatic analysis; Ed Bergmeyer, HV; Vol 2, p. 1013-23

(1974); Academic Press, New York). Ved å utføre gelkromato-grafi er enzymaktiviteten hovedsaklig funnet fra fraksjoner korresponderende til molekylvektene på 20000 til 40000 Dalton. (1974); Academic Press, New York). By performing gel chromatography, the enzyme activity is mainly found from fractions corresponding to the molecular weights of 20,000 to 40,000 Daltons.

EKSEMPEL 2 EXAMPLE 2

Framstilling av lodde- ekstrakt Production of solder extract

Lodde (Mallotus villosus), fanget ved Finnmarkskysten (Norge) i september måned ble frosset og lagret ved -20°C i et år. Den fryste lodda ble så plassert ved 5°C. Etter 24 timer ble innvollene inkludert fordøyelseskanalen fjernet fra den delvis tinte lodda. 25 g av innvollene ble blandet med 50 ml deionisert vann og homogenisert ved 0°C. Blandingen ble så sentrifugert ved 12500 g i en halv time. Den delvis uklare øverste fasen ble dekantert og oppbevart. Bunnfallet ble resuspendert i 50 ml deionisert vann og sentrifugert som ovenfor. Den nye øverste fasen ble dekantert og kombinert med den øverste fasen fra den første ekstraksjonen. Capelin (Mallotus villosus), caught on the coast of Finnmark (Norway) in September was frozen and stored at -20°C for a year. The frozen capelin was then placed at 5°C. After 24 hours, the viscera including the digestive tract were removed from the partially thawed capelin. 25 g of the viscera were mixed with 50 ml of deionized water and homogenized at 0°C. The mixture was then centrifuged at 12,500 g for half an hour. The partially cloudy upper phase was decanted and stored. The precipitate was resuspended in 50 ml of deionized water and centrifuged as above. The new upper phase was decanted and combined with the upper phase from the first extraction.

For å fjerne lipider fra ekstraktet ble 20 ml CC14 tilsatt til den "kombinerte" øvre fasen og homogenisert i kulde (0°C). Blandingen ble sentrifugert ved 2500 g i 15 min i kulde. Vannfasen ble fjernet og ekstrahert en gang til med karbontetraklorid og sentrifugert som beskrevet ovenfor. Vannfasen ble tilslutt frysetørret. To remove lipids from the extract, 20 ml of CC14 was added to the "combined" upper phase and homogenized in the cold (0°C). The mixture was centrifuged at 2500 g for 15 min in the cold. The aqueous phase was removed and extracted once more with carbon tetrachloride and centrifuged as described above. The water phase was finally freeze-dried.

EKSEMPEL 3 EXAMPLE 3

Sammensetninger som inneholder enzymer fra Mallotus villosus A 10 mg frysetørret enzympreparat fra lodde (i samsvar med eksempel 2) blandes med 0.4 mg kalsiumacetat og amylum resorb til 1 g (Biosorbw; Arbrook, Kirkton Campus, Livingston, Scotland). Compositions containing enzymes from Mallotus villosus A 10 mg freeze-dried enzyme preparation from capelin (in accordance with example 2) is mixed with 0.4 mg calcium acetate and amylum resorb to 1 g (Biosorbw; Arbrook, Kirkton Campus, Livingston, Scotland).

Den homogene pulveret som ble oppnådd slik, blir rørt ut i 10 g fysiologisk natriumklorid løsning (saltoppløsning) og kan brukes til å fukte bandasjer. The homogeneous powder thus obtained is stirred into 10 g of physiological sodium chloride solution (saline solution) and can be used to moisten bandages.

B 10 mg frysetørret lodde preparat (fra eksempel 2) B 10 mg freeze-dried solder preparation (from example 2)

15 blandes med en polyetylenglykolgel (inneholdende like deler Macrogol 600 og Macrogol 800 (Holchst, Forbundsrepublikken Tyskland)) til 1 g. En 1%-enzymsammensetning med en semifast, homogen konsistens ble oppnådd. 15 is mixed with a polyethylene glycol gel (containing equal parts Macrogol 600 and Macrogol 800 (Holchst, Federal Republic of Germany)) to 1 g. A 1% enzyme composition with a semi-solid, homogeneous consistency was obtained.

EKSEMPEL 4 EXAMPLE 4

Sammensetning som inneholder krillenzymer i en løsning Composition containing krill enzymes in a solution

10 mg frysetørret enzympreparat (fra eksempel IB) blandes med 0.4 mg kalsiumacetat og amylum resorb til lg. Det homogene pulveret som slik oppnås ristes med 10 g saltoppløsning og sammensetningen som oppnås brukes for å fukte en steril kompress med størrelse 3x3 cm og inneholdende fire lag gas. Den våte kompressen påføres et dødt sår. Et gasbind tvinnes to ganget rundt kompressen for å feste den. Denne bandasjen blir så videre festet med et plaster. Kompressen fuktes med sammensetningen hver fjerde time. For å begrense påføringen bare til den delen av kompressen som dekker såret, blir blandingen påført ved å bruke en injeksjonskanyle med en grov spiss. En gang om dagen blir hele bandasjen fjernet og erstattet med en ny bandasje. I, løpet av denne operasjonen må degraderte og disintegrerte døde partier fjernes mekanisk. Ved den spesifikke behandlingen som ble utført, viste såret seg å være rent etter en uke. 10 mg of freeze-dried enzyme preparation (from example IB) is mixed with 0.4 mg of calcium acetate and amylum resorb to lg. The homogeneous powder thus obtained is shaken with 10 g of salt solution and the composition obtained is used to moisten a sterile compress of size 3x3 cm and containing four layers of gas. The wet compress is applied to a dead wound. A gauze bandage is twisted twice around the compress to secure it. This bandage is then fixed with a plaster. The compress is moistened with the composition every four hours. To limit the application only to the part of the compress covering the wound, the mixture is applied using an injection needle with a coarse tip. Once a day, the entire bandage is removed and replaced with a new bandage. During this operation, degraded and disintegrated dead parts must be removed mechanically. In the specific treatment that was carried out, the wound was found to be clean after a week.

EKSEMPEL 5 EXAMPLE 5

Effekt av krillenzymer på dødt materiale Effect of krill enzymes on dead material

For å undersøke effekten av krillenzymer på dødt materiale som finnes på menneskets hud, ble følgende eksperiment utført: Dødt materiale ble påført den intakte huden på oversiden av høyre hånd på to personer. Det døde materiale var fra et sår på et ben. Materialet besto av devitalisert kollagen-vev, koagulert blod, fibrin, materie og "skorper". Mengden som ble påført hver person var 0.5 g. To investigate the effect of krill enzymes on dead material found on human skin, the following experiment was conducted: Dead material was applied to the intact skin on the upper side of the right hand of two subjects. The dead material was from a wound on a leg. The material consisted of devitalized collagen tissue, coagulated blood, fibrin, matter and "scabs". The amount applied to each person was 0.5 g.

Det døde materialet ble på hver person dekket med en kompress (med areal 10 cm 2), som var blitt fuktet med krill enzymblandingen framstilt som i eksempel 4. Hver kompress ble dekket med gas. Etter fire timer var begge kompressene nesten fullstendig tørre, og derfor måtte mer av enzymsammensetningen tilføres. Etter tolv timer ble kompressene fjernet og det døde materialet som var igjen på hver hånd ble veid separat. Materialet viste karakteristiske tegn på degradering og hadde avtatt i vekt med omtrent 25%. Huden som var i kontakt med det døde materialet under forsøket var upåvirket. Forsøkspersonene viste ingen negative symptomer. The dead material was covered on each person with a compress (with an area of 10 cm 2 ), which had been moistened with the krill enzyme mixture prepared as in example 4. Each compress was covered with gas. After four hours, both compresses were almost completely dry, and therefore more of the enzyme composition had to be added. After twelve hours the compresses were removed and the dead material remaining on each hand was weighed separately. The material showed characteristic signs of degradation and had decreased in weight by approximately 25%. The skin in contact with the dead material during the experiment was unaffected. The subjects showed no negative symptoms.

EKSEMPEL 6 EXAMPLE 6

In vivo forsøk med en person med et mindre dødt sår In vivo experiment with a person with a minor dead wound

En person med et mindre sår inneholdende dødt materiale på sin høyre pekefinger, behandlet seg selv over en periode på 5 dager med daglig påføring av 1% krill en2ymløsning (laget som i eksempel 4). Sårområdet tålte enzymsammensetningen godt og viste en signifikant tendens til å bli rent og til å gro. Ingen ugunstig effekt ble observert. A subject with a minor wound containing dead material on his right index finger treated himself over a period of 5 days with daily application of 1% krill en2ym solution (made as in Example 4). The wound area tolerated the enzyme composition well and showed a significant tendency to become clean and to heal. No adverse effect was observed.

EKSEMPEL 7 EXAMPLE 7

Renseeffekten på lipidrik abnorme fettutsondringer i huden med krillenzymer kombinert med et amfotært tensid En konvensjonell detergent som ble brukt besto av 18.00 vekt% alkylimidazolin, 1,90 vekt% lauryl-polypeptidkondensat, 1.70 vekt% undecylenyl-polypeptidkondensat, 28 vekt% modifisert alkyletersulfat buffret med fettsubstanser (lanolin), 1.40 vekt% kokosnøtt-aminsarcosinat, 1.90 vekt% undecylensyre, 2.00 vekt% undecylen-monoetanolamid sulforavsyreester, en passende mengde melkesyre til pH 6.4, og destillert vann til 100.00 vekt% The cleansing effect on lipid-rich abnormal fat secretions in the skin with krill enzymes combined with an amphoteric surfactant A conventional detergent used consisted of 18.00 wt% alkylimidazoline, 1.90 wt% lauryl polypeptide condensate, 1.70 wt% undecylenyl polypeptide condensate, 28 wt% modified alkyl ether sulfate buffered with fatty substances (lanolin), 1.40% by weight coconut amine sarcosinate, 1.90% by weight undecylenic acid, 2.00% by weight undecylene monoethanolamide sulforaic acid ester, an appropriate amount of lactic acid to pH 6.4, and distilled water to 100.00% by weight

En viss mengde frysetørret krillenzympreparat (fra eksempel IB) ble tilsatt detergenten for dannelse av en 1 vekt% enzym detergentsammensetning. Et område på 10 cm<2>A certain amount of freeze-dried krill enzyme preparation (from example IB) was added to the detergent to form a 1% by weight enzyme detergent composition. An area of 10 cm<2>

hud ved brystbeinet på to personer med synlig abnorme fettutsondringer i denne hudregionen, ble valgt ut til forsøk. Områdene ble vasket to ganger daglig i fem dager med enzymdetergentsammensetningen. Prøver fra det samme området ble tatt både før og etter vaskeperioden. Prøvene ble samlet og analysert fotometrisk i samsvar med Schaeffer, H. og Kuhn-Bussius H. (Arch, Klin. u. exper. Dermatol. 238 (1970) s. 429). skin at the sternum of two people with visibly abnormal fat secretions in this skin region were selected for testing. The areas were washed twice daily for five days with the enzyme detergent composition. Samples from the same area were taken both before and after the washing period. The samples were collected and analyzed photometrically in accordance with Schaeffer, H. and Kuhn-Bussius H. (Arch, Klin. u. exper. Dermatol. 238 (1970) p. 429).

Resultatet viste en signifikant minking i transmisjonsverdien for begge personene som ble undersøkt. Dette indikerer dermed en degradering av lipider på huden ved enzymsammensetningen som ble brukt. Til sammenlikning ble svært liten effekt oppnådd da to personer brukte bare detergent uten enzymer. The result showed a significant decrease in the transmission value for both people who were examined. This thus indicates a degradation of lipids on the skin by the enzyme composition that was used. By comparison, very little effect was achieved when two people used only detergent without enzymes.

EKSEMPEL 8 EXAMPLE 8

Sammenliknende vaskeeksperimenter på tekstil. En sammenlikning mellom enzymer fra E. superba ( krill), AlcalaseR og destillert vann. Comparative washing experiments on textiles. A comparison between enzymes from E. superba (krill), AlcalaseR and distilled water.

Like stykker (5x5 cm) ble skåret fra en homogen del av et tøystykke. Tøystykket var dobbelt med en side av silke og den andce av islett bestående av en blanding av bomull og syntetiske fibre. Seks av stykkene ble stenket med blod. seks med melk og seks med tusj. Til hver av seks Ehrlenmeyerkolber ble 100 ml av en vandig løsning (0,5% vekt/volum) frysetørret krillenzym tilsatt (frysetørret krillenzym ble oppnådd fra eksempel IB). Til hver av seks andre Ehrlenmeyerkolber ble 100 ml av 0.5% (vekt/volum) Equal pieces (5x5 cm) were cut from a homogeneous part of a piece of cloth. The piece of cloth was double with one side of silk and the other of islet consisting of a mixture of cotton and synthetic fibers. Six of the pieces were spattered with blood. six with milk and six with marker. To each of six Ehrlenmeyer flasks, 100 ml of an aqueous solution (0.5% w/v) of freeze-dried krill enzyme was added (freeze-dried krill enzyme was obtained from Example IB). To each of six other Ehrlenmeyer flasks was added 100 ml of 0.5% (w/v)

(R) (R)

Alcalase^ (Novo Industri, København, Danmark) løsning i destillert vann tilsatt. 100. ml destillert vann ble tilsatt seks andre Ehrlenmeyerkolber. Alcalase^ (Novo Industri, Copenhagen, Denmark) solution in distilled water added. 100 ml of distilled water was added to six other Ehrlenmeyer flasks.

Til hver av to kolber inneholdende krillenzym-løsningen, til hver av to kolber inneholdende Alcalasé-'-løsningen og til hver av to kolber inneholdende destillert vann ble et av stykkene stenket med blod tilført. Analogt ble de andre stenkete stykkene tilført de resterende kolbene, slik at bare et tøystykke var tilstede i hver kolbe. Dette betyr at hver av sammensetningene kunne virke dobbelt på tøystykkene stenket med blod, melk og tusj. Deretter ble kolbene ristet i vannbad i en time ved 45°C. Etter denne behandlingen ble vaskevæsken dekantert og 100 ml destillert vann ble tilsatt hver kolbe. Kolbene ble så lukket med en gummikork og ristet voldsomt i et minutt. Deretter ble tøystykkene samlet og vasket rolig i rennende vann fra kranen i 10 minutter. Stykkene ble foldet i rene hvite håndklær og tørket. To each of two flasks containing the krill enzyme solution, to each of two flasks containing the Alcalasé solution and to each of two flasks containing distilled water one of the pieces sprinkled with blood was added. Analogously, the other speckled pieces were added to the remaining flasks, so that only one piece of cloth was present in each flask. This means that each of the compositions could have a double effect on the pieces of cloth splattered with blood, milk and marker. The flasks were then shaken in a water bath for one hour at 45°C. After this treatment, the washing liquid was decanted and 100 ml of distilled water was added to each flask. The flasks were then closed with a rubber stopper and shaken vigorously for one minute. The pieces of cloth were then collected and washed calmly in running water from the tap for 10 minutes. The pieces were folded in clean white towels and dried.

Effekten av vaskingen, dvs. renheten av tøystykkene, ble så bestemt ved e.i dobbel blind-test, dvs. at personen som utførte testen ikke visste hvilken vaskesammensetning hvert stykke var behandlet med. Vaskeeffekten, dvs. renheten av tøystykket ble evakuert visuelt i rekkefølge; 0=fullstendig rent tøy; l=ubetydelige mengder av gjenværende smuss; 2=moderate mengder av gjenværende smuss; 3=betraktelige mengder gjenværende smuss. Resultatet fra vaskingen er presentert i tabell 1. The effect of the washing, i.e. the cleanliness of the pieces of cloth, was then determined by e.i double blind test, i.e. the person who carried out the test did not know which washing composition each piece had been treated with. The washing effect, i.e. the cleanliness of the piece of cloth was evacuated visually in order; 0=completely clean laundry; l=negligible amounts of residual dirt; 2=moderate amounts of residual dirt; 3=considerable amounts of residual dirt. The result from the washing is presented in table 1.

Tabell 1 Table 1

Vaskeeffekten av 0.5% (vekt/volum) krillenzym i destillert vann, 0.5% (vekt/volum) Alcalase<®> i destillert vann; og destillert vann uten tilsats av enzymer. The washing effect of 0.5% (w/v) krill enzyme in distilled water, 0.5% (w/v) Alcalase<®> in distilled water; and distilled water without the addition of enzymes.

Cr) Cr)

0.5% krillenzym i 0.5% Alcalase^ dest. vann 0.5% krill enzyme in 0.5% Alcalase^ dist. water

Fra tabell 1 ser en at enzymsammensetningen fra krill er mer effektiv enn Alcalase-^ eller destillert vann. Liknende forsøk kan utføres med en analog sammensetning inneholdende loddeenzymer. Table 1 shows that the enzyme composition from krill is more effective than Alcalase-^ or distilled water. Similar experiments can be carried out with an analogous composition containing soldering enzymes.

EKSEMPEL 9 EXAMPLE 9

Degradering av fibrin, dødt materiale og koagulert blod A. Fibrin Degradation of fibrin, dead material and coagulated blood A. Fibrin

Fibrin ble dissekert i biter med varierende vekt fra 0.2-0.3g. For hver enzymsammensetning som ble brukt, ble 20 reagensrør nummerert og hvert av dem ble tilført det på forhånd veide fibrin. Til de 20 rørene for hver sammensetning ble det tilsatt like mengde av enzymsammen- Fibrin was dissected into pieces of varying weight from 0.2-0.3g. For each enzyme composition used, 20 test tubes were numbered and to each of them was added the pre-weighed fibrin. To the 20 tubes for each composition, an equal amount of enzyme combination was added

(R) (R)

setningen. Varidasew ble brukt i en fortynning på 1:20 (vekt/volum basert på det kommersielle preparatet) i destillert vann. Trypure ® ble brukt i en konsentrasjon på 1:15 (vekt/volum basert på det kommersielle prepararet) i saltoppløsning. Preparatene av de andre enzymene som ble brukt ble fortynnet i saltoppløsning og konsentrasjonene av sammensetningen som slik ble oppnådd er gitt i tabell 2. Kr i 1lenzymene og lodde-enzymene som ble brukt var de fryse-tørrete preparatene oppnådd i samsvar med henholdsvis eksempel IB og 2. Studiet ble utført ved en temperatur på 33°C, som er den samme som temperaturen i sår. Etter henholdsvis 12 og 24 timer ble reaksjonene stoppet, og gjenværende fibrin ble samlet og oppbevart på et vått filterpapir i 60 sekunder og så veid. Papain, Ficin og Pankreatin var alle fått fra E. Merck, Darmstadt, Tyskland. the sentence. Varidasew was used at a dilution of 1:20 (w/v based on the commercial preparation) in distilled water. Trypure ® was used at a concentration of 1:15 (w/v based on the commercial preparation) in saline. The preparations of the other enzymes that were used were diluted in salt solution and the concentrations of the composition thus obtained are given in Table 2. The Kr in 1l enzymes and the soldering enzymes that were used were the freeze-dried preparations obtained in accordance with example IB and 2. The study was carried out at a temperature of 33°C, which is the same as the temperature in wounds. After 12 and 24 hours, respectively, the reactions were stopped, and the remaining fibrin was collected and kept on a wet filter paper for 60 seconds and then weighed. Papain, Ficin and Pancreatin were all obtained from E. Merck, Darmstadt, Germany.

Fibrin ble oppløst på kortest tid med sammen- setningen inneholdende krillenzymer, lodde-enzymer og Trypuré®, den Fibrin was dissolved in the shortest time with the composition containing krill enzymes, solder enzymes and Trypuré®, the

(R) (8) (R) (8)

gitte rekkefølgen. Varidasew og Alcalase^ var like med ficin, og papin hadde svakest effekt. given the order. Varidasew and Alcalase^ were equal to ficin, and papin had the weakest effect.

B. Degradering av dødt materiale. B. Degradation of dead material.

Dødt materiale ble dissekert i stykker på 0.2-0.3g. For hver enzymsammensetning som ble brukt ble 20 reagensrør nummerert og til hver av disse ble et stykke av på forhånd veid dødt materiale tilsatt. Til de 20 reagensrørene med hver sammensetning, ble like mengder av hver enzymsammensetning tilført. Sammensetningene som ble brukt er gitt i tabell 3 og konsentrasjonene er gitt i % (vekt/volum) i saltoppløsning. Varidasé^ og Trypure-^ ble fortynnet i samsvar med eksempel 8A. Etter tidsintervaller på 12, 24, 36 og 72 timer, ble degraderingen stoppet og det døde materialet ble samlet og veid. Dead material was dissected into pieces of 0.2-0.3g. For each enzyme composition used, 20 test tubes were numbered and to each of these a piece of pre-weighed dead material was added. To the 20 test tubes of each composition, equal amounts of each enzyme composition were added. The compositions used are given in Table 3 and the concentrations are given in % (w/v) in saline. Varidasé^ and Trypure-^ were diluted in accordance with Example 8A. After time intervals of 12, 24, 36 and 72 hours, degradation was stopped and the dead material was collected and weighed.

TABELL 3 TABLE 3

Influeringen av forskjellige enzytnblandinger på dødt materiale. Konsentrasjonene i % er beregnet på en vekt/volum-bas is. The influence of different enzyme mixtures on dead material. The concentrations in % are calculated on a weight/volume basis.

(R) (R)

Det visec seg at Alcalase^, krillenzymer og lodde-enzymer er godt istand til å løse opp dødt materiale It turns out that Alcalase^, krill enzymes and solder enzymes are good at dissolving dead material

(R) (R)

og øker ikke vanninnholdet i dette som i Varidase^, Trypure og saltoppløsning. Når en imidlertid ser på deres influering på dødt materiale, viser Papin og Pankreatin® de samme tendensene som sammensetningene på markedet, dvs. en økning i vekt som skyldes en økning i vanninnhold. Ficin har en effekt som likner, men er svakere enn Alcalase , knllenzymene og loddeenzymene. and does not increase the water content in this as in Varidase^, Trypure and saline solution. However, when looking at their influence on dead matter, Papin and Pancreatin® show the same tendencies as the compositions on the market, i.e. an increase in weight due to an increase in water content. Ficin has an effect similar to, but weaker than, Alcalase, the knll enzymes and the soldering enzymes.

C. Degradering av koagulert blod. C. Degradation of clotted blood.

Koagulert blod ble dissekert og fordelt i reagens-rør arrangert som i eksempel 9A og B. Rnzympreparatene som ble brukt ble løst i saltoppløsningen og konsentrasjonene (% vekt/volum) av sammensetningene som ble oppnådd slik er gitt i tabell 4. Etter tidsintervall på henholdsvis 12 og Coagulated blood was dissected and distributed in test tubes arranged as in examples 9A and B. The enzyme preparations used were dissolved in the salt solution and the concentrations (% w/v) of the compositions thus obtained are given in Table 4. After time intervals of respectively 12 and

Fra tabell 4 framgår at for koagulert blod er kr i 1lenzymene bedre enn enzymene, som begge viser en effekt bedte enn de andre enzymsammensetningen© som er undersøkt. Table 4 shows that for coagulated blood, NOK in the 1lenzymes is better than the enzymes, both of which show a better effect than the other enzyme compositions that have been examined.

EKSEMPEL 10 EXAMPLE 10

Studier av forskjellige enzymsammen setninger på frisk hud. Studies of different enzyme compositions on healthy skin.

Forskjellige løsninger av ficin, papain, AlcalascPK Various solutions of ficin, papain, AlcalascPK

(r) (s)

Pankreatin^, krillenzymer og lodde-enzymer - alle med konsentrasjon på 1% (vekt/volum) - ble påført (0.3 ml) den friske huden til to forsøkspersoner og dekket med en tynn bandasje. Ingen tegn på angrep eller betennelse kunne observeres på huden etter 12 timer. Den samme observasjonen ble gjort ved bruk av Varidase<®>og Trypure®. ?:nzymene synes dermed bare å angripe dødt vev i konsentrasjons-områdene brukt i forsøkene. Pancreatin^, krill enzymes and solder enzymes - all at a concentration of 1% (w/v) - were applied (0.3 ml) to the healthy skin of two subjects and covered with a thin bandage. No signs of attack or inflammation could be observed on the skin after 12 hours. The same observation was made using Varidase<®>and Trypure®. The enzymes thus only seem to attack dead tissue in the concentration ranges used in the experiments.

Claims

1. Process for the production of an enzyme composition, which aims to remove biological contaminants, in particular contaminants containing both peptides and lipids, characterized in that: animals of the type Euphausiaceae are homogenised, preferably at E>°C or lower, where the homogenised is possibly removed for any lipids; and that through extraction, preferably at 5°C or lower, with a solvent, which consists entirely or partly of water, an enzyme composition is isolated which contains a mixture of enzymes, which have a molecular weight of from 15,000 to 80,000 Daltons or are active aggregate of such enzymes., which includes both endo- and exopeptidases, where the isolated enzyme mixture contains enzymes that have the ability to dissolve and remove impurities containing mixtures of substances such as lipids, phospholipids, proteins, peptides, nucleic acids, polysaccharides, mucopolysaccharides and breakdown products of these substances, and; that the enzyme composition is possibly sterilized.

2. Method according to claim 1, characterized in that lipids are removed from the enzyme composition and that this is lyophilised.