KR20220123526A - 조성물 및 제조 방법 - Google Patents

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KR20220123526A
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마크 리차드슨
키스 브로클허스트
주세페 트리지앙테
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피닉스 이글 컴퍼니 피티와이 엘티디
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Abstract

본 발명은 과일-유래 세린 프로테아제를 포함하는 조성물, 과일 공급원으로부터 프로테아제를 추출하는 방법, 이것의 미용 및 치료 용도, 및 복합 키트에 관한 것이다.

Description

조성물 및 제조 방법
본 발명은 카리카 파파야(Carica papaya) 식물에서 확인된 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물들, 카리카 파파야 식물로부터 조성물들을 생산하는 방법들, 전술한 방법들에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 하나 이상의 프로테아제를 포함하는 조성물들, 의약 및 화장료 제조에서의 이러한 조성물들의 용도, 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료에서의 이러한 조성물들의 용도, 미용 응용에서의 이러한 조성물들의 용도, 및 본 발명의 방법 또는 용도를 수행하기 위한 관련 키트들에 관한 것이다.
당뇨병성 족부궤양, 욕창, 정맥궤양 및 동맥궤양을 포함하고 이에 제한되지 않는 다양한 타입의 만성 상처들의 효과적인 관리는 여전한 도전 과제로 남아 있다. 이러한 상처들은 치유하는데 상당한 시간이 필요하거나 실제적으로 치유되지 않을 수 있으며 의료 전문가들로부터의 상당한 자원들을 필요로 할 수도 있다. 아스코르브산, 콜라겐 타입 I 및 알파-토코페롤 아세테이트를 포함하는 전분의 가수분해에 의해 얻어지는 D 글루코스 다당류 드레싱과 같은 상처 치유를 돕기 위한 수많은 제품이 이전에 개발되었다(US 6,187,743).
또한 상처 괴사조직 제거를 위한 파파인(papain) 및 브로멜라인(bromelain)과 같은 프로테아제들의 사용에 대한 이전의 관심이 있었다.
본 발명의 요약
우리는 잘 익은 파파야(Carica papaya) 과육을 알칼리로 처리하여 얻은 여과액에서, 그 과일에 대한 활성 프로테아제로서 이전에는 확인되지 않았던 프로테아제의 존재를 확인했다. 우리는 이 프로테아제가 세린 프로테아제이고 여과액에 세린 프로테아제와 시스테인 프로테아제 활성이 모두 포함되어 있음을 확인하였다. 약용 구더기의 분비물에서 확인된 세린 프로테아제(van der Plas et al., 2014, PLoS ONE 9(3): e92096)는 플라스미노겐을 분해하는 것에 의해 플라스미노겐 활성화제-유래 섬유소 분해를 향상시키는 것으로 이전에 나타났으며, 이것이 괴사조직의 상처를 디브리딩(debriding)하는 약용 구더기의 능력에 기여할 수 있는 것으로 제안되었다.
따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 알칼리 처리된, 펄프화된 익은 카리카 파파야 과일로부터 추출된 활성 세린 프로테아제와 같은, 카리카 파파야 식물의 익은 과일로부터 추출된 활성 세린 프로테아제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 활성 세린 프로테아제에는 불용성 카리카 파파야 유래 물질이 실질적으로 존재하지 않는다.
제 2 실시형태에서, 세린 프로테아제는 SEQ ID NO:1의 아미노산 113 내지 771에 대해 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99% 상동성(예컨대, 서열 동일성)을 갖는 연속적인 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 세린 프로테아제는 약 70 kDa와 같은, 65 내지 75 kDa의 분자량을 갖는다.
제 3 실시형태에서, 세린 프로테아제는 45 내지 55 kDa의 분자량을 가지며 SEQ ID NO:1의 아미노산 142 내지 618에 대해 적어도 95% 상동성을 갖는 연속적인 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명은 45 내지 55 kDa의 분자량을 가지며 SEQ ID NO:1의 아미노산 142 내지 618에 대해 적어도 95% 상동성을 갖는 연속적인 아미노산 서열을 포함하는 단리된 활성 세린 프로테아제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 불용성 카리카 파파야 유래 물질이 실질적으로 존재하지 않는 단리된 활성 세린 프로테아제를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 세린 프로테아제는 45 내지 55 kDa의 분자량을 갖고 SEQ ID NO:1의 아미노산 142 내지 618에 대하여 적어도 95%의 상동성을 갖는 연속적인 아미노산 서열을 포함한다.
제 2 양태에서, 본 발명은 카리카 파파야로부터 유도되거나 유도될 수 있는 하나 이상의 활성 세린 프로테아제들 및 카리카 파파야로부터 유도되거나 유도될 수 있는 하나 이상의 활성 시스테인 프로테아제들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 활성 프로테아제들은 익은 카리카 파파야로부터 추출된다. 또 다른 실시형태에서, 하나 이상의 활성 프로테아제들은 재조합 발현 시스템을 사용하여 생산된다.
본 발명은 또한 익은 카리카 파야야로부터 프로테아제를 추출함으로써 하나 이상의 활성 세린 프로테아제를 포함하는 조성물을 제조하는 방법들에 관한 것이다. 따라서, 제 3 양태에서, 본 발명은 펄프를 가열하는 단계 없이 펄프화된 익은 카리카 파파야 과일을 알칼리로 처리하는 단계를 포함하는 활성 세린 프로테아제를 포함하는 조성물의 제조 프로세스를 제공한다. 일 실시형태에서, 알칼리는 약 알칼리, 바람직하게는 중탄산나트륨이다.
이 프로세스에 의해 제조된 조성물들은 카리카 파파야로부터 유래되거나 유래될 수 있는 하나 이상의 시스테인 프로테아제를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 알칼리 처리 후에 불용성 식물 물질로부터 적어도 하나의 가용성 프로테아제가 분리된다.
조성물은 예를 들어 동결 건조, 투석, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이들의 조합을 사용하여 프로테아제 또는 프로테아제들의 농도를 증가시키기 위해 추가로 처리될 수 있다.
제 4 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법들에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 세린 프로테아제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
조성물은 약제학적 또는 미용적 응용에 더 적합하도록 제형화될 수 있다. 따라서, 제 5 양태에서, 본 발명은 활성 카리카 파파야 세린 프로테아제를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물, 그리고 활성 카리카 파파야 세린 프로테아제를 화장용으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 화장 조성물을 제공한다. 관련된 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제 1, 제 2 또는 제 4 양태들 중 임의의 것의 조성물과 함께 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물, 그리고 본 발명의 제 1, 제 2 또는 제 4 양태들 중 임의의 것의 조성물과 함께 화장용으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 화장 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물들은 다양한 제약 및 화장 용도로 사용될 수 있다. 따라서, 제 6 양태에서, 본 발명은 또한 본 발명의 조성물을 환자의 환부에 투여하는 것을 포함하는 피부 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 상처를 비롯한 질병 및 질환의 치료에 사용된다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 괴사조직 제거에 사용된다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 화상 치료에 사용된다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 궤양을 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 궤양을 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 국소적으로 적용된다.
본 발명은 제 7 양태에서 환자의 환부에 본 발명의 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 개인의 표피의 평활화 및 재생과 같은 원하는 미용적 결과를 달성하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 조성물들을 사용하는 화장 방법을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 각질 제거, 피부 미백, 또는 주름, 피부 흠, 주근깨, 뾰루지, 여드름, 장미증, 기미, 흉터 또는 정맥류에 적용하기 위해, 또는 건조, 노화 또는 손상된 피부에 적용하기 위해 사용된다.
제 8 양태에서, 본 발명은 약제의 제조에 있어서 제 1, 제 2, 제 4 또는 제 5 양태의 조성물들의 용도를 제공한다. 일부 실시형태들에서, 약제는 상처를 비롯한 질병 및 질환의 치료를 위한 것이다. 일부 실시형태들에서, 약제는 괴사조직 제거용이다. 일부 실시형태들에서, 약제는 화상 치료용이다. 일부 실시형태들에서, 약제는 궤양을 치료하기 위한 것이다. 일부 실시형태들에서, 약제는 괴저를 치료하기 위한 것이다.
제 9 양태에서, 본 발명은 화장료의 제조에 있어서 제 1, 제 2, 제 4 또는 제 5 양태의 조성물들의 용도를 제공한다. 일부 실시형태들에서, 화장료는 박리용이다.
제 10 양태에서, 본 발명은 상처를 포함하는 질병 및 질환의 치료에 사용하기 위한, 제 1, 제 2, 제 4 또는 제 5 양태들의 조성물들을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 치료는 괴사조직 제거이다. 일부 실시형태들에서, 치료는 궤양에 대한 것이다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 국소적으로 적용된다.
제 11 양태에서, 본 발명은 박리에 사용하기 위한 제 1, 제 2, 제 4 또는 제 5 양태들의 조성물들을 제공한다.
제 12 양태에서, 본 발명은 제 1, 제 2, 제 4 또는 제 5 양태들의 조성물들을 포함하는 키트를 제공한다. 일 실시형태에서, 키트는 본 발명의 방법들을 수행하기 위해 사용된다.
본 발명의 조성물들은 예를 들어 캡슐, 정제, 크림, 연고, 용액, 페이스트, 점적제, 스프레이, 에어로졸, 증기, 와이프, 패치, 거즈, 겔 또는 액체로서 제형화될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물들은 캡슐, 정제, 크림, 연고, 용액, 페이스트, 점적제, 스프레이, 에어로졸, 증기, 와이프, 패치, 거즈, 겔 또는 액체로서 제공되거나 패캐징되며 사용하기 전에 재구성될 필요가 없다.
도 1: 오버레이-자이모그래피(overlay-zymography) 모식도. 오버레이-자이모그래피 프로세스 및 후속하는 SDS PAGE 겔들에서 프로세스를 위한 효소 활성 지점에서 밴드들의 절제.
도 2: 프란츠(Franz) 셀 확산 시스템을 사용한 괴사조직 제거 분석의 도면(Shi, Ermis et al. 2009).
도 3: OPAL A 및 OPAL B 여과액들의 L-BApNA 단백질 분해 활성에 대한 막대 차트 플롯. 시간 경과의 기울기로 측정되는 L-BApNA에 대한 OPAL A 및 OPAL B 여과액들. OPAL B 여과액은 OPAL A 여과액에 비해 촉매 활성이 거의 8배 더 높다. 결과는 n=8 실험에 대한 평균 ± SD로 표시된다. 구조 분석은 스튜던트 T-테스트를 사용하여 수행되었다(*** p<0.001).
도 4: OPAL B 여과액과 E-64의 첨가에 의한 L-BApNA의 효소 가수분해의 분광 광도 플롯. OPAL B 여과액에 의한 기질 L-BAPNA의 효소적 가수분해 및 시스테인 프로테아제 억제제 E-64에 의한 부분 활성 억제를 보여주는 대표적인 플롯, 이것은 시스테인 프로테아제들 이외에 다른 프로테아제들의 존재를 시사한다.
도 5: OPAL B 여과액의 단백질 분해 활성에 대한 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail; PIC)의 효과에 대한 분광 광도 플롯. OPAL B 여과액에 의한 기질 L-BAPNA의 효소적 가수분해와 PIC에 의한 완전한 억제를 보여주는 대표적인 트레이스.
도 6: OPAL B 여과액의 단백질 분해 활성에 대한 다양한 프로테아제 억제제 클래스들의 효과에 대한 막대 차트 플롯.
도 7: OPAL B 여과액의 단백질 분해 활성에 대한 E-64+AEBSF 효과의 분광 광도 플롯. 시스테인 프로테아제 억제제 E-64 및 세린 프로테아제 억제제 AEBSF의 조합에 의한 OPAL B 여과액에서 L-BAPNA 활성의 완전한 억제를 보여주는 대표적인 트레이스.
도 8: OPAL B 여과액의 오버레이 자이모그래피 분석.
도 9: OPAL B 여과액의 오버레이 자이모그래피 분석 및 억제제들의 사용에 대한 효과. OPAL B 샘플들에서 네이티브 PAGE 겔 밴드들이 얻어졌으며 후속적으로 단백질 밴드들이 겔에서 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겨겼다. 자이모그래피 분석은 시스테인 프로테아제 억제제 E-64로 상부 밴드(---)를 제어하여 완전히 억제하고 세린 프로테아제 억제제 AEBSF로 하부 밴드(---)를 억제하는 두 가지 효소 활성을 보여준다.
도 10: 용리 2 내지 10으로 실행된 SDS PAGE 겔의 은 염색. 80 kDa에서 6번째 분획에 존재하는 고강도 밴드와 50 kDa 및 30 kDa에서 밴드들이 LC/MS 분석을 사용하여 분석되었으며 서브틸라제로 밝혀졌다.
도 11: 다양한 처리를 사용하여 세린 프로테아제 프로브로 처리된 OPAL B 여과액의 SDS PAGE 웨스턴 블롯팅 분석. tris-HCl이 없고(레인 2) 5mg/ml tris-HCl(레인 4), 10mg/ml tris- HCL(레인 6) 및 각각 AEBSF을 갖는(레인 3, 5, 7) 1μl 프로브(100μl당)로 처리된 OPAL B 여과액의 SDS PAGE 웨스턴 블롯팅 분석. 배경 교란이 없음을 보여주는 E-64(레인 6) 및 E-64 및 AEBSF(레인 7)를 갖는 1μL 프로브 및 10-mg/mL tris-HCl를 사용한 OPAL B 여과액.
도 12: 라텍스 파파인과 비교된 OPAL A 여과액에 의한 AWE 기질(백분율 활성)의 차등 분해는, OPAL A가 콜라겐과 피브린을 더 잘 분해하는 반면 대조 라텍스 파파인은 엘라스틴을 더 잘 분해한다는 것을 보여준다. 결과는 n=3 실험에 대한 평균 ± SD로 표시된다. 구조 분석은 스튜던트 T-테스트를 사용하여 수행되었다(** p<0.01, *** p<0.001).
도 13: 네이티브 OPAL A 여과액과 비교된 투석된 OPAL A 및 OPAL A + 10% 요소에 의한 AWE 기질의 차등 분해(백분율 활성). 투석된 OPAL A는 피브린 및 엘라스틴 모두에 대한 괴사조직 제거 활성을 강화하였지만 콜라겐에 대한 OPAL A의 더 낮은 활성과 상관 관계가 있는 콜라겐은 그렇지 않았다. OPAL A 요소의 첨가는 AWE 분석에서 피브린과 엘라스틴에 대한 효소들의 활성을 억제했다. 결과는 n=3 실험에 대한 평균 ± SD로 표시된다. 구조 분석은 스튜던트 T-테스트를 사용하여 수행되었다(** p<0.01, *** p<0.001).
도 14: Opal B로 처리를 시작하기 전에, OPAL B를 사용한 중증 욕창 관리에 관한 생체 내 사례 연구. 괴사의 중심 영역. 롬바이드 플랩(rhomboid flap)으로 궤양의 크기를 줄이려는 시도에 실패함. 플랩의 말단 부분이 거무스름함. 경고 - 그래픽 이미지들.
도 15: 치료 2일차, OPAL B를 사용한 중증 욕창 관리에 관한 생체 내 사례 연구. 생존 가능한 영역에서 괴사가 될 영역의 묘사. 상처 가장자리가 분홍색이며 피부 플랩으로의 혈류가 좋아짐. 경고 - 그래픽 이미지들.
도 16: 치료 4일차, OPAL B를 사용한 중증 욕창 관리에 관한 생체 내 사례 연구. 생존 가능한 조직과 생존 불가능한 조직 사이의 명확한 경계. 생존 가능한 조직은 깨끗하고 분홍색으로 보임. 피부 플랩은 완전히 생존 가능한 것으로 보임. 경고-그래픽 이미지들.
도 17: 치료 16일 차, OPAL B를 사용한 중증 욕창 관리에 관한 생체 내 사례 연구. 수술로 상처의 괴사조직을 제거하고, 봉합사를 제거하고 플랩을 절제함. 깨끗한 상처 표면의 초기 과립화가 또렷함. 상처 가장자리는 분홍색이며 새로운 피부 성장을 나타냄(이전 이미지들의 피부색과 일치하도록 노출 조정됨). 경고-그래픽 이미지들.
도 18: 치료 19일차, OPAL B를 사용한 중증 욕창 관리에 관한 생체 내 사례 연구. 피부와 상처의 색이 거무스름해지며, 특히 상처 가장자리가 거무스름해짐. 상처가 깨끗한 상태로 유지됨(이전 이미지들의 피부색과 일치하도록 노출 조정됨). 경고 - 그래픽 이미지들.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 기재되어 있다. 본 발명의 목적을 위해, 댜음과 같은 용어들이 하기에 정의된다.
"대략"은 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이가 기준으로 적용되는 수량, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 무게 또는 길이보다 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 변할 수 있음을 의미한다.
"활성 프로테아제"는 단백질 분해 활성인 프로테아제를 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 다르게 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 단계 또는 요소 또는 단계나 요소의 군의 포함을 내포하는 것을 의미하지만 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 단계나 요소의 군의 배제를 의미하지 않는 것으로 이해될 것이다. 그러므로, 용어 "포함하는" 등의 사용은, 나열된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이고 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다.
“~로 구성되는"이란, 어구 "~으로 구성되는"에 따라오는 모든 것을 포함하고 이로 제한됨을 의미한다. 그러므로, 어구 "~로 구성되는"은, 나열된 요소가 필요하거나 의무적이고, 다른 요소가 존재하지 않음을 나타낸다. "~로 본질적으로 구성되는"이란, 어구 다음에 나열된 임의의 요소를 포함하고, 나열된 요소에 대해 본 개시에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한됨을 의미한다. 그러므로, 어구 "~로 본질적으로 구성되는"은, 나열된 요소가 필요하거나 의무적이지만, 다른 요소가 선택적이고 이러한 다른 요소가 나열된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치거나 미치지 않는지의 여부에 따라 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있음을 나타낸다.
"괴사조직 제거(debridement)"라는 용어는 상처에서 죽은 조직과 손상된 조직을 제거하는 것을 의미한다.
"유래 가능한"이라는 용어는 "얻을 수 있는"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"유래되는"이라는 용어는 "얻어지는"이라는 용어와 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
"단리된"이란, 물질의 본래의 상태에서 통상적으로 동반되는 성분의 일부 또는 전부가 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용되는 "단리된 프로테아제"는 그것의 천연 세포 환경으로부터, 및 세포의 일부 또는 모든 성분과의 연관으로부터 펩티드 또는 폴리펩티드 프로테아제 분자의 생체 외 단리 및/또는 부분 정제를 지칭한다.
"얻을 수 있는"이라는 용어는, 본 발명의 단백질 또는 조성물과 관련하여 사용될 때, 특정 명시된 방법에 의해 생성되는 단백질 또는 조성물 뿐만 아니라, 예를 들어 과일 또는 야채로부터 프로테아제를 소싱하거나 재조합 DNA 기술 또는 기타 유전 공학 방법, 예를 들어 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성되는 동일한 단백질 또는 조성물을 포함한다.
"환자", "대상체" 및 "개체"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되고 인간 또는 기타 포유동물의 환자, 대상체 및 개체를 지칭하는 것이며 이것은 본 발명을 사용하여 중증도의 질병, 질환 또는 상태를 치료, 예방, 개선 또는 감소시키려는 모든 것들을 포함한다. 그러나, "환자"가 증상이 있다는 것을 의미하지는 않음을 이해해야 한다. 본 발명의 범위에 속하는 적절한 동물, 예를 들어 포유동물에는 영장류(예를 들면, 인간, 침팬지) 가축 동물(예를 들면, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 실험실 테스트 동물(예를 들면, 토끼, 생쥐, 쥐, 기니피그, 햄스터), 반려동물(예를 들면, 고양이, 개) 및 포획된 야생 동물(예를 들면, 여우, 사슴, 딩고)을 포함한다.
"야생형" 및 "자연 발생"이라는 용어는 자연 발생 공급원으로부터 단리될 때 해당 단백질의 특성을 갖는 단백질을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 야생형 단백질(예를 들어, 폴리펩티드)은 집단에서 가장 빈번하게 관찰되어 "정상" 또는 "야생형" 형태의 단백질로 임의로 지정되는 것이다.
"상처"라는 용어는 피부가 베이거나 벗겨진 살아있는 조직의 손상을 의미하며 피부 궤양 및 화상을 포함한다. 피부 궤양에는 당뇨병성 궤양, 욕창, 정맥(또는 정맥류) 궤양 및 동맥 궤양이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 임의의 선행기술에 대해 언급하는 것은 선행기술이 본 기술 분야에서 숙련된 전문가의 일반적인 상식의 일부분을 형성한다는 것을 인정하거나 어떤 형태로든 암시하는 것이 아니며, 그렇게 받아들여지지 않아야 한다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 자료의 전체 내용은 여기에 참조로서 포함된다.
발명의 상세한 설명
세린 프로테아제들을 포함하는 조성물들
본 발명은 예를 들면 중탄산나트륨 등의 알칼리로 카리카 파파야 식물의 펄프화된 익은 과일을 처리한 이후에, 카리카 파파야 식물의 익은 과일에서 추출되거나 유래될 수 있는 적어도 하나의 활성 세린 프로테아제를 포함하는 조성물들에 관한 것이다.
"활성 세린 프로테아제(active serine protease)들"이라는 용어는 하나 이상의 활성 세린 프로테아제를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
일 실시형태에서, 활성 세린 프로테아제는 SEQ ID NO: 2 내지 5에 나와 있는 하나 이상의 서열들(예를 들면 SEQ ID NO: 2, 3 및 4), 또는 SEQ ID NO: 2, 3, 4 및 5에 나와 있는 서열 4개 모두를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다.
적어도 하나의 활성 세린 프로테아제는 전형적으로 주요 촉매 트라이어드 잔기 Asp, His 및 Ser(SEQ ID NO: 1에서 각각 잔기 151, 221 및 558로 표시됨) 및 잔기 326에서 보존된 기질-결합 부위 Asn을 함유하는 단백질의 촉매 도메인인, SEQ ID NO: 1의 아미노산 142 내지 618와 96, 97, 98 또는 99% 서열 상동성(바람직하게는 서열 동일성)과 같은, 95% 이상의 서열 상동성(바람직하게는 서열 동일성)을 갖는 연속적인 서열을 포함한다.
SEQ ID NO: 1(볼드체로 표시된 SEQ ID NO: 2 내지 19의 펩티드 및 His 221)
Figure pct00001
아미노산 1 내지 25는 추정 신호 서열이고, 아미노산 26 내지 112는 절단되어 성숙한 단백질을 형성하는 추정 프로(pro) 영역이다.
SEQ ID NO 2 내지 SEQ ID NO 5는 각각 SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14 및 SEQ ID NO 15의 펩티드 단편(peptide fragment)들이다.
Figure pct00002
일 실시형태에서, 본 발명의 적어도 하나의 활성 세린 프로테아제는 단백질이 세린 프로테아제 활성을 유지한다는 조건 하에 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상(예를 들어 최대 3개 또는 5개)의 아미노산 변형(결실, 삽입 및/또는 치환)을 갖는, SEQ ID NO:1의 아미노산 118 내지 763로부터의 아미노산 서열을 포함한다.
폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 이러한 조작을 위한 방법들은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 세린 프로테아제들은 활성 형태에 있으며, 즉 불활성 자이모겐(zymogen)들이 아니다.
일 실시형태에서, 여기서의 실험 결과들은, 카리카 파파야로부터 단리된 겉보기 분자량이 50 kDa인 단백질이 활성 세린 프로테아제로서 제공되었음을 시사한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 적어도 하나의 활성 세린 프로테아제는 45 내지 55 kDa, 예를 들어 48 내지 52 kDa, 예를 들어 약 50 kDa의 분자량을 가질 수 있다. 본 발명의 적어도 하나의 프로테아제의 분자량은 약 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55 kDa일 수 있다. 분자량은 SDS PAGE에 의해 평가될 수 있으며, 따라서 프로테아제는 45 내지 55 kDa, 예를 들어 48 내지 52 kDa, 예를 들어 약 50 kDa의 SDS PAGE에 의해 측정되는 평균 분자량을 갖는다. 대안적으로, 분자량은 1차 아미노산 서열에 기초하여 계산될 수 있다.
활성 세린 프로테아제(들)는 일반적으로 실질적으로 단리된(isolated) 형태이다. 이것은 활성 세린 프로테아제들이 카리카 파파야 원재료로부터 적어도 부분적으로 정제되었거나 재조합으로 생성되었음을 의미한다. 일 실시형태에서, 단리된 활성 세린 프로테아제들에는 셀룰로오스, 리그닌 등과 같은 불용성 식물 물질들이 실질적으로 존재하지 않는다. 이것은 일반적으로 용액에 가용성 활성 세린 프로테아제들을 남기는 불용성 물질들을 제거하기 위한 하나 이상의 정제 단계들의 결과일 것이다. 이에 대해서는 아래에서 더 설명할 것이다. "불용성 식물 물질이 실질적으로 존재하지 않는다"는 것은 조성물의 2% w/w 미만, 예를 들어 1% w/w 또는 0.5% w/w 미만이 프로테아제에 대한 원재료로부터 유래되는 불용성 식물 물질들을 포함한다는 것을 의미한다.
세린 프로테아제들 및 시스테인 프로테아제들의 혼합물들을 포함하는 조성물들
티올 프로테아제들 및 시스테인 엔도펩티다아제들(EC 3.4.22)로도 알려진 시스테인 프로테아제들은 단백질을 분해하는 효소들이다. 시스테인 프로테아제들은 촉매 트라이어드 또는 다이어드에서 친핵성 시스테인 티올을 포함하는 공통 촉매 메커니즘을 공유한다. 시스테인 프로테아제들은 다양한 유기체들에서 발생한다. 특히, 시스테인 프로테아제들은 파파야(Carica papaya and Vasconcellea cundianmarcensus), 파인애플(Ananas comosus), 무화과(Ficus carica) 및 키위(Actinidia chinensis) 등의 과일에서 흔히 발견된다. 일 실시형태에서, 시스테인 프로테아제는 과일로부터 유래된다. 따라서, 시스테인 프로테아제들에는 파파인(EC 3.4.22.2), 키모파파인(EC 3.4.22.6), 브로멜라인(줄기 브로멜라인 - EC 3.4.22.32 및 과일 브로멜라인 - EC 3.4.22.33), 피카인(EC 3.4.22.3) 및 악티니다인(EC 3.4.22.14)이 포함된다.
"활성 시스테인 프로테아제들"이라는 용어는 하나 이상의 활성 시스테인 프로테아제를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
카리카 파파야에서 유래되는 하나 이상의 활성 세린 프로테아제들(추출에 의해 또는 재조합으로 생성됨)은 카리카 파파야에서 유래되는 상기 언급된 시스테인 프로테아제들 중 하나 이상의 시스테인 프로테아제들과 같은, 하나 이상의 활성 시스테인 프로테아제들을 포함하는 혼합물에 존재할 수 있다. 아래에서 더 설명되는 본 발명의 프로세스는 결과적으로 하나의 이러한 혼합물을 생성한다.
따라서, 활성 시스테인 프로테아제들의 하나의 소스는 활성 세린 프로테아제들에 관한 것과 동일할 수 있다(즉, 카리카 파파야 식물의 과일). 파파야는 익은 것이 바람직하다. 덜 익은 파파야(현재 파파인의 상업적 소스) 대신에 익은 파파야를 원재료로 사용하는 장점은, 시스테인 프로테아제를 포함하는 생성 조성물이 파파인의 일반적인 상업적 소스들보다 훨씬 낮은 수준의 라텍스(latex)를 갖는다는 점이다. 라텍스는 알레르기 반응을 일으킬 수 있다.
활성 시스테인 프로테아제들은 일반적으로 활성 세린 프로테아제들에 대해 위에서 설명된 바와 같이 실질적으로 단리된 형태이다. 이것은 카리카 파파야와 같은 생물학적 소스 물질로부터 적어도 부분적으로 정제되었거나 재조합으로 생성되었음을 의미한다. 일 실시형태에서, 단리된 시스테인 프로테아제들에는 셀룰로오스, 리그닌 등과 같은 불용성 식물 물질이 실질적으로 존재하지 않는다. 이것은 일반적으로 용액에 가용성 활성 프로테아제를 남기도록 불용성 물질들을 제거하기 위한 하나 이상의 정제 단계들의 결과일 것이다.
세린 프로테아제들 및 시스테인 프로테아제들을 얻기 위한 프로세스들
본 발명의 프로세스는 익은 파파야 과일로부터 본 발명의 적어도 하나의 활성 세린 프로테아제를 단리하는데 사용될 수 있다. 잘 익은 파파야 과일은 일반적으로 과일 외부의 대부분이 노란색이다. 덜 익은 파파야(파파인을 생산하기 위해 라텍스가 수확되는 껍질로부터)는 녹색이다. 잘 익은 파파야는 눌렀을 때 단단하지 않아야 하지만 약간의 눌러진 자국이 유지되어야 한다. 눌렀을 때 매우 무르면 너무 익은 것이다. 일 실시형태에서, 파파야 과육(papaya flesh)이 껍질 및 씨앗들로부터 분리된다. 다른 실시형태에서는, 껍질과 씨앗들을 포함하는 전체 과일이 사용된다. 그 다음 과일(예를 들어 과육)이 기계적으로 분쇄되어 펄프(pulp)를 형성한다(예를 들면, 부드러운 펄프가 얻어질 때까지 믹서기에서).
그 다음 생성된 펄프가 알칼리로 처리된다. 적합한 알칼리들로는 NaOH와 같은 강염기 및 중탄산나트륨과 같은 약염기를 포함한다. 알칼리는 건조 분말로서 또는 수용액으로 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, 알칼리는 중탄산나트륨이며 일반적으로 적어도 3% w/w, 예를 들어 적어도 5% w/w의 양으로 분말로서 첨가된다. 이 양은 일반적으로 15% w/w 미만, 예를 들어 12% w/w 미만이다. 특정 실시형태에서, 첨가되는 양은 5 내지 12% w/w이다.
일 실시형태에서, 알칼리는 11 미만의 pKa를 가질 수 있다. 일부 실시형태들에서, 알칼리는 중탄산염 또는 탄산염 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 알칼리는 수용성 알칼리 금속 중탄산염 또는 수용성 알칼리 금속 탄산염 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 첨가되는 알칼리의 양은 약 1% w/w 내지 약 40% w/w, 약 1% w/w 내지 약 35% w/w, 약 1% w/w 내지 30% w/w, 약 1% w/w 내지 약 25% w/w, 약 1% w/w 내지 약 20% w/w, 약 1% w/w 내지 약 15% w/w , 약 1% w/w 내지 약 10% w/w, 약 2% w/w 내지 약 40% w/w, 약 2% w/w 내지 약 35% w/w, 약 2% w/w 내지 약 30% w/w, 약 2% w/w 내지 약 25% w/w, 약 2% w/w 내지 약 20% w/w, 약 2% w/w 내지 약 15% w/w, 약 2% w/w 내지 약 10% w/w, 약 3% w/w 내지 약 40% w/w, 약 3% w/w 내지 약 35% w/w, 약 3% w/w 내지 약 30% w/w, 약 3% w/w 내지 약 25% w/w, 약 3% w/w 내지 약 20% w/w, 약 3% w/w 내지 약 15% w/w, 약 3% w/w 내지 약 10% w/w, 약 4% w/w 내지 약 40% w/w, 약 4% w/w 내지 약 35% w/w, 약 4% w/w 내지 약 30% w/w, 약 4% w/w 내지 약 25% w/w, 약 4% w/w 내지 약 20% w/w , 약 4% w/w 내지 약 15% w/w, 약 4% w/w 내지 약 10% w/w, 약 5% w/w 내지 약 40% w/w, 약 5% w/w 내지 약 35% w/w, 약 5% w/w 내지 약 30% w/w, 약 5% w/w 내지 약 25% w/w, 약 5% w/w 내지 약 20% w/w, 약 5% w/w 내지 약 15% w/w 또는 약 5% w/w 내지 약 10% w/w일 수 있다. 일 실시형태에서, 첨가되는 알칼리의 양은 약 1% w/w 내지 약 20% w/w일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 첨가되는 알칼리의 양은 약 1% w/w 내지 약 15% w/w일 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에서, 첨가되는 알칼리의 양은 약 4% w/w 내지 약 15% w/w일 수 있다.
일 실시형태에서, 알칼리는 알칼리가 펄프와 반응한 후 조성물의 최종 pH가 7.5 이상, 예를 들어 pH 7.5 내지 pH 11.5가 되도록 하는 양으로 첨가된다. 일부 실시형태들에서, 조성물은 최종 pH의 범위가 약 7.0 내지 약 14.0, 약 7.0 내지 약 13.5, 약 7.0 내지 약 13.0, 약 7.0 내지 약 12.5, 약 7.0 내지 약 12.0, 약 7.0 내지 약 11.5, 약 7.0 내지 약 11.0, 약 7.0 내지 약 10.5, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.0 내지 약 9.5, 약 7.0 내지 약 9.0, 약 7.0 내지 약 8.5, 약 7.0 내지 약 8.0, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 7.1 내지 약 14.0, 약 7.1 내지 약 13.5, 약 7.1 내지 약 13.0, 약 7.1 내지 약 12.5, 약 7.1 내지 약 12.0, 약 7.1 내지 약 11.5, 약 7.1 내지 약 11.0, 약 7.1 내지 약 10.5, 약 7.1 내지 약 10.0, 약 7.1 내지 약 9.5, 약 7.1 내지 약 9.0, 약 7.1 내지 약 8.5, 약 7.1 내지 약 8.0, 약 7.1 내지 약 7.5, 약 7.2 내지 약 14.0, 약 7.2 내지 약 13.5, 약 7.2 내지 약 13.0, 약 7.2 내지 약 12.5, 약 7.2 내지 약 12.0, 약 7.2 내지 약 11.5, 약 7.2 내지 약 11.0, 약 7.2 내지 약 10.5, 약 7.2 내지 약 10.0, 약 7.2 내지 약 9.5, 약 7.2 내지 약 9.0, 약 7.2 내지 약 8.5, 약 7.2 내지 약 8.0, 약 7.2 내지 약 7.5, 약 7.3 내지 약 14.0, 약 7.3 내지 약 13.5, 약 7.3 내지 약 13.0, 약 7.3 내지 약 12.5, 약 7.3 내지 약 12.0, 약 7.3 내지 약 11.5, 약 7.3 내지 약 11.0, 약 7.3 내지 약 10.5, 약 7.3 내지 약 10.0, 약 7.3 내지 약 9.5, 약 7.3 내지 약 9.0, 약 7.3 내지 약 8.5, 약 7.3 내지 약 8.0, 약 7.3 내지 약 7.5, 약 7.4 내지 약 14.0, 약 7.4 내지 약 13.5, 약 7.4 내지 약 13.0, 약 7.4 내지 약 12.5, 약 7.4 내지 약 12.0, 약 7.4 내지 약 11.5, 약 7.4 내지 약 11.0, 약 7.4 내지 약 10.5, 약 7.4 내지 약 10.0, 약 7.4 내지 약 9.5, 약 7.4 내지 약 9.0, 약 7.4 내지 약 8.5, 약 7.4 내지 약 8.0, 약 7.4 내지 약 7.5, 약 7.5 내지 약 14.0, 약 7.5 내지 약 13.5, 약 7.5 내지 약 13.0, 약 7.5 내지 약 12.5, 약 7.5 내지 약 12.0, 약 7.5 내지 약 11.5, 약 7.5 내지 약 11.0, 약 7.5 내지 약 10.5, 약 7.0 내지 약 10.0, 약 7.5 내지 약 9.5, 약 7.5 내지 약 9.0, 약 7.5 내지 약 8.5, 또는 약 7.5 내지 약 8.0을 갖는다. 특히 바람직한 실시형태에서, 조성물은 약 7.5 내지 약 9.5 범위의 최종 pH를 가질 수 있다.
반응은 30℃ 이하의 온도에서 펄프와 함께 수행되며, 바람직하게는 펄프에 어떠한 가열 단계도 가하지 않는다. 따라서 반응은 실온에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 표준 실온 및 압력에서 수행될 수 있다. 반응은 더 낮은 온도들, 예를 들어 약 4℃에서 수행될 수도 있다. 따라서, 일부 실시형태들에서, 반응은 약 4℃ 내지 약 25℃, 또는 약 4℃ 내지 약 22℃, 또는 약 4℃ 내지 약 20℃의 범위에서 수행된다.
알칼리가 펄프와 반응하기에 충분한 시간을 갖고 나면, 처리된 펄프는 불용성 식물 물질들을 제거하기 위한 분리 단계를 거치게 된다(중탄산나트륨의 경우, 처리된 펄프가 더 이상 발포하지 않게 되면 분리 단계가 수행될 수 있다). 예를 들어, 처리된 펄프는 원심분리 및/또는 여과될 수 있다. 원심분리는 예를 들어 약 6000 내지 18000 g에서 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 처리된 펄프가 원심분리되고, 생성된 상청액(supernatant)이 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과된다.
생성된 조성물은 다른 세포 성분들로부터 본 발명의 프로테아제들을 농축 및/또는 추가로 분리하기 위한 하나 이상의 정제 단계들을 거칠 수 있다. 적합한 기술들로는 (i) 예를 들어, 실시예들에서 설명되는 바와 같은 Sephadex G-100을 사용하여 분자량을 기준으로 세부적으로 단백질들을 분리하기 위한 겔 여과(크기 배제) 크로마토그래피; (ii) 이온 교환 크로마토그래피; (iii) 투석; (iv) 암모늄 아세테이트 침전 및/또는 (v) 동결 건조를 포함한다. 예를 들어, 실시예들에서 설명되는 분석들(L-BapNA, 선택적으로 프로테아제 활성이 세린 프로테아제 또는 시스테인 프로테아제 활성에 기인하는 것인지 결정하기 위해 분석 중에 첨가되는 세린 프로테아제 억제제 또는 시스테인 프로테아제 억제제와 함께)을 사용하여 크로마토그래피로부터 생성된 조성물들/분획물들을 테스트함으로써 지속적인 프로테아제 활성의 존재를 확인할 수 있다. 본 발명의 적어도 하나의 세린 프로테아제의 알려진 분자량이 또한 예를 들어 SDS-PAGE에 의해 적어도 하나의 세린 프로테아제의 존재 및 양을 확인하는데 사용될 수 있다.
정제 프로세스들은 또한 pH 및/또는 염 농도를, 제약 또는 화장 제품으로의 조성물의 제형화에 적합한 수준으로 조정하는데 편리하게 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 프로세스는 알칼리를 첨가한 이후에 혼합물을 휘젓는(beating) 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, 프로세스는 혼합물을 여과하여 여과액(filtrate)을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, 프로세스는 혼합물을 여과하여 잔류물을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 추가 실시형태에서, 프로세스는 조성물을 동결 및 해동하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 얻어진 혼합물은 여과 전에 냉동 및 해동될 수 있다.
최종 조성물에는 바람직하게는 불용성 식물 물질이 실질적으로 존재하지 않으며, 예를 들어 약 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% w/w 미만의 불용성 물질을 함유한다. 일 실시형태에서, 전체 단백질의 중량을 기준으로 하는 프로테아제의 백분율은 약 0.01% 내지 5% 범위이다. 최종 조성물은 약 1 내지 100 IU/ml의 세린 프로테아제 활성을 포함할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 최종 조성물은 약 1 내지 약 10 IU/ml, 약 1 내지 약 20 IU/ml, 약 1 내지 약 30 IU/ml, 약 1 내지 약 40 IU/ml, 약 1 내지 약 50 IU/ml, 약 1 내지 약 60 IU/ml, 약 1 내지 약 70 IU/ml, 약 1 내지 약 80 IU/ml, 약 1 내지 약 90 IU/ml, 약 10 내지 약 100 IU/ml, 약 20 내지 약 100 IU/ml, 약 30 내지 약 100 IU/ml, 약 40 내지 약 100 IU/ml, 약 50 내지 약 100 IU/ml, 약 60 내지 약 100 IU/ml, 약 70 내지 약 100 IU/ml, 약 80 내지 약 100 IU/ml, 약 90 내지 약 100 IU/ml, 약 1 내지 약 90 IU/ml, 약 10 내지 약 90 IU/ml, 약 20 내지 약 90 IU/ml, 약 30 내지 약 90 IU/ml, 약 40 내지 약 90 IU/ml, 약 50 내지 약 90 IU/ml, 약 60 내지 약 90 IU/ml, 약 70 내지 약 90 IU/ml, 약 80 내지 약 90 IU/ml, 약 1 내지 약 80 IU/ml, 약 10 내지 약 80 IU/ml, 약 20 내지 약 80 IU/ml, 약 30 내지 약 80 IU/ml, 약 40 내지 약 80 IU/ml, 약 50 내지 약 80 IU/ml, 약 60 내지 약 80 IU/ml, 약 70 내지 약 80 IU/ml, 약 1 내지 약 70 IU/ml, 약 10 내지 약 70 IU/ml, 약 20 내지 약 70 IU/ml, 약 30 내지 약 70 IU/ml, 약 40 내지 약 70 IU/ml, 약 50 내지 약 70 IU/ml, 약 60 내지 약 70 IU/ml, 약 1 내지 약 60 IU/ml, 약 10 내지 약 60 IU/ml, 약 20 내지 약 60 IU/ml, 약 30 내지 약 60 IU/ml, 약 40 내지 약 60 IU/ml, 약 50 내지 약 60 IU/ml, 약 1 내지 약 50 IU/ml, 약 10 내지 약 50 IU/ml, 약 20 내지 약 50 IU/ml, 약 30 내지 약 50 IU/ml, 약 40 내지 약 50 IU/ml, 약 1 내지 약 40 IU/ml, 약 10 내지 약 40 IU/ml, 약 20 내지 약 40 IU/ml, 약 30 내지 약 40 IU/ml, 약 1 내지 약 30 IU/ml, 약 10 내지 약 30 IU/ml, 약 20 내지 약 30 IU/ml, 약 1 내지 약 20 IU/ml, 또는 약 10 약 20 IU/ml의 세린 프로테아제 활성을 포함할 수 있다.
제약 조성물들의 제형화
본 발명의 적어도 하나의 세린 프로테아제, 및 선택적으로 시스테인 프로테아제들, 예를 들어 카리카 파파야로부터 유래되거나 유래될 수 있는 프로테아제들을 포함하는 조성물들은 약제학적으로 허용되는 담체들 또는 희석제들과 조합되어 제약 조성물을 형성할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 본 발명의 제약 조성물이 일반적으로 물을 함유하지만, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체들 또는 희석제들"은 물을 제외한다.
화장 조성물들에 대하여 하기 섹션에서 설명되는 담체들 및 희석제들은 또한 일반적으로 제약 조성물들에도 사용될 수 있다. 이러한 조성물들은 예를 들어 크림; 로션; 세럼; 연고; 또는 겔의 형태일 수 있다. 조성물들은 또한 상처 드레싱, 예를 들어 거즈 패드 등과 같은 고체 형태들에 적용/함침될 수 있다.
화장 조성물의 제형화
본 발명의 적어도 하나의 세린 프로테아제를 포함하고, 선택적으로는 카리카 파파야로부터 유래되거나 유래될 수 있는 프로테아제들과 같은 시스테인 프로테아제들을 또한 포함하는 조성물들은 화장용으로 허용되는 담체들 또는 희석제들과 조합되어 화장 조성물을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 화장 조성물이 일반적으로 물을 포함하지만, 용어 "화장용으로 허용되는 담체들 또는 희석제들"은 물을 제외한다.
본 발명에 따른 화장 조성물들은 이러한 제형화들에 대해 통상적으로 알려진 모든 활성 물질들 및 적절한 성분들을 적절하게 포함할 수 있다. 이러한 성분들로는 예를 들어 겔화제, 음이온성 중합체, 증점제, 계면활성제, 수화제, 연화제, 킬레이트제, 항산화제, 보존제, 완충 화합물, 향수, 충전제, 착색제, 휘발성 또는 비휘발성, 변형 또는 비변형 실리콘들 및 환원제들을 포함한다. 서로 다른 성분들의 상대적인 비율들은 적절하게는 통상적인 화장료 제형화들에 사용되는 것들이다. 당업자는 선택적으로 제공되는 물질들을 자연스럽게 선택하고, 원하는 효소 활성과 관련된 유리한 특성들이 유의미하게 변형되거나 제거되지 않는 방식으로 이들을 본 발명에 따른 조성물에 혼합할 것으로 예상된다. 특정 성분들이 둘 이상의 기준을 충족할 수도 있음이 추가로 예상되며, 예를 들어, 글리세린은 용매 및 습윤제 양쪽 모두로서 작용한다는 것이 알려져 있다.
전술한 바와 같이, 다양한 성분들이 본 발명의 조성물들에 존재할 수 있으며; 이들 성분 중 가장 중요한 것은 용매인 물일 가능성이 높다. 물의 양은 조성물의 중량을 기준으로 약 1% 내지 약 95%, 예를 들어, 약 25% 내지 약 90%의 범위일 수 있다. 다른 적합한 용매로는 글리세린 및 벤질 알코올을 포함한다.
본 발명의 화장 조성물들은, 예를 들어 조성물이 로션, 크림, 겔 또는 세럼의 형태인 경우, 하나 이상의 유화제들을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 적합한 유화제들은 예를 들어, 하나 이상의 알콕실화 지방 알코올들, C14-22 알코올들, 알킬폴리글리코시드, C14-22 알킬글루코시드, 비누화제들, 알킬 설페이트들, 모노알킬 및 디알킬 포스페이트들, 알킬 설포네이트들, 아실 이소티오네이트들, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 소르비탄들, 스테아르산, 글리세릴 스테아레이트 또는 이들의 임의의 조합들을 포함한다.
본 발명의 특정 수중유(oil-in-water) 에멀젼-기반 조성물들은 또한 에멀젼을 안정화시키기 위한 하나 이상의 안정화제들을 포함할 수 있다. 적합한 안정화제들로는 예를 들어 알코올들, 알콕실화 알코올들, 지방 알코올들, 글리세릴 에스테르들, 예를 들어 글리세릴 스테아레이트, 검(gum)들, 비누들, 합성 중합체들, 왁스들, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함한다. 특히 적합한 에멀젼 안정화제들로는 스테아릴 알코올 또는 글리세릴 스테아레이트를 포함한다.
본 발명의 조성물들은 피부를 부드럽게 하고 진정시키기 위한 하나 이상의 연화제(emollient)들을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 연화제들로는 예를 들어 하나 이상의 지방 및 오일(수소화 또는 비수소화), 예를 들어 식물성 오일, 피마자유, 코코넛 오일 및 코코아 버터, 시어 버터, 그리고 에스테르들, 예를 들어 트리카프릴 시트레이트 및 이소노닐 이소나노에이트, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함한다.
본 발명의 조성물들은 하나 이상의 습윤제를 포함할 수 있다. 습윤제는 수분을 흡수하거나 유지하는 성분이다. 본 조성물에 사용될 수 있는 적합한 습윤제들로는 예를 들어 요소, 피로글루탐산, 아미노산(예를 들면, 글루탐산), 폴리올들 또는 흡습성을 갖는 다른 화합물들, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함한다. 일반적으로, 습윤제는 소르비톨과 같은 폴리올이다. 세럼 형태의 본 발명의 조성물에서, 존재하는 프라이머리 습윤제는 메틸-글루세스-20 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
본 발명의 조성물들에 사용하기에 적합한 보존제들로는 예를 들어 하나 이상의 알칸올들, 예를 들어 페녹시 에탄올, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 염들, EDTA 지방산 접합체들, 이소티아졸리논, 메틸파라벤 및 프로필파라벤과 같은 파라벤들, 프로필렌 글리콜들, 소르베이트들, 디아졸리디닐 우레아 및 이미다졸리디닐 우레아와 같은 우레아 유도체들, 4차 암모늄 염들, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함한다.
본 발명의 조성물들에 포함시키기에 적합한 킬레이트제들로는 예를 들어 EDTA 유도체들, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함할 수 있다.
조성물은 조성물의 pH를 조정 및 유지하는 역할을 하는 하나 이상의 완충 화합물들을 포함할 수 있다. 적합한 완충제들로는 예를 들어 하나 이상의 아디프산들, 글리신들, 시트르산들, 칼슘 하이드록사이드들, 마그네슘 알루미노메타-실리케이트들, 트리에탄올아민, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함한다.
존재하는 경우, 완충제는 정상적인 저장 수명 및 사용 기간 동안 조성물의 안정적인 pH를 보장하기에 적합한 수준으로 존재해야 한다.
화장 조성물들은 또한 하나 이상의 계면활성제들을 포함할 수 있다. 계면활성제들은 비누들 또는 세안제들과 같은 피부 세정제의 목적을 위한 본 발명의 조성물들에서 특히 중요하다. 적합한 계면활성제들은 예를 들어 음이온성, 비이온성, 양이온성, 양쪽성, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함한다. 바람직하게는 하나 이상의 계면활성제들은 비이온성 계면활성제들이다. 적합한 비이온성 계면활성제들로는, 예를 들어 하나 이상의 알콕실화 알코올들, 에톡실화 알코올들, 프로폭실화 알코올들, 상호 분산된 에톡실화-프로폭실화 알코올들, 공중합체들, 지방산들, 알킬 페놀들, 폴리글리코시드들, 폴리글루코시드들, n-알킬피롤리돈들, 블록 공중합체들, 또는 이들의 임의의 조합들을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 화장 조성물은 크림; 로션; 세럼; 세안; 샴푸; 포옴; 피부 세정; 피부 토닉; 연고; 또는 겔의 형태이다. 그러나, 당업자는 본 발명의 활성 효소들을 표피에 투여하기에 적합한 임의의 조성물이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 조성물들은 용량당 약 0.1 IU/ml 내지 약 100 IU/ml의 총 세린 프로테아제 활성이 피부에 적용될 수 있도록 하기에 충분한 단백질 분해 활성을 함유해야 하며, 여기서 용량은 제품의 약 2 ml 내지 약 10 ml의 양이다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 조성물들은 용량당 약 1 내지 약 10 IU/ml, 약 1 내지 약 20 IU/ml, 약 1 내지 약 30 IU/ml, 약 1 내지 약 40 IU/ml, 약 1 내지 약 50 IU/ml, 약 1 내지 약 60 IU/ml, 약 1 내지 약 70 IU/ml, 약 1 내지 약 80 IU/ml, 약 1 내지 약 90 IU/ml, 약 10 약 100 IU/ml, 약 20 내지 약 100 IU/ml, 약 30 내지 약 100 IU/ml, 약 40 내지 약 100 IU/ml, 약 50 내지 약 100 IU/ml, 약 60 내지 약 100 IU/ml, 약 70 내지 약 100 IU/ml, 약 80 내지 약 100 IU/ml, 약 90 내지 약 100 IU/ml, 약 1 내지 약 90 IU/ml, 약 10 내지 약 90 IU/ml, 약 20 내지 약 90 IU/ml, 약 30 내지 약 90 IU/ml, 약 40 내지 약 90 IU/ml, 약 50 내지 약 90 IU/ml, 약 60 내지 약 90 IU/ml, 약 70 내지 약 90 IU/ml, 약 80 내지 약 90 IU/ml, 약 1 내지 약 80 IU/ml, 약 10 내지 약 80 IU/ml, 약 20 내지 약 80 IU/ml, 약 30 내지 약 80 IU/ml, 약 40 내지 약 80 IU/ml, 약 50 내지 약 80 IU/ml, 약 60 내지 약 80 IU/ml, 약 70 내지 약 80 IU/ml, 약 1 내지 약 70 IU/ml, 약 10 내지 약 70 IU/ml, 약 20 내지 약 70 IU/ml, 약 30 내지 약 70 IU/ml, 약 40 내지 약 70 IU/ml, 약 50 내지 약 70 IU/ml, 약 60 내지 약 70 IU/ml, 약 1 내지 약 60 IU/ml, 약 10 내지 약 60 IU/ml, 약 20 내지 약 60 IU/ml, 약 30 내지 약 60 IU/ml, 약 40 내지 약 60 IU/ml, 약 50 내지 약 60 IU/ml, 약 1 내지 약 50 IU/ml, 약 10 내지 약 50 IU/ml, 약 20 내지 약 50 IU/ml, 약 30 내지 약 50 IU/ml, 약 40 내지 약 50 IU/ml, 약 1 내지 약 40 IU/ml, 약 10 내지 약 40 IU/ml, 약 20 내지 약 40 IU/ml, 약 30 내지 약 40 IU/ml, 약 1 내지 약 30 IU/ml, 약 10 내지 약 30 IU/ml, 약 20 내지 약 30 IU/ml, 약 1 내지 약 20 IU/ml, 또는 약 10 내지 약 20 IU/ml의 총 세린 프로테아제 활성이 피부에 적용될 수 있도록 하기에 충분한 단백질 분해 활성을 함유해야 하며, 여기서 용량은 제품의 약 2 ml 내지 약 3 ml, 약 2 ml 내지 약 4 ml, 약 2 ml 내지 약 5 ml, 약 2 ml 내지 약 6 ml, 약 2 ml 내지 약 7 ml, 약 2 ml 내지 약 8 ml, 약 2 ml 내지 약 9 ml, 약 3 ml 내지 약 4 ml, 약 3 ml 내지 약 5 ml, 약 3 ml 내지 약 6 ml, 약 3 ml 내지 약 7 ml, 약 3 ml 내지 약 8 ml, 약 3 ml 내지 약 9 ml, 약 3 ml 내지 약 10 ml, 약 4 ml 내지 약 5 ml, 약 4 ml 내지 약 6 ml, 약 4 ml 내지 약 7 ml, 약 4 ml 내지 약 8 ml, 약 4 ml 내지 약 9 ml, 약 4 ml 내지 약 10 ml, 약 5 ml 내지 약 6 ml, 약 5 ml 내지 약 7 ml, 약 5 ml 내지 약 8 ml, 약 5 ml 내지 약 9 ml, 약 5 ml 내지 약 10 ml, 약 6 ml 내지 약 7 ml, 약 6 ml 내지 약 8 ml, 약 6 ml 내지 약 9 ml, 약 6 ml 내지 약 10 ml, 약 7 ml 내지 약 8 ml, 약 7 ml 내지 약 9 ml, 약 7 ml 내지 약 10 ml, 약 8 ml 내지 약 9 ml, 약 8 ml 내지 약 10 ml, 또는 약 9 ml 내지 약 10 ml의 양이다.
세린 프로테아제 활성은 세린 프로테아제 성분을 결정하기 위해 분석 동안 세린 프로테아제 억제제를 사용하여 실시예들에서 설명되는 L-BApNA 분석에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로는, GB 2,440,117에서 설명된 벤조일-L-아르기닌 에틸 에스테르(benzoyl-L-arginine ethyl ester; BAEE) 분석이 사용될 수도 있다. 일 실시형태에서, 세린 프로테아제 활성은 적용 용량당 약 5 유닛 내지 약 60 유닛의 범위이다.
본 발명의 조성물들은 또한 유사한 수준의 시스테인 프로테아제 활성을 포함할 수도 있다. 시스테인 프로테아제 활성은 시스테인 프로테아제 성분을 결정하기 위해 분석 동안 시스테인 프로테아제 억제제를 사용하여 실시예들에서 설명되는 L-BApNA 분석에 의해 측정될 수 있다.
피부 표면 마이크로 토포그래피 측정을 사용하여 판정된 바와 같이(GB 2,440,117), 아스퍼질러스 멜레우스(Aspergillus melleus)로부터의 세린 프로테아제와 화장료 세럼 형태의 시스테인 프로테아제의 조합은, 40명의 여성으로 구성된 자원 봉사 그룹에 있어서 14일 내지 28일 동안 피부 부드러움을 개선하고 주름을 감소시킨다는 것을 이전에 보여주었다. 본 발명의 조성물들은 또한 개체의 표피의 부드러움 및 재생을 촉진하기 위한 화장 방법과 같은 다양한 화장 응용들에 사용될 수도 있다.
조성물들의 용도들
일반적으로, 본 발명의 화장 조성물들은 얼굴, 손 및 목의 피부에 적용되지만, 다른 피부 표면들에 화장 치료가 적용될 수도 있다. 유일한 사용 금지 사항은 염증이 있는 피부 또는 눈에 가까운 피부와 같은 특히 민감한 피부 부위를 피해야 한다는 점이다. 본 발명의 조성물들은 일반적으로 기존 방식과 같이 사용자에 의해 수동으로 피부 표면에 직접 적용된다.
따라서, 본 발명의 방법들은 본 발명의 화장 조성물을 개체의 표피에 적용하는 것을 포함한다.
본 발명의 제약 조성물들은 피부 상태들 및 상처들을 포함하는 질병들, 질환들 및 상태들의 치료와 관련된 다양한 약제학적 응용들에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물들은 또한 다양한 화장 응용들에서 사용될 수도 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 조성물의 국소 적용을 포함하는 상처의 괴사조직 제거 방법들, 상처 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 조성물들, 화상으로 고통받는 개체를 치료하는 방법들 - 이 방법은 본 발명의 제제를 개체의 환부에 국소적으로 또는 다른 투여 경로에 의해 투여하는 것을 포함함 -, 상처 치료 방법에 사용하거나 또는 그 방법에서 사용될 시의 본 발명의 조성물들, 상처에 국소적으로 또는 다른 투여 경로에 의해 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함하는 상처 치유를 향상시키는 방법들, 피부에 본 발명의 화장 조성물을 적용하는 것을 포함하는 피부 각질 제거 또는 미백 방법들, 피부 각질 제거 또는 미백을 위한 본 발명의 화장 조성물의 용도들, 피부에 본 발명의 화장 조성물을 적용하는 것을 포함하는 건조, 노화 또는 손상된 피부의 치료 방법들, 및 건조, 노화 또는 손상된 피부를 치료하기 위한 본 발명의 화장 조성물의 용도들을 제공한다.
본 발명의 프로테아제 조성물들은 특히 당뇨병성 궤양, 욕창, 정맥성 궤양 및 동맥성 궤양과 같은 만성 상처를 포함한 상처를 포함하는 다양한 피부 상태들, 및 습진, 건선, 여드름, 장미증, 어린선, 백반증, 두드러기, 지루성 피부염을 포함하고 이에 제한되지 않는 다른 피부 상태들을 예방, 치료, 경감 또는 개선하는데 사용될 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 제약 조성물들은 상처를 절제하는데 사용될 수 있다. 이러한 상처들은 일반적으로 괴사 조직을 포함할 것이며 당뇨병성 궤양, 욕창, 정맥 궤양, 동맥 궤양 등을 포함할 것이다. 따라서, 이러한 상처는 만성 상처일 수 있다. 사용 시에는, 조성물들(또는 조성물이 함침되는 드레싱 등)이 환부에 적용된다. 이것은 일반적으로 적어도 하루에 한 번, 예를 들어 하루에 두 번 수행될 것이다. 조성물의 양 및 적용 빈도는 의사에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물들은 치료학적으로 또는 미용적으로 투여될 수 있다. 이러한 응용들에서, 조성물들은 상태 및 임의의 합병증을 치료하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로, 이미 어떤 상태로부터 고통을 받고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물의 양은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분해야 한다.
조성물들은 또한 리포솜들의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜들은 인지질 또는 다른 지질 물질로부터 유래할 수 있으며, 수성 매질에 분산된 단일층 또는 다중층 수화된 액정에 의해 형성될 수 있다. 리포솜들을 형성할 수 있는 무독성, 생리학적으로 허용 가능한 대사성 지질이 사용될 수 있다. 리포솜 형태의 조성물들은 안정화제, 보존제 및 부형제를 함유할 수 있다. 바람직한 지질들은 인지질 및 포스파티딜 콜린(레시틴), 천연 및 합성 모두를 포함한다. 리포솜들을 생산하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 이와 관련하여 다음의 문헌을 구체적으로 참조하도록 하며: Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 33 et seq., 이 문헌의 내용은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 조성물은 대상체의 피부 상태를 예방, 치료, 경감 또는 개선하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 대상체의 피부 상태를 예방, 치료, 경감 또는 개선하기 위한 화장료의 제조에 사용될 수도 있다.
투여량
특정 환자에 대한 "치료적으로 효과적인" 투여량 수준은 치료 중인 상태 및 상태의 중증도, 사용되는 조성물의 활성, 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이요법, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 및 치료와 함께 또는 동시에 사용되는 임의의 약물과 함께 당업계에 널리 공지된 기타 관련 인자를 포함하는 다양한 인자들에 의존하게 된다. 따라서 당업자는 일상적인 실험을 통해, 적용 가능한 상태들을 치료하는데 필요한 조성물의 유효하고, 무독성인 양을 결정할 수 있을 것이다.
또한, 조성물의 개별 투여에 대한 최적의 양 및 간격은 치료되는 상태의 특성 및 정도, 투여 형태, 경로 및 부위, 및 치료받는 특정 개체의 특성에 의해 결정될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 이러한 최적 상태들은 종래 기술들에 의해 결정될 수 있다.
또한 정의된 일수 동안 하루에 제공되는 조성물의 투여 횟수와 같은, 최적의 치료 과정이 통상의 치료 결정 시험 과정을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다.
투여 경로
본 발명의 조성물들은 표준 경로로 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물들은 국소 경로로 투여될 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 조성물들은 개체의 환부에 국소적으로 투여된다.
다른 실시형태들에서, 조성물들은 직장(rectal), 혀밑(sublingual) 또는 입술밑(sublabial)과 같은 다른 입구/진입 경로에 의해, 또는 경막외(epidural), 뇌내(intracerebral) 또는 뇌실내(intracerebroventricular) 경로와 같은 중추신경계를 통해 투여될 수 있다. 투여를 위한 다른 위치는 표피, 경피, 피내, 비강, 동맥내, 심장내, 골내, 척추강내, 복강내, 방광내, 유리체내, 해면체내, 질내 또는 자궁내 경로를 통한 경로를 포함할 수 있다.
치료의 타이밍
통상적으로, 치료적 응용들에서, 치료는 질병 상태의 기간 동안일 것이다.
당업자는 본 명세서에 개시된 조성물들이 단일 제제로서 또는 본 명세서에 개시된 방법들에 대한 병용 요법 접근 방식의 일부로서 진단 시에 또는 그 이후에, 예를 들어, 그러한 치료에 대해 현재 이용 가능한 요법들에 대한 보완으로서 후속 치료 또는 강화 요법으로서 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 개시된 조성물들은 또한 유전적으로 또는 환경적으로 이러한 질병이 발병하는 경향이 있는 대상체에 대한 예방 요법으로서 사용될 수도 있다.
조성물들은 상태의 개선이 보일 때까지와 같이 필요한 만큼 규칙적으로 투여될 수 있다. 따라서 이 조성물들은 매시간, 하루에 여러 번, 매일, 일주일에 여러 번, 매주, 매월 또는 적절한 빈도로 투여될 수 있다.
키트
본 발명의 키트들은 본 발명의 방법 및 용도의 사용을 용이하게 한다. 통상적으로, 본 발명의 방법 또는 용도를 수행하기 위한 키트들은 방법을 수행하기 위해 필요한 모든 시약 및 수단을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 키트는 본 발명의 조성물 및 선택적으로 현장 진료 방법을 위한 장치와 같은 조성물을 투여하기 위한 수단을 포함할 수 있다.
통상적으로, 본 명세서에서 설명되는 키트들은 또한 하나 이상의 용기를 포함할 것이다. 본 발명의 맥락에서, 구획화된 키트는 조성물이 별도의 용기에 함유된 임의의 키트를 포함하며, 또한 작은 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱 또는 종이 스트립을 포함할 수도 있다. 이러한 용기들은 조성물들의 교차 오염을 피하면서 한 구획에서 다른 구획으로 조성물들을 효율적으로 전달할 수 있고, 정량적 방식으로 한 구획에서 다른 구획으로 각 용기의 제제 또는 용액을 첨가할 수 있다.
통상적으로, 본 발명의 키트는 또한 적절한 방법 및 용도를 수행하기 위해 키트를 사용하기 위한 지침을 포함할 것이다.
본 발명의 방법, 용도, 조성물 및 키트는 예를 들어 인간이 아닌 영장류, 말, 소, 양, 염소, 레포린, 조류, 고양이 및 개 종을 비롯한 인간을 포함하는 임의의 동물에 동등하게 적용 가능하다. 따라서, 상이한 종들에 적용하기 위해, 본 발명의 단일 키트가 적용될 수 있거나, 대안적으로는 예를 들어 각각의 개별 종에 대해 특정한 조성물을 함유하는 상이한 키트가 필요할 수도 있다.
당업자는 본 명세서에 개시된 상이한 특징들이 결합되어 본 발명의 범위 내에 있는 특징들의 조합을 형성할 수 있음을 이해하고 인식할 것이다.
이제 예시적이고 비제한적인 하기 실시예들을 참조하여 본 발명에 대하여 추가로 설명할 것이다. 실시예들은 다음 도면들을 참조한다.
실시예들
OPAL A 및 OPAL B의 준비
OPAL A 여과액의 제조 프로세스가 멸균 조건에서 수행되었다. 카리카 파파야의 익은 과일 단부들을 잘라내고 껍질을 벗겼다. 과일의 과육을 4등분한 다음 씨앗을 제거하였다. 부드러운 펄프가 얻어질 때까지 파파야 조각을 블렌더에서 혼합하였다. 펄프를 80℃로 설정된 수조 안에 있는 비이커에 넣고 펄프의 온도가 55℃(유리 온도계로 측정)가 될 때까지 계속 저어주었다. 10중량% 건조 중탄산나트륨을 비이커에 첨가하였다. 그런 다음 비이커를 수조에 넣고, 55℃로 설정한 다음 5분 동안 천천히 저어주었다. 중탄산나트륨을 포함하는 펄프를 12000 x g에서 30분 동안 원심분리한 이후에, 상청액(supernatant)을 수집하고 0.22 μm 필터(FDR-050-071N - Fisher Scientific)를 사용하여 여과하여 멸균 유니버셜 튜브들로 옮겼다. OPAL B 여과액들은, 가열 단계가 생략되었다는 점에서 제조 프로세스에 있어서의 한 단계 변경으로 준비되었다.
Sephadex G-100 Superfine을 사용한 겔 여과 크로마토그래피
겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 분자량을 기준으로 하여 세부적으로 단백질들을 분리했다. Sephadex G-100(G10050 - Sigma)(4kDa -150kDa 사이의 분리)을 구비한 14 mL 길이 크로마토그래피 컬럼(C3919-1EA-sigma Aldrich)을 패킹하여 pH 8에서 0.15M NaCl이 포함된 100 mM Tris-HCl로 밤새 세정하였다. 분자량 기준으로 단백질들을 분리하기 위해 1 mL의 필요 샘플들을 개별적으로 컬럼에 통과시켰다. 필요한 수의 0.5 mL 분획물을 수집하여 A280을 측정했다. 그런 다음 각 분획물 50μL를 96 웰 플레이트들에 플레이팅하고 50 μL의 1.5 mM L-BApNA 완충액(10mM Tris-HCl pH 8.5 완충액으로 제조)을 첨가했다. 그런 다음 A410에서의 L-BApNA 활성을 Synergy HT 마이크로플레이트 판독기(cat. 12926527, Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, UK)를 사용하여 즉시 및 2시간 후에 측정하였다. 값들의 차이를 플로팅하고 더 높은 L-BApNA 활성을 갖는 분획물을 SDS PAGE 겔들을 통해 실행한 다음, 쿠마시(Coomassie) 또는 은 염색을 사용하여 염색했다.
L-BApNA(N-벤조일-L-아르기닌 4-니트로아닐리드 염산염) 분석
63 mg의 L-BApNA를 1.5 ml 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시킨 다음, 물로 최대 100 ml로 만들어 L-BApNA(B-3133 sigma)의 1.5 mM 스톡 용액을 준비하였다. 아르기닌과 p-니트로아닐린 모이어티들 사이의 결합에서 L-BApNA의 가수분해는 발색단 p-니트로아닐린을 방출하며, 이것은 IU(International Units)에 있어서의 410 nm 흡광도에서 분광기에 의해 검출될 수 있다. IU는 과잉 기질 조건(0차 동역학)에서 흡광도를 0.01 유닛/분 증시키는 효소의 양으로 정의된다. 고체 고유 활성은 IU/mg로 표시되며, 액체 제제의 경우 활성은 IU/mL로 표시된다.
실험 전반에 걸쳐 0차 동역학을 유지하기 위한 최적의 기질 농도를 결정하기 위해, 일련의 적정 실행들이 다양한 기질 농도로 수행되었다. 이에 따라 발견된 최소 농도는 0.2 mM 또는 스톡 1.5 mM 용액의 1:6 희석액이다. 표 1은 모든 동역학 실험들에 사용되는 시약 용량을 보여준다. pH 6의 인산염 완충액이 다른 완충액에 비해 가장 높은 효소 활성 수치를 나타내기 때문에 L-BApNA 분석에 사용되었다.
[표 1] L-BApNA 분석 최종 시약 농도
Figure pct00003
기질 순도를 확인하기 위해, 알칼리에 의해 촉매되는 제어된 총 가수분해가 다음 조건들 하에서 수행되었다.
[표 2] L-BApNA 기질 순도 분석 조성물
Figure pct00004
따라서 [기질] = A410 X 30(희석률)
8800(410 nm에서 p-니트로아닐린의 몰 흡광 계수)
결과는 제조업체가 명시한 대로 99% 순도의 기질임을 확인했다.
억제제
E-64(IUPAC명: (1S,2S)-2-(((S)-1-((4-구아니디노부틸)아미노)-4-메틸-1-옥소펜탄-2-일) 카르바모일) 시클로프로판 카르복실산)은 시스테인 프로테아제들의 강력하고 비가역적인 특정 억제제이다. E-64의 트랜스-에폭시숙시닐 그룹(활성 모이어티)은 시스테인 프로테아제들의 활성 티올 그룹에 비가역적으로 결합하여, 이들을 억제한다. E-64는 비-프로테아제 효소들과 반응하지 않으며 세린 프로테아제들을 억제하지 않는다.
2,2'-디피리딜디설파이드(2DPS)는 파파인, 브로멜라인 및 피신을 포함하는, 시스테인 프로테아제들에 대한 티올 특이적 가역 억제제로서 사용된다.
프로테아제 억제제 칵테일(Protease inhibitor cocktail, PIC)들이 표 3에 나타낸 바와 같이 제형화되었다:
[표 3] 프로테아제 억제제 칵테일들에서의 프로테아제 억제제 성분
Figure pct00005
오버레이 자이모그래피(overlay zymography)
오버레이-자이모그래피는 일부 변형을 포함하는(도 1) Vinokurov et al.의 절차(2005)에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 니트로셀룰로스 멤브레인을 물에 용해된 1.2 mg/mL L-BApNA 용액에 침지하였다. 이어서 멤브레인을 5분 동안 공기 건조 상태로 두고 샘플들을 실행한 후 네이티브 PAGE 겔 상단에 놓았으며, 샘플들은 각각의 실행 완충액에 약간 침지되어 있었다. 멤브레인들을 10 mM DTT 또는 25mM 시스테인과 함께, 35M β-알라닌, 0.14 M 아세트산, pH 4.3에 침지하는 2개의 추가 실험이 수행되었다. 그런 다음 모든 자이모그래피를 30-60분 동안 37℃의 밀폐된 챔버에서 인큐베이션했다. 멤브레인을 제거하고 다시 5분 동안 건조되도록 방치하고 나서 p-니트로아닐린을 디아조화(diazotization)에 의해 가시화하였다.
디아조화는 Hosseininaveh et al.(2009)에 자세히 설명된 프로토콜에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 멤브레인을 5분 동안 아질산나트륨 용액(1M HCl 중 1mg/mL)에, 그 다음 황산암모늄 용액(1M HCl 중 5mg/mL)에, 마지막으로 NNED 용액(N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 디히드로클로라이드)(48% v/v 에탄올/물 중 0.5 mg/mL)에, 디아조화된 p-니트로아닐린이 보라색 얼룩/밴드로 명확하게 보일 때까지 약 30초에서 1분 동안 순차적으로 침지하였다.
질량 분광 분석
콜로이드-쿠마시 염색으로 확인된 단백질 밴드들을 캠브리지 대학교 생화학과 PNAC 시설에서 MALDI-Mass 핑거프린팅으로 분석하였다. 겔 밴드들을 절제하고 다음과 같이 200μL 100mM 중탄산암모늄/50% 아세토니트릴에서, 20℃로, 단계당 30분 처리하였다: 1) 5mM Tris(2-카르복시에틸) 포스핀을 사용하여 환원하는 단계; 2) 아이오도아세트아미드(25mM 최종 농도)의 첨가에 의해 알킬화하는 단계; 및 3) 액체를 제거한 후 세정하는 단계.
세정 후에, 겔 조각들을 진공에서 10분 동안 건조시킨 다음 5μg/mL 변형 트립신(Promega)을 포함하는 100mM 중탄산 암모늄 25μl를 첨가했다. 32℃에서 17시간 동안 분해를 수행하였다. 펩티드를 회수하고 μC18 ZipTip(Millipore)을 사용하여 탈염하고 나서 50% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산에서 1-2 μL 알파-시아노-4-하이드록시신남산 매트릭스(Sigma)를 사용하여 maldi 타겟 플레이트로 용리했다. 리플렉트론 모드에서 Bruker ultrafleXtreme Maldi 질량 분석기를 사용하고 LIFT 모드에서 수행된 ms/ms 단편화를 사용하여 펩티드 질량들을 결정하였다. FlexAnalysis, BioTools 및 ProteinScape 소프트웨어(Bruker)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. Mascot(Matrix Science)를 사용하여 조합된 질량 핑거프린트 데이터의 데이터베이스 검색들을 수행하였다. 필요한 경우, Protein Prospector를 통해 추가 조작을 수행했다.
디브리딩 분석(debriding assay)
AWE 디브리딩 분석은 Health Point에서 개발한 상처 괴사 조직 단백질 분해 활성의 생체 외 서로게이트이다(Shi, Ermis et al. 2009). 이것은 생체 내 동물 데이터와 잘 비교되는 것으로 나타났다. AWE 기질은 세 가지 상처 관련 세포외 매트릭스 단백질(콜라겐, 엘라스틴 및 피브린)의 펠릿으로 구성되며, 각각 서로 다른 형광단(fluorophore)으로 태그가 지정된다. 이 매트릭스의 점진적인 분해는 프란츠 확산 셀 셋업에서 형광 강도의 점진적인 증가에 의해 측정될 수 있다(도 2). 실험들에 대한 최종 판독값들이 24시간에 취해진다.
디브리딩 분석을 위한 재료는 다음과 같다: 콜라겐 - 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)(CF308), 엘라스틴 - 미국 엘라스틴 제품 회사의 로다민(R144), Merck Chemicals Limited의 트롬빈 및 피브리노겐(605157, 341573). 100mM NaCl 및 10mM CaCl2가 포함된 50mM Tris를 함유하는 트리스 완충액, 자기 교반기 막대(Z328936), L-시스테인(W326305), 엘라스틴-보바인(E1625), 7 아미노-4-메틸 쿠마린(A9891) 및 파파야 라텍스로부터의 파파인(P3375)은 모두 Sigma의 제품이다.
피브린-쿠마린의 준비: 피브리노겐은 쿠마린 용액(트리스 완충액 중 0.02mg/mL)의 피브리노겐을 10mg/mL(트리스 완충액 중)의 최종 피브리노겐 농도와 혼합하여 7-아미노-4-메틸 쿠마린으로 라벨링되었다. 이 혼합물을 1시간 동안 회전 셰이킹하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 피브리노겐-쿠마린 용액에 트롬빈 용액(2.5 units/mL)을 첨가하여 2시간 동안 응고시킴으로써 쿠마린-라벨링된 피브린을 얻었다.
형성된 응고물을 물로 3회 세정하고 증류수와 메탄올(1:1)에 밤새 방치하여 과잉 염료를 제거하였다. 그런 다음 응고물을 투명한 비-점착성 필터 페이퍼가 있는 유리 용기로 옮기고 3일 동안 건조되도록 두었다. 건조된 피브린-쿠마린을 모타르와 페슬을 사용하여 미세한 분말로 분쇄하였다.
AWE(Artificial Wound Eschar) 기질의 준비
콜라겐-FITC, 엘라스틴-로다민 및 피브린-쿠마린을 표 4에 나와 있는 조성에 따라 혼합하였다. 피브리노겐을 제외한 모든 물질을 50mL 코니컬 원심분리기 튜브에 넣었다. 조직 절단기를 사용하여 이 물질들을 3-5분 동안 10mL 트리스 완충액에서 균질화했다. 10mL, 15mg/mL 피브리노겐 용액을 별도의 튜브에서 트리스 완충액 pH 6.8로 준비했다. 두 용액을 합하고 나서 조직 절단기를 사용하여 약 2분 동안 완전히 혼합하였다. 트롬빈 용액(50U/mL)을 첨가하여 빠르게 혼합한 다음, 이 용액을 90mm 비반응성 멤브레인을 포함하는 페트리 접시에 붓고 1시간 동안 응고되도록 하였다. 그 다음 응고된 기질을 물로 3회(각 5분) 헹구어 트롬빈을 제거하였다. 세정 후, 티슈 페이퍼를 사용하여 여분의 물을 제거하고 추가 사용 시까지 4℃에서 보관하였다.
프란츠 확산 셀 시스템(Franz Diffusion Cell System)
AWE 기질이 여전히 멤브레인에 부착된 상태에서, 생검 펀치를 사용하여 직경 9mm 조각을 펀칭했다. 9mm AWE 기질을 비-반응성 니트로셀룰로오스 멤브레인의 상단에 놓고 두 챔버 사이의 프란츠 확산 셀에 배치했다(이 중 하부(수용체 셀)는 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 트리스 완충액으로 채워짐(도 2)). 샘플 홀더를 상단에 놓고 전체 어셈블리를 나사 클램프로 수용체 셀에 고정하고 35℃ 수조로 둘러싸았다. 그런 다음 샘플을 샘플 홀더의 상부 챔버에 넣고 공기 구멍이 만들어진 파라필름으로 덮었다. 용액을 실험 내내 500 rpm에서 자기 교반기를 사용하여 혼합하였다. 시간 0에서 최대 24시간까지 일정한 간격으로, 100μL의 용액이 수용체 셀에서 샘플링되었다. 수집된 샘플들은 형광 플레이트 리더(Synergy HT KC4 v3.4)를 사용한 즉각적인 형광 측정을 위해 96 웰 마이크로 플레이트에 넣어졌다. 측정 후, 100 μL의 샘플을 수용체 셀에서 교체했다.
기질 내 모든 3개 단백질 성분의 총 누적 분해를 결정하기 위해 다음 방정식이 적용되었다:
CDn = In x Vcell
여기서 n=시간, CDn 및 In은 시간 n에서의 누적 분해 파라미터 및 형광 강도이고, Vcell은 셀의 부피(5.1mL)이다.
[표 4] AWE(artificial wound Eschar) 기질의 조성
Figure pct00006
실시예 1 - OPAL B 여과액 - OPAL A 여과액의 변형 및 단백질 분해 활성
카리카 파파야는 파파야 과에 속하며 식용 과일과 라텍스를 위해 열대 및 아열대 지역에서 재배되는 주요 과일 중 하나이다. 본 실시예들에서 사용되는 과일은 주로 브라질과 자메이카에서 구입한 잘 익은 파파야 과일로 영국 현지 슈퍼마켓에서 구입했다. 잘 특성화되고 집중적으로 연구된 대부분의 시스테인 프로테아제는 파파인 계열의 구성원들이다. 파파인, 카이모파파인 A 및 B, 카이모파파인 M 및 카리케인은 모두 카리카 파파야의 라텍스에서 추출되었지만 익은 과일에서 특성화된 적이 없었다.
우리는 이전에 질량 분광 분석 연구(Richard J. Lipscombe - Proteomics International lab, University of Western Australia)를 수행한 바 있으며, 카리카 파파야 익은 과일 추출물의 OPAL A 여과액에 시스테인(티올 의존성) 프로테아제가 포함되어 있음을 보여주었다. 이러한 시스테인 프로테아제들은 전통적으로 파파야 라텍스 또는 파파야 껍질에서만 추출된다(Proteomics International, personal communication). OPAL A 여과액에서 시스테인 프로테아제를 기능적으로 확인하기 위해, 분광 광도 분석을 수행하였다. 이러한 실험들은 OPAL A 여과액에 의한 발색 기질 L-BApNA(Nα-벤조일-L-아르기닌 4-니트로아닐리드 염산염)의 촉매 가수분해를 모니터링하는 것과 관련되었다.
아르기닌과 p-니트로아닐린 모이어티들 사이의 결합에서, 프로테아제의 존재 하에 L-BApNA의 가수분해는 발색단 p-니트로아닐린을 방출하며, 이것은 410 nm의 파장에서 분광기에 의해 검출될 수 있다. L-BApNA 활성 판정 절차는 위의 방법들에서 설명되어 있다. 사용된 최적화된 조건 하에서, 과잉 기질은 0차 동역학을 생성하며, 이것은 직선으로서 명백하고 그 기울기는 효소 활성에 비례한다.
우리는 이전에 OPAL A가 시스테인 프로테아제를 특이적으로 억제하는 억제제 E-64의 첨가에 의해 본질적으로 폐지되는 시스테인 프로테아제 활성을 갖는다는 것을 규명하였다(미공개 데이터). 따라서 우리는 이전에 OPAL A의 프로테아제 활성이 본질적으로 활성 시스테인 프로테아제의 존재에만 기인한다고 결론지었다. 열처리 단계 생략의 효과를 판정하기 위해, OPAL A 및 OPAL B 여과액들 모두에서의 프로테아제 활성을 L-BApNA 분석을 사용하여 테스트했다. 10분 후에, E-64 억제제를 첨가하였다.
OPAL B는 OPAL A와 비교하여 거의 8배 증가된 촉매 활성(시간 경과에 따른 A410 기질 방출의 선형 증가)을 나타내는 것으로 나타났다(도 3). 흥미롭게도, OPAL B 여과액에 E-64를 과량으로 첨가해도 OPAL A에서와 같이 활성이 완전히 억제되지는 않았다. 따라서, 이론에 얽매이지 않고, 기질에 따른 A410 값의 증가는 비-티올-의존성(비-시스테인 프로테아제) 촉매 작용으로 인한 것일 수 있다. 시스테인 프로테아제 억제제 E-64를 사용한 처리가 프로테아제 활성을 완전히 제거하지 않았다는 사실은 도 4에 나타난 바와 같이 시스테인 및 비-시스테인 프로테아제가 OPAL B 여과액에 존재했음을 시사한다.
실시예 2 - 효소 동역학을 통한 OPAL B 여과액 중 시스테인 및 세린 프로테아제의 확인
OPAL B 여과액에서의 비-티올 의존성 또는 비-시스테인 프로테아제를 더 잘 이해하기 위해, 모든 필수 프로테아제 억제제를 포함하는, 프로테아제 억제제 칵테일(PIC)(sigma P2714)을 사용하여 효소 분석을 초기에 수행하였다(표 3 참조). 도 5에 나와 있는 바와 같이, OPAL B 여과액에 PIC 20μL를 추가하면 프로테아제 활성이 완전히 억제되었다.
이러한 데이터를 기반으로, 다음으로 우리는 OPAL B의 향상된 활성을 담당할 수 있는 PIC의 각 성분을 개별적으로 테스트하여 각 활성 억제제의 효과를 조사했다. 칵테일에 존재하는 프로테아제 억제제의 성분들은 표 3에 나와 있다.
PIC에 존재하는 각각의 억제제를 OPAL B 여과액으로 테스트한 후, 단 2개의 억제제만이 단백질 분해 활성을 멈출 수 있었다. 이들은 각각 시스테인 프로테아제 및 세린 프로테아제 억제제들인, 도 6에 도시된 바와 같이, E-64 및 AEBSF였다.
두 억제제의 조합은 도 7과 같이 효소 활성을 완전히 제거한다. 이것은 OPAL B 여과액의 효소 활성이 시스테인 및 세린 프로테아제들만으로 구성되어 있음을 시사한다.
실시예 3 - 효소 동역학에 의해 결정된 프로테아제들을 기능적으로 확인하기 위한 자이모그래피 분석
OPAL B 여과액은 많은 단백질로 이루어진 복잡한 혼합물인 것으로 보인다. 따라서, 분광 광도 분석에 의해 검출된 프로테아제 활성들을 개별적으로 시각화하기 위해, 우리는 오버레이 자이모그래피라는 기술을 사용했다. 이 기술에서는, 단백질들이 효소 활성을 보존하는 표준 네이티브 PAGE 겔 상에서 먼저 분리된다. 기질 용액(1.2 mg/mL의 L-BApNA)을 함유하는 멤브레인을 겔 위에 놓고 색상 향상제를 사용하여 현상한다. 이를 통해 활성 프로테아제를 멤브레인 상에 직접 시각화할 수 있다.
도 8에 도시된 바와 같이, 콜로이드 블루로 염색된 네이티브 PAGE 겔은 단방향 페이즈(양극 측)에서의 OPAL B 여과액의 밴드를 나타낸다. 겔로부터 니트로셀룰로스 멤브레인으로의 단백질 이동 및 후속적인 자이모그래피 분석은 효소 활성(두 가지 효소 활성을 나타냄)의 급격한 증가를 보여주었다.
우리는 관찰된 두 신호 또는 밴드가 각각 시스테인 및 세린 프로테아제들임을 확인하기 위해 도 8에서 얻은 2-자이모그래피 밴드를 추가로 특성화했다. 이 방법은 네이티브 PAGE 겔 상단에 멤브레인을 놓기 전에 특정 억제제들(시스테인 프로테아제의 경우 E-64, 세린 프로테아제의 경우 AEBSF)을 니트로셀룰로오스 멤브레인에 포함시키는 것에 의해 수정되었다. 얻어진 데이터는 밴드들이 실제로 OPAL B 농축 여과액에서의 시스테인 프로테아제(들) 및 세린 프로테아제(들)임을 분명히 보여주었다. 도 9에 도시된 바와 같이, 시스테인 프로테아제(들)는 위쪽 밴드에 해당하고 세린 프로테아제(들)는 아래쪽 밴드에 해당한다.
실시예 4 - 세린 프로테아제를 확인하기 위한 크기 배제 크로마토그래피
세린 프로테아제(들)를 정제하기 위해, OPAL B를 농축하고 4 kDa 내지 150 kDa 범위의 단백질들을 분리하는 sephadex G-100 컬럼을 사용하는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다. E-64 및 100mM L-아르기닌(2시간 동안 인큐베이션)으로 사전 처리되는 투석된 OPAL B가 14mL sephadex G-100 컬럼을 통해 실행되었다. 24개의 용리 분획물들이 수집되고 96 웰 플레이트 L-BApNA 분석이 수행되었다(데이터는 표시되지 않음). 가장 높은 L-BApNA 활성을 포함하는 분획물들이 SDS PAGE 겔에 대해 선택되었으며, 그런 다음 도 10에 도시된 바와 같이 은색으로 염색되었다. L-BApNA 활성과 상관 관계가 있는 분획물들의 밴드들이 선택되고, LC/MS-MS 분석에 의해서 분석되었다(즉, 80 kDa, 50 kDa 및 30 kDa 밴드들에서 6번째 분획물에 존재하는 강도 밴드들). 이들은 서브틸라제로 추정적으로 확인되는 SEQ ID NO: 1에 나와 있는 카리카 파파야 서열과 일치되었다.
이 결과는 다음과 같이 SEQ ID NO: 1 내에서 4개의 단편들을 확인하는 완전한 OPAL B 여과액의 분석과 일치한다.
Figure pct00007
실시예 5 - 활성 형태의 세린 프로테아제를 확인하기 위한 반응성 프로브
상이한 밴드들 중 어느 것이 OPAL B 여과액에서 단백질 분해 활성 형태의 서브틸라아제에 대응하는지를 규명하기 위해, 우리는 비오틴에 연결된 플루오로술폰산 그룹을 통해 활성 세린 프로테아제를 구체적으로 표시하는 반응성 프로브를 사용했다. 이 반응성 프로브는 알칼리 포스파타제와 같은 스트렙타비딘 결합 효소들을 사용하여 웨스턴 블로팅 기술을 통해 일반 SDS PAGE 겔 상에서 시각화될 수 있다. 이 기술을 사용하면 도 11에 도시된 바와 같이 약 50 kDa에서 AEBSF 처리에 의해 억제된 활성 세린 프로테아제 밴드를 시각화할 수 있다. 이 밴드는 질량 분광 분석을 통해 파파야 서브틸라제로 확인된 크로마토그래피 실험에서 관찰된 밴드들 중 하나에 대응하지만, 이것의 분자량은 전장 단백질 또는 전효소의 공개된 값(각각 70 및 85 kDa)과 일치하지 않는다. 이론에 얽매이지 않고, 동일한 단백질에서 유래하는 여러 밴드들을 관찰했다는 사실은 50 kDa 형태만이 단백질 분해 활성인 상이한 동형들이 있을 수 있음을 시사한다.
종합적 결론
우리는 이전에 WO 2004/008887에서 익은 파파야(Carica papaya)의 과육에서 OPAL A로 알려진 조성물을 생성하기 위한 프로세스를 설명했다. 이 프로세스는 가열 단계에 이어 중탄산나트륨으로 처리한 다음 여과 단계를 포함한다. OPAL A에 대한 우리의 이전 분석은 시스테인 프로테아제 활성을 확인하였다. OPAL A는 다양한 질환들을 치료하는데 활성을 보였다. OPAL B를 생성하기 위해 가열 단계를 생략하는 것에 의해 OPAL A 프로세스를 수정하였다. 우리는 놀랍게도 그리고 예기치 않게도 OPAL B가 시스테인 프로테아제와 관련이 없는 추가적인 프로테아제 활성을 포함한다는 것을 발견했다. 우리는 이것을 OPAL A에 존재하지 않는 적어도 하나의 세린 프로테아제의 존재로 인한 것으로 특징지었다. 이 단백질은 하나 이상의 형태로 존재하는 것으로 보이지만, SDS-PAGE에 의해 판정된 평균 분자량이 50 kDa인 단백질만이 세린 프로테아제 활성을 보였다. LC-MS/MS 분석은 서브틸라제인 것으로 추정적으로 확인된 C. 파파야 서열과 동일한 서열을 갖는 단백질을 보여주었지만(Othman and Nuraziyan, 2010), 생화학적 특성 분석에서는 확인되지 않았다. 또한, 이 서브틸라아제는 재조합으로 발현될 때, 현재 확인된 활성 세린 프로테아제의 50 kDa 분자량과 비교하여 약 70 kDa의 분자량을 갖는다.
따라서, 우리는 OPAL B가 하나 이상의 단백질 분해 활성 세린 프로테아제들 및 하나 이상의 단백질 분해 활성 시스테인 프로테아제들 모두의 혼합물을 포함하는 것을 보여주었다. 한편, 지금까지 카리카 파파야에서 인식되었던 유일한 알려진 활성 프로테아제들은 시스테인 프로테아제이다.
실시예 6 - 생체 외에서 OPAL A 및 OPAL B 여과액의 디브리딩 효능 정량화
괴사조직 제거는 상처에서 괴사(죽은) 조직과 이물질을 제거하여 생존 가능한 조직을 노출시키는 것이다. 이 프로세스는 상처 치유를 촉진하고 가속화한다. 우리는 OPAL A 여과액에서 확인되는 시스테인 프로테아제가 AWE(Artificial Wound Eschar) 디브리딩 분석을 사용하여 측정되는 괴사조직 제거에서 활성인지 여부를 조사했다.
AWE 디브리딩 분석은 Health Point에서 개발한 상처 괴사 조직 단백질 분해 활성의 생체 외 서로게이트이다(Shi, Ermis et al. 2009). 이 분석은 생체 내 동물 데이터와 잘 비교되는 것으로 나타났으며 따라서 OPAL A 여과액 제형들의 디브리딩 효능을 평가하는데 사용되었다. AWE 기질은 세 가지 상처 관련 세포 외 매트릭스 단백질들, 콜라겐, 엘라스틴 및 피브린의 펠릿으로 구성되며, 각각은 상이한 형광단으로 태그가 지정된다. 이 매트릭스의 점진적인 분해는 프란츠 확산 셀 설정에서 형광 강도의 점진적인 증가로 측정될 수 있다. 실험들에 대한 최종 판독값들은 24시간에 취해진다.
제 1 실험 세트에서는, 네이티브 OPAL A 여과액(0.7 mg/mL 단백질 등가물)의 단백질 분해 효능을 프란츠 셀 확산 시스템을 사용하여 파파야 라텍스의 대조군 조 파파인(10 mg/mL, Sigma)과 비교했다. 도 12에 도시된 결과는 콜라겐 및 피브린의 OPAL A 여과액 샘플 분해가 라텍스 파파인(10 mg/mL)보다 일관되게 우수하지만 엘라스틴에 비해 약하다는 것을 분명히 나타낸다.
실시예 7 - 디브리딩 효능을 개선하기 위한 투석을 이용한 OPAL A 여과액 활성 농축
새로 준비된 OPAL A 여과액의 L-BApNA 활성은 평균 0.60 IU/mL이다. 새로운 OPAL A 여과액의 단백질 함량은 약 0.7 mg/mL로 측정되며, 이것은 약 1 IU/mg의 특정 고체 활성에 대응한다. 약 10 IU/mg의 순수한 라텍스 파파인 활성과 비교할 때, 이것은 OPAL 고형물들의 약 9% 파파인 함량에 가깝다. 놀랍게도, 실시예 6에서 수행된 AWE 디브리딩 분석은, 도 12에 도시된 바와 같이, 공칭 파파인 함량(라텍스 파파인의 경우 0.6 IU/mL 대 30 IU/mL)에서 예상되는 것보다 훨씬 더 높은 OPAL A 활성을 나타낸다.
OPAL A의 고체 잔류물 함량은 추출물을 동결 건조를 통해 측정되었으며 0.216 ± 0.005 g/mL의 배치(batch)들에 걸쳐 일관된 값을 산출했다. 따라서 대다수의 OPAL A 여과액 고형물들은 본질적으로 잠재적으로 비-단백질 분해성임이 분명하다. 따라서 추출물로부터 고형물들을 제거함으로써 추출물의 고유 활성을 증가시키는 것이 가능할 수 있다. 이를 조사하기 위해, 우리는 12 kDa 및 25 kDa의 컷-오프 크기를 가진 멤브레인들을 사용하여 새로운 OPAL A 여과액을 투석하였다. 투석은 4℃에서 24시간 동안 수행한 이후, L-BApNA 분석을 통해 용액의 잔류 단백질 분해 활성이 측정되었다. 용액의 분취량도 동결 건조하여 고형분 함량을 측정하였다. 처리는 계산에서 고려되었던, 작은(20%) 삼투 부피 증가를 일으켰다.
표 5의 결과는 12 및 25 kDa의 컷-오프 크기를 사용한 투석에서 약 86%의 고형분 감소와 결합된 두 투석에 대한 활성의 거의 완전한 보유를 보여준다.
[표 5] 12 kDa 및 25 kDa 컷-오프 분자 크기로 투석된 OPAL A 여과액 및 네이티브 OPAL A 여과액의 고유 활성 및 고체 함량
Figure pct00008
이 결과는 일반적으로 허용되는 카리카 파파야 단백질 분해 효소의 크기들(23 내지 30 kDa) 및 OPAL A 여과액에 투석 시 제거되는 저분자량 당들이 다량 포함되어 있다는 사실과 일치한다. 고형분 함량이 12 kDa에서 25 kDa 투석으로 크게 변하지 않는다는 사실은 이 두 값들 사이의 중간 크기를 갖는 분자 구성이 없음을 나타낸다. 따라서 우리는 추가 실험들을 위해 12 kDa 컷-오프 투석 멤브레인들을 사용했다.
네이티브 Opal A에 대한 OPAL A 여과액의 디브리딩 강도가 실시예 6에 따라 측정되었다. 도 13의 데이터는 투석된 OPAL A가 네이티브 OPAL A보다 피브린 및 엘라스틴을 분해하는데 더 우수하지만 콜라겐에 대해서는 열등함을 보여준다.
요약하면, 투석된 OPAL A 여과액은 네이티브 OPAL A 여과액과 비교하여 단백질 분해 활성의 완전한 보유를 보여주었지만, 대조군보다 86% 미만의 고형분 감소를 보여준다. 이것은 OPAL A 여과액에 있는 대부분의 고형물들이 본질적으로 비-단백질 분해성이며, 투석을 통해 제거할 수 있는 저분자량 당들로 존재한다는 것을 입증한다. 투석된 OPAL A 여과액은 라텍스 파파인 및 네이티브 OPAL A에 비해 피브린 및 엘라스틴 모두에 대한 디브리딩 활성이 향상되었지만 네이티브 OPAL A에 비해 콜라겐에 대한 영향은 미미했다.
실시예 8 - OPAL B를 사용한 중증 욕창 관리에 관한 생체 내 사례 연구
이 사례 연구는 OPAL B의 국소 적용을 통해 노인 환자의 조직 괴사와 관련된 중증 궤양의 신속한 치료를 개시한다. 따라서 OPAL B는 적어도 조직 재생 및 항괴사/디브리딩 인자를 포함하는 다인자 작용 방식을 통해 중증 궤양의 치유에 치료적 이점을 제공하는 것으로 보인다.
치매를 앓고 있는 70대 요양원 환자가 심한 욕창을 앓았다. 궤양들이 환자의 허리 대부분을 가로질러 옆으로 확장되었고 상당한 조직 괴사를 보여주었다. 병원으로 이송된 후 궤양성 상처에서 생성된 과도한 분비물을 제거하기 위해 진공 드레싱을 적용했다. 롬바이드 플랩으로 궤양의 크기를 줄이기 위한 추가의 외과적 개입도 시도되었다. 병원 직원의 지속적인 치료 노력에도 불구하고 상처의 심각성은 지속되었다(도 14).
환자의 주치의의 동의 하에, 매일 상처 표면에 희석되지 않은 신선한 OPAL B를 직접 바르고, 상처 바로 주변의 피부에 30% 희석된 OPAL B 수성 크림을 매일 바르는 방식으로 진공 드레싱 치료 및 기타 외과적 개입이 연기되었다.
Opal B 치료 2 내지 4일차에, 상처가 더 깨끗해지고 염증이 덜한 것처럼 보였다(도 15 및 도 16). 일부 괴사 조직이 여전히 관찰되었지만 상처의 더 작은 영역에 국한된 것으로 나타났다. 16 내지 19일차에, 상처 크기의 감소를 포함하는 추가 개선이 관찰되었다(도 17 및 도 18). 안정화되었을 때에, 상처를 외과적으로 디브리딩하였다. 악화/괴사가 극도로 빠르게 정지되었고 지금까지 극도로 심각하여 치료할 수 없었던 궤양 치료가 진행된 것은 놀랍고 주목할 만한 것이다.
이론에 얽매이지 않고, OPAL B는 다수의 작용 모드를 가질 수 있는 것으로 여겨진다: OPAL B는 생존할 수 없는 조직을 국소화하고, 변연 허혈을 역전시키며, 이에 따라 괴사 조직의 양을 감소시킨다. OPAL B가 궤양의 슬러프를 디브리딩하기 시작했다는 증거가 또한 존재한다.
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위의 개별 섹션에서 언급된 본 발명의 다양한 특징들 및 실시형태들은 필요한 경우 수정하여 다른 섹션들에 적용된다. 결과적으로, 일 섹션에 규정된 특징들은 적절하게 다른 섹션에 규정된 특징들과 결합될 수 있다.
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 명세서에 개시되고 청구된 모든 조성물들 및/또는 방법들은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물들 및 방법들이 바람직한 실시형태들과 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 조성물들 및/또는 방법들에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 9 - OPAL B의 프로테옴 매핑
UniProt Viridplantae 데이터베이스를 검색하는 Protein PilotTM 을 사용한 OPAL B의 프로테옴 매핑(Proteome Mapping)에서, 검출된 펩티드 단편들은 아래에 볼드체로 표시된 부분이다:
SEQ ID NO: 1(볼드체로 표시된 SEQ ID NO: 2 내지 5의 펩티드, Asn 336 및 촉매 트라이어드)
Figure pct00009
아미노산 1-25는 추정 신호 서열이고 아미노산 26-112는 절단되어 성숙한 단백질을 형성하는 추정 프로 영역이다.
Figure pct00010
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Claims (20)

  1. 카리카 파파야(Carica papaya) 식물의 익은 과일로부터 추출된 하나 이상의 활성 세린 프로테아제(serine protease)들을 포함하는, 조성물.
  2. 연속적인 아미노산 서열을 가지며 SEQ ID NO:1의 아미노산 118 내지 763에 대해 적어도 95% 상동성(homology)을 갖는 활성 세린 프로테아제를 포함하는, 조성물.
  3. 연속적인 아미노산 서열을 가지며 SEQ ID NO:1의 아미노산 142 내지 618에 대해 적어도 95% 상동성을 갖는 활성 세린 프로테아제를 포함하는, 조성물.
  4. 카리카 파파야 식물의 익은 과일로부터 추출된 하나 이상의 활성 세린 프로테아제들 및 하나 이상의 활성 시스테인 프로테아제(cysteine protease)들의 혼합물을 포함하는, 조성물.
  5. 활성 세린 프로테아제를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 프로세스로서,
    펄프를 가열하는 단계 없이, 카리카 파파야 식물의 펄프화된(pulped) 익은 과일을 알칼리로 처리하는 단계를 포함하는, 프로세스.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 알칼리는 약알칼리인, 프로세스.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 약알칼리는 11 미만의 pKa를 갖는, 프로세스.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 약알칼리는 중탄산나트륨인, 프로세스.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 활성 시스테인 프로테아제를 추가로 포함하는, 프로세스.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알칼리 처리 후에 불용성 식물 재료로부터 가용성 프로테아제가 분리되는, 프로세스.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물을 추가로 처리하여 상기 프로테아제 또는 프로테아제들의 농도를 증가시키는, 프로세스.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항의 프로세스에 의해 얻을 수 있는 활성 세린 프로테아제를 포함하는, 조성물.
  13. 활성 카리카 파파야 세린 프로테아제를, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는, 제약 조성물.
  14. 제1항 내지 제4항 및 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물을, 약제학적으로(pharmaceutically) 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는, 제약 조성물.
  15. 활성 카리카 파파야 세린 프로테아제를, 화장용으로(cosmetically) 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는, 화장 조성물.
  16. 제1항 내지 제4항 및 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물을, 화장용으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 포함하는, 화장 조성물.
  17. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    상처 괴사조직 제거에 사용하기 위한, 조성물.
  18. 피부 박리에서의 제15항 또는 제16항의 조성물의 용도.
  19. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 피부 상태를 예방, 치료, 경감 또는 개선하는 방법.
  20. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물, 및 사용 설명서를 포함하는, 피부 상태를 예방, 치료, 경감 또는 개선할 시에 사용하거나 또는 이를 위해 사용되는 경우에 사용하기 위한, 키트.
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