EP1471935A2 - Protease-screening und neue verwendung von proteasen - Google Patents

Protease-screening und neue verwendung von proteasen

Info

Publication number
EP1471935A2
EP1471935A2 EP03708017A EP03708017A EP1471935A2 EP 1471935 A2 EP1471935 A2 EP 1471935A2 EP 03708017 A EP03708017 A EP 03708017A EP 03708017 A EP03708017 A EP 03708017A EP 1471935 A2 EP1471935 A2 EP 1471935A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protease
proteases
plasminogen
acute
thrombosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP03708017A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Rudy Susilo
Hans Christian Korting
Hans Günther GASSEN
Martin Hils
Ralf Pasternack
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
N Zyme Biotec GmbH
Original Assignee
N Zyme Biotec GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by N Zyme Biotec GmbH filed Critical N Zyme Biotec GmbH
Priority to EP03708017A priority Critical patent/EP1471935A2/de
Publication of EP1471935A2 publication Critical patent/EP1471935A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)

Definitions

  • US Pat. No. 4,752,603 discloses a method for isolating a new plasminogen activator from the culture medium of human melanoma cells.
  • the isolated activator shows a thrombolytic effect and can be used for therapeutic treatment.
  • the isolation of this new activator is very complex and costly.
  • Another disadvantage is that the culture medium of human melanoma cells is enriched with calf serum, which in times of infectious diseases such as. B. BSE is undesirable.
  • active ingredients which can be used in the treatment and / or supportive therapy of wounds and which in particular promote the healing of wounds which are otherwise poorly or not at all healing. Furthermore, it would be desirable to provide such active ingredients that are relatively inexpensive and that no expensive processes are necessary for their production. It would be particularly desirable if active ingredients were available which are both fibrinolytic and collagenolytic and / or plasminogen-activating, preferably having all three of the properties mentioned above. Active ingredients that have all three of the properties mentioned would be particularly advantageously used in wound healing.
  • the present invention relates in particular to the use of protease from Streptomyces griseus, protease VIII, protease XVIII, ficin, proteinase K, protease XXIII, thrombin, metalloendopeptidase, endoproteinase, Asp-N, clostripain, protease XIX, chymopapain, papain, protease X, and / or trypsin in wound healing to achieve a fibrinolytic, collagenolytic and / or plasminogen-activating effect.
  • the protease from Streptomyces griseus is a protease mixture with the following pronase components: a) streptogrisin A (3.4.21.80, Streptomyces protease A, SGPA, pronase enzyme A), b) Streptogrisin B (3.4.21.80, Streptomyces protease B, SGPB, pronase enzyme B), c) Mycolysin (3.4.24.31, pronase component, Streptomyces griseus neutral proteinase).
  • the natural substrates of the protease from Streptomyces griseus are oligopeptides, which are hydrolyzed by reaction with water.
  • the substrate spectrum also includes casein and gelatin, which are also hydrolyzed by the protease from Streptomyces griseus.
  • this enzyme should not have amidase or esterase activity.
  • Protease VIII's natural substrates are proteins that are hydrolyzed by this enzyme.
  • the range of substrates extends to casein, hemoglobin, ovalbumin, gelatin, insulin and other proteins and peptides.
  • the proteases from S. griseus, the protease VIII, the proteinase K, the protease XXIII, Protease XIX and / or the trypsin have collagenolysis activity.
  • the protease from S. griseus, the protease XIII, the thrombin, the metalloendopeptidase, the endoproteinase Asp-N, the clostripain and / or the trypsin have a plasminogen-activating activity.
  • the protease from S. griseus and protease VIII can be used, which have both a collagenolytic, a fibrinolytic, and a plasminogen-activating activity.
  • proteases could have the activities mentioned.
  • trypsin surprisingly has both a plasminogen-activating and a collagenolytic activity.
  • proteinase K and protease XXIII have both fibrinolytic and collagenolytic activity.
  • protease from S. griseus and protease VIII which have both collageneolytic and fibrinolytic and plasminogen activating activity.
  • the activities mentioned above are connected in any way in such a way that it would have been expected that proteases which have one or the other of these activities could also have further activities.
  • the specific activities of the proteases according to the present invention for the plasminogen activation are preferably each greater than 1 U / milligram. Furthermore, the specific activities of the proteases according to the present invention for collagenolysis or fibrinolysis are greater than 0.1 U / milligram.
  • the proteases according to the invention can be used to degrade fibrin clots, activate matrix metalloproteases, break down an extracellular matrix, process glu-plasminogen to lys-plasminogen, activate and release growth factors and / or endogenous plasminogen to plasmin activate. All of the above activities, individually or in combination, are helpful or necessary in wound healing and thus also contribute to healing otherwise badly or slowly healing wounds.
  • the proteases according to the present invention can therefore be used to produce a pharmaceutical composition for the treatment and / or supportive therapy in wound healing.
  • the pharmaceutical composition preferably further comprises suitable carriers and / or excipients. Such suitable carriers and / or auxiliary substances are known in the field of wound healing.
  • proteases listed above have anti-thrombotic and anti-coagulant properties. These advantageous properties also enable the use of the proteases, in particular the protease from Streptomyces (S.) griseus, the protease VIII, the proteinase K and trypsin, as anti-thrombotic and anti-coagulant active ingredients for the prophylaxis and / or treatment of heart attack, thrombosis , Venous thrombosis, restenosis, hypoxia, ischemia, coagulation necrosis, inflammation of the blood vessels, acute pulmonary embolism, acute and subacute arterial thrombosis, fresh or older clots in the case of venous thrombosis, deep venous thrombosis of the pelvis and extremities, early thrombosis in the area of the occlusive central vessels, amniotic occlusion, Burns and frostbite, disseminated intravascular coagulation in shock, acute arterial occlusion
  • the proteases are preferably used together with an anticoagulant.
  • proteases should be inexpensive to manufacture and easily available on the market; this criterion is met by commercially available proteases. - Only proteases that are active under physiological conditions should be included in the screening. That is, acidic proteases, such as pepsin, have not been used.
  • the selected proteases were tested for three activities that are particularly relevant for wound healing and whose combination can be expected to have a particularly good effect on wound healing, especially of slowly healing wounds:
  • Activation and release of growth factors e.g. B. the "basic fibroblast growth factor” bFGF, the “transforming growth factor” TGFß-1 or the “vascular endothelial growth factor” VEGF.
  • test methods based on microtiter plates should be developed, which should enable the selected proteases to be checked in a short time with little effort.
  • test methods should be developed that can be carried out both easily and on a large scale and also lead to clear results with high reproducibility.
  • screening methods have therefore been developed for screening for fibrinolysis or collagenolysis which do not have the above problems and which furthermore meet the various criteria mentioned above.
  • the present invention is also directed to a screening method for the identification of enzymes suitable for wound healing, the enzymes being examined for their ability to activate plasminogen, for fibrinolysis and / or for collagenolysis.
  • the screening method according to the present invention comprises at least the following steps:
  • the plasminogen activation is preferably measured photometrically by detecting a released dye by increasing the absorbance at 405 nm.
  • the dye released is the para-nitroaniline (pNA) cleaved from the peptide substrate by plasminogen formed from plasminogen.
  • the plasminogen-enzyme mixture is preferably in a 1: 1 (v / v) ratio. This mixture is further preferably incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the incubation of plasminogen, enzyme and peptide substrate is preferably carried out for 5 to 30 minutes, further preferably at about 37 ° C.
  • the investigation of the koUagenolysis activity comprises at least the following steps:
  • the photometric detection in the examination for a KoUagenolysemod is preferably carried out after incubation with the ninhydrin reagent for 10 to 25 minutes, preferably for 20 minutes, at about 60 ° C and cooling to room temperature by measuring the extinction difference at 550 nm.
  • the collagen and the enzyme to be examined are incubated for 30 to 90 minutes, preferably at about 37 ° C., before the reaction is preferably stopped by adding 10% trichloroacetic acid.
  • the insoluble components can be separated by centrifugation.
  • Another preferred embodiment of the screening method of the present invention comprises screening for a fibrinolytic activity of enzymes, this screening method being carried out according to the screening method described for collagenolysis, with collagen being replaced in each case by fibrin.
  • the enzymes to be examined for the screening method are preferably selected from the group of proteases.
  • Proteases which are active under physiological conditions are particularly preferably used for the screening.
  • Proteases which are commercially available are also preferably selected for the screening.
  • the present invention further relates to a protease obtainable by the screening method as described above.
  • the present invention also relates to the use of such a protease, obtained by the screening method described above, for the production of a pharmaceutical composition, for the treatment and / or supportive therapy in wound healing, in particular for providing a fibrinolytic, collagenolytic and / or plasminogen-activating activity.
  • the activity of the proteases with regard to collagenolysis or fibrinolysis is determined directly with the natural substrate collagen or fibrin.
  • the cleaved peptides are acid-soluble and can therefore be determined photometrically after sedimentation of the insoluble collagen.
  • the low sensitivity in the direct measurement of these peptides and amino acids was initially improved by staining with Folin-Ciocalteus phenol reagent.
  • the proteases to be tested partially contained substances which were also colored by the above phenol reagent. For this reason, the coloring was replaced according to the invention by the amino acid detection with ninhydrin.
  • proteases could be identified that have all three required activities (protease from S. griseus, protease VIII).
  • protease from Streptomyces griseus (a mixture of three proteases) and protease VIII (also referred to as subtilisin Carlsberg) are active with respect to all substrates tested.
  • the values of the specific activity of the protease from S. griseus can be classified as very high compared to all substrates. Trypsin also stands out because the enzyme has a particularly high plasminogen activation activity. Trypsin also has collagenolytic activity. In addition to high fibrinolysis activity, the herbal protease ficin has (albeit low) plasminogen activation (below 1 U / mg). Proteinase K is able to degrade both collagen and fibrin with medium or high activity.
  • thrombin could be used for the enzyme thrombin, which is active in the blood coagulation cascade Plasminogen activation activity can be measured. Furthermore, several enzymes with activities against the different substrates were discovered. The results are summarized in a table below.
  • Tab. 1 Compilation of the results of the protease screening with regard to the substrates plasminogen, collagen and fibrin.
  • the symbols used in the table mean:
  • Plasmin activity (after proteolytic activation of plasminogen):
  • protease screening show new ways of enzymatically assisted wound healing.
  • Proteases have been identified that are very potent candidates for wound healing, since they either have a co-agent, fibrinolytic or plasminogen-activating effect or even combine several of the three activities tested.
  • the protease mixture Protease from S. griseus is particularly interesting because it implements all three substrates with high activity.
  • the pharmaceutical compositions contain at least one protease selected from the group consisting of protease from Streptomyces (S.) griseus, protease VIII, protease XVIII, ficin, proteinase K, protease XXIII, thrombin, metalloendopeptidase, endoproteinase Asp-N, clostripain, protease XIX, Chymopapain, papain, protease X and trypsin, together with physiologically compatible carriers, auxiliaries and / or solvents, and optionally anti-coagulant active ingredients.
  • protease selected from the group consisting of protease from Streptomyces (S.) griseus, protease VIII, protease XVIII, ficin, proteinase K, protease XXIII, thrombin, metalloendopeptidase, endoproteinase Asp-N,
  • Proteases from Streptomyces (S.) griseus, protease VIII, proteinase K and / or trypsin are particularly preferred.
  • Heparin, heparin derivatives or acetylsalicylic acid are preferably added as additional anticoagulant active ingredients.
  • the proteases which can be used according to the invention are preferably used in external wound treatment in pharmaceutical compositions which are suitable for topical use.
  • the protease (s) are used in a concentration of 0.01-500 units per gram, preferably 0.1-500 U per gram of pharmaceutical composition, further preferably 0.5-250 U per gram of pharmaceutical composition and particularly preferably in a concentration from 1 - 150 U protease per gram of pharmaceutical composition used.
  • plasters or other dressing materials are used instead of semi-solid preparations in the form of, for example, ointments, creams, pastes, gels, etc., the concentration ranges given above per 2 cm 2 of plaster surface or surface of the dressing material apply.
  • the formulations suitable for topical use in particular ointments, creams, sprays, pastes, gels for wound treatment, especially poorly healing wounds, preferably contain 0.01-500, particularly preferably 0.1-500 U protease per gram of pharmaceutical composition.
  • the protease (s) are used in a concentration of 0.1 to 100,000 units per gram of formulation, preferably 100 to 80,000 units per gram of formulation and particularly preferably 1,000 to 50,000 units per gram of formulation.
  • the proteases are preferred in a concentration of 0.01 unit - 100 million 0.1 unit to 100 million units, further preferably 1 unit to 100 million units per 10 ml solution, further preferably 1 unit to 10 million units per 10 ml solution and particularly preferably 3 units to 5 million units per 10 ml solution and further particularly preferably 10 units - 1 million units of protease (s) used per 10 ml of solution.
  • the stated amounts of protease (s) are further preferably based on 1 ml of solution.
  • proteases are preferably used alone and not in combination with other proteases, but combinations of two or three proteases are definitely useful and usable for certain indications.
  • compositions according to the invention are prepared in a known manner with the customary solid or liquid carriers or diluents and / or the commonly used pharmaceutical adjuvants according to the desired type of application in a suitable dosage.
  • the preferred pharmaceutical formulations or preparations exist in a dosage form which is suitable for topical external application.
  • dosage forms are, for example, ointments, pastes, gels, films, dispersions, emulsions, suspensions or special formulations, such as, for example, nanodisperse systems in the form of liposomes, nanoemulsions or lipid nanoparticles, and also surfactant-free formulations, polymer-stabilized or solids-stabilized emulsions.
  • thrombosis When using the pharmaceutical compositions for the prophylaxis and / or treatment of heart attack, thrombosis, venous thrombosis, restenosis, hypoxia, ischemia, coagulation necrosis, inflammation of the blood vessels, acute pulmonary embolism, acute and subacute arterial thrombosis, fresh or older clots in venous thrombosis of deep vein thrombosis Pelvic and extremities, early thrombosis in the area of the obliterated vessels, acute central vascular occlusion on the eye, disseminated intravascular Coagulation in shock, acute arterial occlusion of the extremities, chronic occlusive arteriopathies, thrombosis of arteriovenous shunts, as well as for treatment after a heart attack, after a bypass operation, after angioplasty and after balloon dilatation, for thrombolytic therapy for acute heart attack, for recanalizing arteriovenous Preparations prepared for parenteral
  • compositions are, for example, protease-containing plasters or other dressing materials. These formulations are particularly suitable for topical use in wound treatment.
  • the screening methods which can preferably be used for the determination of the fibrinolysis activity, the collagenolysis activity and the plasminogen activation activity are presented below as examples.
  • the corresponding protease is pipetted into a fibrin suspension and incubated at 37 ° C.
  • the reaction is stopped by adding 10% trichloroacetic acid and the insoluble constituents are separated off by centrifugation.
  • the same volume of 3 M sodium acetate buffer pH 5.5 is added to 100 ⁇ l of the supernatant and incubated at 60 ° C. for 5 minutes.
  • the extinction difference used for the activity calculation is measured at 550 nm.
  • buffer A 100 mM sodium phosphate buffer pH 8, 0.36 mM CaCl 2 , 0.9% NaCl
  • the suspension thus obtained was washed with a Ultraturrax mixer treated three times for 30 s, level 5 (Ultra Turrax®, IKA T18 basic, dispersing tool S18-105, IKA Works, USA).
  • level 5 Ultra Turrax®, IKA T18 basic, dispersing tool S18-105, IKA Works, USA.
  • protease solution 50 ⁇ l of protease solution were added. This mixture was incubated at 37 ° C with shaking. After 0, 30, 60 and 90 min.
  • L-serine solutions in buffer A were prepared with the following concentrations: 0; 0.5; 1; 1.5; 2; 2.5; 3; 3.5; 4 mM. These solutions were stained with ninhydrin as described above and the absorbance at 550 nm was measured after transfer to microtiter plates.
  • 1 U fibrinolysis activity corresponds to the increase in extinction per minute, which is equivalent to the release or color intensity of 1 ⁇ mol L-serine.
  • proteases from S. griseus, Protease VIII, Protease XXIII, Protease XIX, Protease XVIII, Ficin, Metalloendopeptidase, Clostripain, Endoproteinase Glu-C, Protease XIII, Chymopapain, Chymotrypsin, Protease X, Bromelain, Kallikrein and Proteinase A were from Sigma , Deisenhofen, related; Trypsin, papain, endoproteinase Asp-N, thrombin, dispase I, endoproteinase Lys-C and elastase were from Röche, Mannheim, and proteinase K was supplied by QIAGEN, Hilden.
  • Protease VIII 0.097 U / mg
  • Papain 2.361 U / mg
  • Protease XXIII 0.105 U / mg
  • Protease X 0.032 U / mg
  • Protease XVIII 0.081 U / mg
  • Protease from S. griseus 4.048 U / mg
  • Ficin 1.149 U / mg
  • Chymopapain 0.166 U / mg
  • Proteinase K 1.344 U / mg.
  • No fibrinolysis activity could be determined for the following proteases: trypsin, chymotrypsin, bromelain, dispase I, protease XIX, protease XIII, thrombin, kallikrein, Elastase, Endoproteinase Glu-C, Proteinase A, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain and Endoproteinase Lys-C.
  • proteases trypsin, chymotrypsin, bromelain, dispase I, protease XIX, protease XIII, thrombin, kallikrein, Elastase, Endoproteinase Glu-C, Proteinase A, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain and Endoproteinase Lys-C.
  • the collagenolysis assay follows the same scheme as the assay for fibrinolysis activity.
  • No collagenolysis activity could be determined for the following proteases: chymotrypsin, bromelain, thrombin, papain, protease X, dispase I, protease XIII, protease XVIII, ficin, kallikrein, chymopapain, elastase, endoproteinase Glu-C, proteinase A, metalloendopeptidase, endoproteinase Asp-N, clostripain and endoproteinase Lys-C.
  • proteases chymotrypsin, bromelain, thrombin, papain, protease X, dispase I, protease XIII, protease XVIII, ficin, kallikrein, chymopapain, elastase, endoproteinase Glu-C, proteinase A, metalloendopeptidase, end
  • the inventive screening method for determining the plasminogen activation activity presented here is based on the use of synthetic peptide substrates. These are short amino acid chains that are linked to a chromophore. The chromophore is released by a protease-catalyzed reaction and can be determined photometrically. In addition to the high specificity of the substrates used, these processes also offer the advantage that the reaction can be followed directly.
  • pNA para-nitroaniline, dye
  • the assay developed with this substrate is carried out as follows: Plasmin is added to a Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA solution and incubated at 37 ° C. The course of the reaction can be monitored photometrically using the released dye at 405 nm.
  • proteases supplied in powdered form were dissolved in buffer, the proteases supplied in solution were used directly or, if necessary, diluted with buffer. 25 ⁇ l of the protease solutions were mixed with 25 ⁇ l plasminogen (obtained from Röche, Mannheim, concentration 20 mg / ml) and incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The plasmin activity with respect to the substrate N-tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA was then determined.
  • proteases from S. griseus, Protease VIII, Protease XXIII, Protease XIX, Protease XVIII, Ficin, Metalloendopeptidase, Clostripain, Endoproteinase Glu-C, Protease XIII, Chymopapain, Chymotrypsin, Protease X, Bromelain, Kallikrein and Proteinase A were from Sigma , Deisenhofen, related; Trypsin, papain, endoproteinase Asp-N, dispase I, endoproteinase Lys-C, thrombin and elastase were from Röche, Mannheim, and proteinase K was supplied by QIAGEN, Hilden.
  • proteases protease XXIII, protease XIX, chymopapain, endoproteinase Lys-C, chymotrypsin, papain, Dispase I, protease X, bromelain, kallikrein and proteinase K no plasminogen activation could be detected.
  • proteases identified in the individual screening processes are used for the pharmaceutical formulations:
  • Hydroxyethylcellulose 400 2.5 - 5.0 g of purified water to 100.0 g
  • the swelling time is 1 to 3 hours.
  • Polyhexanide can optionally be used as an antimicrobial active ingredient in a concentration up to
  • Hydroxyethylcellulose 400 e.g. Tylose ® H 300 or Natrosol 250 ® HX PHARM
  • Macrogol 400 30.0 - 32.5 g
  • 12.5 g Macrogol 4000 and 30.0 g Macrogol 400 (7.5 g Macrogol 4000 and 32.5 g Macrogol 400 for soft ointments) are heated in an ointment dish in a water bath until the macrogol has melted. After cooling, the corresponding amount of protease (s) dissolved in 7.5 g of purified water is added and then homogenized.
  • proteases are preferably used individually in the pharmaceutical formulations mentioned herein. However, combinations of two or three proteases can also be used, the amount then being understood in units per protease used or as the total activity of all proteases.
  • Hydroxyethyl cellulose 10,000 3.5 g optional preservation (sorbic acid / potassium sorbate 0.1-0.4%, PHB ester 0.1%). purified water ad 100.0
  • hydroxyethyl cellulose or instead hypromellose or methyl cellulose can alternatively be used in an amount of 0.5-15.0 g. gel
  • Hydroxyethyl cellulose 10,000 32.5 g optional preservation (sorbic acid / potassium sorbate 0.1-0.4% » PHB ester 0.1%)
  • Hydrophilic ointment (macrogol ointment)
  • Vaseline white to 100 g
  • Vaseline white to 100 g
  • Carbomer e.g. Carbopol 974p 15 g
  • Vaseline white 25 g optional preservation (sorbic acid / potassium sorbate 0.1-0.2%), PHB ester 0.1%)
  • one capsule with 0.25g powder / granules contains:
  • 100g pellets contain:

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die neue Verwendung bestimmter Proteasen bei der Behandlung der Wundheilung, insbesondere ihre Verwendung bei der Fibrinolyse, der Kollagenolyse und der Plasminogen-Aktivierung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Screeningverfahren um für die obigen Verwendungen geeignete Proteasen bereitzustellen. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der so erhaltenen Proteasen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Einsatz in der Wundheilung, der Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Venenthrombosen, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akuter Lungenembolie, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Verbrennungen und Erfrierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Ballondilatation, zurthrombolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierung arteriovenöser Shunts sowie zur Reperfusion verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt und nach einer Angioplastie mit oder ohne Stent-Einlage.

Description

PROTEASE-SCREENΓNG UND NEUE VERWENDUNG VON PROTEASEN
Die vorliegende Erfindung betrifft die neue Verwendung bestimmter Proteasen bei der Wundheilung, insbesondere ihre Verwendung bei der Fibrinolyse, der Kollagenolyse und der Plasminogen-Aktivierung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Screeningverfahren um für die obigen Verwendungen geeignete Proteasen bereitzustellen. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der so erhaltenen Proteasen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Einsatz in der Wundheilung.
STAND DER TECHNIK
Auf dem Gebiet der Medizin ist eine ganze Reihe von Wirkstoffen bekannt, die in der Wundheilung eingesetzt werden können. Trotz dieser Vielzahl bereits bekannter Stoffe tritt jedoch nach wie vor das Problem auf, dass bestimmte Wunden nicht oder nur sehr langsam abheilen, was zu einer ernsten Gefährdung der Gesundheit der betroffenen Person oder sogar deren Tod führen kann, mindestens aber mit Schmerzen und unangenehmen Auswirkungen auf das tägliche Leben derselben verbunden ist. Ferner sind etliche zur Zeit für die Wundheilung eingesetzte Stoffe nur schwierig herzustellen und/oder sehr teuer.
In US 4,752,603 wird diesbezüglich ein Verfahren offenbart, einen neuen Plasminogen- Aktivator aus dem Kulturmedium humaner Melanoma-Zellen zu isolieren. Der isolierte Aktivator zeigt einen thrombolytischen Effekt und kann zur therapeutischen Behandlung verwendet werden. Die Isolierung dieses neuen Aktivators ist allerdings sehr aufwendig und kostenintensiv. Ein weiterer Nachteil besteht darin, das Kulturmedium der humanen Melanoma-Zellen mit Kälberserum angereichert ist, was in Zeiten von Infektionskrankheiten wie z. B. BSE unerwünscht ist.
Auch weitere zur Zeit für die Heilung bzw. Wundheilung eingesetzte Stoffe sind schwierig oder in nur geringen Mengen herzustellen und/oder sehr teuer.
Es wäre daher sehr wünschenswert, weitere Wirkstoffe bereitstellen zu können, die in der Behandlung und/oder unterstützenden Therapie von Wunden einsetzbar sind und die insbesondere die Heilung ansonsten schlecht oder gar nicht heilender Wunden begünstigen. Weiterhin wäre es wünschenswert, solche Wirkstoffe bereitzustellen, die relativ kostengünstig sind und für deren Herstellung keine aufwendigen Verfahren notwendig sind. Besonders wünschenswert wäre es, wenn Wirkstoffe zur Verfügung stünden, die sowohl fibrinolytisch als auch kollagenolytisch und/oder Plasminogen-aktivierend sind, vorzugsweise alle drei oben genannten Eigenschaften aufweisen. Wirkstoffe, die alle drei genannten Eigenschaften besäßen, wären in der Wundheilung besonders vorteilhaft einsetzbar.
Es war daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, derartige Wirkstoffe bereitzustellen. Es war ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, dem Fachmann ein Screeningverfahren an die Hand zu geben, durch das derartige Wirkstoffe auffindbar sind.
Diese Aufgaben werden durch die in den unabhängigen Ansprüchen angegebenen Gegenstände bzw. Verfahren gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen sowie der Beschreibung angegeben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Bereitstellung von Protease aus Streptomyces (S.) griseus, Protease VIII, Protease XVIII, Ficin, Proteinase K, Protease XXIII, Thrombin, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain, Protease XIX, Chymopapain, Papain, Protease X und/oder Trypsin zur Verwendung in der Wundheilung angegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von Protease aus Streptomyces griseus, Protease VIII, Protease XVIII, Ficin, Proteinase K, Protease XXIII, Thrombin, Metalloendopeptidase, Endoproteinase, Asp-N, Clostripain, Protease XIX, Chymopapain, Papain, Protease X, und/oder Trypsin in der Wundheilung zur Erzielung einer fibrinolytischen, kollagenolytischen und/oder plasminogen-aktivierenden Wirkung.
Die Protease aus Streptomyces griseus ist auch unter folgenden Synonymen bekannt: Neutrale Proteinase aus Streptomyces griseus (Streptomyces griseus neutral proteinase; Proteinase, Streptomyces griseus neutral), mikrobielle Metalloproteinase (microbial metalloproteinase), Pronasekomponente (pronase component), Neutrale Proteinase aus Äctinomyces griseus (Äctinomyces griseus neutral proteinase) oder Pronase neutrale Protease (pronase neutral protease).
Gemäß Angaben von Sigma handelt es sich bei der Protease aus Streptomyces griseus um eine Proteasemischung mit folgenden Pronasekomponenten: a) Streptogrisin A (3.4.21.80, Streptomyces protease A, SGPA, Pronase Enzym A), b) Streptogrisin B (3.4.21.80, Streptomyces protease B, SGPB, Pronase Enzym B), c) Mycolysin (3.4.24.31, Pronase Komponente, Streptomyces griseus neutrale Proteinase).
Die natürlichen Substrate der Protease aus Streptomyces griseus sind Oligopeptide, welche durch Umsetzung mit Wasser hydrolysiert werden. Zum Substratspektrum gehören ferner Casein und Gelatine, welche durch die Protease aus Streptomyces griseus ebenfalls hydrolysiert werden. Eine Amidase- oder Esteraseaktivität soll dieses Enzym hingegen nicht besitzen.
Der Protease VIII ist die neue EC-Nummer 3.4.21.62 zugewiesen worden, nachdem dieses Enzym bereits vorher unter den alten EC-Nummern 3.4.4.16 und 3.4.21.14a bekannt war. Zudem ist die Protease VIII in der Fachliteratur unter einer Vielzahl von Synonymen bekannt, von denen die Bezeichnungen Subtilisin und Subtilisin Carlsberg wohl am gängigsten sind. Folgend ist eine nicht abschließende Liste bisher in der Literatur verwendeter Synonyme für das Enzym Nr. E.C. 3.4.21.62 aufgeführt. Als andere Bezeichnungen für Protease VIII wurden beispielsweise verwendet: Mikrobielle
Serinproteinase (microbial serine proteinase), Subtilopeptidase A, Subtilopeptidase B, Subtilopeptidase C, Alcalase Novo, Alcalase, Alcalase 0.6L, Alcalase 2.5L, bakterielle Proteinase Novo, Subtilisin BPN', Subtilisin GX, Subtilisin E, Subtilisin BL, Subtilisin Novo, Subtilisin Amylosacchariticus, Subtilisin DY, Subtilisin S41, Subtilisin J, Subtilisin Sendai, Subtilisin A, Subtilisin B, Nagarase Proteinase, Nagarase, Maxatase, ALK- Enzym, Bioprase, Bioprase AL 15, Bioprase APL 30, Colistinase, Bacillopeptidase A, Bacillopeptidase B, Bacillus subtilis alkalische Proteinase (Proteinase, Bacillus subtilis alkaline), Superase, Superase subtilo A, SP 266, Thermoase, Thermoase PC 10, Alkalase 2.0T, Alcalase 2.4L, Savinase 4.0T, Savinase 8.0T, Savinase, Savinase 16.0L, Savinase 32.0L EX, Peptidase subtilo A, P 5380 (Sigma), P5255 (Sigma), Protease VII, SP 266, Kazusase, Protin A 3L, Opticlean, Protease XXVII, Orientase 10B, Protease S, Colistinase, Genenase I, Esperase, Enzym aus Bacillus pumilus, Enzym aus Bacillus licheniformis, Enzym aus Bacillus amyloliquefaciens oder Enzym aus Bacillus subtilis amylosacchariticus.
Die natürlichen Substrate von Protease VIII sind Proteine, welche durch dieses Enzym hydrolysiert werden. Das Substratspektrum erstreckt sich auf Casein, Hämoglobin, Ovalbumin, Gelatine, Insulin sowie andere Proteine und Peptide.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde insbesondere eine Verwendung bereitgestellt, wobei die Proteasen aus S. griseus, die Protease VIII, die Proteinase K, die Protease XXIII, Protease XIX und/oder das Trypsin eine Kollagenolyseaktivität aufweisen. Weiterhin weisen insbesondere die Protease aus S. griseus, die Protease XIII, das Thrombin, die Metalloendopeptidase, die Endoproteinase Asp-N, das Clostripain und/oder das Trypsin eine Plasminogen-aktivierende Aktivität auf. Ferner weisen die Protease aus S. griseus die Protease VIII, die Protease XVIII, das Ficin, die Proteinase K, die Protease XXIII, das Chymopapain, Papain und Protease X eine fibrinorytische Aktivität auf. Überraschend wurde festgestellt, dass Trypsin sowohl eine Plasminogen aktivierende als auch eine kollagenolytische Aktivität aufweist. Fernerhin wurde überraschend gemäß der vorliegenden Erfindung eine Verwendung aufgezeigt, wobei die Proteinase K und die Protease XXIII sowohl eine fibrinolytische, als auch eine kollagenolytische Aktivität aufweisen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Behandlung von schlecht oder langsam heilenden Wunden können die Protease aus S. griseus und die Protease VIII verwendet werden, die sowohl eine kollagenolytische, eine fibrinolytische, als auch eine Plasminogen-aktivierende Aktivität aufweisen.
Es gibt im Stand der Technik keinerlei Hinweis darauf, dass die oben erwähnten Proteasen die erwähnten Aktivitäten aufweisen könnten. Insbesondere wurde gemäß der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass Trypsin überraschend sowohl eine Plasminogen aktivierende, als auch eine kollagenolytische Aktivität aufweist. Ferner wurde insbesondere überraschend festgestellt, dass die Proteinase K und die Protease XXIII sowohl fibrinolytische als auch kollagenolytische Aktivität aufweisen. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung der Protease aus S. griseus und der Protease VIII, die sowohl kollageneolytische, als auch fibrinolytische und Plasminogen aktivierende Aktivität aufweisen. Es gibt ferner keinen Hinweis darauf im Stand der Technik, dass die oben erwähnten Aktivitäten in irgendeiner Weise derartig zusammenhängen, dass zu erwarten gewesen wäre, dass Proteasen, die die eine oder andere dieser Aktivitäten aufweisen, auch weitere Aktivitäten aufweisen könnten. Vorzugsweise sind die spezifischen Aktivitäten der Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung für die Plasminogen-Aktivierung jeweils größer als 1 U/Milligramm. Weiterhin bevorzugt sind die spezifischen Aktivitäten der Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung für die Kollagenolyse bzw. die Fibrinolyse größer als 0,1 U/Milligramm.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die erfindungsgemäßen Proteasen verwendet werden, um Fibrin-Clots zu degradieren, Matrixmetalloproteasen zu aktivieren, eine extrazelluläre Matrix abzubauen, Glu-Plasminogen zu Lys-Plasminogen zu prozessieren, Wachstumsfaktoren zu aktivieren und freizusetzen und/oder endogenes Plasminogen zu Plasmin zu aktivieren. Alle obigen Aktivitäten sind einzeln oder in Kombination in der Wundheilung hilfreich oder notwendig und tragen so auch zur Heilung ansonsten schlecht oder langsam heilender Wunden bei. Die Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung können daher zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder unterstützenden Therapie in der Wundheilung verwendet werden. Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung weiterhin geeignete Träger und/oder Hilfsstoffe. Solche geeigneten Träger und/oder Hilfsstoffe sind auf dem Gebiet der Wundheilung bekannt.
Zudem wurde erkannt, daß die oben aufgeführten Proteasen anti-thrombotische sowie anti- koagulative Eigenschaften aufweisen. Diese vorteilhaften Eigenschaften ermöglichen zudem die Verwendung der Proteasen, insbesondere der Protease aus Streptomyces (S.) griseus, der Protease VIII, der Proteinase K sowie Trypsin, als anti-thrombotische sowie anti- koagulative Wirkstoffe zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Venenthrombosen, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akuter Lungenembolie, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Verbrennungen und Erfrierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation, zur thrombolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierung arteriovenöser Shunts sowie zur Reperfusion verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt.
Bevorzugt werden die Proteasen bei diesen Indikationen zusammen mit einem Antikoagulant eingesetzt. Als Antikoagulantien eignen sich Heparin, Heparinderivate oder
Acetylsalicylsäure.
Zur Entwicklung eines Screeningverfahrens war die Auswahl verschiedener, für die Erfindung besonders geeigneter Kriterien notwendig:
a) Auswahlkriterien
- die gewählten Wirkstoffe, vorzugsweise Proteasen, sollten kostengünstig herstellbar und auf dem Markt leicht erhältlich sein; dieses Kriterium wird durch kommerziell verfügbare Proteasen erfüllt. - es sollten nur Proteasen in das Screening einbezogen werden, die unter physiologischen Bedingungen aktiv sind. D. h. saure Proteasen, wie Pepsin, wurden nicht verwendet.
b) Testkriterien
Die ausgewählten Proteasen wurden auf drei Aktivitäten hin getestet, die besonders relevant für die Wundheilung sind und von deren Kombination man sich eine besonders gute Wirkung auf die Wundheilung insbesondere langsam heilender Wunden versprechen kann:
- Degradation der extrazellulären Matrix (Kollagenolyse- Aktivität)
- Degradation des Fibrinclots (Fibrinolyse- Aktivität)
- Aktivierung von endogenem Plasminogen zu Plasmin, das folgende, für den Wundheilungsprozess förderliche Aktivitäten aufweist:
• Prozessierung von Glu-Plasminogen zu Lys-Plasminogen, welches deutlich schneller zu Plasmin aktivierbar ist.
• Degradation des Fibrinclots.
• Aktivierung und Freisetzung von Wachstumsfaktoren, z. B. dem „basic fibroblast growth factor" bFGF, dem „transforming growth factor" TGFß-1 oder dem „vascular endothelial growth factor" VEGF.
• Aktivierung von Matrix-Metalloproteasen, welche die Degradation der extrazellulären Matrix katalysieren.
c) Eigenschaften der entwickelten Testverfahren
Für die Bestimmung der Aktivitäten sollten Testverfahren auf Mikrotiterplatten- Basis entwickelt werden, welche die Überprüfung der ausgewählten Proteasen in kurzer Zeit bei geringem Aufwand ermöglichen sollten. Insbesondere sollten Testverfahren entwickelt werden, die sowohl einfach als auch in großem Maßstab durchführbar sind und außerdem mit hoher Reproduzierbarkeit zu eindeutigen Ergebnissen führen.
Es war also eine Vielzahl von Faktoren zu bedenken und einzubeziehen, wenn ein sinnvolles, die Aufgabe gemäß der vorliegenden Erfindung lösendes geeignetes Screeningverfahren entwickelt werden sollte. Bei der Entwicklung der Screeningverfahren wurden zunächst im Stand der Technik bekannte Verfahren getestet. Zum Nachweis von Proteasen mit Kollagenase-Aktivität bzw. fibrinolytischer Aktivität sind z. B. Klärhof-Tests bekannt. Bei diesem Verfahren wird Kollagen bzw. Fibrin in einer Agaroselösung suspendiert. Nach Erstarren resultiert eine trübe Matrix, auf die die zu testende Lösung pipettiert wird. Sind in der Lösung Kollagenasen vorhanden, diffundieren diese in die Matrix und hydrolysieren das dort vorhandene Kollagen (Fibrin), wodurch die Trübung verschwindet und ein klarer Hof sichtbar wird.
Die Durchführbarkeit eines solchen Verfahrens wurde zunächst überprüft. Dazu wurde auf eine Kollagen- Agar-Matrix Kollagenase bzw. Proteinase K pipettiert. Anschließend erfolgte eine dreistündige Inkubation bei 37°C. An der Stelle, an der Kollagenase-Lösung aufgetropft worden war, entstand ein Klärhof, während an der Stelle, an der Proteinase K aufgetropft worden war, erwartungsgemäß die Trübung aufrechterhalten blieb. Es stellte sich jedoch heraus, dass die Trübung aufgrund der verhältnismäßig großen KoUagenase-Partikel relativ gering ist und die Klärhöfe nicht gut sichtbar sind. Die Reproduzierbarkeit der Klärhöfe war ebenfalls nicht zufriedenstellend.
Zum Durchmustern von Proteasen auf Fibrin-Degradation wurde ebenfalls zunächst das Klärhofverfahren getestet. Wie beim Kollagenase-Test waren auch hier die Klärhöfe kaum sichtbar.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden daher zum Screening auf Fibrinolyse bzw. Kollagenolyse Screeningverfahren entwickelt, welche die obigen Probleme nicht aufweisen und die außerdem den oben genannten vielfältigen Kriterien entsprechen.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Screening- Verfahren zur Identifizierung von für die Wundheilung geeigneten Enzymen gerichtet, wobei die Enzyme auf ihre Fähigkeit zur Plasminogen- Aktivierung, zur Fibrinolyse und/oder zur Kollagenolyse untersucht werden.
Das Screening- Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst im Hinblick auf die Plasminogen-Aktivierung mindestens die folgenden Schritte:
- Bereitstellung des synthetischen Peptids N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA als Substrat,
- Zugabe von einem Gemisch aus Plasminogen und zu untersuchendem Enzym,
- Inkubation bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitspanne und
- photometrischer Nachweis der Plasminogen-Aktivierung. Vorzugsweise wird die Plasminogen-Aktivierung durch Nachweis eines freigesetzten Farbstoffs photometrisch durch Zunahme der Extinktion bei 405 nm gemessen. Der freigesetzte Farbstoff ist dabei das durch aus Plasminogen gebildetes Plasmin vom Peptidsubstrat abgespaltene para-Nitroanilin (pNA). Vorzugsweise liegt das Plasminogen- Enzymgemisch in einem 1:1 (V/V)-Verhältnis vor. Weiterhin vorzugsweise wird diese Mischung 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Inkubation von Plasminogen, Enzym und Peptidsubstrat erfolgt vorzugsweise für 5 bis 30 Minuten, weiterhin vorzugsweise bei ca. 37°C.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform des Screening-Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Untersuchung der KoUagenolyseaktivität mindestens die folgenden Schritte:
- Bereitstellung von Kollagen,
Vermischen von Kollagen mit einem zu untersuchenden Enzym, Inkubation für eine geeignete Zeitspanne bei einer geeigneten Temperatur,
- Beendigung der Reaktion und Abtrennung unlöslicher Bestandteile,
- Zugabe von Ninhydrinreagenz,
- Inkubation für eine geeignete Zeitspanne bei einer geeigneten Temperatur und
- photometrischer Nachweise des Kollagenspaltproduktes.
Der photometrische Nachweis bei der Untersuchung auf eine KoUagenolyseaktivität wird vorzugsweise nach Inkubation mit dem Ninhydrinreagenz für 10 bis 25 Minuten, vorzugsweise für 20 Minuten, bei ca. 60°C und Abkühlen auf Raumtemperatur durch Messung der Extinktionsdifferenz bei 550 nm durchgeführt. Das Kollagen und das zu untersuchende Enzym werden für 30 bis 90 Minuten, vorzugsweise bei ca. 37°C, inkubiert, bevor die Reaktion vorzugsweise durch Zugabe von 10 % Trichloressigsäure gestoppt wird. Die unlöslichen Bestandteile können durch Zentrifügation abgetrennt werden.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Screening-Verfahrens der vorliegenden Erfindung umfasst ein Screening auf eine fibrinolytische Aktivität von Enzymen, wobei dieses Screening- Verfahren gemäß dem für die Kollagenolyse beschriebenen Screeningverfahren durchgeführt wird, wobei jeweils Kollagen durch Fibrin ersetzt wird.
Vorzugsweise werden die zu untersuchenden Enzyme für das Screening- Verfahren aus der Gruppe der Proteasen gewählt. Besonders bevorzugt werden solche Proteasen für das Screening verwendet, die unter physiologischen Bedingungen aktiv sind. Weiterhin bevorzugt werden solche Proteasen für das Screening gewählt, die kommerziell erhältlich sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Protease, die durch das Screening- Verfahren wie oben beschrieben erhältlich ist. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung einer solchen Protease, erhalten durch das oben beschriebene Screeningverfahren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, zur Behandlung und/oder unterstützenden Therapie bei der Wundheilung, insbesondere zur Bereitstellung einer fibrinolytischen, kollagenolytischen und/oder Plasminogen-aktivierenden Aktivität.
Dabei wird die Aktivität der Proteasen hinsichtlich Kollagenolyse bzw. Fibrinolyse direkt mit dem natürlich Substrat Kollagen bzw. Fibrin bestimmt. Die abgespaltenen Peptide sind säurelöslich und können somit nach Sedimentation des nicht löslichen Kollagens photometrisch bestimmt werden. Die geringe Sensitivität bei der direkten Messung dieser Peptide und Aminosäuren wurde zunächst durch Färbung mit Folin-Ciocalteus- Phenolreagenz verbessert. Jedoch zeigte sich, dass die zu testenden Proteasen teilweise Substanzen enthielten, die durch das obige Phenolreagenz ebenfalls gefärbt wurden. Aus diesem Grund wurde die Färbung erfindungsgemäß durch den Aminosäure-Nachweise mit Ninhydrin ersetzt.
d) Ergebnis des Screening-Verfahrens
Durch das Screening konnten Proteasen identifiziert werden, die alle drei geforderten Aktivitäten aufweisen (Protease aus S. griseus, Protease VIII).
Die in Tab. 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Protease aus Streptomyces griseus (ein Gemisch aus drei Proteasen) und Protease VIII (auch als Subtilisin Carlsberg bezeichnet) bezüglich aller getesteten Substrate aktiv sind. Die Werte der spezifischen Aktivität der Protease aus S. griseus sind gegenüber allen Substraten als sehr hoch einzustufen. Weiterhin sticht Trypsin hervor, da das Enzym eine besonders hohe Plasminogen-Aktivierungs- Aktivität aufweist. Trypsin besitzt ebenfalls kollagenolytische Aktivität. Die pflanzliche Protease Ficin weist neben einer hohen Fibrinolyseaktivität eine (allerdings geringe) Plasminogen-Aktivierung auf (unterhalb von 1 U/mg). Die Proteinase K ist in der Lage, sowohl Kollagen als auch Fibrin mit mittlerer bzw. hoher Aktivität zu degradieren, interessanterweise konnte für das in der Blutgerinnungskaskade aktive Enzym Thrombin eine Plasminogen- Aktivierungs-Aktivität gemessen werden. Des Weiteren wurden noch mehrere Enzyme mit Aktivitäten gegenüber den verschiedenen Substraten entdeckt. Die Ergebnisse sind nachfolgend tabellarisch zusarnmengefasst.
Tab. 1: Zusammenstellung der Ergebnisse des Protease-Screenings bzgl. der Substrate Plasminogen, Kollagen und Fibrin. Die in der Tabelle verwendeten Symbole bedeuten:
- keine Aktivität messbar: -
- Plasmin- Aktivität (nach proteolytischer Aktivierung von Plasminogen):
- 0: <l U/mg; +: 1 - 10 U/mg; ++: 10 - 100 U/mg;
- +++: 100 - 1000 U/mg; ++++: > 1000 U/mg; - Kollagenolyse- bzw. Fibrinolyse-Aktivität:
+: < 0,5 U/mg; ++: 0,5 - 1 U/mg; +++: > 1 U/mg.
Die Ergebnisse des Protease-Screenings weisen neue Wege der enzymatisch unterstützten Wundheilung auf. Es wurden Proteasen identifiziert, die sehr potente Kandidaten für den Einsatz zur Wundheilung darstellen, da sie entweder koUagenolytisch, fibrinolytisch oder Plasminogen-aktivierend wirken oder gar mehrere der drei getesteten Aktivitäten in sich vereinen. Besonders interessant ist das Proteasegemisch Protease aus S. griseus, da es alle drei Substrate mit hoher Aktivität umsetzt.
PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten mindestens eine Protease ausgewählt aus der Gruppe, welche Protease aus Streptomyces (S.) griseus, Protease VIII, Protease XVIII, Ficin, Proteinase K, Protease XXIII, Thrombin, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain, Protease XIX, Chymopapain, Papain, Protease X und Trypsin umfaßt, zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern, Hilfsstoffen und/oder Lösungsmitteln sowie gegebenenfalls anti-koagulativen Wirkstoffen. Insbesondere bevorzugt sind Protease aus Streptomyces (S.) griseus, Protease VIII, Proteinase K und/oder Trypsin. Als zusätzliche antikoagulative Wirkstoffe werden vorzugsweise Heparin, Heparinderivate oder Acetylsalicylsäure zugegeben.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Proteasen werden bei der äußeren Wundbehandlung bevorzugt in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet, welche für die topische Anwendung geeignet sind. Dabei werden die Protease(n) in einer Konzentration von 0,01 - 500 Units pro Gramm, bevorzugt 0,1 - 500 U pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung, weiter bevorzugt 0,5 - 250 U pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung und insbesondere bevorzugt in einer Konzentration von 1 - 150 U Protease pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung verwendet. Werden anstelle von halbfesten Zubereitungen in Form von beispielsweise Salben, Cremes, Pasten, Gelen usw. Pflaster oder sonstige Verbandsmaterialien verwendet, so gelten die oben angegebenen Konzentrationsbereiche pro 2 cm2 Pflasteroberfläche bzw. Oberfläche des Verbandsmaterials. Die zur topischen Anwendung geeigneten Formulierungen, insbesondere Salben, Cremes, Sprays, Pasten, Gele zur Wundbehandlung, vor allem schlecht heilender Wunden, enthalten bevorzugt 0,01 - 500, insbesondere bevorzugt 0,1 - 500 U Protease pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung.
Bei zur oralen Applikation geeigneten Formulierungen werden die Protease(n) in einer Konzentration von 0,1 bis 100.000 Units pro Gramm Formulierung, bevorzugt 100 bis 80.000 Units pro Gramm Formulierung und insbesondere bevorzugt 1.000 bis 50.000 Units pro Gramm Formulierung eingesetzt.
Bei flüssigen Formulierungen wie Injektions- oder Infusionslösungen, Spüllösungen und Sprays werden die Proteasefn) in einer Konzentration von 0,01 Unit - 100 Mio, bevorzugt 0,1 Unit bis 100 Millionen Units, weiter bevorzugt 1 Unit bis 100 Millionen Units pro 10 ml Lösung, ferner weiter bevorzugt 1 Unit bis 10 Millionen Units pro 10 ml Lösung und insbesondere bevorzugt 3 Units bis 5 Millionen Units pro 10 ml Lösung und ferner insbesondere bevorzugt 10 Units - 1 Million Units Protease(n) pro 10 ml Lösung verwendet. Ferner bevorzugt werden die genannten Mengen an Protease(n) auf 1 ml Lösung bezogen. Diese Injektions- und Infusionslösungen dienen insbesondere als Thrombolytikum zur Behandlung von akuten oder drohenden Aderverschlüssen, sowie zur Entfernung von Thromben bei lokal systemischer Applikation oder als Antikoagulant zur Verhinderung der Blutgerinnung beispielsweise während einer Dialyse. Die Spüllösungen und Sprays werden bevorzugt zur Wundreinigung und Wundspülung insbesondere bei schlecht heilenden Wunden eingesetzt.
Bevorzugt werden die Proteasen allein und nicht in Kombination mit weiteren Proteasen eingesetzt, wobei aber Kombinationen von zwei oder drei Proteasen durchaus für bestimmte Indikationen sinnvoll und verwendbar sind.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen werden mit den üblichen festen oder flüssigen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln und/oder den üblicherweise verwendeten pharmazeutischen Hilfsstoffen entsprechend der gewünschten Applikationsart in einer geeigneten Dosierung in bekannter Weise hergestellt. Die bevorzugten pharmazeutischen Formulierungen oder Zubereitungen bestehen in einer Darreichungsform, die zur lokalen äußeren Applikation geeignet ist. Solche Darreichungsformen sind beispielsweise Salben, Pasten, Gele, Filme, Dispersionen, Emulsionen, Suspensionen oder spezielle Formulierungen, wie beispielsweise nanodisperse Systeme in Form von Liposomen, Nanoemulsionen oder Lipid-Nanopartikeln, sowie tensidfreie Formulierungen, polymerstabilisierte oder feststoffstabilisierte Emulsionen.
Verfahren zur Herstellung diverser Formulierungen sowie die verschiedenen Applikationsmethoden sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in "Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA" eingehend beschrieben.
Bei einer Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Venenthrombosen, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akuter Lungenembolie, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation, zur thrombolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierung arteriovenöser Shunts sowie zur Reperfusion verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt eignen sich für die parenterale Applikation hergestellte Zubereitungen. Als parenterale Applikationen kommen vor allem die intravenöse, intraperitoneale, intravasale, subkutane sowie die intramuskuläre Verabreichung in Betracht.
Weitere vorteilhafte Formulierungen stellen beispielsweise Protease-enthaltende Pflaster oder sonstige Verbandsmaterialien dar. Diese Formulierungen eignen sich insbesondere für die topische Anwendung bei der Wundbehandlung.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.
Im folgenden werden beispielhaft die Screeningverfahren vorgestellt, die bevorzugt für die Bestimmung der Fibrinolyse-Aktivität, der Kollagenolyse-Aktivität und der Plasminogen- Aktivierungs-Aktivität verwendet werden können.
Beispiel 1: Bestimmung der Fibrinolyse-Aktivität
Prinzipiell verläuft die Messung der Fibrin-Aktivität erfindungsgemäß nach folgendem Schema:
Zu einer Fibrinsuspension wird die entsprechende Protease pipettiert und bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 % Trichloressigsäure gestoppt und die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt. Zu 100 μl des Überstands wird das gleiche Volumen 3 M Natrium-Acetat-Puffer pH 5,5 gegeben und 5 Min. bei 60 °C inkubiert. Nach Zugabe von 100 μl Ninhydrinreagenz (Sigma, N1632) wird weitere 20 Min. bei 60 °C inkubiert und nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit 1 ml 50 % Isopropanol vermischt. Die zur Aktivitätsberechnung verwendete Extinktionsdifferenz wird bei 550 nm gemessen.
Die folgenden Tests wurden durchgeführt:
Zu 0,24 g Fibrin wurden 40 ml Puffer A (100 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8, 0,36 mM CaCl2, 0,9% NaCl) pipettiert. Die so erhaltene Suspension wurde mit einem Ultraturrax-Mischer dreimal für 30 s, Stufe 5 (Ultra Turrax®, IKA T18 basic, Dispergierwerkzeug S18-105, IKA Works, USA) behandelt. Anschließend wurden 950 μl der Suspension in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 50 μl Proteaselösung versetzt. Dieses Gemisch wurde bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Nach 0, 30, 60 und 90 Min. wurden 200 μl Probe entnommen, mit 200 μl 10% Trichloressigsäure versetzt, gemischt und 10 Min. bei 14000 rpm zentrifugiert. 100 μl des Überstands wurden mit 100 μl 3 M Natriumacetat pH 5,5 versetzt und 5 Min. bei 60°C geschüttelt. Nach Zugabe von 100 μl Ninhydrinlösung (Sigma, N1632) wurde weitere 20 Min. bei 60°C unter Schütteln inkubiert und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Nun wurden 1 ml eines Isopropanol-Wasser-Gemischs (1:1) zupipettiert und zur Färbung mit Ninhydrin eingesetzt. Je Probe wurden 3 mal 200 μl in Mikrotiterplatten pipettiert und die Extinktion bei 550 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (DIGISCAN 400, ASYS Hitec, Österreich) gemessen. Zur Messung von Kontrollwerten wurde anstelle der Fibrinsuspension Puffer A eingesetzt.
Zur Berechnung der Aktivität wurde zunächst eine Kalibriergerade mit L-Serin aufgenommen. Dazu wurden L-Serin-Lösungen in Puffer A mit folgenden Konzentrationen hergestellt: 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4 mM. Diese Lösungen wurden wie oben beschrieben mit Ninhydrin gefärbt und nach Überführung in Mikrotiterplatten die Extinktion bei 550 nm gemessen.
1 U Fibrinolyse-Aktivität entspricht der Extinktionszunahme pro Minute, die der Freisetzung bzw. Farbintensität von 1 μmol L-Serin äquivalent ist.
Die Proteasen Protease aus S. griseus, Protease VIII, Protease XXIII, Protease XIX, Protease XVIII, Ficin, Metalloendopeptidase, Clostripain, Endoproteinase Glu-C, Protease XIII, Chymopapain, Chymotrypsin, Protease X, Bromelain, Kallikrein und Proteinase A wurden von Sigma, Deisenhofen, bezogen; Trypsin, Papain, Endoproteinase Asp-N, Thrombin, Dispase I, Endoproteinase Lys-C und Elastase stammten von Röche, Mannheim, die Proteinase K wurde von QIAGEN, Hilden, geliefert. Folgende Fibrinolyse-Aktivitäten wurden bestimmt: Protease VIII: 0,097 U/mg; Papain: 2,361 U/mg; Protease XXIII: 0,105 U/mg; Protease X: 0,032 U/mg; Protease XVIII: 0,081 U/mg; Protease aus S. griseus: 4,048 U/mg; Ficin: 1,149 U/mg; Chymopapain: 0,166 U/mg; Proteinase K: 1,344 U/mg.
Für folgende Proteasen konnte keine Fibrinolyse-Aktivität bestimmt werden: Trypsin, Chymotrypsin, Bromelain, Dispase I, Protease XIX, Protease XIII, Thrombin, Kallikrein, Elastase, Endoproteinase Glu-C, Proteinase A, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain und Endoproteinase Lys-C.
Beispiel 2: Bestimmung der Kollagenolyse-Aktivität
Schematisch verläuft der Kollagenolyse-Assay nach dem entsprechenden Schema wie der Assay auf die Fibrinolyse-Aktivität.
Die folgenden Tests wurden durchgeführt:
0,25 g Kollagenlösung wurden in 40 ml Puffer A resuspendiert und mit einem Ultraturrax dreimal für 30 s, Stufe 5, behandelt. Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog zum in Beispiel 1 beschriebenen Nachweis der Fibrinolyse-Aktivität.
Folgende Kollagenolyse-Aktivitäten wurden bestimmt: Trypsin: 0,223 U/mg; Protease VIII: 0,119 U/mg; Protease XXIII: 0,118 U/mg; Protease XIX: 0,222 U/mg; Protease aus S. griseus: 0,498 U/mg; Proteinase K: 0,497 U/mg.
Für folgende Proteasen konnte keine Kollagenolyse-Aktivität bestimmt werden: Chymotrypsin, Bromelain, Thrombin, Papain, Protease X, Dispase I, Protease XIII, Protease XVIII, Ficin, Kallikrein, Chymopapain, Elastase, Endoproteinase Glu-C, Proteinase A, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain und Endoproteinase Lys-C.
Beispiel 3: Bestimmung der Plasminogen- Aktivierungs- Aktivität
Das hier vorgestellte erfmdungsgemäße Screeningverfahren zur Bestimmung der Plasminogen-Aktivierungs-Aktivität basiert auf der Verwendung von synthetischen Peptidsubstraten. Dabei handelt es sich um kurze Aminosäureketten, die mit einem Chromophor verknüpft sind. Durch eine Protease-katalysierte Reaktion wird der Chromophor freigesetzt und kann photometrisch bestimmt werden. Neben der hohen Spezifität der eingesetzten Substrate bieten diese Verfahren auch den Vorteil, dass die Reaktion direkt verfolgt werden kann.
Plasmin akzeptiert beispielsweise Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA (pNA = para-Nitroanilin, Farbstoff) als Substrat und spaltet gelbes para-Nitroanilin ab. Im Prinzip wird der mit diesem Substrat entwickelte Assay wie folgt durchgeführt: Zu einer Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA-Lösung wird Plasmin gegeben und bei 37 °C inkubiert. Der Verlauf der Reaktion kann photometrisch anhand des freigesetzten Farbstoffes bei 405 nm verfolgt werden.
Im einzelnen wurde folgendes getestet:
24 im Handel erhältliche Proteasen wurden auf Ihre Eignung zur Plasminogen- Aktivierung getestet. Die Versuche dazu wurden in 100 mM Natriumphosphat-Puffer pH 8, 0,36 mM CaCl2, 0,9% NaCl durchgeführt.
Die in pulverisierter Form gelieferten Proteasen wurden in Puffer gelöst, die in Lösung gelieferten Proteasen wurden direkt eingesetzt bzw. bei Bedarf mit Puffer verdünnt. 25 μl der Protease-Lösungen wurden mit 25 μl Plasminogen (bezogen von Röche, Mannheim, Konzentration 20 mg/ml) vermischt und bei 37°C für 10 Min. inkubiert. Anschließend wurde die Plasmin-Aktivität bzgl. des Substrats N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA bestimmt. Dazu wurden zu 850 μl Puffer 200 μl Substratlösung (9,5 mg N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA, gelöst in 75 mg Glycin/10 ml, 2% Tween® 20) pipettiert, mit den 50 μl des vorinkubierten Plasminogen-Protease-Gemisches versetzt und weiter bei 37°C inkubiert. Die Zunahme der Extinktion wurde photometrisch bei 405 nm gemessen. Zur Messung der durch die Proteasen bedingten Extinktionszunahmen wurden Kontrollen durchgeführt, bei denen anstelle des vorinkubierten Plasminogen-Proteasegemisches ein ebenfalls vorinkubiertes Puffer-Proteasegemisch verwendet wurde.
Die Proteasen Protease aus S. griseus, Protease VIII, Protease XXIII, Protease XIX, Protease XVIII, Ficin, Metalloendopeptidase, Clostripain, Endoproteinase Glu-C, Protease XIII, Chymopapain, Chymotrypsin, Protease X, Bromelain, Kallikrein und Proteinase A wurden von Sigma, Deisenhofen, bezogen; Trypsin, Papain, Endoproteinase Asp-N, Dispase I, Endoproteinase Lys-C, Thrombin und Elastase stammten von Röche, Mannheim, die Proteinase K wurde von QIAGEN, Hilden, geliefert.
Folgende Plasmin- Aktivitäten konnten nach Aktivierung bestimmt werden (1 U/mg = 1 μmol N-Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA-Umsatz pro Minute pro mg Protein): Aktivierung mit Protease aus S. griseus: 613,3 U/mg; Protease VIII: 9 U/mg; Thrombin: 83,0 U/mg; Protease XVIII: 0,7 U/mg; Ficin: 0,01 U/mg; Metalloendopeptidase: 8,9 U/mg; Clostripain: 1,7 U/mg; Endoproteinase Glu-C: 0,6 U/mg; Protease XIII: 0,01 U/mg; Proteinase A: 0,02 U/mg; Trypsin: 11 kU/mg; Endoproteinase Asp-N: 4,3 U/mg und Elastase: 0,63 U/mg.
Für die Proteasen Protease XXIII, Protease XIX, Chymopapain, Endoproteinase Lys-C, Chymotrypsin, Papain, Dispase I, Protease X, Bromelain, Kallikrein und Proteinase K konnte keine Plasminogen-Aktivierung nachgewiesen werden.
Beispiel 4a: Pharmazeutische Formulierungen
Für die pharmazeutischen Formulierungen werden die in den einzelnen Screeningverfahren (s. Beispiele 1 bis 3) als fibrinolytisch, koUagenolytisch und/oder Plasminogen- aktivierend identifizierten Proteasen verwendet:
a) Hydrogele
Basisformulierung für Hydrogele (100 g) Protease(n) 10 - 50.000 U
Hydroxyethylcellulose 400 2,5 - 5,0 g gereinigtes Wasser zu 100,0 g
Die Quellungszeit beträgt 1 bis 3 h.
b) Hydrophile Salbe
Basisformulierung einer hydrophilen Salbe (1000 g):
Protease(n) 100 - 500.000 U wasserfreies Glycerol 85,0 g
Hydroxyethylcellulosel 0.000 32,5 g optional Polyhexanid 0,2 Gew.%
Ringerlösung ohne Lactat zu 1000,0 g
Polyhexanid kann als antimikrobieller Wirkstoff optional in einer Konzentration bis
0,2 Gew.% zugegeben werden.
Anstelle von Hydroxyethylcellulose 10.000 (Natrosol 250® HX PHARM) kann auch
Hydroxyethylcellulose 400 (z.B. Tylose® H 300 oder Natrosol 250® HX PHARM)
c) Salbe
Basisformulierung für Salbe (50 g)
Protease(n) 5 - 25.000 U
Macrogol 400 30,0 - 32,5 g
Macrogol 4000 12,5 - 7,5 g gereinigtes Wasser zu 50,0 g Zubereitung:
12,5 g Macrogol 4000 und 30,0 g Macrogol 400 (bei weichen Salben 7,5 g Macrogol 4000 und 32,5 g Macrogol 400) werden in einer Salbenschale im Wasserbad erwärmt, bis das Macrogol geschmolzen ist. Nach dem Abkühlen wird die entsprechende Menge an Protease(n) gelöst in 7,5 g gereinigtem Wasser zugesetzt und anschließend homogenisiert.
d) Kapseln
Basisformulierung für 0,5 g
Protease(n) 0,05 - 50.000 U
Lactose 0,42 g
Stärke 0,06 g
Magnesiumstearat 0,02 g
e) Injektionslösung / Infusionslösung
Basisformulierung für 100 ml
Protease(n) 10 - 30 Millionen U
Ethanol 0,01 g
Propylenglykol 30 ml gereinigtes Wasser zu 100 ml
Beispiel 4b: Pharmazeutische Formulierungen
Bevorzugt werden die Proteasen in den hierin genannten pharmazeutischen Formulierungen einzeln verwendet. Es können aber auch Kombinationen von zwei oder drei Proteasen eingesetzt werden, wobei sich dann die Menge bezeichnet in Units pro eingesetzter Protease oder als Gesamtaktivität aller Proteasen versteht.
Hydrogele
Basisformulierung für Hydrogele (100g)
Protease(n) 100 U
Hydroxyethylcellulose 10 000 3,5 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,4%, PHB-Ester 0,1%). gereinigtes Wasser ad 100,0
Die Hydroxyethylcellulose bzw. stattdessen Hypromellose bzw. Methylcellulose können alternativ in einer Menge von 0,5 - 15,0 g eingesetzt werden. Gel
Protease(n) 1000 U
Glycerol (85%) 150,0 g
Hydroxyethylcellulose 10 000 32,5 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,4%», PHB-Ester 0,1%)
Ringerlösung ohne Laktat zu 1000,0g
alternativ:
100g enthalten:
Protease(n) 100 U
Hydroxyethylcellulose 30 000 2,5 g
Glycerol 85% 10,0 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%) gereinigtes Wasser ad 100,0
alternativ:
100g Gel enthalten:
Protease(n) 100 U
Polyacrylsäure 1 g
Propylenglykol 8 g
Mittelkettige Triglyceride 8 g
Diethylamin (zur pH-Einstellung) q.s. optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%)
2-Propanol 0 - 1 g
Wasser zu 100g
Hydrophile Salbe (Macrogolsalbe)
50g enthalten
Protease(n) 50 U
Macrogol 400 30,0 g
Macrogol 4000 10,0 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%) gereinigtes Wasser ad 50,0 g alternativ:
wasserfreie Macrogolsalbe
100g enthalten:
Protease(n) 100 U
Macrogol 300 50 g
Macrogol 1500 zu 100 g
alternativ
Wasseraufnehmende Salbe
Proteasefn) 100 U
Cetylstearylalkohol 29 g
Paraffin, dickflüssiges 34 g
Vaselin, weißes zu 100 g
Hydrophobe Salbe
Protease(n) 100 U
Vaseline 80,0 g
Paraffin dünnflüssig zu 100,0 g
Hydrophobe Paste
Protease(n) 100 U
Hypromellose 400 20 g
Vaseline, weißes zu 100 g
alternativ
Protease(n) 100 U
Carbomer (z.B. Carbopol 974p) 15 g
Paraffin, dickflüssiges 40 g weißes Vaselin zu 100,0 g Creme:
Protease(n) 100 U
Mittelkettige Triglyceride 20 g
Emulgierender Cetylstearylalkohol 10 g
Lanolin 10 g
Sorbitol 10 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%, PHB-Ester 0,1%)
Wasser gereinigtes zu 100 g
Nichtionische hydrophile Creme
Protease(n) 100 U
Cetylalkohol 20 g
2- Ethyllauromyristat 10 g
Glycerol 85% 6 g
Kaliumsorbat 0,14 g
Citronensäure 0,07 g
Wasser ad 100 g
Nichtionische Creme
Protease(n) 100 U
Polysorbat 60 5 g
Cetylstearylalkohol 10 g
Glycerol 85% 10 g
Vaselin, weißes 25 g optional Konservierung (Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%), PHB-Ester 0,1 %)
Wasser ad 100 g
Liposomale Formulierung
Protease(n) 100 U
Sojalecithin, Hühnerlecithin 15 g optional Konservierung
(Sorbinsäure/Kaliumsorbat 0,1-0,2%), PHB-Ester 0,1%, bzw. Diazodinylharnstoff l-2g)
Wasser zu 100,0 g Kapsel eine Kapsel mit 0,25g Pulver/Granulat enthält:
Protease(n) 5 U
Stärke 0,1 g
Siliciumdioxid 0,02 g
Magnesiumstearat 0,002 g Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 0,015 g
Triethylcitrat 0,0005 g
Talkum 0,001 g
Cellulose, mikrokristalline zu 0,25 g
alternativ
eine Kapsel mit 0,25g Pulver/Granulat enthält:
Protease(n) 5 U
Siliciumdioxid 0,01 g
Magnesiumstearat 0,002 g
Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 0,015 g
Triethylcitrat 0,0001 g
Talkum 0.001 mg
Mannitol zu 0,25 g
Tablette
100mg Tablettengranulat enthalten
Protease(n) 5 U
Stärke 30 mg
Siliciumdioxid 2 mg
Magnesiumstearat 4 mg
Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 5 mg
Triethylcitrat 0-1 mg
Talkum 0.0001 mg
Cellulose mikrokristalline zu 100 mg Pellets
100g Pellets enthalten:
Protease(n) 2000 U
Stärke 20 g
Sucrosestearat 20 g
Siliciumdioxid 2g
Magnesiumstearat 3g
Polyvinylpyrrolidon 0-lg
Polymethacrylat-Copolymerisate/Polymethacrylsäure 5g
Talkum 0,2 g
Triethylcitrat 0,1g
Cellulose, mikrokristalline zu 100 g
Inj ektionslösung
Protease(n) 500 U
Ethanol 0-lg
Propylenglykol 10 g
Polyethylenglykol 0-lg
Natriumchlorid q.s. optional Puffer CNatriumhydrogenphosphat/Natriumdihydrogenphosphat) gereinigtes Wasser zu 100 ml

Claims

Ansprüche
1. Verwendung von Protease aus Streptomyces (S.) griseus, Protease VIII, Protease XVIII, Ficin, Proteinase K, Protease XXIII, Thrombin, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain, Protease XIX, Chymopapain, Papain, Protease X und/oder Trypsin in der Wundheilung zur Erzielung einer fibrinolytischen, kollagenolytischen und/oder Plasminogen-aktivierenden Wirkung.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Protease aus S. griseus, Protease VIII, Proteinase K, Protease XXIII, Protease XIX und/oder das Trypsin eine Kollagenolyse-Aktivität aufweisen.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Protease aus S. griseus, Protease VIII, Thrombin, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain und/oder das Trypsin eine Plasminogen aktivierende Aktivität aufweisen.
4. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Protease aus S. griseus, Protease VIII, Protease XVIII, Ficin, Proteinase K, Protease XXIII, Chymopapain, Papain und Protease X eine fibrinolytische Aktivität aufweisen.
5. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 4, wobei Trypsin sowohl Plasminogen aktivierende als auch kollagenolytische Aktivität aufweist.
6. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 4, wobei Proteinase K und Protease XXIII sowohl fibrinolytische als auch kollagenolytische Aktivität aufweisen.
7. Verwendung gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 4, wobei die Protease aus S. griseus und die Protease VIII kollagenolytische, fibrinolytische als auch Plasminogen aktivierende Aktivität aufweisen.
8. Verwendung gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die spezifischen Aktivitäten für die Plasminogen-Aktivierung jeweils größer als 1 U/mg sind.
9. Verwendung gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, wobei die spezifischen Aktivitäten für die Kollagenolyse bzw. die Fibrinolyse jeweils größer als 0.1 U/mg sind.
10. Verwendung gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Degradation eines Fibrinclots, zur Aktivierung von Matrix-Metalloproteasen, zur Degradation einer extrazellulären Matrix, zur Prozessierung von Glu-Plasminogen zu Lys-Plasminogen, zur Aktivierung und Freisetzung von Wachstumsfaktoren und/oder zur Aktivierung von endogenem Plasminogen zu Plasmin.
11. Verwendung der Proteasen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder unterstützenden Therapie der Wundheilung.
12. Verwendung der Proteasen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Protease(n) in einer Konzentration von 0,01 - 500 U Protease pro Gramm pharmazeutischer Zusammensetzung oder in einer Konzentration von 0,01 Units - 100 Millionen Units Protease pro 1 - 10 ml Lösung eingesetzt wird.
13. Verwendung der Proteasen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche als anti-thrombotische sowie anti-koagulative Wirkstoffe.
14. Verwendung der Proteasen insbesondere gemäß Anspruch 13 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Venenthrombosen, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akuter Lungenembolie, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefaßverschluss am Auge, Verbrennungen und Erfrierungen, disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation, zur thrombolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierung arteriovenöser Shunts sowie zur Reperfusion verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt.
15. Verwendung der Proteasen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche in Kombination mit einem Antikoagulant.
16. Verwendung der Proteasen gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikoagulant um Heparin, Heparinderivate oder Acetylsalicylsäure handelt.
17. Verwendung der Proteasen gemäß eines der vorhergehenden Ansprüche zum Einbringen in Verbandsmaterialien oder zur Verwendung in Kombination mit Wundheilmitteln.
18. Screeningverfahren zur Identifizierung von für die Wundheilung geeigneten Enzymen, wobei die Enzyme auf ihre Fähigkeit zur Plasminogen-Aktivierung, zur Fibrinolyse und/oder zur Kollagenolyse hin untersucht werden.
19. Screeningverfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Untersuchung auf die Plasminogen-Aktivierung mindestens die folgenden Schritte aufweist:
Bereitstellung des synthetischen Peptids Tosyl-Gly-Pro-Lys-pNA als Substrat,
- Zugabe von einem Gemisch aus Plasminogen und zu untersuchendem Enzym, Inkubation bei einer geeigneten Temperatur und für eine geeignete Zeitspanne und
- photometrischer Nachweis der Plasminogen Aktivierung.
20. Screeningverfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Untersuchung der Kollagenolyse- Aktivität mindestens die folgenden Schritte umfasst:
- Bereitstellung von Kollagen,
- Vermischen von Kollagen und einem zu untersuchenden Enzym, Inkubation für eine geeignete Zeitspanne bei einer geeigneten Temperatur,
- Beendigung der Reaktion und Abtrennung unlöslicher Bestandteile,
- Zugabe von Ninhydrinreagenz,
- Inkubation für eine geeignete Zeitspanne bei einer geeigneten Temperatur und
- photometrischer Nachweis des kollagen-Spaltproduktes.
21. Screeningverfahren gemäß gemäß Anspruch 18, wobei die Untersuchung der fibrinolytischen Aktivität mindestens die folgenden Schritte umfasst:
- Bereitstellung von Fibrin,
- Vermischen von Fibrin und einem zu untersuchenden Enzym,
- Inkubation für eine geeignete Zeitspanne bei einer geeigneten Temperatur, - Beendigung der Reaktion und Abtrennung unlöslicher Bestandteile,
- Zugabe von Ninhydrinreagenz,
- Inkubation für eine geeignete Zeitspanne bei einer geeigneten Temperatur und
- photometrischer Nachweis des Fibrin-Spaltproduktes.
22. Screeningverfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18 - 21, wobei die zu untersuchenden Enzyme aus der Gruppe der Proteasen gewählt wurden.
23. Screeningverfahren gemäß Anspruch 22, wobei solche Proteasen für das Screening verwendet wurden, die unter physiologischen Bedingungen aktiv sind.
24. Protease, erhältlich durch das Screeningverfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 18 - 21.
25. Verwendung der Protease gemäß Anspruch 24 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung und/oder unterstützenden Therapie bei der Wundheilung, insbesondere zur Bereitstellung einer fibrinolytischen, kollagenolytischen und/oder Plasminogen-aktivierenden Aktivität.
26. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend mindestens eine Protease ausgewählt aus der Gruppe, welche Protease aus Streptomyces (S.) griseus, Protease VIII, Protease XVIII, Ficin, Proteinase K, Protease XXIII, Thrombin, Metalloendopeptidase, Endoproteinase Asp-N, Clostripain, Protease XIX, Chymopapain, Papain, Protease X und Trypsin umfaßt, zusammen mit physiologisch verträglichen Trägern, Hilfsstoffen und/oder Lösungsmitteln sowie gegebenenfalls antikoagulativen Wirkstoffen.
27. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 26 enthaltend Protease aus Streptomyces (S.) griseus, Proteinase K und/oder Trypsin.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 26 oder 27 geeignet zur oralen, topischen oder parenteralen, insbesondere intravenösen, intravasalen, intraperitonealen, subkutanen oder intramuskulären Anwendung.
29. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 26 - 28 geeignet zur topischen Applikation, enthaltend 0,1 - 500 U Protease pro Gramm der pharmazeutischen Zusammensetzung, bevorzugt 0,5 - 250 Units und insbesondere bevorzugt 1 - 150 Units Protease pro Gramm der pharmazeutischen Zusammensetzung.
30. Pharmazeutische Zusammensetzung geeignet zur oralen Applikation gemäß einem der Ansprüche 26 - 28, enthaltend 0,1 - 100.000 U Protease pro Gramm der pharmazeutischen Zusammensetzung, bevorzugt 100 - 80.000 Units und insbesondere bevorzugt 1.000 - 50.000 Units Protease pro Gramm der pharmazeutischen Zusammensetzung.
31. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 26 - 28 geeignet zur Injektion oder Infusion, enthaltend 0,1 Unit - 100 Millionen U Protease pro 10 ml Lösung, bevorzugt 1 Unit - 10 Millionen Units und insbesondere bevorzugt 10 Units - 1 Millionen Units Protease pro 10 ml der Injektions- oder Infusionslösung.
32. Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 26 - 31 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Herzinfarkt, Thrombose, Venenthrombosen, Restenose, Hypoxie, Ischämie, Koagulationsnekrose, Entzündungen der Blutgefäße, akuter Lungenembolie, akuter und subakuter arterieller Thrombosen, frischen oder älteren Gerinnsel bei Venenthrombosen, tiefen Venenthrombosen des Beckens und der Extremitäten, Frühthrombosen im Bereich desobliterierter Gefäße, akuter Zentralgefäßverschluss am Auge, Verbrennungen und Erfrierungen,- disseminierter intravasaler Gerinnung im Schock, akuter arterieller Verschlüsse der Extremitäten, chronisch occlusiver Arteriopathien, Thrombosierung von arteriovenösen Shunts sowie zur Behandlung nach einem Herzinfarkt, nach einer Bypass-Operation, nach einer Angioplastie sowie nach einer Ballondilatation, zur thrombolytischen Therapie beim akuten Herzinfarkt, zur Rekanalisierung arteriovenöser Shunts sowie zur Reperfusion verschlossener Koronararterien beim akuten Herzinfarkt.
EP03708017A 2002-02-06 2003-02-06 Protease-screening und neue verwendung von proteasen Withdrawn EP1471935A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03708017A EP1471935A2 (de) 2002-02-06 2003-02-06 Protease-screening und neue verwendung von proteasen

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02002706 2002-02-06
EP02002706 2002-02-06
US35781002P 2002-02-21 2002-02-21
US357810P 2002-02-21
EP03708017A EP1471935A2 (de) 2002-02-06 2003-02-06 Protease-screening und neue verwendung von proteasen
PCT/DE2003/000342 WO2003066088A2 (de) 2002-02-06 2003-02-06 Protease-screening und neue verwendung von proteasen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1471935A2 true EP1471935A2 (de) 2004-11-03

Family

ID=56290377

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP03708017A Withdrawn EP1471935A2 (de) 2002-02-06 2003-02-06 Protease-screening und neue verwendung von proteasen

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1471935A2 (de)
AU (1) AU2003212195A1 (de)
WO (1) WO2003066088A2 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI417113B (zh) 2006-11-07 2013-12-01 Acambis Inc 以凍乾法穩定疫苗
FR2966734B1 (fr) 2010-10-29 2014-07-18 Max Rombi Composition comprenant au moins une enzyme proteolytique pour son utilisation pour empecher la synthese des triglycerides

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5826822A (ja) * 1981-08-10 1983-02-17 Kaken Pharmaceut Co Ltd 慢性腎炎治療剤
WO1984002846A1 (en) * 1983-01-21 1984-08-02 Advanced Drug Tech Enzyme ointment
CS249311B1 (en) * 1983-09-29 1987-03-12 Jaroslava Turkova Proteolytic wound dressing
AU583592B2 (en) * 1985-01-18 1989-05-04 Kailash Kumar Gauri Protein hydrolysates for pharmaceutical use
US4784653A (en) * 1987-06-22 1988-11-15 Johnson & Johnson Patient Care, Inc. Absorbent adhesive dressing
US5206026A (en) * 1988-05-24 1993-04-27 Sharik Clyde L Instantaneous delivery film
EP0456724B1 (de) * 1989-01-27 1995-05-03 Immunolytics, Inc. Zusammensetzung und verfahren für die behandlung gutartiger prostata-hypertrophie
EP0498532A1 (de) * 1991-01-10 1992-08-12 E.R. SQUIBB &amp; SONS, INC. Proteolytische Enzyme enthaltende Puderzusammensetzung zur Entfernung von nekrotischem Gewebe
GB9207288D0 (en) * 1992-04-02 1992-05-13 Unilever Plc Cosmetic composition
WO1995023614A1 (en) * 1994-03-01 1995-09-08 E.R. Squibb & Sons, Inc. Enzymatic debridement compositions and methods
US20030021775A1 (en) * 2001-07-27 2003-01-30 Ramot University Authority For Applied Research & Industrial Development Ltd. Device for and method of controlled enzymatic removal and retrieval of tissue

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO03066088A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003212195A1 (en) 2003-09-02
WO2003066088A3 (de) 2004-04-01
WO2003066088A2 (de) 2003-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69735308T2 (de) Enzymzusammensetzung für die freisetzung von zellen aus geweben.
DE2708065C2 (de) Mittel zur enzymatischen Behandlung des Katarakts
EP1825865B1 (de) Stabilisierte Zubereitungen von Serin-Endopeptidasen, deren Herstellung und Verwendung
DE60015112T2 (de) Peptidextrakt aus lupinen und pharmazeutische oder kosmetische oder pharmaco-nahrungsmittel zusammensetzung, die so ein extrakt enthalten
EP0181465B1 (de) Blutgerinnungshemmende Proteine, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung
DE4214215A1 (de) Verwendung von inhibitoren von plasminogenaktivatoren zur behandlung von entzuendungen
EP0107634A2 (de) Enzymzusammensetzung zum Reinigen, deren Anwendung und Herstellung der Zusammensetzung
DE3888082T2 (de) Cysteinprotease, Herstellung und Verwendung.
DE69123099T2 (de) Vibrio-produzierte Protease enthaltende Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung in Debridement und Wundheilung
Sylvén et al. Studies on the histochemical “leucine aminopeptidase” reaction: IV. Chemical and histochemical characterization of the intracellular and stromal LNA reactions in solid tumor transplants
DE69635977T2 (de) Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirkung von Metalloproteinase-Verbindungen, neue Inhibitor-Verbindungen und deren therapeutische Verwendung
EP0743070A2 (de) Verwendung von Protease-Proenzymen und Amylasen als Wirkstoffe in pharmazeutischen Mitteln zur Krebstherapie sowie ihre Herstellung
DE4323754C1 (de) Bifunktionelle Urokinasevarianten mit verbesserten fibrinolytischen Eigenschaften und thrombinhemmender Wirkung
AT397390B (de) Verfahren zur spaltung von proteinen
EP1471935A2 (de) Protease-screening und neue verwendung von proteasen
DE69009706T2 (de) Thrombolytische Mittel.
EP1096951B1 (de) Verwendung von bromelainproteasen zur hemmung der blutgerinnung
EP1056839A1 (de) Pharmazeutische formulierung enthaltend ein hyaluronsäure-spaltendes enzym mikrobieller herkunft
JP2002526382A (ja) 皮膚創傷の治療へのプロテアーゼ阻害剤の使用
DE69833727T2 (de) Verfahren zur Behandlung der Gefässerkrankungen mit aktiviertem Protein C
DE2047317C3 (de) Verfahren zur Herstellung einer Protease mit der Bezeichnung AM-Protease aus dem Pilz Armiüaria mellea, diese Protease selbst und sie enthaltende pharmazeutische Stoffzusammensetzungen
DE19726255C2 (de) Beeinflussung von Cytokinen durch proteolytische Enzyme und Rutosid
JP3805975B2 (ja) 創傷治癒剤
DE60028372T2 (de) Methode zum auswerten der in vivo matrix-metalloproteinasen hemmenden aktivität
US5112805A (en) Pharmaceutical preparation for promoting epithelial healing and prevention of epithelial destruction

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20040729

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LI LU MC NL PT SE SI SK TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: AL LT LV MK RO

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20060829