JP7127013B2 - 表面から細菌バイオフィルムを低減または除去するためのサーモリシンの使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年7月27日に出願された米国特許仮出願第62/367,338号に対する利益を主張する。参照出願の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の組成物は、サーモリシンを含む。サーモリシンは、Bacillus thermoproteolyticus rokkoと呼ばれる細菌種から、発酵プロセスにより作られる熱安定性のメタロプロテイナーゼであり、疎水性残基ロイシン、フェニルアラニン、バリン、イソロイシン、アラニン、及びメチオニンのN末端で切断を行う。Amano Japanがサーモリシンの製造業者及び供給元である。サーモリシンは単離及び/または精製することができる。サーモリシンのCAS番号は9073-78-3である。
本発明の組成物は、医薬製品及び局所用製品、ならびに非生物学的表面への適用のために設計された製品(例えば、医療デバイス)の製造についての技術分野で公知の方法及び設備により、製造することができる。このような方法としては、以下に限定されないが、機械的ミキサー(LIGHTNINプロペラミキサーを含む)、COWLESディゾルバー、SILVERSONディスパーサー、逆回転サイドスクラッピングミキサー、ホモジナイザー及びディスパーサー(インラインまたはインタンクのローター-ステーターホモジナイザーを含む)、及びミル(3ロールミル、軟膏ミル、またはローター-ステーターミルを含む)の使用が挙げられる。回転サイドスクラッピングミキサー及びインタンクホモジナイザーを有する「オールインワン」真空混合システムも使用することができる。このようなミキサーとしては、以下に限定されないが、OLSAミキサー、FRYMA-KORUMAミキサー、及びLEE TRI-MIX TURBO-SHEARケトルが挙げられる。本発明の組成物は、小規模の実験室スケールバッチからフルスケールの生産バッチまで製造することができる。
本発明の組成物は、グラム陽性及びグラム陰性両方の細菌バイオフィルムにおける細菌の低減及び/または細菌バイオフィルムの除去に適している。また、当該組成物は、このようなバイオフィルムが医療デバイスなどの表面上に形成するのを防止するために使用することもできる。グラム陽性細菌の非限定的な例としては、Staphylococcus spp.、例えば、Staphylococcus aureus、メチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)、及びStaphylococcus epidermidis;Streptococcus spp.、例えば、Streptococcus pneumonia;Bacillus spp.;Listeria monocytogenes;enterococci spp.;ならびに乳酸菌、例えば、Lactobacillus plantarum及びLactococcus lactisが挙げられる。グラム陰性細菌の非限定的な例としては、Pseudomonas spp.、例えば、Pseudomonas aeruginosa;及びEscherichia coliが挙げられる。
in vitroのバイオフィルムモデルを使用して、細菌バイオフィルムに対する本発明の製剤のバイオフィルム有効性を評価した。細菌を、血液寒天プレート上のフィルター上に置いたコラーゲンマトリックス上にスポットし、インキュベートしてバイオフィルム形成を行う。当該モデルは、バイオフィルムの下方から栄養が提供され、局所処置が上方の空気界面に適用される点において、in vivoの創傷バイオフィルムを模倣している。このin vitroのモデル及び方法論は、2010年4月18日にOrlando、FLでの2010 Wound Healing Society Annual Meeting,Poster BRC09で提示されたポスター発表、A Versatile In Vitro Biofilm Model Using Two Wound Pathogens to Screen Formulations,Van der Kar,et al.で開示されている。さらなるin vitroのバイオフィルムモデル及び方法論は以下の刊行物に開示されており、これらの全てが参照により本明細書に組み込まれる。Penetration of Rifampin through Staphylococcus epidermidis Biofilms,Zheng,et al.,Antimicrobial Agents and Chemotherapy,Mar.2002,p.900-903;Oxygen Limitation Contributes to Antibiotic Tolerance of Pseudomonas aeruginosa in Biofilms,Borriello et al.,Antimicrobial Agents and Chemotherapy,July 2004,p.2659-2664;及びHeterogeneity in Pseudomonas aeruginosa Biofilms Includes Expression of Ribosome Hibernation Factors in the Antibiotic-Tolerant Subpopulation and Hypoxia-Induced Stress Response in the Metabolically Active Population,Williamson et al.,Journal of Bacteriology,February 2012,p.2062-2073.
本発明の組成物は、生物学的表面及び非生物学的表面上の細菌バイオフィルムにおける細菌の低減及び/または細菌バイオフィルム除去に有用であり、また、細菌バイオフィルムで感染または汚染された創傷、皮膚病変、粘膜病変、及び他の生物学的表面の処置にも有用である。また、当該組成物は、バイオフィルムが成長または形成しやすい表面(例えば、医療デバイス)上におけるバイオフィルムの成長または形成の防止に使用することもできる。細菌バイオフィルムで感染または汚染された創傷、粘膜病変、皮膚病変、または他の生物学的表面を処置する方法であって、当該方法が、当該創傷、粘膜病変、皮膚病変、または他の生物学的表面に、サーモリシンを含む組成物を局所投与することを含み、当該細菌バイオフィルムが低減または除去される、方法が開示されている。次に、当該組成物による処置の後に、医薬的活性成分、美容的活性成分、傷薬、創傷治癒剤、抗生剤、抗真菌剤、防腐剤、清浄剤、及び/または抗菌剤を含む他の組成物が、さらなる処置のために、創傷、粘膜病変、皮膚病変、または生物学的表面に投与されてもよい。
本発明の組成物は、当該組成物を生物学的表面に投与することにより、生物学的表面上の細菌バイオフィルムの低減または除去に有用である。生物学的表面の非限定的な例としては、創傷(慢性創傷及び急性創傷を含む)、皮膚病変、皮膚、粘膜、粘膜病変、内臓、体腔、口腔、骨組織、筋組織、神経組織、眼組織、尿路組織、肺及び気管組織、洞性組織、耳組織、歯科組織、歯肉組織、鼻組織、血管組織、心臓組織、上皮、上皮病変、及び腹膜組織が挙げられる。慢性創傷の非限定的な例としては、糖尿病性足部潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、圧迫潰瘍、及び熱傷が挙げられる。急性創傷の非限定的な例としては、切開及び外科的創傷が挙げられる。皮膚病変及び粘膜病変の非限定的な例としては、疱疹、潰瘍、擦過傷、疣贅、膿瘍、掻爬、ならびに皮膚及び粘膜の感染症、例えば、ブドウ球菌またはMRSAの感染症が挙げられる。皮膚病変及び粘膜病変の例は、“Description of Skin Lesions”,MacNeal,Robert J.,the on-line Merck Manual Professional Version,March 2013,http://www.merckmanuals.com/professional/dermatologic-disorders/approach-to-the-dermatologic-patient/description-of-skin-lesionsに開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。皮膚病変は、表皮、唇、耳道、頭皮、甘皮、爪床、または生殖器に出現し得る。粘膜病変は、口腔粘膜、鼻粘膜、陰茎及び膣の粘膜、または肛門に出現し得る。
本発明の組成物は、当該組成物を細菌バイオフィルムに感染または汚染された創傷(慢性創傷及び急性創傷を含む)局所投与することにより、当該創傷の処置に有用である。慢性創傷の非限定的な例としては、糖尿病性足部潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、圧迫潰瘍、及び熱傷が挙げられる。急性創傷の非限定的な例としては、切開及び外科的創傷が挙げられる。一部の実施形態において、当該創傷は、焼痂及び/または壊死組織を含み、デブリードマンを必要とする。様々な実施形態において、当該組成物は二重の機能を果たし、創傷内に存在する細菌バイオフィルムを低減または除去することに加えて、さらに、デブリードマンを必要とする創傷のデブリードマンを行う。他の実施形態において、当該創傷は、焼痂及び/または壊死組織を含まず、デブリードマンを必要としない。
本発明の組成物は、当該組成物を細菌バイオフィルムに感染または汚染された皮膚病変または粘膜病変に局所投与することにより、当該皮膚病変または粘膜病変の処置に有用である。皮膚病変及び粘膜病変の非限定的な例としては、疱疹、潰瘍形成、擦過傷、疣贅、膿瘍、掻爬、ならびに皮膚及び粘膜の感染症、例えば、ブドウ球菌またはMRSAの感染症が挙げられる。皮膚病変は、表皮、唇、耳道、頭皮、甘皮、爪床、または生殖器に出現し得る。粘膜病変は、口腔粘膜、鼻粘膜、陰茎及び膣の粘膜、または肛門に出現し得る。一部の実施形態において、当該粘膜病変または皮膚病変は、焼痂及び/または壊死組織を含み、デブリードマンを必要とする。様々な実施形態において、当該組成物は二重の機能を果たし、病変内に存在する細菌バイオフィルムを低減または除去することに加えて、さらに、デブリードマンを必要とする病変のデブリードマンを行う。他の実施形態において、当該粘膜病変または皮膚病変は、焼痂及び/または壊死組織を含まず、デブリードマンを必要としない。
本発明の組成物は、当該組成物を細菌バイオフィルムに感染または汚染された他の生物学的表面に局所投与することにより、当該生物学的表面の処置に有用である。他の生物学的表面の非限定的な例としては、内臓、体腔、口腔、骨組織、筋組織、神経組織、眼組織、尿路組織、肺組織、気管組織、洞性組織、耳組織、歯科組織、歯肉組織、鼻組織、血管組織、心臓組織、上皮組織、上皮病変、膣組織、及び/または腹膜組織が挙げられる。
本発明の組成物は、当該組成物を非生物学的表面(例えば、医療デバイスのような製造品の表面)に投与することにより、当該非生物学的表面上の細菌バイオフィルムの低減または除去に有用である。また、当該組成物は、このような非生物学的表面上にバイオフィルムが成長または形成するのを防止するために使用することもできる。このような表面は、ヒトの組織及び/または創傷への曝露により、バイオフィルムが成長または形成しやすい可能性がある。医療デバイスの非限定的な例としては、人工尿路、尿路カテーテル、腹膜カテーテル、腹膜透析カテーテル、血液透析用及び化学療法剤の長期投与用留置カテーテル(ヒックマンカテーテル)、心臓インプラント(例えば、ペースメーカー、人工心臓弁、心室補助デバイス、ならびに合成血管移植片及びステント)、人工器官、経皮縫合糸、ならびに気管及び人工呼吸器チューブが挙げられる。
サーモリシンの細菌バイオフィルム低減能力を実証するため、in vitroアッセイを実施した。このアッセイでは、S.aureus ATCC 6538を、最適な細菌バイオフィルム形成のために0.25%のグルコースを追加したトリプシンダイズブロスの成長培地に懸濁させた。懸濁液を無菌96ウェルプレートのウェルに移し、37℃で22時間インキュベート(培地を1回交換)した。細菌バイオフィルムの形成後、成長培地を、様々な濃度で成長培地に溶解したサーモリシンの溶液と、同じ濃度で成長培地に溶解したコラゲナーゼの溶液とで置き換えた(酵素濃度は、0.000001mg/mL、0.00001mg/mL、0.0001mg/mL、0.001mg/mL、0.01mg/mL、0.1mg/mL、1.0mg/mL、及び10mg/mLとした)。16時間後、残存する付着細菌の定量化を、酵素溶液(酵素+成長培地)を吸引し、プレートを十分に洗浄し、次にクリスタルバイオレット染色を行い、570nmにおける吸光度を記録することにより行った。酵素を伴わない対照も試験した。クリスタルバイオレットは、残存する付着細菌を染色した。対照と比較しての吸光度低下は、付着細菌の低減を示し、細菌バイオフィルムの低減が生じたことを意味する。図1は、これらのデータの概要を示している。図1に示されるように、サーモリシンは、0.00001mg/mL~10mg/mLの濃度で細菌バイオフィルムの低減に有効であり、この濃度のコラゲナーゼよりも細菌バイオフィルムの低減にはるかに有効であった。この発見における驚くべき性質は、プロテアーゼがそれ自体は細菌バイオフィルムの低減または除去において過度に有効であるとは考えられていないという一般的知識に基づくものである。
Claims (13)
- 細菌バイオフィルムで感染または汚染された創傷、粘膜病変、または皮膚病変を処置するための、サーモリシン及び医薬的に許容される担体を含む組成物であって、
前記組成物は創傷、粘膜病変、または皮膚病変に局所投与され、
前記創傷、粘膜病変、または皮膚病変は壊死組織を含まず、且つデブリードマンを必要とせず、
前記細菌バイオフィルムが低減または除去される、組成物。 - 前記細菌バイオフィルムがグラム陽性細菌バイオフィルムである、請求項1に記載の組成物。
- 前記細菌バイオフィルムがグラム陰性細菌バイオフィルムである、請求項1に記載の組成物。
- 前記創傷が慢性創傷であり、前記慢性創傷が、糖尿病性足部潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、圧迫潰瘍、または熱傷である、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記創傷、粘膜病変、または皮膚病変上の前記細菌バイオフィルムの低減または除去をもたらす量のサーモシリンを含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
- 抗菌剤をさらに含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- 細菌バイオフィルムで感染または汚染された生物学的表面上の細菌バイオフィルムを低減または除去するための、サーモリシン及び医薬的に許容される担体を含む組成物であって、
前記組成物は生物学的表面に局所投与され、
前記生物学的表面は壊死組織を含まず、且つデブリードマンを必要としない、組成物。 - 前記生物学的表面が慢性創傷であり、前記慢性創傷が、糖尿病性足部潰瘍、静脈潰瘍、動脈潰瘍、褥瘡性潰瘍、うっ血性潰瘍、圧迫潰瘍、または熱傷である、請求項7に記載の組成物。
- 前記生物学的表面が、皮膚病変、粘膜病変、内臓、体腔、口腔、骨組織、筋組織、神経組織、眼組織、尿路組織、肺組織、気管組織、洞性組織、耳組織、歯科組織、歯肉組織、鼻組織、血管組織、心臓組織、上皮組織、上皮病変、膣組織、または腹膜組織である、請求項7に記載の組成物。
- 前記細菌バイオフィルムがグラム陽性細菌バイオフィルムである、請求項7~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細菌バイオフィルムがグラム陰性細菌バイオフィルムである、請求項7~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記生物学的表面上の前記細菌バイオフィルムの低減または除去をもたらす量のサーモリシンを含む、請求項7~11のいずれか一項に記載の組成物。
- サーモリシンの濃度が0.0001mg/mL~10mg/mLである、請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物。
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