NO324623B1 - Kalsiumfosfopeptidkomplekser, fremgangsmate for fremstilling av slike, avleveringsbaerere, farmasoytiske-, antikariogene- og terapeutiske sammensetninger, kosttilskudd samt ulike anvendelser av nevnte komplekser. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører nye komplekser hvori amorfe kalsiumfosfater er stabilisert ved fosfopeptider. Disse kompleksene har anti-kariogeniske effekter, og kan også bli brukt som kostsupplementer for å øke kalsiumbiotilgjengeligheten og for å hele eller forhindre sykdommer assosiert med kalsiummangler. Anvendelse av nevnte komplekser for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling eller forhindring av tannkaries eller tann-nedbryting og/eller for behandling av en eller flere tilstander relatert til kalsiumtap fra kroppen slik som bein, kalsiummangel og kalsiumfeilabsorpsjon er også omfattet av foreliggende oppfinnelse.

Tannkaries

Tannkaries blir initiert ved demineralisering av hardt vev på tennene ved organiske syrer produsert fra fermeteringen av sukker i kosten ved tannplaque odontopatogenisk bakterie.

Selv om forekomsten av tannkaries har blitt mindre ved bruk av fluorid i de fleste utviklingsland, gjenstår sykdommen som et stort helseproblem. Den estimerte økonomiske byrden for å behandle tannkaries i Australia i 1991 var $ 471 mill. som er høyere enn for andre kostrelaterte sykdommer inklusive koronar hjertesykdom, hypertensjon eller slag.

I utviklingsland hvor tilgjengeligheten og industrialiserte matprodukter er økende, er prevalensen av tannkaries også økende. Nylige studier har vist et antall av sosiodemografiske variabler assosiert med risikoen for å utvikle karies; høy risiko er assosiert med etnisitet og lav sosioøkonomisk status. Nivå av høyrisikoindivider har forblitt konstant selv om den samlede alvorlighetsgrad og prevalens av sykdommen i samfunnet har minsket. Tannkaries er derfor, fortsatt et stort helseproblem, spesielt i etniske og lavere sosioøkonomiske grupper. Dette viser behovet for et ikke-toksisk antikarsiogent middel som kan supplere effektene av fluorid til ytterligere å minske insidensen av tannkaries. Et middel som ville redusere dosen av fluorid som kreves for å redusere insidensen av karies ville være spesielt ønskelig når en tar i betraktning samfunnsengstelsen for fluorid, og med hensyn til det faktum at fluorosis kan utvikles selv ved vanlige brukte doser.

Matgruppen som man vet utviser antikariesaktivitet i kostproduktene (melk, melkekonsentrater, pulver og ost); US patent nr. 5,130,123 beskriver komponenten som er ansvarlig for denne antikariogene aktiviteten som kasein. Imidlertid er anvendelsen av kasein som et anti-kariogen middel utelukket på grunn av skadelige organoleptiske egenskaper og de svært høye nivåene som kreves for aktivitet.

Preliminære undersøkelser har vist at tryptisk kasein fosfopeptider bidrar til antikariogen aktivitet og dette ble vist i US patent nr. 5,015,628. Spesielt ble peptidene Bos asi-kasein X-5P (f59-79) [1], Bos fi-kasein X-4P (fl-25), Bos as2-kasein X-4P (f46-70) [3] og Bos as2-kasin X-4P (fl-21) [4] beskrevet i US patent 5,015,628 som følger: [ 1 ] Gln<59->Met-Glu-Ala-Glu-Ser(P)-Ile-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Ser(P)-Val-Glu-Gln-Lys<79>.asi(59-79)

[2] Arg^Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Glu-SerCPJ-Leu-SerCP)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg25. 6(1-25)

[3] Asn<46->Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser(P)-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys<70>. as2(46-70)

[4] Lys<1->Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Ser(P)-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys<21>. as2(l-21).

Videre er det fra WO93/03707 kjent at visse casein fosfopeptider (CPP) bindes til fast kalsiumfosfat og at disse kan inhiberer vekst av kalsiumfosfat krystaller. Spesielt nevnes det at CPP kan hindre transformasjonen av ACP til HA, og på den måten inhibere dannelsen av calculus på tannoverflaten.

Fra proceedings of the Nutrition Society of Australia, E.C. Reynolds er det kjent at CPP-ACP komplekser som er dannet ved pH<7 oppviser anti-karriogene effekter samt at slike komplekser kan være anvendelige ved remineralisering av emaljeskader.

Den preliminære bestemmelsen av de ovenfornevnte fosfopeptider for bruk i kombinasjon med CaHPCM og hydroksyapatid tilveiebragte nye peptider som har anti-kariogene egenskaper. Imidlertid har etterfølgende undersøkelser vist at Ser(P) cluster sekvens motivet innen de tidligere beskrevne fosfopeptidene har den uventede egenskapen å stabilisere deres egen vekt i amorf kalsiumfosfat. Evnen til de ovenfornevnte fosfopeptider og spesielt Ser(P) motivet til å stabilisere amorf kalsiumfosfat var svært uventet og ikke beskrevet eller vist i noen publikasjoner kjent for søkerne. Vi har nå funnet at den amorfe formen av kalsiumfosfat Ca3(P04)i.87(HP04)o.2x H20 vare x > 1 stabilisert med kaseinfosfider og er den mest løselige, basiske formen av ikke krystallinsk kalsiumfosfat og en overlegen form av kalsiumfosfat som forhindrer karies og øker kalsiumbiotilgjengeligheten. Amorft kalsiumfosfat (ACP) må dannes ved forsiktig filtrering av Ca-ioner (for eksempel CaCh) og fosfationer (for eksempel Na HPO4) mens en opprettholder pH over 7 (fortrinnsvis 9,0) med tilstedeværelse av fosfopeptidet. Når ACP blir dannet, binder fosfopeptidet til den nærliggende kjernen og stabiliserer ACP som et fosfopeptid-ACP-kompleks. Uten fosfopeptidet, vil ACP presipitere ut av løsningen og transformeres innen minutter til den mest stabile kalsium-fosfatfasen, krystallin hydroksyapatitt (HA). HA som er uløselig har begrenset anti-kariogen aktivitet og presenterer kalsium i en dårlig biotilgjengelig form. Den sure fasen av kalsiumfosfat CaHPCM som helt sikkert er mer løselig enn hydroksyapatitt, bindes dårlig av fosfopeptidet og lokaliseres dårlig på tannoverflaten og har derfor også begrenset antikariogen aktivitet. Den uventede evnen til de før nevnte fosfopeptidene og spesielt Ser(P) cluster motivet for å stabilisere amorft kalsiumfosfat var ikke beskrevet eller vist i US patent nr. 5,015,628 og tilveiebringer for første gang en pålitelig og effektiv metode for å produsere et stabilisert amorft kalsiumfosfatkompleks som har distinkte og nye fordeler i kalsiumbehandlinger og avlevering. US patent nr. 5,015,628 beskriver ikke denne unike amorfe kalsiumfluoirdfosfatfasen Ca8(P04)sF x H2) hvor x > 1 som vi nå har funnet å være stabilisert ved de ovenfornevnte fosfopeptider og kan bli lokalisert på tannoverflaten for å tilveiebringe overlegen antikaries effektivitet. Denne uventede evnen til å stabilisere amorft kalsiumfosfat danner basis for den foreliggende oppfinnelsen.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

I et første aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et stabilt kalsiumfosfatkompleks som omfatter en løselig basisk form av amorft kalsiumfosfat eller amorft kalsiumfluoridfosfat som er stabilisert av fosfopeptider, hvori nevnte fosfopeptider omfatter aminosyreskevensen Ser(P)- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu og hvori komplekset er dannet ved en pH>7.

I en utførelsesform er komplekset dannet ved en pH på omtrent 9.

Når komplekset dannes av fosfopeptid stabilisert av amorft kalsiumfluorfosfat, kan kalsiumfluorfosfatet være av den omtrentlige formelen [Cag(P04) Fx H2O] hvor x > 1. Komplekset kan ytterligere inkludere HPO4 som en liten valgfri komponent til komplekset. HPO4 tror man virker som et dekke for ACP cluster. Når komplekset tar den alternative formen av en stabil løselig alkalisk kalsiumfosfatkompleks som inkluderer stabilisert amorft kalsiumfosfat kan det amorfe kalsiumfosfatet være av en tilnærmet formel [Ca3(P04) H20] hvor x > 1.

Komplekset kan ytterligere inkludere HPO4 som en liten eventuell komponent. Komplekset har fortrinnsvis en pH på omtrent 9,0.

Fosfopeptider (PP) kan være fra en hvilken som helst kilde; det kan erverves ved tryptisk fordøying av kasein eller andre fosfosyrerike proteiner som fosfitin eller ved kjemisk eller rekombinant syntese, forutsatt at den omfatter kjernesekvensen -Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-. Sekvensen som flankerer denne kjernesekvensen kan være en hvilken som helst sekvens. Imidlertid er disse flankerende sekvenser i asi (59-79) [1], J3(l-25) [2], cts2 (46-70) [3] og as2 (1-21) [4] foretrukne. De flankerende sekvensene kan eventuelt bli modifisert ved delesjon, addisjon eller konservativ substitusjon av en eller flere residuer. Aminosyresammensetningen og sekvensen til den flankende region er ikke kritisk så lenge som konformasjonen av peptidet blir opprettholdt og at alle fosforyl og karboksylgruppene som interagerer med kalsiumioner blir opprettholdt som de foretrukne flankerte regioner ser ut til å bidra til den strukturelle virkningen til motivet.

Komplekset som dannes har fortrinnsvis formelen [(PP)(CP)g)n hvor n er lik eller større enn 1, for eksempel 6. Komplekset som dannes kan være et kolloidalt kompleks.

Fosfopeptidet bindes til ACP-cluster for å produsere en metastabil løsning hvori vekst av ACP til en størrelse som initierer nukleering og presipitering blir forhindret. På denne måten kan kalsium og andre ioner slik som fluorioner bli lokalisert for eksempel på en overflate på en tann for å forhindre demineralisering og forhindre dannelsen av dental karies.

Et andre aspekt ved oppfinnelsen vedrører en avleveringsbærer tilpasset for å samlokalisere ioner, slik som kalsium, fluor og fosfat, til et målsted, kjenentegnet ved at nevnte avleveringsbærer inneholder komplekset ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen.

Kalsiumkomplekset kan inneholde 0,05-50% ved vekt av sammensetning, fortrinnsvis 1,0-50%. For orale sammensetninger er det foretrukket at mengden av CPP-ACP og/eller CPP-ACFP administrert er 0,05-50% ved vekt, fortrinnsvis 1,0% - 50% ved vekt av sammensetningen. Den orale sammensetningen fra denne oppfinnelsen som inneholder de ovennevnte midlene kan bli fremstilt og brukt i forskjellige former anvendbare for munnen slike som tannartikler som inkluderer tannpasta, tannpulver og flytende tannmidler, munnvask, "troches", tyggegummi, dentale pastaer, kjevemassasjekremer, gurgletabletter, melkeprodukter og andre matvarer. Den orale sammensetningen ifølge denne oppfinnelsen kan ytterligere inkludere i tillegg velkjente ingredienser avhengig av type og form av den spesielle orale sammensetningen.

I visse svært foretrukne former av oppfinnelsen kan den orale sammensetningen være vesentlig flytende, slik som munnvask eller munnrens. I slik fremstilling er bindemidlet typisk en vannalkoholblanding ønskelig som inkluderer et fuktmiddel som beskrevet under. Generelt er vektforholdet av vann til alkohol i området fra omtrent 1:1 til omtrent 20:1. Den totale mengden av vann-alkoholblanding i denne type av fremstilling er typisk innen området på fra omtrent 70 til omtrent 99,9% ved vekt av fremstillingen. Alkoholen er typisk etanol eller isopropanol. Etanol er foretrukket.

pH'en av en slik flytende væske og andre fremstillinger fra oppfinnelsen er generelt i området fra omtrent 5 til omtrent 9 og typisk fra omtrent 7,0 til 9,0. pH'en kan bli kontrollert med syre (for eksempel sitronsyre eller bensoinsyre) eller base (for eksempel natriumhydroksid) eller bufferet (som med natriumsitrat, bensoat, karbonat eller bikarbonat, dinatriumhydrogenfosfat, natriumdihydrogenfosfat, etc.).

I andre ønskelige former av denne oppfinnelsen kan den orale sammensetningen være vesentlig fast eller av pastakarakter, slik som tannpulver, en dental tablett eller en tannkrem (dental krem) eller gel "dentifrice". Bindemidlet av en slike faste eller pasta-orale fremstillinger inneholder generelt akseptabel poleringsmateriale for tennene. Eksemplet på poleringsmateriale er vannuløselig natriummetafosfat, kaliummetafosfat, trikalsiumfosfat, dihydrert kalsiumfosfat, anhydrert dikalsiumfosfat, kalsiumpyrofosfat, magnesiumortofosfat, trimagnesiumfosfat, kalsiumkarbonat, hydrert alumina, kalsinert alumina, aluminiumsilikat, sirkonium silikat, silika, bentonit, og blandinger derav. Andre egnede poleringsmateriale inkluderer de spesielle termosettende resiner slike som melamin, fenol, og urea-formaldehyder, og kryssbundne polyepoksider og polyestere. Foretrukne poleringsmaterialer inkluderer krystallinsk silika som har partikkelstørrelse på opp til omtrent 5 mikron, en gjennomsnitts partikkel størrelse på opp til omtrent 1,1 mikron, og et overflate areal på omtrent 50.000 cm<2>/gm, silikagel eller kolloidal silika, og kompleks amorft alkalisk metall aluminiumssilikat.

Når visuelt klare geler anvendes er et poleringsmiddel av kolloidal silika, slik som de som selges under varemerket S YLOID som Syloid 72 og Syloid 74 eller under varemeket SANTOCEL som Santocel 100, alkalisk metall alumino-silikat komplekser spesielt nyttige siden de har brytende indekser nær brytningsindeksen av flytende gelatineringsmiddel (inklusiv vann og/eller fuktighetsmiddel) systemer vanligvis brukt i "dentifrices".

Mange av de såkalte "vannuløselige" poleringsmaterialene er anioniske i karakter og inkluderer også små mengder av løselige materiale. Derfor kan uløselig natriummetafosfat bli dannet på enhver egnet måte som illustrert ved Thorpe's dictionary of Applied Chemistry, Volume 9,4. utgave, s. 510-511. Formene for uløselig natriummetafosfat kjent som MadreH's salt og Kurrors salt er ytterligere eksempler på egnede materialer. Disse metafosfatsaltene utviser bare et minutts løselighet i vann, og er derfor vanligvis referert til som uløselige metafosfater (IMP). Det er presentert i en liten mengde av løselig fosfatmateriale som urenheter, vanligvis noen prosent slik som opp til 4% ved vekt. Mengden av løselig fosfatmateriale som man tror inkluderer en løselig natrium trimetafosfat i tilfelle av uløselig metafosfat, kan bli redusert eller eliminert ved å vaske med vann hvis ønskelig. Den uløselige alkaliske metall metafosfat blir typisk anvendt i pulverform av en partikkelstørrelse slik at ikke mer enn 1% av materialet er større en 37 mikron.

Poleringsmaterialet blir generelt presentert i fast eller pastasammensetninger i vekt-konsentrasjoner på omtrent 10% til omtrent 99%. Fortrinnsvis er den tilstede i mengden fra omtrent 10% til omtrent 75% i tannpasta, og fra omtrent 70% til omtrent 99% i tannpulver. I tannpastaer når poleringsmaterialet er kiselholdig er det generelt tilstede i en mengde på omtrent 10-30% ved vekt. Andre poleringsmaterialer er typisk tilstede i en mengde på omtrent 30-75% ved vekt.

I en tannpasta kan det flytende bindemidlet omfatte vann og fuktighetsmiddel typisk i en mengde som varierer fra 10% til omtrent 80% ved vekt av fremstillingen. Glysering, propylen glykol, sorbitol eller propylen glykol er eksempler på egnede fuktighetsmidler/bærere. Også fordelaktig er flytende blandinger av vann, glyserin og sorbitol. I klare geleer hvor brytningsindeksen er av stor betydning blir omtrent 2,5 - 30% v/v av vann, 0 til omtrent 70% v/v av glysering og omtrent 20-80% v/v av sorbitol fortrinnsvis anvendt.

Tannpasta, kremer og geleer inneholder typisk et naturlig eller syntetisk tykningsmiddel eller gelemiddel i andeler på omtrent 0,1 til omtrent 10, fortrinnsvis omtrent 0,5 til omtrent 5% v/v. Et egnet tykningsmiddel er syntetisk hektoritt, et syntetisk kollodial magnesium alkalisk metall silikat kompleks leire tilgjengelig for eksempel som Laponite (for eksempel CP, SP 2002, D) markedsført av Laporte Industries Limited. Laponite D er omtrent ved vekt 58.00% Si02,25,40% MgO, 3,05% Na20, 0,98% Li20 og noe vann og spormetaller. Dens spesifikke gravity er 2.53 og den har en tilsynelatende volum tetthet på 1,0 g/ml ved 8% fuktighet.

Andre egnede tykningsmidler inkluderer irsk mose, iota karragena, tragakantgummi, stivelse, polyvinylpyrrolidon, hydroksyetylpropylcellulose, hydroksybutylmetyl-cellulose, hydroksypropylcellulose, hydroksyetylcellulose (for eksempel tilgjengelig som natrosol), natriumkarboksymetylcellulose og kolloidal silika slik som finmalt Syloid (for eksempel 244). Oppløselighetsmidlet kan også bli inkludert slik som fuktige polyoler slik som propylen glykol, dipropylenglykol og heksylen glykol, cellosolver slik som metylcellosolv og etylcellusolv, vegetabilske oljer og vokser som inneholder minst omtrent 12 karboner i en rett kjede slik som olivenolje, kastorolje og petrolater og estere slik som amylasetat, etylasetat og bensylbensoat.

Det vil forstås at de orale fremstillingene skal selges eller på annen måte distribueres i egnede merkede innpakninger. Således vil et glass av munnrensevenn ha et merke som beskriver dette, i substans, som et munnrensevann eller munnvaskevann og som har beskrivelse for dets bruk; og en tannpasta, krem eller gele vil vanligvis være i en tube typisk aluminium, blykantet eller plast, eller andre klemme-, pumpe- eller trykkebeholdere for å måle ut innholdet, som har et merke som beskriver det, i substans, som en tannpasta, gele eller dentalkrem.

Organiske overflateaktive midler blir brukt i sammensetningen av foreliggende oppfinnelse for å oppnå økt profylaktisk virkning, for å oppnå en grundig og fullstendig dispersjon av det aktive midlet gjennom eller i hele det orale hulrommet, og gjør de ferdige sammensetningene mer kosmetisk akseptable. Det organiske overflate-aktive materialet er fortrinnsvis anionisk, non-ionisk eller amfolytisk av natur og reagerer fortrinnsvis ikke med det aktive midlet. Det er foretrukket at den anvendes som det overflateaktive midlet et rensende materiale som tildeler sammensetningen rensende og skummende egenskaper. Egnede eksempler på anioniske overflatemidler er vannløselige salter av høyere fettsyremonoglysidmonsulfater, slik som natriumsalt fra monosulfert monoglyserid fra hydrogenert kokosnøttolje-fettsyrer, høyere alkylsulfater slik som natrium laurylsulfat, alkylarylsulfonater slik som natrium dodesylbensensulfonat, høyere alkylsulfo-asetater, høyere fettsyreestere av 1,2-dihydroksy propansulfonat, og den vesentlig mettede høyere alifatiske asylamider fra lavere alifatiske aminokarboksylsyreforbindelser, slik som de som har 12 til 16 karboner i fettsyren, alkyl eller asylradikaler og dets like. Eksempler på de sistnevnte amidene er N-lauroyl sarkosin, og natrium, kalium og etanolaminsalter fra N-lauroyl, N-myristoyl, eller N-plamitoyl sarkosin som skulle være vesentlig frie for såpe eller lignende høyere fettsyrematerialer. Anvendelse av disse sarkonittforbindelsene i orale sammensetninger fra den foreliggende oppfinnelse er spesielt fordelaktig siden disse materialene utviser en forlenget markert effekt i inhibering av syredannelse i munnhulen mot karbohydrat-nedbrytning i tillegg til å utvise noe reduksjon i løseligheten til tannemaljen i syreløsningene. Eksempler på vannløselige ikke ioniske overflatestoffer egnet for anvendelse er kondensasjonsprodukter av etylenoksid med forskjellige reaktive hydrogeninneholdende forbindelser reaktive dermed som har lange hydrofobiske kjeder (for eksempel alififatiske kjeder på omtrent 12 til 20 karbonatomer), hvis kondenseringsprodukter ("etoksamerer") inneholder hydrofile polyoksyetylendeler, slik som kondenseringsprodukter av poly (etylenoksid) med fettsyrer, fettalkoholer, fettamider, polyhydridalkoholer (for eksempel sorbitan monostearat) og polypropylen-oksid (for eksempel pluronmaterialer).

Overflateaktive midler er typisk tilstede i en mengde på omtrent 0,5 til 5% ved vekt. Det er verdt å merke seg at overflateaktive midler kan assistere i oppløsning av det aktive midlet fra oppfinnelsen og derved minske mengden av oppløselighetsmiddel som behøves.

Forskjellige andre materialer kan bli inkorporert i orale fremstillinger av denne oppfinnelsen slik som hvitemidler, konserveringsmidler, silikoner, klorofyllforbindelser og/eller ammoniert materiale slik som urea, diammoniumfosfat og blandinger derav. Disse adjuvantene, når de er tilstede, blir inkorporert i fremstillingene i mengder som . ikke vesentlig innvirker på egenskapene og de ønskede karakteristika.

Et hvilket som helst egnet smak eller søtningsmiddel kan også anvendes. Eksempler på egnede smakstilsetninger er smaksoljer, for eksempel oljer fra spearmint, peppermynte, vintergrønn, "sassafras", kryddernellik, salvie, eukalyptus, merian, kanel, sitron og appelsin og metyl salisylat. Egnede søtningsmidler inkluderer sukrose, laktose, maltose, sorbitol, xylitol, natriumsyklamat, perillartin, AMP (aspartyl fenylalanin, metylester), sakkarin og lignende. Egnede smak og søtningsmidler kan hver eller sammen omfatte fra omtrent 0,1% til 5% av fremstillingen.

Den orale sammensetning ifølge oppfinnelsen, slik som munnvask eller "dentrifrice", som inneholder sammensetningen ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan fordelaktig bli brukt regelmessig på gommene og tennene, slik som hver dag eller hver annen dag eller hver tredje dag eller fortrinnsvis fra 1 til 3 ganger daglig, ved en pH på omtrent 4,5 til omtrent 9, vanligvis omtrent 7,0 til omtrent 9, i minst to uker til opp til 8 uker eller hele livet.

Sammensetningene fra denne oppfinnelsen kan også bli inkorporert i drops, eller i tyggegummi eller andre produkter, for eksempel ved omrøring i en varm gummibase eller som overtrekk til en ytre flate av en gummibase, det som kan nevnes er "jelutong", gummilateks, vinylittresiner, etc, ønskelige med konvensjonelle plasitifiserere eller myknere, sukker eller andre søtningsstoffer eller slik som glykose, sorbitol og lignende.

I et tredje aspekt ved oppfinnelsen blir komplekset fra oppfinnelsen formulert for å danne et kostsupplement fortrinnsvis som omfatter 0,1-100% v/v, mer å foretrekke 1-50% v/v, mest å foretrekke 1-10% og spesielt 2% v/v. Komplekset kan også bli inkorporert i matprodukter.

Et fjerde aspekt ved oppfinnelsen vedrører farmasøytiske sammensetninger som omfatter kalsiumkompleks ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer. Slike sammensetninger kan bli selektert fra gruppen bestående av dental, anti-kariogene sammensetninger, terapeutiske sammensetninger og kosttilskudd. Dentale sammensetninger eller terapeutiske sammensetninger kan være i form av en gele, i flytende, fast, pulver, krem eller pastill. Terapeutiske

sammensetninger kan også være i form av tabletter eller kapsler.

Et femte aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en antikariogen sammensetning som er kjennetegnet ved at den omfatter sammensetningen ifølge det fjerde aspekt av foreliggende oppfinnelse eller avleveringsbæreren ifølge det andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilpasset for antikariogen bruk.

Et sjette aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en terapeutisks sammensetning som er kjennetegnet ved at den omfatter sammensetningen ifølge det fjerde aspekt av foreliggende oppfinnelse tilpasset for terapeutisk bruk.

Et syvende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av komplekset ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, for behandling eller forhindring av tannkaries eller tann-nedbryting.

I en utførelsesform ifølge det syvende aspekt av oppfinnelsen blir den farmasøtiske sammensetning administrert på tenner eller tannkjøtt til et individ med et slikt behov, fortrinnsvis ved topisk administrering.

Et åttende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av komplekset ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for behandling av en eller flere tilstander relatert til kalsiumtap fra kroppen slik som bein, kalsiummangel, kalsiumfeilabsorpsjon.

I en utførelsesform ifølge det åttende aspekt av oppfinnelsen omfatter nevnte tilstander osteoporose og osteomalasi. Generelt blir det forutsatt at enhver tilstand kan bli forbedret med kalsiumbiotilgjengelighet.

Et siste aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et stabilt alkalisk kalsiumfosfatkompleks ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter følgende trinn: (i) oppnå en løsning av fosfopeptid med pH på omtrent 9,0; (ii) blande (i) med løsninger som omfatter kalsium og uorganisk fosfat og eventuelt fluorid ved en pH på omtrent 9,0;

(iii) filtrere blandingen som er et resultat fra trinn (ii), og

(iv) tørking for å oppnå det nevnte komplekset.

Kompleksene fra oppfinnelsen er nyttige som kalsiumsupplementer hos individer som trenger stimulering av benvekst, for eksempel individer som gjennomgår bruddreparasjon, ledderstatning, bentransplantat, eller hodeansiktskirurgi.

Disse komleksene er også nyttige som kosttilskudd hos individer som av en eller annen grunn, slik som kostintoleranse, allergi eller religiøse eller kulturelle faktorer er ute av stand til eller uvillig til å innta melkeprodukter i en mengde som er tilstrekkelig for å gi nok kalsium gjennom kosten.

Det vil bli forstått, selv om denne beskrivelsen refererer seg spesifikt til anvendelse hos mennesker, at oppfinnelsen også er nyttig for veterinære formål. Således er oppfinnelsen nyttig i alle aspekter for husdyr slike som kalver, sauer, hester og fjærkre; for dyr slike som katter og hunder; og for dyr i zoologisk have.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Denne oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i detalj ved hjelp av referanser bare til de følgende ikke-begrensende eksemplene.

Eksempel 1: Fremstilling av CPP- ACP og CPP- ACFP

A. Fremstilling av CPP- ACP

En 10% v/v kasein (Murray Goulburn, Victoria, Australia) eller kasinert løsning ble fremstilt ved pH 8,0 og derefter fordøyet med trypsin ved 0,2% v/v av kaseinet i to timer ved 50°C med pH kontrollert til 8,0 ± 0,1 ved NaOH tilsetning. Efter fordøyelsen ble løsningen justert til pH 4,6 ved tilsetting av HC1 og presipitatet ble fjernet ved sentrifugering eller mikrofiltrering. Imidlertid kan løsningen også bli klar ved mikrofiltrering ved pH 8,0 uten forsurning. Supernatanten eller mikrofiltratet ble derefter justert til pH 9,0 med NaOH, derefter CaCl2 (1,6 M) og Na2HP04 (IM) ved pH 9,0 ble tilsatt langsomt (< 1% vol. pr. minutt) med konstant risting med pH holdt konstant ved 9,0 ± 0,1 ved NaOH tilsetning. CaCl2 og natriumfosfat ble tilsatt til sluttkonsentrasjonene på henholdsvis 100 mM og 60 mM. Efter tilsetting av kalsium og fosfatløsningene ble løsningen mikrofiltrert gjennom 0,1 eller 0,2 mikrofilter (kjeramisk eller organisk) for å konsentrere løsningen fem ganger. Det tilbakeholdte materialet ble derefter diafiltrert med en til fem volum av destillert vann. Det tilbakeholdte materialet ble efter diafiltrering spraytørket for å produsere et hvitt pulver som var 50% CPP og 40% ACP og vannresidie. Analyse av CPP fra CPP-ACP komplekset ved revers-fase HPLC, sekvensanalyse og massespektroskopi viste at bare det peptidet som er i stand til å stabilisere amorft kalsiumfosfat og bli tilbakeholdt under mikrofiltrering og diafiltreringen er Bos asi-kasein X-5P (f59-79) [1], Bos fi-kasein X-4P (fl-25), Bos as2-kasein X-4P (f46-70) [3] og Bos as2-kasein X-4P (fl-21) [4] og avkortede og varme-modifiserte former av disse peptidene.

B. Fremstilling av CPP- ACFP

En 10% v/v volum eller kaseinert løsning ble fremstilt ved pH 8,0 ± 0,1 og derefter fordøyet med trypsin ved 0,2% v/v av kasein i 2 timer ved 50°C. Efter fordøyingen ble løsningen justert til pH 4,6 og tilsetting av HC1 og presipitatet fjernet ved sentrifugering eller mikrofiltrering. Imidlertid kan løsningen også bli klar ved mikrofiltrering ved pH 8,0 uten forsurning. Supernatanten eller mikrofiltratet ble derefter justert til pH 9,0 med NaOH, deretter derefter CaCl2 (1,6 M) og Na2HP04 (IM) ved pH 9,0 og 200 mM NaF ble tilsatt langsomt (< 1% vol. pr. minutt) med konstant risting hvor pH'en ble holdt konstant ved 9,0 ±0,1 ved NaOH tilsetning. CaCl2, natriumfosfat og NaF ble tilsatt til sluttkonsentrasjonene på henholdsvis 100 mM, 60 mM og 12 mM. Efter tilsetting av kalsium, ble fosfat og fluorløsningene mikrofiltrert gjennom 0,1 eller 0,2 um mikrofilter (kjeramisk eller organisk) for å konsentrere løsningen fem ganger. Det tilbakeholdte materialet ble derefter diafiltrert med en til fem volum av destillert vann. Det tilbakeholdte materialet ble efter diafiltrering spraytørket for å produsere et hvitt pulver som var 50% CPP og 40% ACP og vannresidie.

Pulveret CPP-ACFP ble derefter rekonstituert i destillert vann for å produsere høykonsentrerte løsninger. For eksempel ble en 10% v/v CPP-ACP-løsning som inneholder 640 mM Ca, 400 mM fosfat og 80 mM F (1,520 ppm F") ved pH 9,0 har blitt fremstilt såvel som en 20% CPP gel som inneholder 1,28 M Ca, 800 mM fosfat og 160 mM F (3,040 ppm F") ved pH 9,0. Denne løsningen og gelen utviser en signifikant større antikariogenisitet i forhold til fluor alene og er derfor overlegen til tilsetninger til tannpasta og munnvask og for profesjonell anvendelse for å forbedre effektiviteten av nåværende fluorinneholdende "dentrifrices" og profesjonelt anvendte produkter.

Eksempel 2: Strukturelle studier av CCP- ACP

A. Struktur og interaksjon av CCP- ACP

Kasein fosfopeptider som inneholder Ser(P) cluster, dvs. kjernesekvensmotivet Ser(P)-Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu-, har en markert evne til å stabilisere kalsiumfosfat i løsning. Løsningene som inneholder 0,1% v/v ccsi(59-79) [1] ved forskjellig pH, kalsium og fosfatkonsentrasjoner, men konstant ionisk styrke ble brukt for å karakterisere peptidenes interaksjon med kalsiumfosfat. Peptidet ble funnet å maksimalt binde 24 Ca og 16 Pi pr. molekyl som vist i tabell 1.

Ioneaktivitetsproduktene for forskjellige kalsiumfosfatfaser (hydroksyapatit (HA); oktakalsiumfosfat (OCP); trikalsiumfosfat (TCP); amorft kalsiumfosfat (ACP); og dikalsiumfosfatdihydrat (DCPD) ble bestemt fra fritt kalsium og fosfatkonsentrasjoner ved hver pH ved å bruke et dataprogram som beregner ioneaktivitetskoeffisientene ved bruk av den utvidede Debye-Hiickel ligningen og tar i betraktning ioneparene CaHP04°, CaH2P04<+>, CaP04 og CaOH<+> og dissosiasjon av H3PO4 og H2O og ionestyrken. Det eneste ioneaktivitetsproduktet som signifikant som korrelerte med kalsiumfosfatbindingen til peptidet uavhengig av pH var den korresponderende til ACP [Ca3(P04)ii87 (HP04)o,2X H2O] som indikerer at dette er fasen stabilisert av asi(59-79). Peptidet ocsi(59-79) bindes for å danne ACP clustere som produserer en metastabil løsning som forhindrer ACP-vekst til den kritiske størrelsen som kreves for nukleering og presipitering. Bindingen av aSi(59-79) til ACP resulterer i dannelsen av kollodiale komplekser med enhetsformelen [asi(59-79)(ACP)8]n hvor n er lik eller større enn 1. Det er sannsynlig at den dominante formen er n = 6 som asi(59-79 kryssbundet med glutaraldehyd ved tilstedeværelse av ACP vandrer som en heksamer på polyakrylamid-gelelektroforese. Interessant nok binder bare syntetisk oktapeptid asi(63-70) AcGlu-Ser(P)-Ile-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-GluNHMe 12 Ca og 8 Pi pr. molekyl dvs.

(ACP)4 og de syntetiske peptidene korresponderende til den N-terminale aS](59-63), Gln-Met-Glu-Ala-Glu og den C-terminale asi(71-78), Ile-Val-Pro-Asn-Ser(P)-Val-Glu-Gln av ocsi(59-79) bandt ikke kalsiumfosfater som vist i tabell 1. Disse resultatene indikerer at konformasjonspesifisiteten er essensielt for full ACP binding.

B. NMR studier

Proteinfleksibilitet i løsning er en utmerket karakteristikk for å komme ut fra spektroskopistudier på proteiner som inneholder Ser(P) duster sekvensen (-Ser(P)-Ser(P)- Ser(P)-) slik som fosvitin fra eggeplomme og fosfoforyn fra tanndentin. Fosforylering ser ut til å destabilisere sekundære og tertiære strukturer heller enn å fremme høyere nivåer av ordning. Imidlertid tilpasses fleksible fosforylerte sekvenser flere regulære konformasjoner når den blir bundet til kalsiumfosfat. Optisk rotasjons-dispersjon (ORD), sirkulær dikroisme (CD), hydrodynamisk og <31>P nukleær magnetisk resonnas (NMR) målinger av kaseiner indikerer alle at asi-kasein og 6-kasein har en heller åpen struktur i løsning med mange aminosyresidekjeder eksponert til løsningsmidlet og er relativt fleksibel. <31>P-NMR relaksasjonsmålinger indikerer at Ser(P)-residier er relativt mobile i B-kasein.

Vi har vist at medium- og langtidsnukleær Overhauser forøkelser (nOes) i 2D 'H NMR spektra av ccsi(59-79) [1] ved tilstedeværelse av Ca<2+> indikerer en konformasjons-preferanse. To strukturerte regioner ble identifisert. Residiene Val72 til Val76 er involvert i en 6-tur konformasjon. Residiene Glu61 til Ser(P)67 som går over en del av Ser(P) clustermotivet - Ser(P)- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu- er involvert i en løkketypestruktur. 2D NMR studier av fi-kasein (1-25) med tilstedeværelse av kalsium har vist en medium variasjonsbredde nOe i Ser(P)17- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu<21->motiv<->regionen mellom CaH eller Ser(P)<18> og NH eller Glu<20>. Ytterligere gjennomsnitts rekkevidde nOer inkluderer en mellom CaH av Ser22 og NH av Thr<24.> Bevis fra <*>H NMR Spektra av aS2-kasein (1-21) [4] har vist at flere residier som inkluderer de som er rundt - Ser(P)- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu- blir perturbert. Videre blir gjennomsnittsrekkevidde nOer mellom NH fra Ser(P)<8> og NH fra Glu<10>. Dette er ennå et annet eksempel på en gjennomsnittsrekkevidde nOe i - Ser(P)- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu-motiv. Andre eksempler på gjennomsnittsrekkevidde nOer inkluderer det mellom NH fra Ile14 og NH fra Ser(P)<16>. ;Som en konklusjon indikerer NMR dataene at foretrukne konformasjoner eksisterer for disse peptidene ved tilstedeværelse av kalsiumioner. Molekulær modellering av både asi(59-79) og 6(1-25) ved å bruke restriksjoner avledet fra NMR-spektroskopi har indikert at peptidene adopterer konformasjoner som tillater både glutamyl og fosfoseryl sidekjeder fra clustermotivet -Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu for å interagere kollektivt med kalsiumionene på ACP. ;Forbindelsen mellom CPP strukturen og interaksjonen med amorft kalsiumfosfat ble undersøkt ved å bruke en serie av syntetiske peptidhomologer og analoger vist i tabell 1. Disse studiene viste at cluster sekvensen -Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu i hovedsak var ansvarlig for interaksjon med ACP og at alle tre nærliggende Ser(P) residier kreves for maksimal interaksjon med ACP. ;Eksempel 3; Strukturelle studier som bruker hvdroksvapatit ( HA) ;Vi undersøkte på en lignende måte adsorbsjon av CPP og syntetiske homologer og analoger på HA (tabell 2). Disse dataene bekreftet også at Ser(P) clustersekvensen i hoveddeterminanten for høy affinitetsbinding og at alle tre nærliggende Ser(P)-residier er essensielle siden tap av en av de, selv når den blir substituert med Glu eller Asp resulterte i en betraktelig lavere affinitetskonstant K som vist i tabell 2. ;Ved å repetere disse HA-adsorpsjonseksperimentene med spyttdekket HA (sHA) viste det at Ser(P) clustermotivet fortsatt var hoveddeterminanten for adsorpsjon selv om affinitetene til peptidene for sHA var noe redusert ved tilstedeværelse av spyttproteiner. Disse resultatene foreslår at den hovedsakelige interaksjonen av CPP med membran og plaque ser ut til å være elektrostatisk og mediert av Ser(P)clustermotivet for CPP. ;Vi har også studert sammenkobling av peptidet Ser(P)- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu- på tre krystallografiske plan av HA, {100}, {010} og {001} ved å bruke datasimulasjons-teknikker og enhetscellekordinater for syntetisk HA. Disse simulasjonsstudiene viste at peptidet Ser(P)- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu- binder til {100} overflate, etterfulgt av {010} overflaten. Ser(P)-clustermotivet kan derfor binde til både {100} og {010} overflater for derved å tillate deponering av kalsium, fosfat og hydroksylioner på {001} overflaten samt tillate vekst av HA krystall sammen med bare c-aksen. Disse resultatene kan derfor nå forklare c-aksevekst av HA-krystaller i enamel og dentin. Detaljert undersøkelse av datasimuleringsdata viste at Ser(P)- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu- konformer med høyest relativ bindingsenergi er posisjonert på HA-overflaten slik at karboksylgruppene fra glutamylresidiene og fosforylgruppene fra fosfoserylresiduene er i umiddelbar nærhet til HA-overflaten med maksimal kontakt mellom disse gruppene og overflatekalsiumatomer. ;Eksempel 4: Antikariogen aktivitet hos CPP- ACP i human in situ studier ;Evnen til 1% v/v CPP-ACP pH 7,0 løsning for å forhindre enamel demineralisering ble studert i en human in situ karies modell. Modellen besto av en fjernbar innretning som inneholdt et venstre og høyre par av enamel plater plassert for å produsere et plaque retensjonssted. Inter-enamel plaque som ble utviklet (3,5 mg) var bakteriologisk lik normal supragingival plaque. Ved hyppig eksponering til sukroseløsninger i en tre ukers periode, øket nivåene av mutante streptokokker og laktobasiller og en under-overflateenamel demineralisering resulterte i dannelse av begynnende "karies-lignende" lesjoner. ;To eksponeringer av CPP-ACP løsning pr. dag til det høyre paret av enamel plater hos 12 individer produserte en 51% ± reduksjon i enamel mineraltap relativ til venstreside, kontrollenamel. Plaquene som ble eksponert til CPP-ACP-løsningen inneholdt 78 ± 22 umol/g kalsium, 52 ± 25 umol/g P{ og 2,4 ± 0,7 mg/g CPP sammenlignet med 32 ± 12 umol/g kalsium og 20 ± 11 umol/g Pi i kontrollplaque. Nivået av CPP ble bestemt ved konkurranse ELISA ved å bruke et antistoff som gjenkjente både asi(59-79) og 13(1-25). Elektronmikrografer av immunosytokjemiske fargesnitt av plaque ga lokalisering av peptidet fortrinnsvis på overflaten av mikroorganismen men også i den intracellulære matriks. ;Selv om disse resultatene indikerte at CPP blir inkorporert i utvikling av dental plaque, ville det aktuelle nivået bestemt ved ELISA ikke være representative for det som ble inkorporert under nedbryting av CPP i plaque gjennom virkning av fosfatasepeptidase-aktiviteter. Inkorporeringen av CPP-ACP i plaque resulterte i en 2,4 gangers økning i plaque kalsium og en 2,6 gangers økning i plaque Pi med et Ca/Pi forhold konsistent med ACP. ;Eksempel 5: Antikariogen potensiale av CPP- ACP i et munnskvllingsstude ;En klinisk utprøving av en munnskylling brukt tre ganger daglig inneholdt 3,0% CPP-ACP pH 9,0 viste at kalsiuminnholdet i supragingival plaque (lavere anterior tenner er ;ekskludert) økte fra 169 ± 103 umol/g tørr vekt til 610 ± 234 umol/g efter anvendelse av munnskylling i en tre dagers periode, og inorganisk fosfat øket fra 240 ± 60 umol/g tørr vekt til 551 ± 164 umol/g. Disse post-munnskylningsnivåene av kalsium og inorganisk fosfat er de høyeste som noen gang har blitt rapportert for ikke-mineralisert supragingival plaque. ;Uten ønske om å bli bundet opp til noen foreslått mekanisme for de observerte fordelene, tror man at mekanismen for antikariogenisitet for CPP-ACP i inkorporeringen av amorft kalsiumfosfat i plaque derved undertrykker enamel demineraliseringen og øker remineraliseringen. I plaque ville CPP-ACP virke som et reservoar for kalsium og fosfat, buffer det frie kalsium og fosfationeaktivitetene for derved å hjelpe til å opprettholde en tilstand av overmetning med hensyn til tannemalje. Bindingen av ACP til CPP er pH-avhengig med svært liten binding under pH 7,0. ;Eksempel 7: Remineralisering av emalielesjoner ved CPP- ACP ;A. In vitro studier ;Et in vitro emlajeremineraliseringssystem ble brukt for å studere remineralisering av kunstige lesjoner i humane tredje molarer ved CPP-ACP løsninger. Ved å bruke dette systemet erstattet en 1,0% CPP-ACP-løsning 56 ±21% av mineraltapet. En 0,1% CPP-ACP-løsning erstattet 34 ± 18% av mineral som ble tapt. Et ytterligere antall av løsninger som inneholder forskjellige mengder av CPP (0,1-1,0%) kalsium (6-60 mM) og fosfat (3,6-36 mM) ved forskjelllige pH-verdier (7,0-9,0) ble fremstilt. Assosieringene mellom aktivitetene av forskjellige kalsiumfosfatarter i løsningen og hastigheten for emaljelesjonsremineraliseringen for disse seriene av løsninger ble derefter bestemt. ;Aktiviteten av de nøytrale ioneartene CaHPCV i forskjellige remineraliseirngsløsninger ble funnet å være svært høyt korrelert med hastigheten for lesjonsremineraliseringen. Diffusjonskoeffisienten for remineraliseirngsprosessen ble estimert ved 3 x IO"10m2s_1 som er i overensstemmelse med koeffisientene for diffusjon av nøytrale molekyler gjennom en ladet matriks. Hastigheten for emaljeremineralisering ervervet med 1,0% CPP-ACP-løsning var 3,3 x IO"<2> mol HA/mVlO dager som er den høyeste remineraliseringshastigheten som noen gang er ervervet. Kalsiumfosfationer, spesielt det nøytrale ioneparet CaHPCV efter diffusjon i emaljelesjonen, vil dissosiere og dermed øke graden av metning med hensyn til HA. Dannelsen av HA i lesjonen vil føre til dannelsen av H3PO4, som i seg selv er nøytral, og vil diffundere ut av lesjonen ned en konsentrasjonsgradient. ;Resultatene indikerer at CPP-bundet ACP, CPP[Ca3(P04)i,37(HP04)o,2xH20]8 virker som et resvoar for de nøytrale ionearter, CaHPCV som ble dannet ved tilstedeværelse av syre. Syren kan bli dannet ved dentale plaquebakterier; under disse betingelser, CPP-bundet ACP vil buffere plaque pH og produsere kalsium og fosfationer, spesielt CaHPCV. Økningen i plaque CaHPCV vil forskyve ethvert fall i pH og derved forhindre emaljedemineralisering. Syre blir også dannet i plaque som H3PO4 ved dannelsen av HA i emaljelesjonen under remineraliseringen. Dette forklarer derfor hvorfor CPP-ACP-løsningene er slike effektive remineraliseringsløsninger siden de vil fordøye H3PO4 produsert under emaljelesjonsremineraliseringen som danner mer CaHPCV for derved å opprettholde dets konsentrasjonsgradient inn i lesjonen. Disse resultatene er derfor i overensstemmelse med den foreslåtte antikariogene mekanismen for CPP som er inhibitoren for emaljedemineralisering og øker remineraliseringen gjennom lokalisering av ACP på tannoverflaten. ;B. Human in situ remineraliseringsstudier ;Evnen til CPP-ACP tilsatt til sukkerfri (sorbitol) tyggegummi for å remineralisere emalje underoverflatelesjoner ble undersøkt i et tilfeldig "cross-over" dobbeltblindt studie. Ti individer bar fjernbare ganeapparater med seks human-emalje, halvplate-innsatser som inneholdt underoverflate demineraliserte lesjoner. Den andre halvdelen av hver emaljeplate ble lagret i en fuktig beholder og ble brukt som kontroll-demineralisert lesjon. Det var fire behandlingsgrupper i studien, sukkerfri tyggegummi som inneholder 3,0% v/v CPP/ACP, sukkerfri tyggegummi som inneholdt 1,0% v/v, sukkerfri tyggegummi med ingen CPP/ACP og en ikke-tyggegummi kontrollgruppe. Tyggegummien ble tygget i tyve minutters periode fire ganger pr. dag. Apparatene ble båret i disse tyve minutters periode og ytterligere tyve minutter efter tyggegummi-tyggingen. Hver behandling varte i 14 dager og hver av de ti individene utførte hver behandling med en ukes hvil mellom behandlingene. På slutten av hver behandling ble emaljeplatene fjernet, og sammenlignet med dens reseptive demineraliserte kontroll innstøpt, seksjonert og utsatt for mikroradiografi og dataassistert densiometrisk avbildingsanalyse for å bestemme nivået av remineraliseringen. Den sukkerfrie tyggegummibehandlingen resulterte i 9,82 ± 1,81% remineralisering relativ til den ikke-tyggegummityggende kontrollen, mens tyggegummien som inneholdt 1,0% CPP-ACP produserte 17,06 ± 2,48% remineralisering og 3,0% CPP-ACP gummi produserte 22,70 ± 3,40% remineralisering med alle verdiene som signifikant forskjellig. Disse resultatene viste at tilsetting av 1,0% og 3,0% CPP-ACP til sukkerfri tyggegummi produserte en henholdsvis 74% og 131% økning i underoverflateemalje remineralisering. ;Eksempel 7; CPP- ACFP munnskvlningsstudie ;Et munnskylningsstudie ble utført for å bestemme evnen til en 3,0% CPP-ACFP munnskylning brukt tre ganger daglig for å øke supragingival plaque kalsium, inorganisk fosfat og fluorioner. 3,0% CPP-ACP løsning brukt som munnskylling i 4 dager inneholdt 192 mM bundet kalsiumioner, 120 mM bundet fosfationer og 24 mM (456 ppm) bundet F ioner stabilisert ved CPP. Anvendelse av munnskyllingen resulterte i en 1,9 gangers økning i plaque kalsium, en 1,5 gangers økning i plaque fosfat og en dramatisk 18 gangers økning i plaque fluorid ion som vist i tabell 3. ;Selv om disse markerte økningene i plaquekalsium, fosfat og fluor ble funnet, ble det ikke observert tannstein hos noen av individene, dette indikerer at plaquekalsiumfluor-fosfat forble stabilisert som amorf fase ved CPP og ble ikke transformert til en krystallinsk fase. Disse økningene i supragingival plaque nivåene av Ca, fosfat og fluorioner produsert ved CPP-ACP er markert større enn de som er ervervet i et lignende studie som brukte CaCPP og 1000 ppm F (MFP og NaF) tannpasta to ganger daglig i en lignende tidsperiode som indikert i tabell 3. Disse resultatene viste en markert synergistisk effekt mellom fluorioner og CPP-ACP. Dette er spesielt fordelaktig når en ser på det faktum at nivået av fluor i orale sammensetninger slike som tannpasta kan bli redusert, som resulterer i en kostnadsbesparing og minsker risikoen for fluorose for individer som lever i et høyfluorområde. ;Eksempel 8; Interaksjon av CPP- ACP med fluor ;En synergistisk anti-kariogen effekt på en 1,0% CPP-ACP sammen med 500 ppm F" ble observert i en rottekariesmodell. Analyse av løsningen som inneholdt 1% CPP, 60 mM CaCl2, 36 mM natriumfosfat og 500 ppm F (26,3 mM NaF) pH 7,0 efter ultrafiltrering viste at nesten halvparten av fluorlonene hadde blitt inkorporert inn i ACP fasen stabilisert ved CPP for å produsere en amorf kalsiumfluoridfosfatfase av sammensetningen Ca3(P04)sFxH20 med 24 Ca, 15 PO4 og 3F molekyler pr. CPP molekyl. ;Uten ønske om å bli begrenset til en foreslått mekanisme for den observerte fordelaktige effekten, betrakter vi den antikariogene mekanisme for CPP-ACP i lokaliseringen av ACP på tannoverflaten slik at den ved tilstedeværelse av syre, dissosierer ACP for å frigis Ca og fosfationer som øker graden av metning med hensyn til HA som forhindrer emaljedemineralisering og fremmer remineralisering. Den antikariogene mekanismen av fluor er lokaliseringen av fluorlonene på tannoverflaten, spesielt i plaque med tilstedeværelse av Ca og fosfationer. Denne lokaliseringen øker graden av metning med hensyn til fluoropatitt (FA) for dermed å fremme remineralisering av emalje med FA. Det er klart at for dannelsen av FA [Caio(P04)6F2] må kalsium og fosfationer bli samlokalisert i plaque på tannoverflaten med fluorion. Den synergistiske antikariogene effekten av CPP-ACP og F kan derfor tillegges lokaliseringen av ACFP på tannoverflaten med CPP som med effekt ville kolokalisere Ca, Pi og F. ;Dette ble demonstrert i munnskylningsstudiet beskrevet i eksempel 7. Metastabile løsninger av CPP ved pH 7,0 har blitt fremstilt å inneholde amorft kalsiumfluoridfosfat ved uvanlig høye konsentrasjoner. For eksempel har 10% v/v CPP-ACFP løsningen som inneholder 640 mM Ca, 400 mM fosfat og 80 mM F (1,520 ppm F<*>) ved pH 7,0 blitt fremstilt såvel som en 20% CPP gel som inneholdt 1,28 m Ca, 800 mM fosfat og 160 mM F (3,040 ppm F") ved pH 7,0. Denne løsningen og gel utviser en signifikant større antikariogenisitet i forhold til fluor alene, og er derfor overlegne tilsetninger til tannpastaer og munnskyllinger og for profesjonell anvendelse for å forbedre effektiviteten av nåværende fluorinneholdende "dentifrices" og profesjonelt anvendte produkter.

Spesifikke eksempler for formuleringer som inneholder komplekser av oppfinnelsen er tilveiebragt under:

Eksempel 9: Tannpastaformuleringer som inneholder CPP- ACFP

Formulering 1

Formulering 2

Formulering 3 Formulering 4

Formulering 5

Eksempel 10: Munnvaskformuleringer Formulering 1 Formulering 2

Eksempel 11: Pastillformulering

Eksempel 12: Gingival massasjekremformulering Eksempel 13: Tyggegummiformulering

Eksempel 14: Kosttilskudd

CPP-ACP ble tilsatt ved 1,0% v/v av dietten til rakitik kyllinger for å bestemme evnen til CPP-ACP til å tilveiebringe biotilgjengelige kalsium for benøkning. CPP-ACP ved 1,0% v/v i dietten produserte en 34% reduksjon i insidensen av vekstplateabnormaliteten, en 17% økning i tibial "ash" og en 22% reduksjon i vekst-platen i dyrene som var signifikant større enn CPP alene (tabell 4) som indikerer at CPP-ACP er overlegen CPP i å tilveiebringe biotilgjengelig kostkalsium og i å fremme benvekst.

Claims (19)

1. Stabilt kalsiumfosfatkompleks, karakterisert ved at det omfatter en løselig basisk form av amorft kalsiumfosfat eller amorft kalsiumfluoridfosfat som er stabilisert av fosfopeptider, hvori nevnte fosfopeptider omfatter aminosyreskevensen Ser(P)- Ser(P)- Ser(P)-Glu-Glu og hvori komplekset er dannet ved en pH>7.

2. Kompleks ifølge krav 1, karakterisert ved at det er dannet ved pH på omtrent 9.

3. Kompleks ifølge ethvert av kravene 1 til 2, karakterisert v e d at nevnte fosfopeptider omfatter en aminosyresekvens valgt fra hvilken som helst av: [ 1 ] Gln<59->Met-Glu-Ala-Glu-Ser(P)-Ile-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Ser(P)-Val-Glu-Gln-Lys<79>.as,(59-79)

[2] Arg<1->Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Glu-Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg25. fi(l-25)

[3] Asn<46->Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser(P)-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys<70>. as2(46-70)

[4] Lys<1->Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Ser(P)-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys<21>. as2(l-21).

4. Fremgangsmåte for fremstilling av et stabilt alkalisk kalsiumfosfatkompleks ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter følgende trinn: (i) oppnå en løsning av fosfopeptid med pH på omtrent 9,0; (ii) blande (i) med løsninger som omfatter kalsium og uorganisk fosfat og eventuelt fluorid ved en pH på omtrent 9,0; (iii) filtrere blandingen som er et resultat fra trinn (ii), og (iv) tørking for å oppnå det nevnte komplekset.

5. Kompleks ifølge ethvert av kravene 1 til 3, karakterisert v e d at det er fremstilt ifølge fremgangsmåten i krav 4.

6. Avleveringsbærer tilpasset for å samlokalisere ioner, slik som kalsium, fluor og fosfat, til et målsted karakterisert ved at nevnte avleveringsbærer inneholder komplekset ifølge ethvert av kravene 1 til 3 eller 5 som en aktiv ingrediens.

7. Avleveringsbærer ifølge krav 6, karakterisert ved at den er hvilken som helst av tannkrem, tannpulver, flytende "dentifrice", munnskylling, pastill, tyggegummi, dental pasta, gingival massasjekrem, gurgletabletter, melkeprodukter og andre matvarer.

8. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den inneholder et kompleks ifølge ethvert av kravene 1 til 3 eller 5 i kombinasjon med en farmasøytisk bærer.

9. Antikariogen sammensetning, karakterisert ved at den inneholder sammensetningen ifølge krav 8 eller avleveringsbæreren ifølge krav 6 eller 7 tilpasset for antikariogen bruk.

10. Terapeutisk sammensetning, karakterisert ved at den inkluderer sammensetningen ifølge krav 8 tilpasset terapeutisk bruk.

11. Sammensetning ifølge ethvert av kravene 8-10, karakterisert v e d at sammensetningen har en pH på omtrent 4.5 til omtrent 9.

12. Kosttilskudd, karakterisert ved at det inneholder komplekset ifølge ethvert av kravene 1-3 eller 5.

13. Kosttilskudd ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte kompleks omfatter 0,1 til 100% w/w av nevnte tilskudd.

14. Kosttilskudd ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte kompleks omfatter 2% w/w av nevnte tilskudd.

15. Anvendelse av komplekset ifølge ethvert av kravene 1-3 eller 5, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, for behandling eller forhindring av tannkaries eller tann-nedbryting.

16. Anvendelse ifølge krav 15, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning blir administrert på tenner eller tannkjøtt til et individ med et slikt behov.

17. Anvendelse ifølge krav 15 eller 16, hvori nevnte farmasøytiske sammensetning blir administrert topisk.

18. Anvendelse av komplekset ifølge ethvert av kravene 1-3 eller 5, for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning, for behandling av en eller flere tilstander relatert til kalsiumtap fra kroppen slik som bein, kalsiummangel, kalsiumfeilabsorpsjon

19. Anvendelse ifølge krav 18, hvori nevnte tilstander omfatter osteoporose og osteomalasi.