CN101247721B - 包括酪蛋白衍生肽的药物组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及源自酪蛋白的肽及其在泌乳动物管理中的用途，特别涉及用于缩短泌乳牲畜动物的干奶期(dry period)长度、增加其产奶量、改善分娩后乳液卫生以及改善所述牲畜福利的方法。本发明还涉及无菌溶液形式的药物组合物，其包括源自酪蛋白的肽，该组合物澄清且基本上无胶粒。

Description

包括酪蛋白衍生肽的药物组合物及其使用方法

技术领域

本发明涉及源自酪蛋白的肽及其在泌乳动物管理中的用途，特别涉及用于缩短泌乳牲畜的干奶期(dryperiod)长度、增加其产奶量、改善分娩后乳液卫生以及改善所述牲畜福利的方法。本发明还涉及无菌溶液形式的药物组合物，其包括源自酪蛋白的肽，该组合物澄清且基本上无胶粒。

背景技术

酪蛋白(CN)是人及非人哺乳动物乳液中主要的蛋白质。先前酪蛋白根据每种片段的电泳迁移率可表征为主要由α、β和γ三种片段组成(Hipp等.1952.DairySci.，35：272)。目前根据每种亚型αS1、αS2、β和κ的氨基酸序列对酪蛋白进行定义(Engel等.1984.J.DairySci.67：1607-1608)。

酪蛋白经酶促水解产生的肽有利于年轻一代的健康和正常发育(FitzGerald等，1998.Int.DairyJ.8：451-457)，并且用作局部的乳腺功能调节剂(Silanikove等，2000.LifeSci.67：2201-2212；Shamay等，2002.LifeSci.70：2707-2719)。丝氨酸蛋白酶(即纤溶酶)是乳液中主要的蛋白酶，并且已知可从β-酪蛋白、α-S1酪蛋白和αS2-酪蛋白产生抗煮沸的肽(-蛋白胨)。

-蛋白胨(PPs)，也叫做酪蛋白磷酸肽(CPP)，其占乳清蛋白的大约三分之一(Andrews，1983.J.DairyRes.50：45-55)。乳液中的纤溶酶主要以无活性的纤溶酶原形式存在，并且纤溶酶原激活剂可调节纤溶酶原转化为纤溶酶(PolitisI.，1996.J.DairySci.79：1097-1107)。

酪蛋白衍生肽已被证实具有多种生物活性及用途。对乳液化合物的研究证实脚注了与酪蛋白相关的杀菌活性。美国专利第3,764,670号公开了源自酪蛋白的具有抗微生物的抗生素性能的新型多肽。

还观察到酪蛋白肽具有免疫调节活性。例如，PCT国际专利申请WO01/13739公开了增强哺乳动物免疫力并通过直接施用或通过食物摄入包括磷酸化氨基酸(如酪蛋白磷酸肽)的蛋白质而促进哺乳动物生长的方法。由于哺乳动物免疫力增强、抗感染性疾病的耐受性提高以及抑制其生长的因素消除，因而促进了哺乳动物的生长。

美国专利申请公布文本第20020147144和20040167073号公开了来源于乳液中酪蛋白的或与乳液中酪蛋白αS1片段的N末端具有同一性的序列相似的生物活性肽，所述肽能够刺激和增强免疫反应、抵抗病毒感染、使血清胆固醇水平正常化并促进血细胞生成。

PCT国际专利申请WO2005/081628公开了来源于乳液酪蛋白的αS1、αS2、β-或κ-酪蛋白片段序列的或与其序列相似的生物活性肽，其具有免疫调节的能力以及具有其他的治疗活性，包括但不限于刺激并增强免疫反应、抗病毒感染、使血清胆固醇水平正常化并促进血细胞生成。酪蛋白衍生肽无毒并且可用于预防和治疗免疫性病理、糖尿病、高胆固醇血症、凝血机制紊乱(hematologicaldisorder)以及病毒相关的疾病。

欧洲专利申请第EP1375513号公开了在源自酪蛋白的肽中，具有包括一个以上磷酸丝氨酸残基的氨基酸序列的肽显示出强大的免疫增强活性。具体地，本发明涉及包括由氨基酸序列Q1-SerP-X-SerP-Q2组成的肽的免疫增强剂，其中SerP表示磷酸丝氨酸残基，X表示一至三个任意氨基酸残基，以及Q1和Q2独立地不存在或代表至少一个任意的氨基酸残基。

属于本发明发明人之一及其合作者的美国专利第6,391,849号公开了用作钙螯合剂的酪蛋白衍生的月示-蛋白胨，及其在控制乳腺的生理变化以及预防、治疗和逆转感染中的用途，其中所述生理变化包括暂时性产乳停止、持续性产乳停止和退化期的诱导。

酪蛋白磷酸肽已经显示具有独特的能够结合常量元素(如Ca、Mg和Fe)和微量元素(如Zn、Ba、Cr、Ni、Co和Se)的性能，这些元素可在小肠溶解因而可以被有效吸收。同样地，将CPP用作饮料和婴儿食品以及牙科药剂的添加剂。例如，美国专利第5,834,427号公开了具有新型氨基酸序列的纯化的酪蛋白磷酸肽(CPP)，以及具有相同氨基酸序列的纯化的酪蛋白。CPP或包括相同氨基酸序列的酪蛋白在动物体内有更好的溶解和吸收矿物质的能力。CPP或包括相同氨基酸的β-酪蛋白-H可添加到食品、饮料、药物、美容产品中，并以促进动物吸收矿物质的有效量饲喂。包括β-酪蛋白H或有创造性的CPP和药学上可接受的载体的口服组合物可以减轻或缓解牙科的超敏反应。

美国专利第5,227,154号公开了通过使用口服组合物治疗牙而控制牙石的方法，其中所述口服组合物包括特异性的酪蛋白磷酸肽和/或其盐。美国专利第6,652,875号公开了将生物活性成分递送至生物表面的剂型，所述生物表面包括诸如牙齿和齿龈的牙齿表面，其中所述剂型包括至少一种分离并纯化的酪蛋白或其盐以及至少一种生物活性成分在水中的悬浮液或溶液。

已经提出了多种制备酪蛋白水解产物(特别是CPP)的方法。例如，美国专利第4,740,462号公开了通过结晶胰蛋白酶水解酪蛋白，随后分馏，再利用超滤或诸如凝胶渗透色谱或离子交换色谱的色谱技术进行分离而制备CPP。该方法有一定的研究价值，但在工业生产上不实用也不经济。其他方法涉及利用食品和/或药物组合物中所不能接受的毒性物质——如氯化钡。

不管所采用的制备方法如何，含有酪蛋白水解产物的溶液都易于产生浑浊。在药物组合物以及在某些食品(特别是饮料)中，浊度被认为是明显的不利因素，因为在浑浊的组合物中用肉眼监测变化特别是检测污染物是困难的或是不可能的。美国专利第5,405,756号公开了一种适合用作饮料添加剂且不影响饮料透明性的酪蛋白磷酸肽的制备方法，但是，所得的蛋白质含有钙，此外，只有在酸性pH下才获得澄清溶液。

泌乳牲畜动物的管理

在现代乳品加工业中，泌乳动物群经历了可控的挤奶和妊娠周期，这种状态有利于产奶量的显著增加。在现在的乳畜群例如奶牛和山羊的管理中，泌乳期和妊娠期间有一明显重叠，其中“干奶期”是在分娩之前50天至70天期间通过停止挤奶而施加的。设置这种状态以在对随后健康泌乳期所需的诱导退化过程的需要和全年高产乳量需求之间进行平衡。

停止挤奶导致乳腺分泌的迅速变化，并引发活跃的乳房退化过程。该过程包括组织和乳液组成中的多方且高度有序的变化，这些变化发生在泌乳阶段和非泌乳阶段的过渡期间。在乳房退化的第一阶段，由引发凋亡的局部刺激启动该过程，但是通过恢复挤奶可逆转该退化(Capuco和Akers，1999.J.MammaryGlandBiol.Neoplasia4：137-144；Wilde等，1999.J.MammaryGlandBiol.Neoplasia4：129-136)。在单侧停止挤奶的泌乳山羊中(Quarrie等.，1994.Biochem.Soc.Trans.22：178S)或在密封乳头后的泌乳小鼠中(Li等.，1997.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：3425-3430；Marti等，1997.Eur.J.Cell.Biol.73：158-165)，观察到当在单个乳腺中诱导乳液淤积时，这种局部控制可导致退化。

退化的第二阶段是持续性的，并且挤奶不能引起乳液分泌的恢复(Capuco和Akers，1999.ibid；Wilde等，1999.ibid)。第二阶段退化的逆转仅仅发生在产后紧接着的泌乳阶段。此阶段的特点是蛋白酶激活，所述蛋白酶通过降解细胞外基质和基底膜以及大量缺失泡状细胞(alveolarcell)而破坏乳腺的泡状小叶(lobularalveolar)结构。

停止挤奶诱导退化与发展为乳腺炎增加的风险有关，乳腺炎是一种由病原体的乳房内感染(IMI)所引发的疾病，所述病原体主要为细菌，也可以是酵母、真菌或甚至是藻类。乳腺炎可以是临床型乳腺炎，其在(一些常规的病例中)具有局部临床体征和乳液分泌异常，或者是亚临床型乳腺炎，其伴有产乳能力丧失和乳液质量下降。

现代的奶牛虽然每天还能生产20升至40升的乳液，但其通常会变干。因此，乳液淤积可引起乳房分泌的泄漏，其实质上增加了罹患IMI的风险。导致长退化过程的常规变干，通常与IMI的较高比率相关。临床型和亚临床型的乳腺炎由于乳液废弃品(较低的农场产量)、较次的乳液质量(较低的收入)、奶牛早期的剔除(遗传潜力的丧失)、药物花费、兽医开支以及增加的人工费，而给农场主带来极大的经济损失。乳腺炎是最能使乳畜群虚弱的疾病，仅其每年就花费掉美国乳品加工业大约20亿的美元。

先前已由本发明的发明人之一与其合作者证实了纯化的β-酪蛋白(β-CN)片段1-28可使奶牛和山羊的泌乳量下调。这种肽的活性与其阻断乳房上皮细胞顶膜的钾通道的能力相关(Silanikove等，2000.supra)。

也表明给山羊或奶牛的乳房注射酪蛋白水解物(CNH)的粗品模拟了自然的退化过程，诱导了局部的炎症性反应和紧密连接完整性的缺失，并使乳房分泌迅速变干(美国专利第6,391,849号；Shamay等，2002.ibid；Shamay等.，2003.J.DairySci.86：1250-1258)。由CNH诱导的过程比自然变干所诱导的过程更为迅速和同步。这些结果表明有可能显著缩短退化所需时间。但是，是否有可能缩短或者消除干奶期而不影响随后的泌乳期乳液产量仍然不清楚。Annen等(2004.JDairyScience87：3746-3761)表明用牛生长激素(bST)治疗经产奶牛可以缩短甚至消除干奶期，且不减少产奶量，但是，这种治疗对初产奶牛没有同样效果。而且，先前已表明使用bST的治疗导致产生乳腺炎、生殖障碍以及其它生产相关性疾病，并且还表明这种治疗增加了步伐紊乱。

西方国家最近十年越来越关注农场动物的福利(BroomDM1992In：Phillips等，Eds.FarmAnimalsandtheEnvironment.CABWallingfordUK，第245-253页)。密集生产系统内近来动物住所和管理条件的发展反映了动物福利受到的道德关注的增加(Fregonesi等，2001.LivestockProductionSci.68：205-216；Fregonesi等，2002.LivestockProductionSci.78：245-257)。定义为预防遭受并增加存在的积极感受或舒适度的动物福利的改善，是牲畜管理中重要的因素(Broom，1992.ibid)。农场动物的福利状态可用与受损生物功能尤其是与健康状况下降和生理应激反应增加有关的测定法来评价。

存在对缩短乳畜群干奶期而对产奶量无负面影响的、增加产奶量和改善卫生并保持和/或改善牲畜动物福利的安全有效治疗方法的未满足的需求。此外，包括酪蛋白衍生肽的、随时可使用的澄清溶液形式的药物组合物将会是非常有利的。

发明内容

本发明通常涉及泌乳牲畜动物的管理，以及包括酪蛋白衍生肽的药物组合物。特别地，本发明涉及用于缩短对泌乳动物有影响的干奶期的长度，提高其产奶量和改善乳液卫生，并预防遭受与乳腺相关的感染，防止挤奶突然停止的方法。本发明还涉及药物组合物，其包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述组合物为无菌澄清溶液形式，其基本上无酪蛋白胶粒，并包括基本上均一的约1,000道尔顿至约5,000道尔顿低分子量的肽。

在泌乳动物预期的分娩前强制其停止产奶以保持产奶量是畜群中常见的做法。非泌乳期(即“干奶期”)，对于动物身体健康以及维持其产奶能力是非常重要的。迄今，50天至70天的干奶期已成为行业标准。目前，本发明出乎意料地显示了有可能缩短干奶期的长度而不对分娩后的产奶量产生负面影响。目前本发明意想不到地公开了一种使分娩后的产奶量比分娩前泌乳期的产奶量增加的方法。

因此，根据一方面，本发明提供了一种对产奶量无负面影响的缩短泌乳动物泌乳周期期间干奶期长度的方法，其包括对泌乳动物施用治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽。

根据某些实施方案，所述干奶期被缩短至少于50天，优选的是少于约40天，更优选的是在约20天至约30天之间。

根据另一方面，本发明提供了一种使泌乳动物分娩后的产奶量比分娩前泌乳期所达到的产奶量增加的方法，其包括对所述泌乳动物施用有效量的源自酪蛋白的至少一种肽。

在乳畜群中，如所生产的乳品通过用每ml乳液所含的体细胞计数(SCC)进行评价的卫生，对畜群的收益率具有极大的影响，原因是每ml乳液含有高水平细胞的乳品必须废弃。

根据又一方面，本发明提供一种用于改善泌乳动物乳液卫生的方法，其包括对所述泌乳动物的乳腺施用治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，使得所述乳液中的体细胞计数(SCC)与所述肽施用前的SCC相比减少。根据某些实施方案，所述肽施用后的SCC为约750,000细胞/ml乳液以及更少，优选的是600,000细胞/ml以及更少，更优选的是400,000细胞/ml以及更少，甚至更优选的是300,000细胞/ml乳液，最优选的是200,000细胞/ml乳液以及更少。根据某些实施方案，在施用治疗的泌乳周期中SCC减少。根据当前某些优选的实施方案，在施用治疗后所施加的干奶期之后的泌乳周期中SCC减少。

乳腺感染和/或挤奶突然停止给动物带来疼痛并使其产生应激。这种应激不仅使患病的动物生产能力下降，而且对处于高度密集生产系统的动物的一般条件的认知增加也需要改善此类牲畜动物福利的方法。目前，本发明出乎意料地公开了其有可能减少或甚至可能预防遭受与乳腺相关的感染或挤奶突然停止。

根据进一步的方面，本发明提供了一种用于减少牲畜泌乳动物遭受与乳腺相关的感染或挤奶突然停止的方法，其包括对所述泌乳动物的乳腺施用治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，从而改善所述泌乳动物的福利。

根据某些实施方案，改善所述泌乳动物的福利是通过减少所述动物每天的步数和通过延长所述动物每天的躺卧时间来估量的。根据一个实施方案，将源自酪蛋白的至少一种肽施用于受感染的乳腺。根据另一个实施方案，将一种或多种肽施用于未感染的乳腺。

根据某些实施方案，本发明的方法采用了源自酪蛋白的肽——磷酸肽。根据一个实施方案，所述磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQIDNO：1)，及其类似物或衍生物。根据另一实施方案，所述磷酸肽选自由来源于β-酪蛋白、αS1-酪蛋白或αS2-酪蛋白的磷酸肽组成的组。根据当前某些优选的实施方案，本发明方法所采用的磷酸肽包括选自由SEQIDNO：2至SEQIDNO：5组成的组的氨基酸序列及其类似物、衍生物或片段。根据当前另外优选的实施方案，本发明方法所采用的磷酸肽由选自SEQIDNO：2至SEQIDNO：5的氨基酸序列及其类似物、衍生物或片段组成。可用单一类型的肽和多种类型的肽。

根据某些实施方案，本发明的方法包括沟内施用源自酪蛋白的至少一种肽。根据当前某些优选的实施方案，所述方法包括施用于泌乳动物乳腺的乳头沟(teatcanal)。施用于乳头沟可借助于注射或输注。可将所述至少一种肽施用于一个或多个乳腺，其包括共同施用于所述泌乳动物的所有乳腺。根据另外的实施方案，本发明的方法进一步包括与抗微生物治疗共同施用，所述抗微生物治疗选自抗生素疗法、杀菌剂疗法、甾族的和非甾族的抗炎疗法、采用免疫调节剂的疗法和疫苗接种疗法组成的组。

根据一个实施方案，用于缩短泌乳周期的干奶期长度的方法包括在停止挤奶的同时施用源自酪蛋白的所述至少一种肽。包括单次施用和多次施用。通常，所述肽以选自由以下组成的组的间隔施用一次或多次，优选一次至三次：约6小时、约8小时、约12小时、约16小时、约20小时或约24小时。根据当前最优选的一个实施方案，所述至少一种肽仅施用一次。根据另外的实施方案，在预期的分娩前约60天停止挤奶，优选在预期的分娩前约40天，更优选的是在预期的分娩前大约20天至大约30天之间。

根据另一实施方案，用于增加分娩后产奶量和增加随后泌乳期产奶量的方法包括在停止挤奶的同时施用源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述停止挤奶的同时一般是在预期的分娩前约60天，优选的是在分娩前约40天，更优选的是在分娩前约30天。选择施用所述至少一种肽的给药步骤并重复该步骤，以便获得分娩后的产奶量增加。根据某些实施方案，将所述肽以选自由以下组成的组的间隔在至少一个乳腺上施用一次或多次，通常施用一次至三次：约6小时、约8小时、约12小时、约16小时、约20小时或约24小时。根据当前最优选的一个实施方案，所述至少一种肽仅施用一次。根据当前其他优选的实施方案，将所述肽施用于乳房的全部四个乳腺。根据某些实施方案，平均产奶量增加至少约3％，优选增加至少约6％，更优选增加至少约9％，最优选增加约10％至约25％。

根据又一实施方案，乳液卫生的改善是通过在干奶期初期施用源自酪蛋白的至少一种肽而获得的，所述干奶期初期一般是在预期的分娩前大约60天。选择施用于乳腺的给药步骤并重复该步骤，以便减少SCC并获得所述干奶期随后泌乳期的乳液卫生的改善。根据当前最优选的一个实施方案，所述至少一种肽仅施用一次。

根据另外的实施方案，用于预防遭受与乳腺相关的感染或挤奶突然停止的方法包括单次施用一种或多种酪蛋白衍生肽。

在本发明所公开的新方法的研究期间，发明人认识到需要包括酪蛋白衍生肽的改良的药物组合物。

源自酪蛋白的肽通常是酪蛋白的酶促水解消化产物，其因具有营养价值而著称，因而被用于临床的营养品、婴儿的配方食品，并用作食品和饮料富集的蛋白质。酪蛋白水解物也被认为有药物用途。这样的制剂常以使用前立即与合适的载体(如无菌水)复原的干燥粉末进行销售。所获得的溶液因其具有高营养价值而受到污染，而且其浊度立即妨碍了污染物的鉴定。而且，浑浊的制剂倾向于产生沉淀。

本发明的发明人意外地发现通过约0.1微米至约0.5微米的滤器，优选通过小于0.25微米的滤器来进一步过滤浑浊的酪蛋白制剂可基本上去除酪蛋白胶粒，所述酪蛋白胶粒的存在是产生浊度的主要原因。此外，过滤后的组合物所包括的肽的范围为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。这种大小范围包括优选的酪蛋白衍生肽种群——特别是磷酸肽，从而使得所述过滤过程进一步提供了包括基本上均一的、分子量范围为1,000道尔顿至5,000道尔顿的酪蛋白衍生肽的组合物。

根据又一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述组合物为随时可使用的无菌澄清溶液形式，其基本上无胶粒，且pH高于6.0。根据某些实施方案，所述组合物包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种磷酸肽。根据另外的实施方案，所述一种或多种肽的分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿，优选为约2,500道尔顿。

有待理解的是虽然用上述过滤方法获得了本发明的药物组合物，但是也可用任何本领域已知的去除约0.25μm以上的物质和/或5,000道尔顿以上的肽的方法来获得，其中所述方法如超滤、透析等。

根据一个实施方案，源自酪蛋白的磷酸肽包括氨基酸序列Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQIDNO：1)及其类似物或衍生物，且分子量范围为1,000道尔顿至5000道尔顿。根据另外的实施方案，所述药物组合物包括治疗有效量的选自由源自β-酪蛋白的磷酸肽、源自αS1-酪蛋白的磷酸肽、源自αS2-酪蛋白的磷酸肽或其组合组成的组的磷酸肽。根据当前某些优选的实施方案，所述磷酸肽来源于包括SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的β-酪蛋白及其类似物、衍生物或片段。根据当前其它优选的实施方案，所述磷酸肽来源于包括SEQIDNO：3所示的氨基酸序列的αS1-酪蛋白及其类似物、衍生物或片段。仍根据当前其他优选的实施方案，所述磷酸肽来源于选自包括SEQIDNO：4所示的氨基酸序列的肽和包括SEQIDNO：5所示的氨基酸序列的肽的αS2-酪蛋白，及其类似物、衍生物或片段。根据另外的实施方案，所述药物组合物包括如上所述的多种源自酪蛋白的肽。根据一个实施方案，所述药物组合物包括治疗有效量的主要由SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4和SEQIDNO：5中任一种所示氨基酸序列组成的肽，或其类似物、衍生物和片段，或其任何组合，其中所述肽的分子量范围为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。

所述源自酪蛋白的肽可以由酪蛋白水解所得，或者其也可以是合成肽。合成肽的制备对于所属领域的技术人员是已知的，并如下文所描述。

根据一个实施方案，本发明药物组合物的蛋白质含量为约10ng/ml至约15mg/ml。此数量在治疗应用中是有效的，而且溶液是澄清的。根据一个实施方案，该组合物的浊度小于6个比浊法浊度单位(NephelometricTurbidityUnits)(NTU)。根据另一实施方案，该组合物的pH为约6.0至约8.0。

本发明组合物中的磷酸肽在宽的温度范围内相当稳定。根据一个实施方案，所述磷酸肽耐热，从而使得将包括该肽的组合物加热至50℃至70℃10-15min时，未观察到活性丧失。根据另一实施方案，所述磷酸肽抗冷冻，从而使得该组合物在-20℃可保存至少6个月，优选至少12个月。

根据另一方面，本发明提供了冷冻干燥粉末形式的药物组合物，其包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述粉末在使用前于液体中复原形成基本上无胶粒且pH值高于6.0的澄清溶液。

应理解的是，本发明所述包括至少一种酪蛋白衍生肽尤其是酪蛋白衍生的磷酸肽的新型药物组合物为无菌澄清溶液形式，其适用于上文描述的牲畜管理新方法。可选地，这些药物组合物还可用于上文背景部分所述且为本领域已知的此类多肽的任何用途。

根据另外的方面，本发明提供了一种用于治疗泌乳动物乳腺的药物组合物，其包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述组合物为随时可使用的无菌澄清溶液形式，其基本上无胶粒，且pH值高于6.0。根据某些实施方案，该组合物包括治疗有效量的源自酪蛋白的磷酸肽。根据另外的实施方案，所述药物组合物所包括的磷酸肽的平均分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。根据当前某些优选的实施方案，平均分子量为约2,500道尔顿。

本发明的新型药物组合物在治疗任何泌乳动物的乳腺中意想不到地有效，其中所述泌乳动物包括人类；经养殖用于产奶或肉用的牲畜，包括奶牛、山羊、绵羊和水牛；其他的牲畜动物，包括骆驼、驼羊(llamas)、马和猪；以及宠物，包括猫和狗。

根据某些实施方案，所述治疗选自由诱导暂时性产乳停止、诱导持续性产乳停止或诱导退化组成的组。有利的是，本发明的药物组合物可在大约3天内诱导退化，而对临近下一次泌乳期的乳腺组织的复原不产生负面影响。而且，可在泌乳周期的任意阶段(包括泌乳高峰)诱导退化。

根据另一方面，本发明的新型药物组合物可用于预防、治疗微生物感染和逆转微生物感染。

该组合物对范围广泛的病原体所引起的感染均有疗效，其中所述病原体包括，但不限于革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌、真菌、支原体以及病毒。根据一个实施方案，本发明的组合物对于引起乳腺炎的微生物感染有疗效。因此，本发明所提供的药物组合物减少了对治疗感染(包括乳腺感染)的抗生素的依赖性，缓解了在乳腺炎的情况中，抗生素耐受感染的问题和抗生素在乳液内存在残留的问题。可选地，本发明的药物组合物可与其他的抗微生物治疗结合施用。根据一个实施方案，本发明的药物组合物与抗微生物剂结合施用，所述抗微生物剂选自由抗生素、杀菌剂、甾族的抗炎剂和非甾族的抗炎剂组成的组。联合治疗可减少上述药剂所需的剂量，和/或增强其治疗效果。根据另一实施方案，所述药物组合物与疫苗联合用药。根据又一实施方案，所述药物组合物与免疫调节剂联合用药。

除在泌乳期有效治疗乳腺炎外，本发明的新型药物组合物在诱导干奶期的同时进行给药，成功地克服了乳腺炎感染从一个泌乳周期延续到下一泌乳周期的问题。

本发明的新型药物组合物通常配制成肠胃外给药。根据一个实施方案，所述药物组合物配制成沟内给药，如通过输注或通过注射。根据当前一个优选的实施方案，所述药物组合物被配制成经泌乳动物乳腺的乳头沟(teatcanal)注射进入乳腺池(glandcistern)。该药物组合物还可配制成凝胶、软膏剂、乳膏、乳剂或持续释放剂型(如透皮贴剂)而局部施用于胸部或乳房。可选地，本发明的药物组合物被配制为全身口服施用。

根据另外的方面，本发明提供了一种用于选自由牙科用途和治疗用途组成的组但不限于其的用途的药物组合物，其包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述组合物为随时可使用的无菌澄清溶液形式，其基本上无胶粒，且pH值高于6.0。例如，除了别的以外，美国专利第5,227,154、5,834,427和6,652,875号；欧洲专利申请第EP1375513号；国际PCT申请WO01/13739和WO2005/081628以及美国专利申请公布文本20020147144和20040167073公开了这些已知的用途。

根据又一方面，本发明提供了一种用于治疗泌乳动物乳腺的方法，其包括对所述泌乳动物施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述组合物为随时可使用的无菌澄清溶液形式，其基本上无胶粒，且pH值高于6.0。

根据一个实施方案，所述治疗选自由诱导暂时性产乳停止、诱导持续性产乳停止和诱导退化组成的组。

根据另一方面，本发明提供了用于治疗和抑制微生物感染的方法。

根据某些实施方案，所述感染为乳腺炎，其包括临床型乳腺炎和亚临床型乳腺炎，并且所述组合物施用于泌乳动物受感染的乳腺。根据一个实施方案，在泌乳期施用所述药物组合物来治疗挤奶期间的乳腺炎。根据另一实施方案，所述药物组合物在泌乳周期末或干奶期期间施用。在干奶期开始或在干奶期过程中的施用包括施用于受感染的乳腺以治疗现有的乳腺炎，以及作为预防治疗用于治疗未感染的乳腺。

泌乳动物的所有乳腺同时停止挤奶通常导致不期望的炎症反应。目前，本发明意想不到地显示了同时对泌乳动物的所有乳腺施用本发明的药物组合物并未伴有任何不良反应。因此，有可能在个体动物的任何期望数目的乳腺中诱导产奶停止和诱导退化并治疗乳腺炎。根据本发明的施用包括仅施用于一个乳腺至施用于所有乳腺，如奶牛乳房的全部四个乳腺。

本发明的药物组合物的施用方案视预期效果和所治疗的动物而定。包括单次施用和多次施用。根据某些实施方案，对于治疗乳腺炎而言，所述肽可以选自由以下组成的组的间隔施用一次或多次，优选1次至3次：约6小时、约8小时、约12小时、约16小时、约20小时或约24小时。根据其他实施方案，对于诱导产奶停止和诱导退化而言，所述肽作为单次治疗施用。单次用药的治疗方案因为增加了治疗的依从性而倍受欢迎。

根据另外的方面，本发明提供了一种调节受治疗者免疫反应的方法，其包括对泌乳动物施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述组合物为随时可使用的无菌澄清溶液形式，其基本上无胶粒，且pH值高于6.0。

根据一个实施方案，调节免疫反应包括刺激和增强天然的免疫反应。

根据以下的说明和附图，本发明的其它目的、特征及优点将变得清楚。

附图说明

图1显示施用酪蛋白水解物后编号2425的奶牛产奶量与先前泌乳期相比的增加。

图2显示施用酪蛋白水解物后编号2331的奶牛产奶量与先前泌乳期相比的增加。

图3显示干奶后的前七天与泌乳(泌乳)的最后三天期间10只接受治疗的奶牛(突然停止挤奶+抗生素干奶治疗+酪蛋白水解产物治疗)与10只以常规方式干奶的对照奶牛(突然停止挤奶+抗生素干奶治疗)的乳房压力指数。干奶期后治疗组间差异在P＜0.01时达统计学意义。

图4显示产奶量大于30L的2只奶牛治疗后第4天的乳房。图4A——使用C治疗的奶牛(突然停止挤奶+抗生素干奶治疗)，图4B——使用C+N治疗的奶牛(突然停止挤奶+酪蛋白水解产物+抗生素干奶治疗)。

图5显示干奶后的前七天与泌乳(泌乳)的最后三天期间接受治疗的10只奶牛(C+N——突然停止挤奶+抗生素干奶治疗+酪蛋白水解产物治疗)与以常规方式干奶的10只对照奶牛(C——突然停止挤奶+抗生素干奶治疗)的步数与躺卧持续时间的平均累积比例。干奶期后治疗组间差异在P＜0.005时达统计学意义。

发明详述

在更详细地解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解的是本发明并不限于其在以下说明书中提出的详细应用或者限于其经由实施例举例说明的应用。本发明可以具有其他的实施方案或者能够用不同方式实施或进行。此外，应理解的是本发明所采用的短语和术语用于说明的目的，而不应认为进行限制。

定义

如本发明所使用的术语“酪蛋白”是指人类和非人类哺乳动物乳液中的主要蛋白质，其包括αS1、αS2、β以及κ亚型。

如本发明所使用的术语αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白和β-酪蛋白是指哺乳动物的蛋白质αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白和β-酪蛋白，所述哺乳动物包括，但不限于牲畜哺乳动物(如奶牛、绵羊、山羊、母马、骆驼、鹿和水牛)、人类及海洋哺乳动物。

说明书通篇所使用的术语“肽”是指氨基酸残基通过肽键彼此连接的线性排列。根据本发明原理的肽不是完整的蛋白质。

如本发明所使用的术语“磷酸肽”是指接合的肽形式的磷酸化肽，其中非肽部分是磷酸残基。特别的是，所表达的“酪蛋白磷酸肽”或“CPP”是指包括酪蛋白片段的磷酸肽。

如本发明所使用的术语“产乳停止”是指暂时性产乳停止和持续性产乳停止。暂时性产乳停止指可逆性的停止。持续性停止是指只能通过妊娠后分娩和通过性激素治疗逆转的泌乳中断。根据本发明的教导，机械刺激(即挤奶)也可逆转由本发明的组合物和方法诱导的持续性产乳停止。

如本发明所使用的术语“干奶期”是指分娩前停止挤奶的时期。根据本实践，施用干奶期对于完成退化过程是必须的，在此之后临近分娩时恢复泌乳能力。当前，干奶期的长度在50天至70天之间。目前，本发明意想不到地显示了可将干奶期缩短至少于约50天，优选少于约40天，更优选在约20天至约30天之间，而对产奶量无负面影响。本发明意想不到地显示了应用酪蛋白衍生肽以施加干奶期使得干奶期后的泌乳期产奶量显著增加。

如本发明所使用的术语“乳腺炎”是指乳腺或乳房的炎症，其由物理损伤、化学制品的引入、病毒、真菌、寄生虫引起，或者最常见的是由细菌侵入及其毒素引起。“乳腺炎”用来描述所有类型的这样的炎症，其包括临床型乳腺炎和亚临床型乳腺炎，其中临床型乳腺炎包括轻度、重度及慢性乳腺炎。

在亚临床型乳腺炎中，既未检测到乳腺或乳房肿胀也未观察到乳液异常。但是，诸如基于评价体细胞计数的加州乳腺炎试验(CMT)和威斯康新州乳腺炎试验(WMT)的特异性的筛选试验和过氧化氢酶试验显示了乳液成分的变化。这种类型的乳腺炎通常称为“隐性”。

临床型乳腺炎可以是轻度或急性的，其特点是乳液中存在白细胞。轻度临床型乳腺炎涉及到乳液外观的变化，包括存在絮状物或凝块、水样奶或其他不寻常的乳液形式。轻度的临床型乳腺炎可能伴有其他的症状，包括乳房或乳腺发热、敏感或肿胀。

重度临床型乳腺炎包括对泌乳动物而言相当痛苦的乳房或乳腺发热、敏感、坚硬。重度临床型乳腺炎发病迅速，从而使得泌乳动物患病，并表现出发热、脉搏加快、抑郁、虚弱和食欲缺乏的体征。当动物的整个泌乳系统受到影响时，该情况称为急性全身性乳腺炎。该严重的症状还可能伴随有产乳停止。

慢性乳腺炎是指持续性乳房感染，其通常为亚临床型乳腺炎形式，所述慢性乳腺炎偶尔可以发展为临床型乳腺炎而后再演变为亚临床型。慢性乳腺炎以因细菌定居和结缔组织形成而产生的乳腺内硬块为特征。

如本发明所使用的术语“奶牛的干奶治疗”或“干奶治疗”是指为了消除、治疗和急性诊断在泌乳期结束时的乳腺炎炎症，在泌乳期的最后一次挤奶后立即在乳房内实施的治疗。

如本发明所使用的术语“奶牛的干奶防止/预防治疗”是指为了预防干奶期期间的乳腺炎炎症，在泌乳期最后一次挤奶后立即实施的乳房内治疗，以及为了预防下一次泌乳期期间的乳腺炎，在分娩后立即实施的乳房内治疗。

如本发明所使用的术语“牲畜福利”或“农场动物福利”是指预防遭受并增加存在的积极感受(一般称为舒适度或愉悦)，其中所述积极感受除了别的以外，是由增加躺卧期、增加反刍时间、减少代谢需要、减少乳房压力和/或乳头渗奶、减少乳腺炎和其他疾病的发生率和减少因产奶过多带来的跛行效应所引起的。

如本发明所使用的术语“澄清药物组合物”和/或“澄清溶液”是指浊值小于6个NTU的液体溶液。如本发明所使用的浊度是指光线通过水柱时因悬浮的有机颗粒和无机颗粒发生散射，测量散射程度的量化单位。光线散射随悬浮物增多而增强。浊度常用比浊法浊度单位来代替杰克森浊度单位(jacksonturbidityunit)(JTU)进行测量。浊度测定法将参考溶液散射的光线和样品散射的光线进行比较。

如本发明所使用的术语“胶粒(micelle)”或“胶粒(micelles)”是指组成胶质颗粒的分子聚集物，尤其指主要包括蛋白质、钙和磷酸盐的酪蛋白胶粒。这些胶粒还包括柠檬酸盐、少量离子、脂酶、纤溶酶以及包埋的乳清。酪蛋白胶粒具有相当多孔的结构，其占乳液总体积份数的大约6％至12％。酪蛋白胶粒直径范围为90nm至150nm。来自电子显微镜及其他方法的证据表明胶粒由直径为10nm至20nm的更小的单元(称为亚胶粒)组成。

如本发明所使用的术语“无菌”是指溶液不含病原体，如同所属领域的技术人员已知的常规无菌技术所测定的，也不含内毒素，其中根据鲎阿米巴样细胞溶解物(LAL)试验，终产物中内毒素水平少于0.5EU/ml。

如本发明所使用的术语“平均分子量”是指通过本领域技术人员已知的方法测定的蛋白质或肽的分子量平均值加或减标准差。这些方法包括，例如SDS凝胶电泳和在诸如HPLC的仪器上进行的分子排阻色谱，其中将样品与已知分子量的标准品一起进行比较跑柱(run)。

本发明药物组合物中的肽优选的平均分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。因此，本发明特别考虑了总共具有10个至50个氨基酸残基的肽。本发明还考虑了其中将核基序序列(如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列)人工嵌入多肽序列(如通过DNA重组技术或通过化学合成制备的肽)内的肽。所述肽可通过酪蛋白水解产生肽的混合物而获得。根据本发明的教导，可以使用肽的混合物，或者可利用任何本领域已知的蛋白质纯化方法来进一步纯化该混合物而得到分离的肽。

本发明药物组合物中的肽还可利用本领域公知的方法进行合成，所述方法包括DNA重组技术和化学合成。所述合成可以在溶液中进行或如Merrifield所述通过固相肽合成进行(参见J.Am.Chem.Soc.，85：2149，1964)。丝氨酸残基的磷酸化可以通过如本领域已知的任何方法进行，除了别的以外，如在例如Meggio等，1991.FEBSLett.283(2)：303-306和PerichJW1997.MethodEnzymol.289：245-246中所描述的。

一般而言，肽合成方法包括在生长的肽链上依序加上一个或多个氨基酸，或加上受适当保护的或衍生的氨基酸。通常第一个氨基酸的氨基或羧基被合适的保护基团保护。受保护或衍生的氨基酸随后可以连接在惰性的固体载体上，或者在适合形成酰胺键的条件下，通过在具有受适当保护的互补(氨基或羧基)基团的序列中添加下一个氨基酸而在溶液里应用。然后将保护基团从这种新加上的氨基酸残基上移除，随后添加下一个氨基酸(受适当保护的)，如此类推。按惯例此过程也包括洗涤步骤。当所有期望的氨基酸以合适的次序连接后，将保护基团(以及任何固体载体)依次或同时移除得到最终的肽。通过这种常规步骤的简单修饰，有可能同时将超过一个的氨基酸添加到生长链上，如，在脱保护后通过将受保护的三肽与受适当保护的二肽进行偶联(在不形成外消旋手性中心的条件下)形成五肽，如此类推。

本发明公开了用于综合管理牲畜泌乳动物畜群的方法，该方法利用了酪蛋白衍生肽。

根据一方面，本发明提供了一种通过对泌乳牲畜动物施用有效量的源自酪蛋白的至少一种肽来缩短泌乳周期间的干奶期长度而对产奶量无负面影响的方法。

在现代的乳品加工行业，泌乳动物一年分娩一次，因而使得动物怀孕时可继续进行挤奶。为了在临近下一泌乳期时使乳房组织恢复，常在分娩前采取对泌乳动物施加干奶期的措施来诱导乳腺的退化过程。除了别的以外，诱导干奶期是保持分娩前后产乳量相近所必需的。奶牛在其通过停止挤奶而进行诱导后的第21天至30天完成了天然的退化过程。由于干奶期少于40天导致随后的泌乳期产奶量下降10％至30％，因此，50天至70天的干奶期成为了行业标准。最近发现干奶期为30天的奶牛的产奶量也并未减少，但是其仅仅是对于施用可能带来不希望的副作用的牛生长激素的经产奶牛而言(Annen等，ibid)。本发明的发明人之一与其合作者以前曾发现泌乳山羊和泌乳奶牛的退化过程的长度可缩短至约3天。本发明目前出乎意料地显示了有可能在3天内诱导泌乳奶牛乳房全部四个乳腺的退化。

本发明目前公开了施用酪蛋白衍生肽不仅有效诱导迅速退化，而且在对产奶量无负面影响下将干奶期有效缩短至少于50天，优选少于约40天，更优选在约20天至约30天之间。现代奶牛虽然每天仍能产奶20升至40升，但其通常也会变干。因此，缩短干奶期具有重要的经济价值。而且，本发明目前证实了通过本发明的方法——即通过对泌乳动物施用源自酪蛋白的至少一种肽而不是通过停止挤奶启动泌乳动物的干奶期，可使干奶期后的泌乳期期间产奶量增加。尽管不希望受到具体的机制束缚，但是这种产奶量的增加可能与以下因素有关：(a)SCC的减少及其对产奶量的负面效应；和/或(b)由施用源自酪蛋白的至少一种肽所诱导的更大范围的细胞凋亡，造成了更广泛的乳房上皮细胞群置换为新的细胞。

根据另一方面，本发明提供了一种用于改善泌乳牲畜动物乳液卫生的方法，其包括对所述泌乳动物的乳腺施用治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽。

如本发明所使用的术语“乳液卫生”是指每ml乳液中的体细胞计数(SCC)。“改善乳液卫生”是指将SCC减少至等于或小于750,000细胞/ml乳液，优选等于或小于600,000细胞/ml乳液，更优选等于或小于400,000细胞/ml乳液，甚至更优选等于或小于300,000细胞/ml乳液，最优选等于或小于200,000细胞/ml乳液。现代乳业的一个典型现象是从泌乳动物特别是奶牛获得高的产奶量，即使是患有亚临床型乳房感染的奶牛亦如此。这样的奶牛通常产奶量高，然而，一个或多个乳腺的感染使乳液中SCC升高到可以导致整个集液罐内总计数都升高的水平，从而降低关于农场水平的乳品等级。泌乳期内进行乳房内抗生素治疗可治疗细菌感染，但是，其与治疗前的水平相比不能够降低四分之一或者使奶牛SCC减少(Cattell等，2001.J.DairySci.84：2036-2043)。本发明目前表明施用酪蛋白衍生肽导致SCC显著降低。更意外的是，本发明目前公开了一次性施用至少一种酪蛋白衍生肽足够达到这种降低SCC的效果。依据本发明的教导，为了使治疗仅仅局限于感染乳腺，将酪蛋白衍生肽局部施用于受感染乳腺的乳头沟。肽在受感染乳腺的局部活性允许从其他未感染乳腺继续挤奶。因为乳腺感染通常是唯一可能提高SCC的因素，故治疗后乳液卫生立即得以迅速改善。本发明目前显示施用源自酪蛋白的至少一种肽有效减少了亚临床型感染奶牛的SCC，并且对临床型感染奶牛也有一定程度的改善。因为治疗作用可以局限于感染乳腺，所以无需废弃未感染乳腺的牛奶，即可立即改善乳液质量。这是重要的，因为废弃患有临床型乳腺炎的奶牛的乳液是造成经济损失的主要原因之一(DeGraves和Fetrow，1993.Vet.Clin.NothAm.FoodAnimalPract.9：421-434)。可以施用于泌乳奶牛的一个乳腺和所有乳腺，例如，施用于泌乳奶牛的全部四个乳腺。意外的是，在下一泌乳周期中由受治疗乳腺获得的乳液包括较低的体细胞计数。根据某些实施方案，在干奶期对泌乳动物的一个或多个乳腺施用酪蛋白衍生肽可以改善下一泌乳期的乳液卫生。

可用源自酪蛋白的一种类型的肽或源自酪蛋白的多种类型的肽来实施本发明的方法。根据某些实施方案，用下文描述的本发明随时可使用的澄清药物组合物来实施本发明的方法。

根据某些另外的实施方案，所述源自酪蛋白的肽包括磷酸肽。根据另外的实施方案，所述磷酸肽包括SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。根据另一实施方案，所述磷酸肽选自由源自β-酪蛋白的磷酸肽、源自αS1-酪蛋白的磷酸肽和源自αS2-酪蛋白的磷酸肽组成的组。根据当前某些优选的实施方案，本发明方法所采用的磷酸肽包括选自由SEQIDNO：2和SEQIDNO：5组成的组的氨基酸序列，及其类似物、衍生物以及片段；其中这些术语如本发明所定义。可用来源于酪蛋白水解的肽来实施本发明的方法，其中所述肽如未纯化的酪蛋白水解产物、纯化的酪蛋白水解产物和从酪蛋白水解产物纯化得到的肽。此外，可用源自酪蛋白的合成肽来实施本发明的方法。所述酪蛋白衍生肽可以掺入药物组合物中。

根据又一方面，本发明提供了一种预防牲畜泌乳动物遭受与乳腺相关的感染和挤奶突然停止的方法，其包括对所述泌乳动物乳腺施用治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，从而改善所述泌乳动物的福利。

根据某些实施方案，改善所述泌乳动物的福利是通过减少所述动物每天的步数和通过延长所述动物每天的躺卧时间来估量的。根据一个实施方案，将源自酪蛋白的所述至少一种肽施用于受感染的乳腺。根据另一个实施方案，将所述至少一种肽施用于未感染的乳腺。

本发明进一步意想不到地公开了通过0.1μm至约0.5μm的滤器，优选通过小于0.25μm的滤器来过滤浑浊的包括酪蛋白衍生肽的组合物得到了高度符合药物用途的澄清溶液。

根据另外的方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述组合物为随时可使用的无菌澄清溶液形式，其基本上无胶粒，且pH值高于6.0。根据一个实施方案，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。根据某些实施方案，所述组合物包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种磷酸肽。根据另外的实施方案，所述药物组合物包括平均分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿的磷酸肽。根据当前某些优选的实施方案，本发明新型药物组合物中肽的平均分子量为约2,500道尔顿。

如本发明所使用的短语“源自酪蛋白的肽”是指为酪蛋白切割产物的肽(此处指源自天然酪蛋白的肽)；对应于酪蛋白单元的氨基酸序列进行化学合成的合成肽(此处指源自酪蛋白的合成肽)；以及与酪蛋白相似的肽(同源的)，例如，特征为具有一个或多个氨基酸置换、插入或缺失(如，但不限于可允许的置换)的肽，前提是其保留至少70％，优选保留至少80％，更优选保留至少90％的相似性，及其功能性同源物。如本发明所使用的术语“同源物”和“功能性同源物”是指具有不影响此处所描述的肽生物活性的任何插入、缺失和置换的肽。

如本发明所使用的短语“其组合”定义为上述源自α-酪蛋白或β-酪蛋白的肽中任意一种与源自α-酪蛋白或β-酪蛋白的肽中一种或多种其他不同的肽组合成的混合物。如本发明所使用的术语“混合物”定义为彼此以可变比例存在的肽的非共价组合。

根据某些实施方案，所述源自酪蛋白的肽是指包括活性基序Ser(p)-Ser(p)-Ser(p)-Glu-Glu(SEQ.IDNO：1)的磷酸肽。应理解的是，包括这种基序的任何的肽均包括在本发明的范围内，其中无论这种基序是来源于酪蛋白或来源于除了酪蛋白之外的通过重组技术合成或生产的蛋白，均保留了如此处所描述的肽的生物活性。本发明的磷酸肽通过具有SEQIDNos.2至5任一所示的氨基酸序列的肽举例说明(见下表)：

本发明还包括药物组合物，所述药物组合物包括以上列出的肽的类似物、衍生物或片段，只要所述类似物、衍生物和片段保留它们如此处所述的生物活性即可，所述药物组合物为此处所定义的澄清溶液形式，并且所述肽的类似物、衍生物和片段的分子量为约1,000道尔顿至约5,000道尔顿。

术语“类似物”包括任何的肽，所述肽包括通过对本发明的肽进行氨基酸置换、添加、缺失或化学修饰而改变的序列，并且所述肽保留了肽的生物活性。“氨基酸置换”是指将序列内的氨基酸残基置换为功能相同的残基而不造成变化。例如，可以将序列内的一种或多种氨基酸残基置换为另一种极性相似的起相同功能的氨基酸，而不产生变化。序列内氨基酸的置换物可以选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性为中性的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这类置换称为保守置换。另外，可以在氨基酸中进行不影响肽生物活性的非保守置换。应理解的是本发明包括肽类似物，在该肽类似物中至少一个氨基酸被置换为另一个氨基酸从而生成了本发明具有活性的肽类似物，所述肽类似物与此处所列的肽相比具有增加的稳定性或更长的半衰期。

虽然SEQIDNO：1至5所示的肽序列的氨基酸残基均为“L”异构形式，但是“D”异构形式的残基也可以置换任何的L-氨基酸残基，只要该肽的类似物保留其活性即可。制备逆反(retro-inverso)D-氨基酸肽类似物的方法为本领域所公知，其中所述肽使用所公开的相同氨基酸制备，但至少一个或多个氨基酸(包括全部氨基酸)是D-氨基酸。当肽类似物中所有的氨基酸都是D-氨基酸并且所述肽类似物的N末端和C末端被反转时，就形成了具有与肽的L-氨基酸形式处于相同位置的相同结构基团的类似物。但是，所述肽类似物对于蛋白水解降解更为稳定，因而可用于此处所叙述的多种用途。

术语“衍生物”是指具有氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列包括本发明肽的氨基酸序列，其中通过支链或官能团的反应使一个或多个氨基酸残基经受化学衍生作用，其中这样的衍生作用不破坏所述肽衍生物的活性。氨基酸残基的化学衍生作用包括，但不限于糖基化、氧化、还原、十四烷基化、硫酸盐化作用、酰化、乙酰化、ADP核糖基化、酰胺化、环化、形成二硫键、羟化、碘化和甲基化。

根据本发明原理的肽衍生物还包括键修饰，所述键修饰包括，但不限于CH₂-NH、CH₂-S、CH₂-S＝O、O＝C-NH、CH₂-O、CH₂-CH₂、S＝C-NH、CH＝CH、CF＝CH以及主链修饰。所述肽内的肽键(-CO-NH-)可被替换为，如N-甲基化键(-N(CH₃)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N)、酮亚甲基键(-CO-CH₂-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R为任意烷基基团(如甲基)、胺甲酰键(carbabonds)(-CH₂-NH-)、羟乙烯键(-CH(OH)-CH₂-)、硫代酰胺键(-C＝S-NH-)、烯属的双键(-CH＝CH-)和肽衍生物(-N(R)-CH₂-CO-)，其中R是碳原子上天然存在的“标准”支链。这些修饰可沿着肽链的任意键进行，甚至可以在几个键(2-3)上同时进行。

本发明还包括游离氨基被衍生形成胺盐的那些肽，所述胺盐包括，但不限于氢氯化物、p-甲苯硫酰基团、苄酯基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基。游离的羧基可衍生形成例如盐、甲基酯和乙基酯或其他类型的酯类或酰肼。游离的羟基可衍生形成如o-酰基或o-烷基衍生物。组氨酸咪唑上的氮可衍生形成N-咪唑-苯甲基组氨酸(N-im-benzylhistidine)。

还作为化学衍生物包括在内的是那些包括二十个标准氨基酸残基的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如：4-羟基脯氨酸可取代为脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代为赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代为组氨酸；同型丝氨酸可取代为丝氨酸以及鸟氨酸可取代为赖氨酸。这些肽还可以包括非天然氨基酸。非天然氨基酸的非限制性实例为正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、同型丝氨酸、同型半胱氨酸、异丙基Lys、3-(2’-萘基)-Ala、烟酰基Lys、氨基异丁酸和3-(3’-吡啶基-Ala)。所述肽还可包括非蛋白质的支链。除此之外，本发明的肽还可包括一种或多种非氨基酸的单体或低聚物(如脂肪酸、碳水化合物复合物等)。还包括相对于上文所列的肽序列添加一个或多个氨基酸残基的任意的肽，只要其保持必要的活性和优选的分子量即可。所述氨基酸残基可加在所述肽序列的氨基末端和/或羧基末端和/或沿着所述肽序列添加。

本发明的肽衍生物还可以是环肽。例如，可以通过形成酰胺键(-CO-NH或-NH-CO键)实现环化，如通过在链上的不同位置引入Glu、Asp、Lys、Orn、二氨基丁(Dab)酸、二氨基丙(Dap)酸。主链与主链的环化还可通过引入式H-N((CH₂)_n-COOH)-C(R)H-COOH或H-N((CH₂)_n-COOH)-C(R)H-NH₂的修饰的氨基酸而实现，其中n＝1-4，且进一步的其中R为任何天然或非天然的氨基酸支链。还包括主链与支链以及支链与支链的环化。

也可能通过引入两个Cys残基形成S-S键进行环化。其他支链与支链的环化可通过与式-(-CH₂-)_n-S-CH₂-C-形成相互作用的键而实现，其中n＝1或2，例如，通过引入Cys或同型Cys并使其游离的SH基团与诸如溴代乙酰化的Lys、Orn、Dab或Dap反应是可能的。

如本发明所使用的术语“片段”是指相对于此处所列的肽序列具有一个或多个氨基酸残基缺失的肽，只要所述肽保持必要的活性即可。所述氨基酸残基可以从所述肽序列的氨基末端和/或羧基末端缺失和/或沿着所述肽序列缺失。

肽片段可由化学合成、重组DNA技术或通过至少一种切割剂作用于此处所列的所述肽制备。切割剂可以是化学切割剂，如溴化氰；或者酶，如外蛋白酶或内蛋白酶。可以用来切割本发明的肽的内蛋白酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶或任何其它本领域已知的产生蛋白水解片段的酶。

如上所述，本发明的肽可由酪蛋白水解获得，或者所述肽可通过合成获得。

酪蛋白的水解通常由胰蛋白酶或胰腺提取物消化来进行。然后从含所述肽的溶液中分离出未消化的酪蛋白，再通过合适的如本领域已知的方法和如以下所举例的方法来进一步脱掉其它杂质而纯化。根据本发明的某些实施方案，制备和纯化随时可使用的澄清药物组合物包括过滤溶液。根据当前某些优选的实施方案，过滤采用了包括如氮气或氩气的惰性气体在低压下通过0.2μm至0.5μm的滤器进行。优选地，过滤通过0.22μm的滤器进行。意外的是，本发明证实了将酪蛋白水解产物制品经过孔径小于0.5μm，优选为约0.2μm的膜过滤，得到了澄清溶液。溶液澄清的外观主要是因为除去了剩余的未消化的酪蛋白胶粒。酪蛋白胶粒形成的胶体颗粒提供了牛奶的不透明的白色外观。应理解的是通过如本领域已知的其它方法获得的具有与本发明的药物组合物相同特性的药物组合物也包括在本发明的范围之内，即，包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，为基本上无胶粒的澄清溶液形式，其中所述至少一种肽的分子量范围为1,000道尔顿至5,000道尔顿。

本发明的药物组合物相当稳定。如本发明所使用的术语“稳定”是指源自酪蛋白的肽在一定温度下孵育后，其活性保留原始肽活性的至少85％，优选90％，更优选95％或更多。

本发明药物组合物内的磷酸肽在高温和低温下均稳定。所述药物组合物内的磷酸肽可以保持冷冻而基本上无活性丧失。另外，将所述药物组合物加热达70℃约15min也无活性丧失。

本发明提供了包括源自酪蛋白的肽的药物组合物，所述药物组合物为随时可使用的无菌澄清溶液形式。这种组合物对当前可获得的酪蛋白衍生产品是有利的，因为该溶液的澄清度使得任何污染特别是微生物污染的检测简便迅速。与许多迄今为止已知的以粉末形式提供的组合物相比，这种随时可使用的溶液在施用前无需复原步骤。根据某些实施方案，本发明的药物组合物预期用于兽医用途，因而使得所述药物组合物可施用于大量的受治疗者。本发明的药物组合物满足了这种情况的需要，提供了一种易检测污染且随时可使用的制剂。

溶液的澄清度可用本领域技术人员已知的任何方法测量。根据某些实施方案，根据其浊值来确定溶液的澄清度。本发明所使用的“澄清”溶液是指浊值小于6个NTU的溶液。

术语“药物组合物”在此处预期更广泛地理解为包括含有依据本发明的蛋白质组合物的配制品，所述配制品不仅如本领域已知的用于治疗目的，而且用作试剂或诊断目的。预期用于治疗用途的药物组合物应包括治疗量的源自酪蛋白的肽，即，该量是预防和治疗卫生措施所需要的。如果采用该药物组合物作为试剂或进行诊断，那么该药物组合物就应包括试剂量或诊断量的源自酪蛋白的肽。

根据某些实施方案，本发明药物组合物的蛋白质浓度为约10ng/ml至约15mg/ml。

术语“药物组合物”进一步指此处所描述的一种或多种肽和其它化学成分的配制品，所述其它化学成分如药学上合适的稀释剂、载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进化合物施用于生物体。

如本发明所使用的术语“药学上可接受的载体”是指对生物体不造成明显刺激且不消除所施用化合物的生物活性和特性的稀释剂或载体。载体的非限制性实例为：水、丙二醇、盐水、乳剂和有机溶剂与水的混合物。如本发明所使用的术语“赋形剂”是指为了进一步促进化合物施用而添加的惰性物质。赋形剂的非限制性实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖类以及各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。

药物的配制和施用技术可参见最新版本的“Remington’sPharmaceuticalSciences，”MackPublishingCo.，Easton，PA，其内容在此通过引用并入。根据当前某些优选的实施方案，本发明的药物组合物被配制成肠胃外施用，如沟内施用，特别是注射或输注入乳腺的乳头沟。对于注射而言，本发明的肽可在水溶液中进行配制，优选在生理相容的缓冲液(如Hank’s溶液、林格氏溶液)中进行配制，或者在具有或不具有有机溶剂(如丙二醇和聚乙二醇)的生理盐水缓冲液中进行配制。鉴于局部施用或全身施用，未对沟内施用于乳腺的乳头沟进行定义。如本发明所公开的，沟内施用本发明的药物组合物可以通过例如只诱导受治疗乳腺的退化来产生局部效应，并由此被称为局部施用。所述药物组合物还可作为凝胶、软膏剂、乳膏、乳剂或持续释放剂型(包括透皮贴剂)进行局部施用。本发明还包括肠胃外(perenterally)或口服的全身施用。

根据另一方面，本发明提供了一种冷冻干燥粉末形式的药物组合物，其包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述粉末在使用前于液体中复原形成基本上无胶粒的且pH值高于6.0的澄清溶液。

根据另一方面，本发明提供了一种用于治疗泌乳动物乳腺的药物组合物，其包括治疗有效量的源自酪蛋白的至少一种肽，其中所述组合物为随时可使用的无菌澄清溶液形式，其基本上无胶粒，且pH值高于6.0；所述治疗包括诱导暂时性产乳停止和诱导持续性产乳停止。

根据又一方面，本发明的新型药物组合物用于预防和治疗感染或逆转感染。根据其他实施方案，所述药物组合物包括平均分子量为约1,000道尔顿至5,000道尔顿的磷酸肽。根据当前某些优选的实施方案，所述肽的平均分子量为约2,500道尔顿。

根据某些实施方案，所述泌乳动物选自由人、奶牛、山羊、绵羊、水牛、骆驼、驴、驼羊、马、猪、猫和狗组成的动物组。

根据当前某些优选的实施方案，所述泌乳动物是人。在最近几十年，全世界技术发达国家的母乳喂养减少，而且在发展中国家甚至也减少到更少的程度。很多女性选择根本不哺育自己的孩子或在短期时间后停止哺育。其他的是因为各种医学原因而不能哺育，包括患某些遗传或非遗传疾病的女性，具体的例子是携带HIV的女性。目前卫生当局推荐HIV携带者在分娩后仅保持母乳喂养大约10周，此后只应提供代乳品。产下早产儿，或未存活的足月儿(termbabies)的妇女也不能哺育。在这些情况中，乳腺产奶但未挤奶。这样的乳液淤积在一定程度上与显著引起身体和心理上的痛苦的乳房肿胀有关。另外，乳液淤积经常与泌乳泄漏有关，这随后增加了患乳房内感染的风险。本发明的药物组合物和方法满足了快速并且有效诱导退化和停止产奶以预防以上所述不希望的情况的需要。

根据当前另外优选的实施方案，动物是选自由奶牛、水牛、山羊和绵羊组成的组的牲畜动物。

本发明新型的药物组合物有效诱导了暂时性产乳停止或持续性产乳停止。通常，通过将本发明的药物组合物经乳头沟直接注射或输注来进行单次应用，而响应于所述单次应用可获得对泌乳动物乳腺的产奶量的暂时性效果。通常，单次注射或输注8小时后可引起产奶量急剧下降。本发明现在公开了单次使用本发明的药物组合物还能够引起持续性产乳停止或退化。仅在治疗的乳腺中发生产乳停止；这种现象很重要，因为未接受治疗的乳腺仍可挤奶从而减少了产奶量的损失。可选地，如果需要，对泌乳动物的所有乳腺进行治疗以诱导产奶停止。

由本发明药物组合物诱导的退化比停止挤奶诱导的退化更为迅速和同步，机械刺激如挤奶可以恢复产奶。在自然退化过程中，在随后的妊娠和分娩后，产奶也可恢复。由本发明组合物诱导的快速退化不干扰乳腺组织的重建和临近分娩时泌乳能力的恢复。

本发明新型的药物组合物可进一步用于治疗乳腺感染。如本发明所使用的术语“治疗”是指预防人类和非人类乳腺感染以及治疗感染的乳腺以逆转感染和治愈乳腺。

本发明药物组合物可用于治疗范围广泛的微生物感染，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、支原体和病毒引起的感染。

根据某些实施方案，所述药物组合物可用于治疗乳腺炎，特别是包括奶牛、绵羊、水牛和山羊的牲畜的乳腺炎。

临床型和亚临床型乳腺炎是主要由细菌感染引起的炎症状态。乳腺炎具有多种细菌病因学，其给年产奶量带来了巨大损失。最经常引起乳腺炎的致病微生物按来源分为两类：环境病原体和传染性病原体。主要的传染性病原体是无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negativestaphylococcus)(CNS)以及大肠埃希杆菌(E.Coli)。除了一些在其它身体部分出现并全身传播的支原体感染外，这五种主要类型的微生物通过乳头沟进入乳腺。传染性病原体在乳腺内很适合存活并生长，经常导致持续数周、数月或数年的感染。在乳畜群中，这些感染的乳腺是这些生物体向未感染区域传播传染性病原体的主要来源，而奶牛主要是在挤奶过程中发生传染。

临床型乳腺炎由于有明显的乳液组成改变和外观改变、产奶量下降、体温升高和受感染乳腺肿胀、潮红、发热，而使其易于诊断。亚临床型乳腺炎是该疾病的最普遍的形式，经常由于症状不明显而难以察觉。许多亚床型IMI往往持续，并且由于乳液SCC升高而导致牛奶质量下降，也导致产奶量下降。局限于单个乳腺的IMI可能发展为临床型乳腺炎，并由感染乳房区域向未感染区域传播某些乳腺炎病原体。与临床型乳腺炎不同，亚临床型乳腺炎因治愈率低，治疗费用以及4至5天的弃奶期而使其不经济(Yamagata等，1987.J.Am.Vet.Med.Assoc.191：1556-1561)，因此不建议在泌乳期施用抗生素治疗患有亚临床型乳腺炎的牲畜(Gruet等.，2001.Adv.DrugDeliveryRev.50：245-259)。本发明的药物组合物可在泌乳期施用。如上所述，本发明的组合物有局部治疗效果，因此可仅给感染的乳腺施用治疗，而未感染的乳腺继续挤奶，从而将乳液损失降至最低。

对于治疗乳腺炎，需要给感染的乳腺施用重复剂量的本发明的药物组合物。通常，在1至10天期间，优选1至3天期间，以选自由以下组成的组的间隔重复施用至少1次，优选1至10次，更优选1至3次：约6小时、约8小时、约12小时、约16小时、约20小时和约24小时。

根据某些实施方案，可在干奶期施用本发明的新型药物组合物来治疗乳房感染。这种治疗可直接治疗感染的乳腺(奶牛干奶治疗)或作为预防治疗(奶牛干奶预防治疗)。在干奶期开始和干奶期期间治疗感染比在泌乳期治疗更为有利，因为其不仅可将药物组合物施用于具有可见感染体征的感染乳腺，也可施用于乳房的全部乳腺。这种治疗可消除已有感染，并且预防在干奶期获得新感染。而且，本发明证明了在干奶期施用本发明的药物组合物可降低在随后泌乳期中的感染发生率。药物组合物可施用于鉴定为患有临床和亚临床乳腺炎的乳腺，也可施用于未感染乳腺作为预防治疗，或施用于上述二者。

根据另外的实施方案，可将本发明新型的药物组合物与其他抗微生物治疗一起施用，所述其他抗微生物治疗选自由以下组成的组，其不限于抗生素、杀菌剂、甾族的和非甾族的抗炎治疗、采用免疫调节剂的治疗和疫苗接种治疗。根据一个实施方案，将本发明的药物组合物与其它抗微生物治疗同时施用，以联合的，单个的药物组合物或以分离的药物组合物的形式施用。可选地，可先施用本发明的药物组合物作为预治疗，随后施用另外的抗微生物治疗，反之亦可。

提供以下实施例以更充分地阐述本发明的优选实施方案。但是，它们不应以任何方式解释为限制本发明的宽泛的范围。

实施例

实施例1：药物组合物的制备

将商用牛酪蛋白(例如，Sigma)溶于25mMTris缓冲液(100g/升)，pH为8，在37℃用胰蛋白酶消化4小时(500U/升)。然后用盐酸将溶液酸化至pH值4.7，通过离心使未消化的酪蛋白成团粒。将上清液沸腾15分钟，冷却至室温，用氢氧化钠溶液调节pH至7。通过离心去除在这些条件下不溶的物质并抛弃。选择性地，将食品级商用酪蛋白水解产物用作起始物，以1-40g/l溶于生理盐水或水中，所得pH为大约7.2。在整个过程中所用的水或生理盐水符合USP“注射用水”各论(monograph)。然后加热溶液至40-60℃，冷却后，使用低压(1-6psi)惰性气体，例如氮气或氩气通过5微米滤器进行过滤。几个批次需要通过3微米滤器另外进行过滤。然后将滤液加热至50℃至70℃以增加多肽的溶解。

然后使用低压(1-6psi)惰性气体，例如氮气或氩气将所得混浊溶液通过0.2微米的滤器进行过滤。过滤步骤除去所有剩余的酪蛋白胶粒，使得过滤后所得溶液是澄清的。滤液取样并采用Bradford方法分析总的蛋白含量，将蛋白浓度调至5-15mg/ml。然后用浓缩的HCl(试剂级ACS)或1.0当量的NaOH调节溶液的pH值至大约7.3-7.6。使用低压惰性气体用0.2微米滤器再次过滤溶液。然后将终滤液(约10ml)过滤并在惰性气体气氛中密封于20ml无菌玻璃安瓿。

为了防止在过程最后堵塞0.2微米滤器，对于某些商用酪蛋白水解产物源，可能需要使用低压(1-6psi)惰性气体，例如氮气或氩气通过5微米滤器进行预过滤的步骤。

溶液的澄清度通过比浊计(Micro100GeneralPurposeTurbidometer，MetexCooperation，Toronto，Canada)测定。所得溶液澄清，NTU为4.0。本文将所得组合物命名为MLTS-2。

实施例2：乳腺炎的治疗

实施例2.1：应用于患有乳腺炎奶牛的干奶治疗

奶牛群体

32只奶牛参与研究(8只病例，即接受治疗的奶牛，24只作为对照，根据研究设计进行选择，参见下文)。根据细菌学诊断被诊断患有临床型和/或亚临床型乳腺炎的8只病例奶牛进入接受使用按上文实施例1所述制备的本发明组合物(MLTS-2)进行的治疗。24只奶牛作为对照，其中6只经诊断患有如上的乳腺炎，18只未被感染。临床型乳腺炎以以下可见的体征为特征，包括乳液出现絮状物或凝块、SCC急剧增高、发热、脉搏加快、食欲不振、脱水和抑郁。感染的区域(quarter)或乳房也可能肿胀。亚临床型乳腺炎以产奶量减少，乳液质量下降和通过集液罐中体细胞计数的增加检测到的SCC升高为特征。对照和试验奶牛为来自同畜群的样本并且同种。

全部奶牛的纳入标准：处于泌乳期的后期，预期的干奶期第一天以前的1至2周；有四个功能区域(fourquarters)；怀孕；无明显外部奶头损伤；进入前4周未接受全身的抗乳腺炎治疗；进入前4周未进食含抗生素的食物；根据研究者判断没有对实验结果有潜在影响的发病迹象。诊断患有乳腺炎的奶牛是确认的IMI和SCC至少为大于400,000细胞/ml的奶牛。

根据以下排除标准将奶牛从研究中排除：进入前4周接受过免疫治疗的奶牛；进入前4周全身或通过进食接受抗生素、激素、抗炎和/或合成代谢治疗的奶牛；进入前12个月接受疫苗治疗的奶牛；全身或通过进食同时使用免疫和疫苗治疗的奶牛；同时有其它选择性的治疗的奶牛；根据研究者的判断患有活动性结核或其它传染性疾病的奶牛；全身或通过进食同时使用合成代谢类固醇的奶牛；全身或通过进食同时使用激素的奶牛。

研究设计

为了尽可能减少外部差异，通过根据以下变量定义的匹配分数对治疗(病例)和对照奶牛进行选择：畜群、种产仔次数，产仔日期、干奶期次数、干奶日期以及奶牛出生日期。全部匹配评分为5，没有匹配评分为0。对于畜群和种需要全部匹配。其它因素(最重要的因素至不太重要的因素)包括：分娩次数(容许匹配±1)、分娩日期的差异(容许匹配±1月)、干奶期次数(容许匹配±1)、干奶期开始日期的差异(容许匹配±2月)、出生日期(容许匹配±3月)。

奶牛在预定进入干奶期之前的1至2周，即分娩前大约75天时进入研究。在此期间，测量以下参数设定基线数据：乳房的大体外观；SCC；根据细菌学测试和可见体征的IMI的存在。分娩前60天，停止挤奶，开始实施治疗。试验奶牛在3天内一天两次接受含8mg/ml多肽的MLTS-210ml。诊断患有乳腺炎的对照组奶牛接受广谱抗生素(头孢喹晤，每次应用75mg)的奶牛干奶治疗。通过乳腺的乳头沟注射入腺乳池来进行施用以对各区域进行单次给药。对乳房的全部四个区域进行治疗。每次注射给药使用新的药水瓶。用过的药瓶保留作为研究筛选的依从性和衡算计量的证明。在最后的治疗，奶牛不再挤奶直到分娩后下一个哺乳期。在3天治疗完成后，在干奶期期间对奶牛的乳腺炎可见体征观察大约9个星期。在分娩后下一个泌乳期的第1个月、第2个月、第3个月期间通过细菌学测试检查乳房各区域的微生物存在情况、乳房的大体外观和SCC。

结果

以下的表1显示了治疗前检测到的细菌在治疗后不存在(即感染的治愈率为100％)。

表1：与匹配对照奶牛(24只奶牛，96个区域)相比，干奶期治疗对使用酪蛋白水解产物治疗的奶牛(8只奶牛，32个区域)细菌治愈和新感染的影响

注：S表示葡萄球菌；CNS表示凝固酶阴性链球菌

在研究开始时诊断为未患乳腺炎，并且未接受任何治疗的对照奶牛在此期间发展为乳腺炎(n＝12，18个区域)；另外6个区域复发感染，1个由同样的微生物引发，剩余5个区域由不同类型的微生物引起。

实施例2.2：以畜群水平应用于包括患有或不患有乳腺炎奶牛的一次剂量干奶治疗

实验设计

本实验目的是研究MLTS-2干奶治疗在畜群水平的效果。。在第二泌乳期来自一个乳畜群的至少55只Holstein奶牛自2005年7月25日至2005年11月11日参与实验。

根据兽医国际协调合作指导原则(GuidelinesoftheinternationalCoodinationofHarmonizationinVeterinary)进行本研究，纳入和排除标准如实施例2.1所述。

奶牛在预定进入干奶期之前的1至2周，即分娩前大约75天时进入研究。在预定干奶治疗之前遵照已确立的指导原则由各区域无菌收集并培养牛奶样品至少两次。通过至少两次阳性培养来确定干奶期前的乳房内感染。在治疗前的期间内，测量下列参数设定基线数据：乳房大体外观；SCC；根据细菌学测试存在的IMI和可见体征。分娩前60天停止挤奶并开始实施治疗。通过对44只实验奶牛的四个区域进行无菌乳房内输注来实施治疗。每个区域每次输入每ml含有8mg肽的MLTS-210ml。每次注射换用新的药水瓶。用过的药瓶保留作为研究筛选的依从性和衡算计量的证明。在最后的治疗后，奶牛不再挤奶直到分娩后的下一个泌乳期。在治疗完成后，在干奶期期间对奶牛的乳腺炎可见体征观察大约9个星期。为了评估区域水平的治愈率和新的感染率，在随后泌乳期的前两个月收集所有区域的初乳样品并在合适的培养基上培养。连续两次牛奶培养为阴性的区域被认为是微生物上的治愈或是未感染的区域。分娩后1个月和2个月时，检查乳房的大体外观和SCC。对每个区域的所有参数进行编辑并通过SAS/STAT软件包使用卡方检验对治疗前后的效果进行分析。

结果

在最初的样本中，发现14只奶牛(25.5％)感染，其中19个区域(8.6％)发生感染。检测到的主要的生物体是葡萄球菌变异株(14/19)。

表2：治疗前后检测的IMI(奶牛n＝55，区域n＝220)

注：S表示葡萄球菌；CNS表示凝固酶阴性葡萄球菌；NOS未另外说明。Strep，链球菌。Prev.表示发病率，治疗前后IMI差异有统计学显著性，p＜0.005。

数据表明产仔后直到89天仅有一个区域被同一类型生物体感染。

实施例2.3泌乳期乳腺炎的治疗

37只奶牛进入本研究。全部奶牛经诊断均有一个乳房患有临床性乳腺炎。通过乳腺的乳头沟注射入感染的腺乳池来施用酪蛋白水解产物，一天两次，，上午下午各一次。

就分娩次数和相应的泌乳次数而言，参与本研究的奶牛处于不同的阶段。通过标准实验室技术鉴定生物体并定量(Leitner等，2004DairySci.87：46-52)。阳性结果基于连续两次鉴定出已知的乳腺炎病原体。如以下表3所示，本发明药物组合物治疗泌乳期的乳腺炎疗效显著。

表3：MLTS-2对泌乳期患有IMI的奶牛细菌治愈的影响

实施例3：缩短干奶期

奶牛群体

根据以上实施例2.1所述纳入/排除的实验奶牛进入本研究。治疗组(n＝5)和对照组(n＝15)之间的匹配评分也如前述实施例。在对照组中，至少五分之一奶牛被诊断患有乳腺炎并且使用抗生素对其进行奶牛干奶治疗。

实验设计

在预定进入研究前的两周将奶牛纳入本研究。在分娩前大约60天、40天、30天、20天、10天进入研究。进入研究前，测量下列参数来设定基线数据：SCC；根据细菌测试存在的IMI、可见体征和产奶量。每天仅施用一次按下文实施例4所述制备的酪蛋白水解产物。减少治疗次数至单次应用是迫切需要的，因为单次治疗可大大简化程序和特定农场的工作量，因此，可能被农户所采用。

通过乳腺的乳头沟注射入腺乳池来进行施用。每次注射换用新的药水瓶。用过的药瓶保留作为研究筛选的依从性和衡算计量的证明。治疗后，奶牛不再挤奶直到下一个泌乳期。治疗完成后，在干奶期期间观察奶牛(包括乳房检查)。另外，在分娩后，检查以下参数：SCC；通过细菌测试的IMI、可见体征以及评估乳头沟，包括评估敞开或闭合的乳头沟和乳头塞(plug)的一致性。还测量产奶量。当其引起产奶完全停止，并且对分娩后所测量的参数没有任何负面影响时认为治疗是成功的。将干奶期缩短至45天或更少是非常成功的。如上文实施例2.2所述进行统计分析。正如已知的，自第一次泌乳期(第一次分娩之后)至至少第四次泌乳期产奶量增加。因此，为了使治疗奶牛和未治疗奶牛的产奶量标准化，根据如下的泌乳量对产奶量数据进行校正：对于第一次泌乳，每天每升奶量除以0.795；对于第二次泌乳，每天每升奶量除以0.965；对于第三次泌乳，每天每升奶量除以1.001。而对于第四次或更多次泌乳未进行标准化。目前在以色列奶牛养殖协会(ICBA)采用这些校正因子进行奶牛的遗传选择。

结果

根据研究设计，所有病例和对照奶牛顺利分娩，无流产或任何其它产后疾病的记录。病例和对照奶牛在先前的泌乳期中干奶期长度(天数)相同。另一方面，在当前的泌乳期，与对照相比，酪蛋白水解产物治疗后，病例奶牛的干奶期的长度明显缩短(表4)。

表4：酪蛋白水解产物治疗对干奶期长度的影响

产仔后，至少在下文表5所述时间期间内干奶期缩短的奶牛之间产仔后产奶量没有差异。

表5：应用酪蛋白水解产物治疗缩短干奶期后的产奶量

实施例4：减少牛奶的体细胞计数

实施例4.1：酪蛋白水解产物治疗3天的泌乳奶牛的体细胞计数

奶牛群体

在最初募集42只奶牛后，有37只奶牛完成了实验。如果奶牛具有四个功能区域，其中至少有一个区域被感染，但没有明显的乳头损伤，身体状态良好并且在治疗前30天内未接受抗生素和/或抗炎治疗，则符合本研究的募集条件。另外，从中选择奶牛的任何畜群至少在以前一年内未使用乳腺炎疫苗。给这些农场的奶牛饲喂典型的总混合比为包括65％浓缩物和含有17％蛋白质的35％饲料的Israeli。

酪蛋白磷酸肽的制备

如前所述(Shamay等，2003，supra)制备包括酪蛋白磷酸肽的酪蛋白水解产物。在Hy实验室(Rehovot，Israel)进行该过程以确保终产物无菌并将产品装入无菌试剂瓶中。根据鲎变形细胞溶解物(LAL)试验，终产品内毒素水平为0.48EU/ml。按0.0001EU/kg体重(假定平均奶牛体重为500kg)注射10ml该溶液，其所含有的内毒素的量比鞘内施用人药物的内毒素耐受限量低2000倍(K＝耐受限量(EU/Kg)，肠胃外药物为5EU/kg，鞘内药物为0.2EU/kg)。单次注射入单个区域的终产物含10mlCNH和浓度为10mg/ml的肽。

实验设计和结果

在三天(3)期间通过乳头沟一天两次将酪蛋白水解产物仅施用于乳房受感染的乳腺。根据畜群的正常时间表继续挤奶并诱导干奶期。

牛奶样品在以色列奶牛养殖协会(ICBA)的中心实验室，Caesarea，Israel或在国家乳腺炎参考中心(NationalMastitisReferenceCenter，KimronVeterinaryInstitue)进行检查。用标准实验室技术(Leitner等，2004.DairySci.87：46-52)鉴定生物体并进行定量。阳性结果基于连续两次鉴定出已知的乳腺炎病原体。

将施用治疗前的牛奶中的体细胞计数(SCC-PRE)与产仔后观察的SCC(SCC-POST)相比。在下文表6所列的SCC-PRE是直到应用酪蛋白水解产物治疗前15天两次测量的平均值。所列SCC-POST是产仔后15至60天至少两次测量的平均值。对于27只奶牛，直到分娩后10个月每个月测定SCC一次。

统计分析

用SAS/STAT软件包通过使用适于SCC的卡方检验和连续变量的单因素方差分析(onewayANOVA)对SCC-PRE和SCC-POST进行比较。所有牛奶样品在ICBA实验室用Fossomatic360和适于统计分析的对数标度转换器(converterthelogscale)来分析SCC。

结果

从9个畜群的37只经诊断确定一个区域患有乳腺炎的奶牛收集数据。鉴定出的最普遍的病原体是化脓隐秘杆菌(Arcanobacteriumpyogengs)、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、乳房链球菌(Streptococcusuberis)。由链球菌、P.auroginosa、Corynobacteriumbovis和微球菌引起的感染全部是亚临床型，而金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌和化脓隐秘杆菌的感染有～60％是临床型，～40％是亚临床型。

当测试个体或整个研究组的病原体时，SCC-PRE(平均值为2,210,200)和SCC-POST(平均值为205,000)之间的差异显著(p＜0.001)(表6)。

表6：酪蛋白水解产物对所治疗的泌乳期奶牛产仔后一个感染乳腺的SCC的影响

在临床型感染的乳腺中，治疗后75％的奶牛(n＝9/12)的SCC-POST为201,000个细胞/毫升或更少，在所有治疗的奶牛中，SCC-POST是401,000或更少(表7)。在亚临床型感染的乳腺中，治疗后57％的奶牛(n＝12/21)的SCC-POST为201,000个细胞/毫升或更少，81％的病例奶牛是401,000个细胞/ml或更少。当考虑所有数据时，63.6％(n＝21/33)的病例奶牛的SCC-POST值低于201,000个细胞/ml，显著高于SCC-POST在201,000个细胞/ml以上的病例数(n＝12/33)(p＜0.01)。

表7：酪蛋白水解产物对所治疗的泌乳期奶牛产仔后单个感染乳腺的SCC的影响

对于27只奶牛，治疗和诱导干奶期之间平均需要经过6.1个月，即在干奶期后产仔。因此，在这些奶牛中，SCC-POST代表在干奶期后的泌乳期观察到的SCC。59.3％的奶牛(16/27)SCC-POST低于201,000个细胞/ml，与在治疗期和干奶期之间SCC-POST低于201,000个细胞/ml的病例数相比，21/23无显著差异。值得注意的是在整个跟踪观察过程中，差不多26％的奶牛SCC-POST低于101,000个细胞/ml，85％(23/27)的SCC-POST低于400,000个细胞/ml。

实施例4.2：给四个乳腺施用单个剂量的酪蛋白水解产物对产仔后体细胞计数的影响

从实践的角度考虑，将施药次数减少至一次是非常重要的，因为单次治疗会大大简化程序和特定农场的工作量，因此，可能被农户所采用。

本实验的目的是研究给四个乳腺应用一个剂量的酪蛋白水解产物对产仔后体细胞计数的影响。至少在第二泌乳期来自一个乳畜群的Holstein(55只)奶牛自2005年7月25日至2005年11月11日参与实验。

研究奶牛、纳入和排除标准、牛奶样品以及研究方案基本如上文实施例2.1所述。将应用治疗前牛奶中的体细胞计数(SCC-PRE)与产仔后观察的SCC相比。SCC-PRE是直到治疗前15天各单个乳腺两次测量的平均值。SCC-POST是产仔后15至60天(间隔15-30，31-60)至少两次测量的平均值。数据和SCC分析如实施例4.1。

结果

治疗前，感染区域(13只奶牛的19个区域)测量的平均SCC-PRE为557,278个细胞/ml，而非IMI区域为183,381个细胞/ml(P＜0.001)。如以下表8所示，治疗有效地降低了SCC-POST值(P＜0.01)。与非IMI乳腺相比(P＜0.05)，乳房内感染乳腺的治疗前后SCC差异更显著(P＜0.01)。然而，这些结果清楚地表明当应用于感染和非感染乳腺时，施用酪蛋白衍生的肽可降低牛奶的SCC，并因此改善牛奶卫生。

表8：酪蛋白水解产物对产仔后感染和未感染乳腺SCC的影响

^*P＜0.001；^**P＜0.01；^***P＜0.05

实施例5：酪蛋白水解产物对分娩后产奶量的影响

实施例5.1：多次应用酪蛋白水解产物的影响

奶牛群体

11只通过细菌学诊断为患有临床型和/或亚临床型乳腺炎的奶牛(病例)进入接受酪蛋白水解产物治疗。33只奶牛作为对照，其中6只诊断患有如上文的乳腺炎，27只未受感染。对照和实验奶牛为来自同一畜群的样本并且同种。

分娩前大约60天，停止挤奶并实施治疗。在3天内实验奶牛一天两次接受含有8mg/ml肽的MLTS-210ml。对照奶牛接受作为单次治疗的抗生素奶牛干奶治疗。乳房的全部四个区域均接受治疗。治疗期间奶牛停止挤奶；并将酪蛋白水解产物治疗前累积的残余牛奶由治疗乳腺丢弃。

将实验数据进行三因素方差分析，其中使用组(治疗奶牛vs.对照牛)；泌乳期(测试的泌乳期：1、2、3或4-5)和分娩后月份(泌乳期第1、第2、第3或第4个月)进行重复测量(“列区”)设计。为了比较治疗前后的平均产奶量，每天的产奶量如上文实施例3所述进行标准化。

结果

图1和图2描述了对酪蛋白水解产物的典型反应(分别为第2425号和2331号奶牛)。两只奶牛在治疗时感染了金黄色葡萄球菌(Staphilococcusaureus)。可以看出在第二次泌乳期感染可引起产奶量下降。但是治疗后，产奶量从分娩直到最后测量(产后60天)显著增加。表9显示产奶量的增加不会对牛奶质量有不利影响，通过蛋白质和脂肪浓度进行测量。

表9：酪蛋白水解产物治疗对分娩后至泌乳期的100天时获得的牛奶蛋白质和脂肪浓度的影响

实施例5.2：单次应用酪蛋白水解产物的影响

本实验目的是研究在分娩前干奶期将单次酪蛋白水解产物治疗应用于四个乳腺对产仔后产奶量的影响。单次应用的重要性在于减少农场的工作量和对治疗施用物质的依从。

至少在第二泌乳期来自一个乳畜群的Holstein(55只)奶牛自2005年7月25日至2005年11月11日参与实验。

研究奶牛、纳入和排除标准、牛奶样品、细菌学测试以及研究方案与实施例2.2和4.2相似。每只动物的产奶量每天自动记录三次。通过比较以下定义的时期的产奶量来对酪蛋白水解产物对产仔后(4至103天)产奶量的影响进行评价。

将第3期的产奶量与第1、第2期的产奶量进行比较(参见上文用于定义时期的流程图)。

就分娩次数和相应的泌乳次数而言，参与本研究的奶牛处于不同阶段。如上文实施例3所述，根据泌乳次数的产奶量将处于不同泌乳期的奶牛的产奶量进行校正。28只奶牛在第一次泌乳期末进行治疗，17只在第二次泌乳期末和10只在第三次或更多次泌乳期末进行治疗。原始结果和校正的产奶量用升计量。数据如实施例5.1所述用SAS/STAT软件包进行分析。

结果

收集55只奶牛的数据。第3期的产奶量比第1期的产奶量增加11.6％(P＜0.01)(表10)。

表10：单次给药酪蛋白水解产物的治疗对分娩后干奶期产奶量的影响

在患有乳房内感染(IMI)的奶牛中(n＝13，乳腺＝19)，酪蛋白水解产物治疗的影响更为显著(P＜0.01)，因为与由非IMI奶牛获得的牛奶量相比，第2期的每日牛奶量更低，为2.2升(表11)，而在第3期患有IMI的奶牛和没有IMI的奶牛的产奶量相似(表12)。

表11：第2期IMI和非IMI奶牛的产奶量

表12：单次给药酪蛋白水解产物的治疗对分娩后(第3期)产奶量的影响

实施例6：酪蛋白水解产物对诱导干奶期的奶牛福利的影响

根据常规实践，现代奶牛需要在预期分娩前干奶60天以兼顾农户所希望的产奶量最大化和预防在下一个泌乳期产奶量下降的使“干奶期”最短的需求(Annen等，2004，ibid)。这种实践与突然停止奶牛挤奶有关，所述奶牛每天仍产生相当数量的牛奶，每天20升至40升，有时甚至达到50升。这种实践导致大量的牛奶在乳房内聚集，这与乳房充胀和漏奶有关，且经常给奶牛带来极大的痛苦，使其数天高声尖叫。因此，现代乳牛业当前使奶牛干奶的实践大大阻碍了奶牛的福利状态。

本实验的目的是测试使用酪蛋白水解产物的治疗对突然停止挤奶诱导进入干奶期的奶牛生产行为和福利的影响。

20只泌乳末期(～60天)并且每天产奶17升至35升的Holstein奶牛进入本研究。奶牛根据泌乳次数、挤奶天数、距分娩天数、乳头末端完整性、产奶量、每只奶牛或每个区域每ml牛奶的SCC和在干奶日中感染的区域数(表13)进行配对。

表13：病例奶牛(CNH+头孢喹诺)与对照(头孢喹诺)奶牛(每组n＝10，数据用平均数±SD表示)起始点的比较

在干奶前一周分别测试区域牛奶SCC和细菌分离物三次。然后将每对中的一只奶牛随机分入亚组(通过抛掷硬币)。亚组1的奶牛在挤奶后用酪蛋白水解产物和广谱抗生素头孢喹诺进行治疗，(每次给药75mg)(N+C)，而亚组2的奶牛单用头孢喹诺进行治疗(每次给药75mg)(C)。治疗前一周将2个亚组的奶牛一起放在有限的处所中以进行调整，所述处所对每只奶牛给予10平方米阴影漏缝地板(shadedslattedfloor)和10平方米的混凝土表面场地。然后从那时起在原地待2周。三周后，从治疗前一周到治疗后第二周，奶牛佩戴数字化的腿部固定(leg-mounted)式传感器(AfifarmManagementSystem，S.A.E.Afikim，Israel)，该传感器能够监测，记录并传送动物活动(脚步)和躺卧行为(LB)，而对其他自由动物行为干扰很小。如下设置乳房压力指数(UPI)：0，1，2和3。0为无压力，1为中等压力，2为高压，3为极高压力。通过将手指按压在组织上评估乳房压力以及评估乳头以上10cm的两个区域——乳池和ubeis体(corpusubeis)对压力的耐受来测定任意UPI值。实验自始自终均由受过训练的同一人在每天的相同时间进行一次而完成所有的UPI测量。

用适合重复测量JMP(第5版，SASInstitute，Cary，NC)的拟合模型程序对数据进行统计分析；治疗是实验对象间因素，时间是实验对象内因素。P＜0.05认为差异显著。模型是：

Y_ijklm＝μ+Pi+αj+C(ij)k+γ+αγil+ε_ijklm

其中Y_ijklm＝自变量，μ＝总体平均数，P_i＝时期的固定影响(干奶前后；i＝1至2)，α_j＝＝固定的治疗影响(I＝1至2)，C_(ij)k＝奶牛k(k＝1至10)在时期i和治疗j的随机影响，γ_i＝1天的影响(l＝1至9)；α_γil＝治疗j和1天相互作用的影响；ε_ijklm＝与在时期i的奶牛K和在第1天治疗有关的随机误差。

通过t检验，使用Tukey-KramerHSD进行治疗期间或治疗后特定日比较。

另外，对每个治疗组分别以两种情况进行线性回归分析：(i)作为自变量的实验天数vs.累积步数，(ii)作为自变量的ΔUPI(Δ指的是在产仔后特定日测定的数据减去产仔前相同数据平均值的差值)vs.步数与躺卧持续时间之比的Δ。回归的显著性由回归系数和n来评估，而用t检验分析回归斜率(b)、斜率的标准误差(S_b)和n来评估回归斜率的差异。

仅用抗生素(C)治疗的奶牛UPI任意值(图3)由治疗前的～1.2显著增加至1.8至2.5，而诱导奶牛进入退化后的前4天在N+C治疗的奶牛中UPI任意值急剧下降，因此，在这4天期间，组间的UPI值差异显著(P＜0.01)。仅在诱导进入干奶期的第5天后，对照奶牛的UPI值下降。图4显示治疗后第四天两只奶牛乳房的照片。这两只特定奶牛的产奶量为干奶期每天30升以上。图3的图片说明UPI值为0的治疗奶牛(B图)与UPI值为～2的未治疗奶牛(A图)之间的差异。

步数与躺卧持续时间之比(RSL)用作评价“动物舒适性”的手段(图5)。N+C治疗奶牛的比例在治疗后第二天开始变小，而C治疗奶牛的比例未变。因此，治疗后第3天及以后组间的差异变大并且变得有显著性(P＜0.005)。

总而言之，与传统方法诱导进入干奶期的奶牛相比，酪蛋白水解产物治疗奶牛的乳房压力、活动度以及休憩行为清楚地表明了奶牛没有受苦且更为平静和更为舒适的迹象。

虽然已对本发明的某些实施方案进行了说明和描述，但是应该清楚本发明并不限于本文所述实施方案。各种修改、改变、变型、代替和等价物对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且未脱离如随后权利要求书所述的本发明的实质和范围。

<110>米勒尤迪斯公司

<120>包括酪蛋白衍生肽的药物组合物及其使用方法

<130>MLTS/001PCT

<150>60/676,292

<151>2005-05-02

<150>60/688,697

<151>2005-06-09

<160>5

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>合成肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(1)..(3)

<223>由磷酸修饰

<400>1

SerSerSerGlyGly

15

<210>2

<211>25

<212>PRT

<213>合成肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(17)..(19)

<223>由磷酸修饰

<400>2

ArgGluLeuGluGluLeuAsnValProGlyGluIleValGluSerLeu

151015

SerSerSerGluGluSerIleThrArg

2025

<210>3

<211>21

<212>PRT

<213>合成肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(10)

<223>由磷酸修饰

<400>3

GlnMetGluAlaGluSerIleSerSerSerGluGluIleValProAsp

151015

SerValGluGlnLys

20

<210>4

<211>21

<212>PRT

<213>合成肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(8)..(10)

<223>由磷酸修饰

<400>4

LysAsnThrMetGluHisValSerSerSerGluGluSerIleIleSer

151015

AsnGluThrTyrLys

20

<210>5

<211>25

<212>PRT

<213>合成肽

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(11)..(13)

<223>由磷酸修饰

<400>5

AsnAlaAsnGluGluGluTyrSerIleGlySerSerSerGluGluSer

151015

AlaGluValAlaThrGluGluValLys

2025

Claims (58)

1.治疗有效量的酪蛋白水解产物在制备对产奶量无负面影响的缩短泌乳动物泌乳周期期间干奶期长度的药物中的应用，其中所述酪蛋白水解产物通过包括以下步骤的方法获得：(a)在水溶液中用胰蛋白酶消化牛酪蛋白以获得等同于在37℃用胰蛋白酶消化4h获得的水解程度的水解程度；(b)终止所述水解；(c)去除不溶的物质并收集所得溶液；(d)通过至少一种0.1μm至0.5μm的滤器过滤在步骤(c)中获得的溶液以获得最终溶液；以及(e)调节所述最终溶液的pH至高于6.0。

2.如权利要求1所述的应用，其中步骤(b)中终止所述水解是通过酸化所述溶液至pH4.7、离心所述溶液、以及使所述溶液沸腾进行的。

3.如权利要求1-2中任一项所述的应用，其中所述过滤是通过至少一种0.2μm的滤器。

4.如权利要求1所述的应用，其中所述干奶期的长度被缩短至少于50天。

5.如权利要求4所述的应用，其中所述干奶期的长度被缩短至20天至30天之间。

6.如权利要求1所述的应用，其中将所述药物施用在所述泌乳动物的至少一个乳腺上。

7.如权利要求6所述的应用，其中将所述药物施用于乳腺的乳头沟。

8.如权利要求1所述的应用，其中所述药物在停止挤奶的同时施用。

9.如权利要求1所述的应用，其中所述药物以6h至24h的间隔施用一次至五次。

10.如权利要求1所述的应用，其中所述药物仅施用一次。

11.治疗有效量的酪蛋白水解产物在制备使牲畜泌乳动物分娩后的产奶量比所述泌乳动物分娩前的产奶量增加的药物中的应用，其中所述酪蛋白水解产物通过包括以下步骤的方法获得：(a)在水溶液中用胰蛋白酶消化牛酪蛋白以获得等同于在37℃用胰蛋白酶消化4h获得的水解程度的水解程度；(b)终止所述水解；(c)去除不溶的物质并收集所得溶液；(d)通过至少一种0.1μm至0.5μm的滤器过滤在步骤(c)中获得的溶液以获得最终溶液；以及(e)调节所述最终溶液的pH至高于6.0。

12.如权利要求11所述的应用，其中步骤(b)中终止所述水解是通过酸化所述溶液至pH4.7、离心所述溶液、以及使所述溶液沸腾进行的。

13.如权利要求11-12中任一项所述的应用，其中所述过滤是通过至少一种0.2μm的滤器。

14.如权利要求11所述的应用，其中在分娩后最初100天平均产奶量增加至少3％。

15.如权利要求11所述的应用，其中所述分娩是在干奶期后。

16.如权利要求11所述的应用，其中将所述药物施用在所述泌乳动物的至少一个乳腺上。

17.如权利要求16所述的应用，其中将所述药物施用于乳腺的乳头沟。

18.如权利要求11所述的应用，其中所述药物在停止挤奶的同时施用。

19.如权利要求11所述的应用，其中所述药物以6h至24h的间隔施用一次至五次。

20.如权利要求11所述的应用，其中所述药物仅施用一次。

21.治疗有效量的酪蛋白水解产物在制备用于改善泌乳动物乳液卫生的药物中的应用，其中对所述泌乳动物的乳腺施用所述药物，使得在所述药物施用后于干奶期之后的泌乳周期期间所述乳液中的体细胞计数与所述药物施用前的体细胞计数相比减少且其中所述酪蛋白水解产物通过包括以下步骤的方法获得：(a)在水溶液中用胰蛋白酶消化牛酪蛋白以获得等同于在37℃用胰蛋白酶消化4h获得的水解程度的水解程度；(b)终止所述水解；(c)去除不溶的物质并收集所得溶液；(d)通过至少一种0.1μm至0.5μm的滤器过滤在步骤(c)中获得的溶液以获得最终溶液；以及(e)调节所述最终溶液的pH至高于6.0。

22.如权利要求21所述的应用，其中步骤(b)中终止所述水解是通过酸化所述溶液至pH4.7、离心所述溶液、以及使所述溶液沸腾进行的。

23.如权利要求21-22中任一项所述的应用，其中所述过滤是通过至少一种0.2μm的滤器。

24.如权利要求21所述的应用，其中所述乳液中的所述体细胞计数少于400,000细胞/mL。

25.如权利要求21所述的应用，其中将所述药物施用在所述泌乳动物的至少一个乳腺上。

26.如权利要求25所述的应用，其中将所述药物施用于乳腺的乳头沟。

27.如权利要求21所述的应用，其中所述药物在停止挤奶的同时施用。

28.如权利要求21所述的应用，其中所述药物以6h至24h的间隔施用一次至五次。

29.如权利要求21所述的应用，其中所述药物仅施用一次。

30.治疗有效量的酪蛋白水解产物在制备用于预防牲畜泌乳动物遭受与乳腺相关的感染或挤奶突然停止的药物中的应用，其中所述药物被施用于所述泌乳动物的乳腺，从而改善所述泌乳动物的福利，其中所述酪蛋白水解产物通过包括以下步骤的方法获得：(a)在水溶液中用胰蛋白酶消化牛酪蛋白以获得等同于在37℃用胰蛋白酶消化4h获得的水解程度的水解程度；(b)终止所述水解；(c)去除不溶的物质并收集所得溶液；(d)通过至少一种0.1μm至0.5μm的滤器过滤在步骤(c)中获得的溶液以获得最终溶液；以及(e)调节所述最终溶液的pH至高于6.0。

31.如权利要求30所述的应用，其中步骤(b)中终止所述水解是通过酸化所述溶液至pH4.7、离心所述溶液、以及使所述溶液沸腾进行的。

32.如权利要求30-31中任一项所述的应用，其中所述过滤是通过至少一种0.2μm的滤器。

33.如权利要求30所述的应用，其中改善所述泌乳动物的福利是通过减少所述动物每天的步数和通过延长所述动物每天的躺卧时间来估量的。

34.如权利要求30所述的应用，其中将所述药物施用在所述泌乳动物的至少一个乳腺上。

35.如权利要求34所述的应用，其中将所述药物施用于选自由感染的乳腺和未感染的乳腺组成的组的乳腺。

36.如权利要求34所述的应用，其中将所述药物施用于乳腺的乳头沟。

37.如权利要求30所述的应用，其中所述药物在停止挤奶的同时施用。

38.如权利要求30所述的应用，其中所述药物以6h至24h的间隔施用一次至五次。

39.如权利要求30所述的应用，其中所述药物仅施用一次。

40.一种药物组合物，其包括治疗有效量的酪蛋白水解产物，其中所述酪蛋白水解产物通过包括以下步骤的方法获得：(a)在水溶液中用胰蛋白酶消化牛酪蛋白以获得等同于在37℃用胰蛋白酶消化4h获得的水解程度的水解程度；(b)终止所述水解；(c)去除不溶的物质并收集所得溶液；(d)通过至少一种具有小于0.25μm截止的滤器过滤在步骤(c)中获得的溶液以获得最终溶液；以及(e)调节所述最终溶液的pH至高于6.0以形成随时可使用的无菌澄清溶液，其基本上无胶粒，且pH高于6.0。

41.如权利要求40所述的药物组合物，其中步骤(b)中终止所述水解是通过酸化所述溶液至pH4.7、离心所述溶液、以及使所述溶液沸腾进行的。

42.如权利要求40-41中任一项所述的药物组合物，其中所述过滤是通过至少一种0.2μm的滤器。

43.如权利要求40所述的药物组合物，其浊值小于6个比浊法浊度单位(NTU)。

44.如权利要求40所述的药物组合物，其包括10ng/mL至15mg/mL的蛋白质。

45.如权利要求40所述的药物组合物，其中所述组合物的pH值范围为6.0至8.0。

46.如权利要求44所述的药物组合物，其中当所述组合物加热至50℃至70℃时，所述蛋白质是稳定的。

47.如权利要求44所述的药物组合物，其中当所述组合物冷冻时，所述蛋白质是稳定的。

48.如权利要求40所述的药物组合物，所述药物组合物呈冷冻干燥粉末的形式，其中所述粉末在使用前于液体中复原形成基本上无胶粒且pH值高于6.0的澄清溶液。

49.如权利要求40或权利要求48所述的药物组合物在制备用于治疗乳腺的药物中的应用，其中所述药物被施用于泌乳动物。

50.如权利要求49所述的应用，其中治疗所述乳腺选自由诱导暂时性产乳停止、诱导持续性产乳停止和诱导退化组成的组。

51.如权利要求40或权利要求48所述的药物组合物在制备用于预防、治疗和逆转微生物感染的药物中的应用，其中所述药物被施用于泌乳动物。

52.如权利要求51所述的应用，其中所述感染为乳腺炎，并且其中所述药物施用于所述泌乳动物的受感染的乳腺。

53.如权利要求51所述的应用，其中所述药物在选自由以下组成的组的时期施用：泌乳期、挤奶停止后的干奶期初期，以及干奶期。

54.如权利要求51所述的应用，其中所述药物与其他的抗微生物治疗结合施用，所述抗微生物治疗选自由抗生素疗法、杀菌剂疗法、甾族的和非甾族的抗炎疗法、采用免疫调节剂的疗法和疫苗接种疗法组成的组。

55.如权利要求49所述的应用，其中将所述药物施用在所述泌乳动物的至少一个乳腺上。

56.如权利要求55所述的应用，其中将所述药物施用在所述泌乳动物的所有乳腺上。

57.如权利要求49所述的应用，其中所述泌乳动物选自由奶牛、山羊、绵羊、水牛、骆驼、驴、驼羊、马、猪、猫和狗组成的组。

58.如权利要求49所述的应用，其中所述泌乳动物为人类。