NO321925B1

NO321925B1 - 2-Alkyl-19-nor-vitamin D-forbindelser samt anvendelse derav ved fremstilling av farmasoytiske blandinger og slike blandinger

Info

Publication number: NO321925B1
Application number: NO19994489A
Authority: NO
Inventors: Hector F Deluca; Rafal R Sicinski
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1997-03-17
Filing date: 1999-09-16
Publication date: 2006-07-24
Also published as: AU714390B2; EP0971888A1; BR9808010A; DK0971888T3; US6127559A; NO994489L; WO1998041500A1; DE69819312T2; US5945410A; DE69819312D1; AU6280098A; ES2206893T3; PT971888E; KR100345820B1; JP3786712B2; EP0971888B1; CA2272745A1; NZ337262A; JP2000513010A; CA2272745C

Description

Oppfinnelsen vedrører vitamin D-forbindelser som angitt i krav 1, og nærmere bestemt vitamin D-derivater substituert i karbon 2-stillingen.

Det naturlige hormon, la,25-dihydroksyvitamin D3 og dets analog i ergosterolserien, det vil si la,25-dihydroksyvitamin D2, er kjent for å være meget kraftige regulatorer av kalsiumhomøostase i dyr og mennesker, og ganske nylig ble deres aktivitet i cellulær differensiering påvist, Ostrem et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 84, 2610

(1987). Mange strukturelle analoger av disse metabolitter

er blitt fremstilt og testet, inklusive la-hydroksyvitamin D3, la-hydroksyvitamin D2, forskjellige sidekjedehomologe vitaminer og fluorerte analoger. Noen av disse forbindelser utøver interessant separering av aktiviteter vedrørende celledifferensiering og kalsiumregulering. Denne forskjell i aktivitet kan være nyttig i behandlingen av mange sykdommer, så som renal osteodystrofi, vitamin D-resistent rakitt, osteoporose, psoriasis og visse ondartede sykdommer.

Nylig er en ny klasse av vitamin D-analoger blitt oppdaget, det vil si de såkalte 19-nor-vitamin D-forbindelser, som karakteriseres ved erstatning av den eksosykliske metylen-gruppe i A-ringen (karbon 19), hvilket er typisk for vitamin D-systemet, med to hydrogenatomer. Biologisk testing av slike 19-nor-analoger (f.eks. la,25-dihydroksy-19-nor-vitamin D3) viste en selektiv aktivitetsprofil med høy potens når det gjelder å indusere cellulær differensiering, og meget lav kalsiummobiliserende aktivitet. Således er disse forbindelser potensielt nyttige som terapeutiske midler for behandling av ondartede sykdommer eller behandling av forskjellige hudsykdommer. To forskjellige syntesemetoder av slike 19-nor-vitamin D-analoger er blitt beskrevet (Perlman et al., Tetrahedron Lett., 31, 1823

(1990); Perlman et al., Tetrahedron Lett., 32, 7663 (1991);

og DeLuca et al., US-patent nr. 5 086 191).

I US-patent nr. 4 666 634 er 2p-hydroksy- og alkoksy-analoger (f.eks. ED-71) av la,25-dihydroksyvitamin D3 blitt beskrevet og undersøkt av Chugai-gruppen som potensielle medikamenter for osteoporose og som antitumormidler. Se også Okano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 1444 (1989). Andre 2-substituerte (med hydroksyalkyl-, f.eks. ED-120, og fluoralkylgrupper) A-ringanaloger av la,25-dihydroksyvitamin D3 er også blitt fremstilt og testet (Miyamoto et al., Chem. Pharm. Bull., 41, 1111

(1993); Nishii et al., Osteoporosis Int., suppl. 1, 190

(1993); Posner et al., J. Org. Chem., 59, 7855 (1994), og J. Org. Chem., 60, 4617 (1995)).

Nylig er 2-substituerte analoger av la,25-dihydroksy-19-nor-vitamin D3 også blitt syntetisert, det vil si forbindelser substituert i 2-stillingen med hydroksy- eller alkoksygrupper (DeLuca et al., US patent nr. 5 536 713), som utøver interessante og selektive aktivitetsprofiler. Alle disse studier indikerer at bindingssetene i vitamin D-reseptorene kan innlemme forskjellige substituenter ved C-2 i de syntetiserte vitamin D-analoger.

I en kontinuerlig bestrebelse for å utnytte 19-nor-klassen av farmakologisk viktige vitamin D-forbindelser er deres analoger, som karakteriseres ved nærvær av en alkylsubsti-tuent (spesielt metyl) ved karbon 2 (C-2), det vil si 2-alkyl-19-nor-vitamin D-forbindelser, og spesielt 2-metyl-19-nor-vitamin D-forbindelser, nå blitt syntetisert og testet. Slike vitamin D-analoger synes å være interessante mål, fordi den relativt lille alkylgruppen (spesielt metyl) ved C-2 ikke bør interferere med vitamin D-reseptoren. På den annen side er det åpenbart at det kan forventes en forandring av konformasjonen av sykloheksandiolringen A for disse nye analoger.

Oppsummering av oppfinnelsen

En klasse av lcc-hydroksylerte vitamin D-forbindelser som hittil ikke har vært kjent, er 19-nor-vitamin D-analogene som har en alkylgruppe (spesielt metyl) i 2-stillingen, det vil si 2-alkyl-19-nor-vitamin D-forbindelser, spesielt 2-metyl-19-nor-vitamin D-forbindelser.

Strukturelt karakteriseres disse nye analoger ved den generelle formel I vist nedenfor:

hvor Yi og Y2 er hydrogen, R6 er metyl, og hvor gruppen R representerer en av de substituentgrupper som er vist i krav 1, og hvor det stereokjemiske senter ved karbon 20 kan ha R- eller S-konfigurasjon, hvor dobbeltbindingen kan ha cis- eller trans-geometri.

Spesifikke, viktige eksempler på sidekjeder av gruppen R med naturlig 20R-konfigurasjon er strukturene representert ved formlene (a), (b), (c), (d) og (e) nedenfor, det vil si sidekjeden slik den foreligger i 25-hydroksyvitamin D3 (a); vitamin D3 (b); 25-hydroksyvitamin D2 (c) ; vitamin D2 (d); og C-24-epimeren av 25-hydroksyvitamin D2 (e) :

Ovennevnte nye forbindelser utøver et ønsket, og meget fordelaktig, mønster av biologisk aktivitet. Disse forbindelser karakteriseres ved liten, hvis noen i det hele tatt, intestinal kalsiumtransportaktivitet sammenlignet med aktiviteten av la,25-dihydroksyvitamin D3, og de utøver relativt høy aktivitet sammenlignet med la,25-dihydroksyvitamin D3 når det gjelder å mobilisere kalsium fra benmassen. Derfor er disse forbindelser meget spesifikke i sin kalsemiske aktivitet. Deres preferensielle aktivitet når det gjelder å mobilisere kalsium fra benmasse og deres reduserte intestinale kalsiumtransportaktivitet, gjør det mulig å administrere in vivo disse forbindelser for å behandle metabolske bensykdommer hvor bentap er den største bekymring. På grunn av sin preferensielle kalsemiske aktivitet på ben vil disse forbindelser være foretrukne terapeutiske midler for behandling av sykdommer hvor bendannelse er ønskelig, så som osteoporose, spesielt osteoporose med lavt benskifte, steroidindusert osteoporose, senil osteoporose eller postmenopausal osteoporose, samt osteomalasi og renal osteodystrofi. Behandlingen kan være transdermal, oral eller parenteral. Forbindelsene kan foreligge i en blanding i en mengde fra ca. 0,1 ug/g til ca. 50 ug/g av blandingen, og kan administreres i doseringer på fra ca. 0,1 ug/dag til ca. 50 ug/dag.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er også spesielt egnet for behandling og profylakse av menneskelige forstyrrelser som karakteriseres ved en ubalanse i immunsystemet, f.eks. i autoimmune sykdommer, inklusive multippel sklerose, diabetes mellitus, "host versus graft"-reaksjoner og fra-støtning av transplantater; og ytterligere for behandling av inflammatoriske sykdommer, så som reumatoid artritt og astma, samt forbedring av benbruddshelbredelse og for-bedrede benimplantater. Akne, alopesi, hudtilstander, så som tørr hud (mangel på dermal hydrering), altfor stor hud-slapphet (utilstrekkelig hudfasthet), utilstrekkelig sebum-sekresjdn og rynker, og hypertensjon er andre tilstander som kan behandles med forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Ovennevnte forbindelser karakteriseres også ved høy celle-differensieringsaktivitet. Således tilveiebringer disse forbindelser også terapeutiske midler for behandling av psoriasis, eller som et anticancermiddel, spesielt mot leukemi, coloncancer, brystcancer og prostatacancer. Forbindelsene kan foreligge i en blanding for behandling av psoriasis i en mengde fra ca. 0,01 ug/g til ca. 100 ug/g av blandingen, og kan administreres topisk, transdermalt, oralt eller parenteralt i doseringer fra ca. 0,01 ug/dag til ca. 100 ug/dag.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 er en grafisk fremstilling som illustrerer den relative aktivitet av en blanding av 2a- og 2p-metyl-19-nor-20S-la,25-dihydroksyvitamin D3, en blanding av 2a- og 2p-metyl-19-nor-la,25-dihydroksyvitamin D3 og la,25-dihydroksy-vitamin D3 når det gjelder å konkurrere om binding av [3H]-1,25-(OH)2-D3 til den intestinale, nukleære reseptor i vitamin D fra griser; og

figur 2 er en grafisk fremstilling som illustrerer prosent-andelen av HL-60-celledifferensiering som funksjon av konsentrasjonen av en blanding av 2a- og 2p-metyl-19-nor-20S-la,25-dihydroksy-vitamin D3, en blanding av 2a- og 2p-metyl-19-nor-la,25-dihydroksy-vitamin D3 og la,25-dihydroksyvitamin D3.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som anvendt i beskrivelsen og kravene, betyr uttrykket "hydroksybeskyttende gruppe" enhver gruppe som vanligvis anvendes for temporær beskyttelse av hydroksyfunksjoner, så som f.eks. alkoksykarbonyl-, acyl-, alkylsilyl- eller alkylarylsilylgrupper (i det følgende helt enkelt omtalt som "silyl"-grupper) og alkoksyalkylgrupper. Alkoksykarbo-nylbeskyttende grupper er alkyl-0-CO-grupperinger, så som metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, propoksykarbonyl, iso-propoksykarbonyl, butoksykarbonyl, isobutoksykarbonyl, tert.-butoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl eller allyloksy-karbonyl. Uttrykket "acyl<M> betegner en alkanoylgruppe på 1-6 karbonatomer, i alle sine isomere former, eller en karboksyalkanoylgruppe på 1-6 karbonatomer, så som en oksalyl-, malonyl-, suksinyl-, glutarylgruppe, eller en aromatisk acylgruppe, så som benzoyl, eller en halogen-, nitro- eller alkylsubstituert benzoylgruppe. Ordet "alkyl" anvendt i beskrivelsen eller kravene, betegner et rett-kjedet eller forgrenet alkylradikal med 1-10 karbonatomer, i alle sine isomere former. Alkoksyalkylbeskyttende grupper er grupperinger, så som metoksymetyl, etoksymetyl, metoksy-etoksymetyl, eller tetrahydrofuranyl og tetrahydropyranyl. Foretrukne silylbeskyttende grupper er trimetylsilyl, trietylsilyl, t-butyldimetylsilyl, dibutylmetylsilyl, difenyl-metylsilyl, fenyldimetylsilyl, difenyl-t-butylsilyl og analoge alkylerte silylradikaler. Uttrykket "aryl" betyr en fenylgruppe eller en alkyl-, nitro- eller halogensubsti-tuert fenylgruppe.

En "beskyttet hydroksy"-gruppe er en hydroksygruppe som er derivatisert eller beskyttet med en av de ovennevnte grupper som vanligvis anvendes for temporær eller permanent beskyttelse av hydroksyfunksjoner, f.eks. silyl-, alkoksy-alkyl-, acyl- eller alkoksykarbonylgruppene, som definert tidligere. Uttrykkene "hydroksyalkyl", "deuteroalkyl" og "fluoralkyl" refererer til et alkylradikal substituert med én eller flere hydroksy-, deuterium- henholdsvis fluor-grupper.

Spesifikke og foretrukne eksempler på 2-alkylforbindelsene med struktur I er: 2(S)-metyl-19-nor-la,25-dihydroksyvitamin D3, 2(R)-metyl-19-nor-la,25-dihydroksyvitamin D3, 2(S)-metyl-19-nor-20(S)-la,25-dihydroksyvitamin D3, 2(R)-metyl-19-nor-20(S)-la,25-dihydroksyvitamin D3. Fremstillingen av la-hydroksy-2-alkyl-19-nor-vitamin D-forbindelser, spesielt la-hydroksy-2-metyl-19-nor-vitamin D-forbindelser med den grunnleggende struktur I, kan ut-føres ved en vanlig generell metode,, det vil si kondensa-sjon av et bisyklisk Windaus-Grundmann-keton II med det allyliske fosfinoksid III til de tilsvarende 2-metylen-19-nor-vitamin D-analoger IV, etterfulgt av en selektiv reduksjon av eksometylengruppen ved C-2 i sistnevnte forbindelser:

I strukturene II, III og IV representerer gruppene Yx og Y2 og R grupper som er definert ovenfor; Yi og Y2 er fortrinnsvis hydroksybeskyttende grupper, og det bør også være underforstått at enhver funksjonalitet i R som kan være sensitiv, eller som interfererer med kondensasjonsreak-sjonen, bør være beskyttet på passende måte, hvilket er velkjent i faget. Fremgangsmåten vist ovenfor representerer en utførelsesform av det konvergente syntesekonsept, som er blitt anvendt på effektiv måte for fremstilling av vitamin D-forbindelser [f.eks. Lythgoe et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I, 590 (1978); Lythgoe, Chem. Soc. Rev., 9, 449

(1983); Toh et al., J. Org. Chem., 48, 1414 (1983); Baggiolini et al., J. Org. Chem., 51, 3098 (1986); Sardina et al., J. Org. Chem., 51, 1264 (1986); J. Org. Chem., 51, 1269 (1986); DeLuca et al., US-patent nr. 5 086 191; DeLuca et al., US-patent nr. 5 536 713].

Hydrindanonene med den generelle struktur II er kjent, eller de kan fremstilles ved kjente metoder. Spesifikke, viktige eksempler på slike kjente bisykliske ketoner er strukturene med sidekjedene (a), (b), (c) og (d), beskrevet ovenfor, det vil si 25-hydroksy-Grundmann-keton (f)

[Baggiolini et al.; J. Org. Chem., 51, 3098 (1986)]; Grundmann-keton (g) [Inhoffen et al., Chem. Ber., 90, 664

(1957)]; 25-hydroksy^Windaus-keton (h) [Baggiolini et al., J. Org. Chem., 51, 3098 (1986)] og Windaus-keton (i)

[Windaus et al., Ann., 524, 297 (1936)]:

For fremstilling av de nødvendige fosfinoksider med den generelle struktur III er det blitt utviklet én syntetisk rute utgående fra metylkinikatderivatet 1, som lett erholdes fra kommersiell (IR,3R,4S,5R)-(-)-kininsyre, som beskrevet av Perlman et al., Tetrahedron Lett., 32, 7663

(1991), og DeLuca et al., US-patent nr. 5 086 191. Den

totale prosess med omdannelse av den utgående metylester 1 til de ønskede A-ringsyntoner er oppsummert i skjema I. Således ble den sekundære 4-hydroksylgruppe i 1 oksidert med

Ru04 (en katalytisk metode med R11CI3 og NaIC-4 som kooksi-dant). Anvendelse av et slikt sterkt oksideringsmiddel er nødvendig for en effektiv oksidasjonsprosess av dette meget hindrede hydroksyl. Imidlertid kan andre vanligere oksida-sjonsmidler også anvendes (f.eks. pyridiniumdikromat), skjønt reaksjonene vanligvis krever meget lengre tid for å sluttføres. Det andre trinn i syntesen omfatter Wittig-reaksjon av den sterisk hindrede 4-ketoforbindelse 2 med ylid fremstilt fra- metyltrifenylfosfoniumbromid og n-butyllitium. Andre baser kan også anvendes for å generere det reaktive metylenfosforan, så som t-BuOK, NaNfø, NaH, K/HMPT, NaN(TMS)2 etc. For fremstilling av 4-metylenforbin-delsen 3 kan noen beskrevne modifikasjoner av Wittig-prosessen anvendes, f.eks. omsetning av 2 med aktivert metylentrifenylfosforan [Corey et al., Tetrahedron Lett., 26, 555 (1985)]. Alternativt kan andre metoder som ofte anvendes for metylenering av ureaktive ketoner anvendes, f.eks. Wittig-Horners reaksjon med PO-ylidet erholdt fra metyldifenylfosfinoksid ved deprotonering med n-butyllitium [Schosse et al., Chimia, 30, 197 (1976)], eller omsetning av keton med natriummetylsulfinat [Corey et al., J. Org. Chem., 28, 1128 (1963)] og kaliummetylsulfinat [Greene et al., Tetrahedron Lett., 3755 (1976)]. Reduksjon av esteren 3 med litiumaluminiumhydrid eller et annet egnet reduk-sjonsmiddel (f.eks. DIBALH) ga diolen 4, som deretter ble oksidert med natriumperjodat til sykloheksanonderivatet 5. Det neste trinn i prosessen omfatter Petersons reaksjon av ketonet 5 med metyl(trimetylsilyl)acetat. Den resulterende allylester 6 ble behandlet med diisobutylaluminiumhydrid, og den dannede allylalkohol 7 ble i sin tur omdannet til det ønskede A-ringfosfinoksid 8. Omdannelse av 7 til 8 inn-befattet tre trinn, nemlig in situ-tosylering med n-butyllitium og p-toluensulfonylklorid, etterfulgt av omsetning med difenylfosfinlitiumsalt og oksidasjon med hydrogen-peroksid.

Flere 2-metylen-19-nor-vitamin D-forbindelser med den generelle struktur IV kan syntetiseres under anvendelse av

A-ringsyntonet 8 og det egnede Windaus-Grundmann-keton II, som har den ønskede sidekjedestruktur.<Således ga f.eks. Wittig-Horner-kobling av litiumfosfinoksykarbanionet gene-rert fra 8 og n-butyllitium med det beskyttede 25-hydroksy-Grundmann-keton 9, fremstilt ifølge den publiserte prosedyre [Sicinski et al., J. Med. Chem., 37, 3730 (1994)], den forventede beskyttede vitaminforbindelse 10. Denne ga etter avblokkering med AG 50W-X4-kationutbyttende harpiks la,25-dihydroksy-2-metylen-19-nor-vitamin D3 (11) .

Sluttrinnet i prosessen var selektiv, homogen, katalytisk hydrogenering av eksometylenenheten ved karbon 2 i vitaminet 11 utført på effektiv måte i nærvær av tris(trifenyl-fosfin)rhodium(I)klorid [Wilkinsons katalysator, (Ph3P)3-RhCl]. Slike reduksjonsbetingelser gjør det mulig å redu-sere bare C(2)=CH2-enheten og påvirker ikke C(5)-C(8)-buta-diengruppen. Det isolerte materialet er en epimer blanding (ca. 1:1) av 2-metyl-19-nor-vitaminene 12 og 13 som atskiller seg i konfigurasjon ved C-2. Blandingen kan anvendes uten separasjon, eller hvis ønskelig kan de individuelle 2a- og 2p-isomerer separeres med et effektivt HPLC-system. C-20-epimeriseringen ble utført ved analog kobling av fosfinoksidet 8 med beskyttet (20S)-25-hydroksy-Grundmann-keton 15 (skjema II) og ga 19-nor-vitamin 16, som etter hydrolyse av dihydroksybeskyttende grupper ga (20S)-la,25-dihydroksy-2-metylen-19-norvitamin D3 (17). Hydrogenering av 17 under anvendelse av Wilkinsons katalysator ga den forventede blanding av 2-metyl-19-nor-vitamin D-analogene 18 og 19. Som angitt ovenfor, kan andre 2-metyl-19-nor-vitamin D-analoger syntetiseres ved metoden beskrevet heri. For eksempel kan la-hydroksy-2-metylen-19-nor-vitamin D3 erholdes ved å tilveiebringe Grundmann-keton (g); på-følgende reduksjon av A-ringens eksometylengruppe i den dannede forbindelse kan gi den tilsvarende epimere blanding av la-hydroksy-2-metyl-19-nor-vitamin D3-forbindelser. Denne oppfinnelsen er beskrevet i de følgende illustrerende eksempler. I disse eksempler refererer spesifikke produkter angitt med arabiske tall (f.eks. 1, 2, 3 etc.) til de spesifikke strukturer som er definert i den foregående beskrivelse og i skjema I og skjema II.

Eksempel 1

Fremstilling av la, 25- dihydroksy- 2a- og la, 25- dihydroksy-2P- metyl- 19- nor- vitamin D3 ( 12 og 13)

Under henvisning først til skjema I ble det utgående metylkinikatderivat 1 erholdt fra kommersiell (-)-kininsyre, som beskrevet tidligere [Perlman et al., Tetrahedron Lett., 32, 7663 (1991); og DeLuca et al., US-patent nr. 5 086 191].

1: smp. 82-82,5 °C (fra heksan) , <1>H-NMR (CDC13) 8 0,098, 0,110, 0,142 og 0,159 (hver 3 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,896

og 0,911 (9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 1,820 (1 H, dd, J = 13,1, 10,3 Hz), 2,02 (1 H, ddd, J = 14,3, 4,3, 2,4 Hz), 2,09 (1 H, dd, J = 14,3, 2,8 Hz), 2,19 (1 H, ddd, J = 13,1, 4,4, 2,4 Hz), 2,31 (1 H, d, J = 2,8 Hz, OH), 3,42 (1 H, rn;

etter D20 dd, J = 8,6, 2,6 Hz), 3,77 (3 H, s), 4,12 (1 H, m), 4,37 (1 H, m), 4,53 (1 H, br s, OH) .

(a) Oksidasjon av 4- hydroksygruppen i metylkinikatderivat 1

( 3R, 5R)- 3, 5- bis[( tert.- butyldimetylsilyl) oksy]- 1- hydroksy-4- oksosykloheksankarboksylsyre- metylester ( 2)

Til en omrørt blanding av ruthenium(III)kloridhydrat

(434 mg, 2,1 mmol) og natriumperjodat (10,8 g, 50,6 mmol) i vann (42 ml) ble det tilsatt en løsning av metylkinikat 1 (6,09 g, 14 mmol) i CC14/CH3CN (1:1, 64 ml). Kraftig om-røring fortsatte i 8 timer. Noen få dråper 2-propanol ble tilsatt, og blandingen ble helt i vann og ekstrahert med kloroform. De organiske ekstrakter ble slått sammen, vasket

med vann, tørket (MgS04) og inndampet, hvilket ga et mørkt, oljeaktig residuum {ca. 5 g) som ble renset ved flashkromatografi. Eluering med heksan/etylacetat (8:2) ga rent, oljeaktig 4-keton 2 (3,4 g, 56 %).

<1>H-NMR (CDC13) 5 0,054, 0,091, 0,127 og 0,132 (hver 3 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,908 og 0,913 (9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 2,22 (1 H, dd, J - 13,2, 11,7 Hz), 2,28 (1 H, - dt, J = 14,9, 3,6 Hz), 2,37 (1 H, dd, J - 14,9, 3,2 Hz), 2,55 {1 H, ddd, J - 13,2, 6,4, 3,4 Hz), 3,79 (3. H, s), 4,41 (1 H, t, J - 3,5 Hz), 4,64 (1 H, s, OH), 5,04 (1 H, dd, J = 11,7, 6,4 Hz); MS: m/z (relativ intensitet), ingen M+, 375 (M+ - t-Bu, 32), 357 (M+ - t-Bu - H20, 47), 243 (31), 225 (57), 73 (100).

(b) Wittiq- reaksjon av 4- ketonet 2

( 3R, 5R)- 3, 5- bis[{ tert.- butyldimetylsilyl) oksy]- 1- hydroksy-4- metylensy klone ksankarboksylsyre- metylester ( 3)

Til metyltrifenylfosfoniumbromidet {2,813 g, 7,88 mmol) i vannfritt THF (32 ml) ved 0 °C ble det dråpevis tilsatt n-BuLi (2,5 M i heksan, 6,0 ml, 15 mmol) under argon med omrøring. En annen porsjon av MePh3P+Br- (2,813 g,

7,88 mmol) ble deretter tilsatt, og løsningen ble omrørt ved 0 °C i 10 minutter og ved romtemperatur i 40 minutter. Den oransjerøde blanding ble igjen avkjølt til 0 °C, og en løsning av 4-keton 2 (1,558 g, 3,6 mmol) i vannfritt THF {16 + 2 ml) ble tilsatt via en sifong til reaksjonskolben i løpet av 20 minutter. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0 °C i 1 time og deretter ved romtemperatur i 3 timer. Blandingen ble deretter forsiktig helt i saltvann inneholdende 1 % HC1 og ekstrahert med etylacetat og benzen. De sammenslåtte organiske ekstrakter ble vasket med fortynnet NaHC03 og saltvann, tørket (MgS04) og inndampet, hvilket ga et oransje, oljeaktig residuum (ca. 2,6 g) som ble renset ved flashkromatografi. Eluering med heksan/etylacetat (9:1)

ga den rene 4-metylenforbindelse 3 som en fargeløs olje (368 mg, 24 %).

<1>H-NMR (CDC13) 8 0,078, 0,083, 0,092 og 0,115 (hver 3 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,889 og 0,920 (9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 1,811 (1 H, dd, J = 12,6, 11,2 Hz), 2,10 (2 H, m), 2,31 (1 H, dd, J 12,6, 5,1 Hz), 3,76 (3 H, s), 4,69 {1 H, t, J = 3,1 Hz), 4,78 (1 H, m), 4,96 (2 H, iii; etter D20, 1 H, br s), 5,17 (1 H, t, J = 1,9 Hz); MS: m/z (relativ intensitet), ingen M+, 373 (M+ - t-Bu, 57), 355 (M+ - t-Bu - H20, 13), 341 (19), 313 (25), 241 (33), 223 (37), 209 (56), 73 (100).

(c) Reduksjon av estergruppen i 4- metylenforbindelse 3

[( 3R, 5R)- 3, 5- bist( tert.- butyldimetylsilyl) oksy]- 1- hydroksy-4- metylensykloheksyl] metanol ( 4) (i) Til en omrørt løsning av esteren 3 (90 mg, 0,21 mmol) i vannfritt THF (8 ml) ble litiumaluminiumhydrid (60 mg,

1,6 mmol) tilsatt ved 0 °C under argon. Kjølebadet ble fjernet etter 1 time, og omrøringen fortsatte ved 6 °C i 12 timer ved romtemperatur i 6 timer. Overskuddet av reagenset ble spaltet med mettet, vandig Na2S04, og blandingen ble ekstrahert med etylacetat og eter, tørket (MgS0<) og inndampet. Flashkromatografi av residuet med heksan/etylacetat (9:1) ga uomsatt substrat (12 mg) og en ren, krystallinsk diol 4 (35 mg, 48 %, basert på utbyttet av ester 3).

<1>H-NMR (CDCI3 + D20) 8 0,079, 0,091, 0,100 og 0,121 (hver 3 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,895 og 0,927 (9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 1,339 (1 H, t, J - 12 Hz), 1,510 (1 H, dd, J = 14,3, 2,7 Hz), 2,10 (2 H, m), 3,29 og 3,40 (1 H og 1 H, hver d, J = 11,0 Hz), 4,66 (1 H, t, J - 2,8 Hz), 4,78 (1 H, m), 4,92 (1 H, t, J = 1,7 Hz), 5,13 (1 H, t, J 2,0 Hz); MS: m/z (relativ intensitet), ingen M+, 345 (M+ - t-Bu, 8), 327 (M+ - t-Bu - H20, 22), 213 (28), 195 (11), 73 (100).

(ii) Diisobutylaluminiumhydrid (1,5 M i toluen, 2,0 ml,

3 mmol) ble tilsatt til en løsning av esteren 3 (215 mg,

0,5 mmol) i vannfri eter (3 ml) ved -78 °C under argon. Blandingen ble omrørt ved -78 °C i 3 timer og ved -24 °C i 1,5 time og fortynnet med eter (10 ml), og reaksjonen ble undertrykt ved sakte tilsetning av 2 N kaliumnatriumtartrat. Løsningen ble oppvarmet til romtemperatur og om-rørt i 15 minutter, deretter helt i saltvann og ekstrahert med etylacetat og eter. De organiske ekstrakter ble slått sammen, vasket med fortynnet (ca. 1 %) HC1 og saltvann, tørket (MgSC>4) og inndampet. Det krystallinske residuum ble renset ved flashkromatografi. Eluering med heksan/etylacetat (9:1) ga den krystallinske diol 4 (43 mg, 24 %).

(d) Spalting av den vicinale diol 4

( 3R, 5R)- 3, 5- bis[( tert.- butyldimetylsilyl) oksy]- 4- metylen-sykloheksanon ( 5)

Natriumperjodatmettet vann (2,2 ml) ble tilsatt til en løsning av diolen 4 (146 mg, 0,36 mmol) i metanol (9 ml) ved 0 °C. Løsningen ble omrørt ved 0 °C i 1 time, helt i saltvann og ekstrahert med eter og benzen. De organiske ekstrakter ble slått sammen, vasket med saltvann, tørket (MgSO<) og inndampet. Et oljeaktig residuum ble oppløst i heksan (1 ml) og overført til en silika-Sep-Pak-patron. Det rene 4-metylensykloheksanonderivatet 5 (110 mg, 82 %) ble eluert med heksan/etylacetat (95:5) som en fargeløs olje.

<X>H-NMR (CDC13) S 0,050 og 0,069 (6 H og 6 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,881 (18 H, s, 2 x Si-t-Bu), 2,45 (2 H, ddd, J = 14,2, 6,9, 1,4 Hz), 2,64 (2 H, ddd, J = 14,2, 4,6, 1,4 Hz), 4,69 (2 H, dd, J = 6,9, 4,6 Hz), 5,16 (2 H, s); MS: m/z (relativ intensitet), ingen M+, 355 (M+ - Me, 3), 313 (M+ - t-Bu, 100), 73 (76).

(e) Fremstilling av allylesteren 6

[ ( 3rR, 5' R) - 3' , 5'- bis[ ( tert.- butyldimetylsilyl) oksy]- 4'-metylensykloheksyliden] eddiksyremetylester ( 6)

Til en løsning av diisopropylamin (37 ul, 0,28 mmol) i vannfritt THF (200 ul) ble det tilsatt n-BuLi (2,5 M i heksan, 113 ul, 0,28 mmol) under argon ved -78 °C med om-røring, og metyl (trimetylsilyl) acetat (46 fil, 0,28 mmol) ble deretter tilsatt. Etter 15 minutter ble ketoforbindel-sen 5 (49 mg, 0,132 mmol) tilsatt dråpevis. Løsningen ble omrørt ved -78 °C i 2 timer, og reaksjonen ble undertrykt med mettet NH4CI, blandingen ble helt i saltvann og ekstrahert med eter og benzen. De sammenslåtte organiske ekstrakter ble vasket med saltvann, tørket (MgS04) og inndampet. Residuet ble oppløst i heksan (1 ml) og overført til en silika-Sep-Pak-patron. Eluering med heksan og heksan/etylacetat (98:2) ga en ren allylester 6 (50 mg,

89 %) som en fargeløs olje.

<1>H-NMR (CDCI3) 8 0,039, 0,064 og 0,076 (6 H, 3 H og 3 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,864 og 0,884 (9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 2,26 (1 H, dd, J - 12,8, 7,4 Hz), 2,47 (1 H, dd, J = 12,8, 4,2 Hz), 2,98 (1 H, dd, J = 13,3, 4,0 Hz), 3,06 (1 H, dd, J = 13,3, 6,6 Hz), 3,69 (3 H, s), 4,48 (2 H, m), 4,99 (2 H, s), 5,74 (1 H, s); MS: m/z (relativ intensitet), 426 (M+, 2), 411 (M+ - Me, 4), 369 (M+ - t-Bu, 100), 263 (69) .

(f) Reduksjon av allylesteren 6

2-[( 3' R, S' R)- 3', 5*- bis[( tert.- butyldimetylsilyl) oksy]- 4'-metylensykloheksyliden] etanol ( 7) ;Diisobutylaluminiumhydrid (1,5 M i toluen, 1,6 ml, ;2,4 mmol) ble langsomt tilsatt til en omrørt løsning av allylesteren 6 (143 mg, 0,33 mmol) i toluen/metylenklorid (2:1, 5,7 ml) ved -78 °C under argon. Omrøringen fortsatte ved -78 °C i 1 time og ved -46 °C (sykloheksanon-/tørris-bad) i 25 minutter. Reaksjonen ble undertrykt ved langsom ;tilsetning av kaliumnatriumtartrat (2 N, 3 ml), vandig HC1 (2 N, 3 ml) og H20 (12 ml), og blandingen ble deretter fortynnet med metylenklorid (12 ml) og ekstrahert med eter og benzen. De organiske ekstrakter ble slått sammen, vasket ;med fortynnet (ca. 1 %) HC1 og saltvann, tørket (MgSCu) og inndampet. Residuet ble renset ved flashkronratografi. Eluering med heksan/etylacetat (9:1) ga den krystallinske allylalkohol 7 (130 mg, 97 %). ;<1>H-NMR (CDC13) 5 0,038, 0,050 og 0,075 (3 H, 3 H og 6 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,876 og 0,904 (9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 2,12 (1 H, dd, J = 12,3, 8,8 Hz), 2,23 (1 H, dd, J = 13,3, 2,7 Hz), 2,45 (1 H, dd, J = 12,3, 4,8 Hz), 2,51 (1 H, dd, J = 13,3, 5,4 Hz), 4,04 (1 H, m; etter D20 dd, J = 12,0, 7,0 Hz), 4,17 (1 H, m; etter D20 dd, J = 12,0, 7,4 Hz), 4,38 (1 H, m), 4,49 (1 H, m), 4,95 (1 H, br s), 5,05 (1 H, t, J = 1,7 Hz), 5,69 (1 H, - t, J = 7,2 Hz); MS: m/z (relativ intensitet) 398 <M+, 2), 383 (M+ - Me, 2), 365 (M+ - Me - H20, 4), 341 (M+ - t-Bu, 78), 323 (M+ - t-Bu - H20, 10), 73 (100). ;(g) Omdannelse av allylalkoholen 7 til fosfinoksid 8 ;[ 2-[( 3' R, 5' R)- 3', 5'- bis t( tert.- butyldimetylsilyl) oksy]- 41-metylensykloheksyliden] etyl] difenylfosfinoksid ( 8) ;Til allylalkoholen 7 (105 mg, 0,263 mmol) i vannfritt THF (2,4 ml) ble det tilsatt n-BuLi (2,5 M i heksan, 105 ul, 0,263 mmol) under argon ved 0 °C. Nylig omkrystallisert tosylklorid (50,4 mg, 0,264 mmol) ble oppløst i vannfritt THF (480 ul) og tilsatt til allylalkohol-BuLi-løsningen. Blandingen ble omrørt ved 0 °C i 5 minutter og satt til side ved 0 °C. I en annen tørr kolbe med luften erstattet med argon ble n-BuLi (2,5 M i heksan, 210 ul, 0,525 mmol) tilsatt til Ph2PH (93 ul, 0,534 mmol) i vannfritt THF ;(750 ul) ved 0 °C under omrøring. Den røde løsning ble til-ført via en sifong under argontrykk til løsningen av tosy-lat inntil den oransje fargen ble bestående (ca. halvparten ;av løsningen ble tilsatt). Den resulterende blanding ble omrørt i ytterligere 30 minutter ved 0 °C, og reaksjonen ble undertrykt ved å tilsette H2O (30 ul) . Løsningsmidlene ble inndampet under redusert trykk, og residuet ble oppløst på nytt i metylenklorid (2,4 ml) og omrørt med 10 % H202 ved 0 °C i 1 time. Det organiske sjikt ble separert, vasket med kaldt, vandig natriumsulfitt og H20, tørket (MgSC^) og inndampet. Residuet ble behandlet flashkromatografisk. Eluering med benzen/etylacetat (6:4) ga semikrystallinsk fosfinoksid 8 (134 mg, 87 %). ;<1>H-NMR (CDCI3) 8 0,002, 0,011 og 0,019 (3 H, 3 H og 6 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,855 og 0,860 (9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 2,0-2,1 (3 H, br m), 2,34 (1 H, m), 3,08 (1 H, m), 3,19 (1 H, m), 4,34 (2 H, m), 4,90 og 4,94 (f H og 1 H, hver s), 5,35 (1 H, ~ q, J= 7,4 Hz); 7,46 (4 H, m) , 7,52 (2 H, m), 7,72 (4 H, m); MS: m/z (relativ intensitet), ingen M+, 581 (M+ - 1, 1), 567 (M+ - Me, 3), 525 (M+ - t-Bu, 100), 450 (10), 393 (48). ;(h) Wittig- Horner- kobling av beskyttet 25- hydroksy-Grundmann- keton 9 med fosfinoksidet 8 ;let, 25- dihydroksy- 2- metylen- 19- nor- vitamin D3 ( 11) ;Til en løsning av fosfinoksid 8 (33,1 mg, 56,8 umol) i vannfritt THF (450 ul) ved 0 °C ble det langsomt tilsatt n-BuLi (2,5 M i heksan, 23 ul, 57,5 umol) under argon med om-røring. Løsningen ble dypt oransje. Blandingen ble avkjølt til -78 °C, og en på forhånd avkjølt (-78 °C) løsning av det beskyttede hydroksyketon 9 (9,0 mg, 22,8 umol), fremstilt i henhold til den publiserte prosedyre [Sicinski et al., J. Med. Chem., 37, 3730 (1994)], i vannfritt THF (200 + 100 ul) ble langsomt tilsatt. Blandingen ble omrørt under argon ved -78 °C i 1 time og ved 0 °C i 18 timer. Etylacetat ble tilsatt, og den organiske fase ble vasket med saltvann, tørket (MgS04) og inndampet. Residuet ble oppløst i heksan og overført til en silika-Sep-Pak-patron og vasket med heksan/etylacetat (99:1, 20 ml), hvilket ga 19-nor-vitaminderivatet 10 (13,5 mg, 78 %). Sep-Pak-patronen ble deretter vasket med heksan/etylacetat (96:4, 10 ml) for å gjenvinne noe av det uforandrede C,D-ringketon 9 (2 mg), og med etylacetat (10 ml) for å gjenvinne difenylfosfinoksidet (20 mg). Av analytiske grunner ble en prøve av det beskyttede vitamin 10 ytterligere renset ved HPLC (6,2 mm x 25 cm Zorbax-Sil-kolonne, 4 ml/minutt) under anvendelse av heksan/etylacetat (99,9:0,1) som løsningsmiddelsystem. Den rene forbindelse 10 ble eluert ved Rv 26 ml som en fargeløs olje. ;UV (i heksan) 244, 253, 263 nm; <X>H-NMR (CDC13) 8 0,025, 0,049, 0,066 og 0,080 (hver 3 H, hver s, 4 x SiCH3), 0,546 (3 H, s, 18-H3), 0,565 (6 H, q, J 7,9 Hz, 3 x SiCH2) , 0,864 og 0,896 (9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 0,931 (3 H, d, J = 6,0 Hz, 21-H3) , 0, 947 (9 H, t, J = 7,9 Hz, 3 x SiCH2Cff3), 1,188 (6 H, s, 26- og 27-H3), 2,00 (2 H, m), 2,18 (1 H, dd, J = 12,5, 8,5 Hz, 40-H), 2,33 (1 H, dd, J = 13,1, 2,9 Hz, 10P-H), 2,46 (1 H, dd, J = 12,5, 4,5 Hz, 4a-H), 2,52 (1 H, dd, J = 13,1, 5,8 Hz, 10a-H), 2,82 (1 H, br d, J = 12 Hz, 9P-H), 4,43 (2 H, m, lp- og 3a-H), 4,92 og 4,97 (1 H og 1 H, hver s, =CH2), 5,84 og 6,22 (1 H og 1 H, hver d, J = 11,0 Hz, 7- og 6-H); MS: m/z (relativ intensitet) 758 (M+, 17), 729 (M+ - Et, 6), 701 (M+ - t-Bu, 4), 626 (100), 494 (23), 366 (50), 73 (92). ;Det beskyttede vitamin 10 (4,3 mg) ble oppløst i benzen (150 lii), og harpiksen (AG 50W-X4, 60 mg; forhåndsvasket med metanol) i metanol (800 fil) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur under argon i 17 timer, fortynnet med etylacetat/eter (1:1, 4 ml) og dekantert. Harpiksen ble vasket med eter (8 ml), og de sammenslåtte organiske faser ble vasket med saltvann og mettet NaHC03, tørket (MgSCU) og inndampet. Residuet ble renset ved HPLC (6,2 mm x 25 cm Zorbax-Sil-kolonne, 4 ml/minutt) under anvendelse av heksan/2-propanol (9:1) som løsningsmiddelsystem. Analytisk rent 2-metylen-19-nor-vitamin 11 (2,3 mg, 97 %) ble opp-samlet ved Rv 29 ml (la,25-dihydroksyvitamin D3 ble eluert ved Rv 52 ml i det samme system) som et hvitt, fast stoff. ;UV (i EtOH) Xmaicg 243,5, 252, 262,5 nm; <1>H-NMR (CDCI3) 8 0,552 (3 H, s, I8-H3), 0,941 (3 H, d, J = 6,4 Hz, 21-H3) , 1,222 (6 H, s, 26- og 27-H3), 2,01 (2 H, m) , 2,27-2,36 ;(2 H, m), 2,58 (1 H, m), 2,80-2,88 (2 H, m), 4,49 (2 H, m, lp- og 3a-H), 5,10 og 5,11 (1 H og 1 H, hver s, =CH2), 5,89 og 6,37 (1 H og 1 H, hver d, J = 11,3 Hz, 7- og 6-H); MS: m/z (relativ intensitet) 416 (M+, 83), 398 (25), 384 (31), 380 (14), 351 (20), 313 (100). ;(i) Hydrogenering av 2- metylen- 19- nor- vitamin 11 ;la, 25- dihydroksy- 2a- og la, 25- dihydroksy- 2P- metyl- 19- nor-vitamin D3 ( 12 og 13) ;Tris(trifenylfosfin)rhodium(I)klorid (2,3 mg, 2,5 umol) ble tilsatt til tørt benzen (2,5 ml) som på forhånd var mettet med hydrogen. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil en homogen løsning var dannet (ca. 45 minutter). En løsning av vitamin 11 (1,0 mg, 2,4 umol) i tørt benzen (0,5 ml) ble deretter tilsatt, og reaksjonen fikk foregå under en kontinuerlig strøm av hydrogen i 3 timer. Benzenet ble fjernet under vakuum, og heksan/etylacetat (1:1, 2 ml) ble tilsatt til residuet. Blandingen ble overført til en silika-Sep-Pak, og begge 2-metylvitaminer ble eluert med det samme løsningsmiddelsystem (20 ml). Ytterligere rensing ble oppnådd med HPLC (6,2 mm x 25 cm Zorbax-Sil-kolonne, 4 ml/minutt) under anvendelse av heksan/2-propanol (9:1) som løsningsmiddelsystem. Blandingen (ca. 1:1) av 2-metyl-19-nor-vitaminer (2a- og 2p~epimerene 12 og 13; 0,80 mg, ;80 %) ga en eneste topp ved Rv 33 ml. ;12 og 13: UV (i EtOH) 243, 251, 261,5 nm; <X>H-NMR (CDCI3) 8 0,536 og 0,548 (3 H og 3 H, hver s, I8-H3), 0,937 (6 H, d, J = 6,3 Hz, 2 x 21-H3), 1,133 og 1,144 (3 H og 3 H, hver d, J ~ 6 Hz, 2 x 2-CH3), 1,219 [12 H, s, 2 x (26-og 27-H3)], 2,60 (1 H, dd, J = 13,0, 4,6 Hz), 2,80 (3 H, m), 3,08 (1 H, dd, J = 12,6, 4,0 Hz), 3,51 (1 H, dt, J = 4,6, 10,2 Hz), 3,61 (1 H, dt, J = 4,5, 9,1 Hz), 3,90 (1 H, smal m), 3,96 (1 H, smal m), 5,82, 5,87, 6,26 og 6,37 (hver 1 H, hver d, J = 11,2 Hz); MS: m/z (relativ intensitet) 418 (M+, 100), 400 (25), 385 (15), 289 (30), 245 (25). ;Eksempel 2 ;Fremstilling av ( 20S)- la, 25- dihydroksy- 2a- og ( 20S)- la, 25-dihydroksy- 2P- metyl- 19- nor- vitamin D3 ( 18 og 19) ;Skjema II illustrerer fremstillingen av det beskyttede (20S)-25-hydroksy-Grundmann-keton 15, dets kobling med fosfinoksidet 8 (erholdt som beskrevet i eksempel 1) og den selektive hydrogenering av eksometylengruppen i 2-metylen-forbindelsen 17. ;(a) Silylering av hydroksyketonet 14 ;( 20S)- 25-[( trietylsilyl) oksy]- des- A, B- cholestan- 8- on ( 15) ;En løsning av ketonet 14 (Tetrionics, Inc.; 56 mg, ;0,2 mmol) og imidazol (65 mg, 0,95 mmol) i vannfritt DMF (1,2 ml) ble behandlet med trietylsilylklorid (95 ul, ;0,56 mmol), og blandingen ble omrørt ved romtemperatur under argon i 4 timer. Etylacetat og vann ble tilsatt, og det organiske lag ble separert. Etylacetatlaget ble vasket med vann og saltvann, tørket (MgS04) og inndampet. Residuet fikk passere gjennom en silika-Sep-Pak-patron i heksan/etylacetat (9:1), og etter inndamping ble det renset ved HPLC (9,4 mm x 25 cm Zorbax-Sil-kolonne, 4 ml/minutt) under anvendelse av heksan/etylacetat (9:1) som løsnings-middelsystem. Rent beskyttet hydroksyketon 15 (55 mg, 70 %) ble eluert ved Rv 35 ml som en fargeløs olje. ;<*>H-NMR (CDCI3) 8 0,566 (6 H, q, J = 7,9 Hz, 3 x SiCH2) , 0,638 (3 H, s, I8-H3), 0,859 (3 H, d, J = 6,0 Hz, 21-H3) ,

0,947 (9 H, t, J = 7,9 Hz, 3 x SiCH2Ctf3) , 1,196 (6 H, s, 26- og 27-H3), 2,45 (1 H, dd, J = 11,4, 7,5 Hz, 14ct-H) .

(b) Wittig- Horner- kobling av det beskyttede ( 20S)- 25-hydroksy- Grundmann- keton 15 med fosfinoksidet 8

( 20S)- la, 25- dihydroksy- 2- metylen- 19- nor- vitamin D3 ( 17)

Til en løsning av fosfinoksid 8 (15,8 mg, 27,1 umol) i vannfritt THF (200 ul) ved 0 °C ble det langsomt tilsatt n-BuLi (2,5 M i heksan, 11 fil, 27,5 umol) under argon med omrøring. Løsningen ble dypt oransje. Blandingen ble av-kjølt til -78 °C, og en på forhånd avkjølt (-78 °C) løsning av det beskyttede hydroksyketon 15 (8,0 mg, 20,3 umol) i vannfritt THF (100 ul) ble langsomt tilsatt. Blandingen ble omrørt under argon ved -78 °C i 1 time og ved 0 °C i 18 timer. Etylacetat ble tilsatt, og den organiske fase ble vasket med saltvann, tørket (MgS04) og inndampet. Residuet ble oppløst i heksan og overført til en silika-Sep-Pak-patron og vasket med heksan/etylacetat (99,5:0,5, 20 ml), hvilket ga 19-nor-vitaminderivatet 16 (7 mg, 45 %) som en fargeløs olje. Sep-Pak-patronen ble deretter vasket med heksan/etylacetat (96:4, 10 ml) for å gjenvinne noe av det uforandrede C,D-ringketon 15 (4 mg), og med etylacetat

(10 ml) for å gjenvinne difenylfosfinoksidet (9 mg). Av analytiske grunner ble en prøve av det beskyttede vitamin 16 ytterligere renset ved HPLC (6,2 mm x 25 cm Zorbax-Sil-kolonne, 4 ml/minutt) under anvendelse av heksan/etylacetat (99,9:0,1) som løsningsmiddelsystem.

16: UV (i heksan) X^^ 244, 253,5, 263 nm; <1>H-NMR (CDC13) 8 0,026, 0,049, 0,066 og 0,080 (hver 3 H, hver s, 4 x SiCH3) , 0,541 (3 H, s, I8-H3), 0,564 (6 H, q, J = 7,9 Hz, 3 x SiCH2), 0,848 (3 H, d, J = 6,5 Hz, 21-H3) , 0,864 og 0,896

(9 H og 9 H, hver s, 2 x Si-t-Bu), 0,945 (9 H, t, J = 7,9 Hz, 3 x SiCH2 CH3) , 1,188 (6 H, s, 26- og 27-H3), 2,15-2,35 (4 H, br m), 2,43-2,53 (3 H, br m), 2,82 (1 H, br d, J = 12,9 Hz, 9P-H), 4,42 (2 H, m, ip- og 3a-H), 4,92 og 4,97 (1

H og 1 H, hver s, =CH2), 5,84 og 6,22 (1 H og 1 H, hver d, J = 11,1 Hz, 7- og 6-H); MS: m/z (relativ intensitet) 758 (M+, 33), 729 (M+ - Et, 7), 701 (M+ - t-Bu, 5), 626 (100), 494 (25), 366 (52), 75 (82), 73 (69).

Det beskyttede vitamin 16 (5,0 mg) ble oppløst i benzen (160 ul), og harpiksen (AG 50W-X4, 70 mg; forhåndsvasket med metanol) i metanol (900 ul) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur under argon i 19 timer, fortynnet med etylacetat/eter (1:1, 4 ml) og dékantert. Harpiksen ble vasket med eter (8 ml), og de sammenslåtte organiske faser ble vasket med saltvann og mettet NaHC03, tørket (MgS04) og inndampet. Residuet ble renset ved HPLC (6,2 mm x 25 cm Zorbax-Sil-kolonne, 4 ml/minutt) under anvendelse av heksan/2-propanol (9:1) som løsningsmiddelsystem. Analytisk rent 2-metylen-19-nor-vitamin 17 (2,6 mg, 95 %) ble opp-samlet ved Rv 28 ml [ (20R)-analogen ble eluert ved Rv 29 ml og la, 25-dihydroksyvitamin D3 ved Rv 52 ml i det samme system] som et hvitt, fast stoff.

UV (i EtOH) Ws 243,5, 252,5, 262,5 nm; <X>H-NMR (CDC13) 8 0,551 (3 H, s, 18-H3), 0,858 (3 H, d, J = 6,6 Hz, 21-H3) , 1,215 (6 H, s, 26- og 27-H3) , 1, 95-2,04 (2 H, m), 2,27-2,35 (2 H, m), 2,58 (1 H, dd, J = 13,3, 3,7 Hz), 2,80-2,87 (2 H, m), 4,49 (2 H, m, 10- og 3a-H), 5,09 og 5,11 (1 H og 1 H, hver s, =CH2), 5,89 og 6,36 (1 H og 1 H, hver d, J = 11,3 Hz, 7- og 6-H); MS: m/z (relativ intensitet) 416 (M+, 100), 398 (26), 380 (13), 366 (21), 313 (31).

(c) Hydrogenering av 2- metylen- 19- nor- vitaminet 17

( 20S)- la, 25- dihydroksy- 2a- og la, 25- dihvdroksy- 2p- metyl-19- nor- vitamin D3 ( 18 og 19)

Tris(trifenylfosfin)rhodium(I)klorid (2,3 mg, 2,5 umol) ble tilsatt til tørt benzen (2,5 ml) som på forhånd var mettet med hydrogen. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur inntil en homogen løsning var dannet (ca. 45 minutter). En

løsning av vitamin 17 (1>0 mg, 2,4 umol) i tørt benzen

(0,5 ml) ble deretter tilsatt, og reaksjonen fikk foregå under en kontinuerlig strøm av hydrogen i 3 timer. Benzenet ble fjernet under vakuum, og heksan/etylacetat (1:1, 2 ml) ble tilsatt til residuet. Blandingen ble overført til en silika-Sep-Pak, og begge 2-metylvitaminer ble eluert med det samme løsningsmiddelsystem (20 ml). Ytterligere rensing ble oppnådd med HPLC (6,2 mm x 25 cm Zorbax-Sil-kolonne, 4 ml/minutt) under anvendelse av heksan/2-propanol (9:1) som løsningsmiddelsystem. Blandingen (ca. 1:1) av 2-metyl-19-nor-vitaminer (2a- og 2p-epimerene 18 og 19; 0,43 mg,

43 %) ga en eneste topp ved Rv 31 ml.

18 og 19: UV (i EtOH) Ws 243, 251, 261 nm; <1>H-NMR (CDC13) 8 0,534 og 0,546 (3 H og 3 H, hver s, 2 x 18-H3) , 0,852 og 0,857 (3 H og 3 H, hver d, J = 6,5 Hz, 2 x 21-H3), 1,133

(3 H, d, J = 6,7 Hz, 2-CH3), 1,143 (3 H, d, J = 6,5 Hz, 2-CH3), 1,214 [12 H, s, 2 x (26- og 27-H3)], 2,60 (1 H, dd, J = 12,7, 4,5 Hz), 2,80 (3 H, m), 3,08 (1 H, dd, J = 13,1, 4,3 Hz), 3,51 (1 H, br m; etter D20 dt, J = 4,5, 10,0 Hz),

3,61 (1 H, br m; etter D20 dt, J = 4,4, 9,2 Hz), 3,90 (1 H, smal m), 3,96 (1 H, smal m), 5,82, 5,87, 6,26 og 6,37 (hver 1 H, hver d, J = 11,3 Hz); MS: m/z (relativ intensitet) 418 (M+, 100), 400 (45), 385 (20), 289 (38), 245 (47).

Biologisk aktivitet av 2- metylsubstituerte 19- nor- l, 25-( OH) 2D3- forbindelser og deres 20S- isomerer

Innføring av en metylgruppe til 2-stillingen av 19-nor-l,25-(OH)2D3 eller dets 20S-isomer hadde liten eller ingen virkning på bindingen til den porcine intestinale vitamin D-reseptor. Alle forbindelser ble bundet like godt til den porcine reseptor inklusive standarden l,25-(OH)2D3 (figur 1). Det bør kunne forventes av disse resultater at alle disse forbindelser vil ha ekvivalent biologisk aktivitet. Men på overraskende måte ga 2-metylsubstitusjonene meget selektive analoger med sin primære virkning på benmasse. Når de fikk 7 dager i en kronisk modus, var de mest potente testede forbindelser en blanding av S- og R-isomerene av 2-metyl-19-nor-20S-l,25-(OH)2D3 (tabell 1). Når den ble gitt i en konsentrasjon på 130 pmol/dag, var aktiviteten til denne blanding av forbindelser på benkalsiummobiliseringen (serumkalsium) meget høyere enn aktiviteten av det native hormon, muligens så høy som 10 eller 100 ganger høyere. Under identiske betingelser ga to ganger dosen av 1,25-(OH)2D3 en serumkalsiumverdi på 7,2 mg/100 ml, mens en blanding av 2-metyl-(S og R)-19-nor-20S-l,25-(OH)2D3 ga en verdi på 9,6 mg/100 ml serumkalsium ved konsentrasjonen 130 pmol/dose. Når den ble gitt i en konsentrasjon på

260 pmol/dag, ga denne blanding den forbløffende verdi 12,2 mg/100 ml serumkalsium på benmassens bekostning. For å vise selektiviteten frembrakte disse forbindelser ingen signifikant forandring i den intestinale kalsiumtransport

ved 130 pmol-dosenivået og hadde en sterk benkalsiummobiliserende aktivitet. Ved den høyere dosen frembrakte 2-metyl-20S-blandingen faktisk en intestinal transportrespons, men ga en enorm benmobiliserende respons. En blanding av S- og R-isomerene av 2-metyl-19-nor-l,25-(OH)2D3 hadde også sterk benkalsiummobilisering ved begge dosenivåer, men viste ingen intestinal kalsiumtransportaktivitet. Således viste 2-metyl-S- og -R-derivatene, når de ble gitt som en blanding, sterk preferensiell benkalsiummobiliserende aktivitet, spesielt når sidekjeden var i 20S-konfigurasjon. Disse resultater illustrerer at 2-metyl- og 20S-2-metylderivatene av 19-nor-l,25-(OH)2D3 er selektive når det gjelder å mobilisere kalsium fra benmasse. Tabell 2 viser responsen av både intestinalkalsium og serumkalsium til en enkelt stor dose av de forskjellige forbindelser; hvilket igjen understøtter konklusjonene utledet fra tabell 1.

Resultatene i figur 2 illustrerer at en blanding av S- og R-derivatene av 2-metyl-19-nor-20S-l,25-(OH)2D3 er ytterst potent når det gjelder å indusere differensiering av HL-60-celler til monocyttene. 2-metyl-S- og -R-forbindelsene hadde en lignende aktivitet som 1,25-(OH)2D3. Disse resultater illustrerer potensialet av 2-metyl-19-nor-20S-l,25-

(OH) 2D3-forbindelsene som anticancermidler, spesielt mot leukemi, coloncancer, brystcancer og prostatacancer, eller som midler for behandling av psoriasis.

Konkurrerende binding av analogene til den porcine intestinale reseptor ble utført ved metoden beskrevet av Dame et al. (Biochemistry, 25, 4523-4534, 1986).

Differensieringen av HL-60-promyelocyttiske celler til monocytter ble bestemt som beskrevet av Ostrem et al.

(J. Biol. Chem., 262, 14164-14171, 1987).

Tabell 1

Den intestinale kalsiumtransportaktivitet og serumkalsium-aktiviteten (benkalsiummobiliseringen) som reaksjon på kroniske doser av 2-metylderivatene av 19-nor-l,25-(OH)2D3 og dets 20S-isomerer

Avvente hannrotter ble erholdt fra Sprague Dawley Co.

(Indianapolis, IN), og de ble foret med en 0,47 % kalsium-, 0,3 % fosforholdig vitamin D-manglende diett i 1 uke, og deretter fikk de samme diett inneholdende 0,02 % kalsium, 0,3 % fosfor i 2 uker. Under den siste uken fikk de den indikerte dose av forbindelsen ved intraperitoneal injeksjon i 0,1 ml 95 % propylenglykol og 5 % etanol hver dag i 7 dager. Kontrolldyrene fikk bare 0,1 ml 95 % propylenglykol, 5 % etanol. 24 timer etter den siste dosen ble rottene avlivet, og den intestinale kalsiumtransport ble bestemt med den vrengte sekks teknikk, som tidligere beskrevet, og serumkalsium ble bestemt ved atomabsorpsjons-spektrometri på et Perkin Elmer-instrument, modell 3110 (Norwalk, CT). Det var 5 rotter pr. gruppe, og verdiene representerer gjennomsnittet ± SEM.

Tabell 2

Den intestinale kalsiumtransportaktivitet og serumkalsium-aktiviteten (benkalsiummobiliseringen) som reaksjon på en enkeltdose av 2-metylderivatene av 19-nor-l,25-(OH) 2D3 og dets 20S-isomerer

Avvente hannrotter av Holtzman-rasen ble erholdt fra Sprague Dawley Co. (Indianapolis, IN), og de ble fåret med den 0,47 % kalsium-, 0,3 % fosforholdige diett beskrevet av Suda et al. (J. Nutr., 100, 1049-1052, 1970) i 1 uke, og deretter fikk de samme diett inneholdende 0,02 % kalsium og 0,3 % fosfor i ytterligere 2 uker. Ved dette tidspunkt fikk de en enkelt intrajugular injeksjon av den indikerte dose oppløst i 0,1 ml 95 % propylenglykol/5 % etanol. 24 timer senere ble de avlivet, og den intestinale kalsiumtransport og serumkalsium ble bestemt som beskrevet i tabell 1. Dosen av forbindelsene var 650 pmol, og det var 5 dyr pr. gruppe. Dataene er uttrykt som gjennomsnittet ± SEM.

For å kunne anvendes ved terapeutisk behandling kan de nye forbindelser ifølge denne oppfinnelsen, definert ved formel I, formuleres farmasøytisk som en løsning i ufarlige løsningsmidler, eller som en emulsjon, suspensjon eller dispersjon i passende løsningsmidler eller bærere, eller som piller, tabletter eller kapsler, sammen med faste bærere, i henhold til konvensjonelle metoder som er kjent i faget. Enhver slik formulering kan også inneholde andre farmasøytisk akseptable og ikke-toksiske eksipienser, så som stabiliseringsmidler, antioksidanter, bindemidler, fargestoffer eller emulgerende eller smaksmodifiserende midler.

Forbindelsene kan administreres oralt, topisk, parenteralt eller transdermalt. Forbindelsene administreres med fordel ved injeksjon eller ved intravenøs infusjon eller egnede sterile løsninger, eller i form av flytende eller faste doser via fordøyelseskanalen, eller i form av kremer, salver, plastre eller lignende vehikler som er egnet for transdermale applikasjoner. Doser på fra 0,1 ug til 50 ug pr. dag av forbindelsene er passende for behandlingsformål, og slike doser justeres i henhold til sykdommen som skal behandles, dens alvor og pasientens respons, hvilket er velkjent i faget. Siden de nye forbindelser utøver spesi-fisitet i sin virkning, kan hver enkelt av dem med fordel administreres alene eller sammen med graderte doser av en annen aktiv vitamin D-forbindelse - f.eks. la-hydroksyvitamin D2 eller D3, eller la,25-dihydroksyvitamin D3 - i situasjoner hvor forskjellige grader av benmineralmobili-sering og kalsiumtransportstimulering har vist seg å være fordelaktig.

Blandinger for anvendelse i ovennevnte behandling av psoriasis og andre ondartede sykdommer omfatter en effektiv mengde av én eller flere 2-substituerte 19-nor-vitamin D-forbindelser, som definert ved ovennevnte formel, som aktiv ingrediens, og en egnet bærer. En effektiv mengde av slike forbindelser for anvendelse i henhold til denne oppfinnelsen er fra ca. 0,01 ug til ca. 100 ug pr. gram av blandingen, og den kan administreres topisk, transdermalt, oralt eller parenteralt i doseringer fra ca. 0,1 ug/dag til ca. 100 ug/dag.

Forbindelsene kan formuleres som kremer, lotions, salver, topiske plastre, piller, kapsler eller tabletter, eller i flytende form som oppløsninger, emulsjoner, dispersjoner eller suspensjoner i farmasøytisk ufarlige og akseptable løsningsmidler eller oljer, og slike preparater kan inneholde i tillegg andre farmasøytisk ufarlige eller vel-gjørende komponenter, så som stabiliseringsmidler, antioksidanter, emulgeringsmidler, fargestoffer, bindemidler eller smaksmodifiserende midler.

Forbindelsene administreres med fordel i mengder som er tilstrekkelige for å bevirke differensiering av promyelo-cytter til normale makrofager. Doseringene som er beskrevet ovenfor, er passende, men det bør være underforstått at de angitte mengder kan justeres i henhold til sykdommens alvor og pasientens tilstand og respons, hvilket er velkjent i faget.

Formuleringene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en aktiv ingrediens i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer og eventuelt andre terapeutiske ingredienser. Bæreren må være "akseptabel" i den forstand at den er kompatibel med de andre ingrediensene i formuleringen og ikke skadelig for mottakeren.

Formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse som er egnet for oral administrasjon, kan være i form av atskilte enheter som kapsler, lukteposer, tabletter eller suge-tabletter, som hver inneholder en forutbestemt mengde av den aktive ingrediens; i form av et pulver eller granuler; i form av en løsning eller en suspensjon i en vandig væske eller ikke-vandig væske; eller i form av en olje-i-vann-emulsjon eller en vann-i-olje-emulsjon.

Formuleringer for rektal administrasjon kan være i form av et suppositorium omfattende den aktive ingrediens og en bærer, så som kakaosmør, eller i form av et klyster.

Formuleringer som er egnet for parenteral administrasjon, omfatter med fordel et sterilt, oljeaktig eller vandig preparat av den aktive ingrediens som fortrinnsvis er isotonisk med pasientens blod.

Formuleringer som er egnet for topisk administrasjon, inn-befatter flytende eller semiflytende preparater, så som linimenter, lotions, applikatorer, olje-i-vann- eller vann-i-olje-emulsjoner, så som kremer, salver eller pastaer; eller løsninger eller suspensjoner, så som dråper; eller som sprayer.

For astmabehandling kan inhalering av pulveraktige, selv-drevne eller sprayende formuleringer som frigis med en sprayboks, en forstøver eller et atomiserende apparat, anvendes. Formuleringene har, når de frigis, fortrinnsvis en partikkelstørrelse i området 10-100 |i.

Formuleringene kan med fordel foreligge i doserings-enhetsform og kan fremstilles ved enhver metode som er velkjent i det farmasøytiske fag. Med uttrykket "doserings-enhet" menes en enhetlig, det vil si en eneste, dose som kan administreres til en pasient som en fysikalsk eller kjemisk stabil enhetsdose omfattende enten den aktive ingrediens som sådan eller en blanding av den med faste eller flytende farmasøytiske fortynningsmidler eller bærere.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel hvor Yi og Y2 er hydrogen, R6 er metyl og hvor gruppen R er representert ved strukturen: hvor det stereokjemiske senter ved karbon 20 kari ha R-eller S-konfigurasjon, hvor dobbeltbindingen kan ha cis-eller transgeometri.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er 2(S)-metyl-19-nor-la,25-dihydroksyvitamin D3,

2 (R) -metyl-19-nor-la, 25-dihydroksyvitamin D3, 2(S)-metyl-19-nor-20(S)-la,25-dihydroksyvitamin D3, eller 2(R)-metyl-19-nor-20(S)-la,25-dihydroksyvitamin D3.

3. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den inneholder minst én forbindelse ifølge krav 1, sammen med en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

4. Farmasøytisk blanding ifølge krav 3, karakterisert ved at den inneholder 2(S)-metyl-19-nor-la,25-dihydroksyvitamin D3, 2(R)-metyl-19-nor-la,25-dihydroksyvitamin D3 2(S)-metyl-19-nor-20(S)-la,25-dihydroksyvitamin D3, eller 2(R)-metyl-19-nor-20(S)-la,25-dihydroksyvitamin D3 i en mengde fra ca. 0,1 ug til ca. 50 ug.

5. Anvendelse av en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelse i henhold til krav 1-2 for fremstilling av et medikament effektivt mot senil osteoporose, postmenopausal osteoporose, steroid-indusert osteoporose, osteoporose grunnet lavt stoffskifte i benmassen, osteomalasi, renal osteodystrofi eller psoreasis.